CN109136108B - 一种提高微生物产纤维素酶的酶活的发酵培养基及其应用和产酶方法 - Google Patents
一种提高微生物产纤维素酶的酶活的发酵培养基及其应用和产酶方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及微生物技术领域,公开了一种提高微生物产纤维素酶的酶活的发酵培养基及其应用和产酶方法。本发明所述发酵培养基包括液体培养基和苎麻秸秆;所述液体培养基包括葡萄糖、(NH4)2SO4、尿素、蛋白胨、KH2PO4、CaCl2、MgSO4、FeSO4、MnSO4、ZnSO4、CoCl2、Tween和苎麻浸出液;所述苎麻浸出液由苎麻水煎提取获得。本发明以苎麻浸出液作为液体培养基的基质,同时优化其中的组分和辅以苎麻秸秆组成新的发酵培养基,用于黑曲霉和木霉发酵产纤维素酶时,能够显著提高纤维素酶的酶活。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域,具体涉及一种提高微生物产纤维素酶的酶活的发酵培养基及其应用和产酶方法。
背景技术
纤维素(Cellulose)是自然界分布最广、含量最丰富的可再生资源,对其进行水解可同时得到含有葡萄糖和木糖等单糖的混合糖,是潜在的重要生物转化原料。目前,这些原料大部分被焚烧,利用率较低(仅有10%左右),资源严重浪费,且存在环境污染的问题。利用微生物发酵生产的纤维素酶可将纤维素类物质转化为人类急需的食物、能源和化工原料,对于解决人类社会食物短缺、环境污染和能源危机具有重大的现实意义。
近年来,随着对纤维素酶研究的深入,越来越多的性质各异的纤维素酶被发现,使得纤维素酶的应用日益广泛。但在纤维素酶的生产中存在着纤维底物的高度复杂、纤维活力较低、生产周期长的缺点,且其生产费用占酶糖化纤维材料总成本的25%~50%,制约了纤维素酶的广泛应用。黑曲霉和木霉因其纤维降解酶产量高、组分全、不产生毒素等特点成为纤维降解酶生产的常用菌种。因此,进一步寻找和研究黑曲霉和木霉产酶工艺,提高酶产量对人类生存环境的改善和可持续发展有着举足轻重的影响。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提供一种提高微生物产纤维素酶的酶活的发酵培养基,使得所述培养基用于产纤维素酶微生物发酵时,能够显著提高纤维素酶的酶活;
本发明的另外一个目的在于提供上述发酵培养基在微生物发酵产酶中的相关应用,以及采用上述发酵培养基发酵产酶的方法。
为了实现上述目的,本发明提供如下技术方案:
一种提高微生物产纤维素酶的酶活的发酵培养基,包括液体培养基和苎麻秸秆;所述液体培养基包括葡萄糖、(NH4)2SO4、尿素、蛋白胨、KH2PO4、CaCl2、MgSO4、FeSO4、MnSO4、ZnSO4、CoCl2、Tween和苎麻浸出液;所述苎麻浸出液由苎麻水煎提取获得。
针对黑曲霉和木霉发酵时纤维素酶酶活较低的问题,本发明通过调整发酵培养基的组分并在发酵过程中添加苎麻成分,可使发酵后所产纤维素酶酶活得到显著提高。
其中,作为优选,所述液体培养基为:葡萄糖0.5-2g/L、(NH4)2SO4 1.1-4.4g/L、尿素0.25-1g/L、蛋白胨0.5-2g/L、KH2PO4 1-4g/L、CaCl2 0.15-0.6g/L、MgSO4 0.04-0.16g/L、FeSO40.0025-0.01g/L、MnSO4 0.0008-0.0032g/L、ZnSO4 0.0007-0.0028g/L、CoCl20.00185-0.0074g/L、Tween 1-4滴/L,余量苎麻浸出液。
在具体实施过程中,可任意选择如下液体培养基:
(1)葡萄糖0.5g/L、(NH4)2SO4 1.1g/L、尿素1g/L、蛋白胨0.5g/L、KH2PO4 4g/L、CaCl2 0.15g/L、MgSO4 0.16g/L、FeSO4 0.0025g/L、MnSO4 0.0032g/L、ZnSO4 0.0007g/L、CoCl2 0.0074g/L、Tween 1滴/L,余量苎麻浸出液;
(2)葡萄糖1g/L、(NH4)2SO4 2.2g/L、尿素0.5g/L、蛋白胨1g/L、KH2PO4 2g/L、CaCl20.3g/L、MgSO4 0.08g/L、FeSO4 0.005g/L、MnSO4 0.0016g/L、ZnSO4 0.0014g/L、CoCl20.0037g/L、Tween 2滴/L,余量苎麻浸出液;
