ES2848049T3 - Procedimiento de producción de un cóctel enzimático que utiliza los residuos líquidos de un procedimiento de conversión bioquímica de materiales lignocelulósicos - Google Patents

Procedimiento de producción de un cóctel enzimático que utiliza los residuos líquidos de un procedimiento de conversión bioquímica de materiales lignocelulósicos Download PDF

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Abstract

Procedimiento de producción de un cóctel enzimático con un microorganismo celulolítico que comprende dos fases: - una fase a) de crecimiento de dicho microorganismo en reactor cerrado 5 en presencia de una solución de carbono de crecimiento, - una fase b) de producción de dicho cóctel enzimático realizada con una alimentación de solución de carbono de producción cuya concentración de sustrato de carbono está comprendida entre 150 y 400 g/l, comprendiendo dicha solución de carbono de producción un sustrato de carbono inductor, caracterizado por que dicho sustrato de carbono inductor es solamente un residuo líquido procedente de una etapa de pretratamiento de materiales lignocelulósicos, utilizado sin esterilización, ni modificación del pH de dicho residuo líquido, cuyos oligómeros de azúcares C5 representan al menos un 1 % en peso de los azúcares totales presentes en dicho residuo líquido y al menos un 0,3 % en peso de los azúcares totales presentes en dicha solución de carbono de producción.

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimiento de producción de un cóctel enzimático que utiliza los residuos líquidos de un procedimiento de conversión bioquímica de materiales lignocelulósicos
Campo de la invención
La presente invención se refiere a la producción de las enzimas celulolíticas y hemicelulolíticas, en concreto, en el marco de la producción de etanol a partir de materiales celulósicos o lignocelulósicos.
Técnica anterior
Desde los años 1970, la transformación de materiales lignocelulósicos en etanol, después de hidrólisis de los polisacáridos constitutivos en azúcares fermentables, ha sido el objeto de muy numerosos trabajos. Se pueden citar, por ejemplo, los trabajos de referencia del National Renewable Energy Laboratory - Laboratorio Nacional de Energía Renovable (Process Design and Economics for Biochemical Conversion of Lignocellulosic Biomass to Ethanol, Humbird et al., NREL/TP-5100-57764, mayo de 2011).
Los materiales lignocelulósicos son unos materiales celulósicos, es decir, constituidos en más de un 90 % en peso de celulosa y/o lignocelulósica, es decir, constituidos de celulosa, de hemicelulosas, que son unos polisacáridos constituidos esencialmente de pentosas y de hexosas, así como de lignina, que es una macromolécula de estructura compleja y de alto peso molecular, a base de compuestos fenólicos.
La madera, las pajas, las raspas de maíz son los materiales lignocelulósicos más utilizados, pero otros recursos, cultivos forestales dedicados, residuos de plantas productoras de alcohol, azucareras y cerealistas, productos y residuos de la industria papelera y unos productos de transformación de los materiales lignocelulósicos son utilizables. En su mayor parte, están constituidos de aproximadamente un 35 a un 50 % de celulosa, de un 20 a un 30 % de hemicelulosa y de un 15 a un 25 % de lignina.
El procedimiento de transformación bioquímica de los materiales lignocelulósicos en etanol comprende una etapa de pretratamiento fisicoquímico, seguida de una etapa de hidrólisis enzimática que utiliza un cóctel enzimático, de una etapa de fermentación etanólica de los azúcares liberados, pudiendo la fermentación etanólica y la hidrólisis enzimática ponerse en marcha simultáneamente y de una etapa de purificación del etanol.
El cóctel enzimático es una mezcla de enzimas celulolíticas (llamadas, igualmente, celulasas) y/o hemicelulolíticas. Las enzimas celulolíticas presentan tres grandes tipos de actividades: endoglucanasas, exoglucanasas y celobiosas, llamándose, igualmente, estas últimas p glucosidasas. Las enzimas hemicelulolíticas presentan, en concreto, unas actividades xilanasas.
La hidrólisis enzimática es eficaz y se efectúa en unas condiciones suaves. En cambio, el coste de las enzimas sigue siendo muy elevado, que representa de un 20 a un 50 % del coste de transformación del material lignocelulósico en etanol. Por ello, se han puesto en marcha muchos trabajos para reducir este coste: primero, la optimización de la producción de enzimas, seleccionando los microorganismos hiperproductores y mejorando los procedimientos de producción de dichas enzimas, a continuación, la disminución de la cantidad de enzimas en hidrólisis, optimizando la etapa de pretratamiento, mejorando la actividad específica de estas enzimas y optimizando la implementación de la etapa de hidrólisis enzimática.
En el transcurso de la última década, unos numerosos trabajos se han centrado en comprender los mecanismos de acción y de expresión del cóctel enzimático. La finalidad es hacer secretar el cóctel más apropiado para la hidrólisis de los materiales lignocelulósicos modificando los microorganismos.
