BRPI0600409B1 - processo de produção de etanol a partir de materiais celulósicos ou ligno-celulósicos - Google Patents
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Abstract
"processo de produção de enzimas celulolíticas e hemicelulolíticas, utilizando os resíduos de destilação de fermentação etanólica de hidrolisados enzimáticos de materiais (ligno)-celulósicos". a presente invenção refere-se a processo de produção de enzimas celulolíticas e/ou hemicelulolíticas que utiliza o resíduo da fermentação etanólica de hidrolisados enzimáticos de materiais celulósicos ou lignocelulósicos que compreende as seguintes etapas: 1) o pré-tratamento químico e/ou físico de um substrato celulósico ou ligno-celulósico; 2) a hidrólise enzimática do substrato pré-tratado utilizando enzimas celuiolíticas e/ou hemiceluiolíticas; 3) a fermentação etanólica por um microorganismo alcoolígeno apropriado do hidrolizado proveniente da etapa (2) e obtenção de um mosto de fermentação; e 4) a separação do microorganismo alcoolígeno utilizado na etapa (3), a separação/purificação do etanol e a obtenção de uma fase aquosa que constitui um resíduo; e no qual esse resíduo serve para produzir as enzimas celulolíticas e/ou hemiceluiolíticas utilizadas na etapa (2).
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROCESSO DE PRODUÇÃO DE ETANOL A PARTIR DE MATÉRIAS CELULÓSICOS OU LIGNO-CELULÓSICOS". A presente invenção refere-se à produção de enzimas celulolíticas e/ou hemicelulolíticas, notadamente no âmbito da produção de etanol a partir de materiais celulósicos ou ligno-celulósicos. A partir dos anos 70, a transformação da biomassa ligno-celulósica em etanol, após hidrólise dos poli-sacarídeos constitutivos em açúcares fermentos-alvos, constituiu o objeto de numerosos trabalhos.
As madeiras de espécies folhosas e as palhas de cereais são substratos os mais utilizados. São constituídos na maior parte de aproximadamente 40 a 50 % de celulose, 20 a 25 % de hemicelulose e de 15 a 25 % de lignina.
Outras fontes, culturas florestais consagradas, resíduos de plantas alcoolígenas, açucareiras e cerealistas, resíduos da indústria do papel e produtos de transformação dos materiais celulósicos e ligno-celulósicos são utilizáveis.
Desses três polímeros, celulose, hemicelulose e lignina, a celulose é a principal fonte de açúcares fermentos-alvos em etanol, pois é constituída de glicose, esta sendo facilmente fermentada em etanol por Saccharomyces cerevisiae em processos industriais aprovados e com bom desempenho. As pentoses contidas nas hemiceluloses não são eficazmente convertidas em etanol. Outros microorganismos dentre os gêneros Saccharomyces, Pichia, Candida, Pachysolen, Zymomonas, Klebsiella, Escherichia, podem ser escolhidos para valorizar os açúcares monômeros oriundos da biomassa em etanol. O processo de transformação dos materiais ligno-celulósicos em etanol (ver a figura 1) compreende uma etapa de pré-tratamento físico-químico, seguida de uma etapa de hidrólise enzimática ou química, de uma etapa de fermentação etanólica dos açúcares liberados e de uma etapa de recuperação do etanol. A etapa de pré-tratamento tem por objeto liberar os açúcares contidos nas hemiceluloses sob a forma de monômeros, essencialmente das pentoses, como a xilose e arabinose, e das hexoses, como a galactose, a manose e glicose, e melhorar a acessibilidade da celulose enviscada na matriz de lignina e hemiceluloses. Numerosas tecnologias existem: cozimentos ácidos, cozimentos alcalinos, explosão ao vapor, processos organo-solv, etc. A eficácia do pré-tratamento é medida pela taxa de recuperação das hemiceluloses e pela susceptibilidade à hidrólise do resíduo celulósico. Os pré-tratamentos ácido em condição suave e por explosão ao vapor são os mais adaptados. Permitem uma recuperação total das pentoses e uma boa acessibilidade