EP4330401A1 - Insertion multicopies d'un gène d'intérêt dans le génome d'un champignon - Google Patents
Insertion multicopies d'un gène d'intérêt dans le génome d'un champignonInfo
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- EP4330401A1 EP4330401A1 EP22726786.1A EP22726786A EP4330401A1 EP 4330401 A1 EP4330401 A1 EP 4330401A1 EP 22726786 A EP22726786 A EP 22726786A EP 4330401 A1 EP4330401 A1 EP 4330401A1
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- C12P2201/00—Pretreatment of cellulosic or lignocellulosic material for subsequent enzymatic treatment or hydrolysis
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- C12P2203/00—Fermentation products obtained from optionally pretreated or hydrolyzed cellulosic or lignocellulosic material as the carbon source
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- C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
- C12R2001/885—Trichoderma
Definitions
- the present invention relates to a method for inserting several copies of a gene of interest into the genome of a fungus.
- the present invention also relates to the fungus strains thus obtained, and the different uses of such a modified fungus strain.
- the fungus strains are used for the production of proteins of interest.
- fungus strains belonging to the Trichoderma genus in particular Trichoderma reesei, are now mainly used for the production of enzymes.
- enzymes for example cellulases, are in fact used to hydrolyze cellulosic or lignocellulosic biomass into simple sugars.
- the enzymes produced by filamentous fungi are therefore useful in production chains for second-generation biofuels or even biosourced products derived from sugars originating from (ligno)cellulosic biomass.
- patent EP 448 430 B1 describes an optimized industrial production of cellulases by Trichoderma reesei.
- This production is carried out in a fed-batch protocol (feed without racking) using a feed solution containing lactose as the sugar inducing the production of proteins.
- This fermentation process comprises two stages: a first stage of growth of the fungus in the presence of an excess of carbon source and a second stage of production of enzymes thanks to the addition of an inducer in the medium with an optimized flow rate ( fed-batch mode). These steps are carried out in a liquid medium in bioreactors with stirring and in the presence of oxygen because the fungus is strictly aerobic.
- Another example of an optimized process for the production of cellulases is described in patent EP 2 744899 B1.
- Mushrooms can also be used to produce useful proteins in other types of industries, such as the food, cosmetics or pharmaceutical industry (see example Rantasalo, A., Vitikainen, M., Paasikallio, T. et al. Novel genetic tools that enable highly pure protein production in Trichoderma reesei. Soi Rep 9, 5032 (2019) or patent EP3405580).
- the TEF1 promoter is known as a strong promoter in fungi (Gao S, Zhou H, Zhou J, Chen J. Promoter-Library-Based Pathway Optimization for Efficient (2S)- Naringenin Production from p-Coumaric Acid in Saccharomyces cerevisiae. J Agric Food Chem. 2020 Jun 24;68(25):6884-6891. doi: 10.1021/acs.jafc.OcOI 130. Epub 2020 Jun 11).
- TEF1 promoter has also been described or suggested for promoting the expression of genes of interest (see for example US20080044878, US9732338, US6011147, W02018067068, US8071298, or even Kitamoto, N., Matsui, J ., Kawai, Y. et al.Utilization of the TEF1-a gene (TEF1) promoter for expression of polygalacturonase genes, pgaA and pgaB, in Aspergillus oryzae.Appl Microbiol Biotechnol 50, 85-92 (1998);Zhang J, Cai Y, Du G, Chen J, Wang M, Kang Z.
- flanking regions are usually necessary for the transgene to be flanked by sequences upstream downstream of the target locus.
- the size (number of base pairs) of these flanking regions depends on the organisms. For those with the ability to carry out homologous recombination, these flanking sequences may be short, for example in the case of Saccharomyces cerevisiae, around twenty base pairs are sufficient to target a locus (Janke C, Magiera MM, Rathfelder N, Taxis C, Reber S, Maekawa H, Moreno-Borchart A, Doenges G, Schwob E, Schiebel E, Knop M.
- the present invention is based here on the results of the inventors showing that the TEF1 promoter can be used for the multicopy insertion of a gene of interest. Each functional copy inserted leads to an increase in the expression of said gene of interest, thus increasing the production capacity of the protein of interest.
- the results of the present invention also show that it is possible to carry out successfully, in particular in Trichoderma reesei, the insertion at the target locus (the region 5' of the TEF1 promoter) by using a single flanking region of the insertion site in the expression cassette according to the invention (instead of the usual two).
- the present invention thus relates to a method for inserting several copies of a gene of interest into the genome of a fungus, said method comprising a step of transforming said fungus using a vector comprising a cassette of expression, said cassette comprising:
- TEF1 promoter identical to the endogenous TEF1 promoter of the fungus species
- the invention also relates to the use of an expression cassette for inserting several copies of a gene of interest into the genome of a fungus, said expression cassette comprising:
- TEF1 promoter identical to the endogenous TEF1 promoter of the fungus species
- the invention also relates to a method for producing a protein of interest comprising the following steps:
- the invention also relates to a fungus strain comprising in its genome several copies of a gene of interest under the control of a TEF1 promoter identical to the endogenous TEF1 promoter of the genetically modified fungus species.
- the invention relates to a method for inserting several copies of a gene of interest into the genome of a fungus, said method comprising a step of transforming said fungus using a vector comprising an expression cassette, said cassette comprising:
- TEF1 promoter identical to the endogenous TEF1 promoter of the fungus species
- the term “TEF1” refers to the translation elongation factor 1 (Translation Elongation Factor 1). It is a GTPase-like protein that is involved in protein biosynthesis.
- TEF1 protein encoded by the TEF1 gene, is represented by SEQ ID NO: 2.
- the expression of the TEF1 gene is essentially constitutive (Tiina Nakari, Edward Alatalo and Merja E. Penttila, Isolation of Trichoderma reesei genes highly expressed on glucose containing media: characterization of the TEF1 gene encoding translation elongation factor 1a, Gene, 136(1993)313-318, 1993 Elsevier Science Publishers B.V). More particularly, according to the invention, the term “TEF1” refers to “TEF1 alpha”.
- the TEF1 promoter means the promoter under the control of which the TEF1 gene is naturally dependent, in a non-genetically modified organism.
- the TEF1 gene which codes for the TEF1 protein of SEQ ID NO: 2 is under the control of the TEF1 promoter represented by the sequence SEQ ID NO: 1.
- the TEF1 promoter is represented by SEQ ID NO: 1 or a sequence having at least 60% identity with SEQ ID NO: 1, preferably at least 80%.
- the expression "at least 60% identity with SEQ ID NO: 1" means all the values between 60% and 100%, in particular the values of 60%, 61%, 62%, 63% , 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80 %, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% and 100%, preferably at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, even more particularly at least 98%, at least 99%.
- the percentage of identity of a given sequence with respect to SEQ ID NO: 1 means the percentage of identity over the total length of the sequences. The percentage thus corresponds to the number of identical nucleotides (residues if any) between this given sequence and SEQ ID NO: 1 divided by the number of nucleotides (residues if any) in the longer of the two sequences.
- the TEF1 promoter can also be understood as a sequence having less than 60% identity with SEQ ID NO: 1 while maintaining an identical function.
- the TEF1 promoter can also mean the promoter under whose control is a gene coding for an orthologous protein or variant of the TEF1 protein represented by SEQ ID NO: 2.
- the TEF1 promoter can also to mean the promoter of a gene coding for a protein of SEQ ID NO: 2 or a protein having at least 80% identity with SEQ ID NO: 2, preferably at least 85%, at least 90%, at least at least 95%, at least 98%, at least 99%.
- the expression "at least 80%” represents all values between 80% and 100%, i.e. 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89 %, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% and 100%.
- a promoter represented by a sequence having at least 60% identity with SEQ ID NO: 1 preferably represents a variant promoter or an orthologous promoter in a fungus different from Trichoderma reesei.
- the expression cassette is a TEF1 promoter identical to the endogenous TEF1 promoter of the mushroom species which is used.
- the term "endogenous fungus species TEF1 promoter” also refers to the "native TEF1 promoter" of the fungus species.
- the TEF1 promoter in Trichoderma reesei being represented by SEQ ID NO: 1, then it is a promoter of SEQ ID NO: 1 which must be used in the expression cassette intended to be integrated when the host fungus is Trichoderma reesei .
- the TEF1 promoter which must be used, in the expression cassette according to the invention must be identical to the TEF1 promoter naturally present in the species of fungus which is going to be transformed.
- the TEF1 promoter to be used in the expression cassette is the endogenous/native TEF1 promoter of Saccharomyces cerevisiae.
- TEF1 promoter identical to the endogenous TEF1 promoter means that the sequence of the TEF1 promoter used is strictly identical to that of the endogenous promoter, but also that the sequence of the TEF1 promoter used may vary at the level of certain nucleotides (not essential to the function of the promoter).
- the TEF1 promoter present in a fungus species can easily be determined, for example using databases such as FungiDB, by sequencing the fungus genome or any other appropriate technique.
- the method according to the invention can thus comprise, before the transformation step, a step optional determination of the sequence of the TEF1 promoter naturally present in the fungus intended to be transformed.
