JP5878396B2 - 新規プロモーター及びその利用 - Google Patents
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Description
本発明は、耐熱性酵母において機能する新規プロモーター及びその利用に関する。
サッカロマイセス セルビシエ（Saccharomyces cerevisiae）に代表される酵母は、その発酵能を利用した食品工業に使用されたり、各種物質生産の宿主として広く利用されており、また、遺伝子工学における主要な研究対象となっている。酵母としては、サッカロマイセス セルビシエ以外にも、比較的に至適温度範囲が高温域にあるような酵母（耐熱性酵母を呼称する場合もある）が知られている。
このような耐熱性酵母を利用すると比較的に高温域に反応系を維持できるため、コンタミネーションを防止することができる。また、生産対象の物質や反応系によっては、比較的に高温域にて酵母を培養する必要がある。このような場合には特に耐熱性酵母を利用することが好適であると言える。
ところで、一般的に酵母において、所定の遺伝子を発現させる場合、恒常的に高発現を可能とするようなプロモーターを使用する。酵母において使用可能なプロモーターとしては、例えば、TDH3プロモーター、ADH1プロモーター及びTEF1プロモーター等が知られている。また、非特許文献１には、TDH3プロモーターを利用してセルラーゼ遺伝子を耐熱性酵母において発現させたことが記載されている。
しかしながら、上述した各種プロモーターは、サッカロマイセス セルビシエといった通常の酵母において下流の遺伝子を恒常的に高発現させることができるが、耐熱性酵母を宿主とした場合には下流の遺伝子の発現量が十分ではなかった。すなわち、従来、耐熱性酵母において所望の遺伝子を高発現できるプロモーターは知られていなかった。
Jiong Hong et al., Journal of Biotechnology 130 (2007) 114-123
そこで、本発明は、上述した実情に鑑み、特に耐熱性酵母において所望の遺伝子を高発現できる新規プロモーターを提供することを目的とする。
上記目的を達成するため、本発明者らが鋭意検討した結果、耐熱性酵母において所望の遺伝子を高発現できる新規なプロモーターを同定することに成功し、本発明を完成するに至った。本発明は以下を包含する。
（１）クリベロマイセス・マルキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）の染色体におけるPIR1遺伝子の上流に位置し、当該PIR1遺伝子の発現を制御している領域からなるプロモーター。
（２）クリベロマイセス・マルキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）の染色体におけるCTR1遺伝子の上流に位置し、当該CTR1遺伝子の発現を制御している領域からなるプロモーター。
（２）クリベロマイセス・マルキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）の染色体におけるCTR1遺伝子の上流に位置し、当該CTR1遺伝子の発現を制御している領域からなるプロモーター。
（３）少なくとも、配列番号１に示す塩基配列の3'末端側の１０００塩基を含む塩基配列からなることを特徴とする（１）記載のプロモーター。
（４）少なくとも、配列番号１に示す塩基配列の3'末端側の２０００塩基を含む塩基配列からなることを特徴とする（１）記載のプロモーター。
（４）少なくとも、配列番号１に示す塩基配列の3'末端側の２０００塩基を含む塩基配列からなることを特徴とする（１）記載のプロモーター。
（５）少なくとも、配列番号２に示す塩基配列の3'末端側の３８４塩基を含む塩基配列からなることを特徴とする（２）記載のプロモーター。
（６）少なくとも、配列番号２に示す塩基配列の3'末端側の４２９塩基を含む塩基配列からなることを特徴とする（２）記載のプロモーター。
（６）少なくとも、配列番号２に示す塩基配列の3'末端側の４２９塩基を含む塩基配列からなることを特徴とする（２）記載のプロモーター。
（７）（１）乃至（６）いずれか一記載のプロモーターを含む核酸構築物。
（８）（１）乃至（６）いずれか一記載のプロモーターを含む発現ベクター。
（９）上記プロモーターの下流に位置する遺伝子を更に含むことを特徴とする（８）記載の発現ベクター。
（８）（１）乃至（６）いずれか一記載のプロモーターを含む発現ベクター。
（９）上記プロモーターの下流に位置する遺伝子を更に含むことを特徴とする（８）記載の発現ベクター。
（１０）（１）乃至（６）いずれか一記載のプロモーターを所望の遺伝子の上流に組み入れた形質転換体。
（１１）上記所望の遺伝子が外来性の遺伝子であることを特徴とする（１０）記載の形質転換体。
（１１）上記所望の遺伝子が外来性の遺伝子であることを特徴とする（１０）記載の形質転換体。
（１２）耐熱性酵母を宿主細胞とすることを特徴とする（１０）記載の形質転換体。
（１３）セルロース系バイオマスを糖化し、且つエタノール発酵能を有することを特徴とする（１０）記載の形質転換体。
（１３）セルロース系バイオマスを糖化し、且つエタノール発酵能を有することを特徴とする（１０）記載の形質転換体。
（１４）（１０）乃至（１３）いずれか一記載の形質転換体を培養し、培養後の培地及び/又は形質転換体内より目的物質を回収する、物質の製造方法。
（１５）上記目的物質は、セルロース系バイオマスを糖化してなる糖類からエタノール発酵により合成されたエタノールであることを特徴とする（１４）記載の物質の製造方法。
（１５）上記目的物質は、セルロース系バイオマスを糖化してなる糖類からエタノール発酵により合成されたエタノールであることを特徴とする（１４）記載の物質の製造方法。
本発明に係るプロモーターによれば、下流に位置する遺伝子を耐熱性酵母においても高発現させることができる。特に、本発明に係るプロモーターを利用することによって、耐熱性酵母において所望の遺伝子の発現量を増大させることができる。
また、本発明に係る物質の製造方法によれば、上記プロモーターを利用することで、所定の遺伝子の発現量が向上することにより、目的物質について優れた生産性を達成することができる。すなわち、本発明に係る物質の製造方法は、上記プロモーターにより発現が促進される遺伝子によりコードされるタンパク質及び/又は当該タンパク質が関与する各種物質の生産性を大幅に向上することができる。
以下、本発明を図面及び実施例を用いてより詳細に説明する。
本発明に係るプロモーターは、クリベロマイセス・マルキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）におけるPIR1遺伝子のプロモーター及びCTR1遺伝子のプロモーターである。クリベロマイセス・マルキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）におけるPIR1遺伝子のプロモーターとは、クリベロマイセス・マルキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）の染色体上における、PIR1遺伝子の発現を制御している領域を意味する。同様に、クリベロマイセス・マルキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）におけるCTR1遺伝子のプロモーターとは、クリベロマイセス・マルキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）の染色体上における、CTR1遺伝子の発現を制御している領域を意味する。
本発明に係るプロモーターは、クリベロマイセス・マルキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）におけるPIR1遺伝子のプロモーター及びCTR1遺伝子のプロモーターである。クリベロマイセス・マルキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）におけるPIR1遺伝子のプロモーターとは、クリベロマイセス・マルキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）の染色体上における、PIR1遺伝子の発現を制御している領域を意味する。同様に、クリベロマイセス・マルキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）におけるCTR1遺伝子のプロモーターとは、クリベロマイセス・マルキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）の染色体上における、CTR1遺伝子の発現を制御している領域を意味する。
