CN103374532A - 一株生产乙醇的耐高温酵母菌及其应用 - Google Patents

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王钦宏
齐显尼
汪保卫
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Abstract

乙醇是一种洁净、可再生、生产过程不净排放碳的交通燃料，是目前使用量最大的生物运输燃料。本发明利用高温适应进化的方法，筛选到一株耐受高温的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)TIB-S.C Y01 CGMCC No.5679。耐温酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)TIB-S.C Y01 CGMCC No.5679能够在40-45℃生长良好，同时不会影响发酵液中乙醇的积累量。耐高温菌株能够减少生产过程中用于降低温度所带来的生产成本的增加，因此该菌株具有广泛的工业应用前景。

Description

一株生产乙醇的耐高温酵母菌及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及到一株生产乙醇的耐高温酵母菌，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)TIB-S.C Y01CGMCC No5679和利用该菌发酵生产乙醇的方法。 
背景技术
能源是国民经济发展的动力。随着石油资源的大量消耗和价格的节节攀升，能源问题已经成为制约我国经济持续稳定发展的重要因素，寻找清洁、廉价、可再生的替代能源成为未来能源战略的关键。燃料乙醇作为一种洁净和可再生的零碳交通燃料，是目前最可行、使用量最大的生物运输燃料，更是减少化石燃油消耗和温室气体排放最经济的方法之一。 
燃料乙醇是由生物资源经过一系列的物理、生物、化学变化过程而获得，是一种洁净、可再生、生产过程不净排放碳的交通燃料，是目前使用量最大的生物运输燃料。乙醇燃料的使用可以有效地减少化石燃料的消耗和温室气体的排放。与传统的玉米淀粉发酵生产乙醇不同的是，纤维素燃料乙醇技术通过对农业废弃物(如秸秆、干草等木质纤维素原料)进行酶解，获得可发酵的糖类，然后发酵生产乙醇。利用木质纤维素为原料生产燃料乙醇，不需要消耗粮食资源，也不占用耕地，原料来源非常广泛，价格低廉，是一项环境友好的、可持续发展的技术，是从化石经济转向生物经济的核心技术支撑之一。 
木质纤维素原料中含有大量纤维素，经过纤维素酶酶解可以将纤维素降解成葡萄糖，而酿酒酵母能够高效的转化葡萄糖生产乙醇。但是纤维素酶的最适酶活是在50-55℃，需要大量的冷却水将酶解糖液降温，以适应目前主要使用的酿酒酵母的发酵温度。因此如果有能适应较高温度的酿酒酵母，那么有可以提高发酵温度，从而减少冷却水的使用，降低能耗。另外高温发酵生产乙醇可以降低染菌 几率，有利于乙醇的分离。因此开发高性能的耐高温菌株来生产乙醇是燃料乙醇技术进步的重要环节。 
发明内容
本发明的目的是提供一株能够耐受高温、生产乙醇的酵母菌和发酵法生产乙醇的方法及应用。 
本发明所提供的耐高温生产乙醇酵母菌为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)TIB-S.C Y01已于2011年12月30日藏保于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC No5679，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。 
目前利用酵母菌进行乙醇发酵生产都是30℃左右的温度下进行，但是由于纤维素酶降解纤维素产生葡萄糖的最适温度为50℃，因此在工业生产过程中需要消耗大量的冷却水来降低温度，以维持30℃左右的发酵过程。初步计算表明在30℃乙醇发酵生产，每生产1吨乙醇将消耗120-130吨的冷却水，如果提高发酵温度到40℃以上，则冷却水的用量可降低到40吨以下。所以提高乙醇的发酵生产温度可以大幅度降低冷却水用量，减少能量消耗，从而降低乙醇生产成本。要实现40℃左右较高温的乙醇发酵生产，就必须有合适的耐高温生产菌株。因此提高酵母菌对温度的耐受性，使其能在高温环境下生长良好且乙醇的生产水平不会降低对工业生产的意义十分重大。 
为了改善菌株工业适应性，我们从工业酿酒酵母Ethanol Red E491出发，利用适应进化(adaptive evolution)的方法对菌株进行高温环境的适应性驯化，得到一株能够在40℃生长良好，且不影响乙醇积累水平的生产乙醇的酵母菌TIB-S.C Y01CGMCC No5679。本发明的目的是提高了菌株发酵条件的温度，使其能够在高温环境下适应生长的同时不影响发酵时乙醇的积累量，该菌株可以在乙醇的工业生产中进行应用。 
具体实施 
以下为列举的实施例，以便于更好地理解本发明。 
实施例1 耐温酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)TIB-S.C Y01CGMCC  No5679的获得。 
工业酿酒酵母Ethanol Red E491接种于适应进化培养基，该培养基pH为5.5，含有下述质量百分比的组分：葡萄糖10％，牛肉膏1％，蛋白胨2％。在含有10mL培养基的50ml摇瓶中于37℃、200r/min的培养24小时后，然后以0.5个OD600值接种于新鲜的相同培养基中，以相同的方法传代培养。以此类推，使菌株适应37℃的环境生长稳定后，用相同的培养基和培养条件逐渐提高生长温度，进行适应性驯化直到温度达到40℃，使其仍能够稳定生长，且增长量与出发菌株在30℃生长量基本相同，从而得到耐温酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)TIB-S.C Y01CGMCC No5679。 
实施例2 工业酿酒酵母Ethanol Red E491和耐温酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)TIB-S.C Y01CGMCC No5679在40℃发酵对比 