- the term “several copies” means at least two copies. According to a preferred embodiment, between 2 and 15 copies of the gene of interest are inserted into the genome of the transformed fungus, preferably between 2 and 11 copies. Between 2 and 15 copies of course means all values between 2 and 15, i.e. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 and 15.
- the transformation step means any technique allowing the integration of the expression cassette into the genome of the fungus.
- a technique is well known to those skilled in the art and includes, for example, biolistics (Te'o VS, Bergquist PL, Nevalainen KM., (2002). Biolistic transformation of Trichoderma reesei using the Bio-Rad seven barrels Hepta Adapter System. J Microbiol Methods. 51(3):393-9) or the protoplast method (Penttilà M, Nevalainen H, Ràttô M, Salminen E, Knowles J., (1987). A versatile transformation System for the cellulolytic filamentous fungus Trichoderma reesei Gene 61 (2):155-64).
- a “vector” means any DNA sequence into which it is possible to insert fragments of foreign nucleic acid, the vectors making it possible to introduce foreign DNA into a host cell (here the fungus).
- vectors are plasmids, cosmids, yeast artificial chromosomes (YAC), bacterial artificial chromosomes (BAC) and bacteriophage P1-derived artificial chromosomes (PAC), virus-derived vectors.
- the vector according to the invention is an integrative vector (preferably an integrative plasmid), allowing the integration of the expression cassette into the genome of the fungus.
- the vector does not comprise a fungal origin of replication.
- an “expression cassette” comprises a DNA fragment (the gene of interest) placed under the control of the elements necessary for its expression. Said DNA fragment is thus placed under the control of the TEF1 promoter.
- the expression cassette comprises at least (1) a TEF1 promoter identical to the endogenous TEF1 promoter of the mushroom species, (2) a gene of interest, and (3) a terminator, at the exception of the endogenous TEF1 terminator of the fungus species.
- the terminator used in the expression cassette according to the invention is a different terminator from the endogenous TEF1 terminator of the fungus species (that is to say the native TEF1 terminator of the fungus species).
- a TEF1 terminator from another fungus can therefore be used, provided that it is a TEF1 terminator different from the endogenous TEF1 terminator of the transformed fungus species (this is the case if the TEF1 terminator has a percentage identity less than or equal to 75% with respect to the sequence of the endogenous TEF1 terminator of the species of transformed fungus).
- the terminator is different from an endogenous TEF1 terminator of a fungus species different from the transformed fungus species.
- the terminator is a different terminator from a TEF1 terminator. In other words, it is not a so-called TEF1 terminator in a species.
- a CBH1 terminator can be used.
- the integrative vector according to the invention (preferably a plasmid) comprises an expression cassette as mentioned above and a selection marker.
- the integrative vector according to the invention comprises an expression cassette as mentioned above, a non-fungal (for example bacterial) origin of replication and a selection marker.
- selection marker means a gene whose expression confers on the cells which contain it a characteristic making it possible to select them.
- the selection marker is a marker compatible with the host. The use of a selection marker makes it possible to identify the fungi that have integrated a genetic modification compared to those that have not integrated it. This is for example a gene for resistance to antibiotics, in particular the gene for resistance to the antibiotic hygromycin hph.
- the multicopy insertion is thus carried out in such a way that the expression of the endogenous TEF1 gene of the transformed species of fungus is maintained.
- the endogenous TEF1 coding sequence and TEF1 promoter are functional and show wild-type expression.
- the insertion is carried out upstream of the endogenous TEF1 promoter in the genome of said fungus. Indeed, as indicated below, fungi naturally possess a copy of the TEF1 gene, under the control of the TEF1 promoter.
- the multicopy insertion is therefore carried out upstream of the endogenous TEF1 promoter of the transformed fungus species.
- the insertion is thus made 5′ of the endogenous TEF1 promoter.
- the insertion is thus carried out between 750 and 1250 base pairs, preferably approximately 1000 base pairs, relative to the translation initiation site of the gene coding for TEF1.
- the insertion is thus carried out between 750 and 1250 base pairs, preferably approximately 1000 base pairs, relative to the translation initiation site of the gene coding for the protein TEF1 of SEQ ID NO: 2 or a protein having at least 80% identity with SEQ ID NO: 2.
- the TEF1 promoter has the advantage of being a strong promoter, thus allowing a large number of transcripts from the same carbon source.
- the genes of interest dependent on the TEF1 promoter thus have a continuous, essentially constitutive expression, and little subject to repression systems.
- the sequence of the TEF1 promoter also corresponds to the only flanking region necessary to target the TEF1 locus.
- the expression cassette according to the invention thus comprises a single flanking region to target the target locus of the insertion (the region 5' of the TEF1 promoter).
- the endogenous TEF1 gene dependent on the endogenous TEF1 promoter are conserved in the transformed genome of said fungus.
- the fungus is a filamentous fungus.
- the filamentous fungus is chosen from the classes of orbiliomycetes, pezizomycetes, dothideomycetes, eurotiomycetes, lecanoromycetes, leotiomycetes, sordariomycetes and saccharomycetes, preferably sordariomycetes.
- the fungus according to the invention belongs to the genus Trichoderma, and more particularly to the species Trichoderma reesei.
- a "gene of interest” means any gene whose production is desired.
- the gene of interest encodes a protein of interest.
- the proteins of interest are all the proteins which can be produced by a fungus, naturally (such as enzymes) or else by genetic modification (for example after transformation using an appropriate vector) .
- the protein of interest can be endogenous or exogenous.
- the protein of interest may be a native protein (as found in nature), a chimeric protein, a synthesized protein or else a variant of a native protein, exhibiting in particular improved and/or modified biological properties.
- the sequence of the gene of interest can comprise appropriate additional elements such as, for example, a sequence coding for a secretion signal.
- the proteins of interest can be proteins useful for any type of industry (production of biofuel, food, cosmetics or pharmaceuticals, etc.)
- the gene of interest codes for an enzyme, in particular a cellulolytic enzyme such as a cellulase or a hemicellulase.
- the enzymes are cellulases.
- the term “cellulases” more particularly means enzymes chosen from endoglucanases, exoglucanases and glucosidases, and more particularly b-glucosidase.
- cellulase refers more particularly to an enzyme adapted to the hydrolysis of cellulose and allowing the microorganisms (such as Trichoderma reesei) which produce them to use cellulose as a source of carbon, by hydrolyzing this polymer into simple sugars. (glucose).
- the method according to the invention comprises a step of selecting the transformed strain, after the transformation step.
- the definitions and embodiments relating to the first aspect of the invention apply mutatis mutandis to the other aspects.
- all the definitions and preferences indicated in the first aspect of the invention above also apply to the second, third, fourth, fifth, sixth and seventh aspect of the invention described below.
- the invention also relates to the use of an expression cassette for inserting several copies of a gene of interest into the genome of a fungus, said expression cassette comprising:
- TEF1 promoter identical to the endogenous TEF1 promoter of the fungus species
- the invention also relates to a process for producing a biomass comprising the following steps:
- said process for producing a biomass comprises a step of selecting a mushroom transformed between the transformation step and the culture step.
- the culture medium may comprise one or more substrates necessary for the growth of the fungus.
- the invention also relates to a method for producing a protein of interest comprising the following steps:
- step (ii) a step of culturing the fungus transformed in step (i) under conditions allowing the production of the protein of interest.
- said method for producing a protein of interest comprises a step of selecting a fungus transformed between the transformation step and the culture step.
- the culture step means a culture in an appropriate medium.
- This is a medium suitable for the survival of the transformed fungus and/or for the growth of the fungus and/or for the production of the protein of interest, or even its secretion. It may be a suitable medium for cultivation of the fungus, supplemented as needed to become a suitable medium for the production and/or secretion of the protein of interest.
- said method for producing a protein of interest also comprises a growth phase of a fungus strain transformed according to the invention, then a phase of growth and production of proteins of interest.
- said growth phase is carried out in the presence of a growth substrate and said phase of growth and production of proteins of interest is carried out in the presence of an inducing substrate.
- the growth substrate and the inducing substrate are preferably carbonaceous substrates.
- the carbonaceous growth substrate is preferably chosen from lactose, glucose, xylose, the residues obtained after ethanolic fermentation of the monomeric sugars of the enzymatic hydrolysates of cellulosic biomass, and/or a crude extract of water-soluble pentoses from pretreatment of cellulosic biomass.
- the inducing carbonaceous substrate is thus preferably chosen from lactose, cellobiose, sophorose, the residues obtained after ethanolic fermentation of the monomeric sugars of the enzymatic hydrolysates of cellulosic biomass, and/or a crude extract of water-soluble pentoses originating from the pretreatment of cellulosic biomass.
- the method for producing a protein of interest may comprise a step of secreting said protein of interest.
- the secretion can be consecutive or concomitant with the production of the protein of interest.
- the present invention relates to a process for producing sugar from cellulosic or lignocellulosic substrates, comprising the following steps:
- step iii a step of enzymatic hydrolysis of the pretreated substrate obtained in step i), in the presence of the cellulolytic enzymes obtained in step ii), in order to obtain a hydrolyzate.
- the sugars are thus obtained at the end of the hydrolysis step.
- they are Cs-Ce sugars.