PIR1遺伝子は、サッカロマイセス セルビシエ（Saccharomyces cerevisiae）において転写因子Swi5pにより制御される遺伝子として知られている（Overlapping and distinct roles of the duplicate yeast transcription factors Ace2p and Swi5p,Marie-Therese Doolin et al., Molecular Microbiology (2001) 40(2),422-432）。また、PIR1遺伝子は、細胞壁を構成する糖タンパク質をコードすることが知られている。なお、転写因子Swi5は細胞周期に関係する遺伝子の転写を制御ことが知られている（Distinct Regions of the Swi5 and Ace2 Transcription Factors Are Required for Specific Gene Activation、Helen J. McBride et al., Vol. 274, No. 30, Issue of July 23, pp. 21029-21036, 1999）。
また、CTR1遺伝子は、サッカロマイセス セルビシエ（Saccharomyces cerevisiae）において銅イオンのトランスポーターをコードする遺伝子として知られている（Copper Ion-sensing Transcription Factor Mac1p Post-translationally Controls the Degradation of Its Target Gene Product Ctr1p*, Jesse Yonkovich et al,THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, Vol. 277, No. 27, Issue of July 5, pp. 23981-23984, 2002）。
本発明に係るプロモーターは、下流に位置する遺伝子の発現を制御できればよく、クリベロマイセス・マルキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）におけるPIR1遺伝子の上流又はCTR1遺伝子の上流に存在する如何なる領域でもよい。一例として、クリベロマイセス・マルキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）におけるPIR1遺伝子の上流2873塩基からなる領域の塩基配列を配列番号１に示す。なお、配列番号１の塩基配列は、５’末端から３’末端に向かって記載されている。よって、クリベロマイセス・マルキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）におけるPIR1遺伝子は、配列番号１の塩基配列の下流側、すなわち３’末端側に位置することとなる。同様に、クリベロマイセス・マルキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）におけるCTR1遺伝子の上流840塩基からなる領域の塩基配列を配列番号２に示す。なお、配列番号２の塩基配列もまた５’末端から３’末端に向かって記載されている。よって、クリベロマイセス・マルキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）におけるCTR1遺伝子は、配列番号２の塩基配列の下流側、すなわち３’末端側に位置することとなる。
より具体的に、本発明に係るプロモーターのうちクリベロマイセス・マルキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）におけるPIR1遺伝子の上流のプロモーターとしては、当該PIR1遺伝子の上流１０００塩基（すなわち、配列番号１の塩基配列における3'末端側の１０００塩基）を含む領域からなることが好ましく、当該PIR1遺伝子の上流２０００塩基（すなわち、配列番号１の塩基配列における3'末端側の２０００塩基）を含む領域からなることがより好ましい。PIR1遺伝子の上流１０００塩基を含む領域は、特に優れた発現促進活性を示すプロモーターとして使用することができる。また、PIR1遺伝子の上流２０００塩基を含む領域は、更に優れた発現促進活性を示すプロモーターとして使用することができる。
また、クリベロマイセス・マルキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）におけるPIR1遺伝子の上流のプロモーターとしては、配列番号１に示す塩基配列を含む領域であることが最も好ましい。配列番号１に示す塩基配列を含む領域は、最も高い転写促進活性を示すプロモーターとして使用することができる。
一方、本発明に係るプロモーターのうちクリベロマイセス・マルキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）におけるCTR1遺伝子の上流のプロモーターとしては、当該CTR1遺伝子の上流３８４塩基から更に上流領域を含むことが好ましい。すなわち、CTR1遺伝子の上流のプロモーターとしては、配列番号２の塩基配列における3'末端から数えて３８４番目の塩基から5'末端側の領域を含むことが好ましい。特に、CTR1遺伝子の上流のプロモーターとしては、配列番号２の塩基配列における3'末端から数えて３８４番目の塩基から４２９番目の塩基までの領域を含むことが好ましい。CTR1遺伝子の上流におけるこれらの領域は、特に高い転写促進活性を示すプロモーターとして使用することができる。
また、本発明に係るプロモーターは、上述のように配列番号１及び２に示した塩基配列を基準として規定できるが、基準となる塩基配列は配列番号１及び２に限定されるものではない。例えば、配列番号１又は２に示した塩基配列に対して８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の一致度を有するポリヌクレオチドであって、プロモーター活性を有するポリヌクレオチドの塩基配列を基準としても良い。すなわち、本発明に係るプロモーターは、配列番号１に示した塩基配列に対して８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の一致度を有する塩基配列、又は当該塩基配列のうち３’末端側の１０００塩基の領域、好ましくは２００塩基とすることができる。
さらに、本発明に係るプロモーターは、配列番号２に示した塩基配列に対して８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の一致度を有する塩基配列、又は当該塩基配列のうち3'末端から数えて３８４番目の塩基から5'末端側の領域、好ましくは3'末端から数えて３８４番目の塩基から４２９番目の塩基までの領域とすることができる。
なお、一致度の値は、配列類似性を検索するプログラム（相同性検索プログラムと称される場合もある）を用いて、配列番号１又は２の塩基配列と他の塩基配列とをアライメントした際に、当該他の塩基配列における、配列番号１又は２の塩基配列に対して一致した塩基の割合として算出される値である。
さらに、本発明に係るプロモーターは、上述のように配列番号１及び２に示した塩基配列を基準として規定できるが、基準となる塩基配列は配列番号１及び２に限定されるものではない。例えば、配列番号１又は２に示した塩基配列における１又は複数個の塩基が置換、欠失、付加又は挿入された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、プロモーター活性を有するポリヌクレオチドの塩基配列を基準としても良い。ここで、複数個の塩基とは、例えば２〜２００個の塩基を意味し、好ましくは２〜１００個、より好ましくは２〜５０個、最も好ましくは２〜２５個のアミノ酸を意味する。
さらにまた、本発明に係るプロモーターは、例えば、配列番号１又は２に示した塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドの一部又は全部に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、プロモーター活性を有するポリヌクレオチドの塩基配列を基準としても良い。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするとは、６０℃で２×ＳＳＣ洗浄条件下で結合を維持することを意味する。ハイブリダイゼーションは、J. Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual,2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory(1989)に記載されている方法等、従来公知の方法で行うことができる。
なお、所定の塩基配列を有するポリヌクレオチドがプロモーター活性を有するか否かは、適当な宿主を用いたレポーターアッセイにより検証することができる。ここで、適当な宿主としては、クリベロマイセス・マルキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）といった耐熱性酵母を使用することが好ましいが、サッカロマイセス セルビシエ（Saccharomyces cerevisiae）等の酵母を使用することもできる。レポーターアッセイに使用するレポーター遺伝子としては、何ら限定されず、例えば、ルシフェラーゼ（LUC)遺伝子やβ-グルクロニダーゼ（GUS)遺伝子を使用することができる。これらレポーター遺伝子を用いたアッセイも、従来公知のプロトコルを適宜改変して使用することができる。
