CN1966694A - 一种利用葡萄糖木糖共发酵生产酒精的方法 - Google Patents

一种利用葡萄糖木糖共发酵生产酒精的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用重组酿酒酵母工业生产菌株共发酵葡萄糖木糖生产酒精的方法。其步骤包括(1)菌种选择：选用重组酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NAN127，保藏编号为CGMCC No.1848；(2)斜面培养；(3)种子培养；(4)扩大培养；(5)酒精发酵，(6)发酵液蒸馏得到酒精等步骤。该方法可以同时发酵利用培养基中的葡萄糖和木糖，并且木糖利用量、酒精转化率均较高，在木质纤维素材料发酵生产酒精方面具有较大的应用前景。

Description

一种利用葡萄糖木糖共发酵生产酒精的方法
技术领域
本发明涉及一种生产酒精的方法，尤其涉及一种利用葡萄糖木糖共发酵生产酒精的方法。
背景技术
石油是不可再生能源物质，以此为基础的现代工业化社会发展模式将难以持续。我国是石油进口国，为促进经济平稳发展，保障国家安全，需要寻找可再生替代能源。酒精是清洁的可再生液体燃料，许多国家已经在使用添加了一定比例酒精的汽油——汽油醇。这种新型燃料既减缓石油消耗速率，又减少汽车尾气污染，具有极大的应用和发展潜力。我国从2001年起也开始推广使用汽油醇，目前汽油醇占汽油类燃料总消耗量的20％，并处于逐年增长的势头。
目前国内外酒精生产的主要原料是玉米等粮食作物。随着世界人口的不断增长，从长远看，粮食不是生产燃料酒精的最佳原料。同时，每年有大量的农林业废弃物(如玉米秸秆)等木质纤维素材料用焚烧等方式不当处理，既造成浪费又污染环境。专家评估认为，通过技术进步，以秸秆等木质纤维素材料为原料生产酒精的成本有望低于粮食发酵生产酒精的成本。
木质纤维素主要由纤维素、半纤维素、木质素组成，在农业废弃物中的三者的含量大约是：30～40％纤维素，20～30％半纤维素，10～25％木质素。其中，葡萄糖是纤维素的组成单元，木糖是半纤维素的主要组成单元。在植物纤维材料水解液中木糖占30％左右，是继葡萄糖之后自然界中最丰富的糖分，因此，葡萄糖木糖的共利用是开发木质纤维素酒精生产的关键技术之一。
目前木质纤维素酒精生产还处于尝试阶段，有望用于该方面的菌株包括某些可利用木糖的天然酵母，如树干毕赤氏酵母(Pichia stipitis)，嗜鞣管囊酵母(Pachysolentannophilus)，休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)，以及一些基因工程重组菌，如，重组酿酒酵母，重组大肠杆菌，重组运动发酵单孢菌，等等。
天然可利用木糖的酵母因为本身不倾向于利用木糖而在发酵前需要长期的驯化过程，又因为本身代谢不倾向于产生酒精，因而酒精产量较低，同时，它们通常对酒精和发酵底物中其他毒性物质的耐受性不高，大大限制了酒精生产能力的提高。重组大肠杆菌也因其对酒精耐受性不高影响酒精产量。重组运动发酵单孢菌是相对较好的选择，但由于其发酵需要在中性条件下进行，而木质纤维素水解过程常常有酸预处理过程，增加了调节pH所需的生产成本，且在中性条件下的发酵生产过程较易污染杂菌，需要较高的发酵工艺控制要求。
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是传统的酒精生产菌株，具备良好的工业生产性状，具有易培养、酒精耐受度高、耐高糖浓度、耐低浓度发酵抑制剂能力及在厌氧条件下发酵等优良品质，一直是酒精发酵的首选微生物。同时，酿酒酵母的遗传操作技术相对成熟，为对其的代谢工程改造创造了良好的条件。酿酒酵母本身由于缺乏木糖代谢途径最初将木糖转化为木酮糖的酶而不能利用木糖。因此，充分利用木质纤维素原料的关键条件之一是获得合适的酿酒酵母代谢工程菌，该代谢工程菌可以通过简单的向酿酒酵母中引入木糖代谢的上游途径(图1)实现。目前以酿酒酵母为出发菌株的工作大部分是在实验室菌株中进行，仅仅为工业生产提供一种思路，也有个别工作在工业菌株中进行，取得了一定效果。
