CN113502282A - 一株青霉固态发酵产果胶酶制剂的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株青霉固态发酵产果胶酶制剂的方法，该方法通过高通量筛选，筛选出一株果胶酶高产菌株Penicilliumsp.Y，并对其固态发酵条件的优化，最终生产出的果胶酶制剂活性高达13800U/g；该一株青霉固态发酵产果胶酶制剂的方法，采用甲基磺酸乙酯(EMS)诱变菌株，在致死率为85.8％的条件下成功筛选出一株酶活高达19000U/g的产酶菌株，并通过后续优化试验确定菌株最适的培养基组分以及生长条件：豆粕20g，初始含水量68％，葡萄糖含量3％，蛋白胨含量1％，CaCl2 0.04％，FeCl3 0.04％，接种量4％，培养温度38℃，培养5天后酶活高达2200U/g，大大提高了菌株产酶能力，达到理想目标。

Description

一株青霉固态发酵产果胶酶制剂的方法
技术领域
本发明涉及生物发酵工程领域，具体为一株青霉固态发酵产果胶酶制剂的方法。
背景技术
酶制剂在饲料行业中对动物的消化吸收以及抗营养因子的消除等方面起到至关重要的作用。其中复合酶制剂又是一种可实现多酶催化功效的产品，应用领域更广泛(化学品、养殖业、食品以及环境保护等方面)，在降低饲料业生产成本的同时，对环境保护也起着一定的作用。并且随着21世纪生物技术在国内外酶制剂市场的迅猛发展，人们会越来越重视酶制剂的性能以及在市场中的应用价值。
果胶酶，作为世界四大酶制剂之一，可以催化水解等反应，在果汁澄清、榨汁、酿酒、榨油等食品行业应用十分广泛，此外，果胶酶还在纺织、医药、造纸、环境、生物技术、饲料等领域有所发展，广泛应用于食品、医药和饲料等行业领域。食品工业用果胶酶多源于微生物，近年来，国内外对果胶酶的研究已经进入了分子生物学水平，已从许多种属微生物中克隆了果胶酶基因和测序，并对果胶酶基因的结构、功能、调控及其表达产物结构与性能等方面进行了探索。我国对果胶酶的需求量很大，但国内果胶酶的发展却较缓慢，且通常是将果胶酶单一使用，这限制了果胶酶的应用范围及效果。
在微生物发酵工业中，菌种是直接决定产品质量和产量是否达标的关键性因素，一般从自然界分离到的菌株积累产物能力非常低，无法实现规模化生产要求。本发明从常州市南郊的麦田中采集土样，历时6年，进行微生物的筛选、培养、鉴定、发酵条件初步优化，最终获得果胶酶高产菌株Penicillium sp.Y。
为此，我们提出一株青霉固态发酵产果胶酶制剂的方法。
发明内容
针对背景技术的不足，本发明提供了一株青霉固态发酵产果胶酶制剂的方法，解决了上述背景技术提出的问题。
本发明提供如下技术方案：一株青霉固态发酵产果胶酶制剂的方法，该方法通过高通量筛选，筛选出一株果胶酶高产菌株Penicilliumsp.Y，并对其固态发酵条件的优化，最终生产出的果胶酶制剂活性高达13800U/g。
优选的，所述青霉菌(Penicilliumsp.)Y为一种高产果胶酶的微生物，于2015年1月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.10455。
一株青霉固态发酵产果胶酶制剂的方法，该方法包括以下步骤：
步骤一、所获得菌株筛选自郊区农田土壤，经过高通量筛选，再经筛选培养基分离纯化，得到21株形态各异的产酶菌株；
步骤二、通过96孔板快速初筛，得到10株高产酶微生物菌株，再经过摇瓶复筛，得到1株高产果胶酶微生物菌株Y。
优选的，所述菌株Y的菌落在初筛培养基平板上培养初期菌丝为绒状，呈白色，后期变成淡绿色，菌落由束状的与单生的分生孢子梗相间组成同心圈，背面无色，菌丝体随培养时间的增加颜色逐渐加深，最后变成深灰色颗粒状。
优选的，所述菌株Y分生孢子梗壁光滑，帚状枝具有单束的小梗，分枝1-2次，密集，菌丝有横隔，孢子成束状或链状，链长而纠结，单个孢子为球形，肾形，孢子表面粗糙，长径为3-3.5μm，依据真菌鉴定手册，初步鉴定该菌为半知菌类，丛梗孢目，丛梗孢科，青霉属。