(3)葡萄糖2g/L、(NH4)2SO4 4.4g/L、尿素0.25g/L、蛋白胨2g/L、KH2PO4 1g/L、CaCl20.6g/L、MgSO4 0.04g/L、FeSO4 0.01g/L、MnSO4 0.0008g/L、ZnSO4 0.0028g/L、CoCl20.00185g/L、Tween 4滴/L,余量苎麻浸出液;
(4)葡萄糖1.5g/L、(NH4)2SO4 3g/L、尿素0.5g/L、蛋白胨1.5g/L、KH2PO4 3g/L、CaCl2 0.2g/L、MgSO4 0.1g/L、FeSO4 0.006g/L、MnSO4 0.0025g/L、ZnSO4 0.001g/L、CoCl20.0025g/L、Tween 3滴/L,余量苎麻浸出液。
本发明所述苎麻浸出液具体的水煎提取为按照苎麻和沸水60-100g:1L的比例水煎提取,然后离心取上清,获得苎麻浸出液;其中的苎麻和沸水比例可以等比例变换调整。
本发明所述发酵培养基中的苎麻秸秆在微生物接种液体培养基后6-24h,再加入到液体培养基中使用,使用量为10-60g;在本发明具体实施方式中,所述发酵培养基中的苎麻秸秆优选为10-60g,具体可选为30g。
本发明通过设立多种对照发酵培养基,接种黑曲霉和木霉进行发酵产酶对比试验,结果显示,无论通过CMC酶活检测,还是滤纸酶活检测和β-葡萄糖苷酶活检测,经过本发明发酵培养基培养过的黑曲霉和木霉,所生产的的纤维素酶酶活均显著高于各对照发酵培养基。基于此技术效果,本发明提出了所述发酵培养基在微生物发酵生产纤维素酶中或在制备微生物发酵生产纤维素酶的培养基产品中的应用。
其中,所述微生物优选为黑曲霉和木霉,所述木霉为哈茨木霉和/或里氏木霉。
根据应用,本发明提供了一种微生物发酵产纤维素酶的方法,将黑曲霉和/或木霉接种至本发明所述发酵培养基中的液体培养基发酵培养,接种6-24h后加入苎麻秸秆。
其中,优选为接种12h后加入苎麻秸秆;所述发酵培养的温度为25-30℃;在具体实施过程中可以选择为25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃,也可在25-30℃范围内波动;所述木霉为哈茨木霉和/或里氏木霉。
由以上技术方案可知,本发明以苎麻浸出液作为液体培养基的基质,同时优化其中的组分和辅以苎麻秸秆组成新的发酵培养基,用于黑曲霉和木霉发酵产纤维素酶时,能够显著提高纤维素酶的酶活。
具体实施方式
本发明公开了一种提高微生物产纤维素酶的酶活的发酵培养基及其应用和产酶方法,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明所述发酵培养基及其应用和产酶方法已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述发酵培养基及其应用和产酶方法进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
在黑曲霉或木霉接种发酵培养基之前,一般会先接种至种子培养基活化,制成种子液接种,例如可以采用PDA培养基加葡萄糖作为种子培养基,如下:
配置PDA培养基(取去皮马铃薯200g,切成小块,加1000mL水煮沸20min。滤去马铃薯块,并将滤液补足至1000mL。添加葡萄糖20g,溶化后分装,115℃,灭菌30min),接种黑曲霉或木霉斜面菌种(20-30mm2每块,接种2-3块,150-170r/min,25-30℃摇床上培养1-2天。
本发明还提供了一种种子培养基,即葡萄糖0.5-2g/L、玉米粉15-60g/L、(NH4)2SO41.1-4.4g/L、尿素0.25-1g/L、蛋白胨0.5-2g/L、KH2PO4 1-4g/L、CaCl2 0.15-0.6g/L、MgSO40.04-0.16g/L、FeSO40.0025-0.01g/L、MnSO4 0.0008-0.0032g/L、ZnSO4 0.0007-0.0028g/L、CoCl2 0.00185-0.0074g/L、Tween 1-4滴/L,余量水;然后接种黑曲霉或木霉斜面菌种(20-30mm2每块,接种2-3块,150-170r/min,25-30℃摇床上培养1-2天。
将所制备的种子液以10-20%的接种量接种至发酵培养基发酵产酶。所用黑曲霉和木霉菌种均可通过市售途径获得,比如购自于CICC。
在本发明各项对比试验中,各组除去应有的差别外,其余试验环境和材料保持一致。
