FR3128470A1 - Souche de champignon hyperproductrice de proteines - Google Patents
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Abstract
L’invention concerne une souche de champignon hyperproductrice de protéines appartenant à l’espèce Trichoderma reesei, dans laquelle le gène Trdim5 a été invalidé. L’invention concerne également les différentes utilisations de cette souche, ainsi que le procédé de modification génétique. (pas de figure)
Description
La présente invention concerne une souche de champignon appartenant à l’espèceTrichoderma reeseidans laquelle le gène Trdim5a été invalidé. L’invention concerne également les différentes utilisations de cette souche, ainsi que le procédé de modification génétique permettant d’obtenir une souche selon l’invention.
Contexte de l’invention
Les souches de champignon, notamment filamenteux, tel que le champignonTrichoderma reesei,sont aujourd’hui majoritairement utilisées pour la production d’enzymes. Ces enzymes, par exemple les cellulases, sont en effet utilisées pour hydrolyser la biomasse cellulosique ou lignocellulosique en sucres simples. Les enzymes produites par les champignons filamenteux sont donc utiles dans les filières de production de biocarburants de seconde génération ou encore des produits biosourcés issus de sucres provenant de biomasse (ligno)cellulosique.
Afin d’améliorer la production de biocarburants de seconde génération ou encore des produits biosourcés, il a ainsi été envisagé d’améliorer la production de cellulases.
Par exemple, le brevet EP 448 430 B1 décrit une production industrielle optimisée de cellulases parTrichoderma reesei. Cette production est réalisée en protocole fed-batch (alimentation sans soutirage) en utilisant une solution d'alimentation contenant du lactose comme sucre inducteur de la production de cellulases. Ce procédé de fermentation comprend deux étapes : une première étape de croissance du champignon en présence d’un excès de source carbonée et une deuxième étape de production d’enzymes grâce à l’ajout d’un inducteur dans le milieu avec un débit optimisé. Ces étapes sont réalisées en milieu liquide dans des bioréacteurs sous une agitation et en présence d’oxygène car le champignon est aérobie stricte. Un autre exemple de procédé optimisé de production de cellulases est décrit dans le brevet EP 2 744 899 B1.
En plus de l’optimisation des procédés de production de cellulases, il a également été envisagé de modifier génétiquement les souches de champignons afin de modifier leur capacité de production. Ainsi, le brevet EP3397768 décrit la surexpression du gèneTrAZF1chez une souche afin d’augmenter de façon significative la production de protéines cellulolytiques.
Des procédés de fermentation et souches utiles pour améliorer la production d’enzymes cellulolytiques par des champignons filamenteux, et ce faisant de produits biosourcés mais également des biocarburants de seconde génération, sont donc déjà décrits dans l’art antérieur.
Cependant, il existe toujours un besoin pour de nouvelles souches plus performantes.
L’invalidation dedim-5chez le champignonNeurospora crassaa déjà été décrite (Smith et al.; Honda et al.). Néanmoins, la production de protéines d’intérêt n’est pas discutée.
Le rôle de la méthyltransférase putative LAE1 sur la production de protéines chez le champignon du genreTrichodermaa également été discutée dans Delabona et al. et Seiboth et al. Cependant, les auteurs testent ici la surexpression de ladite méthytransférase.
Au contraire, la présente invention repose sur les résultats inattendus des inventeurs qui ont mis en évidence que l’invalidation du gène Trdim5(codant pour une histone méthyltransférase), dans une souche de champignon appartenant à l’espèceTrichoderma reesei, permettait d’obtenir une souche hyperproductrice de protéines d’intérêt, par rapport à une souche parente dans laquelle ledit gène Trdim5n’a pas été invalidé. Les inventeurs ont également mis en évidence une corrélation entre la production accrue de protéines d’intérêt (liée à l’invalidation de Trdim5) et les activités mesurées de ces protéines.
Bref exposé de l’invention
La présente invention concerne donc une souche de champignon appartenant à l’espèceTrichoderma reeseidans laquelle le gène Trdim5a été invalidé.
La présente invention concerne aussi un procédé de modification génétique d’une souche de champignon selon l’invention, comprenant une étape d’invalidation du gène Trdim5.
La présente invention concerne aussi un procédé de production de biomasse de champignon, comprenant une étape de culture d'une souche de champignon selon l’invention, dans un milieu de culture comprenant un substrat approprié.
La présente invention concerne également un procédé de production de protéines d’intérêt, notamment des enzymes, comprenant une étape de culture d'une souche de champignon selon l’invention, dans un milieu de culture comprenant un substrat approprié.
La présente invention concerne en outre un procédé de production de produits biosourcés ou de sucres à partir de substrats cellulosiques ou lignocellulosiques, comprenant une étape d’utilisation de la souche de champignon selon l’invention, pour produire des enzymes cellulolytiques.
La présente invention concerne aussi un procédé de production d’alcool, notamment du biocarburant, à partir de substrats cellulosiques ou lignocellulosiques, comprenant une étape d’utilisation de la souche dechampignonselon l’invention, pour produire des enzymes cellulolytiques.
La présente invention concerne également différentes utilisations de la souche selon l’invention, pour la production de protéines d’intérêt, pour l'hydrolyse de la cellulose ou de la lignocellulose en glucose, pour la production de produits biosourcés à partir de substrats cellulosiques ou lignocellulosiques, ou encore pour la production d’alcool tel qu’un biocarburant.
Enfin, la présente invention concerne l’utilisation d'une souche de champignon selon l’invention, pour améliorer les propriétés d’une souche compatible, notamment industrielle.
Dans un premier aspect, la présente invention concerne ainsi une souche de champignon appartenant à l’espèceTrichoderma reeseidans laquelle le gène Trdim5a été invalidé. Ainsi, dans la souche selon l’invention, le gène Trdim5n’est plus fonctionnel ou n’est plus exprimé. Cela signifie également que dans la souche selon l’invention le gène Trdim5est invalidé. La présente invention concerne ainsi une souche variante de champignon, dans laquelle le gène Trdim5a été invalidé. En d’autres termes, cela signifie par exemple que dans la souche selon l’invention la protéine correspondant au gène Trdim5n’est pas produite. Alternativement, la protéine correspondant au gène Trdim5peut être produite, mais elle n’est pas fonctionnelle. Plus particulièrement, le génome de la souche selon l’invention a ainsi été modifié, notamment afin que le gène Trdim5ne soit plus exprimé.
Selon l’invention, le terme « souche variante » s’entend d’une souche modifiée génétiquement par rapport à une souche parente. Selon l’invention, le terme « souche parente » s’entend ainsi d’une souche dont est issue ou dérivée la souche variante, et dans laquelle le gène Trdim5n’a pas été invalidé. La souche selon l’invention correspond ainsi à une souche variante dérivée d’une souche parente, ladite souche variante possédant une production améliorée de protéines d’intérêt par rapport à la souche parente et ladite souche variante comprenant au moins une modification génétique correspondant à l’invalidation du gène Trdim5.
Selon l’invention, le terme « gène fonctionnel » s’entend notamment d’un gène qui permet de produire une protéine fonctionnelle, et le terme « protéine fonctionnelle » s’entend d’une protéine qui possède une fonction ou une activité, par exemple avec la protéine codée par le gène Trdim5il s’agit d’une activité d’histone méthyltransférase DIM5.