外源基因引入的模式决定了其在酿酒酵母中表达的稳定性以及表达水平。以附加体质粒载体引入外源基因稳定性差，将外源基因定位整合到酵母染色体上则稳定性较好。蛋白表达水平和外源基因引入的拷贝数直接相关，因此外源基因在酵母染色体上高拷贝整合是实现高水平稳定表达的关键。酵母基因组中高度重复的rDNA单元，是构建高拷贝整合表达载体同源重组区的首选序列。每个rDNA单元长达9.1kb左右，由5S、5.8S、25S、和18S rRNA的转录区及一些非转录区组成。有研究表明用于介导整合的rDNA区域，不应包含其RNA聚合酶I的起始转录区，同时整合于rDNA区域的外源片断大小接近rDNA单元长度时，其在有丝分裂中稳定性最高。目前，有工作通过在酵母rDNA区域高拷贝整合木糖代谢基因实现高水平稳定表达，但并未考虑具体整合区域问题，因此所使用的酒精生产重组菌株仍然带有稳定性不足的缺陷，需要在以木糖为唯一碳源的培养基中驯化后使用。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种利用葡萄糖木糖共发酵生产酒精的方法。
本发明所述的利用葡萄糖木糖共发酵生产酒精的方法具体步骤如下：
(1)菌种选择：选用重组酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NAN127，其保藏编号为CGMCC No.1848；
(2)斜面培养：取重组酿酒酵母NAN127菌1～2环接种到含有1.5～2％琼脂(w/v)的YEPD培养基斜面上，26～37℃培养12～36小时；
(3)种子培养：取步骤(2)中的NAN127菌1～2环到30～80mL的YEPD液体培养基中，26～37℃，200～400r/min摇床培养12～36小时；
(4)扩大培养：按体积百分比为5％～15％的接种量，将步骤(3)中的NAN127转接到100～1000mL的YEPD液体培养基中，26～37℃，200～400r/min摇床培养12～36小时；
(5)酒精发酵：按体积百分比为5％～15％的接种量，将步骤(4)中NAN127转接到发酵罐中发酵，发酵条件为：发酵温度26～37℃，流加浓度为5～10％的NaOH溶液控制pH为4～6，通气量0.005vvm～0.08vvm，发酵时间60～120小时；
(6)取步骤(5)中发酵液经蒸馏得到酒精。
其中，步骤(1)中使用的菌株是重组酿酒酵母NAN127，该菌株为本实验室构建，该菌株已于2006年10月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.1848。该菌株染色体rDNA重复区(图2)带有多个毕赤氏酵母(Pichiastipitis)来源的木糖还原酶基因XYL1、木糖醇脱氢酶基因XYL2和酿酒酵母来源的木酮糖激酶基因XKS1。这些基因的引入是通过高拷贝整合载体pYMIK-xy127(图3)在一株工业生产菌株NAN27染色体rDNA位置上的同源整合实现。根据稳定性要求，对Saccharomyces cerevisiae rDNA序列进行分析，选定rDNA上跨越17S、5.8S以及26S三个区域长度为2.2kb的片断作为整合位点。
其中步骤(2)、(3)、(4)中所述的YEPD培养基配方是蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，葡萄糖20g/L。
其中步骤(2)、(3)、(4)中所述的培养温度优选是28～32℃。
其中步骤(2)、(3)、(4)中所述的培养时间优选是20～28小时。
其中步骤(4)、(5)中所述的转接量优选是体积百分比为8％～12％。
其中步骤(5)中发酵培养基配方为80～120g/L葡萄糖，30～70g/L木糖，3～20g/L蛋白胨，5～15g/L酵母粉；其优选配方是90～110g/L葡萄糖，40～60g/L木糖，8～12g/L蛋白胨，8～12g/L酵母粉；其最优配方是100g/L葡萄糖，50g/L木糖，10g/L蛋白胨，10g/L酵母粉。
其中步骤(5)中发酵条件优选方案是发酵温度28～32℃，流加浓度为5～10％的NaOH溶液控制pH为4.2～5.4，通气量0.04vvm～0.06vvm，发酵时间84～108小时；其最优方案是发酵温度30℃，流加浓度为5～10％的NaOH溶液控制pH为4.8，通气量0.05vvm，发酵时间96小时。
在实验中，发酵底物产物含量的分析由高效液相色谱(HPLC)测定，分析柱使用AminexHPX-87H(Bio-Rad，USA)离子交换柱，流动相为5mmol/L H2SO4，流速为0.4mL/min，柱温55℃。用视差折光检测仪RID-10A(Shimadzu，Japan)进行检测。
