FR3111643A1 - Procede de production de proteines, de sucres, d’alcool, par une souche de champignon trichoderma dans laquelle le gene cel1a est invalide - Google Patents

Procede de production de proteines, de sucres, d’alcool, par une souche de champignon trichoderma dans laquelle le gene cel1a est invalide Download PDF

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Abstract

L’invention concerne les différentes utilisations d’une souche de champignon appartenant au genre Trichoderma dans laquelle le gène cel1a est invalidé. La présente invention concerne notamment un procédé de production de protéines par une souche de champignon appartenant au genre Trichoderma dans laquelle le gène cel1a est invalidé, comprenant au moins deux étapes : - une première étape de croissance en phase batch en présence d’au moins un substrat carboné de croissance, et- une deuxième étape de production de protéines en phase fed-batch en présence d’une composition comprenant au moins du lactose et un deuxième sucre, la teneur en lactose dans ladite composition représentant environ entre 5 et 30% en poids de la teneur totale des sucres dans ladite composition. (pas de figure)

Description

PROCEDE DE PRODUCTION DE PROTEINES, DE SUCRES, D’ALCOOL, PAR UNE SOUCHE DE CHAMPIGNON TRICHODERMA DANS LAQUELLE LE GENE CEL1A EST INVALIDE
La présente invention concerne un procédé de production de protéines utilisant (i) une souche de champignon appartenant au genreTrichodermadans laquelle le gènecel1aest invalidé, et (ii) une composition inductrice optimisée.
Contexte de l’invention
Les souches de champignon appartenant au genreTrichoderma, notammentTrichoderma reesei,sont aujourd’hui majoritairement utilisées pour la production d’enzymes. Ces enzymes, par exemple les cellulases, sont en effet utilisées pour hydrolyser la biomasse cellulosique ou lignocellulosique en sucres simples. Les enzymes produites par les champignons filamenteux sont donc utiles dans les filières de production de biocarburants de seconde génération ou encore des produits biosourcés issus de sucres provenant de biomasse (ligno)cellulosique.
Afin d’améliorer la production de biocarburants de seconde génération ou encore des produits biosourcés, il a ainsi été envisagé d’améliorer la production de cellulases.
Par exemple, le brevet EP 448 430 B1 décrit une production industrielle optimisée de cellulases parTrichoderma reesei. Cette production est réalisée en protocole fed-batch (alimentation sans soutirage) en utilisant une solution d'alimentation contenant du lactose comme sucre inducteur de la production de protéines. Ce procédé de fermentation comprend deux étapes : une première étape de croissance du champignon en présence d’un excès de source carbonée et une deuxième étape de production d’enzymes grâce à l’ajout d’un inducteur dans le milieu avec un débit optimisé (mode fed-batch). Ces étapes sont réalisées en milieu liquide dans des bioréacteurs sous une agitation et en présence d’oxygène car le champignon est aérobie stricte. Un autre exemple de procédé optimisé de production de cellulases est décrit dans le brevet EP 2 744 899 B1.
Traditionnellement, notamment au laboratoire, la solution d’alimentation utilisée lors de la deuxième étape contient uniquement du lactose. Cependant, industriellement le lactose est trop onéreux pour l’utiliser seul dans la solution d’alimentation. Diverses solutions ont ainsi été envisagées pour diminuer la quantité de lactose à utiliser.
Par exemple, Jourdieret al.ont montré qu’il était possible de remplacer une partie du lactose par d’autres sucres moins onéreux tels que du glucose et/ou du xylose purifié (voir Jourdieret al.Biotechnology for Biofuels 2013, 6:79). Dans cette étude, les auteurs ont notamment analysé l’impact du glucose et/ou du xylose sur la sécrétion des enzymes par une souche hyperproductrice deTrichoderma reesei(la souche CL847). Cette étude permet ainsi de conclure que dans la souche industrielle CL847 qui provient de la souche hyperproductrice modèle RutC30, la capacité d’induction est corrélée positivement à la teneur en lactose présent dans la solution d’alimentation : plus la teneur en lactose est forte, meilleure est l’induction.
La demande internationale PCT/FR2011/000350 décrit également un procédé de production d’enzymes cellulolytiques et/ou hémicellulolytiques utilisant au cours de la phase de production une composition comprenant de 40 à 65% en poids de glucose, de 21 à 25% en poids de lactose et de 10 à 39% en poids de xylose en combinaison avec un champignonTrichoderma reeseiinvalidé pour la répression catabolique par le glucose.
Des souches modifiées deTrichoderma reesei, dans lesquelles des éléments de régulation des séquences promotrices des gènes des xylanases xyn1 et xyn2 ont été insérés dans les promoteurs des cellulases ont également été décrites dans la demande internationale PCT/FR2016/050950. Ainsi, dans lesdites souches modifiées, les gènes sont inductibles par leurs propres substrats inducteurs, tels que le lactose, le cellobiose ou la cellulose, mais également par les substrats inducteurs des xylanases tels que le xylane, le xylose, …
Des procédés de fermentation et souches utiles pour améliorer la production d’enzymes cellulolytiques par des champignons filamenteux, et ce faisant de produits biosourcés mais également des biocarburants de seconde génération, sont donc déjà décrits dans l’art antérieur.
Néanmoins, il existe toujours un besoin pour de nouveaux procédés de production de protéines, notamment des enzymes cellulolytiques, qui soient le plus efficaces possibles, permettant notamment une production suffisante tout en utilisant le moins de lactose possible afin de réduire les coûts.
Des souches deTrichoderma reeseidans lesquelles le gènecel1aa été invalidé ont été décrites dans l’art antérieur. Par exemple, les équipes de Zhouet al.(Differential Involvement ofβ-Glucosidases from Hypocrea jecorina in Rapid Induction of Cellulase Genes by Cellulose and Cellobiose. Eukaryotic Cell, 11 (11) 1371-1381 (2012)) et de Xuet al.(Intracellularβ-Glucosidases CEL1a and CEL1b Are Essential for Cellulase Induction on Lactose in Trichoderma reesei, Eukaryotic Cell13 (8), pp. 1001–1013 (2014)) ont décrit l’invalidation du gènecel1adans la souche parenteTrichoderma reeseiTU-6 (ATCC MYA-256). L’équipe de Xuet al. conclut notamment que la protéine CEL1a est une β-glucosidase intracellulaire qui est essentielle dans l’induction par le lactose.
Au contraire, la présente invention repose sur les résultats inattendus des inventeurs qui ont mis en évidence qu’il était possible d’induire la production de protéines à l’aide d’une composition inductrice contenant seulement environ entre 5 et 30% en poids de lactose par rapport à la teneur totale des sucres dans ladite composition, en utilisant une souche de champignonTrichoderma, notammentTrichoderma reesei,dans laquelle le génome a été modifié afin d’invalider le gènecel1a.
Les inventeurs ont notamment montré que l’invalidation du gènecel1adans une souche deTrichoderma reeseipermettait de diviser par 10 la quantité de lactose utilisé dans la phase de production, tout en maintenant une productivité spécifique équivalente par rapport à une souche de référence.
Les inventeurs ont notamment montré que la souche invalidée pourcel1a, bien qu’elle ne produise pas de protéines lorsqu’elle est alimentée par du glucose pur ou par du lactose pur, produit correctement des protéines lorsqu’elle est alimentée par des mélanges glucose/lactose, avec une plage optimale pour des teneurs en lactose dans la solution d’alimentation comprises entre 5% et 30% en poids du cumul de sucres, avec un maximum pour des teneurs comprises entre 10% et 20% en poids.
Plus particulièrement, les inventeurs ont montré que des solutions d’alimentation ayant des teneurs en lactose comprenant entre 10 et 15% en poids du cumul de sucres donnent une induction équivalente que le lactose pur chez la souche parente (dans laquelle le gènecel1an’a pas été invalidé), avec des vitesses spécifiques de production de protéines de l’ordre de 20 ± 2 mgprotéines/gbiomasse/h.
Bref exposé de l’invention
La présente invention concerne ainsi un procédé de production de protéines par une souche de champignon appartenant au genreTrichodermadans laquelle le gènecel1aest invalidé, comprenant au moins deux étapes :
- une première étape de croissance en phase batch en présence d’au moins un substrat carboné de croissance, et
- une deuxième étape de production de protéines en phase fed-batch en présence d’une composition comprenant au moins du lactose et un deuxième sucre, la teneur en lactose dans ladite composition représentant environ entre 5 et 30% en poids de la teneur totale des sucres dans ladite composition.
La présente invention concerne également l’utilisation d’une composition comprenant au moins du lactose et un deuxième sucre, la teneur en lactose dans ladite composition représentant environ entre 5 et 30% en poids de la teneur totale des sucres dans ladite composition pour la production de protéines d’intérêt par une souche de champignon appartenant au genreTrichodermadans laquelle le gènecel1aest invalidé.
La présente invention concerne aussi un procédé de production de sucres à partir de substrats cellulosiques ou lignocellulosiques, comprenant une étape de production d’enzymes cellulolytiques par une souche de champignon appartenant au genreTrichodermadans laquelle le gènecel1aest invalidé, en présence d’une composition comprenant au moins du lactose et un deuxième sucre, la teneur en lactose dans ladite composition représentant environ entre 5 et 30% en poids de la teneur totale des sucres dans ladite composition. Dans cet aspect, l’invention concerne donc l’utilisation d’une souche de champignon appartenant au genreTrichodermadans laquelle le gènecel1aest invalidé, pour l'hydrolyse de la cellulose ou de la lignocellulose en sucre.
Le présente invention concerne également un procédé de production de produits biosourcés à partir de substrats cellulosiques ou lignocellulosiques, comprenant une étape de production d’enzymes cellulolytiques par une souche de champignon appartenant au genreTrichodermadans laquelle le gènecel1aest invalidé, en présence d’une composition comprenant au moins du lactose et un deuxième sucre, la teneur en lactose dans ladite composition représentant environ entre 5 et 30% en poids de la teneur totale des sucres dans ladite composition. Dans cet aspect, l’invention concerne donc l’utilisation d’une souche de champignon appartenant au genreTrichodermadans laquelle le gènecel1aest invalidé, pour la production de produits biosourcés à partir de substrats cellulosiques ou lignocellulosiques.
La présente invention concerne aussi un procédé de production d'un biocarburant/d’alcool à partir de substrats cellulosiques ou lignocellulosiques, comprenant une étape de production d’enzymes cellulolytiques par une souche de champignon appartenant au genreTrichodermadans laquelle le gènecel1aest invalidé, en présence d’une composition comprenant au moins du lactose et un deuxième sucre, la teneur en lactose dans ladite composition représentant environ entre 5 et 30% en poids de la teneur totale des sucres dans ladite composition. Dans cet aspect, l’invention concerne donc l’utilisation d’une souche de champignon appartenant au genreTrichodermadans laquelle le gènecel1aest invalidé, pour la production de biocarburant/d’alcool à partir de substrats cellulosiques ou lignocellulosiques.
La présente invention concerne enfin une souche de champignon appartenant à l’espèceTrichoderma reesei, ladite souche étant issue de la souche telle que déposée sous la référence ATCC 56765 et ladite souche comprenant une invalidation du gènecel1a.
Dans un premier aspect, l’invention concerne ainsi un procédé de production de protéines par une souche de champignon appartenant au genreTrichodermadans laquelle le gènecel1aest invalidé, comprenant au moins deux étapes :
- une première étape de croissance en phase batch en présence d’au moins un substrat carboné de croissance, et
- une deuxième étape de production de protéines en phase fed-batch en présence d’une composition comprenant au moins du lactose et un deuxième sucre, la teneur en lactose dans ladite composition représentant environ entre 5 et 30% en poids de la teneur totale des sucres dans ladite composition.
