CN114164124A - 一种青霉菌群复配协同降解纤维素复合酶制备方法 - Google Patents

一种青霉菌群复配协同降解纤维素复合酶制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种青霉菌群复配协同降解纤维素复合酶制备方法。该复合酶是将草酸青霉菌XZH‑2、青霉XZH‑6、桔青霉菌XZH‑16、青霉XZH‑22、粗糙脉孢菌N1和橙色嗜热子囊菌T2按体积比1:8:1:1:1:1复配的菌液M18，加入到固态发酵培养基中进行混合发酵制成。将本发明的复合酶组合制剂应用于林木纤维素酶解，酶解效率提升21.5％，纤维素转化率最高可达到88.7％。该复合酶组合制剂是具有协同降解纤维素作用的氧化水解酶，它能够通过氧化作用来断裂纤维素的糖苷键，并促进纤维素酶与纤维底物结合以提高酶解效率，从而有效地降低酶解过程的加酶量。可进一步降低纤维素乙醇的生产成本，加快其产业化进程。

Description

一种青霉菌群复配协同降解纤维素复合酶制备方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种青霉菌群复配协同降解纤维素复合酶制备方法。
背景技术
实施可再生能源替代行动，大力发展风能、太阳能、生物质能、海洋能、地热能等，不断提高非化石能源消费比重。其中，生物质能是一种极具开发潜力的绿色可再生资源，以其为原料制备醇类燃料是未来发展的重要方向。但是，如何高效、环保且低成本地将木质纤维素类生物质糖化，是制备纤维素醇类燃料的关键所在。
生物质的高效利用，需要纤维素酶的生物转化作用。可是，纤维素酶并不是单一组分的酶，而是多组分酶系的集合。主要包括：内切葡聚糖酶(EG，EC 3.2.1.4)，外切葡聚糖酶(CBH， EC 3.2.1.91)和β-葡萄糖苷酶(BGL，EC 3.2.1.21)。纤维素的有效降解至少需要这3种酶的协同作用。可是，目前纤维素酶对预处理后的纤维底物的酶解效率仍需进一步提高。
发明内容
为了提高纤维素酶对生物质纤维素的反应作用效果，青霉菌属能够产生一系列完整的纤维素酶，并且可高产各种复杂的木质纤维素降解酶系统。该菌属基因组编码更高数量的水解酶类和用于水解纤维素和半纤维素的辅助酶蛋白，应用所产的辅助酶构建复合纤维素酶系，能显著提高纤维素酶系降解效率。
本发明的目的之一是提供一种青霉菌群复配协同降解纤维素复合酶制备方法，该方法包括以下步骤：
将草酸青霉菌(Penicillium oxalicum)XZH-2、青霉(Penicillium sp.)XZH-6、桔青霉菌(Penicillium citrinum)XZH-16、青霉(Penicillium sp.)XZH-22、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)N1和橙色嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)T2分别接种至PDA斜面培养基，静置培养；然后挑选上述菌株分别接种至PDA液体种子培养基中进行活化培养，得到活化菌株；将上述活化菌株复配后接种于固态发酵培养基中发酵培养，得到固态发酵物；将固态发酵物浸提，收集浸提液，经离心后取上清即为具有协同降解纤维素作用的复合酶组合制剂。
优选的，所述的将活化菌株复配是将草酸青霉菌(Penicillium oxalicum)XZH-2、青霉 (Penicillium sp.)XZH-6、桔青霉菌(Penicillium citrinum)XZH-16、青霉(Penicillium sp.) XZH-22、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)N1和橙色嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus) T2的活化菌株按1:8:1:1:1:1的体积比复配。
优选的，所述的PDA液体种子培养基每升是通过以下方法制备的：称取200g去皮土豆，加水煮沸，经纱布过滤得土豆浸汁，然后加入葡萄糖20g，溶解后加水定容至1L。
优选的，所述的固态发酵培养基包括稻秆和营养盐溶液，所述的营养盐溶液的添加量为每5g稻秆加入10.5mL营养盐溶液；所述的营养盐溶液成分为：每升营养盐溶液中含有 (NH4)2SO4 10.0g，KH2PO4 4.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，CaCl2·2H2O 0.5g，余量为水。