本发明使用通过基因工程改造的酿酒酵母工业生产菌株——重组酿酒酵母NAN127，其出发菌株NAN27具备良好的利用葡萄糖生产酒精的生产特性，一直在利用淀粉质原料的酒精生产中使用。重组菌NAN127在保持原有的对葡萄糖高效利用的特性的基础上，通过木糖代谢关键酶基因在酵母rDNA区域的特定位点的稳定整合表达，外源基因表达水平高，菌株性质稳定，获得了在利用葡萄糖的同时利用木糖发酵生产酒精的性质，拓展了酒精发酵的底物。
本发明以木质纤维素材料(如玉米芯，秸秆等)中碳源的实际含量比例、木糖的利用量以及酒精产率为关键技术指标，方法中涉及的酒精生产过程不需要菌株驯化过程，木糖和葡萄糖同步利用，发酵工艺简单，木糖利用量高于33g/L，酒精产率高于82％。在发酵过程中使用的培养基，其碳源浓度模拟木质纤维素(如玉米芯，秸秆等)水解液中不同糖分浓度的实际情况比例，为直接利用木质纤维素水解液发酵生产酒精奠定基础，具有继续开发的价值。
附图说明
本发明提供的菌株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NAN127已于2006年10月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市海淀区中关村北一条13号，邮政编码：100080，其保藏编号为CGMCC No.1848。
图1是重组菌株NAN127木糖代谢途径示意图。
其中：XR表示木糖还原酶；XDH表示木糖醇脱氢酶；XK表示木酮糖激酶；PPP表示磷酸戊糖途径；EMP表示糖酵解途径。
图2是木糖代谢基因在酿酒酵母rDNA区域的整合位置示意图。
其中：(A)是rDNA在酵母染色体上的分布；(B)是外源基因在rDNA上的整合位置；Pol I表示RNA聚合酶I转录起始区。
图3是构建重组菌株NAN127使用的重组质粒pYMIK-127的构建过程示意图。
其中：XYL1表示连接了ADH启动子和终止子的木糖还原酶基因；XYL2表示连接了PGK启动子和终止子的木糖醇脱氢酶基因；XKS1表示连接了PGK启动子和终止子的木酮糖激酶基因；rDNA表示同源整合序列；Kanr表示G418抗性基因。
图4是重组菌株NAN127葡萄糖木糖共发酵过程中不同时间发酵液中的各种成分HPLC分析结果。
其中：■葡萄糖；●木糖；▲木糖醇；甘油；◆乙醇(酒精)。
具体实施方式
实施例1本发明所述重组酿酒酵母NAN127的构建方法：
(1)以酵母通用单拷贝整合载体YIp5为基本骨架构建重组质粒pYMIK-127(图2)。
(2)用限制性内切酶HpaI将重组质粒pYMIK-127在5232bp的酶切位点处线性化。
(3)利用通用醋酸锂转化法转化工业酿酒酵母菌株NAN27，用加入G418的YEPD平板筛选得到重组菌NAN127。
其中，步骤(1)中重组质粒载体pYMIK-127中的PGK启动子和终止子(PGK promoterand terminator)克隆于酵母染色体DNA，在启动子和终止子之间插入克隆于树干毕赤氏酵母染色体DNA的木糖醇脱氢酶基因XYL2，整个片断连接到YIp5的HindIII(32bp)位置；
其中，步骤(1)中重组质粒载体pYMIK-127中的ADH启动子和终止子(ADH promoterand terminator)克隆于酵母染色体DNA，在启动子和终止子之间插入克隆于树干毕赤氏酵母染色体DNA的木糖还原酶基因XYL1，整个片断连接到YIp5的BamHI(378bp)位置；
其中，步骤(1)中重组质粒载体pYMIK-127中的卡那霉素抗性基因(Kanr)作为筛选标记，从含有该基因的质粒载体(任何一种含有该基因的商业化载体)上克隆获得，连接到YIp5的BamHI(378bp)和SalI(654bp)之间；
其中，步骤(1)中重组质粒载体pYMIK-127中的PGK启动子和终止子(PGK promoterand terminator)克隆于酵母染色体DNA，在启动子和终止子之间插入克隆于酿酒酵母染色体DNA的木酮糖激酶基因(XKS1)，整个片断连接到YIp5的SalI(654bp)位置；
其中，步骤(1)中重组质粒载体pYMIK-127中的rDNA部分片断克隆于酵母染色体，上下游引物分别为：ATCA CGGCCGAACGAACGAGACCTTAACCT和GCTG TCCGGAGGAACCTCTAATCATTGGCT，连接到YIp5的XmaIII(942bp)和BspMII(2845bp)酶切位点之间，替换掉原单拷贝整合位点URA3。
