KR102246865B1

KR102246865B1 - 셀룰로오즈 분해 효소를 이용한 참나무 바이오매스의 당화방법

Info

Publication number: KR102246865B1
Application number: KR1020190063910A
Authority: KR
Inventors: 김영숙; 김영균; 박소현; 윤새민
Original assignee: 국민대학교산학협력단
Priority date: 2019-05-30
Filing date: 2019-05-30
Publication date: 2021-04-30
Also published as: KR20200137477A

Abstract

본 발명은 폭쇄 전처리된 참나무 바이오매스를 트리코더마 속 KMF006 균주(KCTC13500BP) 유래 셀룰레이즈를 이용하여 처리하여 당화시키는 것을 특징으로 하는 참나무 바이오매스의 당화방법에 관한 것으로, 본 발명에 따르면, 당화가 어려웠던 폭쇄처리된 참나무 바이오매스를 보다 효과적으로 당화시킬 수 있어, 바이오 연료 생산에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

셀룰로오즈 분해 효소를 이용한 참나무 바이오매스의 당화방법{Method for Saccarification of Oak Tree Biomass Using Cellulose Degrading Enzyme}

본 발명은 셀룰로오즈 분해 효소를 이용한 참나무 바이오매스의 당화방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 폭쇄 전처리된 참나무 바이오매스를 트리코더마 속 KMF006 균주(KCTC13500BP) 유래 셀룰레이즈를 이용하여 처리하여 당화시키는 것을 특징으로 하는 참나무 바이오매스의 당화방법에 관한 것이다.

바이오에너지는 화석연료의 소비에 따른 지구온난화 및 고유가에 따라 화석연료를 대체할 수 에너지로 주목받고 있으며, 식물성 바이오매스 자원으로부터 에탄올을 생산하기 위한 기술이 개발되고 있다.

현재 상용화된 바이오에탄올의 주원료인 사탕수수나 옥수수 같은 전분질계 원료는 식량시장의 가격과 공급에 문제를 야기하면서 사회적 이슈로 등장하였다. 이로 인해 바이오 에탄올을 비롯한 바이오 연료 생산을 위해 연료공급이 충분하고 재생산 가능하며 환경 친화적인 목질계 바이오매스가 차세대 바이오연료 원료로서 부상되고 있다.

그러나 목질계 바이오매스는 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스, 리그닌이 주요 구성성분으로 결합이 단단하고 강도가 큰 특징이 있어 분해가 어렵고 단당류로 분리해 내는데 복잡한 공정이 필요하여 고비용의 문제점이 있다. 목질계 바이오매스의 처리에는 우선 목질계 바이오매스로부터 리그닌을 효과적으로 제거하고 셀룰로오스의 결정화도를 감소시키며 바이오매스의 표면적을 증가시켜 효율적인 당화를 돕는 전처리 공정과 셀룰로오스와 헤미셀룰로오스을 이용 가능한 단당류로 분해하기 위한 당화 공정이 필요하다. 당화 공정은 기존 상용기술로 농황산을 이용하거나 희석 산을 이용하는 산 당화가 있으나 이들은 높은 온도에서 실시함에 따라 furfural, 5-hydroxymethylfurfural (HMF) 등과 같은 발효 저해제가 형성되고 환경오염과 같은 문제를 발생시킬 뿐만 아니라 금속을 부식시키므로 최근에는 효소를 이용한 당화기술이 주류를 이루고 있다. 효소당화는 당화하는데 시간이 소요되는 단점이 있지만 화학약품을 사용하지 않아, 약품회수나 중화과정이 필요하지 않기 때문에 에너지 절감과 환경적 측면에서 매우 유리하다.