以上に説明した、本発明に係るプロモーターは、下流に配置された遺伝子の発現を制御する機能を有する。なお、下流とは、転写方向、すなわちセンス鎖における5'側から3'側に向かう方向を意味する。本発明に係るプロモーターを利用することによって、耐熱性酵母においても転写活性に優れた発現制御領域を有する核酸構築物を提供することができる。なお、核酸構築物には、上述したプロモーターの他に、当該プロモーターの転写活性を向上させるようなシス作用エレメントが含まれていても良い。この核酸構築物は、例えば、両末端に制限酵素認識配列を有するように構築することもできる。また、この核酸構築物は、例えば、従来公知の発現ベクターに組み込むこともできる。すなわち、上述した本発明に係るプロモーターを、所望の遺伝子の発現を可能とする発現ベクターに組み込むことで、当該遺伝子を耐熱性酵母で高発現できる発現ベクターを提供できる。
この発現ベクターは、主として宿主細胞の形質転換に使用する従来公知のあらゆる発現ベクターに対して、上述したプロモーターを組み込むことで作製することができる。また、上述したプロモーターを有する発現ベクターは、宿主細胞の染色体に導入する形態や染色体外に保持する形態のいずれであっても良い。また、発現ベクターとしては、プラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクター等のいずれであっても良い。なお、発現ベクターには、上述したプロモーターの他に、エンハンサー、選択マーカー、複製開始点、マルチプルクローニングサイト等を備えることができる。
また、この発現ベクターを、耐熱性酵母を含む酵母に対する形質転換に使用する場合、当該発現ベクターに所望の遺伝子を組み込むことで、組換えベクターを作製することができる。この組換えベクターを用いて宿主細胞を形質転換することで、宿主細胞内において当該遺伝子が高レベルで転写されることとなる。ここで宿主細胞としては、特に限定されないが、耐熱性酵母を含む酵母であることが好ましく、特に耐熱性酵母とすることがより好ましい。
ここで、選択マーカーとは、発現ベクターの導入の目印として導入する遺伝子であり、通常、蛍光タンパク質や呈色反応を示す酵素をコードする遺伝子、宿主の栄養要求性を相補する遺伝子及び薬剤耐性遺伝子が使用されている。本発明においても、これら通常の選択マーカー遺伝子を使用して発現ベクターを構築することができる。
宿主として用いることができる酵母としては、特に限定するものではないが特に耐熱性酵母を使用することが好ましい。耐熱性酵母とは、後述する一般的な酵母と比較して高温域で増殖可能である酵母を意味する。増殖可能温度としては、所定の増殖速度を維持できる高温限界温度として定義することもできる。より具体的に耐熱性酵母とは、増殖可能温度が40℃以上、好ましくは42℃以上、より好ましくは45℃以上である酵母と定義することもできる。
耐熱性酵母としては、特に限定されないが、例えば、クリベロマイセス・マルキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）、ハンセヌラ・ポリモリファ（Hansenula polymorpha）、キャンディダ・グラブラタ（Candida glabrata）、イサトケンキア・オリエンタリス（Issatchenkia orientalis）及びデバリオマイセス・ハンセニイ（Debaryomyces hansenii）等を例示することができる。
また、宿主として用いることができる酵母としては、上述した耐熱性酵母に限定されず、一般的な酵母を使用することもできる。一般的な酵母としては、例えば、Candida Shehatae、Pichia stipitis、Pachysolen tannophilus、Saccharomyces cerevisiae及びSchizosaccaromyces pombeなどの酵母が挙げられ、特にSaccharomyces cerevisiaeが好ましい。
本発明に係るプロモーターを含む発現ベクターを酵母に導入する方法としては、酵母の形質転換方法として知られている従来公知のいかなる手法をも適用することができる。具体的には、例えば、エレクトロポレーション法“Meth. Enzym., 194, p182 (1990)”、スフェロプラスト法“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929(1978)”、酢酸リチウム法“J.Bacteriology, 153, p163(1983)”、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929 (1978)、Methods in yeast genetics, 2000 Edition : A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manualなどに記載の方法で実施可能であるが、これに限定されない。
ところで、上述した本発明に係るプロモーターの下流に配置する遺伝子は、耐熱性酵母等の宿主酵母において発現させることを企図する遺伝子であり、特に限定されず、如何なるタンパク質をコードする遺伝子を対象とすることができる。例えば、遺伝子としては、セルロース系バイオマスの糖化に関与する各種酵素をコードする遺伝子や、当該バイオマスに由来する糖からのエタノール発酵に関与する各種酵素をコードする遺伝子を挙げることができる。より具体的に遺伝子としては、アルカリプロテアーゼ遺伝子、α−アミラーゼ遺伝子、アスコルビン酸オキシダーゼ遺伝子、アスパルチックプロテアーゼ遺伝子、セロビオヒドロラーゼ遺伝子、セルラーゼ遺伝子、クチナーゼ遺伝子、エンドグルカナーゼ遺伝子、グルコアミラーゼ、β−グルコシダーゼ遺伝子、グリオキサールオキシダーゼ遺伝子、ラッカーゼ遺伝子、リグニンオキシダーゼ遺伝子、リグニンペルオキシダーゼ遺伝子、リパーゼ遺伝子、マンガンペルオキシダーゼ遺伝子、1,2-α-マンノシダーゼ遺伝子、ヌクレアーゼ遺伝子、ペクチンリアーゼ遺伝子、ペクチンメチルエステラーゼ遺伝子、酸性ホスファターゼ遺伝子、ポリガラクチュロナーゼ遺伝子、キシラナーゼ遺伝子、β-キシロシダーゼ遺伝子等を挙げることができる。
さらに詳細に、バイオマスに由来する糖からのエタノール発酵に関与する各種酵素をコードする遺伝子としては、例えばキシロースの代謝に関与する酵素をコードする遺伝子（キシロース代謝関連遺伝子）を挙げることができる。キシロース代謝関連遺伝子とは、キシロースをキシリトールに変換するキシロースリダクターゼをコードするキシロースリダクターゼ遺伝子、キシリトールをキシルロースに変換するキシリトールデヒドロゲナーゼをコードするキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子及びキシルロースをリン酸化してキシルロース5-リン酸を生成するキシルロキナーゼをコードするキシルロキナーゼ遺伝子、あるいはキシロースをキシルロースに変換するキシロースイソメラーゼをコードするキシロースイソメラーゼ遺伝子を含む意味である。なお、キシルロキナーゼにより生成されたキシルロース5-リン酸は、ペントースリン酸経路に入り代謝されることとなる。
酵母ゲノムに導入されるキシロース代謝関連遺伝子としては、特に限定されないが、Pichia stipitis由来のキシロースリダクターゼ遺伝子及びキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子、Saccharomyces cerevisiae由来のキシルロキナーゼ遺伝子を挙げることができる（Eliasson A. et al., Appl. Environ. Microbiol, 66:3381-3386及びToivari MN et al., Metab. Eng. 3:236-249参照）。その他にも、キシロースリダクターゼ遺伝子としては、Candida tropicalisやCandida prapsilosis由来のキシロースリダクターゼ遺伝子を利用することができる。キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子としては、Candida tropicalisやCandida prapsilosis由来のキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子を利用することができる。キシルロキナーゼ遺伝子としては、Pichia stipitis由来のキシルロキナーゼ遺伝子を利用することもできる。なお、ストレプトマイセスムリナスクラスター由来のキシロースイソメラーゼ遺伝子等を利用することもできる。
バイオマスに由来する糖からのエタノール発酵に関与する各種酵素をコードする遺伝子としては、上述したキシロース代謝関連遺伝子以外にも、セロビオース、ガラクトース、ラクトース、マンノース及びスクロースといった糖分からのエタノール発酵に関与する各種酵素をコードする遺伝子でもよい。