其中重组菌的筛选是将转化子涂布到带有400～20000μg/mLG418的YEPD平板上，在能够生长的各转化子中选择重组酿酒酵母菌。
本发明选择使用的重组酿酒酵母菌命名为NAN127，该菌已于2006年10月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市海淀区中关村北一条13号，邮政编码：100080，其保藏编号为CGMCC No.1848。
上述菌株构建过程中的具体内容详见Wang Y.，Shi W.L.，Liu X.Y.，Shen Y.，BaoX.M.，Bai F.W.，Qu Y.B.(2004)Establishment of xylose metabolic pathway inindustrial strain NAN-27 Saccharomyces cerevisiae.Biotechnology Letters 26(11)：885-890。
实施例2利用重组工程菌同步发酵葡萄糖和木糖生产酒精，方法如下
(1)菌种选择：选用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NAN127，保藏编号为CGMCC No.1848；
(2)斜面培养：接1～2环上述重组酿酒酵母菌株NAN127到含有2％琼脂(w/v)的YEPD培养基斜面上，30℃培养24小时；
(3)种子培养：接1～2环步骤(2)中NAN127接至50mL YEPD液体培养基中，30℃，150～180r/min振荡培养24小时；
(4)扩大培养：按体积百分比为10％的接种量，将步骤(3)中的NAN127转接到500mL YEPD液体培养基中，30℃，150～180r/min摇床培养24小时；
(5)酒精发酵：按体积百分比为10％的接种量，将步骤(4)中的NAN127转接到发酵罐中发酵，发酵条件为在30℃，流加浓度为5％的NaOH溶液控制pH 4.8，通气量0.05vvm，发酵108小时；
(6)取步骤(5)中发酵液经蒸馏得到酒精。
发酵液经高效液相色谱分析各种关键底物产物成分，葡萄糖利用率为99.9％，木糖利用率为66.9％，酒精产量为54.9g/L，达到理论值的82.6％。
在上述利用重组工程菌NAN127同步发酵葡萄糖和木糖生产酒精的方法中，步骤(2)、(3)、(4)中使用的YEPD培养基配方是蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，葡萄糖20g/L。步骤(5)中使用的发酵培养基配方是100g/L葡萄糖，50g/L木糖，10g/L蛋白胨，10g/L酵母粉。
实施例3：利用重组工程菌同步发酵葡萄糖和木糖生产酒精，方法如下
(1)菌种选择：选用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NAN127，保藏编号为CGMCC No.1848；
(2)斜面培养：接1～2环上述重组酿酒酵母菌株NAN127到含有2％琼脂(w/v)的YEPD培养基斜面上，26℃培养36小时；
(3)种子培养：接1～2环步骤(2)中NAN127接至50mL YEPD液体培养基中，26℃，150～180r/min振荡培养36小时；
(4)扩大培养：按体积百分比为5％的接种量，将步骤(3)中的NAN127转接到500mLYEPD液体培养基中，26℃，150～180r/min摇床培养36小时；
(5)酒精发酵：按体积百分比为5％接种量，将步骤(4)中的NAN127转接到发酵罐中发酵，发酵条件为26℃，流加浓度为5％的NaOH溶液控制pH 4.0，通气量0.08vvm，发酵120小时；
(6)取步骤(5)中发酵液经蒸馏得到酒精。
发酵液经高效液相色谱分析各种关键底物产物成分，葡萄糖利用率为97.3％，木糖利用率为89.3％，酒精产量为57.7g/L，达到理论值的80.3％；
在上述利用重组工程菌NAN127同步发酵葡萄糖和木糖生产酒精的方法中，(2)、(3)、(4)中使用的YEPD培养基配方是蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，葡萄糖20g/L。步骤(5)中使用的发酵培养基配方是120g/L葡萄糖，30g/L木糖，20g/L蛋白胨，5g/L酵母粉。
实施例4：利用重组工程菌NAN127同步发酵葡萄糖和木糖生产酒精
(1)菌种选择：选用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NAN127，保藏编号为CGMCC No.1848；