섬유소계 물질의 효소 가수분해는 Endo-1,4-β-glucanase (EG), β-glucosidase (BGL) 및 cellobiohydrolase (CBH)를 포함하는 셀룰레이즈 복합 효소에 의한 가수분해 반응에 의해 수행된다. 일반적으로 셀룰레이즈 복합체는 목질계 바이오매스를 영양원으로 하는 생물체에서 얻어지는 경우가 많다. 특히 셀룰로오스를 효율적으로 가수분해할 수 있는 미생물 유래의 셀룰레이즈 개발 연구가 다수 수행되고 있다. 이들 미생물 유래 셀룰레이즈는 주로 다양한 배양조건에 의해 그 활성이 다르게 발현될 수 있고 탄소원과 질소원은 리그닌 분해 효소 생산에 중요한 역할을 한다.

그러나, 현재까지 알려진 목질계 바이오매스의 당화는 비교적 당화가 쉬운 짚, 쌀겨 풀 등을 당화시키는 방법이 대부분이고, 목재를 효율적으로 당화할 수 있는 당화효소나 조건의 확립은 요원한 실정이다.

이에, 본 발명자들은 리그닌이 제거되지 않은 목재에 대하여 당화활성을 가지는 셀룰레이즈를 생산하는 신규 트리코더마 속 KMF006균주를 스크리닝하고, 상기 균주로부터 분리한 셀룰레이즈를 폭쇄전처리된 참나무 칩에 적용하는 경우, 기존의 상업효소를 처리하였을 때보다, 현저히 높은 당화수율을 나타내는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 참나무 바이오매스의 당화방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 참나무 바이오매스를 전처리하는 단계; 및 (b) 상기 전처리된 참나무 바이오매스를 트리코더마 속 KMF006 균주(KCTC13500BP) 유래 셀룰레이즈를 이용하여 처리하여 당화시키는 단계를 포함하는 참나무 바이오매스의 당화방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 당화가 어려웠던 폭쇄처리된 참나무 바이오매스를 보다 효과적으로 당화시킬 수 있어, 바이오 연료 생산에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 스팀-폭쇄 전처리된 참나무의 당화율(%)에 대한 주효과도를 나타낸 것이다.
도 2는 스팀-폭쇄 전처리된 참나무의 당화율(%)의 등고선도를 나타낸 것이다.
도 3은 스팀-폭쇄 전처리된 참나무의 당화율(%) 대 효소농도(FPU) 및 기질농도(%)의 표면반응도를 나타낸 것이다(X: 기질농도, Y:효소농도).
도 4는 스팀-폭쇄 전처리된 참나무의 당화율(%) 대 Tween80(mg/g, 글루칸), 및 기질농도(%)의 표면반응도를 나타낸 것이다(X: 기질농도, Y: Tween80 농도).
도 5는 스팀-폭쇄 전처리된 참나무의 당화율(%) 대 Tween80(mg/g, 글루칸), 및 효소농도(FPU)의 표면반응도를 나타낸 것이다(X: 효소농도, Y: Tween80 농도).
도 6은 스팀-폭쇄 전처리된 참나무의 당화의 최적 조건을 나타낸 것이다.
도 7은 KMF006 유래 효소와 상용효소(Cellic CTec2)를 이용한 스팀-폭쇄 전처리된 참나무와 cellulose의 당화율(%)을 나타낸 것이다.

본 발명에서는 목질계 바이오매스인 참나무 바이오매스를 효과적으로 당화하는 방법을 개발하고자 하였으며, 당화효소 활성이 우수한 신규 트리코더마 속 KMF 006균주(대한민국 특허출원 2018-0069387) 유래 셀룰레이즈를 폭쇄전처리된 참나무 바이오매스에 처리하여, 당화를 수행하는 경우, 상용효소보다 높은 효율로 참나무 바이오매스를 당화할 수 있다는 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, (a) 참나무 바이오매스를 전처리하는 단계; 및 (b) 상기 전처리된 참나무 바이오매스를 트리코더마 속 KMF006 균주(KCTC13500BP) 유래 셀룰레이즈를 이용하여 처리하여 당화시키는 단계를 포함하는 참나무 바이오매스의 당화방법에 관한 것이다.

본 명세서에 사용된 용어, '당화(saccharification)'는 녹말, 섬유소 등과 같은 고분자량의 탄수화물을 효소 또는 산의 작용으로 가수분해하여 저분자량(단당류 또는 이당류)의 당(saccharide)으로 바꾸는 반응을 의미한다.