优选的，青霉固态发酵时使用固态发酵培养基，所述固态发酵培养基体系组成：以15-25g豆粕和10-20g麸皮为固体基质，初始含水量50％，玉米粉含量2-5％，蛋白胨2-5％，MgCl20.02-0.06％，CaCl20.02-0.06％，接种量4％，培养温度38℃，培养时间3-6天。
本发明具备以下有益效果：一株青霉固态发酵产果胶酶制剂的方法，本发明还提供上述菌株Y在固体发酵培养基上的发酵优化，可显著提高果胶酶生产能力，并通过单因素试验优化方法获得最优固态发酵产果胶酶的制备方法，同时采用固体发酵培养菌株，使得在操作过程中具有操作简便、能耗低、发酵过程易控制、对无菌要求相对较低、不易发生大面积污染等优点。
附图说明
图1为青霉菌(Penicillium sp.)Y扫描电镜(SEM)图；
图2为青霉菌(Penicillium sp.)Y系统发育树图；
图3为碳源对菌株产酶的影响示意图；
图4为氮源对菌株产酶的影响示意图；
图5为金属离子对菌株产酶的影响示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例中的附图：图中不同种类的剖面线不是按照国标进行标注的，也不对元件的材料进行要求，是对图中元件的剖视图进行区分。
请参阅图1-5，一株青霉固态发酵产果胶酶制剂的方法，该方法通过高通量筛选，筛选出一株果胶酶高产菌株Penicilliumsp.Y，并对其固态发酵条件的优化，最终生产出的果胶酶制剂活性高达13800U/g。
青霉菌(Penicilliumsp.)Y为一种高产果胶酶的微生物，于2015年1月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.10455。
一株青霉固态发酵产果胶酶制剂的方法，该方法包括以下步骤：
步骤一、所获得菌株筛选自郊区农田土壤，经过高通量筛选，再经筛选培养基分离纯化，得到21株形态各异的产酶菌株；
步骤二、通过96孔板快速初筛，得到10株高产酶微生物菌株，再经过摇瓶复筛，得到1株高产果胶酶微生物菌株Y。
菌株Y的菌落在初筛培养基平板上培养初期菌丝为绒状，呈白色，后期变成淡绿色，菌落由束状的与单生的分生孢子梗相间组成同心圈，背面无色，菌丝体随培养时间的增加颜色逐渐加深，最后变成深灰色颗粒状。
菌株Y分生孢子梗壁光滑，帚状枝具有单束的小梗，分枝1-2次，密集，菌丝有横隔，孢子成束状或链状，链长而纠结，单个孢子为球形，肾形，孢子表面粗糙，长径为3-3.5μm，依据真菌鉴定手册，初步鉴定该菌为半知菌类，丛梗孢目，丛梗孢科，青霉属。
青霉固态发酵时使用固态发酵培养基，所述固态发酵培养基体系组成：以15-25g豆粕和10-20g麸皮为固体基质，初始含水量50％，玉米粉含量2-5％，蛋白胨2-5％，MgCl20.02-0.06％，CaCl20.02-0.06％，接种量4％，培养温度38℃，培养时间3-6天。
需要说明的是，本发明中测定果胶酶酶活能力的方法采用的是指示剂滴定法，具体方法见中华人民共和国国家标准法发布的GB/T 23535-2009。
实施例1
青霉菌(Penicillium sp.)Y的分离、筛选与鉴定
(1)菌株的分离
从江苏省常州市南郊不同农田取样点收集泥土表层下5～10cm处的土壤样品5～10g保藏于无菌20mL密封袋中，保存于4℃冰箱中用于后续菌株的筛选。各称取3～5g不同采样点的土壤样品分别加入装有50ml无菌生理盐水的250ml锥形瓶中混匀，充分振荡后静置30～60min，取上清液2～5ml加入装有50ml初始富集培养基的250ml锥形瓶中，在38～40℃条件下以120rpm·min-1的恒温摇床培养3～5天后，将5ml液体培养基转移至装有45ml新鲜的无机盐筛选培养基的250ml锥形瓶中用于随后的传代培养。数次传代培养，取100μL菌悬液涂布与无机盐固体培养基上，待长出菌落后挑选表型各不相同的菌落在无机盐固体平板培养基上进行划线分离，分离出表型各不相同的单菌落，将所有获得的菌落进行多次划线分离以获得纯种菌株，共计35株。将分离得到的35株菌株进行斜面及冻存管保存。
