ES2937668T3 - Procedimiento de producción de celulasas con bagazo lignocelulósico pretratado - Google Patents

Procedimiento de producción de celulasas con bagazo lignocelulósico pretratado Download PDF

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Abstract

La invención se relaciona con un método para producir enzimas celulolíticas o hemicelulolíticas que comprende: una fase a) de crecimiento de un microorganismo celulolítico en un reactor cerrado, en presencia de al menos un sustrato de crecimiento carbonoso con una concentración de 10 a 90 g/L, a una temperatura de 25-30°C y un pH de 4-5,5; una fase b) de producción de enzimas a las que se les añade al menos un sustrato carbonoso inductivo, a una temperatura de 25-27°C y un pH de 4-5, en cuyo método dicho sustrato inductivo es un orujo pretratado resultante de un método de pretratamiento de material lignocelulósico que no ha sufrido hidrólisis enzimática y que se añade en modo discontinuo o continuo, y que tiene características específicas: un rendimiento de hidrólisis superior al 80 % en un ensayo y una viscosidad aparente, medida en un ensayo, de menos de 1 pa (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimiento de producción de celulasas con bagazo lignocelulósico pretratado
La invención se refiere a un procedimiento para la producción de enzimas celulolíticas y hemicelulolíticas.
Las enzimas se utilizan en particular en procedimientos para la producción de biocombustibles de segunda generación (es decir, a partir de biomasa lignocelulósica), y en particular cuando el biocombustible es el etanol. De manera general, el procedimiento según la invención es aplicable en todos los procedimientos que incluyen una hidrólisis enzimática de la biomasa, y en particular de la biomasa lignocelulósica. Puede ser utilizado en particular en la producción de enzimas por hongos filamentosos.
Técnica anterior
Desde hace más de 45 años, la transformación de bagazos lignocelulósicos en etanol, después de la hidrólisis de los polisacáridos constituyentes en azúcares fermentables, es objeto de numerosos estudios.
Los bagazos lignocelulósicos son bagazos celulósicos, es decir, compuestos en más de 90% en peso por celulosa y/o lignocelulosa (la lignocelulosa comprende esencialmente celulosa, hemicelulosa y lignina). Las celulosas y las hemicelulosas son unos polisacáridos formados esencialmente por pentosas y hexosas. La lignina es una macromolécula de estructura compleja y de alto peso molecular, a base de compuestos fenólicos.
La madera, las pajas, las mazorcas de maíz son los bagazos lignocelulósicos más utilizados, pero otros recursos tales como cultivos forestales dedicados, residuos de plantas productoras de alcohol, azúcar y cereales, residuos lignocelulósicos de la industria papelera y productos de la transformación de bagazos lignocelulósicos pueden ser usado. En su mayoría comprenden alrededor de 35 a 50% de celulosa, 20 a 30% de hemicelulosa y 15 a 25% de lignina.
El procedimiento de transformación bioquímica de bagazos lignocelulósicos en etanol incluye una etapa de pretratamiento fisicoquímico, seguida de una etapa de hidrólisis enzimática que usa un cóctel enzimático para producir azúcares, de una etapa de fermentación etanólica de los azúcares liberados, pudiendo la fermentación etanólica y la hidrólisis enzimática ser llevadas a cabo simultáneamente (procedimiento SSF), y de una etapa de purificación del etanol.
El cóctel enzimático es una mezcla de enzimas celulolíticas (también llamadas celulasas) y/o hemicelulolíticas (a menudo llamadas xilanasas). Las enzimas celulolíticas tienen tres tipos principales de actividades: endoglucanasas, exoglucanasas y celobiasas, siendo estas últimas también llamadas p glucosidasas. Las enzimas hemicelulolíticas tienen en particular actividades xilanasa.
La hidrólisis enzimática es eficaz y se lleva a cabo en condiciones suaves.
El coste de las enzimas sigue siendo muy alto, representando de 20 a 50% del coste de transformación del bagazo lignocelulósico en etanol. Por lo tanto, se han llevado a cabo muchos estudios para reducir este coste: en primer lugar, sobre la optimización de la producción de enzimas, mediante la selección de microorganismos hiperproductivos y la mejora de los procedimientos de producción de dichas enzimas, y después en la reducción de la cantidad de enzimas en hidrólisis, optimizando la etapa de pretratamiento, mejorando la actividad específica de estas enzimas, y optimizando la realización de la etapa de hidrólisis enzimática.
Durante la última década, muchos estudios se han centrado en comprender los mecanismos de acción y expresión del cóctel enzimático. El objetivo es que segregue el cóctel más apropiado para la hidrólisis de bagazos lignocelulósicos mediante la modificación de los microorganismos.
