CN104428422A - 使用来自木质纤维素材料的生物化学转化过程的液体残余物生产酶混合物的方法 - Google Patents

使用来自木质纤维素材料的生物化学转化过程的液体残余物生产酶混合物的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用分解纤维素的微生物生产酶混合物的方法，其包括两个步骤：步骤a），其为在碳质生长溶液存在的情况下在密闭反应器中生长所述微生物；步骤b），其为通过供应碳质生产溶液进行所述酶混合物的生产，所述碳质生产溶液的碳质底物的浓度范围为150-400g/L，所述碳质生产溶液含有碳质诱导物底物；其特征在于所述碳质诱导物底物为来自木质纤维素材料的预处理步骤的液体残余物，其C5糖寡聚物是存在于所述液体残余物中的总糖的至少1重量％，和存在于所述碳质生产溶液中的总糖的至少0.3重量％。

Description

使用来自木质纤维素材料的生物化学转化过程的液体残余物生产酶混合物的方法
发明领域
本发明涉及生产纤维素和半纤维素酶，尤其是在从纤维素或木质纤维素材料生产乙醇的背景中。
现有技术
自从20世纪70年代，在水解组分多糖为可发酵糖后将木质纤维素材料转化为乙醇已经称为众多研究的焦点。可以研究的实例为来自国家可再生能源实验室（National Renewable Energy Laboratory）的参考工作 (Process Design and Economics for Biochemical Conversion of Lignocellulosic Biomass to Ethanol, Humbird等人, NREL/TP-5100-57764, May 2011)。
木质纤维素材料是纤维素材料，即由多于90重量％的纤维素和/或木质纤维素构成，即由纤维素、半纤维素构成，其为基本上由戊糖类和己糖类以及木质素构成的多糖，其为具有基于酚类化合物的复杂结构和高分子量的大分子。
木材、秸秆和玉米芯是最广泛使用的木质纤维素材料，但其他来源，专用的林木栽培物、产乙醇的糖和谷类作物的残余物、来自造纸工业的产品和残余物以及木质纤维素材料的转化产品也可以使用。它们大部分由约35％-50%的纤维素、20%-30%的半纤维素和15%-25%的木质素构成。
生物化学转化木质纤维素材料为乙醇的方法包括物理化学预处理步骤和随后使用酶混合物(enzymatic cocktail)进行酶促水解的步骤，将释放的糖进行乙醇发酵的步骤（乙醇发酵和酶促水解可能同时进行），和纯化乙醇的步骤。
酶混合物是纤维素分解酶（也称为纤维素酶）和/或半纤维素分解酶的混合物。纤维素分解酶具有三种主要类型的活性：内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和纤维二糖酶，其后者也称为β-葡萄糖苷酶。半纤维素分解酶具体具有木聚糖酶活性。
酶促水解是有效的且在温和条件下进行。相反的是，酶的成本仍较高，占转化木质纤维素材料为乙醇成本中的20%-50%。为此原因，已进行大量关于降低该成本的研究：首先通过选择高产微生物和通过改进生产所述酶的方法来优化酶生产，随后通过优化预处理步骤，通过改进这些酶的比活性，和通过优化酶促水解步骤的实施来降低水解中酶的量。
在过去的几十年中，大量研究针对于理解酶混合物的作用机制和表达。该目标为通过修饰微生物导致分泌最适合于水解木质纤维素材料的混合物。
最广泛用于工业生产酶混合物的分解纤维素的微生物是真菌里氏木霉(Trichoderma　reesei)。在诱导物碳质底物例如纤维素，存在的情况下，野生菌株具有分泌被认为是最适合于水解纤维素的酶混合物的能力。具有对于水解木质纤维素材料不可或缺的特性的其他蛋白也由里氏木霉所产生，例如木聚糖酶。诱导物底物的存在对于表达纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶是不可或缺的。碳质底物的性质对酶混合物的构成具有相当大的影响。对于木糖的情况正是这样，当木糖伴随有碳质诱导物底物诸如纤维素或乳糖时，可以显著改进称为木聚糖酶活性的活性。