初始富集培养基的组成如下：果胶8g/L、NH4Cl 0.4g/L、MgSO4.7H2O 2g/L、K2HPO41g/L、FeSO4.7H2O 0.01g/L、琼脂20g、pH 7.0，121℃灭菌30min
无机盐筛选培养基(MSM)的组成如下：K2HPO4 4g/L，KH2PO4 4g/L，NH4Cl 0.4g/L，盐溶液10mL/L，果胶8g/L，无机盐固体培养基则再加入1.5～2％琼脂粉。盐溶液的组成如下：MgCl2 15g/L，MnCl2 4g/L，FeCl3 5g/L，CaCl2 0.3g/L。
(2)菌株的筛选
称取0.5g的土壤溶于4.5ml的蒸馏水中，在摇床上38℃，160r/min,旋转混合20min，静置10min，梯度稀释至10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6,10-7，分别吸取400μL上清液涂布于果胶固体平板上，28℃培养3-5d，观察菌株表观形态，进行平板划线分离，纯化菌株。采用单点式将不同的纯种菌株接种在果胶固体培养基平板上，38℃进行培养72h，采用刚果红染色法筛选出产生透明圈的菌株。
复筛：将所筛菌株接种到果胶液体培养基中进行发酵培养，38℃发酵培养3d,检测各个菌株的果胶酶酶活。选取果胶酶酶活最高的菌株为实验后续菌株。
使用96孔板快速初筛选方法和摇瓶复筛相结合的方法。挑取分离所得到的35株单菌落，分别接种于装有无机盐筛选培养基的96孔板中，在38℃恒温摇床中以160rpm·min-1培养3～5天，测果胶酶酶活，从35株产果胶的菌株中，挑选产果胶酶活性最高的菌株Y，并进行后续鉴定及发酵培养基优化。
(3)菌株的鉴定
对真菌进行形态学观察。测定菌株的18S rRNA基因序列与NCBI数据库中的序列进行同源性比较，最终确定该菌的种属。
菌株Y的菌落在初筛培养基平板上培养初期菌丝为绒状，呈白色，后期变成淡绿色。分生孢子梗壁光滑，帚状枝具有单束的小梗，分枝1-2次，密集，菌丝有横隔，孢子成束状或链状，链长而纠结，单个孢子为球形，肾形(图1)。
18S rRNA测序结果表明，菌株Y与P.expansum(登录号：GU561988.1)等的相似性在99％以上，结合菌株的形态学特征则对产果胶酶菌株Y的鉴定结果为青霉属(Penicilliumsp.)，命名为Penicillium sp.Y，系统发育树如图3所示。
本实施例说明筛选出的高活性果胶酶产生菌株Y，在固体发酵培养基中，产生的果胶酶活性高达9500U/g。
实施例2
通过选取Penicillium sp.Y生长的最优固体基质，采用不同的固态发酵培养基质：米糠、豆饼粉、麸皮、豆粕、棉籽饼粉、菜籽饼粉，每组试验做3次对照，具体试验操作如下：
在超净工作台中，用接种环从平板中挑取少许菌接入已灭好菌的种子培养基中，培养至对数生长期后按2％的接种量接入到上述提到的以米糠、豆饼粉、麸皮、豆粕、棉籽饼粉、菜籽饼粉为固体基质的发酵培养基中，在38℃恒温培养箱中培养3天，取样测定菌株所产酶活。
本实施例说明，以豆粕为发酵底物，在发酵第5天时，菌株所产果胶酶酶活最高，达到9000U/g以上；以麸皮、米糠为发酵底物时，菌株所产酶活低于4000U/g。因此选择以豆粕为菌株发酵底物来进行后续培养基组分的优化。
实施例3
通过确定Penicillium sp.Y菌株在发酵过程中所需的最适碳源及其浓度，选取了玉米粉、淀粉、蔗糖、葡萄糖和果糖为发酵碳源，并且选择1％、2％、4％、6％、8％的碳源浓度添加到发酵培养基中，每组试验做3次对照，具体试验操作如下：
发酵培养基配制过程中选取玉米粉、淀粉、蔗糖、葡萄糖和果糖为单一碳源并保证其他变量不变，培养基制备完成后115℃灭菌30min。在超净工作台中，用灭好菌的枪头吸取2mL种子液接入到发酵培养基中，再用无菌玻璃棒将培养基搅拌均匀放入38℃恒温培养箱中培养3天后，取样测酶活。从中挑选出适合菌株产酶的最佳碳源，进而优化其碳源浓度，结果如图3所示。