da celulose à hidrólise. O resíduo celulósico é hidrolísado, seja por via ácida, seja por via enzimática com a utilização de enzimas celulósicas e/ou hemicelulolíti-cas. Microorganismos, como os cogumelos pertencentes aos gêneros Tri-choderma, Aspergillus, Penicillium ou Schizophyllum, ou as bactérias anae-róbias pertencentes, por exemplo, ao gênero Clostridium, produzem essas enzimas, contendo notadamente as celulases e as xilanases, adaptadas à hidrólise total dos polímeros que constituem os vegetais. A via ácida, realizada com o auxílio de ácido forte, ácido sulfúri-co notadamente, é eficaz, mas requer importantes quantidades de produtos químicos {ácido, depois base para a neutralização). A hidrólise enzimática não apresenta esse inconveniente; ela é feita, por outro lado, em condições suaves e é eficaz. Ao contrário, o custo das enzimas permanece muito elevado. Dessa forma, muitos trabalhos foram feitos para reduzir esse custo: o aumento da produção de enzimas inicíalmente, selecionando as cepas hi-perprodutoras e melhorando os processos de fermentação, a diminuição da quantidade de enzimas em hidrólise em seguida, otimizando a fase de pré-tratamento ou melhorando a atividade específica dessas enzimas. No decorrer do último decênio os principais trabalhos se voltaram para compreender os mecanismos de ação das celulases e de expressão das enzimas, a fim de fazer excretar o complexo enzimático o mais apropriado à hidrólise dos substratos ligno-celulósicos, modificando as cepas com os instrumentos de biologia molecular, O microorganismo o mais utilizado para a produção de celulases é o cogumelo Trichoderma reesei. As cepas selvagens têm a faculdade de excretar, em presença de um substrato indutor, a celulose, por exemplo, o complexo enzimático considerado como o mais adaptado à hidrólise da celulose. As enzimas do complexo enzimático contêm três grandes tipos de atividades: as endoglucanases, as exoglucanases e as celobiases. Outras proteínas que possuem propriedades indispensáveis à hidrólise dos materiais ligno-celulósicos são também produzidas por Trichoderna reesei, as xilana-ses por exemplo. A presença de um substrato indutor é indispensável à expressão das enzimas celulolíticas e/ou hemicelulolíticas. A natureza do substrato carbonado tem uma forte influência sobre a composição do complexo enzimático. É o caso da xilose que, associada a um substrato carbonado indutor como a celulose ou a lactose, permite melhorar significativamente a atividade dita xilanase.
As técnicas de genética clássica por mutação permitiram a seleção de cepas de Trichoderma reesei hiperprodutoras de celulases, tais como as cepas MCG77 (Gallo- patente US 4275 167), MCG 80 (Allen, A.L. e An-dreotti, R.E., Biotechnol-Bioengi 1982,12, 451-459 1982), RUT C30 (Monte-necourt, B.S. e Eveleigh, D.E., Appl. Environ. Microbiol. 1977, 34,777-782) e CL847 (Durand et al„ 1984, Proc. Colloque SFM "Génetique des microorga-nismes industrieis’1. Paris. H. HESLOT Ed, pp 39-50). As melhorias permitiram obter cepas hiperprodutoras, menos sensíveis à repressão catabólica sobre açúcares, monômeros notadamente, glicose, por exemplo, em relação às cepas selvagens.
Cepas recombinantes foram obtidas a partir das cepas de Trichoderma reesei Qm9414, RutC30, CL847, clonando genes heterólogos, a invertase de Aspergillus niger, por exemplo, para diversificar a fonte de carbono necessária à produção de celulases, e/ou superexpressando a celobia-se, a fim de melhorar o rendimento de hidrólise enzimática, as celobiases sendo consideradas como as enzimas limitadoras na reação. Essas cepas conservaram, sua hiperprodutividade e sua aptidão a serem cultivadas em fermentador. O processo de produção de celulases por Trichoderma reesei constituiu o objeto de melhorias importantes com vistas à extrapolação na escala industrial.
