CN114657073A - 一株高产纤维二糖酶的橘青霉菌株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株高产纤维二糖酶的橘青霉菌株及其应用，高产纤维二糖酶的橘青霉(Penicillium citrinum)菌株CB21于2022年2月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC No.40081。本发明提供的橘青霉CB21(Penicilliumcitrinum CB21)用于发酵生产纤维二糖酶的发酵工艺流程简单；菌株产纤维二糖酶活性高，酶活最高可达342.5U/mL；纤维二糖酶催化反应的pH为中性，耐高温，且温度范围是50‑80℃。
Description
技术领域
本发明属于微生物及其应用领域，具体涉及一株高产纤维二糖酶的橘青霉菌株及其应用。
背景技术
纤维二糖酶又称β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，3.2.1.21)，能够催化多种葡萄糖苷衍生物非还原末端的β-D-葡萄糖苷残基水解，它普遍存在于细菌、真菌、植物和动物中，在各种生物的细胞内或细胞外产生和发挥功能。纤维二糖酶在食品、农业、医疗和生物能源等领域有着广泛的应用，尤其在木质纤维素的降解反应中能够显著提高纤维素转化为葡萄糖的效率(R.Godse,H.Bawane,J.Tripathi,R.Kulkarni.Unconventional beta-glucosidases:A promising biocatalyst for industrial biotechnology,ApplBiochem Biotechnol,2021,193,2993–3016)。
纤维素是由D-葡萄糖分子通过β-1,4-糖苷键连接而成的可生物降解、可再生的结构复杂多样的聚合物。将纤维素生物质转化为葡萄糖是由生物体中不同的纤维素酶来催化完成。里氏木霉(Trichoderma reesei)是一种著名的产纤维素酶真菌，最早被作为研究纤维素降解机制的模式菌，其合成的纤维素酶主要包括内切葡聚糖酶((endo-1,4-D-glueanase，EC3.2.1.4)，外切葡聚糖酶(exo-1,4-D-glucanase，EC3.2.1.91)和纤维二糖酶，纤维素的完全降解需要这三种酶的共同参与，其中纤维二糖酶是纤维素分解酶系中的一个重要组分，它负责木质纤维素水解的最后一步，将纤维二糖转化为葡萄糖，因为里氏木霉自身合成纤维二糖酶的产量较低(外切葡聚糖酶和内切葡聚糖酶含量>92％)，是纤维素降解过程的限速酶，因此，极大程度上限制了纤维素酶实际在工业化上的应用(B.Barati,I.Sadegh Amiri.Literature review of cellulase and approaches to increase itsstability[M].In Silico Engineering of Disulphide Bonds to Produce StableCellulase.2015:7-21.李程程.里氏木霉高产纤维素酶的机理研究和应用[博士学位论文]；东南大学,2018.)。因此，亟需筛选高活性的纤维二糖酶菌株来提高纤维素的糖化效率。
发明内容
基于现有技术中缺少高产纤维二糖酶的菌株的现状，本发明提供一株高产纤维二糖酶的橘青霉菌株及其应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明首先提供一株高产纤维二糖酶的橘青霉(Penicillium citrinum)菌株CB21，于2022年2月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC No.40081。
本发明提供的橘青霉菌株CB21(Penicillium citrinum CB21)是从河北省唐山市曹妃甸区湿地生态环境中的土壤中采用纤维二糖为唯一碳源的筛选方法分离出来。
本发明提供的橘青霉菌株CB21(Penicillium citrinum CB21)的形态特征：宏观上橘青霉CB21在30℃条件下，PDA平板上整个菌落表现较厚且，菌落由中心向外呈现放射褶皱状，菌体正面呈现灰绿色，成熟的孢子饱满且呈现绿色，不易脱落。培养平板背面呈现均匀橘黄色。在生物显微镜下菌丝体的顶端一般产生2-3个分支，分枝顶端着生小梗，小梗上串生清晰可见的分生孢子，根据菌落形态结构特征，参照《真菌鉴定手册》，这些特征符合橘青霉真菌的特征。