优选的，所述的静置培养是在30℃静置培养3～5天；所述的活化培养是在30℃，150rpm 培养3天，所述的发酵培养是在30℃，150rpm培养5天。
优选的，所述将固态发酵物浸提，收集浸提液，经离心后取上清即为具有协同降解纤维素的复合酶组合制剂，具体为：用pH4.8醋酸-醋酸钠缓冲液浸泡固态发酵物，30℃，150rpm 震荡1h，收集浸提液，8000rpm，4℃离心5min，取上清即为具有协同降解纤维素作用的复合酶组合制剂。
优选的，本发明中所用的发酵青霉菌株均为本实验室筛选保存的专利菌株并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。其中，所述草酸青霉(Penicillium oxalicum)XZH-2的保藏编号为CGMCC No.21425，并已公开于申请号为CN202110419980.9 的中国发明专利中；桔青霉菌(Penicillium citrinum)XZH-16的保藏编号为CGMCC No.21426，并已公开于申请号为CN202110418557.7的中国发明专利中；青霉(Penicillium sp.)XZH-6 的保藏编号为CGMCC No.23296；青霉(Penicillium sp.)XZH-22的保藏编号为CGMCC No. 23297。
本发明中所用的粗糙脉孢菌和橙色嗜热子囊菌均可以通过常规的商业途径购买得到。
优选的，本发明中所用的粗糙脉孢菌具体为粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)N1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.3.14349；橙色嗜热子囊菌具体为橙色嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)T2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.3.15520。
本发明的又一个目的是提供一种由上述制备方法制备得到的具有协同降解纤维素作用的复合酶组合制剂。
优选的，所述的复合酶组合制剂含有纤维素酶和裂解性多糖单加氧酶。
本发明的又一个目的是提供所述的具有协同降解纤维素作用的复合酶组合制剂在纤维素水解中的应用。
本发明的有益效果：
(1)本发明发酵所用的青霉菌株、粗糙脉孢菌和橙色嗜热子囊菌，其中，青霉菌属能够产生一系列完整的纤维素酶，并且可高产各种复杂的木质纤维素降解酶系统。该菌属基因组编码更高数量的水解酶类和用于水解纤维素和半纤维素的辅助酶蛋白，应用不同青霉菌所产的辅助酶复配构建复合纤维素酶系，能显著提高纤维素酶系降解效率；粗糙脉孢菌和橙色嗜热子囊菌是报道产裂解性多糖单加氧酶(LPMO)的优良菌株，可作为辅助酶系的补充，进一步完善复合纤维素酶系。
(2)本发明中用于复配发酵的青霉菌株、粗糙脉孢菌和橙色嗜热子囊菌，各菌株能够协同产生纤维素酶及纤维素辅助酶等，获得较为完整的纤维素酶系，该复配纤维素酶和LPMO 酶组合制剂是具有协同降解纤维素作用，它能够通过氧化作用来断裂纤维素的糖苷键，对预处理的纤维素的水解具有促进效果，该青霉菌群复配所产的纤维素酶和LPMO复配酶组合制剂M18，其滤纸酶活为11.56±0.80FPU/g，LPMO酶活为22.00±3.26U/g，应用于林木纤维素酶解效果最佳，酶解效率提升21.5％，纤维素转化率最高可达到88.7％，有效地降低酶解过程的加酶量。
本发明的青霉(Penicillium sp.)XZH-22于2021年10月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，其保藏编号为：CGMCC No.23297。
本发明的青霉(Penicillium sp.)XZH-6于2021年10月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，其保藏编号为：CGMCC No.23296。
附图说明
图1是不同配比的混菌发酵制得的复合酶组合制剂与商品纤维素酶协同作用于杨木酶解纤维素转化率的变化。其中CK为空白对照组，即商品纤维素酶(CTec2纤维素酶)试验组； M1-M9为不同配比的4种青霉菌株混菌发酵制得的复合酶组合制剂+商品纤维素酶的试验组； M10-M22为不同配比的6种菌株混菌发酵制得的复合酶组合制剂+商品纤维素酶的试验组。
图2是杨木在不同酶解配方的纤维素转化率变化。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：具有协同降解纤维素作用的复合酶组合制剂的制备
