CN104220600B - 启动子及其用途 - Google Patents

启动子及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN104220600B
CN104220600B CN201380012169.2A CN201380012169A CN104220600B CN 104220600 B CN104220600 B CN 104220600B CN 201380012169 A CN201380012169 A CN 201380012169A CN 104220600 B CN104220600 B CN 104220600B
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
yeast
promoter
pir1
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201380012169.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104220600A (zh
Inventor
志佐伦子
赤田伦治
星田尚司
牟田口梢荣
上村毅
德弘健郎
片平悟史
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Toyota Motor Corp
Yamaguchi University NUC
Original Assignee
Toyota Motor Corp
Yamaguchi University NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Toyota Motor Corp, Yamaguchi University NUC filed Critical Toyota Motor Corp
Publication of CN104220600A publication Critical patent/CN104220600A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104220600B publication Critical patent/CN104220600B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C12P7/08—Ethanol, i.e. non-beverage produced as by-product or from waste or cellulosic material substrate
    • C12P7/10—Ethanol, i.e. non-beverage produced as by-product or from waste or cellulosic material substrate substrate containing cellulosic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/50—Methods for regulating/modulating their activity
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明的启动子引起目的基因高表达，尤其在耐热性酵母中高表达。所述启动子位于马克斯克鲁维酵母染色体上的PIR1基因上游或CTR1基因上游并且包含控制PIR1基因或CTR1基因的表达的区域。

Description

启动子及其用途
技术领域
本发明涉及在耐热性酵母中发挥功能的新启动子及其用途。
背景技术
通过利用其发酵能力和作为生产多种物质的宿主，酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)所代表的酵母广泛用于食品工业中。此外，酵母是基因工程领域的主要研究主体。作为酵母的例子，其最佳温度范围落在相对高的温度范围内的酵母(也称作耐热性酵母)是熟知的，酿酒酵母也是熟知的。
使用这类耐热性酵母，可以在相对高的温度范围内维持反应体系，使得防止污染成为可能。此外，需要在相对高的温度范围内培养酵母，这取决于待生产的物质的类型或反应体系。在这种情况下，特别优选的是使用耐热性酵母。
此外，通常，在酵母中表达给定的基因时，使用恒定允许高表达的启动子。可以在酵母中使用的已知启动子的例子包括TDH3启动子、ADH1启动子和TEF1启动子。此外，非专利文献1公开了使用TDH3启动子，在耐热性酵母中表达纤维素酶基因。
虽然以上的不同启动子可以总是引起位于其下游的基因在通常可获得的酵母如酿酒酵母中高表达，但是当使用耐热性酵母作为宿主时，这类下游基因的表达水平不足。即，不存在可以引起目的基因在耐热性酵母中高表达的常规已知的启动子。
引文列表
非专利文献
NPL 1：Jiong Hong等人，Journal of Biotechnology 130(2007)114-123
发明概述
技术问题
考虑到以上情况，本发明的目的是提供能够引起目的基因高表达、特别在耐热性酵母中高表达的新启动子。
技术问题的解决方案
作为为了实现以上目的的充分研究结果，发明人成功鉴定到能够引起目的基因在耐热性酵母中高表达的新启动子。这已经导致本发明的完成。本发明包括以下。
(1)启动子，其位于马克斯克鲁维酵母染色体上的PIR1基因上游并且包含控制PIR1基因表达的区域。
(2)启动子，其位于马克斯克鲁维酵母染色体上的CTR1基因上游并且包含控制CTR1基因表达的区域。