一方、本発明に係るプロモーター及び耐熱性酵母等の酵母を利用することで、各種目的の物質を製造することができる。ここで、製造目的の物質とは、上記プロモーターにより高レベルに転写される遺伝子がコードするタンパク質、当該タンパク質が関与する物質のいずれも意味する。タンパク質が関与する物質とは、例えば、当該タンパク質が酵素として代謝経路に関与している場合の代謝産物を意味する。
ここで、生産対象のタンパク質としては、何ら限定されず、如何なる分子量、如何なる生物種由来、如何なる等電点、如何なるアミノ酸配列のタンパク質であっても良い。特に、生産対象のタンパク質としては、リゾチーム、キモシン、レクチン、インターロイキン、ラクトフェリン、抗Ｆａｓ抗体などの抗体医薬、ダニアレルゲン、花粉アレルゲン、木質バイオマス分解のためのセルロース分解酵素、サイトカイン等が高等生物由来の遺伝子によりコードされるタンパク質として例示できる。
また、タンパク質が関与する物質の一例として、上記タンパク質がセルラーゼである場合、培地に含まれるセルロースを基質とした糖化反応による糖分が挙げられる。また、本発明に係るプロモーターを利用して、エタノール発酵に関与する各種酵素をコードする遺伝子を耐熱性酵母において高発現させる場合には、エタノールが製造目的の物質となる。
なお、製造目的の物質が菌体外に分泌生産される場合には、菌体の破壊処理を行わず、定法に従って当該物質を回収できる。また、製造目的の物質が菌体内に生産される場合には、菌体を破壊処理した後、定法に従って当該物質を回収できる。なお、製造目的の物質がタンパク質である場合、培地の上清サンプルや菌体破壊処理後の上清サンプルを直接、当該技術分野で知られているドデシルナトリウム硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)で解析することにより測定できる。細胞培養中に生産された目的タンパク質は培地の中に分泌され、そして、例えば細胞培地から不要な成分を取り除くことにより、精製、又は、単離される。目的タンパク質の精製には、例えば、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、エタノール沈殿、逆相HPLC、シリカ上またはDEAEなどの陽イオン交換樹脂によるクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、SDS-PAGE、硫酸アンモニュウム沈殿法、ゲルろ過等の手法を単独で又は組み合わせて使用できる。
また、製造目的の物質がエタノールである場合、酵母を培養した培地からエタノールを回収する。エタノールの回収方法は、特に限定されず、従来公知のいかなる方法も適用することができる。例えば、上述したエタノール発酵が終了した後、固液分離操作によってエタノールを含む液層と、組換え酵母や固形成分を含有する固層とを分離する。その後、液層に含まれるエタノールを蒸留法によって分離・精製することで、純度の高いエタノールを回収することができる。なお、エタノールの精製度は、エタノールの使用目的にあわせて適宜調整することができる。
特に、本発明に係るプロモーターは、セルロース系バイオマスを用いた、いわゆる同時糖化発酵によるエタノール製造に利用されることが好ましい。このとき、本発明に係るプロモーターは、セルロース系バイオマスに含まれるキシロース等のグルコース以外の糖成分をエタノール発酵に利用する反応に関与する酵素をコードする遺伝子と連結され、当該遺伝子とともに耐熱性酵母に導入される（組換え耐熱性酵母）。なお、グルコース以外の糖成分としては、例えば、キシロース、セロビオース、ガラクトース、ラクトース、マンノース及びスクロースを挙げることができる。
なお、この同時糖化発酵とは、培地中に含まれるセルロースやヘミセルロース等の高分子多糖を低分子化する糖化反応と、糖化反応により生成した糖分（主として単糖）からエタノールを合成するエタノール発酵とが同時に進行する反応系を意味する。糖化反応とは、例えば、セルロース鎖に対してランダムに作用してセロオリゴ糖を生産するエンドグルカナーゼ、セルロース鎖の末端から作用してセロビオースを生産するセロビオヒドロラーゼI及びII、並びに生産されたオリゴ糖に対して作用して単糖であるグルコースを生産するβ-グルコシダーゼが関与する反応を意味する。なお、これらの酵素をまとめてセルラーゼと称する場合がある。同時糖化発酵における糖化反応には、市販されているセルラーゼ製剤を使用することができる。また、同時糖化発酵における糖化反応には、ヘミセルラーゼを加水分解して低分子化するヘミセルラーゼを使用することもできる。
本発明に係るプロモーター及び上述した遺伝子を導入した組換え耐熱性酵母は、生育至適温度である高温域にて同時糖化発酵に供することができる。すなわち、この生育至適温度である高温域において、上述した遺伝子を発現させることができるため、エタノール発酵によるエタノール生産性を向上させることができる。さらに、耐熱性酵母の生育至適温度である高温域は、上述したセルラーゼやヘミセルラーゼ等の反応速度が高い温度領域となっている。したがって、組換え耐熱性酵母の生育至適温度である高温域にて同時糖化発酵を行うことによって、糖化効率を向上させることができる。言い換えると、所期の糖化効率を達成するために必要な酵素量を低減することができる。このように、本発明に係るプロモーター及び上述した遺伝子を導入した組換え耐熱性酵母を用いた同時糖化発酵により、セルロース系バイオマスを用いたエタノール生産における低コスト化、及びエタノール収率の向上を達成できる。
なお、同時糖化発酵における温度条件は、上述した組換え耐熱性酵母の生育至適温度とすることが好ましいが、これに限定されるものではない。例えば、同時糖化発酵における温度条件は、20〜50℃とすることができ、30〜50℃とすることが好ましく、35〜45℃とすることがより好ましい。また、培養液のpHを4〜6とすることが好ましい。また、培養に際して、攪拌や振とうしてもよい。
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕
本実施例では、耐熱性酵母であるクリベロマイセス・マルキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）におけるPIR1遺伝子のプロモーター及びCTR1遺伝子のプロモーターを単離し、レポーターアッセイ法によりプロモーター活性を評価した。
〔実施例１〕
本実施例では、耐熱性酵母であるクリベロマイセス・マルキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）におけるPIR1遺伝子のプロモーター及びCTR1遺伝子のプロモーターを単離し、レポーターアッセイ法によりプロモーター活性を評価した。
先ず、定法に従ってKluyveromyces marxianusの染色体DNAを調製した。得られた染色体DNAを鋳型とし、KmCTR1-1085（TAGGATCAGGAGACAATCGATATTA（配列番号３））とCLuc+30c-KmCTR1-1c2（caaagcgacagccaagatcaaggtcttcatCTTGATTGTTCAATTGTCAATTGTC（配列番号４））をプライマーとしてKOD plus DNAポリメラーゼ（東洋紡）でPCRを行った。PCRの終了後、反応液を電気泳動に供し、目的のDNAバンドを取り出した。
また、定法に従ってSaccharomyces cerevisiaeのRAK4296株（MATa his3 ・200 leu2 ・0 met15 ・0 trp1Δ63 ura3 ・0::ScGAL10p-yCLuc-15C-LEU2）の染色体DNAを調製した。得られた染色体DNAを鋳型とし、yCLuc+1（ATGAAGACCTTGATCTTGGC（配列番号５））とURA3-280c（CAGTCTGTGAAACATCTTTCTAC（配列番号６））をプライマーとしてKOD plus DNAポリメラーゼでPCRを行った。PCRの終了後、反応液を電気泳動に供し、目的のDNAバンドを取り出した。
このようにして得られた２つのDNA断片を混合し、KmCTR1p-1086とURA3-280cのプライマーでFusion PCRを行った。これにより２つのDNA断片が融合したDNAを取得した。得られたDNA断片は、Kluyveromyces marxianusのCTR1遺伝子のプロモーターの下流にルシフェラーゼ遺伝子が融合した構成となっている。なお、このDNA断片には、選抜マーカー遺伝子としてURA3遺伝子が含まれている。
同様に、K. marxianusの染色体DNAを鋳型とし、KmPIR1-2867（GGAAAGAGTCGATGTGATTCGATGC（配列番号７））と10tg-KmPIR1-1c（tgtgtgtgtgtgtgtgtgtgTGTATAAATCGGGGTATGTG（配列番号８））をプライマーとしてKOD plus DNAポリメラーゼでPCRを行った。PCRの終了後、反応液を電気泳動に供し、目的のDNAバンドを取り出した。