L’expression « une production améliorée par rapport à la souche parente » signifie que la souche variante a une production supérieure à celle de la souche parente, et notamment une production améliorée d’au moins 20% par rapport à celle de la souche parente. Selon l’invention, une « production améliorée d’au moins 20% » s’entend de toutes les valeurs comprises entre 20% et 100%, et notamment 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% et 100%.
Le champignon selon l’invention appartient à l’espèceTrichoderma reesei. Plus particulièrement, la souche parente s’entend ainsi d’une souche issue ou dérivée de l’isolat naturel QM6a (déposée sous le numéro ATCC 13631). En effet, la souche QM6a est la souche à partir de laquelle toutes les souches industrielles sont développées, et c’est pourquoi toutes les souches industrielles sont dites issues de QM6a (il s’agit ici de descendant direct/de première génération de QM6a) ou bien dérivées de QM6a (il s’agit ici de descendants de QM6a de deuxième génération ou génération ultérieure). Les souches dérivées de QM6a sont par exemple la souche Rut-C30 (déposée sous le numéro ATCC 56765), la souche NG14 (déposée sous le numéro ATCC 56767) ou encore la souche QM9414 (déposée sous le numéro ATCC 26921). Selon un mode de réalisation préféré, il s’agit de la souche Rut-C30 ou de ses descendants (c’est-à-dire toutes les souches qui sont issues ou dérivent de Rut-C30).
Le gène Trdim5code pour l’histone méthyltransférase DIM5. Il s’agit d’une enzyme qui méthyle les histones. Celle-ci est recrutée dans les régions riches en nucléotides A:T. Elle appose une triméthylation sur la lysine 9 de l’histone H3, d’où le nom de la marque épigénétique H3K9me3 (Tamaru and Selker, 2001).
Selon l’invention, le gène Trdim5est représenté par la SEQ ID NO : 2, mais peut également correspondre à un variant de ce gène. Préférentiellement, le gène Trdim5est uniquement représenté par la SEQ ID NO : 2.
Selon l’invention, « un variant de gène » s’entend d’un gène qui code également pour une histone méthyltransférase DIM5 ou une protéine qui appose une triméthylation sur la lysine 9 de l’histone H3. Le variant du gène Trdim5est typiquement représenté par une séquence ayant au moins 90% d’identité avec le gène de SEQ ID NO : 2. Le variant du gène Trdim5correspond ainsi à un gène dérivé de la séquence représentée par SEQ ID NO : 2. Plus particulièrement, le variant du gène Trdim5est représenté par une séquence ayant au moins 95%, de préférence au moins 98% ou 99%.
Le gène Trdim5est représenté par la SEQ ID NO : 2, et la protéine codée par le gène Trdim5est représentée par la SEQ ID NO : 3. Ainsi, le variant du gène Trdim5code soit pour la protéine de SEQ ID NO : 3, soit pour une séquence ayant au moins 90% d’identité avec ladite SEQ ID NO : 3, notamment au moins 95%, préférentiellement au moins 98% ou 99%.
Selon l’invention le terme « au moins 90% » signifie toutes les valeurs comprises entre 90% et 100%, notamment les valeurs de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% et 100%. L’homme du métier sait calculer un pourcentage d’identité entre deux séquences. Par exemple, selon l’invention, le pourcentage d'identité d'une séquence donnée par rapport à SEQ ID NO : 2 ou SEQ ID NO : 3 s’entend du pourcentage d’identité sur la longueur totale des séquences. Le pourcentage correspond ainsi au nombre de nucléotides/résidus identiques entre cette séquence donnée et SEQ ID NO : 2 ou 3 divisé par le nombre de nucléotides ou résidus dans la plus longue des deux séquences.
Ainsi, dans un mode de réalisation, dans ladite souche selon l’invention, le gène Trdim5invalidé correspond à un gène représenté par la SEQ ID NO : 2 ou à un gène ayant au moins 90% d’identité avec le gène de SEQ ID NO : 2, notamment au moins 95% et plus particulièrement au moins 98%. Dans un mode de réalisation encore plus préféré, dans ladite souche selon l’invention, le gène Trdim5invalidé correspond à un gène représenté par la SEQ ID NO : 2. Selon ce dernier mode de réalisation, la souche selon l’invention comprend ainsi une délétion du gène codant pour la protéine représentée par la SEQ ID NO : 3.
Toutes les techniques d’invalidation de gène peuvent être utilisées pour obtenir une souche selon l’invention. A titre d’exemples non limitatifs, l’invalidation peut être réalisée par mutagénèse par PCR, mutagénèse dirigée par oligonucléotide, interférence à ARN, à l’aide de méganucléases ou nucléases à doigts de zinc, TALEN (Transcription activator-like effector nucleases), ou encore la technologie CRISPR/cas, ...
Dans un aspect préféré, dans la souche selon l’invention, le gène Trdim5a été invalidé par mutagénèse ou par recombinaison homologue. Selon l’invention, l’invalidation consiste en une délétion de tout ou partie du gène Trdim5. Préférentiellement, dans la souche selon l’invention, le gène Trdim5a été invalidé à l’aide d’une cassette d’invalidation. Encore plus préférentiellement, ladite cassette d’invalidation est représentée par la SEQ ID NO : 1.
La mutagénèse est une technique communément utilisée en génie génétique. Elle vise à introduire volontairement des mutations dans l’ADN afin de créer des gènes génétiquement modifiés. Selon l’invention, la mutagénèse s’entend plus particulièrement de la mutagénèse dirigée. La mutagénèse dirigée permet en effet d’introduire des mutations identifiées dans un gène précis. Pour ce faire, l’ADN d’intérêt (ici le gène Trdim5) contenant les mutations est synthétisé puis introduit dans la cellule à muter, typiquement à l’aide d’un vecteur, avant intégration dans le génome.
La recombinaison homologue est une technique communément utilisée en génie génétique qui consiste à un échange entre molécules d’ADN, typiquement à l’aide d’un vecteur.
Le terme « vecteur » s’entend de toute séquence d’ADN dans laquelle il est possible d’insérer des fragments d’acide nucléique étranger, les vecteurs permettant d’introduire de l’ADN étranger dans une cellule hôte. Des exemples de vecteurs sont les plasmides, les cosmides, les chromosomes artificiels de levures (YAC), les chromosomes artificiels de bactéries (BAC) et les chromosomes artificiels dérivés du bactériophage P1 (PAC), les vecteurs dérivés de virus. Le vecteur selon l'invention permet l'introduction d'une mutation ou d'une délétion.
Dans un mode de réalisation préféré, ladite cassette d’invalidation comprend trois fragments d'ADN :
(1) une région en amont du gène cible,
(2) un marqueur de sélection, et
(3) une région en aval du gène cible.
(1) une région en amont du gène cible,
(2) un marqueur de sélection, et
(3) une région en aval du gène cible.
Dans le cas de la présente invention, le « gène cible » s’entend du gène Trdim5. Les régions en amont et en aval du gène cible sont deux éléments de recombinaison, un à chaque extrémité du gène, et sont nécessaires pour cibler de façon précise la séquence à invalider.