- said process for producing sugars may also comprise one or more separation steps. This thus makes it possible to separate, in particular by distillation, the various products of interest diluted in water.
- the present invention relates to a method for producing an alcohol from cellulosic or lignocellulosic substrates, comprising the following steps: - (i) a step of pretreating a cellulosic or lignocellulosic substrate in order to obtain a pretreated substrate,
- step iii a step of enzymatic hydrolysis of the pretreated substrate obtained in step i), in the presence of the cellulolytic enzymes obtained in step ii), in order to obtain a hydrolyzate
- the alcohol thus obtained is for example used as a biofuel.
- the alcohol thus obtained can also be used as a solvent or as an intermediate product in the chemical industry.
- biofuel means more particularly a second-generation biofuel, that is to say from non-food resources.
- biofuel can also be defined as being any product resulting from the transformation of biomass and which can be used for energy purposes.
- biogas products which can be incorporated (possibly after subsequent transformation) into a fuel or be a fuel in its own right, such as alcohols (the ethanol, butanol and/or isopropanol depending on the type of fermentation organism used), solvents (acetone), acids (butyric), lipids and their derivatives (short or long chain fatty acids, acid esters fatty), as well as hydrogen.
- Biofuel is thus an alcohol or a biogas.
- the alcohol is, for example, ethanol, butanol, isopropanol, 1,2-propane diol, 1,3-propane diol, 1,4-butane diol, and/or or 2,3-butane diol. More preferably, it is ethanol.
- said steps iii) and iv) are carried out simultaneously. This is typically the case in so-called “SSF” (Simultaneous Saccharification and Fermentation) production processes.
- SSF Simultaneous Saccharification and Fermentation
- the step of pretreating a cellulosic or lignocellulosic substrate is a step of suspending said cellulosic or lignocellulosic substrate in the aqueous phase.
- the hydrolyzate obtained in step iii) is a hydrolyzate containing Cs-Ce sugars, in particular glucose.
- the alcoholic fermentation step of the hydrolyzate obtained is a fermentation step, in the presence of a fermentative organism, of the glucose from the hydrolyzate so as to produce a fermentation broth.
- a fermentative organism is for example a yeast.
- the separation step is a separation of the biofuel and the fermentation broth, in particular by distillation.
- the cellulosic or lignocellulosic substrate to be hydrolyzed is suspended in the aqueous phase at a rate of 6 to 40% dry matter, preferably 20 to 30%.
- the pH is adjusted between 4 and 5.5, preferably between 4.8 and 5.2 and the temperature between 40°C and 60°C, preferably between 45°C and 50°C.
- the hydrolysis reaction is started by adding enzymes acting on the pretreated substrate.
- the amount of enzymes usually used is 10 to 30 mg of protein excreted per gram of pretreated substrate or less.
- the reaction generally lasts 15 to 48 hours.
- the reaction is monitored by assaying the sugars released, in particular glucose.
- the sugar solution is separated from the non-hydrolyzed solid fraction, essentially consisting of lignin, by filtration or centrifugation and then treated in a fermentation unit.
- the enzymes and the fermenting organism are added simultaneously and then incubated at a temperature between 30° C. and 35° C. C to produce a fermentation mash.
- the cellulose present in the pre-treated substrate is converted into glucose, and at the same time, in the same reactor, the fermenting organism (for example a yeast) converts the glucose into the final product according to a process of SSF (Simultaneous Saccharification and Fermentation) known to those skilled in the art.
- SSF Simultaneous Saccharification and Fermentation
- the smooth running of the operation may require the addition of a greater or lesser quantity of exogenous cellulolytic mixture.
- the invention also relates to a strain as obtained by the method of the invention.
- the invention also relates to a fungus strain comprising in its genome several copies of a gene of interest under the control of a TEF1 promoter identical to the endogenous TEF1 promoter of the genetically modified fungus species.
- FIG. 1 represents the construction of the plasmid used in Example 1.
- FIG. 2 represents the fluorescence intensity per unit size of germinating Trichoderma reesei spores.
- Figure 2 represents the results of 8 transformants: E1, E2, E3, E4, E5, E6, E8 and E9 and those of 3 untransformed strains: CL847-1, CL847-2 and CL847-3.
- FIG. 3 represents the TEF promoter (TEF1) upstream of the TEF1 gene in the genome of a fungus.
- Fig. 4 represents the TEF promoter (TEF1) upstream of the TEF1 gene in the genome of a fungus.
- FIG. 4 represents an illustration of the integration into the E1 transformant. 7 copies of the EGFP gene of interest have been integrated. The triple indication "(1) the TEF1 promoter, (2) the EGFP gene of interest and (3) the CBH1 terminator" illustrates that the cassette has been correctly integrated and that the EGFP gene is functional.
- FIG. 5 represents an illustration of the integration into the E3 transformant. 10 copies of the EGFP gene of interest were integrated. The triple indication “(1) the TEF1 promoter, (2) the EGFP gene of interest and (3) the CBFI1 terminator” illustrates that the cases where the cassette has been correctly integrated and that the EGFP gene is functional.
- Example 1 Construction of a vector containing an expression cassette according to the invention
- a selection marker comprising a fungal “cpc” and bacterial “IM7” promoter followed by the Flygromycin (hph) resistance gene and the fungal “TrpC” terminator
- an expression cassette comprising (1) a TEF1 promoter, (2) followed by the EGFP gene expressing a green fluorescent protein and (3) the CBFI1 terminator.
- This vector can be obtained by any conventional method, well known to those skilled in the art.
- the construction of this plasmid is shown in Figure 1.
- a person skilled in the art can moreover easily obtain a vector (of plasmid type) comprising an expression cassette according to the invention and a selection marker making it possible to select the transformed fungi.
- Example 2 Transformation of a fungus with the expression vector of Example 1
- Example 1 The plasmid of Example 1 was used to transform the strain of Trichoderma reesei called CL847 (Durand H, Clanet M, Tiraby G. Genetic improvement of Trichoderma reesei for large scale cellulase production. Enzyme Microb Technol 1988, 10: 341-346; Durand et al, 1984, Proc. Colloquium SFM "Genetics of industrial microorganisms". Paris. H. FIESLOT Ed, pp 39-50).
- the transformants were selected on their ability to grow on a medium containing flygromycin.
- the subcultures revealed different macroscopies on the dish between the transformants. Only those showing, after 3 subcultures, growth at the confluence of the perimeter of the 9 cm petri dishes, and displaying a dense, green and hydrophobic spore carpet were kept.
- FIG. 2 The intensity of the fluorescence per unit size of Trichoderma reesei spores in the process of germinating is presented in FIG. 2. These measurements were carried out using a cytometer. The genomic study of four of the eight transformants studied by cytometry made it possible to highlight the site of insertion, and the number of copies of the plasmid. In the four cases studied, all the insertions were made upstream of the TEF1 promoter. The native and constitutive promoter of the TEF1 gene is conserved.
- Figure 3 illustrates the TEF1 gene under the control of the native and constitutive promoter of the TEF1 gene in the genome of the fungus.
- Figure 4 represents an illustration of the integration in the transformant E1. 7 copies of the EGFP gene of interest have been integrated
- Figure 5 represents an illustration of the integration in the transformant E3. 10 copies of the EGFP gene of interest have been integrated.
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Abstract
L'invention concerne un procédé pour insérer plusieurs copies d'un gène d'intérêt dans le génome d'un champignon, ledit procédé comprenant une étape de transformation dudit champignon à l'aide d'un vecteur comprenant une cassette d'expression, ladite cassette comprenant : (1) un promoteur TEF1 identique au promoteur TEF1 endogène de l'espèce de champignon, (2) un gène d'intérêt, et (3) un terminateur, à l'exception du terminateur TEF1 endogène de l'espèce de champignon. L'invention concerne également les champignons obtenus par un tel procédé, et les différentes utilisations des souches ainsi modifiées.
Description
Description
Titre : Insertion multicopies d’un gène d’intérêt dans le génome d’un champignon
[0001] La présente invention concerne un procédé pour insérer plusieurs copies d’un gène d’intérêt dans le génome d’un champignon. La présente invention concerne aussi les souches de champignon ainsi obtenues, et les différentes utilisations d’une telle souche de champignon modifiée.
Contexte de l’invention
[0002] Les souches de champignon sont utilisées pour la production de protéines d’intérêt. Par exemple, les souches de champignon appartenant au genre Trichoderma, notamment Trichoderma reesei, sont aujourd’hui majoritairement utilisées pour la production d’enzymes. Ces enzymes, par exemple les cellulases, sont en effet utilisées pour hydrolyser la biomasse cellulosique ou lignocellulosique en sucres simples. Les enzymes produites par les champignons filamenteux sont donc utiles dans les filières de production de biocarburants de seconde génération ou encore des produits biosourcés issus de sucres provenant de biomasse (ligno)cellulosique.
[0003] Afin d’améliorer la production de biocarburants de seconde génération ou encore des produits biosourcés, il a ainsi été envisagé d’améliorer la production de cellulases.