また、S. cerevisiaeのRAK4296株の染色体DNAを鋳型とし、10CA-yCLuc+1（cacacacacacacacacacaATGAAGACCTTGATCTTGGC（配列番号９））とURA3-280cをプライマーとしてKOD plus DNAポリメラーゼでPCRを行った。PCRの終了後、反応液を電気泳動に供し、目的のDNAバンドを取り出した。
このようにして得られた２つのDNA断片を混合し、KmPIR1-2867とURA3-280cのプライマーでFusion PCRを行った。これにより２つのDNA断片が融合したDNAを取得した。得られたDNA断片は、Kluyveromyces marxianusのPIR1遺伝子のプロモーターの下流にルシフェラーゼ遺伝子が融合した構成となっている。なお、このDNA断片には、選抜マーカー遺伝子としてURA3遺伝子が含まれている。
一方、S. cerevisiaeにおけるTDH3遺伝子のプロモーターについても同様にレポーターアッセイ法によりプロモーター活性を評価した。ScTDH3プロモーター付のyCLuc（アトー株式会社）は、S. cerevisiae RAK4920株（MATa his3 ・200 leu2 ・0 met15 ・0 trp1Δ63 ura3 ・0::ScTDH3p-yCLuc-15C-LEU2）の染色体DNAを鋳型とし、URA3-290（GAGAAGGGCAACGGTTCATCATCTC（配列番号１０））と15G-yCLuc+1662c（gggggggggggggggCTACTTGCACTCATCTGGGA（配列番号１１））をプライマーとしてPCRを行った。PCRの終了後、反応液を電気泳動に供し、目的のDNAバンドを取り出した。また、S. cerevisiae BY4704株（MATa ade2・::hisG his3・200 leu2・0 lys2・0 met15・0 trp1・63）の染色体DNAを鋳型とし、15C-URA3-223（cccccccccccccccaagcttttcaattcatcttttttttttttg（配列番号１２））とURA3-280cをプライマーとしてPCRを行った。PCRの終了後、反応液を電気泳動に供し、目的のDNAバンドを取り出した。
このようにして得られた２つのDNA断片を混合し、URA3-290とURA3-280cのプライマーでFusion PCRを行った。これにより２つのDNA断片が融合したDNAを取得した。得られたDNA断片は、S. cerevisiaeにおけるTDH3遺伝子のプロモーターの下流にルシフェラーゼ遺伝子が融合した構成となっている。なお、このDNA断片には、選抜マーカー遺伝子としてURA3遺伝子が含まれている。
次に、上述のように得られた３種類のDNA断片それぞれを、RAK4174株（K. marxianus leu2- ura3-）に形質転換した。形質転換は以下のように行った。まず、YPD培地で28℃、1日、150rpmで振とう培養した培養液1.5mlを12,000rpmで1分間遠心分離した。上清を捨て、TF buffer（40% ポリエチレングリコール3350、0.2M 酢酸リチウム、0.1M Dithiothreitol）を200μl加え、撹拌混合を15秒間した後、12,000rpmで1分間遠心分離し、上清を捨てた。50μLのTF bufferに懸濁し、DNAを3μL加え、47℃で15分間ヒートショックを与えた。ウラシル欠損固体培地にまき28℃で3日間静置培養した。固体培地に生育したコロニーを無作為に選び、下記の要領で活性測定を行った。
PIR1遺伝子のプロモーターの下流にルシフェラーゼ遺伝子を融合した構成を有するDNA断片でRAK4174株を形質転換して得られた株をK. marxianus RAK5689株と命名した。また、CTR1遺伝子のプロモーターの下流にルシフェラーゼ遺伝子を融合した構成を有するDNA断片でRAK4174株を形質転換して得られた株をK. marxianus RAK5686株と命名した。
活性測定は、YPに各2％濃度の糖を含む培養液１ml、28℃、48時間培養し、その後サンプリングした培養液について実施した。測定は、CLuc測定キット (アトー株式会社)を用い、ルミノメーターGLOMAX 20/20 LUMINOMETER（プロメガ社）で測定した。なお、糖としては、グルコース、セロビオース、ガラクトース、ラクトース、マンノース、シュクロース及びキシロースを使用した。結果を図１に示した。なお、図１において、KmPIR1pはK. marxianusのPIR1プロモーターのプロモーター活性を示し、KmCTR1pはK. marxianusのCTR1プロモーターのプロモーター活性を示し、ScTDH3pはS. cerevisiaeのTDH3プロモーターのプロモーター活性を示している。
図１に示すように、K. marxianusのPIR1プロモーター及びK. marxianusのCTR1プロモーターは、一般的に高発現プロモーターとして使用されているS. cerevisiaeのTDH3プロモーターと比較して、K. marxianusにおいて優れたプロモーター活性を示すことが明らかとなった。また、これらK. marxianusのPIR1プロモーターとK. marxianusのCTR1プロモーターを比較すると、K. marxianusのPIR1プロモーターの方が如何なる糖を使用した場合でも優れたプロモーター活性を示すことがわかった。
ところで、本実施例では、K. marxianusに由来する更に多くのプロモーターについてそのプロモーター活性を評価した。具体的には、上述と同様にして調製したKluyveromyces marxianusの染色体DNA、及び下記表１のプライマーセットを用いてPCRを行い、電気泳動後、目的のDNAバンドを取り出した。また、Saccharomyces cerevisiaeのRAK4296株（MATa his3 ・200 leu2 ・0 met15 ・0 trp1Δ63 ura3 ・0::ScGAL10p-yCLuc-15C-LEU2）の染色体DNA、及びyCLuc+1とURA3-280cをプライマーとしてKOD plus DNAポリメラーゼでPCRを行い、電気泳動後、目的のDNAバンドを取り出した。このようにして得られた２つのDNA断片を混合し、Fusion PCRを行うことで２つのDNA断片が融合したDNAを取得した。取得したDNA断片を上述した手法と同様にしてK. marxianus RAK4174株に導入し、YPD培地でのプロモーター活性を測定した。
なお、表１において、遺伝子名の欄には、本実施例で使用したプロモーターに対応する遺伝子名を記載している。また、遺伝子名の欄における、アルファベット４文字と数字の組み合わせた表記については後述する参考実験に記載したとおりである。
これらプロモーターについてプロモーター活性を測定した結果を、上述したK. marxianusのPIR1プロモーター及びK. marxianusのCTR1プロモーターのプロモーター活性と併せて図２A-Cに示す。図２A-Cに示すように、上述したK. marxianusのPIR1プロモーター及びK. marxianusのCTR1プロモーターは、その他の多くの遺伝子のプロモーターと比較しても優れたプロモーター活性を示すことが明らかとなった。なお、本実施例にて評価したTEF1遺伝子、HSP26遺伝子及びPCK1遺伝子は、後述する参考実験に記載したように、K. marxianusにおけるキシロース資化時又はグルコース資化時にて比較的に高発現していた遺伝子であった。よって、これらTEF1遺伝子、HSP26遺伝子及びPCK1遺伝子の各プロモーターは、K. marxianusにて高発現を誘導するプロモーターであると予測された。しかし、本実施例に示すように、上述したK. marxianusのPIR1プロモーター及びK. marxianusのCTR1プロモーターは、これら高発現プロモーターとして期待されるプロモーターよりも優れたプロモーター活性を示すことが明らかとなった。
〔実施例２〕
本実施例では、実施例１で評価したK. marxianusのPIR1プロモーター及びK. marxianusのCTR1プロモーターについて、その機能領域を検討した。
本実施例では、実施例１で評価したK. marxianusのPIR1プロモーター及びK. marxianusのCTR1プロモーターについて、その機能領域を検討した。
具体的には、実施例１で作製したRAK5689株の染色体DNAを鋳型とし、下記表２に示したプライマーとURA3-280cプライマーでPCRを行った。すなわち、これらPCRにより、実施例１で評価したPIR1プロモーターの５’末端側を切断した様々な長さのDNA断片とルシフェラーゼ遺伝子が融合したDNA断片を合成した。PCRで得られた増幅断片をK. marxianus RAK4174株に導入し、実施例１と同様にしてルシフェラーゼ活性を測定した。
評価したDNA断片の長さとルシフェラーゼ活性を測定した結果を、図３に示す。図３に示すように、PIR1遺伝子の上流５００塩基を超え、１０００塩基程度の長さを有するDNA断片において顕著にプロモーター活性を示すことが明らかとなった。また、PIR1遺伝子の上流２０００塩基程度の長さを有するDNA断片においては、更に優れたプロモーター活性を示すことが明らかとなった。特に、実施例１で評価したDNA断片は、最も優れたプロモーター活性を示すことが明らかとなった。
