BR112014030906B1

BR112014030906B1 - Processo de produção de coquetel enzimático, utilizando resíduos líquidos de processo de conversão bioquímica de materiais lignocelulósicos

Info

Publication number: BR112014030906B1
Application number: BR112014030906-0A
Authority: BR
Inventors: Fadhel BEN CHAABANE; Sylvain Louret
Original assignee: IFP Energies Nouvelles
Priority date: 2012-06-18
Filing date: 2013-06-10
Publication date: 2021-08-10
Also published as: EP2861752B8; BR112014030906A2; EP2861752B1; ES2848049T3; US20150152400A1; HRP20210272T1; MX358824B; US10030236B2; JP6581904B2; CA2874574A1; EP2861752A1; HUE053225T2; PL2861752T3; AU2013279186B2; FR2991997B1; DK2861752T3; WO2013190214A1; UA116987C2; AU2013279186A1; JP2015519070A

Abstract

processo de produção de coquetel enzimático, utilizando resíduos líquidos de processo de conversão bioquímica de materiais lignocelulósicos. processo de produção de um coquetel enzimático com um micro-organismos celulolítico, compreendendo duas fases: - uma fase a) de crescimento desse micro-organismo em reator fechado em presença de uma solução carbonada de crescimento; - uma fase b) de produção desse coquetel enzimático realizada com uma alimentação com solução carbonada de produção, cuja concentração em substrato carbonado está compreendida entre 150 e 400 g/l, essa solução carbonada de produção, compreendendo um substrato carbonado indutor, caracterizado pelo fato de esse substrato carbonado indutor ser um resíduo líquido oriundo de uma etapa de pré-tratamento de materiais lignocelulósicos, cujos oligômeros de açúcares c5 representam pelo menos 1 % em peso dos açúcares totais presentes nesse resíduo líquido, e pelo menos 0,3 % em peso dos açúcares totais presentes nessa solução carbonada de produção.

Description

DOMÍNIO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se à produção das enzimas celulósicas e hemicelulolíticas, notadamente no escopo da produção de etanol, a partir de materiais celulósicos ou lignocelulósicos.

TÉCNICA ANTERIOR

[002] A partir dos anos 70, a transformação de materiais lignoce-lulósicos em etanol, após hidrólise dos poli-sacarídeos constitutivos em açúcares fermentáveis, constitui o objeto de numerosíssimos trabalhos. Podem-se citar, por exemplo, trabalhos de referência do National Renewable Energy Laboratory (Process Design and Economics for Biochemical Conversion of Lignocellulosic Biomass to Ethanol, Humbird et al., NREL/TP-5100-57764, May 2011).

[003] Os materiais lignocelulósicos são materiais celulósicos, istoé, constituídos em mais de 90 % em peso de celulose, e/ou lignocelu- lósico, isto é, constituídos de celulose, de hemiceluloses, que são poli- sacarídeos essencialmente constituídos de pentoses e de hexoses, assim como de lignina, que é uma macromolécula de estrutura complexa e de elevado peso molecular, à base de compostos fenólicos.

[004] A madeira, as palhas, as palhas de milho são os materiaislignocelulósicos os mais utilizados, mas outras fontes, culturas florestais dedicadas a isso, resíduos de plantas alcoolígenas, açucareiras e de cereais, produtos e resíduos da indústria do papel e produtos de transformação dos materiais lignocelulósicos são utilizáveis. Eles são constituídos na maior parte de aproximadamente 35 a 50 % de celulose, de 20 a 30 % de hemicelulose e de 15 a 25% de lignina.

[005] O processo de transformação bioquímica dos materiais lig- nocelulósicos em etanol compreende uma etapa de pré-tratamento físico-químico, seguida de uma etapa de hidrólise enzimática, utilizando um coquetel enzimático, de uma etapa de fermentação etanólica dos açúcares liberados, a fermentação etanólica e a hidrólise enzimá- tica que podem ser conduzidas simultaneamente, e de uma etapa de purificação do etanol.

[006] O coquetel enzimático é uma mistura de enzimas celulolíti-cas (também denominadas celulases) e/ou hemicelulolíticas. As enzimas celulolíticas apresentam três grandes tipos de atividades: endo- glucanases, exoglucanases e celobiases, estas sendo também denominadas β glicosidades. As enzimas hemicelulolíticas apresentam no- tadamente atividades xilanases.

[007] A hidrólise enzimática é eficaz e é feita em condições suaves. Ao contrário, o custo das enzinas permanece muito elevado, re-presentando de 20 a 50 % do custo de transformação do material lig- nocelulósico em etanol. Dessa forma, muitos trabalhos foram conduzidos para reduzir esse custo: a otimização da produção de enzimas de início, selecionando os micro-organismos hiperprodutores e melhorando os processos de produção dessas enzimas, a diminuição da quantidade de enzimas em hidrólise em seguida, otimizando a etapa de pré-tratamento, melhorando a atividade específica dessas enzimas, e otimizando a utilização da etapa de hidrólise enzimática.