El microorganismo celulolítico más utilizado para la producción industrial del cóctel enzimático es el hongo Trichoderma reesei. Las cepas silvestres tienen la facultad de secretar, en presencia de un sustrato de carbono inductor, la celulosa, por ejemplo, el cóctel enzimático considerado como el mejor adaptado para la hidrólisis de la celulosa. Otras proteínas que poseen unas propiedades indispensables para la hidrólisis de los materiales lignocelulósicos se producen, igualmente, por Trichoderma reesei, las xilanasas, por ejemplo. La presencia de un sustrato de carbono inductor es indispensable para la expresión de las enzimas celulolíticas y/o hemicelulolíticas. La naturaleza del sustrato de carbono tiene una fuerte influencia sobre la composición del cóctel enzimático. Este es el caso de la xilosa, que, asociada a un sustrato de carbono inductor como la celulosa o la lactosa, permite mejorar significativamente la actividad denominada xilanasa.
La lactosa sigue siendo, en un procedimiento de producción industrial de cóctel enzimático, uno de los sustratos más apropiados; sin embargo, su coste varía de manera importante y representa aproximadamente de uno a dos tercios del precio de coste de las enzimas. En el caso de la utilización de lactosa como sustrato de carbono, el procedimiento de producción de cóctel enzimático es dependiente de una fuente de carbono exterior. Por ello, la utilización de sustratos de carbono procedentes del procedimiento de conversión bioquímica de materiales lignocelulósicos es una vía de progreso importante.
La solicitud de patente europea EP1690944 enseña que el extracto de la fracción hemicelulósica en forma monomérica proveniente de materiales lignocelulósicos pretratados se puede utilizar como sustrato de carbono no inductor para el crecimiento del microorganismo celulolítico y la producción de enzimas. En este último caso, debe mezclarse con un sustrato de carbono inductor de la producción de celulasas (lactosa o celobiosa).
Las solicitudes de patente internacionales WO09026716 A1 y WO090061486 A1 describen la producción de un cóctel enzimático a partir de Trichoderma reesei utilizando un sustrato de carbono que contiene unos azúcares inductores de la producción de celulasas, así como una fuente de carbono principal. Esta solicitud enseña que un 3 % en peso de azúcares inductores es suficiente para inducir la producción de celulasas. La producción de celulasas se multiplica por un factor superior a 4 con respecto al ejemplo donde se utiliza la xilosa sola en la solución de producción. Los azúcares inductores descritos son unos mono-, di- y oligosacáridos (azúcares Ce) producidos eventualmente por la hidrólisis de la celulosa. La fuente de carbono principal es un conjunto que comprende unos mono-, di- y oligosacáridos procedentes de las hemicelulosas o de la xilosa sintética.
El documento europeo EP 2371 950 A1 describe un procedimiento de producción de celulasas basado en la regulación de la oscilación de la presión de oxígeno disuelto en el medio de cultivo. Este documento divulga que el sustrato inductor de carbono se elige de entre la lactosa, la xilosa, la celobiosa, la soforosa, unos residuos obtenidos después de fermentación de azúcares monoméricos y/o un extracto crudo de pentosas hidrosolubles, es decir, de azúcares C5 hidrosolubles.
La publicación "Cellulase Production by Continuous Culture of Trichoderma reesei Rut C30 using acid hydrolysate prepared to retain more oligosaccharides for induction", Lo etal., Bioresource Technology 101 (2010) 717-723, enseña una inducción por los oligosacáridos producidos por hidrólisis ácida de celulosa, estando dicho hidrolizado, constituido de oligómeros de azúcares C6, basificado por una solución de Ca(OH)2 antes de ser neutralizado. El papel inductor de los oligómeros C6, en particular, de la celobiosa, se conoce, por otra parte.+
La patente francesa FR 2962444 se refiere a un procedimiento de producción de enzimas celulolíticas y/o hemicelulolíticas por un microorganismo celulolítico y/o hemicelulolítico, que comprende al menos una fase de crecimiento en presencia de una fuente de carbono y al menos una fase de producción en presencia de un sustrato inductor, en el que dicho sustrato inductor es una mezcla que comprende de un 40 a un 65 % en peso de glucosa o de hidrolizados celulósicos, de un 21 a un 25 % en peso de lactosa y de un 10 a un 39 % en peso de xilosa o de una solución de hidrolizado hemicelulósico lignocelulósico, siendo la suma de estos tres constituyentes igual a un 100 %. Este documento indica que el sustrato inductor está desprovisto de cualquier otro azúcar que no sean los constituyentes listados más arriba, siendo los hidrolizados celulósicos glucosa procedente de la hidrólisis de la celulosa y siendo los hidrolizados hemicelulósicos una solución de azúcares C5.
Un objeto de la invención es proponer una nueva fuente de carbono inductora fácilmente disponible, que permite producir un cóctel enzimático con las actividades apropiadas para la hidrólisis del material lignocelulósico. Con respecto a la patente europea EP1690944, la invención reivindica la utilización ventajosa de una fracción hemicelulósica que contiene, igualmente, unos oligómeros, lo que permite prescindir de la añadidura de un sustrato inductor. Con respecto a la patente internacional WO09026716, la invención recomienda la utilización de una sola fuente de carbono inductora no sintética y, particularmente, adaptada para la expresión de una mezcla de enzimas perfectamente eficaz para el tratamiento de la biomasa a hidrolizar. Esta invención permite, por otra parte, la puesta en valor de forma interna de coproductos.