本发明还提供所述高产纤维二糖酶的橘青霉(Penicillium citrinum)菌株CB21的18S rDNA，其序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明利用真菌基因组DNA提取试剂盒(Solarbio，D2300)提取橘青霉CB21的总DNA，扩增其18S rDNA序列，经第三方测序，菌株CB21的18S rDNA，其序列如SEQ ID NO.1所示。
将测序得到的18S rDNA核酸序列在线提交NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，并进行BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)比对和分析，本发明的菌株CB21的18S rDNA序列与参考菌Penicillium citrinum TG2一致性达到99％以上，进一步接合其形态特征鉴定其为Penicillium citrinum。
本发明还提供高产纤维二糖酶的橘青霉(Penicillium citrinum)菌株CB21的应用，利用橘青霉(Penicillium citrinum)菌株CB21发酵生产纤维二糖酶。
在本发明的一个实施方式中，将橘青霉(Penicillium citrinum)菌株CB21接种到液体培养基中发酵，得到纤维二糖酶粗提液。
在本发明的一个实施方式中，所述液体发酵培养基中含有碳源、氮源、水和无机盐。
在本发明的一个实施方式中，所述液体发酵培养基的碳源选自下列物质中的一种或几种：微晶纤维素、玉米秸秆或小麦秸秆。
在本发明的一个实施方式中，所述液体培养基的氮源选自下列物质中的一种或几种：硫酸铵、蛋白胨或酵母提取物。
在本发明的一个实施方式中，所述液体培养基的水为自来水或蒸馏水。
在本发明的一个实施方式中，所述液体培养基的无机盐选自KH2PO4，(NH4)2SO4、MgSO4、CaCl2、MnSO4·H2O、FeSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O或CoCl2中的一种或几种。
在本发明的一个实施方式中，将橘青霉(Penicillium citrinum)菌株CB21接种到液体培养基中发酵培养的温度是30-35℃。
在本发明的一个实施方式中，将橘青霉(Penicillium citrinum)菌株CB21接种到液体培养基中发酵培养的方式是恒温摇床震荡培养，转速为200-250rpm培养2-10天。
与现有技术相比，本发明提供的橘青霉CB21(Penicillium citrinum CB21)用于发酵生产纤维二糖酶的发酵工艺流程简单；菌株产纤维二糖酶活性高，酶活最高可达342.5U/mL；纤维二糖酶催化反应的pH为中性，耐高温，且温度范围是50-80℃。
本发明中，菌株CB21的18S rDNA具体如下所示：
附图说明
图1为本发明的橘青霉CB21(Penicillium citrinum CB21)和里氏木霉RUT-C30纤维酶活力比较图。
图2为本发明的橘青霉CB21(Penicillium citrinum CB21)粗酶液中纤维二糖酶催化反应的最适温度和最适pH图。
图3为本发明的橘青霉CB21(Penicillium citrinum CB21)菌落平板宏观形态特征图。
图4为本发明的橘青霉CB21(Penicillium citrinum CB21)菌丝体显微镜检图。
图5为本发明的橘青霉CB21(Penicillium citrinum CB21)与参考菌系统发育进化图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1：产纤维二糖酶菌株的筛选过程
样品采集：2021年10月从河北省唐山市华北理工大学(曹妃甸校区)校园里采集土壤样品存放于无菌瓶中。
纤维二糖唯一碳源筛选培养基:KH2PO4 15g/L，(NH4)2SO4 5g/L，MgSO4 0.6g/L,CaCl2 0.8g/L,MnSO4·H2O 0.0016g/L，FeSO4·7H2O 0.0005g/L，ZnSO4·7H2O 0.0014g/L，CoCl2 0.0002g/L,纤维二糖10g/L,琼脂粉20g/L，pH 4.8。