본 발명에서, 상기 트리코더마 속 KMF006 균주는 셀룰로오스를 단당류(포도당)로 분해하는 과정에 필요한 엔도-β-1,4-글루카네이스, 셀로바이오하이드로레이스 및 베타-글루코시데이스를 모두 생산할 수 있다.

본 명세서에 사용된 용어, '셀룰레이즈(cellulase)'는 셀룰로오스를 가수분해하는 효소의 총칭이며, '셀룰로오스(cellulose)'는 포도당이 β-1,4 글루코시드(β-1,4-glucosde) 결합으로 연결된 동종 중합체를 의미한다.

본 발명의 셀룰레이즈는 트리코더마 속 KMF006 균주를 배양한 배양액에서 수득되는 것을 특징으로 한다.

상기 셀룰레이스는 엔도-β-1,4-글루카네이스 (endo-β-1,4-glucanase; EC 3214), 셀로바이오하이드로레이스(cellobiohydrolase; EC 32191) 및 베타-글루코시데이스(β-glucosidase; EC32121)로 구성된 군에서 선택될 수 있다.

상기 엔도-베타-1,4-글루카네이스는 셀룰로오스의 β-1,4-글루코시드 결합을 내부에서 무작위로 가수분해하는 효소이고, 일반적으로 가용성의 카르복시메틸셀룰로오스(carboxymethyl cellulose, CMC)를 기질로 사용하므로 CMC 분해효소(CMCase)라고도 불린다.

셀로바이오하이드로레이스는 엔도-베타-1,4-글루카네이스에 의해 가수분해된 산물의 환원 말단 및 비환원 말단을 가수분해하여 글루코스 이당체인 셀로바이오스(cellobiose)를 생성한다. 생성된 셀로바이오스는 엔도-베타-1,4-글루카네이스와 셀로바이오하이드로레이스의 활성을 억제하게 된다. 베타-글루코시데이스는 셀로바이오스를 글루코스(포도당)로 분해하므로 셀로바이오스에 의한 엔도-베타-1,4-글루카네이스와 셀로바이오하이드로레이스의 활성 억제를 제거한다.

본 발명의 '셀룰레이즈'는 트리코더마 속 KMF006 균주(KCTC13500BP) 배양물, 세포 파쇄물, 정제된 효소 및 농축액 등을 모두 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 농축액이란, 상기 트리코더마 속 KMF006 균주의 배양물 또는 무세포( cell-free)배양액을 농축한 것을 의미한다.

본 발명의, 무세포(cell-free) 배양액이란 상기 미생물을 배양한 배지에서 배양된 미생물을 제거한 것을 의미하며, 배양물은 상기 배양된 미생물이 포함된 것을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 참나무 바이오매스의 전처리는 폭쇄전처리인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 스팀-폭쇄 전처리인 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, 상기 폭쇄는 20~30kgf/cm² 조건에서 3~20분간 수행하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 5~13분간 수행할 수 있다.

본 발명의 일 양태에서는 스팀-폭쇄 전처리 공정은, Masonite 기술을 기반으로 진행하였으며, 스팀-폭쇄 처리는 25kgf/cm²의 압력으로 처리시간을 3, 5, 7, 13분으로 조정하여 처리하였고, 스팀-폭쇄 처리된 참나무를 사이클론(cyclone)에서 수집하고, 약 40℃로 냉각한 후 고체 회수를 위해 여과하였다. 여과 후, 남은 잔사에 대하여, 화학적 조성분 분석을 실시하고, 당화용 기질로 사용하였다.

본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계는 당화 증진제를 추가로 처리하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 당화 증진제로는 비이온성 물질로 Tween 80 및 PEG 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 Tween 80을 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 당화 증진제로 트윈 80(Tween 80)을 사용하는 경우, 10~500mg/g _글루칸 으로 처리하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 10~200mg/g _글루칸,더욱 바람직하게는 50~100mg/g _글루칸, 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 셀룰레이즈는 10~60 FPU로 처리하는 것을 특징을 할 수 있으며, 바람직하게는 20~30FPU로 처리할 수 있다.