Resumen e interés de la invención
La presente invención se refiere a un procedimiento de producción de un cóctel enzimático por un microorganismo celulolítico caracterizado por que utiliza solamente un residuo líquido del pretratamiento de materiales lignocelulósicos como sustrato de carbono inductor para inducir la producción del cóctel enzimático.
Una ventaja de la invención es reducir, incluso, suprimir el aporte de sustrato de carbono de origen externo al procedimiento de conversión bioquímica de materiales lignocelulósicos. Otra ventaja es poner en valor los residuos líquidos de dicho procedimiento de conversión bioquímica para la producción de un cóctel enzimático. Esta puesta en valor permite reducir la cantidad de efluentes producidos que deben ser retratados antes de rechazo o almacenamiento.
Poniéndose dichos residuos líquidos que contienen unos oligómeros inductores en valor para la producción de un cóctel enzimático, se reduce el coste de dicho cóctel.
Una ventaja suplementaria del procedimiento según la invención es producir un cóctel enzimático particularmente adaptado para la hidrólisis enzimática del material lignocelulósico pretratado convertido en el procedimiento de conversión bioquímica. En particular, se ha descubierto un efecto positivo de los oligómeros C5 sobre la actividad celulasa de las enzimas obtenidas.
Descripción detallada de la invención
La presente invención es un procedimiento de producción de un cóctel enzimático con un microorganismo celulolítico que comprende dos fases:
- una fase a) de crecimiento de dicho microorganismo en reactor cerrado en presencia de una solución de carbono de crecimiento,
- una fase b) de producción de dicho cóctel enzimático realizada con una alimentación de solución de carbono de producción cuya concentración de sustrato de carbono está comprendida entre 150 y 400 g/l, comprendiendo dicha solución de carbono de producción un sustrato de carbono inductor,
caracterizado por que dicho sustrato de carbono inductor es solamente un residuo líquido procedente de una etapa de pretratamiento de materiales lignocelulósicos, utilizado sin esterilización, ni modificación del pH de dicho residuo líquido, cuyos oligómeros de azúcares C5 representan al menos un 1 % en peso de los azúcares totales presentes en dicho residuo líquido y al menos un 0,3 % en peso de los azúcares totales presentes en dicha solución de carbono de producción.
De manera preferente, la solución de carbono de crecimiento utilizada en dicha fase a) está a una concentración inicial comprendida entre 10 y 90 g de sustrato de carbono por litro de volumen de reacción.
De manera preferente, dicha etapa de pretratamiento es una hidrólisis ácida, una cocción ácida o una explosión de vapor con impregnación previa de dichos materiales lignocelulósicos con una solución acuosa de ácido sulfúrico. De manera preferente, dicho residuo líquido se utiliza sin esterilización ni modificación del pH de dicho residuo líquido. De manera preferida, dicho residuo líquido se utiliza sin esterilización ni destoxificación, ni modificación del pH de dicho residuo líquido.
De manera preferente, los oligómeros de azúcares C5 representan entre un 1 y un 50 % en peso de los azúcares totales presentes en dicho residuo líquido.
De manera preferente, dicho sustrato de carbono inductor se utiliza solo o como mezcla con al menos otro sustrato de carbono no inductor.
De manera preferente, dicho otro sustrato de carbono no inductor se elige de entre la glucosa, la xilosa y la sacarosa tomadas solas o como mezcla.
De manera preferente, dicha solución de carbono de producción consiste en un residuo líquido y en al menos un sustrato de carbono no inductor, elegido de entre la glucosa, la xilosa y la sacarosa, tomadas solas o como mezcla, procediendo dicho residuo líquido de una etapa de pretratamiento de materiales lignocelulósicos y utilizándose sin esterilización, ni destoxificación, ni modificación del pH, consistiendo dicho residuo líquido en oligómeros de azúcares C5, en monómeros de azúcares C5 y C6 y en productos de degradación de los azúcares monoméricos, cuyos oligómeros de azúcares C5 representan al menos un 1 % en peso de los azúcares totales presentes en dicho residuo líquido y al menos un 0,3 % en peso de los azúcares totales presentes en dicha solución de carbono de producción. De manera preferente, el caudal específico de la alimentación de solución de carbono de producción de la fase b) está comprendido entre 35 y 65 mg de sustrato de carbono por gramo de microorganismo y por hora.
De manera preferente, el microorganismo celulolítico se elige de entre las cepas de hongos pertenecientes a los géneros Trichoderma, Aspergillus, Penicillium o Schizophyllum.
De manera preferente, el microorganismo celulolítico pertenece a la especie Trichoderma reesei.