工业酿酒酵母Ethanol Red E491和TIB-S.C Y01CGMCC No5679分别接种于种子培养基中，该培养基pH为5.5，含有下述质量百分比的组分：葡萄糖10％，蛋白胨2％，酵母膏1％，在装有10mL的50ml摇瓶中于40℃、200r/min的培养24小时后，取5mL种子液接种到装有200mL发酵培养基的500mL摇瓶中，该培养基的pH为5.5，含有下述质量百分比的组分：葡萄糖20％，蛋白胨2％，酵母膏1％。在40℃、200r/min的培养48小时，利用分光光度方法测定菌体的生长量及发酵液中乙醇的含量。工业酿酒酵母Ethanol Red E491的OD600为10.4，乙醇为60g/l，乙醇得率为0.39g/g；酿酒酵母TIB-S.C Y01CGMCC No5679的OD600为13.4，乙醇为81.7g/l，乙醇得率为0.44g/g。 
实施例3 工业酿酒酵母Ethanol Red E491和耐温酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)TIB-S.C Y01CGMCC No5679在42℃发酵对比 
工业酿酒酵母Ethanol Red E491和TIB-S.C Y01CGMCC No5679分别接种于种子培养基中，该培养基pH为5.5，含有下述质量百分比的组分：葡萄糖10％，蛋白胨2％，酵母膏1％，在装有10mL的50ml摇瓶中于40℃、200r/min的培养24小时后，取5mL种子液接种到装有200mL发酵培养基的500mL摇瓶中，该培养基的pH为5.5，含有下述质量百分比的组分：葡萄糖20％，蛋白胨2％，酵母膏1％。 在40℃、200r/min的培养48小时，利用分光光度方法测定菌体的生长量及发酵液中乙醇的含量。工业酿酒酵母Ethanol Red E491的OD600为8.3，乙醇为46.9g/l，乙醇得率为0.37g/g；酿酒酵母TIB-S.C Y01CGMCC No5679的OD600为11.6，乙醇为64.7g/l，乙醇得率为0.42g/g。 
实施例4 耐温酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)TIB-S.C Y01CGMCC No5679在40℃、30L发酵罐发酵玉米秸秆水解液生产乙醇 
耐温酿酒酵母TIB-S.C Y01CGMCC No5679接种装有50mL种子培养基的250mL摇瓶中，该培养基的pH为5.5，含有下述质量百分比的组分：葡萄糖10％，蛋白胨2％，酵母膏1％。在40℃、200r/min的摇床培养16小时后，将培养的酵母菌转接10ml到含有300ml的种子培养基1000ml摇瓶中，准备3个1000的摇瓶，共900ml的种子培养基，该培养基的pH为5.5，含有下述质量百分比的组分：葡萄糖10％，蛋白胨2％，酵母膏1％。在40℃、200r/min的摇床培养16小时后，加入到含有18L玉米秸秆水解液(葡萄糖含量为68.3g/l)的30L发酵罐中，在40℃，100r/min条件下厌氧发酵24h之后，利用HPLC测定乙醇含量为29.5g/l。 
实施例5 耐温酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)TIB-S.C Y01CGMCC No5679与玉米芯在40℃、30L发酵罐同步糖化酶解发酵生产乙醇 
将耐温酿酒酵母TIB-S.C Y01CGMCC No5679接种装有100mL一级种子培养基的250mL摇瓶中，该培养基的pH为5.5，含有下述质量百分比的组分：葡萄糖10％，蛋白胨2％，酵母膏1％。在40℃、200r/min的摇床培养16小时后，将培养的酵母菌转接10ml到含有300ml的二级种子培养基的1L摇瓶中，准备4个1L的摇瓶，共1.2L的种子培养基，该培养基的pH为5.5，含有下述质量百分比的组分：葡萄糖10％，蛋白胨2％，酵母膏1％。在40℃、200r/min的摇床培养16小时后，加入到发酵罐中进行同步糖化酶解发酵。 
玉米芯经过稀酸处理之后，将半纤维素去除，剩下纤维素和木质素，含量分别是49.6％和23.1％，含水量为6.1％。30L发酵罐首先一次性加水10.1L，称取12％底物含量对应的原料(1.8Kg)，纤维素酶0.465L；开搅拌并投料。完成后设定同步糖化发酵程序，温度40℃，pH4.5，转速100rpm，罐压0.005Mpa，微通气。 
12h补料6％及对应纤维素酶量，接种1.2L(OD600＝10.0)；24h补料6％及对应纤维素酶量；36h补料3％及对应纤维素酶量，接种0.5L(OD600＝10.0)；48h补料3％及对应酶量。最后取样，利用HPLC测定乙醇含量为42.3g/L。 

Claims (8)

1.一株能够耐受高温的产乙醇的耐温酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)TIB-S.CY01 CGMCC No5679。
2.根据权利1要求，菌的生长及发酵生产的培养基包括碳源、氮源和维生素，pH4.5-6.5。
3.根据权利要求2所述，其特征在于：所述碳源为质量百分含量为5％-40％的葡萄糖和/或蔗糖和/或淀粉和/或糖蜜和/或生物质水解糖液。
4.根据权利要求2所述，其特征在于：所述氮源为质量百分含量为0.1％-5％的玉米浆和/或牛肉膏和/或酵母提取物和/或蛋白胨和/或豆粕和/或豆饼粉和/或花生粕。
5.根据权利要求1、2、3或4所述，其特征在于：耐温酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)TIB-S.C Y01 CGMCC No5679的生长和发酵温度为30-50℃。
6.根据权利要求1、2、3、4或5所述，其特征在于：耐温酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)TIB-S.C Y01 CGMCC No5679的发酵时间为20h-80h。
7.根据权利要求1所述的菌株在乙醇生产中的应用。
8.根据权利要求2、3、4、5或6所述的配方和方法在耐温酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)TIB-S.C Y01 CGMCC No5679乙醇的生产中的应用。
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