一种青霉菌群复配协同降解纤维素复合酶制备方法，包括如下步骤：
1.培养基：
PDA液体培养基：称取200g去皮土豆，加水煮沸，经纱布过滤得土豆浸汁，然后加入葡萄糖20g，溶解后加水定容至1L，pH值自然，115℃灭菌30min，制成一级种子培养基。
固态发酵培养基：由5g稻秆和10.5mL营养盐溶液组成，营养盐溶液成分为：每升营养盐溶液中含有(NH4)2SO4 10.0g，KH2PO4 4.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，CaCl2·2H2O 0.5g，余量为1000mL水。起始pH调为6(用1M NaOH调)，115℃灭菌30min，制成固态发酵培养基 (二级发酵培养基)。
2.复配方法：
(1)一级种子液制备：将草酸青霉菌XZH-2、青霉XZH-6、桔青霉菌XZH-16和青霉XZH-22的4株不同青霉菌以及粗糙脉孢菌N1和橙色嗜热子囊菌T2分别接种到PDA液体培养基中，30℃摇瓶150rpm培养3天，获得一级种子培养液。
(2)二级固态发酵：将草酸青霉菌XZH-2、青霉XZH-6、桔青霉菌XZH-16、青霉 XZH-22、粗糙脉孢菌N1和橙色嗜热子囊菌T2的一级种子培养液按一定体积比复配，复配后的菌液的接种总体积为2mL。将复配后的菌液接种到由稻杆和营养盐制成的二级固态发酵培养基中，底物含水量为75％，30℃，150rpm培养5天，获得固态发酵物；
对步骤(2)制备的混菌发酵复配的不同菌株体积比见表1。
表1不同菌株菌配比(体积比)
Figure BDA0003426598890000061
Figure BDA0003426598890000071
(3)复合酶组合制剂的提取：用50mL pH4.8醋酸-醋酸钠缓冲液浸泡固态发酵物，30℃，150rpm震荡1h，收取液体即为发酵酶液，8000rpm，4℃离心5min，取上清即为具有协同降解纤维素作用的复合酶组合制剂。
3、不同菌株菌配比所产FPA和LPMO酶活检测
分别用标准滤纸酶活(FPA)法和Amplex Red-辣根过氧化氢酶法测定菌株产粗酶液(复合酶组合制剂)的FPA和LPMO酶活。FPA法测定具体方法为：15mL具塞试管中分别加入0.25mL粗酶液，1.75mL pH4.8醋酸-醋酸钠缓冲液，1×6cm新华中速定量滤纸条(约50mg)，充分混匀后放入50℃水浴反应60min；然后加入2mL DNS试剂，在沸水浴中煮沸10min；冷却后用蒸馏水定容至15mL；定容后550nm下测定OD值。空白中的粗酶液用煮沸灭活的粗酶液代替。测得OD值后，查标准曲线，求出溶液中葡萄糖的含量(酶活力单位定义：在上述测定条件下，每l mL粗酶液每分钟水解产生1μmol底物(葡萄糖180)所需的酶量为一个酶活单位IU)。Amplex Red-辣根过氧化物酶法的具体方法为：参照
Figure BDA0003426598890000082
Red Hydrogen Peroxide/Peroxidase Assay Kit说明书，配制100μM Red reagent 50μL，加入粗酶液20μL，1 ×Reaction buffer 30μL，共100μL反应体系，使用酶标仪(EON，BioTek)在波长530nm 获得吸光度数据，孵育30min后，再使用酶标仪在波长560nm下获得吸光度数据。以没有 LPMO的对照样品中作为测量背景信号并从测定中扣除。以H2O2为底物做标准曲线，求出反应释放的过氧化氢含量(LPMO酶活力单位定义：在反应体系中每毫升粗酶液，每分钟催化 1μmol过氧化氢降解，定义为一个酶活力单位U)。结果见表2。
表2不同菌株菌配比所产FPA和LPMO酶活
Figure BDA0003426598890000081
Figure BDA0003426598890000091
以上结果显示，菌株XZH-2:XZH-6:XZH-16:XZH-22:N1:T2的不同组合复配，最高滤纸酶活复配组合为体积比1:1:1:1:0:0的M1组，FPA酶活达15.97±1.26U/g；最高LPMO酶活复配组合为体积比8:1:1:1:0:0的M6，LPMO酶活达28.05±1.87U/g。
实施例2：复合酶组合制剂应用于杨木纤维素酶解