Dicho procedimiento de producción de un cóctel enzimático se lleva a cabo en cultivo sumergido. Por cultivo sumergido, se entiende un cultivo en medio líquido.
Los microorganismos celulolíticos implementados en el procedimiento de producción de un cóctel enzimático según la invención son unas cepas de hongos celulolíticos, por ejemplo, pertenecientes a los géneros Trichoderma, Aspergillus, Penicillium o Schizophyllum, preferentemente pertenecientes a la especie Trichoderma reesei. Las cepas industriales de mejor rendimiento son las cepas pertenecientes a la especie Trichoderma reesei, modificadas para mejorar el cóctel enzimático por los procedimientos de mutación-selección, como, por ejemplo, la cepa IFP CL847 (patente francesa FR-B-2555803). Igualmente, se pueden utilizar las cepas mejoradas por las técnicas de recombinación genética. Estas cepas se cultivan en reactores agitados y aireados en unas condiciones compatibles con su crecimiento y la producción de las enzimas.
Por sustrato de carbono, se designa el conjunto de los azúcares comprendidos en la solución de carbono.
La solución de carbono de crecimiento de dicho microorganismo utilizada en dicha fase a) del procedimiento según la invención es una solución acuosa que comprende ventajosamente un sustrato de carbono elegido de entre los azúcares solubles industriales y preferentemente de entre la glucosa, la xilosa, los residuos líquidos obtenidos después de fermentación etanólica de los azúcares monoméricos de los hidrolizados enzimáticos de materiales lignocelulósicos y los extractos de la fracción hemicelulósica en forma de monómeros provenientes de materiales lignocelulósicos pretratados, utilizado solo o como mezcla. Según su naturaleza, dicha solución de carbono de crecimiento se introduce en el reactor cerrado antes de esterilización o se esteriliza por separado y se introduce en el reactor cerrado después de esterilización de este último.
Preferentemente, dicha solución de carbono de crecimiento se utiliza en dicha fase a) a una concentración inicial comprendida entre 10 y 90 g de sustrato de carbono por litro de volumen de reacción.
Preferentemente, dicha fase a) se realiza sobre una duración comprendida entre 30 y 70 h, preferentemente entre 30 y 40 h.
Preferentemente, dicha fase a) opera a un pH de 4,8 y a una temperatura de 27 °C.
Preferentemente, dicha fase a) se realiza en un reactor cerrado, aireado y agitado. La aireación se regula para obtener un VVM (caudal volumétrico de aire Nm3/min dividido por el volumen de reacción en m3) comprendido entre 0,1 y 1, de manera preferente entre 0,3 y 0,7 y de manera más preferente para obtener un VVM de 0,5. La agitación está adaptada para obtener una presión parcial de oxígeno disuelto comprendida entre un 20 y un 80 % de la saturación teórica, de manera preferente entre un 30 y un 50 % y de manera más preferente a un valor de un 40 %.
La solución de carbono de producción de dicho microorganismo utilizada en dicha fase b) según la invención es una solución acuosa que comprende un sustrato de carbono inductor. Dicho sustrato de carbono inductor es un residuo líquido procedente de la etapa de pretratamiento de materiales lignocelulósicos que comprenden unos oligómeros de azúcares C5.
De acuerdo con la invención, dichos oligómeros de azúcares C5 representan al menos un 0,3 % en peso de los azúcares totales contenidos en dicha solución de carbono de producción. Preferentemente, dichos oligómeros de azúcares C5 representan entre un 0,3 y un 50 % en peso de los azúcares totales contenidos en dicha solución de carbono de producción, de manera preferida entre un 0,3 y un 20 % en peso, de manera más preferida entre un 0,3 y un 10 % en peso y de manera todavía más preferida entre un 0,3 y un 6 % en peso.
Preferentemente, dicho sustrato de carbono inductor se utiliza solo o como mezcla con al menos otro sustrato de carbono no inductor.
Preferentemente, dicho otro sustrato de carbono no inductor se elige de entre unos azúcares no inductores, de manera preferida elegido de entre la glucosa, la sacarosa y la xilosa, tomadas solas o como mezcla. De manera muy preferida, dicho otro sustrato de carbono se elige de entre la glucosa y la sacarosa tomadas solas o como mezcla.
De acuerdo con la invención, dicha solución de carbono de producción utilizada en dicha fase b) según la invención se prepara a la concentración de 150 a 400 g de sustrato de carbono por litro de solución de carbono de producción. El caudal específico de la alimentación de solución de carbono de producción de dicha fase b) está comprendido ventajosamente entre 35 y 65 mg de sustrato de carbono por gramo de microorganismo y por hora, de manera preferente de 35 a 45 mg de sustrato de carbono por gramo de microorganismo y por hora.
Preferentemente, dicha fase b) se realiza sobre una duración al menos superior a 30 h, preferentemente al menos superior a 100 h.
Preferentemente, dicha fase b) opera a un pH comprendido entre 3 y 5,5 y a una temperatura comprendida entre 20 y 30 °C.