Selon l’invention, la région en amont du gène cible (c’est-à-dire la séquence 5’ en amont du gène Trdim5) est notamment représentée par la séquence de SEQ ID NO : 10.
Selon l’invention, la région en aval du gène cible (c’est-à-dire la séquence 3’ en aval du gène Trdim5) est notamment représentée par la séquence de SEQ ID NO : 12.
L’expression « marqueur de sélection » s’entend d’un gène dont l’expression confère aux cellules qui le contiennent une caractéristique permettant de les sélectionner. L’utilisation d’un marqueur de sélection permet en effet d’identifier les cellules ayant intégré une modification génétique par rapport à celles qui ne l’ont pas intégrée. Il s’agit par exemple d’un gène de résistance aux antibiotiques, notamment le gène de résistance à l’antibiotique hygromycinehph, tel que représenté par la SEQ ID NO : 11.
Plus précisément, selon l’invention, la cassette d’invalidation est préférentiellement constituée d’un gène de résistance placé sous le contrôle d’un promoteur et d’un terminateur, avec en amont et en aval les régions flanquantes 5’ et 3’ du gène Trdim5. Selon l’invention, ladite cassette d’invalidation pourra être liée opérationnellement à un promoteur, un terminateur ou toute autre séquence nécessaire à son expression dans une cellule hôte.
La cassette d’invalidation peut être amplifiée selon les techniques classiques bien connues de l'homme du métier, typiquement par une méthode choisie parmi le clonage classique, la fusion PCR, ou encore le clonagein vivopar PCR. Préférentiellement, cette cassette d’invalidation est amplifiée par PCR, notamment à l’aide des séquences représentée par les SEQ ID NO : 4 (forward) et SEQ ID NO : 5 (reverse). La cassette d’invalidation est ensuite introduite par recombinaison dans une souche deTrichoderma reesei,qui n'exprime pas un gène du marqueur de sélection. L'homme du métier peut aisément identifier les gènes de marqueur de sélection pertinents pour la mise en œuvre de l'invention. Après culture, les souches variantes/mutantes ayant incorporé la cassette d’invalidation sont sélectionnées en fonction de l'expression ou non du marqueur de sélection ; les clones ayant été transformés exprimant ledit marqueur de sélection. Il s’agit des souches selon l’invention. Préférentiellement, les souches mutantes sont identifiées à l’aide des amorces de SEQ ID NO : 6 (forward 5’), SEQ ID NO : 7 (reverse 5’), SEQ ID NO : 8 (reverse 3’) et SEQ ID NO : 9 (forward 3’), pour vérifier par PCR l’insertion de la cassette au locus du gène Trdim5. Ces techniques de recombinaison génétiques sont bien connues de l’homme du métier.
Dans un deuxième aspect, l’invention concerne également un procédé de modification génétique d’une souche de champignon selon l’invention, telle que mentionné ci-dessus, comprenant une étape d’invalidation du gène Trdim5. Le procédé de modification génétique d’une souche selon l’invention permet ainsi d’obtenir des souches de champignon hyperproductrice par rapport à la souche de champignon parent. C’est pourquoi la souche selon l’invention peut être considérée comme un variant de la souche de champignon parent.
Comme indiquées précédemment, toutes les techniques peuvent être utilisées pour invalider le gène Trdim5. Préférentiellement, dans ledit procédé de modification génétique selon l’invention, l’étape d’invalidation du gène Trdim5est réalisée à l’aide d’une étape de mutagénèse ou de recombinaison homologue, éventuellement en utilisant la technologie CRISPR/Cas9. Encore plus préférentiellement, dans ledit procédé de modification génétique selon l’invention, l’étape d’invalidation du gène Trdim5est réalisée à l’aide d’une cassette d’invalidation telle que mentionnée ci-dessus, notamment représentée par la SEQ ID NO : 1, chez un champignon appartenant à l’espèceTrichoderma reesei.
Dans un troisième aspect, la présente invention concerne aussi un procédé de production de biomasse de champignon, comprenant une étape de culture d'une souche de champignon selon l’invention, dans un milieu de culture comprenant un substrat approprié. Cette étape permet ainsi la croissance de la souche de champignon selon l’invention. L’homme du métier connait les substrats appropriés à la croissance des souches de champignon.
Dans un quatrième aspect, la présente invention concerne également un procédé de production de protéines d’intérêt, notamment des enzymes, comprenant une étape de culture d'une souche de champignon selon l’invention, dans un milieu de culture comprenant un substrat approprié. L’invention concerne ainsi l’utilisation d’une souche de champignon selon l’invention, pour la production de protéines d’intérêt.
De façon avantageuse, ledit procédé comprend ainsi une phase de croissance d’une souche de champignon selon l’invention, puis une phase de croissance et de production de protéines d’intérêt par ladite souche. Encore plus préférentiellement, ladite phase de croissance est réalisée en présence d’un substrat de croissance et ladite phase de croissance et de production de protéines d’intérêt est réalisée en présence d’un substrat inducteur. Le substrat de croissance et le substrat inducteur sont de préférence des substrats carbonés.
Ainsi, le substrat carboné de croissance est choisi de préférence parmi le lactose, le glucose, le xylose, les résidus obtenus après fermentation éthanolique des sucres monomères des hydrolysats enzymatiques de biomasse cellulosique, et/ou un extrait brut de pentoses hydrosolubles provenant du prétraitement d’une biomasse cellulosique.
Le substrat carboné inducteur est ainsi choisi de préférence parmi le lactose, le cellobiose, le cellulose, le glucose, le sophorose, les résidus obtenus après fermentation éthanolique des sucres monomères des hydrolysats enzymatiques de biomasse cellulosique, un extrait brut de pentoses hydrosolubles provenant du prétraitement d’une biomasse cellulosique, ou un mélange de ces substrats. Encore plus préférentiellement, le substrat carboné inducteur est choisi parmi le lactose, le glucose, un mélange lactose et cellulose ou un mélange glucose et cellulose.
Selon l’invention, les protéines d’intérêt sont toutes les protéines pouvant être produites par un champignon, de façon naturelle ou bien par modification génétique (par exemple après transformation à l’aide d’un vecteur approprié).
De façon avantageuse, les protéines d’intérêt selon l’invention sont des enzymes, notamment des enzymes cellulolytiques telles que des cellulases ou des hémicellulases. De façon préférée, les enzymes sont des cellulases. Selon l’invention, le terme « cellulases » s’entend plus particulièrement des enzymes choisies parmi les endoglucanases, les exoglucanases et les glucosidases, et plus particulièrement la β-glucosidase. Le terme « cellulase » fait plus particulièrement référence à une enzyme adaptée à l'hydrolyse de la cellulose et permettant aux microorganismes (tels queTrichoderma reesei) qui les produisent d'utiliser la cellulose comme source de carbone, en hydrolysant ce polymère en sucres simples (glucose). La production de cellulases par une souche selon l’invention peut être déterminée par toutes techniques usuelles pour l’homme du métier, ou encore par les techniques décrites dans les brevets EP 448 430 B1 ou EP 2 744 899 B1.