본 발명에 있어서, 당화처리에 있어서, 폭쇄재의 기질 농도는 3~10%일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 5~8%일 수 있으며, 가장 바람직하게는 7%일 수 있다.

본 발명의 일 양태에서는 참나무 폭쇄재(25kgf/cm², 5min)를 KMF006 균주 유래 셀룰레이즈를 이용하여 당화시켰을 때, 기질농도 :7%, 효소농도 :약 25.66FPU, 당화 증진제 Tween80 :100mg/g,glucan에서 최대 예측 당화율이 약 98.41%인 것으로 확인되었다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 셀룰레이즈 효소액의 제조

트리코더마 속 KMF006 균주(KCTC13500BP)를 MEA 플레이트에서 5일 내지 7일 동안 배양하고, PDB 50 ㎖에 균사체를 접종하여 30℃에서 150 rpm으로 진탕하면서 5일 동안 전배양하였다.

본배양은 하기 표 1에 기재된 조건으로 액체배지를 제조하여 수행하였다. 제조된 액체배지에 전배양액 5%(w/v)를 접종하고, 150 rpm으로 30℃에서 약 4주 동안 배양하였다. 배양이 진행되는 동안 매일 배양액 500㎕를 회수하고, 원심분리하여 균체를 제거한 후 효소액으로 사용하였다.

성분	농도
아비셀 (g/L)	30
효모 추출물 (g/L)	15
K₂HP0₄ (g/L)	5
KH₂P0₄(g/L)	5
MgS0₄(g/L)	3
pH	6.0

실시예 2: 셀룰레이즈 효소활성 측정

실시예 1에서 수득한 트리코더마 속 KMF006 균주 유래 효소액의 베타-글루코시데이스 활성, 엔도-베타-1,4-글루카네이스(endo-β-1,4-glucanase, EG) 활성 및 셀로바이오하이드로레이스(cellobiohydrolase, CBH)의 활성을 측정하였다.

2-1: 베타-글루코시데이스(β-glucosidase, BGL) 활성 측정

0.1M 아세트산 나트륨(sodium acetate, NaAC) 완충용액(pH 5.0) 0.8㎖에 10mM p-니트로페닐-β-D-글리코피라노시드(p-nitrophenyl-β-D-glycopyranoside,pNPG) 0.1 ㎖과 상기 본배양액 0.1 ㎖를 첨가하여 50℃에서 15분 동안 반응시켰다. 이후 2M 탄산나트륨(Na2CO3) 용액 0.1 ㎖를 첨가하여 반응을 정지시키고, 405㎚에서 흡광도를 측정하여 생성된 p-니트로페놀(p-nitrophenol)의 양을 확인하였다. 효소 활성 단위인 1 unit(U)은 일정 조건에서 15분 동안 p-니트로페놀 1 μmol을 생성하는데 필요한 효소의 양으로 정의하였다.

2-2: 엔도-베타-1,4-글루카네이스 활성

0.1M 아세트산 나트륨 완충용액(pH 5.0)에 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨을 2%(v/v) 농도로 용해시켜 효소 반응액을 제조하였다. 효소 반응액 45 ㎕에 배양액 5 ㎕를 첨가하여 50℃에서 30분 동안 반응시키고, 구리 용액 50 ㎕를 첨가한 후 100℃에서 10분 동안 가열하여 반응을 정지시켰다. 생성된 환원당의 양은 Somogyi-Nelson 방법으로 측정하였다(최신 실험 미생물학, p253, 2001) 효소 활성의 단위인 1 unit(U)은 일정 조건에서 30분 동안 글루코스(glucose) 1 μmol을 생성하는데 필요한 효소의 양으로 정의하였다.