乳糖保持为酶混合物的生产的工业方法中最合适的底物之一；然而，其成本变化巨大，且占大约酶成本价中的三分之一至三分之二。当乳糖用作碳质底物时，酶混合物生产方法依赖于碳的外部来源。为此原因，使用获自生物化学转化木质纤维素材料过程的碳质底物构成了重大进步。
专利申请EP 1 690 944公开了来自于衍生自预处理的木质纤维素材料的以单体形式的半纤维素级分的提取物可用作用于分解纤维素的微生物生长和生产酶的非诱导物碳质底物。在后一种情况下，必须与诱导物碳质底物混合以生产纤维素酶（乳糖或纤维二糖）。
专利申请WO 09 026 716 A1和WO 09 0061486 A1描述了使用含有用于生产纤维素酶的诱导物糖的碳质底物以及碳的主要来源从里氏木霉生产酶混合物。该申请公开了3重量％的诱导物糖足以诱导产生纤维素酶。相比于其中将木糖单独用于生产溶液中的实例，纤维素酶的生产扩大了多于4倍。所描述的诱导物糖为可能由纤维素水解产生的单糖、二糖和寡糖(C6糖)。碳的主要来源是获自半纤维素或获自合成木糖的包含单糖、二糖和寡糖的总体。
文件FR 2 962 444公开了生产纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的方法。诱导物底物为葡萄糖或纤维素水解物、乳糖和木糖的混合物，或具有至少10重量％的这三组组分的每一种的半纤维素水解物的溶液。该文件表明诱导物底物除上文列出的组分外，再无任何其他糖，纤维素水解物为获自纤维素水解的葡萄糖，且半纤维素水解物为C5糖的溶液。
文件EP 2 371 950 A1描述了基于调节溶解于培养基中的氧压力的波动而生产纤维素酶的方法。该文件公开了碳质诱导物底物选自乳糖、木糖、纤维二糖、槐糖、发酵单体糖后获得的残余物和/或水溶性戊糖的粗提取物，即水溶性C5糖。
出版物"Cellulase Production by Continuous Culture of Trichoderma reesei Rut C30 using acid hydrolysate prepared to retain more oligosaccharides for induction", Lo等人, Bioresource Technology 101 (2010) 717-723教导了通过由酸水解纤维素产生的寡糖的诱导，所述水解物（由C6糖寡聚物构成）在中和之前通过Ca(OH)2溶液变为碱性。由C6寡糖尤其是纤维二糖所起的诱导物作用也是已知的。
本发明的一个目标是提出易于获得的诱导物碳的新来源，其能够产生具有适合于水解木质纤维素材料的活性的酶混合物。相比于专利EP 1 690 944，本发明要求保护还含有寡聚物的半纤维素级分的有利用途，这意味着可以免去添加诱导物底物。相比于专利WO09 026716，本发明推荐使用非合成碳的单一来源，所述非合成碳的单一来源尤其适合于酶混合物的表达，其对于待水解的生物质的处理完全有效。本发明还使得联产物能够内部改进。
本发明的概述和优点
本发明涉及通过分解纤维素的微生物生产酶混合物的方法，其特征在于它使用来自预处理木质纤维素材料的液体残余物作为用于诱导产生酶混合物的诱导物碳质底物。
本发明的一个优点是减少或免去向转化木质纤维素材料的生物化学过程中添加外部来源的碳质底物。另一个优点是用于生产酶混合物的来自所述生物化学转化过程的液体残余物得到改进。以这样的方式改进意味着在排出或储存前需要被再处理的所产生的流出液的量可以降低。
由于含有诱导物寡聚物的液体残余物得到改进以产生酶混合物，因此所述混合物的成本降低。
本发明的方法的另一个额外的优点是产生尤其适合于酶促水解在生物化学转化过程中转化的预处理的木质纤维素材料的酶混合物。具体而言，C5寡聚物对所获的酶的纤维素酶活性的积极作用已被发现。
发明详述
本发明是用分解纤维素的微生物生产酶混合物的方法，其包括两个阶段：