(3)根据(1)的启动子，其包含核苷酸序列，所述核苷酸序列由来自SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列的3'末端的至少1000个核苷酸组成。
(4)根据(1)的启动子，其包含核苷酸序列，所述核苷酸序列由来自SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列的3'末端的至少2000个核苷酸组成。
(5)根据(2)的启动子，其包含核苷酸序列，所述核苷酸序列由来自SEQ ID NO:2中所示的核苷酸序列的3'末端的至少384个核苷酸组成。
(6)根据(2)的启动子，其包含核苷酸序列，所述核苷酸序列由来自SEQ ID NO:2中所示的核苷酸序列的3'末端的至少429个核苷酸组成。
(7)核酸构建体，其包含根据(1)至(6)中任一项的启动子。
(8)表达载体，其包含根据(1)至(6)中任一项的启动子。
(9)根据(8)的表达载体，其还包含位于所述启动子下游的基因。
(10)转化体，其中根据(1)至(6)中任一项的启动子插入目的基因的上游。
(11)根据(10)的转化体，其中目的基因是外来基因。
(12)根据(10)的转化体，其中使用耐热性酵母细胞作为宿主细胞。
(13)根据(10)的转化体，所述转化体能够引起基于纤维素的生物量糖化和乙醇发酵。
(14)用于制备物质的方法，包括培养根据(10)至(13)中任一项的转化体并且在培养后收集培养基和/或转化体中产生的目的物质。
(15)用于制备根据(14)所述的物质的方法，其中目的物质是通过乙醇发酵从糖合成的乙醇，所述糖通过糖化基于纤维素的生物量获得。
有利的发明效果
本发明的启动子可以甚至在耐热性酵母中引起位于其下游的基因高表达。具体而言，对于耐热性酵母，可以使用本发明的启动子增加目的基因的表达水平。
另外，根据用于生产本发明物质的方法，可以实现目的物质的优异生产率，原因是使用上述启动子可以改进给定基因的表达水平。即，根据用于产生本发明物质的方法，可以明显增加由基因编码的蛋白质和/或使用这类蛋白质待产生的多种物质的生产率，其中所述基因受以上启动子促进时高度表达。
附图简述
[图1]图1是显示KmPIR1p、KmCTR1p和ScTDH3p的报道分子测定法结果的特征图。
[图2]图2是显示KmPIR1p、KmCTR1p和其他启动子的报道分子测定法结果的特征图。
[图3]图3是显示KmPIR1p的功能性区域的报道分子测定法结果的特征图。
[图4]图4是显示KmCTR1p的功能性区域的报道分子测定法评价结果的特征图。
[图5]图5显示pRS434XYL2d-RsXI的构建体。
[图6]图6显示pRS434KmPIR1p-RsXI的构建体。
[图7]图7显示pRS434KmCTR1p-RsXI的构建体。
[图8]图8是显示DMKU3-1042株、RAK6163株、KM103株、KM203株、KM303株和KM306株的增殖测试结果的特征图。
[图9]图9是显示KM203株、KM303株、KM306株和W700M2株的增殖测试结果的特征图。
实施方案描述
下文参考附图和实施例更详细地描述本发明。
本发明的启动子包括马克斯克鲁维酵母中的PIR1基因启动子和CTR1基因启动子。在马克斯克鲁维酵母中的PIR1基因启动子对应于马克斯克鲁维酵母染色体上控制PIR1基因表达的区域。类似地，在马克斯克鲁维酵母中的CTR1基因启动子对应于马克斯克鲁维酵母染色体上控制CTR1基因表达的区域。
将PIR1基因称作受酿酒酵母中转录因子Swi5p控制的基因(Overlapping anddistinct roles of the duplicate yeast transcription factors Ace2p and Swi5p，Marie-Therese Doolin等人，Molecular Microbiology(2001)40(2),422-432)。还已知PIR1基因编码构成细胞壁的糖蛋白。此外，已知转录因子Swi5控制参与细胞周期的基因的转录(Distinct Regions of the Swi5and Ace2Transcription Factors Are Requiredfor Specific Gene Activation,Helen J.McBride等人，第274卷，第30期，1999年7月23日发行，第21029-21036页)。
此外已知CTR1基因编码酿酒酵母中铜离子的转运蛋白(Copper Ion-sensingTranscription Factor Mac1p Post-translationally Controls the Degradation ofIts Target Gene Product Ctr1p*,Jesse Yonkovich等人，THE JOURNAL OF BIOLOGICALCHEMISTRY，第277卷，第27期，2002年7月5日发行，第23981-23984页)。
能够控制位于其下游的基因表达的启动子可以充当本发明的启动子。 这类启动子可以对应于位于马克斯克鲁维酵母中PIR1基因或CTR1基因上游的任何区域。作为启动子的核苷酸序列的例子，SEQ ID NO:1中显示了包含马克斯克鲁维酵母中PIR1基因上游2873个核苷酸的区域的核苷酸序列。此外，SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列从5'末端向3'末端读取。这意指PIR1基因位于马克斯克鲁维酵母中SEQ ID NO:1中所显示的核苷酸序列的下游(即，在其3'末端侧上)。类似地，SEQ ID NO:2中显示了包含马克斯克鲁维酵母中CTR1基因上游840个核苷酸的区域的核苷酸序列。SEQ ID NO:2中所示的核苷酸序列也从5'末端向3'末端读取。这意指CTR1基因位于马克斯克鲁维酵母中SEQ ID NO:2中所显示的核苷酸序列的下游(即，在其3'末端侧上)。