[008] No decorrer do último decênio, numerosos trabalhos se ligaram em compreender os mecanismos de ação e de expressão do coquetel enzimático. A finalidade é de fazer secretar o coquetel o mais apropriado à hidrólise dos materiais lignocelulósicos, modificando os micro-organismos.

[009] O micro-organismo celulolítico o mais utilizado para a produção industrial do coquetel enzimática é o cogumelo Trichoderma reesei. As cepas selvagens têm a faculdade de secretar, em presença de um substrato indutor, a celulose, por exemplo, o coquetel enzimáti- co considerado como o melhor adaptado à hidrólise da celulose. Outras proteínas que possuem propriedades indispensáveis à hidrólise dos materiais lignocelulósicos são também produzidas por Trichoder- ma reesei, as xilanases, por exemplo. A presença de um substrato carbonado indutor é indispensável à expressão das enzimas celulolíti- cas e/ou hemicelulolíticas. A natureza do substrato carbonado tem uma forte influência sobre a composição do coquetel enzimático. É o caso da xilose que, associada a um substrato carbonado indutor como a celulose ou a lactose, permite melhorar significativamente a atividade dita xilanase.

[0010] A lactose permanece, em um processo de produção industrial de coquetel enzimático, um dos substratos os mais apropriados; seu custo varia, todavia, de maneira importante e representa aproximadamente de um a dois terços do preço de custo das enzimas. No caso da utilização de lactose como substrato carbonado, o processo de produção de coquetel enzimático é dependente de uma fonte de carbono externa. Dessa forma, a utilização de substratos carbonados oriundos do processo de conversão bioquímica de materiais lignocelu- lósicos é uma via de progresso importante.

[0011] O pedido de patente EP1690944 ensina que o extrato dafração hemicelulósica sob a forma monômera proveniente de materiais lignocelulósicos pré-tratados pode ser utilizado como substrato carbonado não indutor para o crescimento do micro-organismo celulolítico e a produção de enzimas. Neste último caso, ela deve ser misturada a um substrato carbonado indutor da produção de celulases (lactose ou celobiose).

[0012] Os pedidos de patente WO0902 6716 A1 e WO090061486A1 descrevem a produção de um coquetel enzimático a partir de Tri- choderma reesei, utilizando um substrato carbonado contendo açúca- res indutores da produção de celulases, assim como uma fonte de carbono principal. Esse pedido ensina que 3% em peso de açúcares indutores são suficientes para induzir a produção de celulases. A produção de celulases é multiplicada por um fator superior a 4 em relação ao exemplo no qual a xilose é utilizada sozinha na solução de produção. Os açúcares indutores descritos são mono-, di- e oligo-sacarídeos (açúcares C6) produzidos eventualmente pela hidrólise da celulose. A fonte de carbono principal é um conjunto que compreende mono-, di- e oligo-sacarídeos oriundos das hemiceluloses ou da xilose sintética.

[0013] O documento FR 2 962 444 ensina um processo de produção de enzimas celulolíticas e/ou hemicelulolíticas. O substrato é uma mistura de glicose ou hidrolisados celulósicos, de lactose ou de xilose ou de uma solução de hidrolisados hemicelulósicos com pelo menos 10 % em peso de cada um desses três grupos de constituintes. Esse documento indica que o substrato indutor é desprovido de qualquer outro açúcar que os constituintes listados acima, os hidrolisados celulósicos sendo a glicose oriunda da hidrólise da celulose, e os hidroli- sados hemicelulósicos sendo uma solução de açúcares em C5.

[0014] O documento EP 2 371 950 A1 descreve um processo deprodução de celulases baseado na regulagem da oscilação da pressão em oxigênio dissolvido no meio de cultura. Esse documento divulga que o substrato indutor carbonado é escolhido dentre a lactose, a xilo- se, a celobiose, a soforose, os resíduos obtidos após fermentação de açúcares monômeros e/ou um extrato bruto de pentoses hidro- solúveis, isto é, de açúcares em C5 hidro-solúveis.

[0015] A publicação "Cellulase Production by Continous Culture ofTrichoderma reesei Rut C30 using acid hydrolysate prepared to retain mode oligosacharides for induction", Lo et al., Bioresource Technology 101 (2010) 717-723, ensina uma indução pelos oligo-sacarídeos produzidos por hidrólise ácida de celulose, esse hidrolisado, constituído de oligômeros produzidos por hidrólise ácida de celulose, esse hidroli- sado, constituído de oligômeros de açúcares em C6, sendo basificado por uma solução de Ca(OH)2, antes de ser neutralizado. O papel indutor dos oligômeros C6, em particular da celobiose, é conhecido por outro lado.