● 阶段a），其为在碳质生长溶液存在的情况下在密闭反应器中生长所述微生物；
● 阶段b），其为通过供应碳质生产溶液（其碳质底物的浓度范围为150-400 g/L）进行所述酶混合物的生产，所述碳质生产溶液含有碳质诱导物底物；
其特征在于所述碳质诱导物底物为获自木质纤维素材料的预处理步骤的液体残余物（其使用时无需灭菌或调节所述液体残余物的pH），其C5糖寡聚物占存在于所述液体残余物中的总糖的至少1重量％，和占存在于所述碳质生产溶液中的总糖的至少0.3重量％。
优选地，所述阶段a）中所用的碳质生长溶液以范围为10-90 g碳质底物/升反应体积的起始浓度。
优选地，所述预处理步骤为用硫酸水溶液预先浸渍所述木质纤维素材料的酸水解、酸蒸煮或蒸汽爆破(steam explosion)。
优选地，所述液体残余物使用时既不需灭菌也不需要调节所述液体残余物的pH。更优选地，所述液体残余物使用时既不需灭菌也不需要解毒或调节所述液体残余物的pH。
优选地，C5糖寡聚物占所述液体残余物中存在的总糖的1重量％-50重量%的范围。
优选地，所述诱导物碳质底物单独使用或作为与至少一种其他非诱导物碳质底物的混合物来使用。
优选地，所述其他非诱导物碳质底物（单独地或作为混合物）选自葡萄糖、木糖和蔗糖。
优选地，所述碳质生产溶液由液体残余物和至少一种非诱导物碳质底物组成，所述非诱导物碳质底物（单独地或作为混合物）选自葡萄糖、木糖和蔗糖，所述液体残余物获自木质纤维素材料的预处理步骤，且使用时无需灭菌或解毒或调节pH，所述液体残余物由C5糖寡聚物组成，由C5和C6糖单体组成，和由糖单体降解产物组成，其中C5糖单体占所述液体残余物中存在的总糖的至少1重量％，和占所述碳质生产溶液中存在的总糖的至少0.3重量％。
优选地，供应阶段b）的碳质生产溶液的比流速范围为35-65 mg碳质底物/克微生物/小时。
优选地，分解纤维素的微生物选自属于属木霉属（Trichoderma）、曲霉属（Aspergillus）、青霉属（Penicillium）或裂褶菌属（Schizophyllum）的真菌的菌株。
优选地，分解纤维素的微生物属于里氏木霉种。
所述用于生产酶混合物的方法使用深层培养进行。术语“深层培养”意指培养在液体培养基中。
本发明的用于生产酶混合物的方法中所用的分解纤维素的微生物为纤维素分解真菌的菌株，例如属于属木霉属（Trichoderma）、曲霉属（Aspergillus）、青霉属（Penicillium）或裂褶菌属（Schizophyllum），优选属于里氏木霉种。最佳性能工业菌株为属于里氏木霉种的菌株，通过突变选择方法进行修饰以改进酶混合物，诸如例如菌株IFP CL847 (法国专利FR-B-2 555 803)。通过遗传重组技术改进的菌株也可以使用。这些菌株在与其生长和酶的生产相容的条件下在搅拌、通气的反应器中培养。
术语“碳质底物”意指包含于碳质溶液中的所有糖。
本发明的方法的所述阶段a）中使用的所述微生物的碳质生长底物为有利地包含碳质底物（单独地或作为混合物使用）的含水溶液，所述碳质底物选自可溶性工业糖，优选选自葡萄糖、木糖、来自木质纤维素材料的酶水解物的糖单体的乙醇发酵后获得的液体残余物和来自于获自预处理的木质纤维素材料的以单体形式的半纤维素级分的提取物。根据其性质，在灭菌前将所述碳质生长溶液引入密闭的反应器中，或将其分开地灭菌并在密闭的反应器灭菌后引入密闭的反应器中。
优选地，所述阶段a）中的所述碳质生长溶液以范围为10-90 g碳质底物/升反应体积的起始浓度使用。
优选地，所述阶段a）进行范围为30-70 h的时期，优选范围为30-40 h。
优选地，所述阶段a）在4.8的pH下和在27°C的温度下操作。
优选地，所述阶段a）在密闭、通气且搅拌的反应器中进行。调节通气使得获得范围为0.1-1的VVM（空气的体积流速，Nm3/min，除以m3计的反应体积），优选范围为0.3-0.7，且更优选以获得0.5的VVM。调整搅拌以获得范围为理论饱和的20％-80%的溶解氧的分压，优选范围为30%-50%，且更优选为40％的值。