Para conseguir boas produtividades em enzimas, é necessário fornecer uma fonte de carbono rapidamente assimilável para o aumento de Trichoderma reesei e um substrato indutor que permita a expressão das celulases e a secreção no meio de cultura. A celulose pode exercer dois papéis; todavia, é de difícil utilização no estágio industrial e foi substituída por fontes de carbono solúveis, glicose, xilose ou lactose, a lactose exercendo também o papel de substrato indutor. Outros açúcares solúveis como a ce-lobiose e a soforose foram descritos como indutores, mas são muito onerosos para serem utilizados no estágio industrial. Todavia, constatou-se que as produções de celulases por Trichoderma reesei, com substratos solúveis, são muito inferiores àquelas obtidas sobre celulose em cargas. Isto é devido ao efeito repressor dos açúcares facilmente assimiláveis, com forte concentração. A alimentação em contínuo dos substratos carbonados solúveis permitiu levar à repressão catabólica, limitando a concentração residual nas culturas e otimizando a quantidade de açúcar, permitindo conseguir melhor rendimento e melhor produtividade enzimática (ver a patente FR-B-2 555 603). A lactose permanece, em um processo de produção industrial de enzimas celulolíticas, um dos substratos os mais apropriados e um dos menos caros; permanece todavia onerosa e representa aproximadamente um terço do preço de custo das enzimas. Apesar de todos os progressos feitos, o custo das enzimas permanece um posto importante na transformação da biomassa celulósica em etanol, de 30 a 50%; além disso, no caso da utilização de lactose como fonte de carbono para a produção de celulases, o processo é dependente de uma fonte de carbono externa. Dessa forma, a utilização de substratos carbonados provenientes da fileira, as hemiceluloses hidrolisadas, por exemplo, é uma via de progresso importante, caso a fonte de carbono indutora esteja facilmente disponível.
Descrição Detalhada da Invenção A presente invenção refere-se à utilização do resíduo obtido após fermentação etanólica dos açúcares monômeros dos hidrolisados enzi-máticos de biomassa celulósica, como fonte de carbono indutora para a produção de enzimas celulolíticas e/ou hemícelulolíticas com cepas de cogumelo celulolítico, notadamente aquelas pertencentes ao gênero Trichoderma reesei. A fonte de carbono principal pode ser um açúcar solúvel industrial, por exemplo a glicose, a lactose ou a xilose, ou um extrato da fração hemi-celulósica sob a forma de monômeros provenientes da biomassa pré-tratada. O resíduo pode também ser utilizado também como fonte de carbono total, isto é, para o aumento do microorganismo e a indução do sistema de expressão. Essa fonte de carbono é utilizável pelas cepas melhoradas geneticamente e notadamente as cepas recombinantes.
Um objeto da invenção é de propor uma fonte de carbono indutora ou total, facilmente disponível, permitindo produzir enzimas celulolíticas e/ou hemícelulolíticas às atividades apropriadas à hidrólise da biomassa celulósica. O esquema de produção de enzimas celulolíticas e/ou hemicelulolí-ticas, a partir de resíduos de fermentação etanólica, de acordo com a invenção, está representado na figura 2. Essa invenção permite, por outro lado, a valorização em interno de co-produtos não valorizáveis em etanol.
Uma primeira etapa de pré-tratamento da biomassa é realizada para melhorar a susceptibilidade à hidrólise enzimática da fração celulósica e hidrolisar a fração hemicelulósica. O método mais apropriado é a explosão ao vapor em condição ácida. Nas condições ótimas, de 150 a 250 °C, durante alguns minutos, ela transforma as hemiceluloses em monômeros, minimizando as perdas, em furfural notadamente, a xilose sendo o açúcar majoritário. Os açúcares liberados podem ser extraídos por lavagem em fase aquo-sa; o resíduo sólido da extração só contém então a celulose e a lignina. Após extração, os açúcares liberados são utilizados para a produção de enzimas como fonte de carbono principal ou valorizados em etanol por fermentação com as cepas apropriadas. A fração celulósica, livre ou não da fração hemicelulósica hidroli-sada e, se foro caso, a lignina, é hidrolisada pelas enzimas celulolíticas e/ou hemicelulolíticas