Preferentemente, dicha fase b) se realiza en un reactor aireado y agitado. La aireación se regula para obtener un VVM comprendido entre 0,1 y 1, de manera preferente entre 0,3 y 0,7 y de manera más preferente para obtener un VVM de 0,5. La agitación está adaptada para obtener una presión parcial de oxígeno disuelto comprendida entre un 20 y un 80 %, de manera preferente entre un 30 y un 50 % y de manera más preferente a un valor de un 40 %.
Dicha fase b) puede ponerse en marcha según los modos de fed-batch (lote alimentado) y chemostat (quimiostato) según la terminología anglosajona, conocidos por el experto en la materia.
Los oligómeros de azúcares C5 utilizados como sustrato de carbono inductor en la solución de carbono de producción utilizada en dicha fase b) están comprendidos en un residuo líquido procedente de la etapa de pretratamiento de materiales lignocelulósicos.
Dicha etapa de pretratamiento del material lignocelulósico permite mejorar la susceptibilidad a la hidrólisis enzimática de la fracción celulósica. Dicha etapa de pretratamiento es una etapa de pretratamiento físico, como, por ejemplo, una explosión de vapor o química o fisicoquímica. Preferentemente, dicha etapa de pretratamiento es una etapa de pretratamiento ácido o básico, como, por ejemplo, una hidrólisis alcalina, una cocción alcalina o una explosión de vapor con impregnación previa de dicho material con una solución acuosa alcalina. Preferentemente, dicha etapa de pretratamiento es una etapa de pretratamiento ácido, de manera preferida una hidrólisis ácida, una cocción ácida o una explosión de vapor con impregnación previa de dicho material con una solución acuosa de ácido sulfúrico. De manera muy preferida, la etapa de pretratamiento es la explosión de vapor.
El efluente de dicha etapa de pretratamiento se separa en dos fases: una fase que constituye el residuo sólido y una fase que constituye el residuo líquido. Dicha separación se puede efectuar por cualquier medio conocido por el experto en la materia. Por ejemplo, dicha separación se puede efectuar por centrifugación, filtro-prensa, decantación o cualquier otro medio técnico que permita la separación de una fase líquida y de una fase sólida.
En el caso de un pretratamiento ácido, el experto en la materia ajusta las condiciones operativas (cantidad de ácido, tasa de humedad, temperatura, presión, duración) en función del material lignocelulósico a pretratar y de las tecnologías implementadas. Dichas condiciones operativas serán más severas, por ejemplo, para miscanthus que para paja de trigo. Estos ajustes tienen como objetivo obtener una hidrólisis completa de las hemicelulosas en forma de monómeros, minimizando al mismo tiempo la formación de productos de degradación (en concreto, furfural, 5-HMF). Para hacer esto, la etapa de pretratamiento se puede subdividir, igualmente, en dos fases: una primera fase que tiene como objetivo liberar los oligómeros de azúcares C5, seguida de una fase que tiene como objetivo producir unos monómeros a partir de los oligómeros liberados (Process Design and Economics for Biochemical Conversion of Lignocellulosic Biomass to Ethanol, Humbird et al., NREL/TP-5100-57764, mayo de 2011).
De acuerdo con la invención, dicha etapa de pretratamiento se opera por unos medios conocidos por el experto en la materia de manera que el residuo líquido comprenda unos oligómeros de azúcares C5.
Para obtener unos oligómeros de azúcares C5 en el residuo líquido de dicha etapa de pretratamiento, se puede bajar la cantidad de ácido implementada en dicha etapa de pretratamiento. Igualmente, se puede bajar la temperatura y/o la presión a la que se opera dicha etapa de pretratamiento con respecto a las condiciones optimizadas para no liberar más que unos monómeros.
De acuerdo con la invención, dichos oligómeros de azúcares C5 comprendidos en dicho residuo líquido procedente de la etapa de pretratamiento de materiales lignocelulósicos representan entre un 1 y un 100 % en peso de los azúcares totales presentes en dicho residuo líquido, de manera preferente entre un 1 y un 50 % en peso y de manera más preferente entre un 1 y un 30 % en peso.
Dicho residuo líquido que contiene los oligómeros de azúcares C5 procedente de dicha etapa de pretratamiento se utiliza como fuente de carbono inductor sin que sea necesario ni esterilizar dicho residuo líquido, ni modificar el pH de dicho residuo.
En un modo de realización preferido, el material lignocelulósico pretratado que corresponde a la fracción denominada "sólida", se hidroliza en una etapa de hidrólisis enzimática. El efluente de esta etapa se trata, a continuación, en una etapa de fermentación etanólica de los azúcares monoméricos de los hidrolizados enzimáticos. Estos tratamientos se pueden realizar en el mismo equipo o en unos equipos diferentes.
En otro modo de realización preferido, la etapa de fermentación y al menos una parte de la etapa de hidrólisis se realizan simultáneamente. Esto se realiza, por ejemplo, añadiendo unas levaduras etanólicas en el transcurso de la etapa de hidrólisis enzimática.
Los ejemplos que siguen ilustran la invención sin limitar el alcance de ello.