PDA富集培养基：土豆块200g，加适量蒸馏水，煮沸30分钟后用纱布过滤去除残渣，葡萄糖20g，琼脂粉20g，最后加水定容1L。
筛选方法：用无菌水浸泡后梯度稀释并涂布到含有纤维二糖为唯一碳源的筛选培养基中，30℃静置培养7天，挑选长出的单菌落并在筛选培养基中传代和复筛。经过平板初筛获得63株能够在含有纤维二糖的培养基中生长良好的真菌，将这些菌株转接传代接种的PDA培养平板上进行富集。
实施例2：发酵与纤维二糖酶活性测定
一、发酵工艺与培养基
种子瓶培养基：KH2PO4 15g/L，(NH4)2SO4 5g/L，MgSO4 0.6g/L,CaCl2 0.8g/L,MnSO4·H2O 0.0016g/L，FeSO4·7H2O 0.0005g/L，ZnSO4·7H2O 0.0014g/L，CoCl2 0.0002g/L,葡萄糖20g/L，蛋白胨1g/L，pH 4.8。
发酵瓶培养基：KH2PO4 15g/L，(NH4)2SO4 5g/L，MgSO4 0.6g/L,CaCl2 0.8g/L,MnSO4·H2O 0.0016g/L，FeSO4·7H2O 0.0005g/L，ZnSO4·7H2O 0.0014g/L，CoCl2 0.0002g/L，微晶纤维素20g/L，麸皮20g/L，蛋白胨1g/L，尿素0.3g/L，pH4.8。
将实施例1筛选得到的63株真菌在PDA培养平板上培养6天，富集孢子并梯度稀释成1.0×106个/ml的悬液。发酵操作工艺流程如下：将100μl孢子悬液(1.0×106/ml)分别接种到种子瓶培养基中(250ml三角瓶中加入50ml培养基)，30℃，200r/min振荡培养2天，按5％接种量转接入发酵培养基中(250ml三角瓶中加入50ml培养基)，每隔2天取发酵液，8000r/min离心，收集上清粗酶液。
二、纤维二糖酶活性测试
缓冲液及DNS试剂配制：1.0mg/ml葡萄糖标准溶液：称取1.0g葡萄糖用蒸馏水溶解定容1000ml。纤维二糖酶活性测定方法采用DNS法，纤维二糖酶活性测定的底物为水杨苷。1％水杨苷溶液：称取1.0g水杨苷分别溶于100ml的缓冲液中。DNS试剂配制方法如下，A液：称取10g 3,5-二硝基水杨酸和10g NaOH混合后加水溶解；B液：称取200g酒石酸钾钠溶解于250ml水中，然后加入2.0g苯酚，5.0g Na2SO3，溶解冷却。A液和B液混合并加蒸馏水定容1000ml，存放棕色瓶中7天后使用。
葡萄糖标准曲线制作：取8支试管分别加入1.0mg/ml葡萄糖标准液0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2和1.5ml，每管用蒸馏水分别补足总体积1.5ml，向每支试管中加入2.0mlDNS溶液，煮沸10min，冷却后加蒸馏水定容10ml，测量OD 540nm吸光值，以葡萄糖的实际质量为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。
纤维二糖酶活性的测定过程：向试管中加入1.0ml 1％的水杨苷溶液和0.5ml稀释后的酶液，水浴充分反应30min，加入2.0ml DNS试剂，加6.5ml蒸馏水定容10ml，OD540 nm测定吸光度值。酶活力单位(U)定义：在60℃、pH 6.0条件下，1min内催化水杨苷生成1μg葡萄糖所需的酶量。
采用DNS法测定和评价实施例1中63株菌发酵粗酶液中纤维二糖酶活性。经过多轮比较发现：编号CB21的菌株粗酶液中纤维二糖酶活性较高，其酶活力最高达到342.5U/ml，以研究降解纤维素的模式菌里氏木霉RUT-C30(Trichoderma reesei ATCC 56765)作为对照，在相同的发酵培养和检测条件下，菌株CB21的纤维二糖酶活力是里氏木霉RUT-C30的11.3倍(图1)。
三、CB21纤维二糖酶最适温度和pH
按照上述的发酵条件，菌株CB21发酵培养6天，在不同反应条件下检测其粗酶液中纤维二糖酶的活力。具体的将上清粗酶液和水杨苷底物混合分别在10℃，20℃，30℃，40℃，50℃，60℃，70℃，80℃，90℃保温反应30min，如图2A所示，在50℃-80℃宽范围内该菌株纤维二糖酶仍表现出较高的酶活力(80％以上)，其中60℃时该酶的活力最高。在不同的pH缓冲液(pH 3-10)中进一步测定该菌株纤维二糖酶的活力，结果如图2B所示，在pH 6-9范围内上清液中纤维二糖酶活力能够保持在60％以上，其中中性条件pH 7为该酶的最适反应pH。因此，该菌株纤维二糖酶具有耐高温特点，具有宽温度范围下依然保持良好的活性的特点，以及在中性pH环境下保持最高催化活性，拓展了其在工业上的应用价值。