Selon l’invention, le gènecel1acorrespond au gène représenté par la SEQ ID NO : 1 ou un gène ayant au moins 80% d’identité avec SEQ ID NO : 1. Le gènecel1aest également nommé TRIREDRAFT_120749 dans le génome de référenceTrichoderma reesei(https://www.uniprot.org/uniprot/G0RD31). Ce gène code une protéine CEL1a appartenant à la famille 1 des glycosides hydrolases. Plus spécifiquement, CEL1a est une β-glucosidase intracellulaire, également dénommée bgl2 ou bglII, (M. Saloheimo, J. Kuja-Panula, E. Ylösmäki, et al. (2002)Enzymatic Properties and Intracellular Localization of the Novel Trichoderma reeseiβ-Glucosidase BGLII (Cel1A). Applied and Environmental Microbiology, 68 (9) 4546-4553). La protéine CEL1a est représentée par la SEQ ID NO : 2.
Le gènecel1aest le gène de référence chezTrichoderrma reesei. Un gène ayant au moins 80% d’identité représente ainsi un variant de ce gène ou bien un gène orthologue chez une autre espèce deTrichoderma. Selon l’invention, l’expression « au moins 80% d’identité avec SEQ ID NO : 1 » signifie toutes les valeurs comprises entre 80% et 100%, notamment les valeurs de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% et 100%, préférentiellement au moins 90%, au moins 95%, encore plus particulièrement au moins 98%, au moins 99%. L’homme du métier sait calculer un pourcentage d’identité entre deux séquences. Par exemple, selon l’invention, le pourcentage d'identité d'une séquence donnée par rapport à SEQ ID NO : 1 s’entend du pourcentage d’identité sur la longueur totale des séquences. Le pourcentage correspond ainsi au nombre de nucléotides (résidus le cas échéant) identiques entre cette séquence donnée et SEQ ID NO : 1 divisé par le nombre de nucléotides (résidus le cas échéant) dans la plus longue des deux séquences.
Lorsque la protéine CEL1A est codée par un gène orthologue ou un variant du gènecel1, ladite protéine peut être représentée par une protéine ayant au moins 80% d’identité avec SEQ ID NO : 2, notamment au moins 90%, au moins 95%, de préférence au moins 98% ou au moins 99%.
Selon un mode de réalisation préféré de l’invention, le champignon appartient à l’espèceTrichoderma reesei. Selon ce mode de réalisation, le gènecel1aest de préférence représenté par la SEQ ID NO : 1 ou une séquence ayant au moins 98% d’identité avec SEQ ID NO : 1. Très préférentiellement, le gènecel1aest représenté par la SEQ ID NO : 1. La souche parente deTrichoderma reeseipeut notamment être la souche QM6a (déposée sous le numéro ATCC 13631), ou encore une souche issue de l’isolat naturel QM6a (notamment obtenue par mutagénèse aléatoire ou dirigée), telle que la souche Rut-C30 (déposée sous le numéro ATCC 56765), la souche déposée sous le numéro CNCM I-5221 (déposée le 03 août 2017 auprès de la CNCM, Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de l’Institut Pasteur, située 25 rue du Docteur Roux, F-75724 Paris cedex 15), la souche NG14 (déposée sous le numéro ATCC 56767) ou encore la souche QM9414 (déposée sous le numéro ATCC 26921).
Selon l’invention, les protéines sont toutes les protéines pouvant être produites par un champignon, de façon naturelle ou bien par modification génétique (par exemple après transformation à l’aide d’un vecteur approprié).
De façon avantageuse, les protéines d’intérêt selon l’invention sont des enzymes, notamment des enzymes cellulolytiques telles que des cellulases ou des hémicellulases. De façon préférée, les enzymes sont des cellulases. Selon l’invention, le terme « cellulases » s’entend plus particulièrement des enzymes appartenant à la famille des glycosides hydrolases, par exemple choisies parmi les endoglucanases, les exoglucanases et les glucosidases. Les glycosides hydrolases sont notamment regroupées sous la nomenclature « EC 3.2.1. ». Le terme « cellulase » fait plus particulièrement référence à une enzyme adaptée à l'hydrolyse de la cellulose et permettant aux microorganismes (tels queTrichoderma reesei) qui les produisent d'utiliser la cellulose comme source de carbone, en hydrolysant ce polymère en sucres simples (glucose). La production de cellulases par une souche selon l’invention, notammentTrichoderma reesei, peut être déterminée par toutes techniques usuelles pour l’homme du métier, ou encore par les techniques décrites dans les brevets EP 448 430 B1 ou EP 2 744 899 B1.
L’expression « la teneur en lactose représentant environ entre 5 et 30% en poids de la teneur totale des sucres » signifie que durant l’étape de fed-batch, entre 70 et 95% en poids du ou des sucres apportés par ladite composition sont un ou des sucres autres que le lactose. La teneur totale des sucres correspond ainsi à 100% en poids de la teneur des sucres de la composition.
Selon un mode de réalisation, le procédé selon l’invention est réalisé en bioréacteur agité et aéré. Plus particulièrement, la vitesse d’agitation est contrôlée, notamment afin de maintenir une concentration d’oxygène dissous supérieure à 40% de la concentration à saturation. Par exemple au laboratoire la vitesse d’agitation est généralement contrôlée entre 400 et 1200 rpm.
Selon un mode de réalisation, dans ledit procédé la température est contrôlée pendant la première et la deuxième étape, notamment entre 20 et 35°C. Plus particulièrement, la température est contrôlée à 27°C pendant la première étape et à 25°C pendant la deuxième étape.
Selon un mode de réalisation, dans ledit procédé, le pH est contrôlé. Plus particulièrement le pH est contrôlé à 4.0, notamment par ajout automatique d’une solution d’ammoniaque à 5N.
Selon un mode de réalisation, la première phase se déroule jusqu’à épuisement du substrat carboné de croissance. Cette première étape dure généralement entre environ 18 et 48 heures, notamment pendant 24 à 36 heures.
Selon un mode de réalisation, la deuxième phase se déroule pendant environ 70 à 240 heures, notamment 70 heures.
Selon un mode de réalisation préféré, dans ledit procédé, la première phase dure entre 18 et 48 heures, notamment pendant 24 à 36 heures, et la deuxième phase se déroule pendant environ 70 à 240 heures, notamment 70 heures.
Selon un mode de réalisation, le procédé selon l’invention permet d’obtenir une productivité comprise entre 15 et 20 mgprotéines/gbiomasse/h, notamment entre 16 et 19 mgprotéines/gbiomasse/h. La capacité d’induction d’une solution de sucres sur une souche est jugée en mesurant la vitesse spécifique de production de protéines (aussi appelée « productivité spécifique »), exprimée en mgprotéines/gbiomasse/h, lors d’une culture avec alimentation de la solution de sucres à débit optimisé. Il est connu de l’homme du métier que les protéines produites parTrichoderma reeseisont majoritairement des enzymes, dont des cellulases. Une corrélation entre protéines totales sécrétées et cellulases peut être faite car chezTrichoderma reesei, les exoglucanases (CBHI, CBHII) et les endoglucanases (EGI, EGII) principales peuvent représenter jusqu’à 90% de la quantité totale de protéines sécrétées (voir par exemple Markov, A.V., Gusakov, A.V., Kondratyeva, E.G., Okunev, O.N., Bekkarevich, A.O., and Sinitsyn, A.P. (2005). New Effective Method for Analysis of the Component Composition of Enzyme Complexes from Trichoderma reesei. Biochemistry (Moscow)70, 657-663). Ainsi, la productivité en enzymes ou en cellulases est donc équivalente à la productivité en protéines.
L’expression « une souche de champignon appartenant au genreTrichodermadans laquelle le gènecel1aest invalidé » signifie que le génome des souches utilisées dans la présente invention a été modifié afin que le gènecel1ane soit plus exprimé (ou le gène variant ou le gène orthologue le cas échéant). Ainsi dans les souches utilisées dans la présente invention, la protéine CEL1a n’est pas produite ou alors une CEL1a non fonctionnelle est produite (c’est-à-dire que la protéine n’est plus biologiquement active). En d’autres termes, le génome de la souche selon l’invention est modifié (ou a été modifié) afin que la protéine CEL1a ne soit pas synthétisée ou soit synthétisée dans une forme non fonctionnelle. De préférence, la protéine CEL1a n’est pas produite/synthétisée. L’invalidation d’un gène est bien connue de l’homme du métier. Selon un mode de réalisation, le gènecel1aa été invalidé dans la souche par mutagénèse ou par recombinaison homologue, notamment à l’aide d’une cassette d’invalidation telle que représentée par la SEQ ID NO : 3.
La présente invention concerne ainsi l’utilisation d’une souche variante de champignonTrichoderma, dans laquelle le gènecel1aa été invalidé. Selon l’invention, le terme « souche variante » s’entend d’une souche modifiée génétiquement par rapport à une souche parente. Selon l’invention, le terme « souche parente » s’entend ainsi d’une souche dont est issue ou dérivée la souche variante, et dans laquelle le gènecel1an’a pas été invalidé. La souche selon l’invention correspond ainsi à une souche variante dérivée d’une souche parente, ladite souche variante comprenant au moins une modification génétique correspondant à l’invalidation du gènecel1apar rapport à la souche parente.
Durant l’étape de croissance en mode « batch » il est nécessaire d’apporter une source de carbone rapidement assimilable pour la croissance du champignonTrichoderma. Selon l’invention, le « substrat carboné de croissance » est de préférence choisi parmi le lactose, le glucose, le xylose, les résidus liquides obtenus après fermentation éthanolique (optionnellement obtenus après fermentation éthanolique puis distillation) des sucres monomères des hydrolysats enzymatiques de biomasse cellulosique, un extrait brut de pentoses hydrosolubles provenant du prétraitement d’une biomasse cellulosique, un hydrolysat enzymatique de lignocellulose (c’est-à-dire avant fermentation), et/ou un hydrolysat de biomasse amylacée. Préférentiellement, le substrat est choisi parmi le glucose, le xylose, les résidus liquides obtenus après fermentation éthanolique (optionnellement obtenus après fermentation éthanolique puis distillation des sucres monomères des hydrolysats enzymatiques de biomasse cellulosique, un extrait brut de pentoses hydrosolubles provenant du prétraitement d’une biomasse cellulosique, un hydrolysat enzymatique de lignocellulose (c’est-à-dire avant fermentation), et/ou un hydrolysat de biomasse amylacée. Très préférentiellement le substrat est le glucose.
Selon l’invention, la concentration en substrat carboné de croissance est notamment comprise entre 10 et 80 g/L, notamment entre 15 et 40 g/L.
La composition utilisée dans la deuxième étape de production de protéines du procédé selon l’invention peut également être nommée « solution d’alimentation » ou « solution d’alimentation en sucres ». Cette composition comprend au moins deux sucres : du lactose et un autre sucre. Dans un aspect de l’invention, cette composition comprend au moins trois sucres différents : du lactose et deux autres sucres.
Le lactose est un substrat inducteur, c’est-à-dire qu’il permet l’expression de protéines, notamment des cellulases, dans le milieu de culture. De préférence, dans ladite composition, ledit deuxième sucre n’est pas un sucre inducteur mais est néanmoins un substrat carboné.