produzidas pelas cepas especializadas, pelas celulases de Trichoderma reesei sendo as mais eficazes e as mais apropriadas, quando os substratos carbonados são provenientes da biomassa celulósica ou ligno-celulósica. O material a hidrolisar é colocado em suspensão em fase aquosa à razão de 6 a 25 % de matéria seca, de preferência 10 a 20 %, o pH é ajustado entre 4 e 5,5, de preferência entre 4,8 e 5,2 e a temperatura entre 40 e 60 °C, de preferência entre 45 e 50 °C. A reação de hidrólise é acionada por acréscimo de celulases; a quantidade habitualmente utilizada é de 10 a 30 mg de proteínas excretadas por grama de substrato pré-tratado. A reação dura geraímente de 15 a 48 horas, segundo a eficácia do pré-tratamento, a composição da mistura de celulases e a quantidade de enzimas acrescentadas. A reação é seguida por dosagem dos açúcares liberados, notadamente a glicose. A solução açucarada é separada da fração sólida não-hidrolisada, essencialmente constituída de lignina, por filtragem ou centrifugação; ela é utilizada para a fermentação etanólica. Quando a fração celulósica estiver livre das hemiceluloses hidrolisadas na etapa de tratamento, a glicose é o açúcar majoritário retirado nessa etapa. O resíduo da fermentação etanólica, após separação do etanol, é utilizado como açúcar de carbono indutor ou como fonte de carbono principal para a produção de enzimas. A concentração desse resíduo é ajustada para se obter a concentração em fonte de carbono a mais adaptada ao processo de produção de enzimas celulolíticas e/ou hemicelulolíticas.
Em geral, o etanol é separado do mosto de fermentação por destilação e o resíduo é constituído dos resíduos de destilação.
As cepas utilizadas para a produção de enzimas celulolíticas e/ou hemicelulolíticas são cepas de cogumelos pertencentes aos gêneros Trichoderma, Aspergillus, Penicillium ou Schizophyllum, de preferência pertencentes à espécie Trichoderma reesei. As cepas industriais de melhor desempenho são as cepas pertencentes à espécie Trichoderma reesei, modificadas para melhorar as enzimas celulolíticas e/ou hemicelulolíticas pelos processos de mutação-seleção, como, por exemplo, a cepa IFP CL847 (patente francesa FR-B-2 555 803); as cepas melhoradas pelas técnicas de re-combinação genéticas podem ser também utilizadas.
Essas cepas são cultivadas em fermentadores agitados e arejados em condições compatíveis com seu aumento e a produção das enzimas. Segundo sua natureza, o substrato carbonado escolhido para a obtenção da biomassa é introduzido no fermentador antes da esterilização ou é esterilizado separadamente e introduzido no fermentador após esterilização deste para ter uma concentração inicial de 20 a 35 g.L'1; a fonte indutora pode não ser acrescentada nessa fase. Uma solução aquosa contendo o substrato escolhido para a produção das enzimas é preparada à concentração de 200250 g.L'1; essa solução deve conter o substrato indutor. Ela é injetada após o esgotamento do substrato inicial de modo a fornecer uma quantidade otimizada, compreendida entre 35 e 45 mg.g"1 de células (cargas de nutrição), A concentração residual em açúcar no meio de cultura é inferior a 1 g.L'1 durante essa fase de cargas de nutrição.
Dentre os exemplos que se seguem, os Exemplos 1 a 3 são dados a título indicativo e os exemplos 4 e 5 ilustram a invenção.
Exemplo 1; produção de enzimas sobre lactose A produção de celulases é feita em fermentador agitado mecanicamente. O meio tem a seguinte composição: KOH 1,66 g.L'1, H3PO485 % 2 mL.L, (NH4)2S04 2,8 g.L'1, MgS04, 7 H20 0,6 g.L'1' CaCI2 0,6g.L'1, MnS04 3,2 mg.L'1, ZnS04, 7 H20 2,8 m g.L'1, CoCI2 4,0 mg.L'1, FeS04, 7 H20 10 mg.L'1, infusão de milho 1,2 g.L'1, anti-espuma 0,5 ML.L'1. O fermentador contendo 1,75 L de meio mineral e 70 g de lactose é esterilizado a 120 °C, depois inseminado com 0,25 litro de uma pré-cultura líquida da cepa de Trichoderma reesei CL847. O meio da pré-cultura, adicionado de ftalato de potássio a 5 g.L"1 para controlar as variações de pH, é idêntico àquele do fermentador. O aumento do cogumelo em pré-cultura é feita sobre lactose, à concentração de 30 g.L'1. O aumento do inoculum dura de 2 a 3 dias e é feito entre 27 e 30 °C sobre uma mesa de agitação.