实施例3：橘青霉CB21(Penicillium citrinum CB21)形态学特征
一.橘青霉CB21(Penicillium citrinum CB21)在PDA平板上的菌落特征
通过血细胞计数板制备1.0×106个/ml的孢子悬液，取2μl孢子悬液接种到PDA培养平板中，30℃条件下静置培养7天，观察菌株的生长特征。如图3所示，培养7天后，菌株CB21的菌落直径约21±2mm，整个菌落表现较厚且致密，菌体四周边缘较为平坦，由中心向外呈现放射褶皱状，菌体中心部分有少量轻微凸起和凹陷，生长早期平板菌丝体呈白色，成熟后菌体正面呈现艾绿色或灰绿色，表面覆盖浓密不均的绒状白色细小菌丝，成熟的孢子饱满且呈现绿色，不易脱落。培养平板背面菌体呈现均匀橘黄色。
用无菌牙签从PDA培养平板上挑取少量CB21菌丝体于载玻片上，滴加乳酸酚棉蓝染色液固定。菌丝体的显微镜(目镜10×，物镜20×)微观特征如图4所示，菌株CB21的菌丝细长，在菌丝的顶端一般产生2-3个分支，分枝顶端着生小梗，小梗上串生清晰可见的分生孢子，这些特征符合青霉真菌的特征。
三.橘青霉CB21(Penicillium citrinum CB21)系统发育进化分析
通过PCR扩增菌株CB21的18S rDNA基因，并送第三方测序公司进行测序，菌株CB21的18S rDNA序列长度为1770bp(如SWQ ID NO.1所示)，将其提交Genbank数据库，获得Genbank accession No.OM302164。同时，将18S rDNA基因序列进行在线BLAST核酸序列比对，根据比对结果从数据库中选择已公开发表的参考序列，利用MEGA软件(version 11)进行多重对位排列(Multiple alignments)，参考软件包中程序分析和构建系统发育进化树状关系图，采用NJ邻位相连法(Neighbor-joining，NJ)做进化距离分析，采用自展法(Bootstrap)检验系统发育树的每个分支的统计学显著性分析，如图5进化分析结果，菌株CB21与Penicillium citrinum TG2(Genbank No.KC960012)亲缘关系最近，同时结合该菌株宏观和微观的形态学特征，鉴定CB21为橘青霉种属，最终命名Penicillium citrinumCB21，于2022年2月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC No.40081。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中溶科技股份有限公司
<120> 一株高产纤维二糖酶的橘青霉菌株及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1770
<212> DNA
<213> 橘青霉(Penicillium citrinum)
<400> 1
gtagtcatat gcttgtctca aagattaagc catgcatgtc taagtataag cactttatac 60
tgtgaaactg cgaatggctc attaaatcag ttatcgttta tttgatagta ccttactaca 120
tggatacctg tggtaattct agagctaata catgctacaa accccgactt caggaagggg 180
tgtatttatt agataaaaaa ccaacgccct tcggggctcc ttggtgaatc ataataactt 240
aacgaatcgc atggccttgc gccggcgatg gttcattcaa atttctgccc tatcaacttt 300
cgatggtagg atagtggcct accatggtgg caacgggtaa cggggaatta gggttcgatt 360
ccggagaggg agcctgagaa acggctacca catccaagga aggcagcagg cgcgcaaatt 420