Selon l’invention, la concentration en sucres de la composition utilisée durant l’étape de fed-batch est comprise entre 200 et 500 g/L, notamment 250 g/L.
Plus particulièrement, le deuxième sucre est fourniviaune solution de glucose et/ou de xylose (de préférence purifié), un hydrolysat de biomasse amylacée, un hydrolysat enzymatique de biomasse lignocellulosique, un extrait brut de pentoses hydrosolubles provenant du prétraitement d’une biomasse cellulosique et/ou les résidus liquides obtenus après fermentation éthanolique (optionnellement obtenus après fermentation éthanolique puis distillation) des sucres monomères des hydrolysats enzymatiques de biomasse cellulosique. La présente invention permet ainsi d’utiliser des solutions de sucres industrielles, à condition de les complémenter en lactose, pour induire la production de protéines.
Comme ces solutions contiennent majoritairement du glucose et du xylose, deux sucres qui ne sont pas inducteurs de la production de protéines chezTrichoderma reesei, il est nécessaire de les complémenter avec du lactose pour que le mélange obtenu fournisse un niveau d’induction correct. Selon l’invention, la composition comprenant au moins du lactose et un deuxième sucre peut ainsi être également appelée une composition inductrice. Selon un mode de réalisation particulier, la composition/solution d’alimentation utilisée dans l’étape de fed-batch correspond ainsi à une solution de glucose et/ou de xylose (de préférence purifiée), un hydrolysat de biomasse amylacée, un hydrolysat enzymatique de biomasse lignocellulosique, un extrait brut de pentoses hydrosolubles provenant du prétraitement d’une biomasse cellulosique et/ou les résidus liquides obtenus après fermentation éthanolique (optionnellement obtenus après fermentation éthanolique puis distillation) des sucres monomères des hydrolysats enzymatiques de biomasse cellulosique , dans laquelle du lactose est ajouté, de façon à ce que la teneur en lactose dans ladite composition représente environ entre 5 et 30% en poids de la teneur totale des sucres.
Typiquement un hydrolysat de biomasse amylacée contient principalement du glucose.
Typiquement, un hydrolysat enzymatique de biomasse lignocellulosique contient principalement du glucose et du xylose.
Typiquement, un extrait brut de pentoses hydrosolubles provenant du prétraitement d’une biomasse cellulosique contient principalement du xylose.
Typiquement, les résidus liquides obtenus après fermentation éthanolique (optionnellement obtenus après fermentation éthanolique puis distillation) des sucres monomères des hydrolysats enzymatiques de biomasse cellulosique contiennent principalement des sucres non fermentescibles (arabinose, mannose, galactose) et des résidus de sucres fermentescibles (glucose et xylose).
Plus particulièrement, selon un mode de réalisation préféré, le deuxième sucre est choisi parmi le glucose et/ou le xylose, de préférence le glucose. Selon un mode de réalisation, ladite composition comprend uniquement comme sucre du lactose et du glucose, OU uniquement du lactose et du xylose OU uniquement du lactose, du glucose et du xylose.
Selon l’invention, les pourcentages de lactose, de glucose et/ou de xylose dans la composition sont calculés par rapport à la teneur totale en poids des sucres dans ladite composition. Typiquement, la teneur totale des sucres est celle utilisée lors du mode fed-batch. La teneur de chaque sucre dans la composition/solution est par exemple mesurée par chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC), éventuellement après concentration par évaporation. Puis du lactose ou du glucose purifiés en poudre est dissous, ou une solution concentrée de glucose est mélangée. Les nouvelles teneurs de chaque sucre sont ensuite remesurées par HPLC dans le mélange final.
Selon un mode de réalisation, la composition durant l’étape de fed-batch est apportée/fournie en continue, en flux limitant. Cela signifie que la concentration de sucres dans le milieu de culture est contrôlée de façon à maintenir une concentration résiduelle de sucres dans le milieu de culture proche de zéro. De façon préférée, la concentration en sucre dans le milieu de culture est inférieure à 1g/L pendant cette phase, notamment inférieure à 0,5 g/L, plus particulièrement inférieure à 0,1 g/L. Ceci favorise ainsi l’induction et la production de protéines.
Etant donné que le champignonTrichoderma, notammentTrichoderma reesei, est capable de consommer tous les sucres présents dans ladite composition inductrice, le calcul du débit optimisé de ladite composition (solution d’alimentation pour le mode fed-batch) doit se faire non pas par rapport à la concentration en lactose de la solution mais en cumulant la concentration de tous les sucres présents dans la solution. Selon un mode de réalisation, c’est le débit massique (en gsucres/h) qui est optimisé et non pas la concentration totale en sucres dans la solution d’alimentation (en gsucres/L). Le débit volumique de la solution d’alimentation (en L/h) peut ainsi être adapté pour apporter le bon débit massique de sucres quelle que soit la concentration en sucres dans la solution d’alimentation. Selon un mode de réalisation ladite composition dans l’étape de production (fed-batch) est apportée à un débit compris entre 0,8 et 8 mLsolution/Lmilieu/h, préférentiellement entre 1 et 3 mLsolution/Lmilieu/h. Le terme «mLsolution» représente ici le volume de ladite composition (solution d’alimentation pour le mode fed-batch) et le terme « Lmilieu» représente ici le volume du bioréacteur/fermenteur.
Selon l’invention, l’expression « environ entre 5 et 30% en poids de la teneur totale des sucres dans ladite composition » représente toutes les valeurs comprises entre 5 et 30, c’est-à-dire 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 et 30. Plus spécifiquement, le terme « environ » signifie que des valeurs très légèrement inférieures à 5 (par exemple comprises entre 4,5 et 5) sont comprises dans la gamme 5-30%. Cela signifie également que des valeurs très légèrement supérieures à 30 (par exemple comprises entre 30 et 30,5) sont comprises dans la gamme 5-30%.
Selon un mode de réalisation particulier, dans le procédé de production de protéines selon l’invention, ladite composition comprend, par rapport à la teneur totale des sucres dans ladite composition :
- environ entre 70-95% en poids de glucose et/ou de xylose, et
- environ entre 5-30% en poids de lactose.
L’expression « environ entre 70-95% » signifie que des valeurs très légèrement inférieures à 70 (par exemple comprises entre 69,5 et 70) sont comprises dans la gamme 70-95%. Cela signifie également que des valeurs très légèrement supérieures à 95 (par exemple comprises entre 95 et 95,5) sont comprises dans la gamme 70-95%.
Selon un mode de réalisation encore plus particulier, dans le procédé de production de protéines selon l’invention, ladite composition comprend, par rapport à la teneur totale des sucres dans ladite composition :
- entre 70-95% en poids de glucose, et
- entre 5-30% en poids de lactose.
Encore plus préférentiellement, dans ledit procédé de production de protéines selon l’invention, la teneur en lactose dans ladite composition représente environ entre 10 et 20% en poids, notamment entre 10 et 20% en poids, de la teneur totale des sucres dans ladite composition.
L’expression « environ entre 10 et 20% » signifie que des valeurs très légèrement inférieures à 10 (par exemple comprises entre 9,5 et 10) sont comprises dans la gamme 10-20%. Cela signifie également que des valeurs très légèrement supérieures à 20 (par exemple comprises entre 20 et 20,5) sont comprises dans la gamme 10-20%.
Selon un mode de réalisation encore plus particulier, dans le procédé de production de protéines selon l’invention, ladite composition comprend :
- environ entre 80-90% en poids de glucose et/ou de xylose, et
- environ entre 10-20% en poids de lactose,
et plus particulièrement
- environ entre 80-90% en poids de glucose, et
- environ entre 10-20% en poids de lactose.
Encore plus préférentiellement, dans ledit procédé de production de protéines selon l’invention, la teneur en lactose dans ladite composition représente environ entre 10 et 15% en poids, notamment entre 10 et 15% en poids, de la teneur totale des sucres dans ladite composition.
L’expression « environ entre 10 et 15% » signifie que des valeurs très légèrement inférieures à 10 (par exemple comprises entre 9,5 et 10) sont comprises dans la gamme 10-15%. Cela signifie également que des valeurs très légèrement supérieures à 15 (par exemple comprises entre 15 et 15,5) sont comprises dans la gamme 10-15%.
Selon un mode de réalisation encore plus particulier, dans le procédé de production de protéines selon l’invention, ladite composition comprend :
- environ entre 85-90% en poids de glucose et/ou de xylose, et
- environ entre 10-15% en poids de lactose,
et plus particulièrement
- environ entre 85-90% en poids de glucose, et
- environ entre 10-15% en poids de lactose.
Selon un mode de réalisation, les substrats sont stérilisés. Ainsi, selon un mode de réalisation, le substrat carboné de croissance est introduit dans le bioréacteur avant stérilisation. Selon un autre mode de réalisation, le substrat carboné de croissance est stérilisé séparément puis introduit dans le bioréacteur après stérilisation. Selon l’une ou l’autre de ces alternatives, selon un mode de réalisation, la composition de sucres utilisée au cours de l’étape de fed-batch est stérilisée séparément puis introduite dans le bioréacteur après stérilisation.
Dans un deuxième aspect, l’invention concerne l’utilisation d’une composition comprenant au moins du lactose et un deuxième sucre, la teneur en lactose dans ladite composition représentant environ entre 5 et 30% en poids de la teneur totale des sucres dans ladite composition pour la production de protéines d’intérêt par une souche de champignon appartenant au genreTrichodermadans laquelle le gènecel1aest invalidé.
Dans un troisième aspect, l’invention concerne un procédé de production de sucres à partir de substrats cellulosiques ou lignocellulosiques, comprenant une étape de production d’enzymes cellulolytiques par une souche de champignon appartenant au genreTrichodermadans laquelle le gènecel1aest invalidé, en présence d’une composition comprenant au moins du lactose et un deuxième sucre, la teneur en lactose dans ladite composition représentant environ entre 5 et 30% en poids de la teneur totale des sucres dans ladite composition. En d‘autres termes, l’invention concerne l’utilisation d’une souche de champignon appartenant au genreTrichodermadans laquelle le gènecel1aest invalidé, pour l'hydrolyse de la cellulose ou de la lignocellulose en sucre.
Dans un quatrième aspect, l’invention concerne un procédé de production de produits biosourcés à partir de substrats cellulosiques ou lignocellulosiques, comprenant une étape de production d’enzymes cellulolytiques par une souche de champignon appartenant au genreTrichodermadans laquelle le gènecel1aest invalidé, en présence d’une composition comprenant au moins du lactose et un deuxième sucre, la teneur en lactose dans ladite composition représentant environ entre 5 et 30% en poids de la teneur totale des sucres dans ladite composition. En d’autres termes, l’invention concerne l’utilisation d’une souche de champignon appartenant au genreTrichodermadans laquelle le gènecel1aest invalidé, pour la production de produits biosourcés à partir de substrats cellulosiques ou lignocellulosiques.
Selon l’invention, le terme « produits biosourcés » s’entend plus particulièrement des molécules intéressant l'industrie chimique, comme par exemple des acides organiques tels que l'acide acétique, propionique, acrylique, butyrique, succinique, malique, fumarique, citrique, itaconique, ou des hydroxyacides comme l'acide glycolique, hydroxypropionique, ou lactique.