生产本发明的所述阶段b）中使用的所述微生物的碳质溶液为包含诱导物碳质底物的含水溶液。所述诱导物碳质底物为获自包含C5糖寡聚物的木质纤维素材料的预处理步骤的液体残余物。
根据本发明，所述C5糖寡聚物占所述碳质生产溶液中包含的总糖的至少0.3重量％。优选地，所述C5糖寡聚物占所述碳质生产溶液中包含的总糖的0.3重量%-50重量%的范围，优选范围为0.3重量％-20重量％，更优选范围为0.3重量％-10重量％，且仍更优选范围为0.3重量％-6重量％。
优选地，所述诱导物碳质底物单独使用或作为与至少一种其他非诱导物碳质底物的混合物来使用。
优选地，所述其他非诱导物碳质底物（单独地或作为混合物）选自非诱导物糖，优选选自葡萄糖、蔗糖和木糖。高度优选地，所述其他碳质底物（单独地或作为混合物）选自葡萄糖和蔗糖。
根据本发明，本发明的所述阶段b）中使用的所述碳质生产溶液以150-400 g碳质底物/升碳质生产溶液的浓度制备。供应所述阶段b）的碳质生产溶液的比流速的范围有利地为35-65 mg/碳质底物/克微生物/小时，优选35-45 mg碳质底物/克微生物/小时。
优选地，所述阶段b）进行至少30 h或更长的时期，优选至少100 h或更长。
优选地，所述阶段b）在范围为3-5.5的pH下和范围为20°C-30°C的温度下进行。
优选地，所述阶段b）在通气且搅拌的反应器中进行。调节通气以获得范围为0.1-1的VVM，优选范围为0.3-0.7，且更优选以获得0.5的VVM。调整搅拌以获得范围为20％-80%的溶解氧的分压，优选范围为30%-50%，且更优选为40％的值。
所述阶段b）可以根据本领域技术人员已知的分批补料和恒化器模式进行。
在所述阶段b）中使用的碳质生产溶液中用作诱导物碳质底物的C5糖寡聚物包含在获自木质纤维素材料的预处理步骤的液体残余物中。
所述木质纤维素材料的预处理步骤可以用于改进纤维素级分对酶水解的易感性。所述预处理步骤为物理预处理步骤，诸如例如，蒸汽爆破步骤，或化学或物理化学步骤。优选地，所述预处理步骤为酸或碱预处理步骤，诸如例如用碱性水溶液预先浸渍所述材料的碱水解、碱蒸煮或蒸汽爆破。优选地，所述预处理步骤为酸预处理步骤，优选为用硫酸水溶液预先浸渍所述材料的酸水解、酸蒸煮或蒸汽爆破。高度优选地，所述预处理步骤为蒸汽爆破。
将来自所述预处理步骤的流出物分离为两相：构成固体残余物的相和构成液体残余物的相。所述分离可通过技术人员已知的任何方法获得。作为实例，所述分离可以通过离心、压滤机、倾析、或任何允许液相和固相分离的其他技术手段来获得。
在酸预处理的情况下，技术人员随待预处理的木质纤维素材料和所用的技术而调节操作条件（酸的量、湿度、温度、压力、持续时间）。例如，所述操作条件将对于芒草比对于小麦秸秆更严格。这些调整旨在使得以单体形式的半纤维素完全水解，同时将降解产物（尤其是糠醛、5-HMF）的形成降到最低。为此，预处理步骤还可以细分为两个阶段：释放C5糖寡聚物的第一阶段，随后为从释放的寡聚物中产生单体的阶段(Process Design and Economics for Biochemical Conversion of Lignocellulosic Biomass to Ethanol, Humbird等人, NREL/TP-5100-57764, May 2011)。
根据本发明，所述预处理步骤使用本领域技术人员已知的方法来操作，使得液体残余物包含C5糖寡聚物。
为了从所述预处理步骤中获得液体残余物中的C5糖寡聚物，可以降低所述预处理步骤中所用的酸的量。还可以相比于优化的条件降低所述预处理步骤操作的温度和/或压力，以仅释放单体。
根据本发明，包含于获自木质纤维素材料的预处理步骤的所述液体残余物中的所述C5糖寡聚物占所述液体残余物中存在的总糖的1重量％-100重量％，优选范围为1重量％-50重量％，并且更优选范围为1重量％-30重量％。