2-3: 셀로바이오하이드로레이스 활성

0.1M 아세트산 나트륨 완충용액(pH 5.0) 08 ㎖에 p-니트로페닐-β-D-셀로바이오시드(p-nitrophenyl-β-D-cellobioside, pNPC) 0.1 ㎖과 배양액 0.1㎖를 첨가하여 50℃에서 15분 동안 반응시켰다. 이후 2M 탄산나트륨 용액 0.1 ㎖를 첨가하여 반응을 정지시키고, 405㎚에서 흡광도를 측정하여 생성된 p-니트로페놀(p-nitrophenol)의 양을 확인하였다. 효소 활성 단위인 1 unit(U)은 일정 조건에서 15분 동안 p-니트로페놀 1 μmol을 생성하는데 필요한 효소의 양으로 정의하였다.

효소활성단위 FPU(filter paper unit)는 트리코더마 속 KMF006 균주유래 셀룰레이즈를 이용하여, 셀룰레이즈 활성의 측정방법(Measurment of Cellulose Activity, NREL/TP-510-42628)에 의거하여 측정하였다. 기질로 50mg의 Whatman No. 1 여과지를 사용하여, 100mM sodium citrate buffer pH 4.5를 사용하였다. 기질인 50mg의 여과지를 넣은 테스트 튜브에 각 버퍼와 효소액을 넣고 50℃에서 60분간 반응시켰다. 그 후, 3mL DNS(3, 5 Dimitrosalicylic acid, Alfa Aesar) 시약을 넣고 5분간 끓는물에 넣고 반응을 정지시키고 상온으로 냉각시켰다. 펄프화된 여과지를 13500 rpm으로 10분간 원심분리하여 가라앉힌 후, 증류수와 일정비율로 섞어 540nM에서 흡광도를 측정하였다.

상기 방법으로 측정된 KMF006 균주 유래 효소액의 베타-글루코시데이스 활성, 엔도-베타-1,4-글루카네이스(endo-β-1,4-glucanase, EG) 활성 및 셀로바이오하이드로레이스(cellobiohydrolase, CBH)의 활성을 표 2에 나타내었다.

	효소 활성 (U/㎖)
효소 종류	베타-글루코시데이 스	엔도-베타-1,4-글루 카네이스	셀로바이오 하이드로레이스
KMF006 균주 유래 효소액	216.04±1094	202.13±785	8.9±034

실시예 3: 참나무 바이오매스의 폭쇄 전치리

목질 바이오오매스는 스팀-폭쇄 전처리된 한국산 참나무(Guercus mongolica)를 사용하였다. 사용한 참나무는 경상남도 진주시에서 벌채된 원목에서 생산된 우드 칩을 구매하여 사용하였다. 비교 기질로는 cellulose(DAEJUNG, 20~100미크론)을 사용하였다. 스팀-폭쇄 전처리 공정은, Masonite 기술을 기반으로 한 맞춤형 batch pilot 유닛(유림하이텍, 한국)에서 스팀-폭쇄 전처리가 진행되었다. 스팀-폭쇄 처리는 25kgf/cm²의 압력으로 처리시간을 3, 5, 7, 13분으로 조정하여 처리하였고, 스팀-폭쇄 처리된 참나무를 사이클론(cyclone)에서 수집하고, 약 40℃로 냉각한 후 고체 회수를 위해 여과하였다. 여과 후, 남은 잔사에 대하여, 화학적 조성분 분석을 실시하고, 당화용 기질로 사용하였다.

폭쇄 전처리된 참나무 목재의 화학적 조성을 분석하기 위하여, 바이오매스에서 구성적 탄수화물과 리그닌의 결정방법(Determination of structural carbohyrates and lignin in biomass method, NREL/TP 510-42618)에 의거하여, 글루칸, 자일란, 갈락탄 아라비난, 만난, 리그닌, Ash에 대한 분석실험을 실시하였으며, 그 결과를 표 3에 나타내었다.

스팀-폭쇄 참나무의 화학적 조성(25kgf/cm², 5분)

Component		Rate of component ( % w/w)
Component	Glucan	Xylan	Galactan	Arabinan	Mannan	Lignin	Ash
참나무 폭쇄재 (25kgf/cm², 5분)	40.99	7.37	-	-	2.04	38.58	0.41

실시예 4: 폭쇄전처리 참나무 바이오매스의 최적 당화조건 확립

KMF006 균주 유래 효소를 이용한 실시예 3에서 스팀-폭쇄 전처리된 참나무 바이오매스의 최적 당화조건을 확립하였다.