Após 46 horas de aumento, 0 substrato inicia! do fermentador é esgotado e a solução de lactose a 250 g.L’1 é injetada em contínuo à vazão de 4,5 mLL'1 até 142 horas. A temperatura é regulada a 27 °C durante a fase de aumento da biomassa, depois a 25 °C até o fim da cultura. O pH é regulado em 5, durante a fase de aumento, depois em 4 até o fim da cultura por adição de uma solução de amoníaco que fornece o nitrogênio necessário à síntese das proteínas excretadas. O teor em oxigênio dissolvido é mantido acima de 15 a 20 % por ação sobre arejamento e a agitação. A produção de enzimas é seguida pela dosagem das proteínas extracelulares pelo método de Folin (Lowry), após separação do micélio por filtragem ou centrifugação. As atividades celulolíticas são determinadas pelo método da atividade papel filtro (UPF: unidade papel filtro) para uma atividade global e a atividade celobiase, atividade considerada como limitante do processo de hidrólise enzimática da biomassa lignocelulósica. A atividade UPF é medida sobre papel Whatman N° 1 à concentração inicial de 50 g.L'1; determina-se a tomada de teste da solução enzimática a analisar que libera o equivalente de 2 g.L'1 de glicose (dosagem colorimétrica) em 60 minutos. A atividade celobiase é medida sobre celobiose à concentração de 20mM; determina-se a tomada de teste que libera 0,5 g.L"1 de glicose (dosagem enzimática) em 30 minutos.
As atividades em U.m.L'1 são expressas em microondas de glicose liberadas por minuto e por mililitro de solução enzimática.
As determinações analíticas sobre o mosto final dão os seguintes resultados: EXEMPLO 2: produção de enzimas sobre xilose A produção de enzimas é feita nas mesmas condições que no Exemplo 1. 0 fermentador contendo 1,75 L de meio mineral com 40 g de xilose pura é inseminado com 0,25 litro de uma pré-cultura líquida da cepa de Trichoderma reesei CL847. O substrato carbonado da pré-cultura é a glicose à concentração de 20 g.L"1. Após 27 horas de aumento, após o esgotamento do substrato inicial, a solução de xilose a 200 g.L'1 é injetada em contínuo à vazão de 5 mL.h'1 até 164 horas.
As determinações analíticas sobre o mosto final dão os seguintes resultados: EXEMPLO 3: produção de enzimas sobre uma mistura lactose-xilose a 2575% respectivamente Nesse exemplo, a lactose é utilizada como substrato indutor e injetada unicamente na fase de produção de enzimas, após o esgotamento da xilose inicial. A fermentação é feita nas mesmas condições que no Exemplo 2. A solução de substrato injetada para a produção de enzimas é substituída por uma mistura de lactose e de xilose à concentração de 200 g.L'1, a concentração em lactose sendo de 50 g.L'1. A injeção é parada a 164 horas.
As determinações analíticas sobre o mosto final dão os seguintes resultados: EXEMPLO 4: produção de enzimas sobre xilose. utilizando o resíduo produzido por fermentação etanólica de um hidrolisado enzimático parcial de um material celulósico tratado e despentosado, como fonte indutora A fermentação é feita nas mesmas condições que no Exemplo 2. A produção de biomassa é feita em cargas com 20 g.L'1 de xilose. A produção de enzimas é feita em cargas de nutrição com uma solução preparada a partir de um resíduo ao qual se acrescenta xilose. A solução de resíduo, referenciada por H1, é preparada da seguinte forma: 6 kg de material sólido úmido, obtido após tratamento de palha de trigo por explosão ao vapor em condição ácida e extração das pentoses, seja 1,4 kg de matéria seca tratada e lavada, são retomados em .0,75 litro de tampão acetato de sódio 0,5 M com pH 4,8 e 0,75 litro de uma solução de celulases comerciais, seja 30 g de proteínas. Após uma hidrólise enzimática de 24 horas, feita em um reator agitado mecanicamente e mantido em 50 °C. A suspensão é separada por centrifugação. A fração líquida recuperada contém 92 g.L"1 de glicose, 10,3 g.L'1 de xilose, 1,0 g.L'1 de arabinose. Uma fermentação etanólica é feita sobre essa fração por Saccharomyces cerevi-siae. O inoculum, de um volume de 0,4 L, é preparado em fiole agitado sobre glicose com um levedo de padaria. A glicose do hidrolisado é totalmente fermentada em etanol. O mosto obtido fica livre das proteínas e do levedo por aquecimento a 100 °C e centrifugação. Após concentração sob vácuo, são obtidos 0,85 L do resíduo de destilação H1 livre do etanol. A solução de substrato, de um volume de 1,5 L, utilizada para a produção de enzima, é preparada a partir desse resíduo de destilação com acréscimo de xilose para se obter uma concentração final em substrato carbonado de 200 g.L'1. A fermentação é feita nas mesmas condições que para os Exemplos 1 a 3. A fermentação é feita nas mesmas condições que para os Exemplos 1 a 3. A fermentação é parada em 136 horas.