また、CTR1プロモーターの機能領域についても以下のように検討した。すなわち実施例１で作製したRAK5686株の染色体DNAを鋳型とし、下記表３に示したプライマーとURA3-280cプライマーでPCRを行った。すなわち、これらPCRにより、実施例１で評価したCTR1プロモーターの５’末端側を切断した様々な長さのDNA断片とルシフェラーゼ遺伝子が融合したDNA断片を合成した。PCRで得られた増幅断片をK. marxianus RAK4174株に導入し、実施例１と同様にしてルシフェラーゼ活性を測定した。
評価したDNA断片の長さとルシフェラーゼ活性を測定した結果を、図４に示す。図４に示すように、CTR1遺伝子の上流３１４塩基を超え、３８４塩基程度の長さを有するDNA断片において最も顕著にプロモーター活性を示すことが明らかとなった。また、CTR1遺伝子の上流４２９塩基を超える長さを有するDNA断片においては、３８４塩基程度の長さを有するDNA断片におけるプロモーター活性より低下するものの優れたプロモーター活性を示すことが明らかとなった。
〔実施例３〕
本実施例では、実施例１で評価したK. marxianusのPIR1プロモーター及びK. marxianusのCTR1プロモーターを、外来遺伝子を耐熱性酵母に導入する際のプロモーターとして利用し、そのプロモーター活性を評価した。
本実施例では、実施例１で評価したK. marxianusのPIR1プロモーター及びK. marxianusのCTR1プロモーターを、外来遺伝子を耐熱性酵母に導入する際のプロモーターとして利用し、そのプロモーター活性を評価した。
〔XI遺伝子を導入したxyl1, xyl2二重破壊株の作製〕
Kluyveromyces marxianus DMKU3-1042株（RAK3596とも称する）のxyl1破壊株RAK6163（xyl1::ScURA3, leu2, his3）のxyl2遺伝子を破壊し、同時にキシロースイソメラーゼ（XI）遺伝子を導入するためのベクターを下記の方法で作製した。なお、XI遺伝子としてはSaccharomyces cerevisiaeで活性があることがわかっている特開2011-147445に記載のReticulitermes speratus腸内共生原生生物由来のXI遺伝子を、酵母のコドン使用頻度に合わせて全合成したRsXI-C1-opt（以下RsXI）遺伝子を用いた。また、PCR増幅にはPrimeSTAR Max DNA Polymerase（Takara Bio, Shiga, Japan）を添付のプロトコルに従い使用した。
K. marxianus DMKU3-1042株のゲノムDNAを鋳型として、プライマーBss-XYL2U-F（gtaaaacgacggccagtgagcgcgccctgcaggatcgatctcttcctgctaaaaccaaaaacac（配列番号３７））及びTDH3-XYL2U-R（aactgaaaaagcgtgttttttattcggttgataatttgtatttttgttat（配列番号３８））、並びにプライマーXYL2D-F（acatgtttcaaaactgtgattgaacgttatttatg（配列番号３９））及びBss-XYL2D-R（atgaccatgattacgccaagcgcgccctgcaggagggataggttccgctcctg（配列番号４０））を用いて、それぞれxyl2遺伝子の上流1.0Kbの断片（XYL2U（1.0 kb））並びにxyl2遺伝子の上流1.0Kbの断片（XYL2D（1.0 kb））をPCR増幅した。
Kluyveromyces marxianus DMKU3-1042株（RAK3596とも称する）のxyl1破壊株RAK6163（xyl1::ScURA3, leu2, his3）のxyl2遺伝子を破壊し、同時にキシロースイソメラーゼ（XI）遺伝子を導入するためのベクターを下記の方法で作製した。なお、XI遺伝子としてはSaccharomyces cerevisiaeで活性があることがわかっている特開2011-147445に記載のReticulitermes speratus腸内共生原生生物由来のXI遺伝子を、酵母のコドン使用頻度に合わせて全合成したRsXI-C1-opt（以下RsXI）遺伝子を用いた。また、PCR増幅にはPrimeSTAR Max DNA Polymerase（Takara Bio, Shiga, Japan）を添付のプロトコルに従い使用した。
K. marxianus DMKU3-1042株のゲノムDNAを鋳型として、プライマーBss-XYL2U-F（gtaaaacgacggccagtgagcgcgccctgcaggatcgatctcttcctgctaaaaccaaaaacac（配列番号３７））及びTDH3-XYL2U-R（aactgaaaaagcgtgttttttattcggttgataatttgtatttttgttat（配列番号３８））、並びにプライマーXYL2D-F（acatgtttcaaaactgtgattgaacgttatttatg（配列番号３９））及びBss-XYL2D-R（atgaccatgattacgccaagcgcgccctgcaggagggataggttccgctcctg（配列番号４０））を用いて、それぞれxyl2遺伝子の上流1.0Kbの断片（XYL2U（1.0 kb））並びにxyl2遺伝子の上流1.0Kbの断片（XYL2D（1.0 kb））をPCR増幅した。
次に、S. cerevisiae S288C株のゲノムDNAを鋳型として、プライマーTDH3-F（gaataaaaaacacgctttttcagttcgagtttatcattatc（配列番号４１））及びTDH3-R（tttggtttgtttgtttatgtgtgtttattcgaaactaagttc（配列番号４２））、プライマーPGK1-F（tcgagattgaattgaattgaaatcgatagatc（配列番号４３））及びPGK1-R（taaacttaaaatacgctgaacccgaac（配列番号４４））、並びにプライマーPGK1t-LEU2-F（tcgggttcagcgtattttaagtttatcgaggagaacttctagtatatccac（配列番号４５））及びXYL2D-LEU2-R（gttcaatcacagttttgaaacatgttcgactacgtcgtaaggccgtttctg（配列番号４６））を用いて、それぞれScTDH3プロモーター（0.7Kb）、ScPGK1ターミネータ（0.25Kb）並びにScLEU2マーカー（2.2 Kb）をPCR増幅した。
全合成したRsXI遺伝子を搭載するベクターを鋳型として用い、プライマーTDH3-RsXI-F（aacacacataaacaaacaaaccaaaatgtctcaaatttttaaggatatccc（配列番号４７））及びPGK1-RsXI-R（cgatttcaattcaattcaatctcgattattgaaacaaaatttggttaataatac（配列番号４８））を用いて、RsXI-C1（1.3kb）遺伝子断片をPCR増幅した。
上記のPCRにより増幅された各遺伝子断片をアガロースゲル電気泳動し、目的のサイズのバンドを切り出して精製した。精製されたXYL2U、XYL2D、ScTDH3プロモーター、ScPGK1ターミネータ、ScLEU2マーカー、及びRsXI遺伝子断片を混合し、プライマーBss-XYL2U-F及びBss-XYL2D-Rを用いてFusion PCRにより各遺伝子を連結したDNA断片を合成した。そして、得られたDNA断片を制限酵素BssHIIで消化したのち、pRS434GAPベクター（Genbank：AB304854）のBssHIIサイトにライゲーションしてpRS434XYL2d-RsXIを作製した（図５）。
このpRS434XYL2d-RsXIを鋳型とし、プライマーXYL2U-F（atcgatctcttcctgctaaaaccaaaaac（配列番号４９））及びXYL2D-R（agggataggttccgctcctgttggg（配列番号５０））を用いてXYL2U-TDH3p-RsXI-PGK1t-ScLEU2-XYL2D領域をPCR増幅した。得られたDNA断片をRAK6163に形質転換した。SD-Leu寒天培地（Yeast Nitrogen Basewo amino acids（YNB）(Difco)6.7g/L、complete supplement mixture（CSM）-Leu(Bio101)0.77g/L、glucose 20g/L、agar 20g/L）上に形質転換体を展開し、生育したコロニーを再度SD-Leu寒天培地上でストリークしてシングルコロニーを得た。導入した遺伝子断片が正しくxyl2遺伝子座に挿入され、かつxyl2遺伝子が破壊されていることをコロニーダイレクトPCRで確認し、KM103株（xyl1::ScURA3, xyl2::RsXI-ScLEU2, his3）とした。
〔XI遺伝子（ScTHD3プロモーター）をマルチコピー導入したxyl1, xyl2二重破壊株の作製〕
