CN115595344A - 儿茶素作为裂解性多糖单加氧酶降解纤维素的电子供体的应用 - Google Patents

儿茶素作为裂解性多糖单加氧酶降解纤维素的电子供体的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及儿茶素作为裂解性多糖单加氧酶降解纤维素的电子供体的应用。木质纤维素类生物质中天然存在的化合物能作为裂解性多糖单加氧酶电子供体，显著降低裂解性多糖单加氧酶的使用成本，促进其大规模地推广应用。

Description

儿茶素作为裂解性多糖单加氧酶降解纤维素的电子供体的 应用
技术领域
本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及儿茶素作为裂解性多糖单加氧酶降解纤维素的电子供体的应用。
背景技术
纤维素的酶解糖化效率低、成本高等问题限制了其进一步发展应用的潜力，迫切需要改造与开发新型的纤维素降解酶制剂。传统纤维素的酶解糖化主要依赖于内切葡聚糖酶、外切纤维素酶和β-葡萄糖苷酶间的协同降解；近年来，裂解性多糖单加氧酶作为一类新型的多糖降解酶，其通过氧化方式断裂不溶性结晶多糖的糖苷键，与内切葡聚糖酶、外切纤维素酶和β-葡萄糖苷酶的协同作用下，可显著提高纤维素的酶解糖化效率，展现出广阔的工业应用前景。
研究表明，裂解性多糖单加氧酶的催化反应需要电子供体的参与，其提供外源电子使裂解性多糖单加氧酶的二价铜离子辅基还原为一价铜离子，才能起始催化反应。目前，常用的电子供体有抗坏血酸、半胱氨酸、左旋多巴等，但是外源电子供体的添加会导致应用成本的增加，不利于大规模地使用。因此，探明木质纤维素类生物质中天然存在的化合物能否作为裂解性多糖单加氧酶电子供体的可行性，对于指导裂解性多糖单加氧酶的工业化应用，具有重要的经济价值。
发明内容
本发明的目的在于提供儿茶素作为裂解性多糖单加氧酶降解纤维素的电子供体的应用。
根据本发明具体实施方式，在缓冲溶液中对纤维素进行高效降解，所述缓冲液为浓度50 mM、pH 5.0的醋酸-醋酸钠缓冲液。
根据本申请的技术方案，其中所述裂解性多糖单加氧酶可以为现有技术公开或未公开任意裂解性多糖单加氧酶，例如，NCBI基因库中公开的序列号为KAI0755988.1或白腐真菌乳白耙菌的裂解性多糖单加氧酶。
木质纤维素类生物质中天然存在的化合物儿茶素能作为裂解性多糖单加氧酶电子供体，显著降低裂解性多糖单加氧酶的使用成本，促进其大规模地推广应用。
附图说明
图1显示裂解性多糖单加氧酶-抗坏血酸体系下纤维素氧化断裂产物的生成量分析结果；
图2显示裂解性多糖单加氧酶-儿茶素体系下纤维素氧化断裂产物的生成量分析结果；
图3显示裂解性多糖单加氧酶-儿茶素体系下纤维素氧化断裂产物的离子色谱检测分析结果；
图4显示裂解性多糖单加氧酶-熊果苷/愈创木酚/对羟基苯甲酸/乙酰丁香酮体系下纤维素氧化断裂产物的生成量分析结果。
具体实施方式
实施例1 重组裂解性多糖单加氧酶的制备
根据NCBI基因库中公开的序列号KAI0755988.1合成裂解性多糖单加氧酶基因片段，连接到表达载体pPIC9K，获得裂解性多糖单加氧酶基因的重组大肠杆菌表达质粒，参考英杰生命科技公司毕赤酵母表达实验操作手册，电击转化至毕赤酵母GS115感受态细胞中，然后挑选转化子进行SDS-PAGE电泳分析，获得表达裂解性多糖单加氧酶的重组毕赤酵母。
取重组毕赤酵母菌株，接种于30 mL YPD培养液中，30 ℃ 180 rpm振荡培养24 h，按2%比例转接于300 mL BMGY培养基中，30 ℃ 180 rpm振荡培养48 h；而后离心收集菌体，采用150 mL BMMY培养基重悬菌体，于30 ℃ 180 rpm诱导培养48 h，离心收集上清。进一步利用Ni亲和层析柱进行纯化，收集电泳纯的洗脱组分并透析至蛋白储存液（20 mM pH 7Tris-HCl）中，然后以3倍摩尔浓度比的硫酸铜孵育纯化蛋白，完成重组裂解性多糖单加氧酶的制备。
实施例2重组裂解性多糖单加氧酶-抗坏血酸体系降解纤维素