1.反应底物：杨木粉碎至60目，105℃烘干至恒重，准确称量(10g)杨木至耐压瓶中，首先加入0.5％v/v硫酸溶液使固液比为1:20(g:L)，使用灭菌锅121℃处理1h。预处理结束后，采用G3砂芯漏斗将混合物进行固液分离，然后用去离子水洗涤残渣至中性pH值，置于105℃烘箱中烘至恒重；然后称取酸预处理后的底物，加入2％w/v氢氧化钠溶液使固液比为1:20(g:L)，使用灭菌锅121℃处理1h。预处理结束后，采用G3砂芯漏斗将混合物进行固液分离，然后用去离子水洗涤残渣至中性pH值，置于105℃烘箱中烘至恒重，最终得到酸碱预处理反应底物。
2.称取步骤1的酸碱预处理反应底物0.1g，与5mL的混合溶液(溶液组成包括：CTec2 纤维素酶10FPU/g底物，复配酶组合制剂25mg蛋白量，并以浓度为0.2M，pH＝4.8的醋酸 -醋酸钠缓冲液补足5mL)。混菌配比编号参照表1。空白对照(CK)为0.1g酸碱预处理反应底物与5mL的混合溶液(溶液组成包括：CTec2纤维素酶10FPU/g底物，以浓度为0.2M、 pH＝4.8的醋酸-醋酸钠缓冲液补足5mL)。将上述体系分别混合装入25mL三角瓶中，将混合物放置在50℃、150rpm的摇床中反应72h。收集酶解72h后的反应上清液并置于-20℃的冰箱中保存，用于后续还原糖的测定。
结果如图1所示，不同混菌配比与商品纤维素酶(CTec2纤维素酶)协同作用于酸碱复合预处理的杨木，纤维素转化率均有提高。本研究的结果显示，纤维素降解辅助酶与纤维素酶协同作用于酸碱复合预处理的杨木，大多数纤维素转化率达到60％，与商品纤维素酶单独作用于酸碱复合预处理的杨木相比，纤维素转化率提高11.57％。其中，以青霉菌XZH-6接种量为8倍的M18混菌体积比为1:8:1:1:1:1时，其滤纸酶活为11.56±0.80FPU/g，LPMO酶活为22.00±3.26U/g，纤维素转化率最高达到66.7％。
实施例3：不同酶解配方比较
按照实施例2的方法制备酸碱复合预处理的杨木。
取0.1g酸碱复合预处理的杨木，在5mL不同溶液配方体系中进行酶解。其中，配方1：不添加CTec2纤维素酶，M1复合酶组合制剂，蛋白量40mg，以浓度为0.2M、pH＝4.8的醋酸-醋酸钠缓冲液补足5mL；配方2：不添加CTec2纤维素酶，M18复合酶组合制剂，蛋白量40mg，以浓度为0.2M、pH＝4.8的醋酸-醋酸钠缓冲液补足5mL；配方3：CTec2纤维素酶10FPU/g底物，M1复合酶组合制剂，蛋白量40mg，以浓度为0.2M、pH＝4.8的醋酸-醋酸钠缓冲液补足5mL；配方4：CTec2纤维素酶10FPU/g底物，M18复合酶组合制剂，蛋白量40mg，以浓度为0.2M、pH＝4.8的醋酸-醋酸钠缓冲液补足5mL；配方5：CTec2纤维素酶10FPU/g底物和过氧化氢酶(CAT)，蛋白量40mg，以浓度为0.2M、pH＝4.8的醋酸-醋酸钠缓冲液补足5mL；对照组：CTec2纤维素酶10FPU/g底物，以浓度为0.2M、pH＝4.8的醋酸-醋酸钠缓冲液补足5mL。将上述体系分别混合装入25mL三角瓶中，将混合物放置在 50℃、150rpm的摇床中反应72h。收集酶解72h后的反应上清液并置于-20℃的冰箱中保存，用于后续还原糖的测定。每个样品三个重复。
将复合酶组合制剂的蛋白含量由25mg提升至40mg，与商品纤维素酶(CTec2纤维素酶) 协同作用于酸碱复合预处理的杨木，结果如图2所示。将复合酶组合制剂的蛋白含量提升后所得的纤维素转化率都明显提高，纤维素转化率最高可达到88.7％。同时设置过氧化氢酶 (CAT)作为对照，与过氧化氢酶(CAT)相比纤维素转化率提高20％，与单纯加入商品纤维素酶的对照组相比，杨木酶解纤维素转化率提升21.5％，与未处理杨木纤维素转化率相比提高21倍。
以上结果表明，本发明由草酸青霉菌XZH-2、青霉XZH-6、桔青霉菌XZH-16、青霉XZH-22、粗糙脉孢菌N1和橙色嗜热子囊菌T2按体积比1:8:1:1:1:1复配进行固体发酵制得的纤维素酶和LPMO酶的复合酶组合制剂是具有协同降解纤维素作用的氧化水解酶，它能够通过氧化作用来断裂纤维素的糖苷键，并促进纤维素酶与纤维底物结合以提高酶解效率，该复合酶组合制剂使得高度结晶的杨木底物结构趋于松散，从而使纤维素酶更易与底物结合，最终协同提高纤维素的水解效率，尤其适合于林木纤维素降解的应用。从而有效地降低酶解过程的加酶量。对于促进纤维素乙醇的产业化进程具有广阔的发展前景。
上述详细说明是针对本发明的可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明的等效实施或变更，均应包含于本发明的专利范围中。

Claims (10)