El microorganismo celulolítico más utilizado para la producción industrial del cóctel enzimático es el hongo Triohoderma reesei. Tiene la facultad de segregar, en presencia de un sustrato carbonado inductor, la celulosa por ejemplo, un cóctel enzimático con muy altas concentraciones (que pueden ir hasta 100 g/l). Otras proteínas que tienen propiedades indispensables para la hidrólisis de bagazos lignocelulósicos también son producidas por Triohoderma reesei, las xilanasas por ejemplo. La presencia de un sustrato carbonado inductor es indispensable para la expresión de enzimas celulolíticas y/o hemicelulolíticas. La naturaleza del sustrato carbonado tiene una fuerte influencia sobre la composición del cóctel enzimático. Es el caso de la xilosa que, combinada con un sustrato carbonado inductor tal como la celulosa o la lactosa, permite mejorar significativamente la actividad denominada xilanasa.
La lactosa sigue siendo, en un procedimiento de producción industrial de cócteles enzimáticos, uno de los sustratos más apropiados; sin embargo, su coste oscila de manera importante y representa alrededor de uno a dos tercios del precio de fabricación de las enzimas. En el caso del uso de lactosa como sustrato carbonado, el procedimiento de producción del cóctel enzimático depende de una fuente externa de carbono. Por lo tanto, el uso de sustratos carbonados resultantes del procedimiento de conversión bioquímica de bagazos lignocelulósicos es una vía importante de progreso.
Otro sustrato inductor que se puede utilizar es la celulosa. Sin embargo, esta tiene un coste aún mayor que la lactosa.
La solicitud de patente US-2011/262997 sustituye a la celulosa utilizada en los procedimientos convencionales de producción de celulasas con biomasa pretratada, en particular por explosión al vapor en condición ácida, biomasa que se ha lavado opcionalmente. La biomasa pretratada se utiliza únicamente como inductor, obteniéndose el crecimiento del microorganismo con glucosa como sustrato carbonado. En los ejemplos del procedimiento operado por lotes, el bagazo pretratado (por cocción ácida) y lavado se añade al inicio del experimento en su totalidad, así como una disolución de glucosa y antiespumante.
Por un lado, este procedimiento tiene el inconveniente de que requiere la detoxificación del bagazo pretratado utilizado antes de su uso. Los lavados son una opción que se proponen para esto. Si este procedimiento se aplicara a escala industrial, la realización de lavados aumentaría mucho el coste del procedimiento.
Por otro lado, el hecho de añadir todo el bagazo pretratado desde el inicio del experimento aumenta mucho la viscosidad del medio, lo que requiere la aplicación de potencias disipadas elevadas. Se denomina “potencia disipada” a la potencia del motor (kW/m3) necesario para la agitación del medio. Este aumento de la viscosidad también requiere caudales de aireación muy elevados para permitir una transferencia de oxígeno suficiente.
Otra solicitud de patente WO-13/190064 también se refiere a la producción de enzimas para la hidrólisis enzimática de biomasa lignocelulósica pretratada (llamada 1a biomasa pretratada). Esta producción se lleva a cabo en ausencia de adición de azúcares (como la glucosa), pero en presencia de un sólido que comprende azúcares complejos y lignina. Este sólido deriva preferentemente de otro procedimiento de tratamiento de biomasa que comprende la hidrólisis enzimática y después la separación de dicho sólido, procedimiento que trabaja a partir de una 2a biomasa pretratada. En este procedimiento de producción de enzimas, es esencial que la relación azúcares complejos/lignina de dicho sólido sea inferior a la relación azúcares complejos/lignina de dicha 2a biomasa. Este criterio requiere eliminar al menos 50% del agua y azúcares solubles del hidrolizado. Esto aumenta el coste del procedimiento. Por otro lado, este sólido contiene un porcentaje muy alto de lignina, lo que hace que la producción de enzimas sea menos eficaz. En efecto, se sabe que los compuestos fenólicos de la lignina tienen un efecto inhibidor sobre las enzimas.
La solicitud de patente WO-13/053924 trabaja con un procedimiento del mismo tipo, la biomasa pretratada también actúa como sustrato de crecimiento, sin adición (o con poca adición) de azúcar simple (glucosa). Por otro lado, el cultivo se lleva a cabo en ausencia de adición de vitaminas y/o minerales y/o inductores de la producción de enzimas. Este procedimiento también necesita la detoxificación del bagazo (especialmente si el pretratamiento utilizado es ácido).
La solicitud de patente WO11028554 enseña el uso del residuo sólido resultante de la hidrólisis de hemicelulosas para la producción de celulasas por Triohoderma reesei, siendo el residuo liberado de su fracción de lignina en una etapa de extracción de lignina. La producción se lleva a cabo en presencia de una aportación de azúcares (glucosa). Las enzimas obtenidas se utilizan para la hidrólisis de la celulosa y no para la hidrólisis de hemicelulosa. El residuo sólido deslignificado se utiliza desde el inicio de la fase de crecimiento del microorganismo, lo que induce dificultades operativas.