以下就本发明所提供的一种提高微生物产纤维素酶的酶活的发酵培养基及其应用和产酶方法做进一步说明。
实施例1:本发明所述发酵培养基
液体培养基选自如下之一:
(1)葡萄糖0.5g/L、(NH4)2SO4 1.1g/L、尿素1g/L、蛋白胨0.5g/L、KH2PO4 4g/L、CaCl2 0.15g/L、MgSO4 0.16g/L、FeSO4 0.0025g/L、MnSO4 0.0032g/L、ZnSO4 0.0007g/L、CoCl2 0.0074g/L、Tween 1滴/L,余量苎麻浸出液;苎麻秸秆为10g;
(2)葡萄糖1g/L、(NH4)2SO4 2.2g/L、尿素0.5g/L、蛋白胨1g/L、KH2PO4 2g/L、CaCl20.3g/L、MgSO4 0.08g/L、FeSO4 0.005g/L、MnSO4 0.0016g/L、ZnSO4 0.0014g/L、CoCl20.0037g/L、Tween 2滴/L,余量苎麻浸出液;苎麻秸秆为30g;
(3)葡萄糖2g/L、(NH4)2SO4 4.4g/L、尿素0.25g/L、蛋白胨2g/L、KH2PO4 1g/L、CaCl20.6g/L、MgSO4 0.04g/L、FeSO4 0.01g/L、MnSO4 0.0008g/L、ZnSO4 0.0028g/L、CoCl20.00185g/L、Tween 4滴/L,余量苎麻浸出液;苎麻秸秆为40g
(4)葡萄糖1.5g/L、(NH4)2SO4 3g/L、尿素0.5g/L、蛋白胨1.5g/L、KH2PO4 3g/L、CaCl2 0.2g/L、MgSO4 0.1g/L、FeSO4 0.006g/L、MnSO4 0.0025g/L、ZnSO4 0.001g/L、CoCl20.0025g/L、Tween 3滴/L,余量苎麻浸出液;苎麻秸秆为60g。
其中,苎麻浸出液的制备方法为将60-100g苎麻加入1L沸水中,提取2小时,反应结束后离心取上清,即为苎麻浸出液。
实施例2:发酵产酶对比试验
1、试验培养基
发酵培养基1(g/L):葡萄糖1;苎麻秸秆30;(NH4)2SO4 2.2;尿素0.5;蛋白胨1;KH2PO4 2;CaCl2 0.3;MgSO4 0.08;FeSO4 0.005;MnSO4 0.001 6;ZnSO4 0.0014;CoCl20.0037;Tween-80 2滴/L,加水至1L;
发酵培养基2(g/L):葡萄糖1;苎麻秸秆30g;(NH4)2SO4 2.2;尿素0.5;蛋白胨1;KH2PO4 2;CaCl2 0.3;MgSO4 0.08;FeSO4 0.005;MnSO4 0.001 6;ZnSO4 0.0014;CoCl20.0037;Tween-80 2滴/;加苎麻浸出液至1L;
发酵培养基3(g/L):葡萄糖1;(NH4)2SO4 2.2;尿素0.5;蛋白胨1;KH2PO4 2;CaCl20.3;MgSO4 0.08;FeSO4 0.005;MnSO4 0.001 6;ZnSO4 0.0014;CoCl2 0.0037;Tween-80 2滴/L;加苎麻浸出液至1L;接种12h后加入30g苎麻秸秆;
发酵培养基4(g/L):葡萄糖1;(NH4)2SO4 2.2;尿素0.5;蛋白胨1;KH2PO4 2;CaCl20.3;MgSO4 0.08;FeSO4 0.005;MnSO4 0.001 6;ZnSO4 0.0014;CoCl2 0.0037;Tween-80 2滴/L;加水至1L;接种12h后加入30g苎麻秸秆;
发酵培养基5(g/L):葡萄糖1;(NH4)2SO4 2.2;尿素0.5;蛋白胨1;KH2PO4 2;CaCl20.3;MgSO4 0.08;FeSO4 0.005;MnSO4 0.001 6;ZnSO4 0.0014;CoCl2 0.0037;Tween-80 2滴/L;加苎麻浸出液至1L;接种12h后加入30g玉米秸秆。
发酵培养基6(g/L):葡萄糖1;微晶纤维素30;(NH4)2SO4 2.2;尿素0.5;蛋白胨1;KH2PO4 2;CaCl2 0.3;MgSO4 0.08;FeSO4 0.005;MnSO4 0.001 6;ZnSO4 0.0014;CoCl20.0037;Tween-80 2滴/L;加水至1L;
发酵培养基7(g/L):葡萄糖1;麦麸30;(NH4)2SO42.2;尿素0.5;蛋白胨1;KH2PO42;CaCl20.3;MgSO40.08;FeSO40.005;MnSO40.0016;ZnSO40.0014;CoCl20.0037;Tween-80 2滴/L;加水至1L。