Une corrélation entre protéines totales sécrétées et cellulases peut être faite car chezT. reesei, les exoglucanases (CBHI, CBHII) et les endoglucanases (EGI, EGII) principales peuvent représenter jusqu’à 90% de la quantité totale de protéines sécrétées (voir par exemple Markov, A.V., Gusakov, A.V., Kondratyeva, E.G., Okunev, O.N., Bekkarevich, A.O., and Sinitsyn, A.P. (2005). New Effective Method for Analysis of the Component Composition of Enzyme Complexes from Trichoderma reesei. Biochemistry (Moscow)70, 657-663).
Dans un cinquième aspect, la présente invention concerne également un procédé de production de produits biosourcés à partir de substrats cellulosiques ou lignocellulosiques, comprenant une étape d’utilisation de la souche de champignon selon l’invention, pour produire des enzymes cellulolytiques. L’invention concerne donc également l’utilisation d’une souche de champignon selon l’invention, pour la production de produits biosourcés à partir de de substrats cellulosiques ou lignocellulosiques.
Dans un sixième aspect, l’invention concerne un procédé de production de sucre à partir de substrats cellulosiques ou lignocellulosiques selon l’invention, comprend :
i) une étape de prétraitement d'un substrat cellulosique ou lignocellulosique afin d’obtenir un substrat prétraité,
ii) une étape d’utilisation de la souche selon l’invention pour produire des enzymes cellulolytiques,
iii) une étape d'hydrolyse enzymatique du substrat prétraité obtenu à l’étape i), en présence des enzymes cellulolytiques obtenues à l’étape ii), afin d’obtenir un hydrolysat.
i) une étape de prétraitement d'un substrat cellulosique ou lignocellulosique afin d’obtenir un substrat prétraité,
ii) une étape d’utilisation de la souche selon l’invention pour produire des enzymes cellulolytiques,
iii) une étape d'hydrolyse enzymatique du substrat prétraité obtenu à l’étape i), en présence des enzymes cellulolytiques obtenues à l’étape ii), afin d’obtenir un hydrolysat.
Les sucres (ou jus sucré) sont ainsi obtenus à l’issue de l’étape d’hydrolyse. De préférence ce sont des sucres en C5-C6.
Selon un mode de réalisation, ledit procédé de production de sucres peut également comprendre un ou plusieurs étapes de séparation. Ceci permet ainsi de séparer, notamment par distillation, les différents produits d’intérêt dilués dans l’eau.
Dans un septième aspect, la présente invention concerne un procédé de production d’alcool, notamment de biocarburant, à partir de substrats cellulosiques ou lignocellulosiques, comprenant une étape d’utilisation de la souche de champignon selon l’invention pour produire des enzymes cellulolytiques. L’invention concerne ainsi l’utilisation d’une souche de champignon selon l’invention, pour la production d’alcool à partir de substrats cellulosiques ou lignocellulosiques.
L’alcool ainsi obtenu est par exemple utilisé comme un biocarburant. L’alcool ainsi obtenu peut aussi être utilisé comme solvant ou comme produit intermédiaire dans l’industrie chimique.
Selon l’invention, le terme « biocarburant » s’entend plus particulièrement d’un biocarburant de seconde génération, c’est-à-dire issu de ressources non alimentaires. Selon l’invention, le terme « biocarburant » peut également être défini comme étant tout produit issu de la transformation de la biomasse et pouvant être utilisé à des fins énergétiques. D’une part et sans vouloir se limiter, on peut citer à titre d’exemple des biogaz, des produits pouvant être incorporés (éventuellement après transformation ultérieure) à un carburant ou être un carburant à part entière, tels que des alcools (l’éthanol, le butanol et/ou l’isopropanol selon le type d’organisme fermentaire utilisé), des solvants (acétone), des acides (butyrique), des lipides et leurs dérivés (acides gras à courtes ou longues chaînes, esters d’acides gras), ainsi que l’hydrogène. De manière préférée, le biocarburant selon l’invention est un alcool, par exemple l’éthanol, le butanol et/ou l’isopropanol. Plus préférentiellement, le biocarburant selon l’invention est l’éthanol. Dans un autre mode de réalisation, le biocarburant est du biogaz. Dans un autre mode de réalisation, le produit est une molécule intéressant l'industrie chimique, comme par exemple, un autre alcool tel que le 1,2-propane diol, le 1,3-propane diol, le 1,4-butane diol, le 2,3-butane diol, des acides organiques comme l'acide acétique, propionique, acrylique, butyrique, succinique, malique, fumarique, citrique, itaconique, ou des hydroxyacides comme l'acide glycolique, hydroxypropionique, ou lactique. De manière préférée, l’alcool est par exemple l’éthanol, le butanol, l’isopropanol, le 1,2-propane diol, le 1,3-propane diol, le 1,4-butane diol, et/ou le 2,3-butane diol. Plus préférentiellement, il s’agit de l’éthanol.
Dans un aspect préféré, le procédé de production d’alcool à partir de substrats cellulosiques ou lignocellulosiques selon l’invention, comprend :
i) une étape de prétraitement d'un substrat cellulosique ou lignocellulosique afin d’obtenir un substrat prétraité,
ii) une étape d’utilisation de la souche selon l’invention pour produire des enzymes cellulolytiques,
iii) une étape d'hydrolyse enzymatique du substrat prétraité obtenu à l’étape i), en présence des enzymes cellulolytiques obtenues à l’étape ii), afin d’obtenir un hydrolysat,
iv) une étape de fermentation alcoolique de l'hydrolysat obtenu,
v) une étape de séparation, notamment par distillation.
i) une étape de prétraitement d'un substrat cellulosique ou lignocellulosique afin d’obtenir un substrat prétraité,
ii) une étape d’utilisation de la souche selon l’invention pour produire des enzymes cellulolytiques,
iii) une étape d'hydrolyse enzymatique du substrat prétraité obtenu à l’étape i), en présence des enzymes cellulolytiques obtenues à l’étape ii), afin d’obtenir un hydrolysat,
iv) une étape de fermentation alcoolique de l'hydrolysat obtenu,
v) une étape de séparation, notamment par distillation.
Dans un aspect encore plus préféré, le procédé de production d’alcool à partir de substrats cellulosiques ou lignocellulosiques selon l’invention, comprend :
i) une étape de prétraitement d'un substrat cellulosique ou lignocellulosique afin d’obtenir un substrat prétraité,
ii) une étape d’utilisation de la souche selon l’invention pour produire des enzymes cellulolytiques,
iii) une étape d'hydrolyse enzymatique du substrat prétraité obtenu à l’étape i), en présence des enzymes cellulolytiques obtenues à l’étape ii), afin d’obtenir un hydrolysat,
iv) une étape de fermentation alcoolique de l'hydrolysat obtenu,
v) une étape de séparation, notamment par distillation,
les dites étapes iii) et iv) étant réalisées simultanément. Cela est typiquement le cas dans les procédés de production dits « SSF » (Simultaneous Saccharification and Fermentation).
i) une étape de prétraitement d'un substrat cellulosique ou lignocellulosique afin d’obtenir un substrat prétraité,
ii) une étape d’utilisation de la souche selon l’invention pour produire des enzymes cellulolytiques,
iii) une étape d'hydrolyse enzymatique du substrat prétraité obtenu à l’étape i), en présence des enzymes cellulolytiques obtenues à l’étape ii), afin d’obtenir un hydrolysat,
iv) une étape de fermentation alcoolique de l'hydrolysat obtenu,
v) une étape de séparation, notamment par distillation,
les dites étapes iii) et iv) étant réalisées simultanément. Cela est typiquement le cas dans les procédés de production dits « SSF » (Simultaneous Saccharification and Fermentation).