K. marxianus DMKU3-1042株は、直鎖状のDNA断片がゲノム上にランダムにインテグレーションされることが知られている（Nonklang, S. et al, 2008. High-temperature ethanol fermentation and transformation with linear DNA in the thermotolerant yeast Kluyveromyces marxianus DMKU3-1042. Appl Environ Microbiol 74:7514-21）。そこで、HIS3dマーカーカセットとXI発現カセットを連結した直鎖状DNAを合成し、K. marxianusのゲノム上にマルチコピーインテグレーションを行うこととした。
K. marxianus DMKU3-1042株は、直鎖状のDNA断片がゲノム上にランダムにインテグレーションされることが知られている（Nonklang, S. et al, 2008. High-temperature ethanol fermentation and transformation with linear DNA in the thermotolerant yeast Kluyveromyces marxianus DMKU3-1042. Appl Environ Microbiol 74:7514-21）。そこで、HIS3dマーカーカセットとXI発現カセットを連結した直鎖状DNAを合成し、K. marxianusのゲノム上にマルチコピーインテグレーションを行うこととした。
先ず、S. cerevisiae S288C株のゲノムDNAを鋳型として、プライマーHIS3d-F（caagataaacgaaggcaaagatgacagag（配列番号５１））及びHIS3d-R-5GCG（cccccgggggcccccgcgcgcctcgttcagaatgacacgtatagaatg（配列番号５２））を用いてHIS3dマーカー断片をPCR増幅した。反応終了後、反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、目的のDNA断片を切り出した後に定法に従って精製した。
次に、pRS434XYL2d-RsXI（図５）を鋳型とし、プライマー5GCG-TDH3p-700F（gggggcccccggggggaataaaaaacacgctttttcagttcgagtttatcattatc（配列番号５３））及びPGK1t-R（taaacttaaaatacgctgaacccgaacatagaaatatcg（配列番号５４））を用いて、ScTDH3p-RsXI-ScPGK1t断片をPCR増幅した。反応終了後、反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、目的のDNA断片を切り出した後に定法に従って精製した。
次に、HIS3dマーカー断片とScTDH3p-RsXI-ScPGK1t断片を混合し、プライマーHIS3d-FおよびPGK1t-Rを用いたFusion PCRにより2つの断片を連結した。その後、得られた断片をKM103株に導入し、SD-His（SD-Leu培地のCSM-Leuの代わりにCSM-Hisを使用）寒天培地に増殖したコロニーを純化して得られた株をKM203株とした。すなわち、KM203株は、ScTHD3プロモーターによりXI遺伝子が発現するような発現カセットをマルチコピーで導入した形質転換株である。
〔XI遺伝子（KmPIR1及びKmCTR1プロモーター）をマルチコピー導入したxyl1, xyl2二重破壊株の作製〕
KmPIR1プロモーターを用いてXI遺伝子を発現するカセット及びKmCTR1プロモーターを用いてXI遺伝子を発現するカセットを下記の手順で作製した。
KmPIR1プロモーターを用いてXI遺伝子を発現するカセット及びKmCTR1プロモーターを用いてXI遺伝子を発現するカセットを下記の手順で作製した。
先ず、S. cerevisiae S288C株のゲノムDNAを鋳型として、プライマーBss-HIS3d-F（acgttgtaaaacgacggccagtgagcgcgccctgcagggaaggcaaagatgacagagcagaaagccc（配列番号５５））及びHIS3d-R（gcgcgcctcgttcagaatgacacgtatagaatg（配列番号５６））を用いてHIS3dマーカー断片をPCR増幅した。
次に、K. marxianus DMKU3-1042株のゲノムDNAを鋳型として、プライマーHIS3-KmPIR1-2921F（acgtgtcattctgaacgaggcgcgctgtataaattgaaatgtttggattgaaaagggaagc（配列番号５７））及びKmPIR1-1R（tgtataaatcggggtatgtgtgtgttggtaaaaacg（配列番号５８））、並びにプライマーHIS3-KmCTR1-521F（acgtgtcattctgaacgaggcgcgctcttggacaaaaaacgcatattgcgaggtttataac（配列番号５９））及びKmCTR1-1R（cttgattgttcaattgtcaattgtcaatgggcttcttgtcgtc（配列番号６０））を用いて、それぞれKmPIR1プロモーター断片（2.92 kb）並びにKmCTR1プロモーター断片（0.52 kb）をPCR増幅した。
次に、pRS434XYL2d-RsXI（図５）を鋳型とし、プライマーKmPIR1-RsXI-F（acacacacataccccgatttatacaatgtctcaaatttttaaggatatcccagttattaaatatg（配列番号６１））及びBss-ScPGK1t-R（atgaccatgattacgccaagcgcgccctgcaggtaaacttaaaatacgctgaacccgaacatag（配列番号６２））を用いてKmPIR1-RsXI-ScPGK1t断片をPCR増幅した。
次に、上記のPCRにより増幅された各DNA断片をアガロースゲル電気泳動に供し、目的のDNA断片を定法に従って精製した。得られたHIS3dマーカー断片、KmPIR1プロモーター断片及びKmPIR1-RsXI-ScPGK1t断片を混合し、プライマーBss-HIS3d-F及びBss-ScPGK1t-Rを用いてFusion PCRによりこれら３つの断片を連結した。その後、得られた断片を制限酵素BssHIIで消化したのち、pRS434GAPベクターのBssHIIサイトにライゲーションしてpRS434KmPIR1p-RsXIを作製した（図６）。
また、同様に、pRS434XYL2d-RsXI（図５）を鋳型とし、プライマーKmCTR1-RsXI-F（gacaattgacaattgaacaatcaagatgtctcaaatttttaaggatatcccagttattaaatatg（配列番号６３））及びBss-ScPGK1t-Rを用いてKmCTR1-RsXI-ScPGK1t断片をPCR増幅した。この断片および上記の断片を用いて、上記と同様のFusion PCRにより３つの断片を連結した。得られた断片をpRS434GAPベクターのBssHIIサイトにライゲーションしてpRS434KmCTR1p-RsXIを作製した（図７）
次に、pRS434KmPIR1p-RsXI（図６）及びpRS434KmCTR1p-RsXI（図７）を鋳型として、プライマーHIS3d-F及びPGK1t-Rを用いてPCRを行い、それぞれScHIS3-KmPIR1p-RsXI-ScPGK1t断片及びScHIS3-KmCTR1p-RsXI-ScPGK1t断片を増幅した。得られた増幅断片をそれぞれKM103株に導入し、SD-His寒天培地に増殖したコロニーを純化して得られた株をそれぞれKM303及びKM306株とした。すなわち、KM303及びKM306株は、それぞれKmPIR1プロモーター及びKmCTR1プロモーターによりXI遺伝子が発現するような発現カセットをマルチコピーで導入した形質転換株である。
〔XI遺伝子を導入したxyl1, xyl2二重破壊株のキシロース培地での増殖〕
K. marxianus DMKU3-1042、RAK6163、KM103、KM203、KM303及びKM306株をL字型試験管に調製したキシロースを炭素源とするSX培地（YNB 6.7g/L、CSM 0.77g/L、xylose 20g/L）5mlに接種し、それぞれ増殖試験を行った。増殖試験は、バイオフォトレコーダーTVS062CA（ADVANTEC, Tokyo, Japan）を用いて30℃、70rpmの条件で行った。増殖試験の結果を図８に示す。
K. marxianus DMKU3-1042、RAK6163、KM103、KM203、KM303及びKM306株をL字型試験管に調製したキシロースを炭素源とするSX培地（YNB 6.7g/L、CSM 0.77g/L、xylose 20g/L）5mlに接種し、それぞれ増殖試験を行った。増殖試験は、バイオフォトレコーダーTVS062CA（ADVANTEC, Tokyo, Japan）を用いて30℃、70rpmの条件で行った。増殖試験の結果を図８に示す。