[0016] Um objeto da invenção é de propor uma nova fonte de carbono indutora facilmente disponível, permitindo produzir um coquetel enzimático nas atividades apropriadas à hidrólise do material lignoce- lulósico. Em relação à patente EP 1690944, a invenção reivindica a utilização vantajosa de uma fração hemicelulósica contendo também oligômeros, o que permite se livrar do acréscimo de um substrato indutor. Em relação à patente WO09026716, a invenção preconiza a utilização de uma única fonte de carbono indutora não sintética e particularmente adaptada à expressão de uma mistura de enzimas perfeitamente eficaz para o tratamento da biomassa a hidrolisar. Essa invenção permite, por outro lado, a valorização em interno de co-produtos.

SUMÁRIO E INTERESSE DA INVENÇÃO

[0017] A presente invenção refere-se a um processo de produçãode um coquetel enzimático por um micro-organismo celulolítico, caracterizado pelo fato de utilizar um resíduo líquido do pré-tratamento de materiais lignocelulósicos como substrato carbonado indutor para induzir a produção do coquetel enzimático.

[0018] Uma vantagem da invenção é de reduzir, até mesmo suprimir o fornecimento em substrato carbonado de origem externa ao processo de conversão bioquímica de materiais lignocelulósicos. Uma outra vantagem é de valorizar os resíduos líquidos desse processo de conversão bioquímica para a produção de um coquetel enzimático. Essa valorização permite reduzir a quantidade de efluentes produzidos que devem ser retratados antes da rejeição ou estocagem.

[0019] Esses resíduos líquidos contendo oligômeros indutores sendo valorizados para produção de um coquetel enzimático, o custo desse coquetel é reduzido.

[0020] Uma vantagem suplementar do processo, de acordo com ainvenção, é de produzir um coquetel enzimático particularmente adaptado à hidrólise enzimática do material lignocelulósico pré-tratado convertido no processo de conversão bioquímico. Em particular, descobriu-se um efeito positivo dos oligômeros C5 sobre a atividade celulase das enzimas obtidas.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0021] A presente invenção é um processo de produção de umcoquetel enzimático com um micro-organismo celulolítico, compreendendo duas fases:- uma fase a) de crescimento desse micro-organismo em reator fechado em presença de uma solução carbonada de crescimento;- uma fase b) de produção desse coquetel enzimático realizada com uma alimentação com solução carbonada de produção, cuja concentração em substrato carbonado está compreendida entre 150 e 400 g/L, essa solução carbonada de produção compreendendo um substrato carbonado indutor;

[0022] caracterizado pelo fato de esse substrato carbonado indutorser um resíduo líquido oriundo de uma etapa de pré-tratamento de materiais lignocelulósicos, utilizado sem esterilização, nem modificação do pH desse resíduo líquido, cujos oligômeros de açúcares C5 representam pelo menos 1 % em peso dos açúcares totais presentes nesse resíduo líquido, e pelo menos 0,3 % em peso dos açúcares totais presentes nessa solução carbonada de produção.

[0023] Preferencialmente, a solução carbonada de crescimentoutilizada nessa fase a) está a uma concentração inicial compreendida entre 10 e 90 g de substrato carbonado por litro de volume reacional.

[0024] Preferencialmente, essa etapa de pré-tratamento é uma hidrólise ácida, um cozimento ácido ou uma explosão ao vapor com impregnação prévia desses materiais lignocelulósicos com uma solução aquosa de ácido sulfúrico.

[0025] Preferencialmente, esse resíduo líquido é utilizado sem esterilização, nem modificação do pH desse resíduo líquido. De maneira preferida, esse resíduo líquido é utilizado sem esterilização, nem des- toxificação, nem modificação do pH desse resíduo líquido.

[0026] Preferencialmente, os oligômeros de açúcares C5 representam entre 1 e 50 % em peso dos açúcares totais presentes nesse resíduo líquido.

[0027] Preferencialmente, esse substrato carbonado indutor é utilizado sozinho ou em mistura com pelo menos um outro substrato carbonado não indutor.

[0028] Preferencialmente, esse outro substrato carbonado não indutor é escolhido dentre a glicose, a xilose, e a sacarose considerados sozinhos ou em mistura.

[0029] Preferencialmente, essa solução carbonada de produçãoconsiste em um resíduo líquido e em pelo menos um substrato carbonado não indutor, escolhido dentre a glicose, a xilose, e a sacarose considerados ou em mistura, esse resíduo líquido sendo oriundo de uma etapa de pré-tratamento de materiais lignocelulósicos, e utilizado sem esterilização, nem destoxificação, nem modificação do pH, esse resíduo líquido consistindo em oligômeros de açúcares C5, em monô- meros do pH, esse resíduo líquido consistindo em oligômeros de açúcares C5, em monômeros de açúcares C5 e C6 e em produtos de degradação dos açúcares monômeros, cujos oligômeros de açúcares C5 representam pelo menos 1 % em peso dos açúcares totais presentes nesse resíduo líquido, e pelo menos 0,3 % em peso dos açúcares totais presentes nessa solução carbonada de produção.

[0030] Preferencialmente, o fluxo específico da alimentação com solução carbonada de produção da fase b) está compreendido entre 35 e 65 mg de substrato carbonado por grama de micro-organismo e por hora.