获自所述预处理步骤的包含C5糖寡聚物的所述液体残余物用作诱导物碳的来源，而无需灭菌所述液体残余物或调节所述残余物的pH。
在优选的实施方案中，对应于称为“固体”的级分的预处理的木质纤维素材料在酶水解步骤中水解。来自该步骤的流出物随后在酶水解物的糖单体的乙醇发酵步骤中处理。这些处理在相同设备或在不同设备中进行。
在另一个优选的实施方案中，发酵步骤和至少一部分水解步骤同时进行。例如，这通过在酶水解步骤中添加乙醇酵母来实现。
以下实施例说明本发明，而不限制其范围。
实施例1（与本发明不一致）：在葡萄糖上生产酶混合物
实施例1呈现使用葡萄糖作为碳质生产底物的培养。它是纤维素酶生产的阻遏物。该实施例导致酶的低产量。
在机械搅拌的反应器中产生酶混合物。矿物培养基（称为4N）具有以下组成：KOH 1.66 g/L, 85% H3PO4 2 mL/L, (NH4)2SO4 2.8 g/L, MgSO4.7 H2O 0.6 g/L, CaCl2 0.6 g/L, MnSO4 3.2 mg/L, ZnSO4.7 H2O 2.8 mg/L, CoCl2.10 H2O 4.0 mg/L, FeSO4.7 H2O 10 mg/L, 玉米浆 1.2 g/L, 消泡剂 0.5 mL/L。
液体预培养
通过使用浓度为30 g/L的葡萄糖作为碳质生长底物预培养，使微生物（里氏木霉CL847菌株）生长。预培养的矿物培养基为补充有5 g/L邻苯二甲酸钾（以缓冲pH）的4N培养基。接种物生长持续3天并在30°C下在摇动培养箱中进行。如果剩余葡萄糖浓度低于15 g/L，则转移到反应器中。
生长阶段
将含有4N培养基的反应器在120°C下灭菌20分钟。将葡萄糖碳质生长底物120°C灭菌20分钟，随后以无菌方式加入到反应器中，以达到30 g/L的浓度。反应器用里氏木霉CL847菌株的液体预培养物接种至10% (v/v)。操作条件为27°C的温度和4.8的pH（使用5.5 mol/L氨水调节）。通气在0.5 VVM且搅拌随pO2（溶解氧压）而变增加至200-800 rpm之间，其维持在30％。
生产阶段
当反应器的碳质生长底物耗尽时，将250 g/L葡萄糖碳质生产底物持续以35-45 mg/g微生物/小时的流速注入，持续164小时。操作条件为：25°C的温度和4的pH（用5.5 mol/L的氨水调节，该后者还提供合成分泌的蛋白所必需的氮）。通过调节搅拌将溶解氧含量维持在30％。
通过过滤或离心分离出微生物后通过使用Lowry法和标准BSA测定胞外酶来监测酶的生产。确定的纤维素分解活性如下：
● 滤纸活性（FPU: 滤纸单位）以测定内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶酶混合物的总体活性；
● 芳基β-葡萄糖苷酶活性的比活性。
FPU活性在Whatman n° 1纸（由IUPAC生物技术委员会推荐的程序）上以50 g/L的起始浓度测量；确定待分析的酶溶液的样品（其在60分钟内释放等同于2 g/L的葡萄糖（比色测定））。滤纸活性的原理是通过DNS测定（二硝基水杨酸）（由IUPAC生物技术委员会推荐的程序）确定获自Whatman n°1纸的还原的糖的量。
待用于确定芳基β-葡萄糖苷酶活性的底物为对硝基苯基-?-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)。其被?-葡萄糖苷酶切割，这释放对硝基苯酚。
一芳基β-葡萄糖苷酶活性单位定义为每分钟从PNPG产生1 μmol的对硝基苯酚所需的酶的量，并表示为IU/ml。
比活性通过将活性（表示为IU/ml）除以蛋白浓度来获得。它们表示为IU/mg。
实施例1的最终醪液的分析测定产生以下结果：
生物量g/L 15.2
酶g/L 2.9
FPU IU/mL 1.4
芳基β-葡萄糖苷酶比活性IU/mg 0.35
实施例2（与本发明不一致）：在木糖上的酶生产
实施例2呈现使用木糖作为碳质生产底物的培养。它是纤维素酶生产的阻遏物。该实施例导致酶的低产量。