按如下反应体系：50 mM pH 5.0 醋酸-醋酸钠缓冲液，1 μM重组裂解性多糖单加氧酶，1 mM 抗坏血酸，100 μM过氧化氢，0.5% 纤维素。以未加入重组裂解性多糖单加氧酶和未加入抗坏血酸的体系作为对照，反应体系设3个重复。反应在30℃下进行，1h后煮沸终止，采用离子色谱检测纤维素氧化断裂产物的生成量。离子色谱为戴安ICS5000型离子色谱仪，色谱柱为CarboPac PA1分析柱（2 x 250 mm），流动相A（0.1 M氢氧化钠），流动相B（1 M醋酸钠-0.1 M氢氧化钠），洗脱程序如下：0-10% B, 10 min; 10-30% B, 15 min; 30-100%B, 5 min; 100-0% B, 5 min; 100% A, 5 min。
结果如图1所示，在重组裂解性多糖单加氧酶-抗坏血酸体系下，可见纤维素氧化断裂产物的生成；在不添加重组裂解性多糖单加氧酶和抗坏血酸的体系下，均未检测到纤维素氧化断裂产物的生成；这些结果表明抗坏血酸可作为裂解性多糖单加氧酶的电子供体参与高效降解纤维素。
实施例3 重组裂解性多糖单加氧酶-儿茶素体系降解纤维素
按如下反应体系：50 mM pH 5.0 醋酸-醋酸钠缓冲液，1 μM重组裂解性多糖单加氧酶，1 mM 儿茶素，100 μM过氧化氢，0.5% 纤维素。以未加入重组裂解性多糖单加氧酶和未加入儿茶素的体系作为对照，反应体系设3个重复。反应在30℃下进行，1h后煮沸终止，采用离子色谱检测纤维素氧化断裂产物的生成量。离子色谱为戴安ICS5000型离子色谱仪，色谱柱为CarboPac PA1分析柱（2 x 250 mm），流动相A（0.1 M氢氧化钠），流动相B（1 M醋酸钠-0.1 M氢氧化钠），洗脱程序如下：0-10% B, 10 min; 10-30% B, 15 min; 30-100% B,5 min; 100-0% B, 5 min; 100% A, 5 min。
结果如图2和图3所示，在重组裂解性多糖单加氧酶-儿茶素体系下，可见纤维素氧化断裂产物的生成；在不添加重组裂解性多糖单加氧酶和儿茶素的体系下，均未检测到纤维素氧化断裂产物的生成；由此可知，儿茶素可作为裂解性多糖单加氧酶的电子供体参与高效降解纤维素。
实施例4 裂解性多糖单加氧酶-熊果苷/愈创木酚/对羟基苯甲酸/乙酰丁香酮体系降解纤维素
按如下反应体系：50 mM pH 5.0 醋酸-醋酸钠缓冲液，1 μM 重组裂解性多糖单加氧酶，1 mM 熊果苷或愈创木酚或对羟基苯甲酸或乙酰丁香酮，100 μM过氧化氢，0.5% 纤维素。以未加入重组裂解性多糖单加氧酶和未加入熊果苷或愈创木酚或对羟基苯甲酸或乙酰丁香酮的体系作为对照，反应体系设3个重复。反应在30℃下进行，1h后煮沸终止，采用离子色谱检测纤维素氧化断裂产物的生成量。离子色谱为戴安ICS5000型离子色谱仪，色谱柱为CarboPac PA1分析柱（2 x 250 mm），流动相A（0.1 M氢氧化钠），流动相B（1 M醋酸钠-0.1 M氢氧化钠），洗脱程序如下：0-10% B, 10 min; 10-30% B, 15 min; 30-100% B, 5 min;100-0% B, 5 min; 100% A, 5 min。
结果如图4所示，在重组裂解性多糖单加氧酶-熊果苷/愈创木酚/对羟基苯甲酸/乙酰丁香酮体系下，未见纤维素氧化断裂产物的生成，由此可知，熊果苷或愈创木酚或对羟基苯甲酸或乙酰丁香酮不能作为裂解性多糖单加氧酶的电子供体参与高效降解纤维素。
以上实施例仅用于解释本申请的技术方案，不限定本申请的保护范围。

Claims (4)

1.儿茶素作为裂解性多糖单加氧酶降解纤维素的电子供体的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在缓冲溶液中对纤维素进行降解，所述缓冲液为浓度50 mM、pH 5.0的醋酸-醋酸钠缓冲液。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述裂解性多糖单加氧酶来自白腐真菌乳白耙菌。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述裂解性多糖单加氧酶在NCBI基因库中公开的序列号为KAI0755988.1。
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