Un objeto de la invención es proporcionar una fuente de carbono inductora resultante del procedimiento de producción y que permite producir un cóctel enzimático apropiado para la hidrólisis del bagazo lignocelulósico.
El procedimiento para la producción de celulasas utiliza un bagazo pretratado, preferiblemente no detoxificado previamente.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere a un procedimiento para la producción de enzimas celulolíticas o hemicelulolíticas en cultivo sumergido por un microorganismo celulolítico, siendo dicho microorganismo celulolítico un hongo de la especie Triohoderma reesei, que utiliza un bagazo pretratado tal como se define en la reivindicación 1.
La invención se expone en el conjunto adjunto de reivindicaciones.
Se denomina “bagazo pretratado” el sustrato procedente de bagazos lignocelulósicos que han sufrido una etapa de pretratamiento, preferentemente una explosión al vapor en medio ácido. La biomasa es un tipo de bagazo preferido; aquí, los términos biomasa y bagazo lignocelulósico se usan frecuentemente de manera equivalente.
Un procedimiento para la conversión bioquímica de bagazos lignocelulósicos en alcohol (en particular en etanol) comprende generalmente una etapa de pretratamiento fisicoquímico (preferiblemente una explosión con vapor en un medio ácido) que produce un bagazo pretratado, seguida de una etapa de hidrólisis enzimática utilizando un cóctel enzimático que produce azúcares, después una etapa de fermentación etanólica de dichos azúcares, pudiendo llevarse a cabo la fermentación etanólica y la hidrólisis enzimática simultáneamente (procedimiento SSF) o por separado (procedimiento SHF), y una etapa de purificación del etanol.
La invención tiene muchas ventajas:
- reducir, o incluso eliminar, el aporte de sustrato carbonado de origen externo a dicho procedimiento de conversión bioquímica de bagazos lignocelulósicos.
- producir un cóctel enzimático particularmente adecuado para la hidrólisis enzimática del bagazo lignocelulósico pretratado en el procedimiento de conversión bioquímica.
- proponer un modo de realización del procedimiento que permite no tener que detoxificar (por ejemplo lavar) el bagazo pretratado utilizado. Esto permite reducir la cantidad de efluentes producidos durante los lavados y que deben volver a tratarse antes de su evacuación.
- proponer un procedimiento en el que la viscosidad del medio se mantiene en un valor bajo, lo que permite limitar la demanda de oxígeno y así disponer de un procedimiento que se puede extrapolar a escala industrial.
El procedimiento se puede llevar a cabo en modo continuo o por lotes.
En modo por lotes, un modo particularmente ventajoso para llevar a cabo el procedimiento es proceder a la adición del bagazo de manera secuencial en función de la evolución del pH del medio de reacción y del % de CO2 en los gases a la salida.
Este modo de realización permite el uso de bagazos pretratados no detoxificados (sin lavar).
Una ventaja de este procedimiento, y en particular con el modo de realización anterior, es mantener una baja viscosidad del medio. Esto es importante para no penalizar la transferencia de oxígeno y tener un procedimiento extrapolable a escala industrial.
La invención se refiere más particularmente a un procedimiento de producción de enzimas que comprende dos fases: - una fase a) de crecimiento de dicho hongo de la especie Triohoderma reeseien presencia de al menos un sustrato de crecimiento carbonado, en un reactor cerrado, llevándose a cabo dicha fase de crecimiento con una concentración de sustrato de crecimiento carbonado comprendido entre 10 y 90 g/l. En esta fase no se introduce el bagazo pretratado. Se obtiene así un cultivo de dicho microorganismo.
- una fase b) de producción del cóctel enzimático (o enzimas) en la que se añade al menos un sustrato carbonado inductor por lotes o en continuo, siendo dicho sustrato carbonado inductor una parte de dicho bagazo pretratado, realizándose dicha fase de producción con una adición en continuo o discontinua (por lotes) del bagazo.