[0031] Preferencialmente, o micro-organismo celulolítico é escolhido dentre as cepas de cogumelos pertencentes aos gêneros Tricho- derma, Aspergillus, Penicillium ou Schizophyllum.

[0032] Preferencialmente, o micro-organismo celulolítico pertenceà espécie Trichoderma reesei.

[0033] Esse processo de produção de um coquetel enzimático queé levado em cultura submersa. Por cultura submersa, entende-se uma cultura em meio líquido.

[0034] Os micro-organismos celulolíticos utilizados no processo deprodução de um coquetel enzimático, de acordo com a invenção, são cepas de cogumelos celulolíticas, por exemplo, pertencente aos gêneros Trichoderma, Aspergillus, Penicilium ou Schizophyllum, de preferência, pertencente à espécie Trichoderma reesei. As cepas industriais as de melhores desempenhos são as cepas pertencentes à espécie Trichoderma reesei, modificadas para melhorar o coquetel enzimático pelos processos de mutação-seleção, como, por exemplo, a cepa IFP CL847 (patente francesa FR-B-2 555 803). As cepas melhoradas pelas técnicas de recombinação genética podem ser também aplicadas. Essas cepas são cultivadas em reatores agitados e aerados em condições compatíveis com seu crescimento e a produção das enzimas.

[0035] Por substrato carbonado, designa-se o conjunto dos açúcares compreendidos na solução carbonada.

[0036] A solução carbonada de crescimento desse microorganismo utilizada nessa fase a) do processo, de acordo com a invenção, é uma solução aquosa compreendendo vantajosamente um substrato carbonado escolhido dentre os açúcares solúveis industriais, e, de preferência, dentre a glicose, a xilose, os resíduos líquidos obti- dos após fermentação etanólica dos açúcares monômeros dos hidroli- sados enzimáticos de materiais lignocelulósicos e os extratos da fração hemicelulósica sob a forma de monômeros provenientes de materiais lignocelulósicos pré-tratados, utilizados sozinhos ou em mistura. Segundo sua natureza, essa solução carbonada de crescimento é introduzida no reator fechado antes da esterilização ou é esterilizada separadamente e introduzida no reator fechado, após esterilização deste.

[0037] De preferência, essa solução carbonada de crescimento éutilizada nessa fase a) a uma concentração inicial compreendida entre 10 e 90 g de substrato carbonado por litro de volume reacional.

[0038] De preferência, essa fase a) é realizada em uma duraçãocompreendida entre 30 e 70 horas, de preferência, entre 30 e 40 horas.

[0039] De preferência, essa fase a) opera a um pH de 4,8 e a umatemperatura de 27 oC.

[0040] De preferência, essa fase a) é realizada em um reator fechada, aerada e agitado. A aeração é regulada de maneira a se obter uma VVM (fluxo volúmico de ar Nm3/min dividido pelo volume reacio- nal em m3) compreendida entre 0,1 e 1, preferencialmente entre 0,3 e 0,7, e mais preferencialmente, de maneira a se obter uma VVM de 0,5. A agitação é adaptada de maneira a se obter uma pressão parcial em oxigênio dissolvido compreendida entre 20 e 80 % da saturação teórica, preferencialmente entre 30 e 50 %, e mais preferencialmente a um valor de 40 %.

[0041] A solução carbonada de produção desse micro-organismoutilizada nessa fase b), de acordo com a invenção, é uma solução aquosa que compreende um substrato carbonado indutor. Esse substrato carbonado indutor é um resíduo líquido oriundo da etapa de pré- tratamento de materiais lignocelulósicos, compreendendo oligômeros de açúcares C5.

[0042] De acordo com a invenção, esses oligômeros de açúcaresC5 representam pelo menos 0,3 % em peso dos açúcares totais contidos nessa solução carbonada de produção. De preferência, esses oli- gômeros de açúcares C5 representam entre 0,3 e 50 % em peso dos açúcares totais contidos nessa solução carbonada de produção, de maneira preferida entre 0,3 e 20 % em peso, de maneira mais preferida entre 0,3 e 10 % em peso e, de maneira ainda mais preferida, entre 0,3 e 6 % em peso.

[0043] De preferência, esse substrato carbonado indutor é utilizado sozinho ou em mistura com pelo menos um outro substrato carbonado não indutor.

[0044] De preferência, esse outro substrato carbonado não indutoré escolhido dentre açúcares não indutores, de maneira preferida, escolhidos dentre a glicose, a sacarose e a xilose, considerados sozinhos ou em mistura. De maneira muito preferida, esse outro substrato carbonado é escolhido dentre a glicose e a sacarose considerados sozinho ou em mistura.

[0045] De acordo com a invenção, essa solução carbonada deprodução utilizada nessa fase b), de acordo com a invenção, é preparada à concentração de 150 a 400 g de substrato carbonado por litro de solução carbonada de produção. O fluxo específico da alimentação com solução carbonada de produção dessa fase b) está vantajosamente compreendido entre 35 e 65 mg de substrato carbonado por grama de micro-organismo e por hora, preferencialmente de 35 a 45mg de substrato carbonado por grama de micro-organismo e por hora.