[0004] Par exemple, le brevet EP 448 430 B1 décrit une production industrielle optimisée de cellulases par Trichoderma reesei. Cette production est réalisée en protocole fed-batch (alimentation sans soutirage) en utilisant une solution d'alimentation contenant du lactose comme sucre inducteur de la production de protéines. Ce procédé de fermentation comprend deux étapes : une première étape de croissance du champignon en présence d’un excès de source carbonée et une deuxième étape de production d’enzymes grâce à l’ajout d’un inducteur dans le milieu avec un débit optimisé (mode fed-batch). Ces étapes sont réalisées en milieu liquide dans des bioréacteurs sous une agitation et en présence d’oxygène car le champignon est aérobie stricte. Un autre exemple de procédé optimisé de production de cellulases est décrit dans le brevet EP 2 744899 B1 .
[0005] En plus de l’optimisation des procédés de production de cellulases, il a également été envisagé de modifier génétiquement les souches de champignons afin de modifier leur capacité de production. Ainsi le demande internationale PCT/FR2016/053601 décrit la surexpression du gène TrAZFI dans une souche afin d’améliorer sa capacité de production d’une protéine d’intérêt, en particulier une enzyme cellulolytique.
[0006] Des procédés de fermentation et souches utiles pour améliorer la production d’enzymes cellulolytiques par des champignons filamenteux, et ce faisant de produits biosourcés mais également des biocarburants de seconde génération, sont donc déjà décrits dans l’art antérieur.
[0007] Les champignons peuvent également être utilisés pour produire des protéines utiles dans d’autres types d’industries, tels que l’industrie alimentaire, cosmétique ou pharmaceutique (voir par
exemple Rantasalo, A., Vitikainen, M., Paasikallio, T. et al. Novel genetic tools that enable highly pure protein production in Trichoderma reesei. Soi Rep 9, 5032 (2019) ou encore le brevet EP3405580).
[0008] Le promoteur TEF1 est connu comme un promoteur fort chez les champignons (Gao S, Zhou H, Zhou J, Chen J. Promoter-Library-Based Pathway Optimization for Efficient (2S)- Naringenin Production from p-Coumaric Acid in Saccharomyces cerevisiae. J Agric Food Chem. 2020 Jun 24;68(25):6884-6891. doi: 10.1021 /acs.jafc.OcOI 130. Epub 2020 Jun 11).
[0009] L’utilisation de ce promoteur TEF1 a également été décrite ou suggéré pour favoriser l’expression de gènes d’intérêt (voir par exemple US20080044878, US9732338, US6011147, W02018067068, US8071298, ou encore Kitamoto, N., Matsui, J., Kawai, Y. et al. Utilization of the TEF1-a gene (TEF1) promoter for expression of polygalacturonase genes, pgaA and pgaB, in Aspergillus oryzae . Appl Microbiol Biotechnol 50, 85-92 (1998) ; Zhang J, Cai Y, Du G, Chen J, Wang M, Kang Z. Evaluation and application of constitutive promoters for cutinase production by Saccharomyces cerevisiae. J Microbiol. 2017 Jul;55(7):538-544. Epub 2017 Jun 30 ; Umemura M, Kuriiwa K, Dao LV, Okuda T, Terai G. Promoter tools for further development of Aspergillus oryzae as a platform for fungal secondary métabolite production. Fungal Biol Biotechnol. 2020 Mar 23;7:3 ; Fang F, Salmon K, Shen MW, Aeling KA, Ito E, Irwin B, Tran UP, Hatfield GW, Da Silva NA, Sandmeyer S. A vector set for systematic metabolic engineering in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 2011 Feb;28(2):123-36. Epub 2010 Oct 8 ; Tiina Nakari, Edward Alatalo and Merja E. Penttila, Isolation of Trichoderma reesei genes highly expressed on glucose containing media: characterization of the TEF1 gene encoding translation élongation factor 1 a, Gene, 136(1993)313- 318, 1993 Elsevier Science Publishers B.V; Partow S, Siewers V, Bjorn S, Nielsen J, Maury J. Characterization of different promoters for designing a new expression vector in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 2010 Nov;27(11):955-64).
[0010] Egalement, l’intégration multicopie de vecteurs d’expression dans le génome d’un champignon a déjà été décrite, voir par exemple EP0778348 ou W01991002803.
[0011] Des techniques de génie génétique, impliquant notamment le promoteur TEF1 et l’expression de gènes d’intérêt, ont donc déjà été décrites dans l’art antérieur.
[0012] Par ailleurs, pour cibler une insertion à un locus bien défini, il faut habituellement, que le transgène soit encadré de séquences en amont en aval du locus cible. La taille (nombre de paires de base) de ces régions flanquantes dépend des organismes. Pour ceux ayant une capacité à réaliser une recombinaison homologue, ces séquences flanquantes peuvent-être courtes, par exemple dans le cas de Saccharomyces cerevisiae, une vingtaine de paires de bases suffisent pour cibler un locus (Janke C, Magiera MM, Rathfelder N, Taxis C, Reber S, Maekawa H, Moreno- Borchart A, Doenges G, Schwob E, Schiebel E, Knop M. A versatile toolbox for PCR-based tagging of yeast genes: new fluorescent proteins, more markers and promoter substitution cassettes. Yeast. 2004 Aug;21(11):947-62). A contrario, chez d’autres champignons tels que Trichoderma reesei ces
séquences flanquantes doivent faire 1000 paires de base et même dans ces conditions, la probabilité que l’insertion se fasse au site voulu est faible.
[0013] Les techniques d’édition génétique permettent de réduire la taille des régions flanquantes à 200 paires de bases et augmenter la probabilité d’insertion au site.
[0014] Néanmoins, il existe toujours un besoin pour de nouveaux procédés permettant l’expression améliorée de gènes d’intérêt et/ou des procédés de production de protéines d’intérêt, qui soient le plus efficaces possibles, notamment chez Trichoderma reesei.
[0015] La présente invention repose ici sur les résultats des Inventeurs montrant que le promoteur TEF1 peut être utilisé pour l’insertion multicopie d’un gène d’intérêt. Chaque copie fonctionnelle insérée entraîne une augmentation de l’expression dudit gène d’intérêt, augmentant ainsi la capacité de production de la protéine d’intérêt. Les résultats de la présente invention montrent également qu’il est possible de réaliser avec succès, notamment chez Trichoderma reesei, l’insertion au locus cible (la région en 5’ du promoteur TEF1) en utilisant une seule région flanquante du site d’insertion dans la cassette d’expression selon l’invention (au lieu des deux habituelles).
Bref exposé de l’invention
[0016] La présente invention concerne ainsi un procédé pour insérer plusieurs copies d’un gène d’intérêt dans le génome d’un champignon, ledit procédé comprenant une étape de transformation dudit champignon à l’aide d’un vecteur comprenant une cassette d’expression, ladite cassette comprenant :
- un promoteur TEF1 identique au promoteur TEF1 endogène de l’espèce de champignon,
- un gène d’intérêt,
- un terminateur, à l’exception du terminateur TEF1 endogène de l’espèce de champignon.
[0017] L’invention concerne également l’utilisation d’une cassette d’expression pour insérer plusieurs copies d’un gène d’intérêt dans le génome d’un champignon, ladite cassette d’expression comprenant :
- un promoteur TEF1 identique au promoteur TEF1 endogène de l’espèce de champignon,
- un gène d’intérêt,
- un terminateur, à l’exception du terminateur TEF1 endogène de l’espèce de champignon.
[0018] L’invention concerne également un procédé de production d’une protéine d’intérêt comprenant les étapes suivantes :
- (i) une étape de transformation d’un champignon à l’aide d’un vecteur comprenant une cassette d’expression comprenant (1) un promoteur TEF1 identique au promoteur TEF1 endogène de l’espèce de champignon, (2) un gène d’intérêt codant pour ladite protéine d’intérêt et (3) un terminateur, à l’exception du terminateur TEF1 endogène de l’espèce de champignon,
- (ii) une étape de culture du champignon transformé à l’étape (i) dans des conditions permettant la production de la protéine d’intérêt.
[0019] L’invention concerne également une souche de champignon comprenant dans son génome plusieurs copies d’un gène d’intérêt sous la dépendance d’un promoteur TEF1 identique au promoteur TEF1 endogène de l’espèce de champignon génétiquement modifiée.
Exposé de l’invention
[0020] Dans un premier aspect, l’invention concerne un procédé pour insérer plusieurs copies d’un gène d’intérêt dans le génome d’un champignon, ledit procédé comprenant une étape de transformation dudit champignon à l’aide d’un vecteur comprenant une cassette d’expression, ladite cassette comprenant :
- un promoteur TEF1 identique au promoteur TEF1 endogène de l’espèce de champignon,
- un gène d’intérêt,
- un terminateur, à l’exception du terminateur TEF1 endogène de l’espèce de champignon.
[0021] Selon l’invention, le terme « TEF1 » fait référence au facteur d’élongation de la traduction 1 (Translation Elongation Factor 1). Il s’agit d’une protéine de type GTPase qui intervient dans la biosynthèse des protéines. Chez Trichoderma reesei, la protéine TEF1 , codée par le gène TEF1, est représentée par SEQ ID NO : 2. L’expression du gène TEF1 est essentiellement constitutive (Tiina Nakari, Edward Alatalo and Merja E. Penttila, Isolation of Trichoderma reesei genes highly expressed on glucose containing media: characterization of the TEF1 gene encoding translation élongation factor 1 a, Gene, 136(1993)313-318, 1993 Elsevier Science Publishers B.V). Plus particulièrement, selon l’invention, le terme « TEF1 » fait référence au « TEF1 alpha ».