Ejemplo 1 (no conforme) - Producción de un cóctel enzimático sobre glucosa
El ejemplo 1 presenta un cultivo que utiliza la glucosa como sustrato de carbono de producción. Se trata de un represor de la producción de celulasas. Este ejemplo da como resultado una escasa producción de enzimas.
La producción de un cóctel enzimático se efectúa en reactor agitado mecánicamente. El medio mineral (denominado 4N) tiene la siguiente composición: KOH 1,66 g/l, H3PO485 % 2 ml/l, (NH^SO4 2,8 g/l, MgSO4, 7 H2O 0,6 g/l, CaCL2 0,6 g/l, MnSO4 3,2 mg/l, ZnSO4, 7 H2O 2,8 mg/l, CoCh 10 H2O 4,0 mg/l, FeSO4, 7 H2O 10 mg/l, Maíz Fermentado 1,2 g/l, antiespumante 0,5 ml/l.
Precultivo líquido
El crecimiento del microorganismo (la cepa de Trichoderma reesei CL847) en precultivo se hace utilizando la glucosa como sustrato de carbono de crecimiento, a la concentración de 30 g/l. El medio mineral del precultivo es el medio 4N adicionado con ftalato de potasio a 5 g.l-1 con el fin de tamponar el pH. El crecimiento del inóculo dura 3 días y se efectúa a 30 °C en una incubadora agitada. La transferencia hacia el reactor se realiza si la concentración residual de glucosa es inferior a 15 g/l.
Fase de crecimiento
El reactor que contiene el medio 4N se esteriliza a 120 °C durante 20 minutos. El sustrato de carbono de crecimiento de glucosa se esteriliza aparte a 120 °C durante 20 minutos, luego, se añade estérilmente en el reactor para tener una concentración de 30 g/l. El reactor se siembra a un 10 % (v/v) con el precultivo líquido de la cepa de Trichoderma reesei CL847. Las condiciones operativas son una temperatura de 27 °C y un pH de 4,8 (regulado por 5,5 mol/l de amoniaco). La aireación es de 0,5 vvm y la agitación se aumenta entre 200 y 800 rpm en función de la pO2 (presión de oxígeno disuelto), que se mantiene a un 30 %.
Fase de producción
Cuando se agota el sustrato de carbono de crecimiento del reactor, el sustrato de carbono de producción de glucosa a 250 g/l se inyecta de forma continua al caudal de 35 a 45 mg por g de microorganismo y por hora hasta 164 horas. Las condiciones operativas son una temperatura de 25 °C y un pH de 4 (regulado por 5,5 mol/l de amoniaco, aportando este último, igualmente, el nitrógeno necesario para la síntesis de las proteínas excretadas). El contenido de oxígeno disuelto se mantiene a un 30 % por acción sobre la agitación.
La producción de enzimas se sigue por la dosificación de las enzimas extracelulares por el método de Lowry y estándar BSA, después de separación del microorganismo por filtración o centrifugación. Las actividades celulolíticas determinadas son:
- La actividad de papel de filtro (UPF: unidad de papel de filtro) que permite dosificar la actividad global del cóctel enzimático de endoglucanasas y exoglucanasas
- La actividad de aril p-glucosidasa para las actividades específicas.
La actividad UPF se mide sobre papel Whatman n.° 1 (Proceso recomendado por la comisión biotecnológica de la IUPAC) a la concentración inicial de 50 g/l; se determina la toma de ensayo de la solución enzimática a analizar que libera el equivalente a 2 g/l de glucosa (dosificación colorimétrica) en 60 minutos. El principio de la actividad de papel de filtro es determinar por dosificación con DNS (ácido dinitrosalicílico) la cantidad de azúcares reducidos procedente de un papel Whatman N.° 1 (Proceso recomendado por la comisión biotecnológica de la IUPAC).
El sustrato utilizado para determinar la actividad de aril p-glucosidasa es el p-nitrofenil-p-D-glucopiranósido (PNPG). Es escindido por la p-glucosidasa que libera el p-nitrofenol.
Una unidad de actividad de aril p-glucosidasa se define como la cantidad de enzima necesaria para producir 1 pmol de p-nitrofenol a partir de PNPG por minuto y se expresa en Ul/ml.
Las actividades específicas se obtienen dividiendo las actividades expresadas en Ul/ml por la concentración de proteínas. Se expresan en Ul/mg.
Las determinaciones analíticas sobre el mosto final del ejemplo 1 dan los siguientes resultados:
Figure imgf000007_0001
Ejemplo 2 (no conforme) - Producción de enzimas sobre xilosa
El ejemplo 2 presenta un cultivo que utiliza la xilosa como sustrato de carbono de producción. Se trata de un represor de la producción de celulasas. Este ejemplo da como resultado una escasa producción de enzimas.
La producción de enzimas se lleva a cabo en las mismas condiciones que en el Ejemplo 1. El sustrato de carbono durante la fase de crecimiento es la lactosa y durante la fase de producción, la xilosa pura.