Más específicamente, la invención se refiere a un procedimiento para la producción de enzimas celulolíticas o hemicelulolíticas que comprende:
- una fase a) de crecimiento de un microorganismo celulolítico en un reactor cerrado, en presencia de al menos un sustrato carbonado de crecimiento a una concentración comprendida entre 10 y 90 g/l, a una temperatura de 25-30°C y un pH de 4 a 5,5,
- una fase b) de producción de enzimas en la que se introduce al menos un sustrato carbonado inductor a una temperatura de 25-27°C y un pH de 4-5,
procedimiento en el que
- dicho sustrato inductor es un bagazo pretratado que resulta de un procedimiento de pretratamiento de bagazo lignocelulósico, no habiendo sufrido dicho bagazo ninguna hidrólisis enzimática e introduciéndose en modo por lotes o continuo,
- dicho bagazo muestra un rendimiento de hidrólisis enzimática de al menos 80% después de 96 h, llevándose a cabo dicha hidrólisis a 50°C y pH 4,8 sobre dicho bagazo al 15% en peso de materia seca (MS) con 10 mg de enzimas CELLIC® CTEC2 por gramo de MS, siendo dicho rendimiento la relación entre la masa de azúcares simples liberados por hidrólisis enzimática entre la masa máxima teórica que se obtendría si se hidrolizaran todas las celulosas, hemicelulosas y oligómeros resultantes del pretratamiento,
- dicho bagazo pretratado puesto en suspensión a temperatura ambiente, al 10% en peso de MS, tiene una viscosidad aparente inferior a 1 Pa.s para una velocidad de cizallamiento de 10 s-1, preferentemente inferior a 0,15 Pa.s.
- dicho bagazo se introduce a un caudal comprendido entre 0,3 y 0,8 gramos de MS por litro de medio y por hora en modo continuo; en modo por lotes, la cantidad de bagazo añadida cada f horas, estando f comprendido entre 0,5 h y 48 h, está comprendida entre 0,3f y 0,8f gramo de materia seca por litro de medio.
Preferentemente, la viscosidad aparente del medio de la etapa b) se mantiene inferior a 10 Pa.s para una velocidad de cizallamiento de 10 s-1, preferentemente inferior a 1 Pa.s.
El bagazo puede haber sido detoxificado (lavado) antes de ser introducido en la fase b) o no haber sido detoxificado (lavado). La fase b) trabaja generalmente en ausencia de azúcar añadido. Así, de manera muy ventajosa, dicho bagazo pretratado es el único sustrato inductor.
Como se detallará más adelante, el bagazo pretratado está formado por un líquido y un de un sólido, el sólido contiene 20-70% de materia seca de la cual 20-50% de lignina. El sólido de dicho bagazo pretratado contiene además 30-60% en peso de celulosa y 1 -10% en peso de compuestos minerales y hemicelulosa, y el líquido contiene 30-80% en peso de azúcares.
El pretratamiento es una explosión al vapor en condición ácida.
Fase a)
Los microorganismos utilizados en el procedimiento de producción de un cóctel enzimático según la invención son cepas de hongos pertenecientes a la especie Triohoderma reesei, Las cepas industriales de mayor éxito son las cepas pertenecientes a la especie Triohoderma reesei, modificada para mejorar el cóctel enzimático mediante procedimientos de mutación-selección, como por ejemplo la cepa CL847 (patente FR-2555803). También se pueden utilizar cepas mejoradas mediante técnicas de recombinación genética. Estas cepas se cultivan en reactores agitados y aireados en condiciones compatibles con su crecimiento y la producción de enzimas. Se conocen muchas cepas mejoradas, tales como MCG77 (Gallo - Patente US 4275 167), GCM 80 (Allen, AL y Andreotti, RE, Biotechnol-Bioengi 1982 12, 451 -459 1982), Ru T C30 (Montenecourt, BS y Eveleigh, DE, Appl. Environ. Microbiol. 1977, 34, 777-782) y CL847 (Durand et al,, 1984 Proc. Symposium SFM “Genetics of Industrial Microorganisms”. Paris. HESLOT H. Ed, pp 39-50).
El sustrato carbonado para el crecimiento de dicho microorganismo utilizado en dicha fase a) se escoge ventajosamente entre azúcares solubles industriales, y preferentemente entre glucosa, lactosa, xilosa, residuos líquidos (vinazas) obtenidos después de la fermentación etanólica de los azúcares monómeros de los hidrolizados enzimáticos de bagazos lignocelulósicos y los extractos de la fracción hemicelulósica (compuestos de C5) en forma de monómeros procedentes de sustrato lignocelulósico pretratado (tal como el líquido separado a nivel del pretratamiento), utilizado solo o en mezcla. Según su naturaleza, dicho sustrato carbonado se introduce en el reactor cerrado antes de la esterilización o se esteriliza por separado y se introduce en el reactor cerrado después de la esterilización de este último.
Este sustrato carbonado de crecimiento se utiliza en dicha fase a) a una concentración inicial comprendida entre 10 y 90 g de sustrato carbonado por litro de volumen de reacción.
Preferiblemente, dicha fase a) de crecimiento se lleva a cabo durante un período comprendido entre 30 y 70 h, preferiblemente entre 30 y 40 h.