在与实施例1中相同的条件下生产酶。生长阶段过程中的碳质底物为乳糖，且在生产阶段过程中，其为纯木糖。
30小时生长后，耗尽起始底物后，将250 g/L木糖溶液持续以35 mg/g细胞/小时的流速注入，持续164小时。
在最终醪液上进行的分析确定提供以下结果：
生物量g/L 17.3
酶g/L 3.1
FPU IU/mL 1.2
芳基β-葡萄糖苷酶比活性IU/mg 0.1
实施例3（与本发明不一致）：在乳糖上的酶生产
实施例3呈现使用乳糖作为碳质生产底物的培养。它是纤维素酶生产的诱导物。该实施例导致高活性酶的高产量。
在与实施例1中相同的条件下生产酶。在生长阶段过程中和生产阶段过程中的碳质底物为纯乳糖。乳糖是纤维素酶生产的重要诱导物。它是最广泛使用的纤维素酶生产的工业底物。
30小时生长后，耗尽起始底物后，将250 g/L分批补料溶液持续以35 mg/g细胞/小时的流速注入，持续164小时。
在最终醪液上进行的分析确定提供以下结果：
生物量g/L 13.5
酶g/L 37.8
FPU IU/mL 22.1
芳基β-葡萄糖苷酶比活性IU/mg 0.96
实施例4（与本发明一致）：在含C 5 糖寡聚物的100％液体残余物上生产
实施例4呈现使用液体残余物作为碳质生产底物的培养。该实施例导致酶的生产和高于实施例1和2中获得的活性。因此，其显示单独使用的液体残余物诱导产生纤维素酶。其导致与专利WO　09　026　716　A1中描述的相似的效果，但除液体残余物外无需添加诱导物溶液。
酶生产在如实施例1中相同的条件下进行。生长阶段过程中的碳质底物为葡萄糖。生产阶段过程中的碳质底物为预处理后获得的液体级分，称为“液体残余物”。这获自预处理的芒草，通过用0.65% H2SO4浸渍后以14.5 bar蒸汽爆破2分钟随后液相/固相分离。
其组成如下：
寡聚物 0.78 g/L
葡萄糖 8.98 g/L
木糖 31.44 g/L
半乳糖 1.73 g/L
阿拉伯糖 3.85 g/L
乙酸 4.14 g/L
HMF 0.14 g/L
糠醛 0.85 g/L
总计 51.91 g/L
将其浓缩至300 g/L。30小时生长后，耗尽起始底物后，将浓缩的半纤维素水解物持续以35 mg/g细胞/小时的流速注入。
在最终醪液上的分析确定提供以下结果：
生物量g/L 26.0
酶g/L 19.2
FPU IU/mL 4.9
芳基β-葡萄糖苷酶比活性IU/mg 0.48
实施例5（与本发明一致）：在包含不同比例的寡聚物的两种不同的液体残余物上的生产
实施例5呈现每种使用液体残余物作为碳质生产底物的两种培养。该实施例导致酶的生产和高于实施例1和2中获得的活性。它显示C 5 糖寡聚物含量对所获得的酶的量和活性具有积极作用。
两种不同的液体残余物获自蒸汽爆破的小麦秸秆。蒸汽爆破的操作条件为14.5 bar持续2分钟。液体残余物C1获自已用0.64% H2SO4浸渍的小麦秸秆。液体残余物C2获自已用0.32% H2SO4浸渍的小麦秸秆。
由于用于浸渍小麦秸秆的酸的量更少，相比于水解物C1，液体残余物C2含有更高比例的获自秸秆的半纤维素水解的寡聚物。
液体残余物C1和C2的组成详述于下表中：
  C1 C2
单体 50.9 g/L 33.6 g/L
寡聚物 0.9 g/L 14.1 g/L
降解的糖 2.9 g/L 1.8 g/L
总计 54.7 g/L 49.5 g/L
单体对应于葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖和鼠李糖的总和。寡聚物对应于C5糖寡聚物（例如：木二糖、木三糖、木阿拉伯糖(xyloarabinose)）的总和。降解的糖对应于糠醛、5HMF、乙酰丙酸和甲酸的总和。
两种分批补料溶液通过将葡萄糖溶解在C1和C2水解物中以获得250 g/L的总糖浓度来制备。葡萄糖是纤维素酶生产的阻遏物。
实验在如实施例1中相同的条件下进行。
获得的在最终醪液上的分析测定提供以下结果：
。