[0046] De preferência, essa fase b) é realizada em uma duraçãopelo menos superior a 30 horas, de preferência, pelo menos superior a 100 h.

[0047] De preferência, essa fase b) opera a um pH compreendidoentre 3 e 5,5 e a uma temperatura compreendida entre 20 e 30 oC.

[0048] De preferência, essa fase b) é realizada em um reator ae-rado e agitado. A aeração é regulada de maneira a se obter uma VVM compreendida entre 0,1 e 1, preferencialmente entre 0,3 e 0,7, e mais preferencialmente de maneira a se obter uma VVM de 0,5. A agitação é adaptada de maneira a se obter uma pressão parcial em oxigênio dissolvido compreendida entre 20 e 80 %, preferencialmente entre 30 e 50 %, e, mais preferencialmente, a um valor de 40 %.

[0049] Essa fase b) pode ser conduzida segundos os modos fed-batch e quemostato, segundo a terminologia anglo-saxônica, conhecidos do técnico.

[0050] Os oligômeros de açúcares C5 utilizados como substratocarbonado indutor na solução carbonada de produção utilizada nessa fase b) estão compreendidos em um resíduo líquido oriundo da etapa de pré-tratamento de materiais lignocelulósicos.

[0051] Essa etapa de pré-tratamento do material lignocelulósicopermite melhorar a susceptibilidade à hidrólise enzimática da fração celulósica. Essa etapa de pré-tratamento é uma etapa de pré- tratamento físico, como, por exemplo, uma explosão ao vapor, ou químico, ou físico-químico. De preferência, essa etapa de pré-tratamento é uma etapa de pré-tratamento ácido ou básico, como, por exemplo, uma hidrólise alcalina, um cozimento alcalino ou uma explosão ao vapor com impregnação prévia desse material com uma solução aquosa alcalina. De preferência, essa etapa de pré-tratamento é uma etapa de pré-tratamento ácido, de maneira preferida, uma hidrólise ácida, um cozimento ácido ou uma explosão ao vapor com impregnação prévia desse material com uma solução aquosa de ácido sulfúrico. De maneira muito preferida, a etapa de pré-tratamento é a explosão ao vapor.

[0052] O efluente dessa etapa de pré-tratamento é separada em duas fases: uma fase que constitui o resíduo sólido e uma fase que constitui o resíduo líquido. Essa separação pode ser efetuada por qualquer meio conhecido do técnico. Por exemplo, essa separação pode ser efetuada por centrifugação, filtro prensa, decantação, ou qualquer outro meio técnico permitindo a separação de uma fase líquida e de uma fase sólida.

[0053] No caso de um pré-tratamento ácido, o técnico ajusta ascondições operacionais (quantidade de ácido, taxa de umidade, temperatura, pressão, duração) em função do material lignocelulósico a pré-tratar e tecnologias aplicadas. Essas condições operacionais serão mais severas, por exemplo, para o miscanthus do que para a palha de trigo. Esses ajustes visam a obter uma hidrólise completa das hemice- luloses sob a forma de monômeros, minimizando a formação de produtos de degradação (notadamente furfurak, 5-HMF). Para isto, a etapa de pré-tratamento pode também ser subdividida em duas fases: uma primeira fase, visando liberar os oligômeros de açúcares C5, seguida de uma fase visando a produzir monômeros a partir dos oligô- meros liberados (Process Design and Economics for Biochemical Conversion of Lignocellulosic Biomass to Ethanol, Humbird et al., NREL/TP-5100-57764, Maio 2011).

[0054] De acordo com a invenção, essa etapa de pré-tratamento éoperada por meios conhecidos do técnico, de maneira que o resíduo líquido compreenda oligômeros de açúcares C5.

[0055] Para se obter oligômeros de açúcares C5 no resíduo líquidodessa etapa de pré-tratamento, pode-se diminuir a quantidade de ácido utilizada nessa etapa de pré-tratamento. Pode-se também baixar a temperatura e/ou a pressão à qual essa etapa de pré-tratamento é operada em relação às condições otimizadas para liberar apenas mo- nômeros.

[0056] De acordo com a invenção, esses oligômeros de açúcares C5 compreendidos nesse resíduo líquido oriundo da etapa de pré- tratamento de materiais lignocelulósicos representam entre 1 e 100 % em peso dos açúcares totais presentes nesse resíduo líquido, preferencialmente entre 1 e 50 % em peso, e, mais preferencialmente, entre 1 e 30 % em peso.

[0057] Esse resíduo líquido que contém os oligômeros de açúcares C5 oriundo dessa etapa de pré-tratamento é utilizado como fonte de carbono indutor sem que seja necessário, nem esterilizar esse resíduo líquido, nem modificar o pH desse resíduo.