Preferentemente, dicha fase a) de crecimiento trabaja con un pH comprendido entre 4 y 5,5, y preferentemente de 4,8 y a una temperatura comprendida entre 25 y 30°C, y preferentemente de 27°C.
Fase b)
Según la invención, dicho sustrato carbonado inductor utilizado en dicha fase b) de producción es ventajosamente un bagazo pretratado.
La etapa de pretratamiento del bagazo lignocelulósico permite mejorar la susceptibilidad de la fracción celulósica a la hidrólisis enzimática.
Preferentemente, la etapa de pretratamiento se lleva a cabo en medio ácido. Se trata preferentemente de una explosión al vapor en condición ácida. La explosión al vapor está precedida por una etapa de impregnación de dicho bagazo lignocelulósico con una disolución ácida, que es preferentemente una disolución acuosa de ácido sulfúrico. Se habla entonces de explosión al vapor en condición ácida (el bagazo contiene ácido).
Al final del pretratamiento se obtiene un bagazo pretratado y se toma parte de este bagazo para la producción de enzimas, la otra parte se envía a hidrólisis enzimática y después a fermentación para la producción de alcohol. Dicha parte del bagazo puede utilizarse tal cual (bagazo entero) o, preferentemente, puede ser su parte sólida o incluso ventajosamente una porción obtenida después de una separación más o menos importante del líquido.
Según el pretratamiento utilizado, el bagazo se presenta en forma sólida con más o menos humedad, pero sin fase líquida o bien contiene fases sólida y líquida, pudiendo en este último caso separarse la fase líquida total o parcialmente.
En función del método de pretratamiento utilizado, la parte sólida representa entre 20 y 70% del peso del bagazo pretratado. El bagazo utilizado para la producción de enzimas tiene un porcentaje de materia seca de 20-70%, y de manera muy preferida de 40%-60% (lo que corresponde frecuentemente a la obtención de un bagazo en forma sólida al final del pretratamiento).
Dicha parte sólida está constituida por lignina, compuestos minerales, celulosa y hemicelulosa residual no hidrolizada. La parte de celulosa en dicha parte sólida es de 30 a 60% en peso. La parte de lignina en dicha parte sólida es de 20 a 50% en peso. La parte de compuestos minerales y hemicelulosa en dicha parte sólida es de 1 a 10% en peso. La parte líquida de dicho bagazo pretratado contiene xilosa, xiloligosacáridos, manosa, arabinosa, en proporciones comprendidas entre 30 y 80%.
En una realización preferida, el bagazo se utiliza directamente, es decir sin someterse a ningún tratamiento químico o bioquímico. Así, la invención no utiliza un bagazo pretratado que también se ha sometido una hidrólisis enzimática. Son posibles uno o más tratamientos físicos (separación de líquidos, calentamiento, medios de concentración, etc.). En un modo preferido, el bagazo está sin lavar. En algunos casos, se puede lavar para desintoxicar, preferiblemente usando una cantidad mínima de agua.
Dicha fase b) de producción se lleva a cabo durante un período comprendido entre 70 y 200 h, preferentemente entre 100 y 150 h.
Preferiblemente, dicha fase b) de producción trabaja a un pH comprendido entre 4 y 5 y a una temperatura de 25 a 27°C.
Al final de la etapa de pretratamiento, el bagazo pretratado se utiliza directamente o no en la fase b) de producción del cóctel enzimático según la invención como sustrato carbonado inductor.
La fase b) de producción se lleva a cabo bien en modo continuo por adición continua del bagazo con un caudal comprendido entre 0,3 y 0,8 gramos de materia seca por litro de medio y por hora (preferiblemente de 0,4 a 0,6 g/l/h, y lo más frecuentemente 0,5 g/l/h), o en modo por lotes mediante una adición secuencial del bagazo cada f horas, estando f comprendido entre 0,5 horas y 48 horas, siendo la cantidad de bagazo añadida comprendida entre 0,3f y 0,8f gramos de materia seca por litro de medio.
Esto significa que si, por ejemplo, la adición se lleva a cabo cada 12 horas, la cantidad de bagazo añadida estará comprendida entre 3,6 (es decir, 0,3x12) y 9,6 (es decir, 0,8x12) g de materia seca por litro de medio, preferentemente entre 4,8 y 8,4 g de materia seca por litro de medio.
Según un modo preferido de funcionamiento del modo por lotes, la adición de bagazo pretratado se lleva a cabo en función de la señal del % molar de CO2 en los gases de salida y la medida del pH del medio. Una estabilización del % de CO2 a ± 0,02% (para una vvm de 0,5 min-1) junto con un aumento del pH de 0,05 unidades o un aumento de pO2 de al menos 5%, iniciará la adición secuencial de bagazo.