本实施例说明，适合菌株产酶的最适碳源为玉米粉，以玉米粉为碳源发酵果胶酶酶活可达11000U/g，进而优化玉米粉浓度为3％时，菌株所产酶活最高，达到12000U/g。
实施例4
通过确定Penicillium sp.Y菌株在发酵过程中所需的最适氮源及其浓度，在保证培养基中其他组分不变的情况下，我们选取了牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、NH4Cl、(NH4)2SO4和尿素为发酵氮源，并且选择1％、2％、4％、6％、8％的氮源浓度添加到发酵培养基中，每组试验做3次对照，具体试验操作见实施例4，结果如图4所示。
本实施例说明，适合菌株产酶的最佳氮源为蛋白胨，以蛋白胨为氮源发酵菌株果胶酶酶活可达12350U/g，进而优化蛋白胨浓度为1％时，菌株所产酶活最高，达到13500U/g。
实施例5
通过确定Penicillium sp.Y菌株在发酵过程中所需的最适金属离子及其浓度，在保证培养基中其他组分不变的情况下，我们选取了一定量的MgSO4、CaCl2、FeCl3、K2HPO4、BaCl2添加到发酵培养基中，而后选择0.02％、0.04％、0.06％、0.08％、0.1％的金属离子浓度再次添加到发酵培养基中，确定适合菌株产酶的最适金属离子浓度，每组试验做3次对照，具体试验操作见实施例4，结果如图5所示。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (6)

1.一株青霉固态发酵产果胶酶制剂的方法，其特征在于：该方法通过高通量筛选，筛选出一株果胶酶高产菌株Penicilliumsp.Y，并对其固态发酵条件的优化，最终生产出的果胶酶制剂活性高达13800U/g。
2.根据权利要求1所述的一株青霉固态发酵产果胶酶制剂的方法，其特征在于：所述青霉菌(Penicilliumsp.)Y为一种高产果胶酶的微生物，于2015年1月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.10455。
3.根据权利要求1所述的一株青霉固态发酵产果胶酶制剂的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：
步骤一、所获得菌株筛选自郊区农田土壤，经过高通量筛选，再经筛选培养基分离纯化，得到21株形态各异的产酶菌株；
步骤二、通过96孔板快速初筛，得到10株高产酶微生物菌株，再经过摇瓶复筛，得到1株高产果胶酶微生物菌株Y。
4.根据权利要求3所述的一株青霉固态发酵产果胶酶制剂的方法，其特征在于：所述菌株Y的菌落在初筛培养基平板上培养初期菌丝为绒状，呈白色，后期变成淡绿色，菌落由束状的与单生的分生孢子梗相间组成同心圈，背面无色，菌丝体随培养时间的增加颜色逐渐加深，最后变成深灰色颗粒状。
5.根据权利要求3所述的一株青霉固态发酵产果胶酶制剂的方法，其特征在于：所述菌株Y分生孢子梗壁光滑，帚状枝具有单束的小梗，分枝1-2次，密集，菌丝有横隔，孢子成束状或链状，链长而纠结，单个孢子为球形，肾形，孢子表面粗糙，长径为3-3.5μm，依据真菌鉴定手册，初步鉴定该菌为半知菌类，丛梗孢目，丛梗孢科，青霉属。
6.根据权利要求1所述的一株青霉固态发酵产果胶酶制剂的方法，青霉固态发酵时使用固态发酵培养基，其特征在于：所述固态发酵培养基体系组成：以15-25g豆粕和10-20g麸皮为固体基质，初始含水量50％，玉米粉含量2-5％，蛋白胨2-5％，MgCl20.02-0.06％，CaCl20.02-0.06％，接种量4％，培养温度38℃，培养时间3-6天。
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