Después de 30 horas de crecimiento, después del agotamiento del sustrato inicial, la solución de xilosa a 250 g/l se inyecta de forma continua al caudal de 35 mg por g de células y por hora hasta 164 horas.
Las determinaciones analíticas sobre el mosto final dan los siguientes resultados:
Figure imgf000008_0001
Ejemplo 3 (no conforme) - Producción de enzimas sobre lactosa
El ejemplo 3 presenta un cultivo que utiliza la lactosa como sustrato de carbono de producción. Se trata de un inductor de la producción de celulasas. Este ejemplo da como resultado una fuerte producción de enzimas que presentan una buena actividad.
La producción de enzimas se lleva a cabo en las mismas condiciones que en el Ejemplo 1. El sustrato de carbono durante las fases de crecimiento y de producción es la lactosa pura. La lactosa es un inductor importante de la producción de celulasas. Es el sustrato más utilizado industrialmente para la producción de celulasas.
Después de 30 horas de crecimiento, después del agotamiento del sustrato inicial, la solución de fed-batch (lote alimentado) a 250 g/l se inyecta de forma continua al caudal de 35 mg por g de células y por hora hasta 164 horas. Las determinaciones analíticas sobre el mosto final dan los siguientes resultados:
Figure imgf000008_0002
Ejemplo 4 (conforme) - Producción sobre un 100 % de residuo líquido que contiene unos oligómeros de azúcares C5 El ejemplo 4 presenta un cultivo que utiliza el residuo líquido como sustrato de carbono de producción. Este ejemplo da como resultado una producción de enzimas y una actividad superiores a las obtenidas en los ejemplos 1 y 2. Por lo tanto, se muestra que el residuo líquido utilizado solo induce la producción de celulasas. Se da como resultado un efecto similar a lo que se describe en la patente internacional WO09026716 A1, pero sin añadidura de solución inductora que no sea el residuo líquido.
La producción de enzimas se lleva a cabo en las mismas condiciones que en el Ejemplo 1. El sustrato de carbono durante las fases de crecimiento es la glucosa. El sustrato de carbono durante la fase de producción es la fracción líquida obtenida después de pretratamiento llamada "un residuo líquido". Este procede de un miscanthus pretratado por explosión de vapor a 1.450 kPa (14,5 bar) durante 2 minutos después de impregnación a un 0,65 % de H2SO4, luego, separación fase líquida/fase sólida.
Su composición es la siguiente:
Figure imgf000008_0003
Se concentra a 300 g/l. Después de 30 horas de crecimiento, después del agotamiento del sustrato inicial, la solución concentrada de hidrolizado hemicelulósico se inyecta de forma continua al caudal de 35 mg por g de células y por hora.
Las determinaciones analíticas sobre el mosto final dan los siguientes resultados:
Figure imgf000009_0003
Ejemplo 5 (conforme) - Producción sobre dos residuos líquidos diferentes que comprenden unas proporciones de oligómeros diferentes
El ejemplo 5 presenta dos cultivos que utilizan cada uno un residuo líquido como sustrato de carbono de producción. Este ejemplo ha dado como resultado una producción de enzimas y una actividad superiores a las obtenidas en los ejemplos 1 y 2. Se muestra que el contenido de oligómeros de azúcares C5 tiene un efecto positivo sobre la cantidad y la actividad de las enzimas obtenidas.
Se producen dos residuos líquidos distintos a partir de paja de trigo explosionada de vapor. Las condiciones operativas de la explosión de vapor son 1.450 kPa (14,5 bar), 2 minutos. El residuo líquido C1 se obtiene a partir de una paja de trigo previamente impregnada por H2SO4 a un 0,64 %. El residuo líquido C2 se obtiene a partir de una paja de trigo previamente impregnada por H2SO4 a un 0,32 %.
El residuo líquido C2 contiene una proporción más importante de oligómeros procedentes de la hidrólisis de las hemicelulosas de la paja con respecto al hidrolizado C1, por el hecho de la menor cantidad de ácido utilizada para la impregnación de la paja de trigo.
La composición de los residuos líquidos C1 y C2 se detalla en la siguiente tabla:
Figure imgf000009_0002
Los monómeros corresponden a la suma de la glucosa, xilosa, arabinosa, manosa, galactosa, ramnosa. Los oligómeros corresponden a la suma de los oligómeros de los azúcares C5 (ejemplo: xilobiosa, xilotriosa, xiloarabinosa). Los azúcares degradados corresponden a la suma de furfural, de 5 HMF, de ácido levulínico y de ácido fórmico. Se preparan dos soluciones de fed-batchs (lotes alimentados) disolviendo glucosa en los hidrolizados C1 y C2 para alcanzar una concentración total de azúcares de 250 g/l. Siendo la glucosa un represor de la producción de celulasas. Los experimentos se llevan a cabo en las mismas condiciones que el ejemplo 1.