1.一种青霉菌群复配协同降解纤维素复合酶制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将草酸青霉菌(Penicillium oxalicum)XZH-2、青霉(Penicillium sp.)XZH-6、桔青霉菌(Penicillium citrinum)XZH-16、青霉(Penicillium sp.)XZH-22、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)N1和橙色嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)T2分别接种至PDA斜面培养基，静置培养；然后挑选上述菌株分别接种至PDA液体种子培养基中进行活化培养，得到活化菌株；将上述活化菌株复配后接种于固态发酵培养基中发酵培养，得到固态发酵物；将固态发酵物浸提，收集浸提液，经离心后取上清即为具有协同降解纤维素作用的复合酶组合制剂。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的将活化菌株复配是将草酸青霉菌(Penicillium oxalicum)XZH-2、青霉(Penicillium sp.)XZH-6、桔青霉菌(Penicilliumcitrinum)XZH-16、青霉(Penicillium sp.)XZH-22、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)N1和橙色嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)T2的活化菌株按1:8:1:1:1:1的体积比复配。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的PDA液体种子培养基每升是通过以下方法制备的：称取200g去皮土豆，加水煮沸，经纱布过滤得土豆浸汁，然后加入葡萄糖20g，溶解后加水定容至1L。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的固态发酵培养基包括稻秆和营养盐溶液，所述的营养盐溶液的添加量为每5g稻秆加入10.5mL营养盐溶液；所述的营养盐溶液成分为：每升营养盐溶液中含有(NH4)2SO4 10.0g，KH2PO4 4.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，CaCl2·2H2O 0.5g，余量为水。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的静置培养是在30℃静置培养3～5天；所述的活化培养是在30℃，150rpm培养3天，所述的发酵培养是在30℃，150rpm培养5天。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述将固态发酵物浸提，收集浸提液，经离心后取上清即为具有协同降解纤维素的复合酶组合制剂，具体为：用pH4.8醋酸-醋酸钠缓冲液浸泡固态发酵物，30℃，150rpm震荡1h，收集浸提液，8000rpm，4℃离心5min，取上清即为具有协同降解纤维素作用的复合酶组合制剂。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述草酸青霉菌(Penicilliumoxalicum)XZH-2的保藏编号为CGMCC No.21425；青霉(Penicillium sp.)XZH-6的保藏编号为CGMCC No.23296；桔青霉菌(Penicillium citrinum)XZH-16的保藏编号为CGMCCNo.21426；青霉(Penicillium sp.)XZH-22的保藏编号为CGMCC No.23297；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)N1的保藏编号为CGMCC No.3.14349；橙色嗜热子囊菌(Thermoascusaurantiacus)T2的保藏编号为CGMCC No.3.15520。
8.权利要求1-7任一项所述的制备方法制备得到的具有协同降解纤维素作用的复合酶组合制剂。
9.根据权利要求8所述的具有协同降解纤维素作用的复合酶组合制剂，其特征在于，所述的复合酶组合制剂含有纤维素酶和裂解性多糖单加氧酶。
10.权利要求8所述的具有协同降解纤维素作用的复合酶组合制剂在纤维素水解中的应用。
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