En efecto, después de una adición, se constata un aumento del %CO2 en los gases de salida, esto corresponde al consumo de los azúcares solubles presentes en el bagazo pretratado (esencialmente xilosa y glucosa). Después, las enzimas atacan la celulosa, lo que inducirá la producción de celulasas, y el %CO2 disminuirá.
La adición se lleva a cabo cuando se observa un cese del descenso del %CO2 en los gases de salida y un aumento del pH de más de 0,05 unidades.
La señal de pO2 (concentración de oxígeno disuelto en saturación) se mantiene generalmente alta (por encima de 30% de la concentración en saturación de oxígeno en el medio líquido a presión atmosférica).
Durante el procedimiento, se cuidará ventajosamente que la viscosidad aparente del medio se mantenga por debajo de 10 Pa.s para una velocidad de cizallamiento de 10 s.-1 preferiblemente por debajo de 1 Pa.s.
En efecto, la viscosidad afecta negativamente la transferencia de oxígeno. Es entonces necesario aumentar mucho la potencia disipada y/o el caudal de aireación para asegurar la transferencia, lo que aumenta mucho el gasto energético y puede resultar en que el procedimiento sea difícilmente extrapolable a escala industrial.
El bagazo pretratado utilizable en el procedimiento según la invención tiene las siguientes características:
- en el ensayo de hidrólisis enzimática realizado con una muestra de dicho bagazo reducido al 15% de materia seca (MS), con 10 mg de enzimas CELLIC® CTEC2 (comercializada por Novozymes) por gramo de MS, a 50°C y pH 4,8, tras 96 h, el rendimiento de hidrólisis es superior a 80%. El rendimiento de hidrólisis es la relación entre la masa de azúcares simples (tales como glucosa, xilosa) liberados por hidrólisis enzimática dividida por la masa teórica máxima que se obtendría si se hidrolizaran todas las celulosas, hemicelulosas y oligómeros resultantes del pretratamiento,
- en el ensayo de viscosidad, se pone en suspensión al 10% de MS, el bagazo pretratado tiene una viscosidad aparente inferior a 1 Pa.s, y preferentemente inferior a 0,15 Pa.s, para una velocidad de cizallamiento de 10 s-1. La medición se lleva a cabo con un reómetro AR2000 de TA Instrument con una geometría tipo cinta helicoidal tal como se describe en el artículo “Experimental guidelines to optimize two crucial steps of lignocellulosic bioethanol production: a rheological approach” de Hénault et al. 2014.
La naturaleza de la biomasa al origen del bagazo pretratado tiene una influencia sobre la producción de enzimas, y también sobre los rendimientos en hidrólisis enzimática del procedimiento bioquímico de tratamiento de biomasa lignocelulósica. Los ejemplos muestran que el miscanthus es más reactivo que la paja, produciendo esta última no obstante rendimientos de buen nivel en el procedimiento según la invención.
Ejemplos
Los ejemplos demuestran que el modo de trabajo y el tipo de bagazo utilizado tienen una influencia sobre los rendimientos del procedimiento.
Ejemplo 1 : Uso del bagazo pretratado en modo por lotes: se añade todo el bagazo al inicio del experimento.
El precultivo del hongo se lleva a cabo en un fermentador agitado mecánicamente. El medio mineral tiene la siguiente composición: KOH 1,66 g./l, H3PO4 85% 2 ml/l, (NH4)2SO42,8 g/l, MgSO4, 7 H2O 0,6 g/l, CaCl20,6 g/l, MnSO43,2 mg/l, ZnSO4, 7 H2O 2,8 mg/l, CoCl2 104,0 mg/l, FeSO4, 7 H2O 10 mg/l, macerado de maíz 1,2 g/l, antiespumante 0,5 ml/l y adición de ftalato de potasio a 5 g.l-1 para amortiguar el pH.
El fermentador que contiene el medio mineral se esteriliza a 120°C durante 20 minutos.
El fermentador se inocula con la cepa de Triohoderma reesei CL847.
El crecimiento del hongo en precultivo se lleva a cabo utilizando glucosa como sustrato carbonado, a una concentración de 30 g.l-1. El crecimiento del inóculo tarda de 2 a 3 días y se lleva a cabo a 28°C en una incubadora agitada.
La transferencia hacia al fermentador de producción de celulasa se lleva a cabo cuando la concentración residual de glucosa es inferior a 15 g/l.