Las determinaciones analíticas sobre el mosto final dan los siguientes resultados:
Figure imgf000009_0001
La solución de Fed-batch (Lote alimentado) C2 que contiene más oligómeros procedentes de la fracción de hemicelulosa da como resultado una producción de proteínas superior a la de la solución de Fed-batch (Lote alimentado) C1 con unas mejores actividades enzimáticas. En este ejemplo, la producción de enzimas se realiza con unas fuentes de carbono potencialmente procedentes únicamente del procedimiento de producción de etanol a partir de biomasa lignocelulósica, pudiendo la glucosa sustituirse por un hidrolizado celulósico.
Ejemplo 6 (no conforme) - Producción sobre residuo líquido (hidrolizado hemicelulósico) que no contiene unos oligómeros de azúcares C5
El ejemplo 6 muestra, partiendo del residuo líquido C2 del ejemplo 5, que son efectivamente los oligómeros de azúcares C5 los que inducen la producción de enzimas.
La solución C2 del ejemplo 5 experimenta de manera previa una hidrólisis ácida para hidrolizar los oligómeros en monómeros. La composición de la nueva solución C3 es la siguiente:
Figure imgf000010_0001
A continuación, se lleva a cabo el cultivo en las mismas condiciones que el ejemplo 5. Se prepara una solución de fedbatch (lote alimentado) disolviendo glucosa en C3 para alcanzar una concentración total de azúcares de 250 g/l. Las determinaciones analíticas sobre el mosto final dan los siguientes resultados:
Figure imgf000010_0002
Este ejemplo muestra que en ausencia de oligómeros hemicelulósicos, los residuos líquidos no inducen la producción de celulasas.

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Procedimiento de producción de un cóctel enzimático con un microorganismo celulolítico que comprende dos fases: - una fase a) de crecimiento de dicho microorganismo en reactor cerrado en presencia de una solución de carbono de crecimiento,
- una fase b) de producción de dicho cóctel enzimático realizada con una alimentación de solución de carbono de producción cuya concentración de sustrato de carbono está comprendida entre 150 y 400 g/l, comprendiendo dicha solución de carbono de producción un sustrato de carbono inductor,
caracterizado por que dicho sustrato de carbono inductor es solamente un residuo líquido procedente de una etapa de pretratamiento de materiales lignocelulósicos, utilizado sin esterilización, ni modificación del pH de dicho residuo líquido, cuyos oligómeros de azúcares C5 representan al menos un 1 % en peso de los azúcares totales presentes en dicho residuo líquido y al menos un 0,3 % en peso de los azúcares totales presentes en dicha solución de carbono de producción.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho residuo líquido comprende dichos oligómeros de azúcares C5, unos monómeros de azúcares C5 y C6 y unos productos de degradación de los azúcares monoméricos.
3. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en el que la solución de carbono de crecimiento utilizada en dicha fase a) está a una concentración inicial comprendida entre 10 y 90 g de sustrato de carbono por litro de volumen de reacción.
4. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha etapa de pretratamiento es una hidrólisis ácida, una cocción ácida o una explosión de vapor con impregnación previa de dichos materiales lignocelulósicos con una solución acuosa de ácido sulfúrico.
5. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en el que los oligómeros de azúcares C5 representan entre un 0,3 y un 20 % en peso, preferentemente entre un 0,3 y un 10 % en peso, de los azúcares totales presentes en dicha solución de carbono de producción.
6. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en el que los oligómeros de azúcares C5 representan entre un 1 y un 50 % en peso, preferentemente entre un 1 y un 30 % en peso, de los azúcares totales presentes en dicho residuo líquido.
7. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho sustrato de carbono inductor se utiliza solo o como mezcla con al menos otro sustrato de carbono no inductor.
8. Procedimiento según la reivindicación anterior, en el que dicho otro sustrato de carbono no inductor se elige de entre la glucosa, la xilosa y la sacarosa tomadas solas o como mezcla.
9. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha solución de carbono de producción consiste en un residuo líquido y en al menos un sustrato de carbono no inductor elegido de entre la glucosa, la xilosa y la sacarosa, tomadas solas o como mezcla, procediendo dicho residuo líquido de una etapa de pretratamiento de materiales lignocelulósicos y utilizándose sin esterilización, ni modificación del pH, consistiendo dicho residuo líquido en oligómeros de azúcares C5, en monómeros de azúcares C5 y C6 y en productos de degradación de los azúcares monoméricos, cuyos oligómeros de azúcares C5 representan al menos un 1 % en peso de los azúcares totales presentes en dicho residuo líquido y al menos un 0,3 % en peso de los azúcares totales presentes en dicha solución de carbono de producción.
10. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en el que el caudal específico de la alimentación de solución de carbono de producción de la fase b) está comprendido entre 35 y 65 mg de sustrato de carbono por gramo de microorganismo y por hora.
11. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en el que el microorganismo celulolítico se elige de entre las cepas de hongos pertenecientes a los géneros Trichoderma, Aspergillus, Penicillium o Schizophyllum. 12. Procedimiento según la reivindicación anterior, en el que el microorganismo celulolítico pertenece a la especie Trichoderma reesei.
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