Selon un mode de réalisation particulier, l’étape de prétraitement d'un substrat cellulosique ou lignocellulosique est une étape de mise en suspension en phase aqueuse dudit substrat cellulosique ou lignocellulosique.
Selon un mode de réalisation particulier, l’hydrolysat obtenu à l’étape iii) est un hydrolysat contenant des sucres en C5-C6, notamment du glucose.
Selon un mode de réalisation particulier, l’étape de fermentation alcoolique de l'hydrolysat obtenu est une étape de fermentation, en présence d'un organisme fermentaire, du glucose issu de l'hydrolysat de manière à produire un moût de fermentation. Un organisme fermentaire est par exemple une levure.
Selon un mode de réalisation particulier, l’étape de séparation est une séparation du biocarburant et du moût de fermentation, notamment par distillation.
Dans un huitième aspect, l’invention concerne également l’utilisation d’une souche de champignon selon l’invention, pour l'hydrolyse de la cellulose ou de la lignocellulose en glucose.
Dans un neuvième aspect, l’invention concerne également l’utilisation d'une souche de champignon selon l’invention, pour améliorer les propriétés d’une souche compatible, notamment industrielle.
Dans la présente description, les définitions et préférences indiquées dans un aspect s’appliquentmutatis mutandisaux autres aspects. Par exemples, toutes les définitions et préférences indiquées dans le premier aspect de l’invention ci-dessus s’appliquent également aux deuxième, troisième, quatrième, cinquième, sixième, septième et huitième aspect.
Brève description des Figures
D’autres caractéristiques, détails et avantages de l’invention apparaîtront à la lecture des Figures annexées et des exemples qui illustrent l’invention et ne visent en aucun cas à la limiter.
Fig. 1
Fig. 2
Fig. 3
Fig. 4
Fig. 5
Séquences de la présente invention
Nom de la séquence | Séquence |
SEQ ID NO : 1 | ATAAAGATTGTCGAGTGGGCATTCAGACGGGTATGGATATGTTGCTCTCTTTGTCAGTTTGTATAAGAGAGCTTGACCGGCATTGATGAGAATGATTCACTACCTCGGAAACCCGCCACAAGCGGAATACAAGGGGAAAACGCATTGTACTAGGCCATTAGCTAAAACCAAACAACGAGAAAGAAGTCAGAATAGAATCAGGTGGGGCAGTGCTAGTGTGTGTACCGACCCGCAGGATTGGTGCTTTGCCCAGAGCTCTACAGAATAGCGCGCGCATCCATATGTTAGTTCTGCAATTTTCTTGTATCGGTGCTGTGACTCATACTTCCCCCTTTGGCTGGCCTTGCGGCAACCAATAAGAACGCACAGTGAAATCTTGCGGGTGGGGAGTGCATGGCGCCTGCATTGGCTTGGGGACGCGCACTGTCGCACACTTCCATCTGACCTTTCAGAAGGGTTTCGTGGTGGGCAAGGACCAACCGGTTGCGCGGCCGTGCGTGGGTGCCTCGCCCGGCACTGCCAGGGCCACTGCAGTGGCAGTTTGCTGCCTGATACAAAATCCTTCCCTCCGCCCAGTTTTCCCTCTTTGACCTTCCTTTCTCTTCTCTGCAACCAAATCCACCCTATCAAACCAAAACAGTGTCTCGACCGAGGTATCAACCTGAATCAGCAACATCGTAGCCAGCATTTGTCTCCGTCTCTGCAGAACCAGCGAGTTGCAAACATTATCCAGGCAACAGGGCACCAACTCACTTCTTCGGCTTTCACCAATCGGTACAGCTCTTCTCAGAACTCGCGTCCGCAACAGTTCTACGCTTCCTCAGCACCTTCTTCAGCTTCAATCCTGAACACTCAGAACCGCGCACAGCAGCGCCCTCCTGTTCCCTTGTTTCCCAAAAGTACCGGTAGTATTTCGCACGGAAAGCAGGGCAACACGTAAGTGATATCTACTAGTTGTGACCGGCGCCTAGTGTTGACAATTAATCATCGGCATAGTATATCGGCATAGTATAATACGACTCACTATAGGAGGGCCACCATGTCGACTACTAACCTTCTTCTCTTTCCTACAGCTGAGATCACCGGTAGGAGGGCCATCATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCGACGTCTGTCGCGAAGTTTCTGATCGAAAAGTTCGACAGCGTCTCCGACCTGATGCAGCTCTCGGAGGGCGAAGAATCTCGTGCTTTCAGCTTCGATGTAGGAGGGCGTGGATATGTCCTGCGGGTAAATAGCTGCGCCGATGGTTTCTACAAAGATCGTTATGTTTATCGGCACTTTGCATCGGCCGCGCTCCCGATTCCGGAAGTGCTTGACATTGGGGAATTCAGCGAGAGCCTGACCTATTGCATCTCCCGCCGTGCACAGGGTGTCACGTTGCAAGACCTGCCTGAAACCGAACTGCCCGCTGTTCTGCAACCCGTCGCGGAGCTCATGGATGCGATCGCTGCGGCCGATCTTAGCCAGACGAGCGGGTTCGGCCCATTCGGACCGCAAGGAATCGGTCAATACACTACATGGCGTGATTTCATATGCGCGATTGCTGATCCCCATGTGTATCACTGGCAAACTGTGATGGACGACACCGTCAGTGCGTCCGTCGCGCAGGCTCTCGATGAGCTGATGCTTTGGGCCGAGGACTGCCCCGAAGTCCGGCACCTCGTGCACGCGGATTTCGGCTCCAACAATGTCCTGACGGACAATGGCCGCATAACAGCGGTCATTGACTGGAGCGAGGCGATGTTCGGGGATTCCCAATACGAGGTCGCCAACATCTTCTTCTGGAGGCCGTGGTTGGCTTGTATGGAGCAGCAGACGCGCTACTTCGAGCGGAGGCATCCGGAGCTTGCAGGATCGCCGCGGCTCCGGGCGTATATGCTCCGCATTGGTCTTGACCAACTCTATCAGAGCTTGGTTGACGGCAATTTCGATGATGCAGCTTGGGCGCAGGGTCGATGCGACGCAATCGTCCGATCCGGAGCCGGGACTGTCGGGCGTACACAAATCGCCCGCAGAAGCGCGGCCGTCTGGACCGATGGCTGTGTAGAAGTACTCGCCGATAGTGGAAACCGACGCCCCAGCACTCGTCCGAGGGCAAAGGAATGACCGGAGTTGAGACAAATGGTGTTCAGGATCTCGATAAGATACGTTCATTTGTCCAAGCAGCAAAGAGTGCCTTCTAGTGATTTAATAGCTCCATGTCAACAAGAATAAAACGCGTTTCGGGTTTACCTCTTCCAGATACAGCTCATCTGCAATGCATTAATGCATTGGACCTCGCAACCCTAGTACGCCCTTCAGGCTCCGGCGAAGCAGAAGAATAGCTTAGCAGAGTCTATTTTCATTTTCGGGAGACGAGATCAAGCAGATCAACGGTCGTCAAGAGACCTACGAGACTGAGGAATCCGCTCTTGGCTCCACGCGACTATATATTTGTCTCTAATTGTACTTTGACATGCTCCTCTTCTTTACTCTGATAGCTTGACTATGAAAATTCCGTCACCAGCCCCTGGGTTCGCAAAGATAATTGCACTGTTTCTTCCTTGAACTCTCAAGCCTACAGGACACACATTCATCGTAGGTATAAACCTCGAAAATCATTCCTACTAAGATGGGTATACAATAGTAACCATGCATGGTTGCCTAGTGAATGCTCCGTAACACCCAATACGCCGGCCGAAACTTTTTTACAACTCTCCTATGAGTCGTTTACCCAGAATGCACAGGTACACTTGTTTAGAGGTAATCCTTCTTTCTAGGGCTGGCTGAGTTGCTCACTTGACGGATGCGCCTGTGCTGTTGAGGGTTCTTATGAGATGGAGTATCCGGTCATCAACCATAACCTCCTGAATCAGTCGTAAAGATAAATGGCTGTTCAATGGTGAAATTGTATCAAATTAAAGTACGAGGCAGAACGGTAGTAACAGCACTGAGCCAGGACGCGTTATGAGAATGAAGC Les régions flanquantes en 5’ et 3 sont soulignées. |
SEQ ID NO : 2 | ATGGAGGCCGTCACGAGACAGCACTTTTTCTTCCACGACCAGCCGGAATACGCGGCCCAAAGGGAATCCTGCCACTTCTGCCAGCTCCGCGCCTTTCCCGCGCACAAGACCATCCCCGTCACCATCGTCAACGAGGTCGACCAGGCCGTCATCCCGCCCAACTTCCGCTTCGTCGACCGCATGGTCCTGCGCCGCGGCGTCGAGCCCGCTAGGATAGCTTCCGCAGCGGCTGCTCGTGCGAGTCCGACGACGCGTGCCAGTACACGGGCTGCCTGTGCCTCGCCGACCTGGACGACCAGGACAGCGGCAGCGACGAGGACGACGACGAGGACGACGACGAGGGGAACGACGCCTTTCACATCGCCAACCAGCTCAATGGGGATGATTTCGAGGCCGCGGCCGCAAAGAAGAAGAAGATGAAGAAGAAGGACAGGACGAAGAGAAAGGCGTACGCGTATCACTCGCACGGGGCCAAGGCGGGCCTGCTGCGCTCCAAGATGCTCAACTCCAAGGAGCCGCTGTACGAATGCCATGCCGGCTGCTCGTGCTCCATGAGCTGCCCCAACCGGGTTGTCGAGCGAGGGCGAACCGTGCCGCTGCAGATATTCCGCACCCCCGATAGGGGCTGGAGTACACGCCCAGGCGGCCATCAAAAAGGGCCAGTTCGTCGACCGCTACTACGGCGAAATCATCACCTCGGCCGAGGCCGACCGCCGGCGCACCGCCGCCGCCTTCTCCCAGCGCAAGGACGTCTACCTCTTCGCCCTCGACAAGTTCACCGACCCGGACTCGCTGGACGCGCGCCTCCGGGGCCCGCCGCTCGAGGTCGACGGCGAGTTCCAGTCGGGCCCGACGCGCTTCATCAACCACTCGTGCGAGCCCAACCTGCGCATCTTTGCGCGCGTCGGCGACCACGCCGACAAGCACATTCACGACCTGGCGCTCTTTGCCATCAGGGACATTCCCAGGGGGGAGGAGCTGACGTTTGATTACGTCGACGGGGTGATGACGGGGGACTTGGCCGGGATGGAGGAGCAGGAGGCGCATGGCGAGATGGCCAAGTGTTTGTGCGGGAGCCGCAAGTGCAGGGGATATCTGTGGTGA |
SEQ ID NO : 3 | meavtrqhff fhdqpeyaaq reschfcqlr afpahktipv tivnevdqav ippnfrfvdr mvlrrgvepa edsfrsgcsc esddacqytg clcladlddq dsgsdeddde dddegndafh ianqlngddf eaaaakkkkm kkkdrtkrka yayhshgaka gllrskmlns keplyechag cscsmscpnr vvergrtvpl qifrtpdrgw gvhaqaaikk gqfvdryyge iitsaeadrr rtaaafsqrk dvylfaldkf tdpdsldarl rgpplevdge fqsgptrfin hscepnlrif arvgdhadkh ihdlalfair diprgeeltf dyvdgvmtgd lagmeeqeah gemakclcgs rkcrgylw* |
SEQ ID NO : 4 | ATAAAGATTGTCGAGTGGGC |
SEQ ID NO : 5 | GCTTCATTCTCATAACGCGT |
SEQ ID NO : 6 | GGGTTGGATGATGCGGTTTG |
SEQ ID NO : 7 | AGGTCAGATGGAAGTGTGCG |
SEQ ID NO : 8 | GCACAGCTGGCTAGATCGAT |
SEQ ID NO : 9 | CGAGACTGAGGAATCCGCTC |
SEQ ID NO : 10 | ATAAAGATTGTCGAGTGGGCATTCAGACGGGTATGGATATGTTGCTCTCTTTGTCAGTTTGTATAAGAGAGCTTGACCGGCATTGATGAGAATGATTCACTACCTCGGAAACCCGCCACAAGCGGAATACAAGGGGAAAACGCATTGTACTAGGCCATTAGCTAAAACCAAACAACGAGAAAGAAGTCAGAATAGAATCA |
SEQ ID NO : 11 | GGTGGGGCAGTGCTAGTGTGTGTACCGACCCGCAGGATTGGTGCTTTGCCCAGAGCTCTACAGAATAGCGCGCGCATCCATATGTTAGTTCTGCAATTTTCTTGTATCGGTGCTGTGACTCATACTTCCCCCTTTGGCTGGCCTTGCGGCAACCAATAAGAACGCACAGTGAAATCTTGCGGGTGGGGAGTGCATGGCGCCTGCATTGGCTTGGGGACGCGCACTGTCGCACACTTCCATCTGACCTTTCAGAAGGGTTTCGTGGTGGGCAAGGACCAACCGGTTGCGCGGCCGTGCGTGGGTGCCTCGCCCGGCACTGCCAGGGCCACTGCAGTGGCAGTTTGCTGCCTGATACAAAATCCTTCCCTCCGCCCAGTTTTCCCTCTTTGACCTTCCTTTCTCTTCTCTGCAACCAAATCCACCCTATCAAACCAAAACAGTGTCTCGACCGAGGTATCAACCTGAATCAGCAACATCGTAGCCAGCATTTGTCTCCGTCTCTGCAGAACCAGCGAGTTGCAAACATTATCCAGGCAACAGGGCACCAACTCACTTCTTCGGCTTTCACCAATCGGTACAGCTCTTCTCAGAACTCGCGTCCGCAACAGTTCTACGCTTCCTCAGCACCTTCTTCAGCTTCAATCCTGAACACTCAGAACCGCGCACAGCAGCGCCCTCCTGTTCCCTTGTTTCCCAAAAGTACCGGTAGTATTTCGCACGGAAAGCAGGGCAACACGTAAGTGATATCTACTAGTTGTGACCGGCGCCTAGTGTTGACAATTAATCATCGGCATAGTATATCGGCATAGTATAATACGACTCACTATAGGAGGGCCACCATGTCGACTACTAACCTTCTTCTCTTTCCTACAGCTGAGATCACCGGTAGGAGGGCCATCATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCGACGTCTGTCGCGAAGTTTCTGATCGAAAAGTTCGACAGCGTCTCCGACCTGATGCAGCTCTCGGAGGGCGAAGAATCTCGTGCTTTCAGCTTCGATGTAGGAGGGCGTGGATATGTCCTGCGGGTAAATAGCTGCGCCGATGGTTTCTACAAAGATCGTTATGTTTATCGGCACTTTGCATCGGCCGCGCTCCCGATTCCGGAAGTGCTTGACATTGGGGAATTCAGCGAGAGCCTGACCTATTGCATCTCCCGCCGTGCACAGGGTGTCACGTTGCAAGACCTGCCTGAAACCGAACTGCCCGCTGTTCTGCAACCCGTCGCGGAGCTCATGGATGCGATCGCTGCGGCCGATCTTAGCCAGACGAGCGGGTTCGGCCCATTCGGACCGCAAGGAATCGGTCAATACACTACATGGCGTGATTTCATATGCGCGATTGCTGATCCCCATGTGTATCACTGGCAAACTGTGATGGACGACACCGTCAGTGCGTCCGTCGCGCAGGCTCTCGATGAGCTGATGCTTTGGGCCGAGGACTGCCCCGAAGTCCGGCACCTCGTGCACGCGGATTTCGGCTCCAACAATGTCCTGACGGACAATGGCCGCATAACAGCGGTCATTGACTGGAGCGAGGCGATGTTCGGGGATTCCCAATACGAGGTCGCCAACATCTTCTTCTGGAGGCCGTGGTTGGCTTGTATGGAGCAGCAGACGCGCTACTTCGAGCGGAGGCATCCGGAGCTTGCAGGATCGCCGCGGCTCCGGGCGTATATGCTCCGCATTGGTCTTGACCAACTCTATCAGAGCTTGGTTGACGGCAATTTCGATGATGCAGCTTGGGCGCAGGGTCGATGCGACGCAATCGTCCGATCCGGAGCCGGGACTGTCGGGCGTACACAAATCGCCCGCAGAAGCGCGGCCGTCTGGACCGATGGCTGTGTAGAAGTACTCGCCGATAGTGGAAACCGACGCCCCAGCACTCGTCCGAGGGCAAAGGAATGACCGGAGTTGAGACAAATGGTGTTCAGGATCTCGATAAGATACGTTCATTTGTCCAAGCAGCAAAGAGTGCCTTCTAGTGATTTAATAGCTCCATGTCAACAAGAATAAAACGCGTTTCGGGTTTACCTCTTCCAGATACAGCTCATCTGCAATGCATTAATGCATTGGACCTCGCAACCCTAGTACGCCCTTCAGGCTCCGGCGAAGCAGAAGAATAGCTTAGCAGAGTCTATTTTCATTTTCGGGAGACGAGATCAAGCAGATCAACGGTCGTCAAGAGACCTACGAGACTGAGGAATCCGCTCTTGGCTCCACGCGACTATATATTTGTCTCTAATTGTACTTTGACATGCTCCTCTTCTTTACTCTGATAGCTTGACTATGAAAATTCCGTCACCAGCCCCTGGGTTCGCAAAGATAATTGCACTGTTTCTTCCTTGAACTCTCAAGCCTACAGGACACACATTCATCGTAGGTATAAACCTCGAAAATCATTCCTACTAAGATGGGTATACAATAGTAACCATGCATGGTTGCCTAGTGAATGCTCCGTAACACCCAATACGCCGGCCGAAACTTTTTTACAACTCTCCTATGAGTCGTTTACCCAGAATGCACAGGTACACTTGTTTAGAGGTAATCCTTCTTTCTAG |
SEQ ID NO : 12 | GGCTGGCTGAGTTGCTCACTTGACGGATGCGCCTGTGCTGTTGAGGGTTCTTATGAGATGGAGTATCCGGTCATCAACCATAACCTCCTGAATCAGTCGTAAAGATAAATGGCTGTTCAATGGTGAAATTGTATCAAATTAAAGTACGAGGCAGAACGGTAGTAACAGCACTGAGCCAGGACGCGTTATGAGAATGAAGC |
SEQ ID NO : 13 | GCCATCAGGGACATTCCCAG |
Smith KM, Kothe GO, Matsen CB, Khlafallah TK, Adhvaryu KK, Hemphill M, Freitag M, Motamedi MR, Selker EU. The fungus Neurospora crassa displays telomeric silencing mediated by multiple sirtuins and by methylation of histone H3 lysine 9. Epigenetics Chromatin. 2008 Nov 3;1(1):5. doi: 10.1186/1756-8935-1-5
Honda S, Selker EU. Direct interaction between DNA methyltransferase DIM-2 and HP1 is required for DNA methylation in Neurospora crassa. Mol Cell Biol. 2008 Oct;28(19):6044-55. doi: 10.1128/MCB.00823-08.
Delabona PDS, Codima CA, Ramoni J, Zubieta MP, de Araújo BM, Farinas CS, Pradella JGDC, Seiboth B. The impact of putative methyltransferase overexpression on the Trichoderma harzianum cellulolytic system for biomass conversion. Bioresour Technol. 2020 Oct;313:123616. doi: 10.1016/j.biortech.2020.123616.
Seiboth B, Karimi RA, Phatale PA, Linke R, Hartl L, Sauer DG, Smith KM, Baker SE, Freitag M, Kubicek CP. The putative protein methyltransferase LAE1 controls cellulase gene expression in Trichoderma reesei. Mol Microbiol. 2012 Jun;84(6):1150-64. doi: 10.1111/j.1365-2958.2012.08083.x.
Tamaru, H., and Selker, E.U. (2001) A histone H3 methyltransferase controls DNA methylation in Neurospora crassa. Nature 414: 277–283.
Ogunmolu, F.E., Jagadeesha, N.B.K., Kumar, R., Kumar, P., Gupta, D., and Yazdani, S.S. (2017) Comparative insights into the saccharification potentials of a relatively unexplored but robust Penicillium funiculosum glycoside hydrolase 7 cellobiohydrolase.Biotechnology for Biofuels 10: 71.
Park, A.-R., Hong, J.H., Kim, J.-J., and Yoon, J.-J. (2012) Biochemical Characterization of an Extracellular β-Glucosidase from the Fungus, Penicillium italicum, Isolated from Rotten Citrus Peel.Mycobiology 40: 173–180.