[0022] Selon l’invention, le promoteur TEF1 s’entend du promoteur sous la dépendance de laquelle le gène TEF1 est naturellement dépendant, dans un organisme non génétiquement modifié. Typiquement, chez Trichoderma reesei, le gène TEF1 qui code pour la protéine TEF1 de SEQ ID NO : 2 est sous la dépendance du promoteur TEF1 représenté par la séquence SEQ ID NO : 1. Selon un mode de réalisation, dans le procédé selon l’invention, le promoteur TEF1 est représenté par SEQ ID NO : 1 ou une séquence ayant au moins 60% d’identité avec SEQ ID NO : 1 , préférentiellement au moins 80%. Selon l’invention, l’expression « au moins 60% d’identité avec SEQ ID NO : 1 » signifie toutes les valeurs comprises entre 60% et 100%, notamment les valeurs de 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% et 100%, préférentiellement au moins 80%, au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, encore plus particulièrement au moins 98%, au moins 99%. L’homme du métier sait calculer un pourcentage d’identité entre deux séquences. Par exemple, selon l’invention, le pourcentage d'identité d'une séquence donnée par rapport à SEQ ID NO : 1 s’entend du pourcentage d’identité sur la longueur totale des séquences. Le pourcentage correspond ainsi au nombre de nucléotides (résidus le cas échéant) identiques entre cette séquence donnée et SEQ ID NO : 1 divisé par le nombre de nucléotides (résidus le cas échéant) dans la plus longue des deux séquences. Selon un mode de réalisation, dans le procédé selon l’invention, le promoteur TEF1 peut également s’entendre d’une séquence ayant moins de 60%
d’identité avec SEQ ID NO : 1 tout en conservant une fonction identique. Cela s’entend notamment des promoteurs orthologues du promoteur TEF1 chez des champignons différents de Trichoderma, notamment Trichoderma reesei, qui ont des séquences très éloignées de SEQ ID NO : 1 , bien qu’assurant la même fonction que le promoteur TEF1 chez Trichoderma reesei (à savoir le promoteur TEF1 du gène TEF1 codant pour un facteur d’élongation de la traduction 1 , plus particulièrement le facteur d’élongation de la traduction 1 alpha). Cela peut également être le cas si le promoteur est muté (sur des nucléotides non essentiels à sa fonction de promoteur). Selon un mode de réalisation, le promoteur TEF1 peut également s’entendre du promoteur sous la dépendance de laquelle est un gène codant pour une protéine orthologue ou variante de la protéine TEF1 représentée par SEQ ID NO : 2. Ainsi, le promoteur TEF1 peut également s’entendre du promoteur d’un gène codant pour une protéine de SEQ ID NO : 2 ou une protéine ayant au moins 80% d’identité avec SEQ ID NO : 2, de préférence au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 98%, au moins 99%. L’expression « au moins 80% » représente toutes les valeurs comprises entre 80% et 100%, soit 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% et 100%.
[0023] Selon l’invention, un promoteur représenté par une séquence ayant au moins 60% d’identité avec SEQ ID NO : 1 , représente de préférence un promoteur variant ou un promoteur orthologue chez un champignon différent de Trichoderma reesei.
[0024] Dans la cassette d’expression selon l’invention, c’est un promoteur TEF1 identique au promoteur TEF1 endogène de l’espèce de champignon qui est utilisé. Le terme « promoteur TEF1 endogène de l’espèce de champignon » fait également référence au « promoteur TEF1 natif » de l’espèce de champignon. Typiquement, le promoteur TEF1 chez Trichoderma reesei étant représenté par SEQ ID NO : 1 , alors c’est un promoteur de SEQ ID NO : 1 qui doit être utilisé dans la cassette d’expression destinée à être intégrée lorsque le champignon hôte est Trichoderma reesei. En d’autres termes, le promoteur TEF1 qui doit être utilisé, dans la cassette d’expression selon l’invention, doit être identique au promoteur TEF1 naturellement présent dans l’espèce de champignon qui va être transformée. A titre d’exemple, si le champignon hôte utilisé est Saccharomyces cerevisiae, alors le promoteur TEF1 à utiliser dans la cassette d’expression est le promoteur TEF1 endogène/natif de Saccharomyces cerevisiae. Le terme « promoteur TEF1 identique au promoteur TEF1 endogène » signifie que la séquence du promoteur TEF1 utilisé est strictement identique à celle du promoteur endogène, mais également que la séquence du promoteur TEF1 utilisé peut varier au niveau de certains nucléotides (non essentiels à la fonction du promoteur).
[0025] Le promoteur TEF1 présent dans une espèce de champignon peut aisément être déterminé, par exemple à l’aise des bases de données telles que FungiDB, par séquençage du génome du champignon ou toute autre technique appropriée. Selon un mode de réalisation, le procédé selon l’invention peut ainsi comprendre avant l’étape de transformation une étape
optionnelle de détermination de la séquence du promoteur TEF1 naturellement présent dans le champignon destiné à être transformé.
[0026] Selon l’invention, le terme « plusieurs copies » s’entend d’au moins deux copies. Selon un mode de réalisation préféré, entre 2 et 15 copies du gène d’intérêt sont insérées dans le génome du champignon transformé, de préférence entre 2 et 11 copies. Entre 2 et 15 copies s’entend bien entendu de toutes les valeurs comprises entre 2 et 15, soit 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 et 15.
[0027] L’étape de transformation s’entend de toute technique permettant l’intégration de la cassette d’expression dans le génome du champignon. Une telle technique est bien connue de l’homme du métier et s’entend par exemple de la biolistique (Te'o VS, Bergquist PL, Nevalainen KM. ,(2002). Biolistic transformation of Trichoderma reesei using the Bio-Rad seven barrels Hepta Adaptor System. J Microbiol Methods. 51(3):393-9) ou la méthode des protoplastes (Penttilà M, Nevalainen H, Ràttô M, Salminen E, Knowles J., (1987). A versatile transformation System for the cellulolytic filamentous fungus Trichoderma reesei. Gene. 61 (2):155-64).
[0028] Selon l’invention, un « vecteur » s’entend de toute séquence d’ADN dans laquelle il est possible d’insérer des fragments d’acide nucléique étranger, les vecteurs permettant d’introduire de l’ADN étranger dans une cellule hôte (ici le champignon). Des exemples de vecteurs sont les plasmides, les cosmides, les chromosomes artificiels de levures (YAC), les chromosomes artificiels de bactéries (BAC) et les chromosomes artificiels dérivés du bactériophage P1 (PAC), les vecteurs dérivés de virus. Le vecteur selon l’invention est un vecteur intégratif (de préférence un plasmide intégratif), permettant l’intégration de la cassette d’expression dans le génome du champignon. Selon un mode de réalisation particulier, le vecteur ne comprend pas d’origine de réplication fongique.
[0029] Selon l’invention, une « cassette d’expression » comprend un fragment d’ADN (le gène d’intérêt) placé sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression. Ledit fragment d’ADN est ainsi placé sous le contrôle du promoteur TEF1. Selon l’invention, la cassette d’expression comprend au moins (1) un promoteur TEF1 identique au promoteur TEF1 endogène de l’espèce de champignon, (2) un gène d’intérêt, et (3) un terminateur, à l’exception du terminateur TEF1 endogène de l’espèce de champignon.
[0030] Selon l’invention, le terminateur utilisé dans la cassette d’expression selon l’invention est un terminateur différent du terminateur TEF1 endogène de l’espèce de champignon (c’est-à-dire le terminateur TEF1 natif de l’espèce de champignon). Selon l’invention, un terminateur TEF1 d’un autre champignon peut donc être utilisé, à la condition que ce soit un terminateur TEF1 différent du terminateur TEF1 endogène de l’espèce de champignon transformée (c’est le cas si le terminateur TEF1 a un pourcentage d’identité inférieur ou égal à 75% par rapport à la séquence du terminateur TEF1 endogène de l’espèce de champignon transformé). Selon un autre mode de réalisation particulier, le terminateur est différent d’un terminateur TEF1 endogène d’une espèce de champignon différente de l’espèce de champignon transformée. Selon un mode de réalisation
particulier, le terminateur est un terminateur différent d’un terminateur TEF1. En d’autres termes il ne s’agit pas d’un terminateur dit terminateur TEF1 chez une espèce. Par exemple un terminateur CBH1 peut être utilisé.
[0031] Selon un mode de réalisation particulier, le vecteur intégratif selon l’invention (de préférence un plasmide) comprend une cassette d’expression telle que susmentionnée et un marqueur de sélection. Selon un mode de réalisation particulier, le vecteur intégratif selon l’invention comprend une cassette d’expression telle que susmentionnée, une origine de réplication non fongique (par exemple bactérienne) et un marqueur de sélection. L’expression « marqueur de sélection » s’entend d’un gène dont l’expression confère aux cellules qui le contiennent une caractéristique permettant de les sélectionner. Le marqueur de sélection est un marqueur compatible avec l’hôte. L’utilisation d’un marqueur de sélection permet en effet d’identifier les champignons ayant intégré une modification génétique par rapport à celles qui ne l’ont pas intégrée. Il s’agit par exemple d’un gène de résistance aux antibiotiques, notamment le gène de résistance à l’antibiotique hygromycine hph.