사용한 효소는 농축 후 효소활성이 각각 endo-β-glucanase활성이 3,241 ± 50.07unit/mℓ, β-glucosidase활성이 3,587 ± 41.92 unit/mℓ, cellobiohydrolase활성이 256.92 ± 12.46 unit/mℓ 인 것을 이용하였다.

당화 증진제로는 Tween80(Sigma-aldrich)을 사용하였으며, 1~5% 수준으로 설정하여 사용하였다.

실험 디자인은 반응표면분석법(response surface method) 중 Box-behnken방법을 이용하였다. 영향 요인은 당화율에 영향을 미치는 인자들 중 기질농도, 효소농도 및 당화 증진제 농도를 3가지 요인으로 설정하였으며 각 요인의 농도 범위를 표 4에 나타낸 바와 같이 설정하여 시험을 진행하였다. 설계는 Box-behnken법에서 3인자 3수준 완전요인 설계법을 이용하여 수행하였으며 반복실험 횟수 2번, 중앙점 1번으로 설정하여 총 26개의 실험수를 구성하였고 이 디자인을 코드화 형식으로 표 5에 나타내었다.

반응표면분석법을 위한 인자 수준

Factor		Levels of factor
Factor		-	0	+
1	Substrate concentration(%) steam-explosion oak (25kgf/cm², 5min)	3	5	7
2	Enzyme concentration (FPU, KMF006)	10	35	60
3	Tween80 (mg/g,glucan)	100	300	500

변수들의 실험 디자인 코드화 형식

Order	Run	Substrate concentration	Enzyme concentration	Tween80 (mg/g,glucan)
6	1	+	0	-
1	2	-	-	0
7	3	-	0	+
9	4	0	-	-
8	5	+	0	+
15	6	0	0	0
14	7	0	0	0
12	8	0	+	+
11	9	0	-	+
5	10	-	0	-
10	11	0	+	-
3	12	-	+	0
4	13	+	+	0
13	14	0	0	0
2	15	+	-	0
21	16	+	0	-
16	17	-	-	0
22	18	-	0	+
24	19	0	-	-
23	20	+	0	+
30	21	0	0	0
29	22	0	0	0
27	23	0	+	+
26	24	0	-	+
20	25	-	0	-
25	26	0	+	-
18	27	-	+	0
19	28	+	+	0
28	29	0	0	0
17	30	+	-	0

반응표면분석법(Box-behnken)을 이용하여 폭쇄전처리된 참나무재의 최적 당화 조건 도출 결과를 도 1~6에 나타내었다. 당화에 영향하는 3가지 요인인 기질농도, 효소농도 및 당화 증진제 농도에 따른 주효과도는 도 1에 나타난 바와 같이, 기질농도가 가장 큰 주효과도를 보였으며 기질농도가 높아질수록 높은 당화율을 보이는 경향을 나타내었다. 기질농도는 7%에서 가장 높은 당화율을 보이는 것으로 나타났다. 또한 효소농도의 경우, 농도가 높아질수록 높은 당화율을 나타내었으며 60FPU에서 감소하는 경향을 보였다. Tween80의 경우, 100mg/g,glucan 농도에서 가장 높은 당화율을 나타내었으며 당화 증진제 농도가 높아질수록 당화율이 감소하는 경향을 보였다. 또한 도 2~5에 나타낸 등고선도와 표면도에서도 동일한 경향을 나타내었다.

상기 결과를 바탕으로 도 6에 나타난 바와 같이, 참나무 폭쇄재(25kgf/cm², 5min)의 요인 3가지(기질농도, 효소농도, 당화 증진제(Tween80) 농도)에 따른 최적 당화조건을 도출한 결과, 기질농도 :7%, 효소농도 :약 25.66FPU, Tween80 :100mg/g,glucan에서 최대 예측 당화율이 약 98.41%인 것으로 도출되었다.