図８から判るように、RAK6163、KM103及びKM203株は、10時間程度までは培地中に微量に含まれるグルコースなどを資化して若干の増殖が見られるが、その後は全く増殖することができず、キシロースを炭素源として増殖することができないことが明らかとなった。この結果は、xyl1破壊株（RAK6163）はキシロースを炭素源として増殖ができないこと、染色体上に1コピー及びマルチコピー導入されたScTDH3プロモーターにより発現されるRsXI遺伝子（それぞれKM103及びKM203）では、キシロースを炭素源として増殖するのに十分なXI活性が発現しないことを示唆している。
一方、図８から判るように、KM303及びKM306株は、キシロースを炭素源として増殖することができた。この結果は、染色体上にマルチコピー導入されたKmPIR1プロモーターにより発現されるRsXI及びKmCTR1プロモーターにより発現されるRsXIは、それぞれキシロースを炭素源として増殖するのに十分なXI活性が発現することを示している。
また、KM203、KM303及びKM306株に関する増殖試験の結果に対して、W700M2株に関する増速試験の結果を併せたグラフを図９に示した。なお、W700M2株は、一般に入手可能なS.cerevisiae W303-1B株におけるPPP遺伝子及びXKS1遺伝子の発現を強化するとともに、GRE3遺伝子を破壊した株に対して、ScHOR7p-RsXIをインテグレーションした株である。ScHOR7p-RsXIは、S.cerevisiaeのHOR7遺伝子のプロモーターであり、高発現プロモーターとして知られている。また、W700M2株は、上述したような構成を有する遺伝子組換え体であるため、キシロースを炭素源として増殖することができる。すなわち、W700M2株は、本実験におけるポジティブ・コントロールとして使用できる。図９に示すように、KM303及びKM306株は、ポジティブ・コントロールであるW700M2株と同様に、それぞれキシロースを炭素源として増殖できることが明らかとなった。
以上の結果より、K. marxianusのPIR1プロモーター及びK. marxianusのCTR1プロモーターは、耐熱性酵母に外来遺伝子を導入する際のプロモーターとして利用したときに、優れたプロモーター活性を示し、外来遺伝子を十分に発現させる能力を有することが明らかとなった。
〔参考実験〕
耐熱性酵母であるクリベロマイセス・マルキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）について、キシロース資化時の遺伝子発現及びグルコース資化時の遺伝子発現をそれぞれ次世代シークエンス転写解析により解析した。
耐熱性酵母であるクリベロマイセス・マルキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）について、キシロース資化時の遺伝子発現及びグルコース資化時の遺伝子発現をそれぞれ次世代シークエンス転写解析により解析した。
まず、Kluyveromyces marxianus DMKU3-1042をYPD(2% glucose)培地とYPX(2% xylose)培地でそれぞれ18時間培養を行った。培養後、RNAを抽出し、次世代シークエンス転写解析を実施した。次世代シークエンス転写解析は、Illumina GAIIによるSingle-End法を用いたmRNAシークエンスにより行った。得られたデータは用意したドラフトゲノムにアセンブルし、マッピングされた領域を抽出し、その領域100bpあたりのリード数を計算することでその領域の転写量とした。
本実験では、YPD培地及びYPX培地で発現を示すそれぞれ2000以上の遺伝子を転写量順に示すことができた。このとき、Kluyveromyces marxianusで推定されるORFのなかで、S. cerevisiaeに対応するORFが存在しないものについては、アルファベット４文字と数値の組み合わせで命名した。例えば、mRNAシーケンスの結果、所定のORFについてS. cerevisiaeに対応するORFが存在しないとき、当該所定のORFは、ATG開始コドンからの４アミノ酸を一文字表記した４文字のアルファベットと、当該ORFのヌクレオチド長を表す数値と組み合わせて表記する。例えば、MIFP960やMFRK1161といった表記となる。この命名法によれば、Kluyveromyces marxianusで推定されるORFのなかでS. cerevisiaeに対応するORFが存在しないものは、互いに重複することなく表記できる。
上述した実施例にて検討したK. marxianusのPIR1遺伝子及びK. marxianusのCTR1遺伝子は、いずれの培地においても、転写量順位が１０番以降にランクされていた。すなわち、これらK. marxianusのPIR1遺伝子及びK. marxianusのCTR1遺伝子のプロモーターは、この参考実験からすると高発現プロモーターとして機能するとは予測できない。これに対して、実施例１で比較のために検討したTEF1遺伝子、HSP26遺伝子及びPCK1遺伝子は、キシロース資化時又はグルコース資化時において、K. marxianusのPIR1遺伝子及びK. marxianusのCTR1遺伝子と比較して高発現していた遺伝子であった。すなわち、K. marxianusのPIR1遺伝子及びK. marxianusのCTR1遺伝子よりも、これらTEF1遺伝子、HSP26遺伝子及びPCK1遺伝子のプロモーターの方が高発現プロモーターとして有望な候補と言える。
また、クリベロマイセス・マルキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）について、キシロース資化時の遺伝子発現及びグルコース資化時の遺伝子発現をマイクロアレイを用いて評価した。なお、マイクロアレイ解析はロシュ・ダイアグノスティックスのNimbleGenマイクロアレイ受託サービスを利用した。サンプルRNAは、酵母を2.5 mlのYPD培地又はYPX（YPDのグルコースの代わりに2％キシロースを用いた）培地で24時間培養し、その後、QIAGEN RNAeasy Mini Kit（株式会社キアゲン）を用いて調製した。
マイクロアレイ解析の結果、K. marxianusのPIR1遺伝子及びK. marxianusのCTR1遺伝子は、いずれの培地においても高発現する遺伝子ではないことが判った。特に、K. marxianusのPIR1遺伝子は、上位１００番目以内にもランクされていなかった。この結果からも、K. marxianusのPIR1遺伝子及びK. marxianusのCTR1遺伝子のプロモーターは、耐熱性酵母において高発現可能なプロモーターとして機能するとは予測できなかった。
Claims (11)
- クリベロマイセス・マルキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）の染色体におけるPIR1遺伝子の上流に位置し、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかの塩基配列からなるプロモーター。
（ａ）少なくとも、配列番号１に示す塩基配列の3'末端側の１０００塩基を含む塩基配列
（ｂ）上記（ａ）の塩基配列に対して９０％以上の一致度を有し、プロモーター活性を有するポリヌクレオチドの塩基配列
（ｃ）少なくとも、配列番号１に示す塩基配列の3'末端側の２０００塩基を含む塩基配列
（ｄ）上記（ｃ）の塩基配列に対して９０％以上の一致度を有し、プロモーター活性を有するポリヌクレオチドの塩基配列 - クリベロマイセス・マルキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）の染色体におけるCTR1遺伝子の上流に位置し、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかの塩基配列からなるプロモーター。
（ａ）少なくとも、配列番号２に示す塩基配列の3'末端側の３８４塩基を含む塩基配列
（ｂ）上記（ａ）の塩基配列に対して９０％以上の一致度を有し、プロモーター活性を有するポリヌクレオチドの塩基配列
（ｃ）少なくとも、配列番号２に示す塩基配列の3'末端側の４２９塩基を含む塩基配列
（ｄ）上記（ｃ）の塩基配列に対して９０％以上の一致度を有し、プロモーター活性を有するポリヌクレオチドの塩基配列 - 請求項１又は２記載のプロモーターを含む核酸構築物。
- 請求項１又は２記載のプロモーターを含む発現ベクター。
- 上記プロモーターの下流に位置する遺伝子を更に含むことを特徴とする請求項４記載の発現ベクター。
- 請求項１又は２記載のプロモーターを所望の遺伝子の上流に組み入れた形質転換体。
- 上記所望の遺伝子が外来性の遺伝子であることを特徴とする請求項６記載の形質転換体。
- 耐熱性酵母を宿主細胞とすることを特徴とする請求項６記載の形質転換体。
- セルロース系バイオマスを糖化し、且つエタノール発酵能を有することを特徴とする請求項６記載の形質転換体。
- 請求項６乃至９いずれか一項記載の形質転換体を培養し、培養後の培地及び/又は形質転換体内より目的物質を回収する、物質の製造方法。
- 上記目的物質は、セルロース系バイオマスを糖化してなる糖類からエタノール発酵により合成されたエタノールであることを特徴とする請求項１０記載の物質の製造方法。
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