[0032] Les champignons possèdent naturellement une copie du gène TEF1, sous la dépendance du promoteur TEF1. Selon l’invention, l’insertion multicopie est ainsi réalisée de façon à ce que l’expression du gène TEF1 endogène de l’espèce de champignon transformée soit maintenue. En d’autres termes, la séquence codante TEF1 et le promoteur TEF1 endogènes sont fonctionnels et présentent une expression de type sauvage. Selon un mode de réalisation, dans le procédé pour insérer plusieurs copies d’un gène d’intérêt dans le génome d’un champignon, l’insertion est réalisée en amont du promoteur TEF1 endogène dans le génome dudit champignon. En effet, comme indiqué ci-dessous, les champignons possèdent naturellement une copie du gène TEF1, sous la dépendance du promoteur TEF1. Selon ce mode de réalisation, l’insertion multicopie est donc réalisée en amont du promoteur TEF1 endogène de l’espèce de champignon transformée. L’insertion est ainsi réalisée en 5’ du promoteur TEF1 endogène. De préférence, dans le procédé selon l’invention, l’insertion est ainsi réalisée entre 750 et 1250 paires de bases, de préférence environ 1000 paires de bases, par rapport au site d’initiation de la traduction du gène codant pour TEF1. De préférence, dans le procédé selon l’invention, l’insertion est ainsi réalisée entre 750 et 1250 paires de bases, de préférence environ 1000 paires de bases, par rapport au site d’initiation de la traduction du gène codant pour la protéine TEF1 de SEQ ID NO : 2 ou une protéine ayant au moins 80% d’identité avec SEQ ID NO : 2.
[0033] Le choix du promoteur TEF1 et de la localisation de l’insertion multicopie de la cassette telle que définie selon l’invention, présentent plusieurs avantages. (1) Le promoteur TEF1 présente l’avantage d’être un promoteur fort, permettant ainsi un nombre de transcrits important à partir d’une même source de carbone. (2) Tout comme le gène TEF1, les gènes d’intérêts sous la dépendance du promoteur TEF1 ont ainsi une expression continue, essentiellement constitutive, et peu soumise à des systèmes de répression. (3) La séquence du promoteur TEF1 correspond également à la seule région flanquante nécessaire pour cibler le locus TEF1. Selon un mode de
réalisation selon l’invention, la cassette d’expression selon l’invention comprend ainsi une seule région flanquante pour cibler le locus cible de l’insertion (la région en 5’ du promoteur TEF1).
[0034] Selon un mode de réalisation de l’invention, le gène TEF1 endogène sous la dépendance du promoteur TEF1 endogène sont conservés dans le génome transformé dudit champignon.
[0035] Parmi les champignons utilisables selon l’invention, on peut citer certains champignons du phylum des Ascomycètes (Ascomycota), des Basidiomycètes ( Basidiomycota ) et des Zygomycètes (Zygomycota). Dans un aspect préféré, selon l’invention, le champignon est un champignon filamenteux. Selon un mode de réalisation, le champignon filamenteux est choisi parmi les classes des orbiliomycètes, des pézizomycètes, des dothideomycètes, des eurotiomycètes, des lecanoromycètes, des léotiomycètes, des sordariomycètes et des saccharomycètes, de préférence les sordariomycètes. De façon avantageuse, le champignon selon l’invention appartient au genre Trichoderma, et plus particulièrement à l’espèce Trichoderma reesei.
[0036] Selon l’invention, un « gène d’intérêt » s’entend de tout gène dont la production est souhaitée. De préférence, le gène d’intérêt code pour une protéine d’intérêt. Selon l’invention, les protéines d’intérêt sont toutes les protéines pouvant être produites par un champignon, de façon naturelle (telles que les enzymes) ou bien par modification génétique (par exemple après transformation à l’aide d’un vecteur approprié). La protéine d’intérêt peut être endogène ou exogène. La protéine d’intérêt peut être une protéine native (telle que retrouvée dans la nature), une protéine chimérique, une protéine synthétisée ou bien un variant d’une protéine native, présentant notamment des propriétés biologiques améliorées et/ou modifiées. Selon un mode de réalisation, la séquence du gène d’intérêt peut comprendre des éléments additionnels appropriés comme, par exemple, une séquence codant pour un signal de sécrétion. Les protéines d’intérêt peuvent être des protéines utiles à tout type d’industrie (la production de biocarburant, alimentaire, cosmétique ou pharmaceutique, ...)
[0037] Selon un mode de réalisation, dans le procédé selon l’invention, le gène d’intérêt code pour une enzyme, notamment une enzyme cellulolytique telle qu’une cellulase ou une hémicellulase. De façon préférée, les enzymes sont des cellulases. Selon l’invention, le terme « cellulases » s’entend plus particulièrement des enzymes choisies parmi les endoglucanases, les exoglucanases et les glucosidases, et plus particulièrement la b-glucosidase. Le terme « cellulase » fait plus particulièrement référence à une enzyme adaptée à l'hydrolyse de la cellulose et permettant aux microorganismes (tels que Trichoderma reesei) qui les produisent d'utiliser la cellulose comme source de carbone, en hydrolysant ce polymère en sucres simples (glucose).
[0038] Selon un mode de réalisation, le procédé selon l’invention comprend une étape de sélection de la souche transformée, après l’étape de transformation.
[0039] Les définitions et modes de réalisation relatif au premier aspect de l’invention s’appliquent mutatis mutandis aux autres aspects. Par exemple, toutes les définitions et préférences indiquées dans le premier aspect de l’invention ci-dessus s’appliquent également au deuxième, troisième, quatrième, cinquième, sixième et septième aspect de l’invention décrits ci- après.
[0040] Dans un second aspect, l’invention concerne également l’utilisation d’une cassette d’expression pour insérer plusieurs copies d’un gène d’intérêt dans le génome d’un champignon, ladite cassette d’expression comprenant :
- un promoteur TEF1 identique au promoteur TEF1 endogène de l’espèce de champignon,
- un gène d’intérêt,
- un terminateur, à l’exception du terminateur TEF1 endogène de l’espèce de champignon.
[0041] Dans un troisième aspect, l’invention concerne aussi un procédé de production d’une biomasse comprenant les étapes suivantes :
- (i) une étape de transformation d’un champignon à l’aide d’un vecteur comprenant une cassette d’expression comprenant (1) un promoteur TEF1 identique au promoteur TEF1 endogène de l’espèce de champignon, (2) un gène d’intérêt et (3) un terminateur, à l’exception du terminateur TEF1 endogène de l’espèce de champignon,
- (ii) une étape de culture du champignon, dans un milieu de culture approprié.
[0042] Selon un mode de réalisation particulier, ledit procédé de production d’une biomasse comprend une étape de sélection d’un champignon transformé entre l’étape de transformation et l’étape de culture.
[0043] Selon un mode de réalisation, le milieu de culture peut comprendre un ou plusieurs substrats nécessaires à la croissance du champignon.
[0044] Dans un quatrième aspect, l’invention concerne aussi un procédé de production d’une protéine d’intérêt comprenant les étapes suivantes :
- (i) une étape de transformation d’un champignon à l’aide d’un vecteur comprenant une cassette d’expression comprenant (1) un promoteur TEF1 identique au promoteur TEF1 endogène de l’espèce de champignon, (2) un gène d’intérêt codant pour ladite protéine d’intérêt et (3) un terminateur, à l’exception du terminateur TEF1 endogène de l’espèce de champignon,
- (ii) une étape de culture du champignon transformé à l’étape (i) dans des conditions permettant la production de la protéine d’intérêt.
[0045] Selon un mode de réalisation particulier, ledit procédé de production d’une protéine d’intérêt comprend une étape de sélection d’un champignon transformé entre l’étape de transformation et l’étape de culture.
[0046] L’étape de culture s’entend d’une culture dans un milieu approprié. Il s’agit d’un milieu adapté à la survie du champignon transformé et/ou à la croissance du champignon et/ou à la production de la protéine d’intérêt, voire sa sécrétion. Il peut s’agit d’un milieu adapté à la culture
du champignon, complété au besoin pour devenir un milieu adapté à la production et/ou sécrétion de la protéine d’intérêt.
[0047] De façon avantageuse, plus particulièrement lorsque le gène d’intérêt code pour une enzyme cellulolytique, ledit procédé de production d’une protéine d’intérêt comprend aussi une phase de croissance d’une souche de champignon transformée selon l’invention, puis une phase de croissance et de production de protéines d’intérêt. Encore plus préférentiellement, ladite phase de croissance est réalisée en présence d’un substrat de croissance et ladite phase de croissance et de production de protéines d’intérêt est réalisée en présence d’un substrat inducteur. Le substrat de croissance et le substrat inducteur sont de préférence des substrats carbonés.