Dans un cinquième aspect, l’invention concerne un procédé de production d'un biocarburant/d’alcool, notamment d’éthanol, à partir de substrats cellulosiques ou lignocellulosiques, comprenant une étape de production d’enzymes cellulolytiques par une souche de champignon appartenant au genreTrichodermadans laquelle le gènecel1aest invalidé, en présence d’une composition comprenant au moins du lactose et un deuxième sucre, la teneur en lactose dans ladite composition représentant environ entre 5 et 30% en poids de la teneur totale des sucres dans ladite composition. En d‘autres termes, l’invention concerne l’utilisation d’une souche de champignon appartenant au genreTrichodermadans laquelle le gènecel1aest invalidé, pour la production de biocarburant/d’alcool à partir de substrats cellulosiques ou lignocellulosiques.
Selon l’invention, le terme « biocarburant » s’entend plus particulièrement d’un biocarburant de seconde génération, c’est-à-dire issu de ressources non alimentaires. Selon l’invention, le terme « biocarburant » peut également être défini comme étant tout produit issu de la transformation de la biomasse et pouvant être utilisé à des fins énergétiques. D’une part et sans vouloir se limiter, on peut citer à titre d’exemple des biogaz, des produits pouvant être incorporés (éventuellement après transformation ultérieure) à un carburant ou être un carburant à part entière, tels que des alcools (l’éthanol, le butanol et/ou l’isopropanol selon le type d’organisme fermentaire utilisé), des solvants (acétone), des acides (butyrique), des lipides et leurs dérivés (acides gras à courtes ou longues chaînes, esters d’acides gras), ainsi que l’hydrogène. De manière préférée, le biocarburant selon l’invention est un alcool, par exemple l’éthanol, le butanol, l’isopropanol, le 1,2-propane diol, le 1,3-propane diol, le 1,4-butane diol, et/ou le 2,3-butane diol. Plus préférentiellement, le biocarburant selon l’invention est l’éthanol. Dans un autre mode de réalisation, le biocarburant est du biogaz.
Selon un mode de réalisation particulier, ledit procédé de production d'un biocarburant ou d’alcool à partir de substrats cellulosiques ou lignocellulosiques comprend les étapes suivantes :
- i) une étape de prétraitement d'un substrat cellulosique ou lignocellulosique afin d’obtenir un substrat prétraité,
- ii) une étape de production enzymes cellulolytiques par une souche de champignon appartenant au genreTrichodermadans laquelle le gènecel1aest invalidé, en présence d’une composition comprenant au moins du lactose et un deuxième sucre, la teneur en lactose dans ladite composition représentant environ entre 5 et 30% en poids de la teneur totale des sucres dans ladite composition,
- iii) une étape d'hydrolyse enzymatique du substrat prétraité, en présence des enzymes cellulolytiques obtenues à l’étape ii) et d'un substrat approprié, afin d’obtenir un hydrolysat,
- iv) une étape de fermentation alcoolique de l'hydrolysat obtenu,.
- v) une étape de séparation, notamment par distillation.
Selon un autre mode de réalisation particulier, ledit procédé de production d'un biocarburant ou d’alcool à partir de substrats cellulosiques ou lignocellulosiques comprend les étapes suivantes :
- i) une étape de prétraitement d'un substrat cellulosique ou lignocellulosique afin d’obtenir un substrat prétraité,
- ii) une étape de production enzymes cellulolytiques par une souche de champignon appartenant au genreTrichodermadans laquelle le gènecel1aest invalidé, en présence d’une composition comprenant au moins du lactose et un deuxième sucre, la teneur en lactose dans ladite composition représentant environ entre 5 et 30% en poids de la teneur totale des sucres dans ladite composition,
- iii) une étape d'hydrolyse enzymatique du substrat prétraité, en présence des enzymes cellulolytiques obtenues à l’étape ii) et d'un substrat approprié, afin d’obtenir un hydrolysat,
- iv) une étape de fermentation alcoolique de l'hydrolysat obtenu, - v) une étape de séparation, notamment par distillation,
lesdites étapes iii) et iv) étant réalisées simultanément. Cela est typiquement le cas dans les procédés de production dits « SSF » (Simultaneous Saccharification and Fermentation).
Selon un mode de réalisation particulier, l’étape de prétraitement d'un substrat cellulosique ou lignocellulosique est une étape de mise en suspension en phase aqueuse dudit substrat cellulosique ou lignocellulosique.
Selon un mode de réalisation particulier, l’hydrolysat obtenu à l’étape iii) est un hydrolysat contenant du glucose.
Selon un mode de réalisation particulier, l’étape de fermentation alcoolique de l'hydrolysat obtenu est une étape de fermentation, en présence d'un organisme fermentaire, du glucose issu de l'hydrolysat de manière à produire un moût de fermentation. Un organisme fermentaire est par exemple une levure.
Selon un mode de réalisation particulier, l’étape de séparation est une séparation du biocarburant ou de l’alcool et du moût de fermentation, notamment par distillation.
Selon un mode de réalisation encore plus préféré, le substrat cellulosique ou lignocellulosique prétraité à hydrolyser est mis en suspension en phase aqueuse à raison de 6 à 40% de matière sèche, de préférence 20 à 30%. Le pH est ajusté entre 4 et 5,5, de préférence entre 4,8 et 5,2 et la température entre 40°C et 60°C, de préférence entre 45°C et 50°C. La réaction d'hydrolyse est démarrée par l'ajout des enzymes agissant sur le substrat prétraité. La quantité d’enzymes habituellement utilisée est de 10 à 30 mg de protéines par gramme de substrat prétraité ou moins. La réaction dure généralement de 15 à 48 heures. La réaction est suivie par dosage des sucres libérés, notamment le glucose. La solution de sucres est séparée de la fraction solide non hydrolysée, essentiellement constituée de lignine, par filtration ou centrifugation et ensuite traitée dans une unité de fermentation.
Selon un autre mode de réalisation encore plus préféré, lorsque l’étape d’hydrolyse et de fermentation sont réalisées conjointement, les enzymes et l'organisme fermentaire sont ajoutés simultanément puis incubés à une température comprise entre 30°C et 35°C pour produire un moût de fermentation. Selon ce mode de réalisation, la cellulose présente dans le substrat pré-traité est convertie en glucose, et en même temps, dans le même réacteur, l'organisme fermentaire (par exemple une levure) convertit le glucose en produit final selon un procédé de SSF (Simultaneous Saccharification and Fermentation) connu de l'homme du métier. Selon les capacités métaboliques et hydrolytiques de l'organisme fermentaire, le bon déroulement de l'opération peut nécessiter l'addition d'une quantité plus ou moins importante de mélange cellulolytique exogène.
Dans un sixième aspect, l’invention concerne une souche de champignon appartenant à l’espèceTrichoderma reesei, ladite souche étant issue de la souche telle que déposée sous la référence ATCC 56765 (Rut-C30) et ladite souche comprenant une invalidation du gènecel1a.L’invention concerne ainsi également une souche RutC30 dont le génome a été modifié afin d’invalider le gènecel1a. Cette souche variante de RutC30 est donc une souche dans laquelle la protéine CEL1a n’est pas produite, ou alors une protéine CEL1a non fonctionnelle est produite.
Selon un mode de réalisation, une telle souche est obtenue par un procédé de modification génétique d’une souche de champignon Rut-C30, comprenant une étape d’invalidation du gènecel1a. Cette étape d’invalidation du gènecel1aest notamment réalisée par mutagénèse, par recombinaison homologue ou plus préférentiellement à l’aide d’une cassette d’invalidation représentée par la SEQ ID NO : 3.
La mutagénèse est une technique communément utilisée en génie génétique. Elle vise à introduire volontairement des mutations dans l’ADN afin de créer des gènes génétiquement modifiés. Selon l’invention, la mutagénèse s’entend plus particulièrement de la mutagénèse dirigée. La mutagénèse dirigée permet en effet d’introduire des mutations identifiées dans un gène précis. Pour ce faire, l’ADN d’intérêt (ici le gènecel1a) contenant les mutations est synthétisé puis introduit dans la cellule à muter, typiquement à l’aide d’un vecteur, où le mécanisme de réparation de l’ADN s’occupe de l’intégrer dans le génome.
La recombinaison homologue est une technique communément utilisée en génie génétique qui consiste à un échange entre molécules d’ADN, typiquement à l’aide d’un vecteur.
Le terme « vecteur » s’entend de toute séquence d’ADN dans laquelle il est possible d’insérer des fragments d’acide nucléique étranger, les vecteurs permettant d’introduire de l’ADN étranger dans une cellule hôte. Des exemples de vecteurs sont les plasmides, les cosmides, les chromosomes artificiels de levures (YAC), les chromosomes artificiels de bactéries (BAC) et les chromosomes artificiels dérivés du bactériophage P1 (PAC), les vecteurs dérivés de virus. Le vecteur selon l'invention permet l'introduction d'une mutation ou d'une délétion.
Dans un mode de réalisation préféré, ladite cassette d’invalidation comprend trois fragments d'ADN :
(1) une région en amont du gène cible,
(2) un marqueur de sélection, et
(3) une région en aval du gène cible.
Dans le cas de la présente invention, le « gène cible » s’entend du gènecel1a. Les régions en amont et en aval du gène cible sont deux éléments de recombinaison, un à chaque extrémité du gène, et sont nécessaires pour cibler de façon précise la séquence à invalider.
Selon l’invention, la région en amont du gène cible (c’est-à-dire la séquence 5’ en amont du gènecel1a) est notamment représentée par la séquence de SEQ ID NO : 4.
Selon l’invention, la région en aval du gène cible (c’est-à-dire la séquence 3’ en aval du gènecel1aest notamment représentée par la séquence de SEQ ID NO : 5.
L’expression « marqueur de sélection » s’entend d’un gène dont l’expression confère aux cellules qui le contiennent une caractéristique permettant de les sélectionner. L’utilisation d’un marqueur de sélection permet en effet d’identifier les cellules ayant intégré une modification génétique par rapport à celles qui ne l’ont pas intégrée. Il s’agit par exemple d’un gène de résistance aux antibiotiques, notamment le gène de résistance à l’antibiotique hygromycinehph, tel que représenté par la séquence de SEQ ID NO : 6.
Plus précisément, selon l’invention, la cassette d’invalidation est préférentiellement constituée d’un gène de résistance placé sous le contrôle d’un promoteur et d’un terminateur, avec en amont et en aval les régions flanquantes 5’ et 3’ du gènecel1a. Selon l’invention, ladite cassette d’invalidation pourra être liée opérationnellement à un promoteur, un terminateur ou toute autre séquence nécessaire à son expression dans une cellule hôte.
La cassette d’invalidation peut être amplifiée selon les techniques classiques bien connues de l'homme du métier, typiquement par une méthode choisie parmi le clonage classique, la fusion PCR, ou encore le clonagein vivopar PCR. Préférentiellement, cette cassette d’invalidation est amplifiée par PCR, notamment à l’aide des séquences représentée par les SEQ ID NO : 9 et SEQ ID NO : 11. La cassette d’invalidation est ensuite introduite par recombinaison dans une souche deTrichoderma, notammentTrichoderma reesei,qui n'exprime pas un gène du marqueur de sélection. Après culture, les souches variantes/mutantes ayant incorporé la cassette d’invalidation sont sélectionnées en fonction de l'expression ou non du marqueur de sélection; les clones ayant été transformés exprimant ledit marqueur de sélection. Il s’agit notamment des souches à utilisées selon l’invention. Préférentiellement, les souches mutantes sont identifiées à l’aide des amorces de SEQ ID NO : 8 et SEQ ID NO : 13. Ces techniques de recombinaison génétiques sont bien connues de l’homme du métier.