[0058] Em um modo de realização preferido, o material lignocelu-lósicos pré-tratado, que corresponde à fração dita "sólida", é hidrolisa- do em uma etapa de hidrólise enzimático. O efluente dessa etapa é em seguida tratado em uma etapa de fermentação etanólica dos açúcares monômeros dos hidrolisados enzimáticos. Esses tratamentos podem ser realizados no mesmo equipamento ou em equipamentos diferentes.

[0059] Em um outro modo de realização preferido, a etapa de fermentação e pelo menos uma parte da etapa de hidrólise são realizadas simultaneamente. Isto é realizado, por exemplo, acrescentando-se lêvedos etanólicos no decorrer da etapa de hidrólise enzimática.

[0060] Os exemplos a seguir ilustram a invenção sem limitar-lhe oalcance.Exemplo 1 (não conforme) - Produção de um coquetel enzimático sobre glicose

[0061] O exemplo 1 apresenta uma cultura que utiliza a glicosecomo substrato carbonado de produção. Trata-se de um repressor da produção de celulases. Esse exemplo chega a uma pequena produção de enzimas.

[0062] A produção de um coquetel enzimática é realizada em reator agitado mecanicamente. O meio mineral (

[0063] 4N) tem a seguinte composição: KOH 1,66 g/l, H3PO4 84 %2 Ml/l, (NH4)2SO4 2,8 g/l, MgSO4, 7 H2O 0,6 g/l, CaCl2 0,6 g/l, MnSO4 3,2 mg/l, ZnSO4, 7 H2O 2,8 mg/l, COCl2 10 H2O 4,0 mg/l, FeSO4, 7 H2O 10 mg/l, Corn Steep 1,2 g/l, antiespuma 0,5 ml/l.Pré-cultura líquida

[0064] O crescimento do micro-organismo (a cepa de Trichodermareesei CL847) em pré-cultura é feita, utilizando a glicose como substrato carbonado de crescimento, à concentração de 30 g/l. O meio mineral da pré-cultura é o meio 4N adicionado de ftalato de potássio com 5 g.L-1, a fim de tamponar o pH. O crescimento do inoculum dura 3 dias e é realizada a 30 oC em um incubador agitado. A transferência para o reator é realizada, caso a concentração residual em glicose é inferior a 15 g/L.Fase de crescimento

[0065] O reator contendo o meio 4N é esterilizado a 120 oC durante 20 minutos. O substrato carbonado de crescimento glicose é esterilizado à parte a 120 oC durante 20 minutos, depois acrescentado este- rilmente no reator, de forma a ter uma concentração de 30 g/l. O reator é inseminado a 10 % (v/v) com a pré-cultura líquida da cepa de Tri- choderma reesei CL847. As condições operacionais estão a uma temperatura de 27 oC e um pH de 4,8 (regulado pelo amoníaco 5,5 mol/l) . A aeração é de 0,5 vvm e a agitação é aumentada entre 200 e 800 rpm em função da pO2 (pressão em oxigênio dissolvido), que é mantida a 30 %.Fase de produção

[0066] Quando o substrato carbonado de crescimento do reator éesgotado, o substrato carbonado de produção glicose a 250 g/l é injetado em contínuo ao fluxo de 35 a 45 mg por g de micro-organismo e por hora até 164 horas. As condições operacionais estão a uma temperatura de 25 oC e um pH de 4 (regulado pelo amoníaco 5.5 mol/l, este fornecendo também o nitrogênio necessário à síntese das proteínas excretadas). O teor em oxigênio dissolvido é mantido a 30 % por ação sobre a agitação.

[0067] A produção de enzimas é seguida pela dosagem das enzimas extracelulares pelo método de Lowry e padrão BSA, após separação do micro-organismo por filtragem ou centrifugação. As atividades celulolíticas determinadas são:

[0068] A atividade UPF é medida sobre papel Whatman no 1 (procedimento recomendado pela comissão biotecnológico IUPAC) á concentração inicial de 50 g/l; determina-se a tomada de teste da solução enzimática a analisar que libera o equivalente de 2 g/l de glicose (dosagem colorimétrica) em 60 minutos. O princípio da atividade filtro de papel é de determinar por dosagem ao DNS (ácido dinitro-salicílico) a quantidade de açúcares reduzidos oriunda de um papel Whatman No 1 (Procedimento recomendado pela comissão biotecnológica IUPAC).

[0069] O substrato utilizado para determinar a atividade aril β-glicosidase é o p-nitrofenil-β-D- glicopiranosida (PNPG). Ele é clivado pela β-glicosidase que libera o p-nitrofenol.

[0070] Uma unidade de atividade aril β-glicosidase é definida comoa quantidade de enzima necessária para produzir 1 μmol de p- nitrofenol a partir de PNPG por minuto e é expresso em IU/ml.

[0071] As atividades específicas são obtidas, dividindo-se as atividades expressas em IU/ml pela concentração em proteínas. Elas são expressas em IU/mg.