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aaaataagga ttgacagatt gagagctctt tcttgatctt ttggatggtg gtgcatggcc 1260
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ttaaatagcc cggtccgcat ctgcgggccg ctggcttctt agggggacta tcggctcaag 1380
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gttaaaccct gtcgtgctgg ggatagagca ttgcaattat tgctcttcaa cgaggaatgc 1560
ctagtaggca cgagtcatca gctcgtgccg attacgtccc tgccctttgt acacaccgcc 1620
cgtcgctact accgattgaa tggctcagtg aggccttcgg actggcgccg gagggttggc 1680
aacgaccccc cagcgccgga aagttggtca aactcggtca tttagaggaa gtaaaagtcg 1740
taacaaggtt tccgtaggtg aacctgcgga 1770
Claims (10)
1.一株高产纤维二糖酶的橘青霉(Penicillium citrinum)菌株CB21，其特征在于，于2022年2月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC No.40081。
2.高产纤维二糖酶的橘青霉(Penicillium citrinum)菌株CB21的18S rDNA，其特征在于，其序列如SEQ ID NO.1所示。
3.权利要求1所述高产纤维二糖酶的橘青霉(Penicillium citrinum)菌株CB21的应用，其特征在于，利用橘青霉(Penicillium citrinum)菌株CB21发酵生产纤维二糖酶。
4.根据权利要求3所述高产纤维二糖酶的橘青霉(Penicillium citrinum)菌株CB21的应用，其特征在于，将橘青霉(Penicillium citrinum)菌株CB21接种到液体培养基中发酵，得到纤维二糖酶粗提液。
5.根据权利要求4所述高产纤维二糖酶的橘青霉(Penicillium citrinum)菌株CB21的应用，其特征在于，所述液体发酵培养基中含有碳源、氮源、水和无机盐。
6.根据权利要求5所述高产纤维二糖酶的橘青霉(Penicillium citrinum)菌株CB21的应用，其特征在于，所述液体发酵培养基的碳源选自下列物质中的一种或几种：微晶纤维素、玉米秸秆或小麦秸秆。
7.根据权利要求5所述高产纤维二糖酶的橘青霉(Penicillium citrinum)菌株CB21的应用，其特征在于，所述液体培养基的氮源选自下列物质中的一种或几种：硫酸铵、蛋白胨或酵母提取物。
8.根据权利要求5所述高产纤维二糖酶的橘青霉(Penicillium citrinum)菌株CB21的应用，其特征在于，所述液体培养基的水为自来水或蒸馏水。
9.根据权利要求5所述高产纤维二糖酶的橘青霉(Penicillium citrinum)菌株CB21的应用，其特征在于，所述液体培养基的无机盐选自KH2PO4，(NH4)2SO4、MgSO4、CaCl2、MnSO4·H2O、FeSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O或CoCl2中的一种或几种。
10.根据权利要求4所述高产纤维二糖酶的橘青霉(Penicillium citrinum)菌株CB21的应用，其特征在于，将橘青霉(Penicillium citrinum)菌株CB21接种到液体培养基中发酵培养的温度是30-35℃；
将橘青霉(Penicillium citrinum)菌株CB21接种到液体培养基中发酵培养的方式是恒温摇床震荡培养，转速为200-250rpm培养2-10天。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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