Exemples
Exemple 1
: Invalidation du gène Tr
dim5
dans la souche hyper-productrice RutC30 de
T. reesei
La souche Rut-C30 a été transformée avec une cassette d’invalidation représentée par SEQ ID NO : 1 contenant un gène de résistance à l’hygromycine et les régions flanquantes du gène Trdim5( ). L’intégration des cassettes par recombinaison homologue a été facilitée par l’utilisation de la technologie CRISPR-Cas9. L’ARN guide ciblant le gène à déléter (SEQ ID NO : 13) et la protéine Cas9 sont assemblésin vitro.L’intégration de la cassette d’invalidation a été validée par PCR ( ). Elle peut également l’être par Southern. Les sites de restrictions choisis ici pour analyser les mutants Δdim5 sont BamHI et EcoRI.
La transformation de la souche peut également être réalisée selon les techniques décrites dans l’exemple 1 de la demande WO 2021/111090.
Exemple 2
: Phénotype des souches Rut-C30 invalidé pour le gène Tr
dim5
a.
Analyses de la production et activité enzymatique des transformants
Afin d’étudier l’impact de l’invalidation du gène Trdim5sur la production de protéines, une première étude a été réalisée sur 6 transformants (appelés transformants 12, 13, 21, 23, 39 et 47). Les transformants ont été cultivés sur un milieu induisant la production de cellulases. Après une semaine de culture, le surnageant a été utilisé pour réaliser des dosages de protéines (dosage de Bradford) et d’activités enzymatiques (activité pNPL et activité pNPG). Chaque analyse a été réalisée en duplicat de cultures (biologique) et en duplicat technique.
Le dosage des protéines permet une estimation et une comparaison de la production enzymatique des mutants.
Trois grandes familles d’enzymes sont nécessaires à la dégradation de la cellulose en sucres monomères fermentables : l’endo-1,4- β-D-glucanase, les cellobiohydrolases, et la β-glucosidase. Le pNPL (p-Nitrophenyl β-D-Lactopyranoside) est un substrat chromogène utilisé pour déterminer l’activité de la CBH1 (pour cellobiohydrolase 1, aussi appelée cellulose 1,4-β-cellobiosidase) (Ogunmolu et al., 2017). Le pNPG, (p-Nitrophenyl β-D- Glucopyranoside) est également un substrat chromogène, qui permet quant à lui de mesurer l’activité de la β-glucosidase (Park et al., 2012). Ces deux mesures d’activités permettent donc d’évaluer le potentiel enzymatique des mutants obtenus, notamment dans le cadre de la production de bioéthanol de deuxième génération. Ces deux enzymes ne sont pas les seules à être utilisées par le champignon dans ce procédé de dégradation, mais elles sont considérées comme représentatives du cocktail enzymatique.
Les résultats sont présentés en . Une production plus importante est ainsi observée chez les mutants, mais il existe une hétérogénéité sur les niveaux de productions. Celle-ci pourrait provenir de la dérégulation de mécanismes épigénétiques.
Deux souches parmi les six ont ensuite été sélectionnées afin de vérifier l’activité enzymatique. Les résultats sont présentés en . Les mesures des deux activités enzymatiques β glucosidase (pNPG) et endoglucanase (pNPL) montrent qu’il existe une corrélation entre la production accrue de protéines et les activités mesurées.
b. Analyses des transformants en présence de différents inducteurs.
La production de protéines d’un transformant en présence de différentes sources de carbone a été testée. Les résultats sont présentés en , et montrent une amélioration de la production sur tous les milieux testés.
Claims (15)
- Souche de champignon appartenant à l’espèceTrichoderma reeseidans laquelle le gène Trdim5a été invalidé.
- Souche de champignon selon la revendication 1, dans laquelle le gène Trdim5a été invalidé par mutagénèse ou par recombinaison homologue, notamment à l’aide d’une cassette d’invalidation telle que représentée par la SEQ ID NO : 1.
- Souche de champignon selon l’une quelconque des revendications 1 à 2, dans laquelle le gène Trdim5correspond à un gène représenté par la SEQ ID NO : 2 ou un gène ayant au moins 90% d’identité avec le gène de SEQ ID NO : 2, notamment au moins 95% et plus particulièrement au moins 98%.
- Procédé de modification génétique d’une souche de champignon selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, comprenant une étape d’invalidation du gène Trdim5.
- Procédé de modification génétique d’une souche de champignon selon la revendication 4, dans lequel l’étape d’invalidation du gène Trdim5est réalisée par mutagénèse, par recombinaison homologue ou plus préférentiellement à l’aide d’une cassette d’invalidation représentée par la SEQ ID NO : 1.
- Procédé de production de biomasse de champignon, comprenant une étape de culture d'une souche de champignon selon l’une quelconque des revendications 1 à 3 dans un milieu de culture comprenant un substrat approprié.
- Procédé de production de protéines d’intérêt, notamment des enzymes, comprenant une étape de culture d'une souche de champignon selon l’une quelconque des revendications 1 à 3 dans un milieu de culture comprenant un substrat approprié.
- Procédé de production de produits biosourcés à partir de substrats cellulosiques ou lignocellulosiques, comprenant une étape d’utilisation de la souche de champignon selon l’une quelconque des revendications 1 à 3 pour produire des enzymes cellulolytiques.
- Procédé de production de sucre à partir de substrats cellulosiques ou lignocellulosiques, comprenant :
- i) une étape de prétraitement d'un substrat cellulosique ou lignocellulosique afin d’obtenir un substrat prétraité,
- ii) une étape d’utilisation de la souche selon l’une quelconque des revendications 1 à 3 pour produire des enzymes cellulolytiques,
- iii) une étape d'hydrolyse enzymatique du substrat prétraité, en présence des enzymes cellulolytiques obtenues à l’étape ii) et d'un substrat approprié, afin d’obtenir un hydrolysat. - Procédé de production d’alcool à partir de substrats cellulosiques ou lignocellulosiques, comprenant une étape d’utilisation de la souche de champignon selon l’une quelconque des revendications 1 à 3 pour produire des enzymes cellulolytiques.
- Procédé de production d'un d’alcool à partir de substrats cellulosiques ou lignocellulosiques selon la revendication 10, comprenant :
- i) une étape de prétraitement d'un substrat cellulosique ou lignocellulosique afin d’obtenir un substrat prétraité,
- ii) une étape d’utilisation de la souche selon l’une quelconque des revendications 1 à 3 pour produire des enzymes cellulolytiques,
- iii) une étape d'hydrolyse enzymatique du substrat prétraité, en présence des enzymes cellulolytiques obtenues à l’étape ii) et d'un substrat approprié, afin d’obtenir un hydrolysat,
- iv) une étape de fermentation alcoolique de l'hydrolysat obtenu, l’étape iv) étant optionnellement réalisée en simultané avec l’étape iii).
- v) une étape de séparation, notamment par distillation. - Utilisation d’une souche de champignon selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, pour la production de protéines d’intérêt, plus particulièrement des enzymes, notamment des enzymes cellulolytiques telles que des cellulases.
- Utilisation d’une souche de champignon selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, pour l'hydrolyse de la cellulose ou de la lignocellulose en glucose.
- Utilisation d’une souche de champignon selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, pour la production de produits biosourcés à partir de substrats cellulosiques ou lignocellulosiques.
- Utilisation d’une souche de champignon selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, pour la production d’alcool à partir de substrats cellulosiques ou lignocellulosiques.
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