[0048] Ainsi, le substrat carboné de croissance est choisi de préférence parmi le lactose, le glucose, le xylose, les résidus obtenus après fermentation éthanolique des sucres monomères des hydrolysats enzymatiques de biomasse cellulosique, et/ou un extrait brut de pentoses hydrosolubles provenant du prétraitement d’une biomasse cellulosique.
[0049] Le substrat carboné inducteur est ainsi choisi de préférence parmi le lactose, le cellobiose, le sophorose, les résidus obtenus après fermentation éthanolique des sucres monomères des hydrolysats enzymatiques de biomasse cellulosique, et/ou un extrait brut de pentoses hydrosolubles provenant du prétraitement d’une biomasse cellulosique.
[0050] Selon un mode de réalisation, le procédé de production d’une protéine d’intérêt peut comprendre une étape de sécrétion de ladite protéine d’intérêt. La sécrétion peut être consécutive ou concomittante à la production de la protéine d’intérêt.
[0051] Dans un cinquième aspect, la présente invention concerne un procédé de production de sucre à partir de substrats cellulosiques ou lignocellulosiques, comprenant les étapes suivantes :
- (i) une étape de prétraitement d'un substrat cellulosique ou lignocellulosique afin d’obtenir un substrat prétraité,
- (ii) une étape d’utilisation d’un champignon transformé à l’aide d’un vecteur comprenant une cassette d’expression comprenant (1) un promoteur TEF1 identique au promoteur TEF1 endogène de l’espèce de champignon, (2) un gène d’intérêt codant pour une enzyme cellulolytique et (3) un terminateur, à l’exception du terminateur TEF1 endogène de l’espèce de champignon,
- (iii) une étape d'hydrolyse enzymatique du substrat prétraité obtenu à l’étape i), en présence des enzymes cellulolytiques obtenues à l’étape ii), afin d’obtenir un hydrolysat.
[0052] Les sucres (ou jus sucré) sont ainsi obtenus à l’issue de l’étape d’hydrolyse. De préférence ce sont des sucres en Cs-Ce.
[0053] Selon un mode de réalisation, ledit procédé de production de sucres peut également comprendre un ou plusieurs étapes de séparation. Ceci permet ainsi de séparer, notamment par distillation, les différents produits d’intérêt dilués dans l’eau.
[0054] Dans un sixième aspect, la présente invention concerne un procédé de production d'un alcool à partir de substrats cellulosiques ou lignocellulosiques, comprenant les étapes suivantes :
- (i) une étape de prétraitement d'un substrat cellulosique ou lignocellulosique afin d’obtenir un substrat prétraité,
- (ii) une étape d’utilisation d’un champignon transformé à l’aide d’un vecteur comprenant une cassette d’expression comprenant (1) un promoteur TEF1 identique au promoteur TEF1 endogène de l’espèce de champignon, (2) un gène d’intérêt codant pour une enzyme cellulolytique et (3) un terminateur, à l’exception du terminateur TEF1 endogène de l’espèce de champignon,
- (iii) une étape d'hydrolyse enzymatique du substrat prétraité obtenu à l’étape i), en présence des enzymes cellulolytiques obtenues à l’étape ii), afin d’obtenir un hydrolysat,
- (iv) une étape de fermentation alcoolique de l'hydrolysat obtenu,
- (v) une étape de séparation, notamment par distillation.
[0055] L’alcool ainsi obtenu est par exemple utilisé comme un biocarburant. L’alcool ainsi obtenu peut aussi être utilisé comme solvant ou comme produit intermédiaire dans l’industrie chimique.
[0056] Selon l’invention, le terme « biocarburant » s’entend plus particulièrement d’un biocarburant de seconde génération, c’est-à-dire issu de ressources non alimentaires. Selon l’invention, le terme « biocarburant » peut également être défini comme étant tout produit issu de la transformation de la biomasse et pouvant être utilisé à des fins énergétiques. D’une part et sans vouloir se limiter, on peut citer à titre d’exemple des biogaz, des produits pouvant être incorporés (éventuellement après transformation ultérieure) à un carburant ou être un carburant à part entière, tels que des alcools (l’éthanol, le butanol et/ou l’isopropanol selon le type d’organisme fermentaire utilisé), des solvants (acétone), des acides (butyrique), des lipides et leurs dérivés (acides gras à courtes ou longues chaînes, esters d’acides gras), ainsi que l’hydrogène. Le biocarburant est ainsi un alcool ou un biogaz..
[0057] De manière préférée, l’alcool est par exemple l’éthanol, le butanol, l’isopropanol, le 1 ,2- propane diol, le 1 ,3-propane diol, le 1 ,4-butane diol, et/ou le 2,3-butane diol. Plus préférentiellement, il s’agit de l’éthanol.
[0058] Selon un mode de réalisation préférée, lesdites étapes iii) et iv) sont réalisées simultanément. Cela est typiquement le cas dans les procédés de production dits « SSF » (Simultaneous Saccharification and Fermentation).
[0059] Selon un mode de réalisation particulier, l’étape de prétraitement d'un substrat cellulosique ou lignocellulosique est une étape de mise en suspension en phase aqueuse dudit substrat cellulosique ou lignocellulosique.
[0060] Selon un mode de réalisation particulier, l’hydrolysat obtenu à l’étape iii) est un hydrolysat contenant des sucres en Cs-Ce, notamment du glucose.
[0061] Selon un mode de réalisation particulier, l’étape de fermentation alcoolique de l'hydrolysat obtenu est une étape de fermentation, en présence d'un organisme fermentaire, du
glucose issu de l'hydrolysat de manière à produire un moût de fermentation. Un organisme fermentaire est par exemple une levure.
[0062] Selon un mode de réalisation particulier, l’étape de séparation est une séparation du biocarburant et du moût de fermentation, notamment par distillation.
[0063] Selon un mode de réalisation encore plus préféré, le substrat cellulosique ou lignocellulosique à hydrolyser est mis en suspension en phase aqueuse à raison de 6 à 40% de matière sèche, de préférence 20 à 30%. Le pH est ajusté entre 4 et 5,5, de préférence entre 4,8 et 5,2 et la température entre 40°C et 60°C, de préférence entre 45°C et 50°C. La réaction d'hydrolyse est démarrée par l'ajout des enzymes agissant sur le substrat prétraité. La quantité d’enzymes habituellement utilisée est de 10 à 30 mg de protéines excrétées par gramme de substrat prétraité ou moins. La réaction dure généralement de 15 à 48 heures. La réaction est suivie par dosage des sucres libérés, notamment le glucose. La solution de sucres est séparée de la fraction solide non hydrolysée, essentiellement constituée de lignine, par filtration ou centrifugation et ensuite traitée dans une unité de fermentation.
[0064] Selon un autre mode de réalisation encore plus préféré, lorsque l’étape d’hydrolyse et de fermentation sont réalisées conjointement, les enzymes et l'organisme fermentaire sont ajoutés simultanément puis incubés à une température comprise entre 30°C et 35°C pour produire un moût de fermentation. Selon ce mode de réalisation, la cellulose présente dans le substrat pré-traité est convertie en glucose, et en même temps, dans le même réacteur, l'organisme fermentaire (par exemple une levure) convertit le glucose en produit final selon un procédé de SSF (Simultaneous Saccharification and Fermentation) connu de l'homme du métier. Selon les capacités métaboliques et hydrolytiques de l'organisme fermentaire, le bon déroulement de l'opération peut nécessiter l'addition d'une quantité plus ou moins importante de mélange cellulolytique exogène.
[0065] Dans un septième aspect, l’invention concerne aussi une souche telle qu’obtenue par le procédé de l’invention. L’invention concerne également une souche de champignon comprenant dans son génome plusieurs copies d’un gène d’intérêt sous la dépendance d’un promoteur TEF1 identique au promoteur TEF1 endogène de l’espèce de champignon génétiquement modifiée.
[0066] Les séquences de la présente invention sont décrites dans le Tableau 1 .
[0067] [Tableau 1]
[0068] Séquences de l’invention
[0069] D’autres caractéristiques, détails et avantages de l’invention apparaîtront à la lecture des Figures annexées et des exemples qui visent uniquement à illustrer l’invention, sans la limiter.
Brève description des Figures Fig. 1
[0070] [Fig. 1] représente la construction du plasmide utilisé dans l’Exemple 1.
Fig. 2
[0071] [Fig. 2] représente l’intensité de la fluorescence par unité de taille de spores de Trichoderma reesei en train de germer. La Figure 2 représente les résultats de 8 transformants : E1 , E2, E3, E4, E5, E6, E8 et E9 et celles de 3 souches non transformées : CL847-1 , CL847-2 et CL847-3.
Fig. 3
[0072] [Fig. 3] représente le promoteur TEF (TEF1) en amont du gène TEF1 dans le génome d’un champignon. Fig. 4
[0073] [Fig. 4] représente une illustration de l’intégration dans le transformant E1. 7 copies du gène d’intérêt EGFPont été intégrées. La triple indication « (1) le promoteur TEF1 , (2) le gène d’intérêt EGFP et (3) le terminateur CBH1 » illustre que la cassette a été correctement intégrée et que le gène EGFP est fonctionnel.