[0072] As determinações analíticas sobre o mosto final do exemplo1 dão os seguintes resultados:

[0073] O exemplo 2 apresenta uma cultura que utiliza a xilose como substrato carbonado de produção. Trata-se de repreensor da produção de celulases. Esse exemplo chega a uma baixa produção de enzimas.

[0074] A produção de enzimas é conduzida nas mesmas condições que no Exemplo 1. O substrato carbonado durante a fase de crescimento é a lactose e durante a fase de produção, a xilose pura.

[0075] Após 30 horas de crescimento, após o esgotamento dosubstrato inicial, a solução de xilose a 250 g/l é injetada em contínuo ao fluxo de 35 mg por g de células e por hora até 164 horas.

[0076] As determinações analíticas sobre o mosto final dão os seguintes resultados:

[0077] O exemplo 3 apresenta uma cultura que utiliza a lactosecomo substrato carbonado de produção. Trata-se de um indutor da produção de celulases. Esse exemplo chega a uma elevada produção de enzimas que apresentam uma boa atividade.

[0078] A produção de enzimas é conduzida nas mesmas condições que no exemplo 1. O substrato carbonado durante as fases de crescimento e de produção é a lactose pura. A lactose é um indutor importante da produção de celulases. É o substrato que é o mais utilizado industrialmente para produção de celulases.

[0079] Após 30 horas de crescimento, após depois do esgotamento do substrato inicial, a solução de fed-batch com 250 g/l é injetada em contínuo ao fluxo de 35 mg por g de células e por hora até 164 horas.

[0080] As determinações analíticas sobre o mosto final dão os se- guintes resultados:

Exemplo 4 (conforme) - Produção em 100 % de resíduo líquido contendo oligômeros de açúcares C5.

[0081] O exemplo 4 apresenta uma cultura que utiliza o resíduolíquido como substrato carbonado de produção. Esse exemplo chega a uma produção de enzimas e uma atividade superiores àquelas obtidas nos exemplos 1 e 2. Mostra-se, portanto, que o resíduo líquido utilizado sozinho induz a produção de celulases. Chega-se a um efeito similar ao que foi descrito na patente WO09026716 A1, mas sem acréscimo de solução indutora diferente do resíduo líquido.

[0082] A produção de enzimas é conduzida nas mesmas condições que no exemplo 1. O substrato carbonado durante as fases de crescimento é a glicose. O substrato carbonado durante a fase de produção é a fração líquida obtida após pré-tratamento denominada "um resíduo líquido". Este é oriundo de um miscanthus pré-tratado por bombardeio ao vapor a 1,45 MPa (14,5 bar) durante 2 minutos, após impregnação a 0,65 % de H2SO4, depois separação fase líquida/fase sólida.

[0083] Sua composição é a seguinte:

[0084] Ele é concentrado a 300 g/l. Após 30 horas de crescimento,depois do esgotamento do substrato inicial, a solução concentrada de hidrolisado hemicelulósico é injetada em contínuo ao fluxo de 35 mg por g de células e por hora.

[0085] As determinações analíticas sobre o mosto final dão os seguintes resultados:

Exemplo 5 (conforme) - Produção sobre d ois resíduos líquidos dife-rentes compreendendo proporções de oligômeros diferentes.

[0086] O exemplo 5 apresenta duas culturas que utilizam, cadauma, um resíduo líquido como substrato carbonado de produção. Esse exemplo chegado a uma produção de enzimas e uma atividade superiores àquelas obtidas nos exemplos 1 e 2. Mostra-se que o teor em oligômeros de açúcares C5 tem um efeito positivo sobre a quantidade e a atividade das enzimas obtidas.

[0087] Produzem-se dois resíduos líquidos distintos a partir de palha de trigo explodida ao vapor. As condições operacionais da explosão ao vapor são 1,45 MPa (14,5 bar), 2 minutos. O resíduo líquido C1 é obtido a partir de uma palha de trigo previamente impregnada por H2SO4 a 0,64 %. O resíduo líquido C2 é obtido a partir de uma palha de trigo previamente impregnada por H2SO4 a 0,32 %.

[0088] O resíduo líquido C2 contém uma proporção mais importante de oligômeros oriundos da hidrólise das hemiceluloses da palha em relação ao hidrolisado C1, devido à menor quantidade de ácido utilizada para a impregnação da palha de trigo.

[0089] A composição dos resíduos líquidos C1 e C2 é detalhadana seguinte tabela:

[0090] Os monômeros correspondem à soma da glicose, xilose,arabinose, manose, galactose, rahmnose. Os oligômeros correspondem à soma dos oligômeros dos açúcares C5 (exemplo: xilobiose, xilo- triose, xiloarabinose). Os açúcares degradados correspondem à soma de furfural, de 5 HMF, de ácido levulínico e de ácido fórmico.

[0091] Duas soluções de fed-batchs são preparadas, dissolvendo-se glicose nos hidrolisados C1 e C2, de maneira a atingir uma concentração total em açúcares de 250 g/l. A glicose sendo um repreensor da produção de celulases.

[0092] As experiências são conduzidas nas mesmas condiçõesque no exemplo 1.