(2)斜面培养：接1～2环上述重组酿酒酵母菌株NAN127到含有1.5％(w/v)琼脂的YEPD培养基斜面上，37℃培养12小时；
(3)种子培养：接1～2环步骤(2)培养的菌株，接种到50mLYEPD液体培养基中，37℃，150～180r/min振荡培养12小时；
(4)扩大培养：按体积百分比为15％的接种量，将步骤(3)中的NAN127转接到500mL YEPD液体培养基中，37℃，150～180r/min摇床培养12小时；
(5)酒精发酵：按体积百分比为15％的接种量，将步骤(4)中的NAN127转接到发酵罐中发酵，发酵条件为37℃，流加浓度为10％的NaOH溶液控制pH 6.0，通气量0.005vvm，发酵60小时；
(6)取步骤(5)中发酵液经蒸馏得到酒精。
发酵液经高效液相色谱分析各种关键底物产物成分，葡萄糖利用率为99.2％，木糖利用率为38.6％，酒精产量为43.6g/L，达到理论值的82.4％；
在上述利用重组工程菌NAN127同步发酵葡萄糖和木糖生产酒精的方法中，步骤(2)、(3)、(4)中使用的YEPD培养基配方是蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，葡萄糖20g/L。步骤(5)中使用的发酵培养基配方是80g/L葡萄糖，70g/L木糖，3g/L蛋白胨，15g/L酵母粉。

Claims (8)

1.一种利用葡萄糖木糖共发酵生产酒精的方法，包括：
(1)使用重组酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NAN127，该菌已于2006年10月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCCNo.1848；
(2)斜面培养：取重组酿酒酵母NAN127菌1～2环接种到含有1.5～2％琼脂的YEPD培养基斜面上，26～37℃培养12～36小时；
(3)种子培养：取步骤(2)中的NAN127菌1～2环到30～80mL的YEPD液体培养基中，26～37℃，200～400r/min摇床培养12～36小时；
(4)扩大培养：按体积百分比为5％～15％的接种量，将步骤(3)中的NAN127转接到100～1000mL的YEPD液体培养基中，26～37℃，200～400r/min摇床培养12～36小时；
(5)酒精发酵：按体积百分比为5％～15％的接种量，将步骤(4)中NAN127转接到发酵罐中发酵，发酵条件为：发酵温度26～37℃，流加浓度为5～10％的NaOH溶液控制pH为4～6，通气量0.005vvm～0.08vvm，发酵时间60～120小时；
上述发酵培养基配方为80～120g/L葡萄糖，30～70g/L木糖，3～20g/L蛋白胨，5～15g/L酵母粉；
(6)取步骤(5)中发酵液经蒸馏得到酒精。
2.如权利要求1所述的利用葡萄糖木糖共发酵生产酒精的方法，其特征在于，步骤(2)、(3)、(4)中培养温度为28～32℃。
3.如权利要求1所述的利用葡萄糖木糖共发酵生产酒精的方法，其特征在于，步骤(2)、(3)、(4)中培养时间为20～28小时。
4.如权利要求1所述的利用葡萄糖木糖共发酵生产酒精的方法，其特征在于，步骤(4)、(5)中的转接量是体积百分比为8％～12％。
5.如权利要求1所述的利用葡萄糖木糖共发酵生产酒精的方法，其特征在于，步骤(5)中发酵培养基配方为90～110g/L葡萄糖，40～60g/L木糖，8～12g/L蛋白胨，8～12g/L酵母粉。
6.如权利要求5所述的一种利用葡萄糖木糖共发酵生产酒精的方法，其特征在于，步骤(5)中发酵培养基配方为100g/L葡萄糖，50g/L木糖，10g/L蛋白胨，10g/L酵母粉。
7.如权利要求1所述的利用葡萄糖木糖共发酵生产酒精的方法，其特征在于，步骤(5)中发酵条件为：发酵温度28～32℃，流加浓度为5～10％的NaOH溶液控制pH为4.2～5.4，通气量0.04vvm～0.06vvm，发酵时间84～108小时。
8.如权利要求7所述的利用葡萄糖木糖共发酵生产酒精的方法，其特征在于，步骤(5)中发酵条件为发酵温度30℃，流加浓度为5～10％的NaOH溶液控制pH为4.8，通气量0.05vvm，发酵时间96小时。
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