실시예 5: 최적조건에 의한 참나무 바이오매스 당화

실시예 3과 동일하게 처리된 스팀-폭쇄 전처리된 참나무 폭쇄재(25kgf/cm²,3,5,7 및13분)으로 기질 농도 3~7% 범위로 사용하였다. 참나무 폭쇄재의 화학적 조성분을 표 6에 나타내었다.

Component	Rate of component ( % w/w)
Component	Glucan	Xylan	Galactan	Arabinan	Mannan	Lignin	Ash
참나무 폭쇄재 (25kgf/cm², 3min)	37.73	9.55	-	-	1.91	37.46	0.40
참나무 폭쇄재 (25kgf/cm², 5min)	40.99	7.37	-	-	2.04	38.58	0.41
참나무 폭쇄재 (25kgf/cm², 7min)	42.71	4.63	-	-	1.66	39.60	0.30
참나무 폭쇄재 (25kgf/cm², 13min)	47.03	0.76	-	-	-	42.05	0.30
1) Acid insoluble lignin

KMF001 유래 셀룰레이즈 효소는 효소활성이 각각 endo-β-glucanase활성이 3,241 ± 50.07unit/mℓ,β-glucosidase활성이 3,587 ± 41.92 unit/mℓ, cellobiohydrolase활성이 256.92 ± 12.46 unit/mℓ 인 것을 이용하였다. 대조군으로는 상용효소 Cellic CTec2 (Novozyme)를 비교효소로 사용하였다.

당화 증진제는 Tween 80(Sigma-aldeich)를 사용하였으며, 실시예 4에서 확립한 최적조건인 하기 조건으로 당화를 수행하였다.

폭쇄전처리참나무 : 기질농도 7%, 효소농도 25.66FPU, Tween80 100mg/g,glucan)

당화조건 : 72시간, 5.0 pH, 250rpm

그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, KMF006 유래 효소는 비교기질인 cellulose(DAEJUNG, 20~100미크론)에 대해 당화율 81.42%로, 상용효소(Cellic CTec2)가 76.55% 당화율을 나타낸 것에 비해 높은 당화율을 나타내었다.

참나무 폭쇄재에 대해서는 폭쇄시간에 따라 당화율이 다른 결과를 보였다. 당화 증진제을 적용하지 않은 참나무의 경우, 폭쇄시간이 3, 5, 7분으로 전처리된 참나무는 당화율이 약 50~76% 정도를 나타내었고, 13분 폭쇄전처리한 경우에 약 90%정도의 당화율을 나타내어 상용효소와 유사한 결과를 나타냈다.

그러나 당화 증진제를 적용하는 경우, 폭쇄처리시간 5분에서도 95% 이상의 높은 당화율로 상용효소보다 우수한 결과를 나타냈다. 이와 같이 본 실시예에서 도출된 최적 당화 조건이 폭쇄전처리된 참나무 기질에 대한 당화성능을 현저하게 증진시킨다는 것을 확인하였으며, 실제 적용가능한 조건으로 판단하였다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

다음 단계를 포함하는 참나무 바이오매스의 당화방법:
(a) 참나무 바이오매스를 20~30kgf/cm² 조건에서 3~20분간 스팀-폭쇄 전처리하는 단계; 및
(b) 상기 전처리된 참나무 바이오매스를 리그닌을 분해하는 트리코더마 속 KMF006 균주(KCTC13500BP) 유래의 엔도-베타-1,4-글루카네이스(endo-β-1,4-glucanase), 베타-글루코시데이스(β-glucosidase) 및 셀로바이오하이드로레이스(cellobiohydrolase)을 포함하는 셀룰레이즈 효소액과 당화 증진제를 이용하여 처리하여 당화시키는 단계.
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제1항에 있어서, 상기 당화 증진제는 트윈 80인 것을 특징으로 하는 방법.
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제5항에 있어서, 상기 당화 증진제는 트윈 80(Tween 80)을 10~500mg/g _글루칸 으로 처리하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 셀룰레이즈는 10~60 FPU로 처리하는 것을 특징으로 하는 방법.