Se han llevado a cabo 4 experimentos para producir enzimas utilizando miscanthus pretratado por explosión con vapor en condición ácida:
- 2 experimentos realizados a 10% de MS
- 2 experimentos realizados a 20% de MS
La producción de celulasas se lleva a cabo en un fermentador con agitación mecánica. El medio mineral tiene la siguiente composición: KOH 1,66 g./l, H3PO4 85% 2 ml/l, (NH4)2SO4 2,8 g/l, MgSO4, 7 H2O 0,6 g/l, CaCl2 0,6 g/l, MnSO4 3,2 mg/l, ZnSO4, 7 H2O 2,8 mg/l, CoCl2 10 4,0 mg/l, FeSO4, 7 H2O 10 mg/l, macerado de maíz 1,2 g/l, antiespumante 0,5 ml/l.
El fermentador que contiene el medio mineral se esteriliza a 120°C durante 20 minutos.
El fermentador se inocula al 10% (v/v) con un precultivo líquido de la cepa de Triohoderma reesei CL847. El pH se ajusta a 5,5.
Los experimentos llevados a cabo al 20% de MS fracasaron: no hubo producción de celulasas. El medio era demasiado viscoso y/o contenía demasiados inhibidores.
Los experimentos llevados a cabo al 10% de MS permitieron producir 15 g/l de proteínas después de 150 h, es decir, una productividad de 0,1 g/l/h.
La evolución de la concentración en proteína en modo por lotes con biomasa lignocelulósica pretratada en condición ácida se ilustra en la Figura 1.
Ejemplo 2 : Experimentos en modo por lotes
Se llevaron a cabo 5 experimentos (Exp. 1 a 5).
El precultivo de hongos Triohoderma reesei CL847 se lleva a cabo como en el Ejemplo 1 pero con 15 g/l de glucosa como único sustrato carbonado. La producción de celulasas comienza después de 24 horas añadiendo el bagazo pretratado en modo por lotes, es decir, por adición
- 6 g de extracto seco de bagazo por litro de medio cada 12 horas (Exp. 3, Exp. 4, Exp. 5),
- o 12 g de materia seca por litro con la misma frecuencia (Exp. 1 y Exp. 2).
Los 5 experimentos se llevaron a cabo utilizando 3 sustratos lignocelulósicos diferentes pretratados por explosión al vapor en condición ácida y obtenidos de tal manera que (sin separación de líquidos):
- Miscanthus 1 que responde al ensayo de hidrólisis y al ensayo de viscosidad (viscosidad aparente a 10 s-1 igual a 0,09 Pa.s) (Exp. 1 y Exp. 5)
- Miscanthus 2 que no responde al ensayo de hidrólisis (rendimiento <70%) (Exp. 2 y Exp. 3)
- Paja de trigo 1 que responde al ensayo de hidrólisis y al ensayo de viscosidad (viscosidad aparente a 10 s-1 igual a 1,1 Pa.s) (Exp. 4)
Los ensayos de hidrólisis y de viscosidad son los descritos anteriormente.
La Figura 1 muestra la evolución de la concentración de proteínas de diferentes experimentos realizados con dichos bagazos:
Exp. 1: Bagazo miscanthus 1 - llevado a cabo con una cantidad de bagazo 2 veces superior a la de la realización óptima
Exp. 2: Bagazo miscanthus 2 - llevado a cabo con una cantidad de bagazo 2 veces superior a la de la realización óptima
Exp. 3: Bagazo miscanthus 2 - realización denominada óptima
Exp. 4: Bagazo de paja de trigo 1 - realización denominada óptima
Exp. 5: Bagazo miscanthus 1 - realización denominada óptima
El protocolo de realización denominado óptimo para la producción de celulasas, utilizado en Exp. 3, 4 o 5 es el siguiente:
Después de una fase de crecimiento de 24 h en modo por lotes con glucosa a 15 g/l, se llevan a cabo adiciones de bagazo de miscanthus cada 12 horas aproximadamente con una adición de 6 g de materia seca por litro de medio. Después de 120 h, la frecuencia de las adiciones se ajustó en función de la señal de CO2.
En efecto, después de una adición, se constata un aumento del %CO2 en los gases de salida (Figura 3), esto corresponde al consumo de los azúcares solubles presentes en el bagazo pretratado (esencialmente xilosa y glucosa). Después, las enzimas atacan la celulosa que inducirá la producción de celulasas (Figura 2) y el %CO2 disminuye. La adición se lleva a cabo cuando se produce un cese del descenso del %CO2 en los gases de salida y un aumento del pH superior a 0,05 unidades.
La señal de pO2 (concentración de oxígeno disuelto con saturación) se mantiene alta (por encima de 30%) durante todo el experimento con una potencia disipada baja (menos de 1kW/m3).
En la figura 1, el bagazo se añade cuando sube el pH y deja de bajar el CO2 a razón de 6 g de materia seca por litro por adición. La flecha corresponde al momento en que se añade el bagazo.
Los resultados se dan en la Figura 2 y muestran la importancia tanto del modo de realización como del tipo de bagazo utilizado sobre el rendimiento del procedimiento.