[0093] As determinações analíticas sobre o mosto final dão os seguintes resultados:

[0094] A solução de Fed-batch C2 que contém mais oligômerosoriundos da fração hemicelulose chega a uma produção de proteínas superior àquela da solução de Fed-batch C1 com melhores atividades enzimáticas. Nesse exemplo, a produção de enzimas são realizadas com fontes de carbono potencialmente oriundas unicamente do processo de produção de etanol, a partir de biomassa lignocelulósica, a glicose podendo ser substituída por um hidrolisado celulósico.Exemplo 6 (não conforme) - Produção sobre resíduo líquido (hidroli- sado hemicelulósico) não contendo oligômeros de açúcares C5.

[0095] O exemplo 6 mostra, partindo do resíduo líquido C2 doexemplo 5, que são os oligômeros de açúcares C5 que induzem a produção de enzimas.

[0096] A solução C2 do exemplo 5 sofre previamente uma hidrólise ácida, de maneira a hidrolisar os oligômeros em monômeros. A composição da nova solução C3 é a seguinte:

[0097] A cultura é em seguida conduzida nas mesmas condiçõesque no exemplo 5. Uma solução de fed-batch é preparada, dissolvendo-se a glicose em C3, de maneira a atingir uma concentração total em açúcares de 250 g/l. As determinações analíticas sobre o mosto final dão os seguintes resultados:

[0098] Esse exemplo mostra que, na ausência de oligômeros he-micelulósicos, os resíduos líquidos não induzem a produção de celula- ses.

Claims

1. Processo de produção de um coquetel enzimático com um micro-organismo celulolítico, compreendendo duas fases:- uma fase a) de crescimento desse micro-organismo em reator fechado em presença de uma solução carbonada de crescimento;- uma fase b) de produção desse coquetel enzimático realizada com uma alimentação com solução carbonada de produção, cuja concentração em substrato carbonado está compreendida entre 150 e 400 g/l, essa solução carbonada de produção, compreendendo um substrato carbonado indutor,caracterizado pelo fato de esse substrato carbonado indutor ser um resíduo líquido oriundo de uma etapa de pré-tratamento de materiais lignocelulósicos, utilizado sem esterilização, nem modificação do pH desse resíduo líquido, cujos oligômeros de açúcares C5 representam pelo menos 1 % em peso dos açúcares totais presentes nesse resíduo líquido, e pelo menos 0,3 % em peso dos açúcares totais presentes nessa solução carbonada de produção.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de esse resíduo líquido compreender os ditos oligômeros de açúcares C5, monômeros de açúcares C5 e C6, e produtos de degradação dos açúcares monômeros.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de a solução carbonada de crescimento utilizada nessa fase a) estar a uma concentração inicial compreendida entre 10 e 90 g de substrato carbonado por litro de volume reacional.

4. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de essa etapa de pré-tratamento ser uma hidrólise ácida, um cozimento ácido ou um bombardeio ao vapor com impregnação prévia desses materiais lignocelulósicos com uma solução aquosa de ácido sulfúrico.

5. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de os oligômeros de açúcares C5 representarem entre 0,3 e 20 % em peso, preferencialmente entre 0,3 e 10 % em peso dos açúcares totais presentes nessa solução carbonatada de produção.

6. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de os oligômeros de açúcares C5 representarem entre 1 e 50 % em peso, preferencialmente entre 1 e 30 % em peso dos açúcares totais presentes nesse resíduo líquido.

7. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de esse substrato indutor carbonatado ser utilizado sozinho ou em mistura com pelo menos um outro substrato carbonado não indutor.

8. Processo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de esse substrato carbonado não indutor ser escolhido dentre a glicose, a xilose, e a sacarose, considerados sozinhos ou em mistura.

9. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato que de essa solução carbonada de produção consistir em um resíduo líquido e em pelo menos um substrato carbonado não indutor selecionado entre a glicose, a xilose, e a sacarose, considerados sozinhos ou em mistura, desse resíduo líquido sendo oriundo de uma etapa de pré-tratamento de materiais lignocelu- lósicos, e utilizado sem esterilização, nem modificação do pH, desse resíduo líquido consistindo em oligômeros de açúcares C5, em monô- meros de açúcares C5 e C6, e em produtos de degradação dos açúcares monômeros, cujos oligômeros de açúcares C5 representam pelo menos 1 % em peso dos açúcares totais presentes desse resíduo líquido e pelo menos 0,3 % em peso dos açúcares totais presentes nessa solução carbonada de produção.

10. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de o fluxo específico da alimentação em solução carbonada de produção da fase b) está compreendida entre 35 e 65 mg de substrato carbonado por grama de microorganismo e por hora.

11. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de o micro-organismo celulolítico ser escolhido dentre as cepas de cogumelos pertencentes aos gêneros Trichoderma reesei, Aspergillus, Penicilium ou Schizophyllum.

12. Processo, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de o micro-organismo celulolítico pertencer à espécie Trichoderma reesei.