Dans la présente description, les définitions, mode de réalisation et préférences indiquées dans un aspect s’appliquentmutatis mutandisaux autres aspects. Par exemple, toutes les définitions et préférences indiquées dans le premier aspect de l’invention ci-dessus s’appliquent également aux deuxième, troisième, quatrième, cinquième et sixième aspects.
Brève description des Figures
D’autres caractéristiques, détails et avantages de l’invention apparaîtront à la lecture des Figures annexées.
Fig. 1
représente le plasmide pRS426-∆cel1a-hph qui a été utilisé pour obtenir une souche dans laquelle le gènecel1aa été invalidé. Les positions des différents fragments de la cassette d’invalidation et des oligonucléotides utilisées pour la construction sont indiquées.
Fig. 2
représente l’optimisation de la composition du mélange lactose/glucose utilisé comme solution d’alimentation pour la phase de production de protéines parTrichoderma reeseiRutC30-Δcel1a.
Fig. 3
représente la comparaison de la productivité spécifique en bioréacteur des souches RutC30 et RutC30-Δcel1alorsqu’elles sont alimentées en mode fed-batch par des solutions de sucres de différentes compositions.
Séquences de la présente invention
Nom de la séquence Séquence
SEQ ID NO : 1 atgttgcccaaggactttcagtgggggttcgccacggctgcctaccagatcgagggcgcc
gtcgaccaggacggccgcggccccagcatctgggacacgttctgcgcgcagcccggcaag
atcgccgacggctcgtcgggcgtgacggcgtgcgactcgtacaaccgcacggccgaggac
attgcgctgctcaagtcgctcggggccaagagctaccgcttctccatctcgtggtcgcgc
atcatccccgagggcggccgcggcgatgccgtcaaccaggcgggcatcgaccactacgtc
aagttcgtcgacgacctgctcgacgccggcatcacgcccttcatcaccctcttccactgg
gacctgcccgagggcctgcatcagcggtacggggggctgctgaaccgcaccgagttcccg
ctcgactttgaaaactacgcccgcgtcatgttcagggcgctgcccaaggtgcgcaactgg
atcaccttcaacgagccgctgtgctcggccatcccgggctacggctccggcaccttcgcc
cccggccggcagagcacctcggagccgtggaccgtcggccacaacatcctcgtcgcccac
ggccgcgccgtcaaggcgtaccgcgacgacttcaagcccgccagcggcgacggccagatc
ggcatcgtcctcaacggcgacttcacctacccctgggacgccgccgacccggccgacaag
gaggcggccgagcggcgcctcgagttcttcacggcctggttcgcggatcccatctacttg
ggcgactacccggcgtcgatgcgcaagcagctgggcgaccggctgccgacctttacgccc
gaggagcgcgccctcgtccacggctccaacgacttttacggcatgaaccactacacgtcc
aactacatccgccaccgcagctcgcccgcctccgccgacgacaccgtcggcaacgtcgac
gtgctcttcaccaacaagcagggcaactgcatcggccccgagacgcagtccccctggctg
cgcccctgtgccgccggcttccgcgacttcctggtgtggatcagcaagaggtacggctac
ccgcccatctacgtgacggagaacggcacgagcatcaagggcgagagcgacttgcccaag
gagaagattctcgaagatgacttcagggtcaagtactataacgagtacatccgtgccatg
gttaccgccgtggagctggacggggtcaacgtcaaggggtactttgcctggtcgctcatg
gacaactttgagtgggcggacggctacgtgacgaggtttggggttacgtatgtggattat
gagaatgggcagaagcggttccccaagaagagcgcaaagagcttgaagccgctgtttgac
gagctgattgcggcggcgtga
SEQ ID NO : 2 MLPKDFQWGFATAAYQIEGAVDQDGRGPSIWDTFCAQPGKIADGSSGVTACDSYNRTAEDIALLKSLGAKSYRFSISWSRIIPEGGRGDAVNQAGIDHYVKFVDDLLDAGITPFITLFHWDLPEGLHQRYGGLLNRTEFPLDFENYARVMFRALPKVRNWITFNEPLCSAIPGYGSGTFAPGRQSTSEPWTVGHNILVAHGRAVKAYRDDFKPASGDGQIGIVLNGDFTYPWDAADPADKEAAERRLEFFTAWFADPIYLGDYPASMRKQLGDRLPTFTPEERALVHGSNDFYGMNHYTSNYIRHRSSPASADDTVGNVDVLFTNKQGNCIGPETQSPWLRPCAAGFRDFLVWISKRYGYPPIYVTENGTSIKGESDLPKEKILEDDFRVKYYNEYIRAMVTAVELDGVNVKGYFAWSLMDNFEWADGYVTRFGVTYVDYENGQKRFPKKSAKSLKPLFDELIAAA
SEQ ID NO : 3 GTGACCGAACAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGGTGCCGACGACGACGGAGGCGAAGCGGAGCGCCGCGCTGCGCCAGTCGTTTGGCGTGCCCTGGTTCGAGACGCTGATTGAGGGCTCGCGCCTGGGCAGCATGCGCCGGAGCTACGGGGCGCAGCGGTCGCGCGACGGGCAGGCGAGCATCGAGTGGGAGATTGTCGAGTTCTCGGACGGCGGCGGGGAGATGGACTTGGGCGAGGCGGACGACGCGGCGCTGCAGCAGCTGGGCAAGAGGAAGCATCACGAGGTTTGACCGGGGAGGGGGCCAAATAGCTTTGGGTATTACACACACACGTGTGTGTGTGTGTGTGAGAGGTGCAAGTGAGGTGGCGAGTGAGTTGACTGAGTAACTGAGTGGCTGAGTGAGCGAGTGATGTGTAACAACAACAGCTGTCGGAAAACAAAAGGGGAACCGATACGCCGTTCGTGGTTCAGGGGTAATGTGTGTGTCTGGCATGGTTGGCGTGGTCCGGTCTGTATATGAGCTGTCGCTTCTGTATCGTTTGTCTTCTTGTTGCAATTCTTTTTTTTCTTGTCCTCGGTCAGGCGTTGTTGTGCAGACAGTGGTTGGGGAGGGAGGCGGTTGTCTGTCCACCTTGCACCTTTTTCATCATTTTGCCTTTAGGCGTAACTCGATAGCAGAGGCTATATAGAGAGATCCAGATGGGAATCGACGCAAAACCTTTTGGAGTCACCACTCGGGACGCTTGTGCCTTTCGTCTTTATTATGCATAAATGCCACCTCCAGCCGGCGTGCAGCGTATACTTGTACACTTCAGACTTGTAGTAGTAGGTAGTACTGTATGTGACTAGGTACTATTCATCCGCAAAGTGTTGTCAAGGAACATGCGGCTTATAAGAGTAGCACTCGGCTGGAATATGGCGTTTGATCCTCGCAATCCAATTCCCCTTTGCATGATTACATGGCAACTGTCCCACGTGCTGTCTCGGCTGAATCTATCCGTCGGCTTACCAGAAAGAAACGAAGCCGGACAGAATAGCCAGATTTCCATACCTTCAACTCCTTTGTTTCTGTCTCCTATTCCCGCCATTCCCCGATGCCTCGAACTACTGGCAGCAAAAATCTCCCCGTCTTCTCACCTTTCGACCACTCCTCCTCCTCCGATCCTCTCTTTCCCCTCTCAACGTCCCTCAGCGTACCATCAAAGTGATAATCAGCAGCAGCAGCGGCAGCAGCTCTTTCGGAGTATCACCGTGTCACACCCTCTCCCCCCATCGCCGGGCTAAGCTGCTTGGAGCCGTCCGGATCGCCCGCCTCCGCTTCTCCAGCTTCCCCATTTACGTTGAGGTGCGGCTAGCCTTGCCTTGTGACTCGCCTTTTCTGCTTGTATCGGCCAGGGGGGGGTTTGGTTAGGTGGTTGGCTGGTTGGCTGGTTGGTTAGGATACTGTAGAAAAGGGATCCGAGAGCTACCTTACATCAATATGGCCAGCACCTCTTCGGCGATACATACTCGCCACCCCAGCCGGGGCGATTGTGTGTACTAGGTAGGCTCGTACTATACCAGCAGGAGAGGTGCTGCTTGGCAATCGTGCTCAGCTGTTAGGTTGTACTTGTATGGTACTTGTAAGGTGGTCATGCAGTTGCTAAGGTACCTAGGGAGGGATTCAACGAGCCCTGCTTCCAATGTCCATCTGGATAGGATGGCGGCTGGCGGGGCCGAAGCTGGGAACTCGCCAACAGTCATATGTAATAGCTCAAGTTGATGATACCGTTTTGCCAGGATTAGGATGCGAGAAGCAGCATGAATGTCGCTCATCCGATGCCGCATCACCGTTGTGTCAGAAACGACCAAGCTAAGCAACTAAGGTACCTTACCGTCCACTATCTCAGGTAACCAGGTACTACCAGCTACCCTACCTGCCGTGCCTACCTGCTTTAGTATTAATCTTTCCACCTCCCTCCTCAATCTTCTTTTCCCTCCTCTCCTCTTTTTTTTTTCTTCCTCCTCTTCTTCTCCATAACCATTCCTAACAACATCGACATTCTCTCCTAATCACCAGCCTCGCAAATCCTCAGGTTAGTATTACTACTACTACAATCATCACCACGATGCTCCGCCCGACGATGCGGCTTCTGTTCGCCTGCCCCTCCTCTCACTCGTGCCCTTGACGAGCTACCCCGCCAGACTCTCCTGCGTCACCAATTTTTTTCCCTATTTACCCCTCCTCCCTCTCTCCCTCTCGTTTCTTCCTAACAAACAACCACCACCAAAATCTCTTTGGAAGCTCACGACTCACGCAAGCTCAATTCGCAGATACAAATCTAGAATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCGACGTCTGTCGAGAAGTTTCTGATCGAAAAGTTCGACAGCGTCTCCGACCTGATGCAGCTCTCGGAGGGCGAAGAATCTCGTGCTTTCAGCTTCGATGTAGGAGGGCGTGGATATGTCCTGCGGGTAAATAGCTGCGCCGATGGTTTCTACAAAGATCGTTATGTTTATCGGCACTTTGCATCGGCCGCGCTCCCGATTCCGGAAGTGCTTGACATTGGGGAATTCAGCGAGAGCCTGACCTATTGCATCTCCCGCCGTGCACAGGGTGTCACGTTGCAAGACCTGCCTGAAACCGAACTGCCCGCTGTTCTGCAGCCGGTCGCGGAGGCCATGGATGCGATCGCTGCGGCCGATCTTAGCCAGACGAGCGGGTTCGGCCCATTCGGACCGCAAGGAATCGGTCAATACACTACATGGCGTGATTTCATATGCGCGATTGCTGATCCCCATGTGTATCACTGGCAAACTGTGATGGACGACACCGTCAGTGCGTCCGTCGCGCAGGCTCTCGATGAGCTGATGCTTTGGGCCGAGGACTGCCCCGAAGTCCGGCACCTCGTGCACGCGGATTTCGGCTCCAACAATGTCCTGACGGACAATGGCCGCATAACAGCGGTCATTGACTGGAGCGAGGCGATGTTCGGGGATTCCCAATACGAGGTCGCCAACATCTTCTTCTGGAGGCCGTGGTTGGCTTGTATGGAGCAGCAGACGCGCTACTTCGAGCGGAGGCATCCGGAGCTTGCAGGATCGCCGCGGCTCCGGGCGTATATGCTCCGCATTGGTCTTGACCAACTCTATCAGAGCTTGGTTGACGGCAATTTCGATGATGCAGCTTGGGCGCAGGGTCGATGCGACGCAATCGTCCGATCCGGAGCCGGGACTGTCGGGCGTACACAAATCGCCCGCAGAAGCGCGGCCGTCTGGACCGATGGCTGTGTAGAAGTACTCGCCGATAGTGGAAACCGACGCCCCAGCACTCGTCCGAGGGCAAAGGAATAATGCATGTGCTGTGTTCCTCAGAATGGGCCCCAGAAGGGCGTCGAGCATTGTCTATGAATGCAAACAAAAATAGTAAATAAATAGTAATTCTGGCCATGACGAATAGAGCCAATCTGCTCCACTTGACTATCCTTGTGACTGTATCGTATGTCGAACCCTTGACTGCCCATTCAAACAATTGTAAAGGAATATGAGCTACAAGTTATGTCTCACGTTTGCGTGCGAGCCCGTTTGTACGTTATTTTGAGAAAGCGTTGCCATCACATGCTCACAGTCACTTGGCTTACGATCATGTTTGCGATCTTTCGGTAAGAATACACAGAGTAACGATTATACATCCATCGCTTTCTATGATTAGGTACTCAGACAACACATGGGAAACAAGATAACCATCGCATGCAAGGTCGATTCCAATCATGATCTGGACTGGGGTATTCCATCTAAGCCATAGTACCCTCGAGCCCATCATCGTCTGCGCCATGGCGCTCATGGCGGACGGGGGCATGGATGATGGCATGGATGATGGCATGGATGATGGCATGGACGATGGCATGGACGATGGCTGGGGCCCGCCACCGCCCTTAACGGGACCGTAGATGGCCTCGTCGTCGCTCGTGTCATCTGTATCATCGTCGTCGTCTTCGTCCTTTTTCGCTTTTGGGTGCTTCGCGCGGAGACGCATATTCTTTGCGACTTCGTCCGCGCTGAAGCCGTAGATGCTCTTGAGGTAGCGCATGAACTCGAGGTACGCATCCGACACGATTTGCACATGCAAGTGCGTCAACTCGACCTTGGCATCCTCATCCCTCACGCCCTGCTTCTTCTTCTTTCCTTCTTCTCCCACGTTGGTGCTGCTGATGCTCCGATTCTGGGCGTCAAACTCGGCCATGGCCAGCGCCGTCTGGCACGCGTTGCGAATCTGCCGGCCGTTCCAGCGCATGTTTTCGTGCTTCTTCCAGTATGCGGTGGCGTACTTGAGAATGTCCTTTTCGTGGATGTCGATTTCGCGGCCCTTGTCGCGGAAGCGCTGCTTGATGATGCGCAGGTTGAGGCGGAAGATTTCGCGCGTGGACGATTTGTCGAGGGGCGGGTAGTAGAGGGAGATGTGGATGCGGGAGGTGAAGGCCTCGTCAAAGTCGCCGATGCGGTTGGTCGTGAGGAAGAGGATGCCTGCGTAGTATTCGAGGACGCGGAGGAAGACTTGAGTTGACGAGAGTTTAGCTGATTCTGAGTAGGGGGTAGCGCACAGATAGGGGTAAAGGGGTTGGAGGTCAACTTACCTGCTACGAGGCCGTTGCGGACAAAGTTCTTGGGGGAGCGCTGGGCGAGAAAGACGTCTGCTTCGTCGAGGAGGAGGATGCAGCCCCATCGGTTGGCCAGGCTAAAGTTTCTCTCCAGGGCCGCTTCTACTTCACTGGCAGTTGCACCAAGATCTCCTGCAAAAGGAGTTGTTGTGTACATGCTTTAGCCTATATGAATCTTGTAGATTACTTGGACACAGGAAGTGACAGTGCACATACCGCAGGTGATTTGGAACAAAGGCTTGTTGAAGCGTTCGGCAACACCCTCTATAACATCCATGTCAGCACATGTACGAGGAGGGTTGGCATGATTCTCTGAACTTACCAGCAGTTGTTGTCTTTCCCACGCCTGGACTTCCATGTAACAGAAGAATGAGGCCCTTCCCTGTATAAAGAAGTCAGTTGATTCGCGCTCAAAAAGCCTTGTCAAAAAGGGGAATACCTTTGCCTCGAATAATGTCCACCTCTTCATTATCGCTAACCCTCGCCTCCTTGTTCCGAAAGTGCTGGTCAACCAAACAATACACAATGTCCTTGTGCTGCTTCGGGAGCACCAGCTGGTCAAACGCCGTCTGCTCTTTTGAGCCCTCGCTGACGGGACTGAGATACTTGAGATCGAGCTTCGCTATCCAGCAAGTCAGCACACACACTCTTCAACGCAGTAAAAAAGAGAAGAAAAAAGGGGGGGGATAAGTGACGAACCC
SEQ ID NO : 4 ACGATGATACCGACGCCGCCGTGACCGAACAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGGTGCCGACGACGACGGAGGCGAAGCGGAGCGCCGCGCTGCGCCAGTCGTTTGGCGTGCCCTGGTTCGAGACGCTGATTGAGGGCTCGCGCCTGGGCAGCATGCGCCGGAGCTACGGGGCGCAGCGGTCGCGCGACGGGCAGGCGAGCATCGAGTGGGAGATTGTCGAGTTCTCGGACGGCGGCGGGGAGATGGACTTGGGCGAGGCGGACGACGCGGCGCTGCAGCAGCTGGGCAAGAGGAAGCATCACGAGGTTTGACCGGGGAGGGGGCCAAATAGCTTTGGGTATTACACACACACGTGTGTGTGTGTGTGTGAGAGGTGCAAGTGAGGTGGCGAGTGAGTTGACTGAGTAACTGAGTGGCTGAGTGAGCGAGTGATGTGTAACAACAACAGCTGTCGGAAAACAAAAGGGGAACCGATACGCCGTTCGTGGTTCAGGGGTAATGTGTGTGTCTGGCATGGTTGGCGTGGTCCGGTCTGTATATGAGCTGTCGCTTCTGTATCGTTTGTCTTCTTGTTGCAATTCTTTTTTTTCTTGTCCTCGGTCAGGCGTTGTTGTGCAGACAGTGGTTGGGGAGGGAGGCGGTTGTCTGTCCACCTTGCACCTTTTTCATCATTTTGCCTTTAGGCGTAACTCGATAGCAGAGGCTATATAGAGAGATCCAGATGGGAATCGACGCAAAACCTTTTGGAGTCACCACTCGGGACGCTTGTGCCTTTCGTCTTTATTATGCATAAATGCCACCTCCAGCCGGCGTGCAGCGTATACTTGTACACTTCAGACTTGTAGTAGTAGGTAGTACTGTATGTGACTAGGTACTATTCATCCGCAAAGTGTTGTCAAGGAACATGCGGCTTATAAGAGTAGCACTCGGCTGGAATATGGCGTTTGATCCTCGCAATCCAATTCCCCTTTGCATGATTACATGGCAACTGTCCCACGTGCTGTCTCGGCTGAATCTATCCGTCGGCTTACCAGAAAGAAACGAAGCCGGACAGAATAGCCAGATTTCCATACCTTCAACTCCTTTGTTTCTGTCTCCTATTCCCGCCATTCCCCGATGCCTCGAACTACTGGCAGCAAAAATCTCCCCGTCTTCTCACCTTTCGACCACTCCTCCTCCTCCGATCCTCTCTTTCCCCTCTCAACGTCCCTCAGCGTACCATCAAAGTGATAATCAGCAGCAGCAGCGGCAGCAGCTCTTTCGGAGTATCACCGTGTCACACCCTCTCCCCCCATCGCCGGGCTAAGCTGCTTGGAGCCGTCCGGATCGCCCGCCTCCGCTTCTCCAGCTTCCCCATTTACGTTGAGGTGCGGCTAGCCTTGCCTTGTGACTCGCCTTTTCTGCTTGTATCGGCCAGGGGGGGGTTTGGTTAGGTGGTTGGCTGGTTGGCTGGTTGGTTAGGATACTGTAGAAAAG
SEQ ID NO : 5 CCCATCATCGTCTGCGCCATGGCGCTCATGGCGGACGGGGGCATGGATGATGGCATGGATGATGGCATGGATGATGGCATGGACGATGGCATGGACGATGGCTGGGGCCCGCCACCGCCCTTAACGGGACCGTAGATGGCCTCGTCGTCGCTCGTGTCATCTGTATCATCGTCGTCGTCTTCGTCCTTTTTCGCTTTTGGGTGCTTCGCGCGGAGACGCATATTCTTTGCGACTTCGTCCGCGCTGAAGCCGTAGATGCTCTTGAGGTAGCGCATGAACTCGAGGTACGCATCCGACACGATTTGCACATGCAAGTGCGTCAACTCGACCTTGGCATCCTCATCCCTCACGCCCTGCTTCTTCTTCTTTCCTTCTTCTCCCACGTTGGTGCTGCTGATGCTCCGATTCTGGGCGTCAAACTCGGCCATGGCCAGCGCCGTCTGGCACGCGTTGCGAATCTGCCGGCCGTTCCAGCGCATGTTTTCGTGCTTCTTCCAGTATGCGGTGGCGTACTTGAGAATGTCCTTTTCGTGGATGTCGATTTCGCGGCCCTTGTCGCGGAAGCGCTGCTTGATGATGCGCAGGTTGAGGCGGAAGATTTCGCGCGTGGACGATTTGTCGAGGGGCGGGTAGTAGAGGGAGATGTGGATGCGGGAGGTGAAGGCCTCGTCAAAGTCGCCGATGCGGTTGGTCGTGAGGAAGAGGATGCCTGCGTAGTATTCGAGGACGCGGAGGAAGACTTGAGTTGACGAGAGTTTAGCTGATTCTGAGTAGGGGGTAGCGCACAGATAGGGGTAAAGGGGTTGGAGGTCAACTTACCTGCTACGAGGCCGTTGCGGACAAAGTTCTTGGGGGAGCGCTGGGCGAGAAAGACGTCTGCTTCGTCGAGGAGGAGGATGCAGCCCCATCGGTTGGCCAGGCTAAAGTTTCTCTCCAGGGCCGCTTCTACTTCACTGGCAGTTGCACCAAGATCTCCTGCAAAAGGAGTTGTTGTGTACATGCTTTAGCCTATATGAATCTTGTAGATTACTTGGACACAGGAAGTGACAGTGCACATACCGCAGGTGATTTGGAACAAAGGCTTGTTGAAGCGTTCGGCAACACCCTCTATAACATCCATGTCAGCACATGTACGAGGAGGGTTGGCATGATTCTCTGAACTTACCAGCAGTTGTTGTCTTTCCCACGCCTGGACTTCCATGTAACAGAAGAATGAGGCCCTTCCCTGTATAAAGAAGTCAGTTGATTCGCGCTCAAAAAGCCTTGTCAAAAAGGGGAATACCTTTGCCTCGAATAATGTCCACCTCTTCATTATCGCTAACCCTCGCCTCCTTGTTCCGAAAGTGCTGGTCAACCAAACAATACACAATGTCCTTGTGCTGCTTCGGGAGCACCAGCTGGTCAAACGCCGTCTGCTCTTTTGAGCCCTCGCTGACGGGACTGAGATACTTGAGATCGAGCTTCGCTATCCAGCAAGTCAGCACACACACTCTTCAACGCAGTAAAAAAGAGAAGAAAAAAGGGGGGGGATAAGTGACGAACCCCATTTACGGCTCCTCAACACA
SEQ ID NO : 6 GGATCCGAGAGCTACCTTACATCAATATGGCCAGCACCTCTTCGGCGATACATACTCGCCACCCCAGCCGGGGCGATTGTGTGTACTAGGTAGGCTCGTACTATACCAGCAGGAGAGGTGCTGCTTGGCAATCGTGCTCAGCTGTTAGGTTGTACTTGTATGGTACTTGTAAGGTGGTCATGCAGTTGCTAAGGTACCTAGGGAGGGATTCAACGAGCCCTGCTTCCAATGTCCATCTGGATAGGATGGCGGCTGGCGGGGCCGAAGCTGGGAACTCGCCAACAGTCATATGTAATAGCTCAAGTTGATGATACCGTTTTGCCAGGATTAGGATGCGAGAAGCAGCATGAATGTCGCTCATCCGATGCCGCATCACCGTTGTGTCAGAAACGACCAAGCTAAGCAACTAAGGTACCTTACCGTCCACTATCTCAGGTAACCAGGTACTACCAGCTACCCTACCTGCCGTGCCTACCTGCTTTAGTATTAATCTTTCCACCTCCCTCCTCAATCTTCTTTTCCCTCCTCTCCTCTTTTTTTTTTCTTCCTCCTCTTCTTCTCCATAACCATTCCTAACAACATCGACATTCTCTCCTAATCACCAGCCTCGCAAATCCTCAGGTTAGTATTACTACTACTACAATCATCACCACGATGCTCCGCCCGACGATGCGGCTTCTGTTCGCCTGCCCCTCCTCTCACTCGTGCCCTTGACGAGCTACCCCGCCAGACTCTCCTGCGTCACCAATTTTTTTCCCTATTTACCCCTCCTCCCTCTCTCCCTCTCGTTTCTTCCTAACAAACAACCACCACCAAAATCTCTTTGGAAGCTCACGACTCACGCAAGCTCAATTCGCAGATACAAATCTAGAATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCGACGTCTGTCGAGAAGTTTCTGATCGAAAAGTTCGACAGCGTCTCCGACCTGATGCAGCTCTCGGAGGGCGAAGAATCTCGTGCTTTCAGCTTCGATGTAGGAGGGCGTGGATATGTCCTGCGGGTAAATAGCTGCGCCGATGGTTTCTACAAAGATCGTTATGTTTATCGGCACTTTGCATCGGCCGCGCTCCCGATTCCGGAAGTGCTTGACATTGGGGAATTCAGCGAGAGCCTGACCTATTGCATCTCCCGCCGTGCACAGGGTGTCACGTTGCAAGACCTGCCTGAAACCGAACTGCCCGCTGTTCTGCAGCCGGTCGCGGAGGCCATGGATGCGATCGCTGCGGCCGATCTTAGCCAGACGAGCGGGTTCGGCCCATTCGGACCGCAAGGAATCGGTCAATACACTACATGGCGTGATTTCATATGCGCGATTGCTGATCCCCATGTGTATCACTGGCAAACTGTGATGGACGACACCGTCAGTGCGTCCGTCGCGCAGGCTCTCGATGAGCTGATGCTTTGGGCCGAGGACTGCCCCGAAGTCCGGCACCTCGTGCACGCGGATTTCGGCTCCAACAATGTCCTGACGGACAATGGCCGCATAACAGCGGTCATTGACTGGAGCGAGGCGATGTTCGGGGATTCCCAATACGAGGTCGCCAACATCTTCTTCTGGAGGCCGTGGTTGGCTTGTATGGAGCAGCAGACGCGCTACTTCGAGCGGAGGCATCCGGAGCTTGCAGGATCGCCGCGGCTCCGGGCGTATATGCTCCGCATTGGTCTTGACCAACTCTATCAGAGCTTGGTTGACGGCAATTTCGATGATGCAGCTTGGGCGCAGGGTCGATGCGACGCAATCGTCCGATCCGGAGCCGGGACTGTCGGGCGTACACAAATCGCCCGCAGAAGCGCGGCCGTCTGGACCGATGGCTGTGTAGAAGTACTCGCCGATAGTGGAAACCGACGCCCCAGCACTCGTCCGAGGGCAAAGGAATAATGCATGTGCTGTGTTCCTCAGAATGGGCCCCAGAAGGGCGTCGAGCATTGTCTATGAATGCAAACAAAAATAGTAAATAAATAGTAATTCTGGCCATGACGAATAGAGCCAATCTGCTCCACTTGACTATCCTTGTGACTGTATCGTATGTCGAACCCTTGACTGCCCATTCAAACAATTGTAAAGGAATATGAGCTACAAGTTATGTCTCACGTTTGCGTGCGAGCCCGTTTGTACGTTATTTTGAGAAAGCGTTGCCATCACATGCTCACAGTCACTTGGCTTACGATCATGTTTGCGATCTTTCGGTAAGAATACACAGAGTAACGATTATACATCCATCGCTTTCTATGATTAGGTACTCAGACAACACATGGGAAACAAGATAACCATCGCATGCAAGGTCGATTCCAATCATGATCTGGACTGGGGTATTCCATCTAAGCCATAGTACCCTCGAG
SEQ ID NO : 7 GGATCCGAGAGCTACCTTAC
SEQ ID NO : 8 CTCGAGGGTACTATGGCTTA
SEQ ID NO : 9 GTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGACGATGATACCGACGCCGCC
SEQ ID NO : 10 CATATTGATGTAAGGTAGCTCTCGGATCCCTTTTCTACAGTATCCTAACCA
SEQ ID NO : 11 TATTCCATCTAAGCCATAGTACCCTCGAGCCCATCATCGTCTGCGCCA
SEQ ID NO : 12 GCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTGTGTTGAGGAGCCGTAAATG
SEQ ID NO : 13 ATCACCACGAAGCTTTGTCT
Bibliographie des exemples
Hartl, Lukas; Kubicek, Christian P.; Seiboth, Bernhard (2007): Induction of the gal pathway and cellulase genes involves no transcriptional inducer function of the galactokinase in Hypocrea jecorina. InThe Journal of Biological Chemistry282 (25), pp. 18654–18659. DOI: 10.1074/jbc.M700955200.
Christianson, T. W.; Sikorski, R. S.; Dante, M.; Shero, J. H.; Hieter, P. (1992): Multifunctional yeast high-copy-number shuttle vectors. InGene110 (1), pp. 119–122.
Montenecourt, B. S.; Eveleigh, D. E. (1977) Semiquantitative Plate Assay for Determination of Cellulase Production by Trichoderma viride. In : Applied and environmental microbiology, vol. 33, n° 1, p. 178–183
Schiestl, Robert H.; Gietz, R. Daniel (1989): High efficiency transformation of intact yeast cells using single stranded nucleic acids as a carrier. InCurrent Genetics16 (5), pp. 339–346. DOI: 10.1007/BF00340712.
Exemples
Exemple 1 : Invalidation du gène cel1a dans une souche hyperproductrice
Pour la construction de la cassette d’invalidation de cel1a contenant le gène de résistance à l’hygromycine B (hph), les régions flanquantes (1 kb) de cel1a ont été amplifiées à partir d’ADN génomique de T. reesei en utilisant la polymérase Phusion (Thermo Fisher Scientific) et à l’aide des oligonucléotides suivants : cel1a-5F et cel1a-5R ; cel1a-3F et cel1a-3R (voir le Tableau 2). Le marqueur hph a été amplifié à partir du plasmide pLHhph1 à l’aide des oligonucléotides hphF and hphR (Hartl et al., 2007). Les oligonucléotides utilisés pour l’amplification des régions flanquantes chevauchent les différents fragments de la construction ( ). La cassette de délétion sera assemblée dans le plasmide pRS426 par recombinaison homologue lors du passage dans la levure. La transformation des levures a été réalisée en utilisant la méthode décrite par Schiestl et Gietz (1989). La souche de levure ATCC 208405 a été transformée avec les deux régions flanquantes, le marqueur hph et le plasmide pRS426 préalablement digéré par EcoRI et XbaI (Christianson et al., 1992) pour donner le plasmide pRS426-∆cel1a-hph. Le plasmide a ensuite été introduit et amplifié dans les bactéries E. coli thermo-compétentes NEB 10-beta (New England Biolabs). Les oligonucléotides cel1a-3F et cel1a-5R ont servi à amplifier la cassette d’invalidation à partir du plasmide pRS426-∆cel1a-hph. La cassette a été purifiée à l’aide du kit de purification PCR QIAquick (QIAGEN). La souche utilisée pour la transformation est la souche hyperproductrice RutC30 (Montenecourt et Eveleigh, 1977). La souche a été transformée par la méthode des protoplastes (Penttila et al. (1987) en utilisant 1 µg de cassette purifiée. L’intégration de la cassette hph a été vérifiée par PCR en utilisant les oligonucléotides cel1a_ch et hphR de manière à obtenir un produit PCR uniquement si la cassette s’est correctement insérée. Trois clones indépendants ont été isolés et analysés comme réplicats biologiques. Les séquences et noms des amorces sont présentés dans les Tableaux 1 et 2. La souche invalidée pour le gène cel1a est nommés RutC30-Δcel1a.
Nom des amorces Séquences correspond à l’amorce
hphF SEQ ID NO : 7
hphR SEQ ID NO : 8
cel1a-5F SEQ ID NO : 9
cel1a-5R SEQ ID NO : 10
cel1a-3F SEQ ID NO : 11
cel1a-3R SEQ ID NO : 12
cel1a_ch SEQ ID NO : 13
Séquences des amorces de la présente invention
Exemple 2 : Protocole de culture en fioles
Les cultures en fioles alimentées sont réalisées dans des fioles Erlenmeyer de 8 cm de diamètre, contenant 60mL de milieu de culture, ensemencées avec des spores de la souche souhaitée stockés en cryotubes, et mises en incubation à 150 rpm et 30°C dans un incubateur Infors Multitron.
Le milieu de culture possède la composition finale suivante :
- 1 mL/L H3PO485%
- 2,8 g/L de (NH4)2SO4
- 0,3 g/L de MgSO4,7H2O
- 0,15 g/L de CaCl2,2H2O
- 1 mL/L de solution d’oligos éléments (FeSO4: 5 g/L, MnSO4: 1,4 g/L, ZnSO4: 1,4 g/L, CoCl2: 3,7 g/l)
- 8,0 g/L de dipotassium phtalate
- 1,5 g/L de cornsteep
- 12,5 g/L de glucose
- pH ajusté à 5.4 avec de la soude 30%
- Stérilisation 20 min à 121°C (le glucose est stérilisé séparément des autres composés)
La première phase de croissance est réalisée pendant 48h jusqu’à épuisement du glucose, ce qui entraine l’acidification du milieu à un pH d’environ 3,5. Le pH est alors remonté à environ 4,3 par ajout de soude.
La deuxième phase de production est réalisée pendant 48h par alimentation à 0,3 mL/h d’une solution de « fed-batch » contenant :
- 50 g/L de sucres (lactose pur, ou mélanges lactose + glucose)
- 5,6 g/L d’urée (ajoutée à partir d’un stock à 250 g/L stérilisé par filtration) qui permet de mimer l’ammoniaque qui serait apporté par la régulation de pH lors d’une culture en bioréacteur.