Fig. 5
[0074] [Fig. 5] représente une illustration de l’intégration dans le transformant E3. 10copies du gène d’intérêt EGFP ont été intégrées. La triple indication « (1) le promoteur TEF1 , (2) le gène d’intérêt EGFP et (3) le terminateur CBFI1 » illustre que les cas où la cassette a été correctement intégrée et que le gène EGFP est fonctionnel.
[0075] Exemples
[0076] Exemple 1 : Construction d’un vecteur contenant une cassette d’expression selon l’invention
[0077] Le plasmide de construction suivante a été obtenu :
- une origine de réplication d ’Escherichia coli ,
- un marqueur de sélection comprenant un promoteur fongique « cpc » et bactérien « IM7 » suivi du gène de résistance à l’Flygromycine (hph) et du terminateur fongique « TrpC »,
- une cassette d’expression comprenant (1) un promoteur TEF1 , (2) suivi du gène EGFP exprimant une protéine fluorescente verte et (3) le terminateur CBFI1 .
[0078] Ce vecteur peut être obtenu par toute méthode classique, bien connue de l’homme du métier. La construction de ce plasmide est présentée en Figure 1 . L’homme du métier peut par ailleurs aisément obtenir un vecteur (de type plasmidique) comprenant une cassette d’expression selon l’invention et un marqueur de sélection permettant de sélectionner les champignons transformés.
[0079] Exemple 2 : Transformation d’un champignon avec le vecteur d’expression de l’Exemple 1
[0080] Le plasmide de l’Exemple 1 a été utilisé pour transformer la souche de Trichoderma reesei dite CL847 (Durand H, Clanet M, Tiraby G. Genetic improvement of Trichoderma reesei for large scale cellulase production. Enzyme Microb Technol 1988, 10:341-346; Durand et al, 1984, Proc. Colloque SFM "Génétique des microorganismes industriels". Paris. H. FIESLOT Ed, pp 39- 50).
[0081] Les transformants ont été sélectionnés sur leur capacité à croître sur un milieu contenant de l’Flygromycine.
[0082] Les repiquages ont mis en évidence des macroscopies différentes sur boite entre les transformants. Seuls ceux présentant au bout de 3 repiquages, une croissance à confluence du périmètre des boites de pétri de 9 cm, et arborant un tapis de spore dense, vert et hydrophobe ont été conservés.
[0083] Au bout de ces 3 étapes de sélection, huit transformants ont été conservés et utilisés pour une caractérisation en cytométrie en flux. L’étude de la fluorescence a permis de mettre en évidence huit niveaux d’expression de la fluorescence (Erreur ! Source du renvoi introuvable.).
[0084] L’intensité de la fluorescence par unité de taille de spores de Trichoderma reesei en train de germer est présentée en Figure 2. Ces mesures ont été réalisées à l’aide d’un cytomètre.
[0085] L’étude génomique de quatre des huit transformants étudiés en cytométrie a permis de mettre en évidence le site d’insertion, et le nombre de copie du plasmide. Dans les quatre cas étudiés, toutes les insertions se sont faites en amont du promoteur TEF1. Le promoteur natif et constitutif du gène TEF1 est conservé. [0086] La Figure 3 illustre le gène TEF1 sous la dépendance du promoteur natif et constitutif du gène TEF1 dans le génome du champignon.
[0087] La Figure 4 représente une illustration de l’intégration dans le transformant E1. 7 copies du gène d’intérêt EGFP ont été intégrées
[0088] La Figure 5 représente une illustration de l’intégration dans le transformant E3. 10 copies du gène d’intérêt EGFP ont été intégrées.
Claims
[Revendication 1] Procédé pour insérer plusieurs copies d’un gène d’intérêt dans le génome d’un champignon, ledit procédé comprenant une étape de transformation dudit champignon à l’aide d’un vecteur comprenant une cassette d’expression, ladite cassette comprenant :
- un promoteur TEF1 identique au promoteur TEF1 endogène de l’espèce de champignon,
- un gène d’intérêt,
- un terminateur, à l’exception du terminateur TEF1 endogène de l’espèce de champignon.
[Revendication 2] Procédé selon la revendication 1 , dans lequel l’insertion est réalisée en amont du promoteur TEF1 endogène dans le génome dudit champignon, de préférence l’insertion est réalisée entre 750 et 1250 pb par rapport au site d’initiation de la traduction du gène codant pour TEF1 , la protéine TEF1 étant de préférence représentée par SEQ ID NO : 2 ou une protéine ayant au moins 80% d’identité avec SEQ ID NO : 2.
[Revendication 3] Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le gène TEF1 endogène sous la dépendance du promoteur TEF1 endogène sont conservés dans le génome transformé dudit champignon.
[Revendication 4] Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le promoteur TEF1 est représentée par :
- SEQ ID NO : 1 ou une séquence ayant au moins 60% d’identité avec SEQ ID NO : 1 , de préférence au moins 80%, ou
- le promoteur d’un gène codant pour une protéine de SEQ ID NO : 2 ou une protéine ayant au moins 80% d’identité avec SEQ ID NO : 2.
[Revendication 5] Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le champignon est choisi parmi les classes des orbiliomycètes, des pézizomycètes, des dothideomycètes, des eurotiomycètes, des lecanoromycètes, des léotiomycètes, des sordariomycètes et des saccharomycètes.
[Revendication 6] Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le champignon appartient au genre Trichoderma, et plus particulièrement à l’espèce Trichoderma reesei.
[Revendication 7] Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le gène d’intérêt code pour une enzyme, notamment une enzyme cellulolytique telle qu’une cellulase ou une hémicellulase.
[Revendication 8] Utilisation d’une cassette d’expression pour insérer plusieurs copies d’un gène d’intérêt dans le génome d’un champignon, ladite cassette d’expression comprenant :
- un promoteur TEF1 identique au promoteur TEF1 endogène de l’espèce de champignon,
- un gène d’intérêt,
- un terminateur, à l’exception du terminateur TEF1 endogène de l’espèce de champignon.
[Revendication 9] Procédé de production d’une protéine d’intérêt comprenant les étapes suivantes :
- (i) une étape de transformation d’un champignon à l’aide d’un vecteur comprenant une cassette d’expression comprenant (1) un promoteur TEF1 identique au promoteur TEF1 endogène de l’espèce de champignon, (2) un gène d’intérêt codant pour ladite protéine d’intérêt et (3) un terminateur, à l’exception du terminateur TEF1 endogène de l’espèce de champignon,
- (ii) une étape de culture du champignon transformé à l’étape (i) dans des conditions permettant la production de la protéine d’intérêt.
[Revendication 10] Procédé de production d’une biomasse comprenant les étapes suivantes :
- (i) une étape de transformation d’un champignon à l’aide d’un vecteur comprenant une cassette d’expression comprenant (1) un promoteur TEF1 identique au promoteur TEF1 endogène de l’espèce de champignon, (2) un gène d’intérêt et (3) un terminateur, à l’exception du terminateur TEF1 endogène de l’espèce de champignon,
- (ii) une étape de culture du champignon dans un milieu de culture approprié.
[Revendication 11] Procédé de production de sucre à partir de substrats cellulosiques ou lignocellulosiques, comprenant les étapes suivantes :
- (i) une étape de prétraitement d'un substrat cellulosique ou lignocellulosique afin d’obtenir un substrat prétraité,
- (ii) une étape d’utilisation d’un champignon transformé à l’aide d’un vecteur comprenant une cassette d’expression comprenant (1) un promoteur TEF1 identique au promoteur TEF1 endogène de l’espèce de champignon, (2) un gène d’intérêt codant pour une enzyme cellulolytique et (3) un terminateur, à l’exception du terminateur TEF1 endogène de l’espèce de champignon,
- (iii) une étape d'hydrolyse enzymatique du substrat prétraité obtenu à l’étape i), en présence des enzymes cellulolytiques obtenues à l’étape ii), afin d’obtenir un hydrolysat.
[Revendication 12] Procédé de production d'un alcool à partir de substrats cellulosiques ou lignocellulosiques, comprenant les étapes suivantes :
- (i) une étape de prétraitement d'un substrat cellulosique ou lignocellulosique afin d’obtenir un substrat prétraité,
- (ii) une étape d’utilisation d’un champignon transformé à l’aide d’un vecteur comprenant une cassette d’expression comprenant (1) un promoteur TEF1 identique au promoteur TEF1 endogène de l’espèce de champignon, (2) un gène d’intérêt codant pour une enzyme cellulolytique et (3) un terminateur, à l’exception du terminateur TEF1 endogène de l’espèce de champignon,
- (iii) une étape d'hydrolyse enzymatique du substrat prétraité obtenu à l’étape i), en présence des enzymes cellulolytiques obtenues à l’étape ii), afin d’obtenir un hydrolysat,
- (iv) une étape de fermentation alcoolique de l'hydrolysat obtenu,
- (v) une étape de séparation, notamment par distillation, les étapes (iii) ou (iv) pouvant éventuellement être réalisées simultanément.
[Revendication 13] Souche de champignon comprenant dans son génome plusieurs copies d’un gène d’intérêt sous la dépendance d’un promoteur TEF1 identique au promoteur TEF1 endogène de l’espèce de champignon génétiquement modifiée.
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