分批补料溶液C2（其包含获自半纤维素级分的多种寡聚物）导致产生比分批补料溶液C1的更多的蛋白，并具有更好的酶活性。在本实施例中，酶生产用可能仅获自从木质纤维素生物质生产乙醇过程中的碳源进行，葡萄糖可能替换为纤维素水解物。
实施例6（与本发明不一致）－在不含C5糖寡聚物的液体残余物（半纤维素水解物）上生产
实施例6显示从实施例5的液体残余物C2开始，的确是C 5 糖寡聚物诱导酶的生产。
实施例5的溶液C2开始经历酸水解，以将寡聚物水解为单体。新溶液C3的组成如下：
   
单体 45.7 g/L
寡聚物 0.0 g/L
降解的糖 3.5 g/L
总计 49.2 g/L
如实施例5中的相同条件用于培养。分批补料溶液通过将葡萄糖溶解在C3中以获得250 g/L的糖的总浓度来制备。在最终醪液上的分析确定产生以下结果：
生物量g/L 21.2
酶g/L 3.9
FPU IU/mL 1.1
芳基β-葡萄糖苷酶IU/mg 0.2
本实施例显示在半纤维素寡聚物不存在的情况下，液体残余物不诱导产生纤维素酶。

Claims (11)

1.用分解纤维素的微生物生产酶混合物的方法，其包括两个阶段：
● 阶段a），其为在碳质生长溶液存在的情况下在密闭反应器中生长所述微生物；
● 阶段b），其为通过供应碳质生产溶液进行所述酶混合物的生产，所述碳质生产溶液的碳质底物的浓度范围为150-400 g/L，所述碳质生产溶液含有碳质诱导物底物；
其特征在于所述碳质诱导物底物为获自木质纤维素材料的预处理步骤的液体残余物，使用时无需灭菌或调节所述液体残余物的pH，其C5糖寡聚物占存在于所述液体残余物中的总糖的至少1重量％，和占存在于所述碳质生产溶液中的总糖的至少0.3重量％。
2.权利要求1的方法，其中所述阶段a）中使用的碳质生长溶液为范围为10-90 g碳质底物/升反应体积的起始浓度。
3.权利要求1或权利要求2的方法，其中所述预处理步骤为用硫酸水溶液预先浸渍所述木质纤维素材料的酸水解、酸蒸煮或蒸汽爆破。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述液体残余物使用时无需灭菌或解毒，或调节所述液体残余物的pH。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述C5糖寡聚物占所述液体残余物中存在的总糖的1重量％-50重量%的范围。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述诱导物碳质底物单独使用或作为与至少一种其他非诱导物碳质底物的混合物使用。
7.权利要求6的方法，其中所述其他非诱导物碳质底物单独地或作为混合物选自葡萄糖、木糖和蔗糖。
8.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述碳质生产溶液由液体残余物和至少一种非诱导物碳质底物组成，所述非诱导物碳质底物单独地或作为混合物选自葡萄糖、木糖和蔗糖，所述液体残余物获自木质纤维素材料的预处理步骤，且使用时无需灭菌或解毒或调节pH，所述液体残余物由C5糖寡聚物组成，由C5和C6糖单体组成，和由糖单体降解产物组成，其中所述C5糖寡聚物占所述液体残余物中存在的总糖的至少1重量％，和占所述碳质生产溶液中存在的总糖的至少0.3重量％。
9.权利要求1-8中任一项的方法，其中供应阶段b）的碳质生产溶液的比流速范围为35-65 mg碳质底物/克微生物/小时。
10.权利要求1-9中任一项的方法，其中分解纤维素的微生物选自属于属木霉属（Trichoderma）、曲霉属（Aspergillus）、青霉属（Penicillium）或裂褶菌属（Schizophyllum）的真菌的菌株。
11.权利要求10的方法，其中所述分解纤维素的微生物属于里氏木霉（Trichoderma reesei）种。
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