2、发酵方法
黑暗环境下,发酵温度介于25-30℃,各组发酵温度一致,发酵时间均为4天;
3、酶活检测方法
(1)CMC纤维素酶活测定(主要代表内切β-1.4-葡聚糖的活力)
将CMC至于pH 5.0柠檬酸柠檬酸钠缓冲液中,配制成0.5%(w/v)反应底物溶液。取0.5mL粗酶液加入1.5mL底物混匀后于50℃反应1h。反应结束后添加3mL DNS溶液混匀后沸水浴15min,显色反应结束后测其吸光值。
CMC酶活定义为每1min从底物中释放出1μmol还原糖所需的酶量为一个酶活单位。
(2)滤纸酶活(FPA)测定方法(滤纸酶活反映了纤维素酶的3种水解酶,即内切型葡聚糖酶、外切型葡聚糖酶和β-葡聚糖苷酶组成的诱导复合酶系的协同水解纤维素能力,是衡量菌株整个纤维素酶系的酶活力水平的综合体现)
取适当稀释的上清液0.5mL,以50mg新华滤纸条为底物,加pH4.8的醋酸缓冲液,以不加底物为对照,55℃反应60分钟,取出加2mLDNS溶液,沸水浴中保持5分钟,流水冷却,定容至15mL,混匀,在545nm处比色测OD值。酶活定义为每1min从底物中释放出1μmol还原糖所需的酶量为一个酶活单位。
(3)β-葡萄糖苷酶活性(β-G)测定方法
取适当稀释的上清液0.5mL,加入浓度1%的水杨素溶液,再加pH 4.8的醋酸缓冲溶液,55℃反应30min,后面步骤同滤纸酶活测定。
4、试验结果
(1)黑曲霉
表1
(2)哈茨木霉
表2
(3)里氏木霉
表3
由表1-表3的结果可以明显看出,发酵培养基3(即本发明发酵培养基)相比较其他对照的培养基,纤维素酶酶活得到显著提升;此外,采用实施例1中其余3种发酵培养基也获得了相同的结论。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种微生物发酵产β-葡萄糖苷酶的方法,其特征在于,将黑曲霉或木霉接种至液体培养基发酵培养,接种6-24h后每一升液体培养基加入10-60g苎麻秸秆;每一升所述液体培养基为:葡萄糖 0.5-2g/L、(NH4)2SO4 1.1-4.4g/L、尿素 0.25-1g/L、蛋白胨 0.5-2g/L、KH2PO4 1-4g/L、CaCl2 0.15-0.6g/L、MgSO4 0.04-0.16g/L、FeSO4 0.0025-0.01g/L、MnSO40.0008-0.0032g/L、ZnSO4 0.0007-0.0028 g/L、CoCl2 0.00185-0.0074g/L、Tween 1-4滴/L,余量苎麻浸出液;所述苎麻浸出液由苎麻水煎提取获得,所述苎麻水煎提取为按照苎麻和沸水60-100g:1L的比例水煎提取,然后离心取上清;所述木霉为哈茨木霉或里氏木霉。
2.根据权利要求1所述方法,其特征在于,所述发酵培养的温度为25-30℃。
3.液体培养基联合苎麻秸秆在微生物发酵生产β-葡萄糖苷酶中的应用;每一升所述液体培养基为:葡萄糖 0.5-2g/L、(NH4)2SO4 1.1-4.4g/L、尿素 0.25-1g/L、蛋白胨 0.5-2g/L、KH2PO4 1-4g/L、CaCl2 0.15-0.6g/L、MgSO4 0.04-0.16g/L、FeSO4 0.0025-0.01g/L、MnSO40.0008-0.0032g/L、ZnSO4 0.0007-0.0028 g/L、CoCl2 0.00185-0.0074g/L、Tween 1-4滴/L,余量苎麻浸出液;所述苎麻浸出液由苎麻水煎提取获得,所述苎麻水煎提取为按照苎麻和沸水60-100g:1L的比例水煎提取,然后离心取上清;所述苎麻秸秆在微生物接种液体培养基后6-24h,再加入到液体培养基中使用,每一升液体培养基加入10-60g苎麻秸秆,所述微生物为黑曲霉或木霉,所述木霉为哈茨木霉或里氏木霉。
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Also Published As
Publication number | Publication date |
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CN109136108A (zh) | 2019-01-04 |
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