Des prélèvements réguliers de 2 mL sont effectués pour suivre le pH, le glucose résiduel, et la concentration en protéines. A la fin de chacune des deux phases, un prélèvement plus conséquent (environ 10mL) est réalisé pour mesurer la concentration en champignon dans le milieu de culture (par filtration et séchage avec un filtre de 1,2 µm).
Pour juger du niveau d’induction d’une composition de sucres sur la souche, la vitesse spécifique de production (en mgprotéines/gbiomasse/h) est calculée en rapportant la productivité en protéines (en mgprotéines/L/h) à la concentration en champignon (gbiomasse/L).
Exemple 3 : Optimisation de la composition du fed-batch pour l’induction de la souche RutC30-Δcel1a
La souche RutC30-Δcel1a a été cultivée selon le protocole décrit dans l’exemple 2 afin de mesurer la productivité spécifique en protéines de la souche lorsqu’elle est alimentée en fed-batch par différents mélanges glucose/lactose. Les mélanges glucose/lactose testés vont de 99%glucose/1%lactose à 50%glucose/50%lactose. Le % s’entend ici par rapport à la quantité totale de sucres présents dans la solution.
La productivité spécifique est présentée après normalisation par la valeur maximale qui a été mesurée. On observe une productivité maximale avec le mélange 15%lactose/85%glucose, optimale dans la gamme de teneur en lactose comprise entre 10% et 20%, et bonne dans la gamme de teneur en lactose comprise entre 5% et 30%.
Exemple 4 : Protocole de culture en bioréacteurs
Les cultures en bioréacteurs sont réalisées dans des fermenteurs de 10 cm de diamètre, contenant 800 mL de milieu de culture, ensemencés à 10%v/v à partir d’une préculture. L’agitation est effectuée par une turbine Rushton et une turbine pitch-blade de 5 cm de diamètre. La vitesse d’agitation est contrôlée entre 400 et 1200 rpm pour maintenir une concentration d’oxygène dissous supérieure à 40% de la concentration à saturation. La température est contrôlée à 27°C pendant la 1èrephase puis à 25°C pendant la 2ephase. Le pH est contrôlé pendant toute la culture à 4,0 par ajout automatique d’une solution d’ammoniaque à 5N.
La préculture est réalisée dans des fioles de 19 cm de diamètre contenant 250 mL du même milieu de culture, tamponné avec 5g/L de dipotassium phtalate et dont le pH initial est ajusté à 5.0 avec de la soude. Les précultures sont ensemencées avec des spores de la souche souhaitée stockés en cryotubes, et mises en incubation à 150 rpm et 30°C dans un incubateur Infors Multitron.
Le milieu de culture possède la composition finale suivante :
- 3 mL/L d’acide orthophosphorique à 85%
- 0,25 mL/L d’acide sulfurique à 96%
- 1,66 g/L de potasse KOH en cristaux
- 2,8 g/L de (NH4)2SO4
- 0,6 g/L de MgSO4,7H2O
- 0,6 g/L de CaCl2,2H2O
- 0,12 g/L de Na2HPO4,12H2O
- 1 mL/L de solution d’oligos éléments (FeSO4: 5 g/L, MnSO4: 1,4 g/L, ZnSO4: 1,4 g/L, CoCl2: 3,7 g/l)
- 1 g/L de cornsteep
- 20 g/L de glucose
- Stérilisation 20 min à 121°C (le glucose est stérilisé séparément des autres composés)
- Ajustement du pH à 4,0 avec la solution d’ammoniaque servant au contrôle du pH
La première phase (croissance en batch sur glucose) est réalisée pendant 27 à 30h (jusqu’à épuisement du glucose), puis la 2ephase (production de protéines en mode fed-batch) est réalisée pendant 70h par alimentation d’une solution de sucres à 250g/L contenant soit du lactose pur, soit un mélange de lactose et de glucose.
Des prélèvements réguliers d’environ 15 mL sont effectués pour :
- suivre le glucose résiduel
- mesurer la concentration en champignon (par filtration puis séchage sur filtres de 1,2µm)
- mesurer la concentration en protéines (kit Biorad DC-Protein Assay en utilisant de la BSA comme standard).
Exemple 5 : Comparaison des performances des souches RutC30 et RutC30-Δcel1a
Pour mesurer plus précisément la vitesse spécifique de production de protéines de la souche RutC30-Δcel1a lorsqu’elle est alimentée par les différentes solutions optimales (identifiées dans l’exemple 3), et comparer avec la souche de référence RutC30, des cultures en bioréacteurs ont été réalisées avec ces 2 souches et avec différentes solutions d’alimentation pour la phase de fed-batch, selon le protocole décrit dans l’exemple 4. Les résultats sont présentés en .
La souche sauvage RutC30 alimentée avec une solution de lactose pur a une productivité spécifique de 20 à 22 mgprotéines/gbiomasse/h. Alimenter cette même souche avec une solution contenant un mélange composé de 10% de lactose et 90% de glucose donne une productivité spécifique environ 2,5 fois plus faible, autour de 8 mgprotéines/gbiomasse/h. Cette stratégie n’aurait donc pas d’intérêt industriellement car le surcoût lié à une productivité plus faible ne serait pas compensé par l’économie réalisée en utilisant moins de lactose.
La souche RutC30-Δcel1a alimentée avec une solution de lactose pur a une productivité spécifique très faible, autour de 3 mgprotéines/gbiomasse/h, car elle n’est plus capable d’assimiler de grande quantité de lactose. En revanche, lorsqu’elle est alimentée avec une solution contenant un mélange glucose/lactose avec 10 à 20% de lactose dans le mélange, la souche RutC30-Δcel1a a une productivité spécifique comprise entre 16 et 19 mgprotéines/gbiomasse/h, soit quasiment aussi bonne que la souche RutC30 alimentée avec du lactose pur. Avec 10% ou 15% de lactose dans le mélange, une productivité spécifique équivalente (non significativement différente) au témoin RutC30 alimenté pas du lactose pur a été observée.

Claims (15)

  1. Procédé de production de protéines par une souche de champignon appartenant au genreTrichodermadans laquelle le gènecel1aest invalidé, comprenant au moins deux étapes :
    - une première étape de croissance en phase batch en présence d’au moins un substrat carboné de croissance, et
    - une deuxième étape de production de protéines en phase fed-batch en présence d’une composition comprenant au moins du lactose et un deuxième sucre, la teneur en lactose dans ladite composition représentant environ entre 5 et 30% en poids de la teneur totale des sucres dans ladite composition.
  2. Procédé de production de protéines selon la revendication 1, dans lequel le champignon appartient à l’espèceTrichoderma reesei.
  3. Procédé de production de protéines selon l’une quelconque des revendications 1-2, dans lequel les protéines sont des enzymes, notamment des enzymes cellulolytiques telles que des cellulases ou des hémicellulases.
  4. Procédé de production de protéines selon l’une quelconque des revendications 1-3, dans lequel le deuxième sucre est choisi parmi le glucose ou le xylose, de préférence le glucose.
  5. Procédé de production de protéines selon l’une quelconque des revendications 1-4, dans lequel la teneur en lactose dans ladite composition représente environ entre 10 et 20% en poids de la teneur totale des sucres dans ladite composition.
  6. Procédé de production de protéines selon l’une quelconque des revendications 1-5, dans lequel ladite composition comprend :
    - environ entre 70-95% en poids de glucose et/ou de xylose, et
    - environ entre 5-30% en poids de lactose.
  7. Procédé de production de protéines selon l’une quelconque des revendications 1-6, dans lequel ladite composition comprend :
    - environ entre 80-90% en poids de glucose et/ou de xylose, et
    - environ entre 10-20% en poids de lactose,
    et plus particulièrement
    - environ entre 80-90% en poids de glucose, et
    - environ entre 10-20% en poids de lactose.
  8. Procédé de production de protéines selon l’une quelconque des revendications 1-7, dans lequel ledit substrat carboné de croissance est choisi parmi le lactose, le glucose, le xylose, les résidus liquides obtenus après fermentation éthanolique, optionnellement obtenus après fermentation éthanolique puis distillation, des sucres monomères des hydrolysats enzymatiques de biomasse cellulosique, un extrait brut de pentoses hydrosolubles provenant du prétraitement d’une biomasse cellulosique., un hydrolysat enzymatique de lignocellulose, et/ou un hydrolysat de biomasse amylacée.
  9. Procédé de production de protéines selon l’une quelconque des revendications 1-8, dans lequel le gènecel1aa été invalidé dans ladite souche par mutagénèse ou par recombinaison homologue, notamment à l’aide d’une cassette d’invalidation telle que représentée par la SEQ ID NO : 3.
  10. Procédé de production de sucres à partir de substrats cellulosiques ou lignocellulosiques, comprenant une étape de production d’enzymes cellulolytiques par une souche de champignon appartenant au genreTrichodermadans laquelle le gènecel1aest invalidé, en présence d’une composition comprenant au moins du lactose et un deuxième sucre, la teneur en lactose dans ladite composition représentant environ entre 5 et 30% en poids de la teneur totale des sucres dans ladite composition.
  11. Procédé de production de produits biosourcés à partir de substrats cellulosiques ou lignocellulosiques, comprenant une étape de production d’enzymes cellulolytiques par une souche de champignon appartenant au genreTrichodermadans laquelle le gènecel1aest invalidé, en présence d’une composition comprenant au moins du lactose et un deuxième sucre, la teneur en lactose dans ladite composition représentant environ entre 5 et 30% en poids de la teneur totale des sucres dans ladite composition.
  12. Procédé de production d’alcool, notamment de l’éthanol, à partir de substrats cellulosiques ou lignocellulosiques, comprenant une étape de production d’enzymes cellulolytiques par une souche de champignon appartenant au genreTrichodermadans laquelle le gènecel1aest invalidé, en présence d’une composition comprenant au moins du lactose et un deuxième sucre, la teneur en lactose dans ladite composition représentant environ entre 5 et 30% en poids de la teneur totale des sucres dans ladite composition.
  13. Procédé de production d'un d’alcool à partir de substrats cellulosiques ou lignocellulosiques selon la revendication 12, comprenant :
    - i) une étape de prétraitement d'un substrat cellulosique ou lignocellulosique afin d’obtenir un substrat prétraité,
    - ii) une étape de production enzymes cellulolytiques par une souche de champignon appartenant au genreTrichodermadans laquelle le gènecel1aest invalidé, en présence d’une composition comprenant au moins du lactose et un deuxième sucre, la teneur en lactose dans ladite composition représentant environ entre 5 et 30% en poids de la teneur totale des sucres dans ladite composition,
    - iii) une étape d'hydrolyse enzymatique du substrat prétraité, en présence des enzymes cellulolytiques obtenues à l’étape ii) et d'un substrat approprié, afin d’obtenir un hydrolysat,
    - iv) une étape de fermentation alcoolique de l'hydrolysat obtenu, l’étape iv) étant optionnellement réalisée en simultané avec l’étape iii).
    - v) une étape de séparation, notamment par distillation.
  14. Utilisation d’une souche de champignon appartenant au genreTrichodermadans laquelle le gènecel1aest invalidé, pour l'hydrolyse de la cellulose ou de la lignocellulose en sucre, ou pour la production de produits biosourcés à partir de substrats cellulosiques ou lignocellulosiques.
  15. Souche de champignon appartenant à l’espèceTrichodermaressei, ladite souche étant issue de la souche telle que déposée sous la référence ATCC 56765 et ladite souche comprenant une invalidation du gènecel1a.
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