En efecto, el procedimiento óptimo (Exp. 5 en la Figura 2) permite alcanzar una concentración final de celulasas de 35 g/l en 210 h, es decir, una productividad de 0,17 g/l/h.
Es por tanto superior de 70% a la obtenida por lotes presentado en el Ejemplo 1.
Los otros experimentos con el mismo caudal por lotes (realización óptima) pero usando paja pretratada 1 (que responde a os ensayos) (Exp. 4) o miscanthus 2 (que no responde a los ensayos) (Exp3) han llegado a una productividad menor respectivamente de 32% y 25 % a la del experimento Exp. 5.
Los experimentos con caudales por lotes dos veces superiores al óptimo han llevado a malos rendimientos de producción, ya sea con miscanthus pretratado 1 que responde a los ensayos (Exp. 1) o con miscanthus pretratado 2 que no responde a los ensayos (Exp. 2).
En estos experimentos, se constató que la pO2 cayó por debajo de 10%. La paja pretratada utilizada tiene una viscosidad aparente en iso materia en suspensión aproximadamente 12 veces mayor que la del miscanthus, lo que puede explicar la disminución de la pO2.

Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Procedimiento para producir enzimas celulolíticas o hemicelulolíticas que comprende:
- una fase a) de crecimiento de un microorganismo celulolítico, siendo dicho microorganismo celulolítico un hongo de la especie Triohoderma reesei, en un reactor cerrado, en presencia de al menos un sustrato carbonado de crecimiento a una concentración comprendida entre 10 y 90 g/l, a una temperatura de 25-30°C y un pH de 4-5,5, - una fase b) de producción de enzimas, en la que se introduce al menos un sustrato carbonado inductor a una temperatura de 25-27°C y un pH de 4-5,
procedimiento en el que
- dicho sustrato inductor es un bagazo pretratado procedente de un procedimiento de pretratamiento de bagazo lignocelulósico, siendo dicho pretratamiento una explosión con vapor en condición ácida, y no habiendo sido sometido dicho bagazo a hidrólisis enzimática, y estando introducido en modo por lotes o continuo,
- dicho bagazo pretratado, puesto en suspensión a temperatura ambiente, a 10% en peso de MS, tiene una viscosidad aparente inferior a 1 Pa.s para una velocidad de cizallamiento de 10 s-1, preferentemente menor que 0,15 Pa.s,
- dicho bagazo se introduce a un caudal comprendido entre 0,3 y 0,8 gramos de MS por litro de medio y por hora en modo continuo; en modo por lotes la cantidad de bagazo añadida cada f horas, estando f comprendido entre 0,5 h y 48 h, está comprendida entre 0,3f y 0,8f gramos de materia seca por litro de medio,
- dicho bagazo está formado por un líquido y un sólido, conteniendo el sólido 20-70% de materia seca, de las cuales 20-50% de lignina, 30-60% en peso de celulosa y 1-10% en peso de compuestos minerales y de hemicelulosa, y el líquido que contiene 30-80% en peso de azúcares en forma de xilosa, xiloligosacáridos, manosa y arabinosa.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la viscosidad aparente del medio en la etapa b) permanece inferior a 10 Pa.s para una velocidad de cizallamiento de 10 s-1, preferiblemente inferior a 1 Pa.s.
3. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 y 2, en el que el bagazo se ha lavado antes de su introducción.
4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 y 2, en el que el bagazo no se ha lavado antes de su introducción.
5. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores que trabaja en fase b) en ausencia de azúcar añadido.
6. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho bagazo pretratado es el único sustrato inductor.
7. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en el que, en la fase en la que se añade el bagazo, la concentración pO2 de oxígeno disuelto a saturación de oxígeno en el medio a presión atmosférica se mantiene por encima de 30%.
8. Procedimiento de tratamiento de un bagazo pretratado procedente de un pretratamiento de bagazo lignocelulósico, en el que una parte del bagazo pretratado se utiliza como sustrato inductor en el procedimiento de producción de enzimas según una de las reivindicaciones anteriores, y en el que la otra parte del bagazo pretratado se introduce en una etapa de hidrólisis enzimática en presencia de enzimas obtenidas por el procedimiento de producción de enzimas según una de las reivindicaciones anteriores, siendo el hidrolizado obtenido enviado a una etapa de fermentación etanólica, estando el efluente obtenido destilado para separar el etanol
9. Procedimiento según la reivindicación anterior, en el que dicha parte del bagazo pretratado se utiliza directamente en la fase b).
10. Procedimiento según una de las reivindicaciones 8 o 9, en el que se separa una parte o la totalidad del líquido contenido en dicha parte del bagazo pretratado, y se introduce el bagazo obtenido en la fase b).
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