As determinações analíticas sobre o mosto final dão os resultados indicados na tabela abaixo. As proteínas são precipitados pelo ácido tricloroacético, a fim de evitar a reação colorida indesejável ligada às impurezas do resíduo, EXEMPLO 5: produção de enzimas sobre xilose, utilizando o resíduo produzido por fermentação etanólica de um hidrolisado impulsionado de um material celulósico tratado e despentosado, como fonte indutora Como no Exemplo 4, a produção de biomassa é feita em cargas com 20 g.L'1 de xilose. A produção de enzimas é feita em cargas de nutrição com uma solução de substrato preparado a partir de resíduos de destilação aos quais se acrescentam xilose. No caso presente, a solução de resíduos de destilação, referenciada por H2, é preparada da mesma forma que para H1, mas a hidrólise é prolongada até 48 horas com um acréscimo de enzimas, idêntico ao primeiro acréscimo, após 24 horas de hidrólise. O hidrolisado contém 110,8 g.L'1 de glicose, 11,6 g.L'1 de xilose. O resíduo de destilação H2, após eliminação do etanol e concentração, é utilizado para preparar 1,5 L de uma solução de substrato a 200 g.L'1 em açúcares totais. A fermentação é feita nas mesmas condições que para o exemplo 4; a fermentação é parada em 158 horas.
As determinações analíticas sobre o mosto final dão os seguintes resultados: REIVINDICAÇÕES
Claims (4)
1. Processo de produção de etanol, a partir de materiais celuló-sicos ou ligno-celulósicos, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: 1) o pré-tratamento químico e/ou físico de um substrato celulósi-co ou ligno-celulósico; 2) a hidrólise enzimática de um substrato pré-tratado utilizando enzimas celulolíticas produzidas pelo fungo pertencente à espécie Tricho-derma reeser, 3) a fermentação etanólica por um microorganismo alcoolígeno apropriado do hidrolizado proveniente da etapa (2) e obtenção de um mosto de fermentação; e 4) a separação do microorganismo alcoolígeno utilizado na etapa (3), a separação/purificação do etanol e a obtenção de uma fase aquosa que constitui um resíduo; em que o resíduo constituído dos resíduos de destilação é usado, após separação de etanol, como uma fonte de carbono para crescimento do microorganismo celulolítico e a produção das enzimas celulolíticas.
2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o resíduo é usado como uma fonte indutora de carbono como um complemento para outras fontes de carbono usadas para crescimento do microorganismo celulolítico.
3. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o resíduo é usado como uma fonte única de carbono para crescimento do microorganismo celulolítico e produção das enzimas celulolíticas.
4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que os materiais celulósicos ou lignocelulósicos são selecionados dentre palha, madeira, culturas florestais, resíduos de plantas alcoolígenos, açucareiras e cerealistas, resíduos da indústria do papel e os produtos de transformação dos materiais celulósicos e lignocelulósicos.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR0501371A FR2881753B1 (fr) | 2005-02-09 | 2005-02-09 | Procede de production d'enzymes cellulolytiques et hemicellulolytiques utilisant les residus de distillation de fermentation ethanolique d'hydrolysats enzymatiques de materiaux (ligno-)cellulosique |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
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