更具体地，作为本发明启动子的例子，位于马克斯克鲁维酵母中PIR1基因上游的启动子优选地包含这样的区域，所述区域包含位于PIR1基因上游的1000个核苷酸(即，在SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列的3'末端侧上的1000个核苷酸)。更优选地，它包含这样的区域，所述区域包含位于PIR1基因上游的2000个核苷酸(即，在SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列的3'末端侧上的2000个核苷酸)。可以使用包含位于PIR1基因上游的1000个核苷酸的区域作为明显显示优异表达促进活性的启动子。此外，可以使用包含位于PIR1基因上游的2000个核苷酸的区域作为进一步显示优异表达促进活性的启动子。
另外，对位于马克斯克鲁维酵母中PIR1基因上游的启动子而言是最优选的是包含这样的区域，所述区域包含SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列。可以使用包含SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列的区域作为显示最高反式激活活性的启动子。
同时，作为本发明启动子的例子，位于马克斯克鲁维酵母中CTR1基因上游的启动子优选地包含这样的区域，所述区域进一步位于包含CTR1基因的384个核苷酸的区域上游。具体而言，位于CTR1基因上游的启动子优选地包含在来自SEQ ID NO:2中所示核苷酸序列的3'末端的第384核苷酸和第384核苷酸的5'-端侧上的核苷酸之间的区域。特别优选地，位于CTR1基因上游的启动子包含在来自SEQ ID NO:2中所示核苷酸序列的3'末端的第384核苷酸和来自相同末端的第429核苷酸之间的区域。可以使用位于CTR1基因上游的这些区域用作为显示特别高的反式激活活性的启动子。
此外，可以使用如上文所述的SEQ ID NO:1或2中所示的核苷酸序列作为参考序列限定本发明的启动子；然而，参考核苷酸序列不限于SEQ ID NO:1和2中所示的序列。例如，参考核苷酸序列可以是具有启动子活性并包含相对于SEQ ID NO:1或2中所示的核苷酸序列80％或更大、优选地90％或更大和更优选地95％或更大同一性的多核苷酸的序列。具体而言，本发明的启动子可以包含核苷酸序列或区域，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列具有80％或更大、优选地90％或更大和更优选地95％或更大同一性，所述区域包含在核苷酸序列的3'末端侧上的1000个核苷酸和优选地200个核苷酸。
另外，将本发明的启动子限定为对应于与SEQ ID NO:2中所示的核苷酸序列具有80％或更大、优选地90％或更大和更优选地95％或更大同一性的核苷酸序列，或在来自3'末端的第384核苷酸和第384核苷酸的5'端侧上的核苷酸之间的区域和优选地在来自3'末端的第384核苷酸和来自相同末端的第429核苷酸之间的区域。
这里，同一性的值是使用序列同源性检索程序(有时称作同源性检索程序)在核苷酸序列和SEQ ID NO:1或2中所示的核苷酸序列之间比对时，计算为该核苷酸序列中与SEQID NO:1或2中所示核苷酸序列的核苷酸相对应的核苷酸的百分数值。
另外，使用SEQ ID NO:1或2中所示的核苷酸序列作为参考序列限定本发明的启动子；然而，参考核苷酸序列不限于SEQ ID NO:1和2中所示的核苷酸序列。例如，下述多核苷酸的核苷酸序列可以是参考序列，所述多核苷酸具有启动子活性并且包含通过替换、缺失、添加或插入一个或多个核苷酸而从SEQ ID NO:1或2中所示的核苷酸序列衍生的核苷酸序列。本文所用的表述“多个核苷酸”指例如2至200个氨基酸、优选地2 至100个氨基酸、更优选地2至50个基酸和最优选地2至25个氨基酸。
另外，可以使用下述多核苷酸的核苷酸序列作为参考序列限定本发明的启动子，所述多核苷酸具有启动子活性并且在严格条件下同包含与例如SEQ ID NO:1或2中所示核苷酸序列互补的核苷酸序列的多核苷酸的部分或全部杂交。这里，在严格条件下杂交指在60℃在用2x SSC洗涤期间维持偶联。杂交可以通过常规的已知方法如J.Sambrook等人，Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory(1989)中所述的方法进行。
此外，可使用适宜的宿主，通过报道分子测定法验证具有某种核苷酸序列的多核苷酸是否具有启动子活性。本文所用的适宜宿主可以优选地是耐热性酵母如马克斯克鲁维酵母；然而，也可以使用酵母如酿酒酵母。不限制用于报道分子测定法的报道基因。例如，可以使用萤光素酶(LUC)基因或β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)基因。采用报道基因的此类测定法可以根据常规已知方案的适当改良形式使用。
上文描述的本发明启动子发挥作用以控制位于其下游的基因表达。这里，术语“下游”指转录方向，即，从有义链的5'末端至3'末端的方向。可以使用本发明的启动子提供具有表达控制区的核酸构建体，所述表达控制区甚至在耐热性酵母中显示优异的转录活性。此外，该核酸构建体不仅可以包含启动子，还可以包含可以改善启动子的转录活性的顺式作用元件。可以构造这种核酸构建体以在两个末端都具有限制性酶识别序列。此外，还能够将核酸构建体掺入，例如，常规已知的表达载体中。具体而言，当本发明的启动子掺入可以引起目的基因表达的表达载体中时，可以提供可以引起该基因在耐热性酵母中高表达的表达载体。
可以通过将以上启动子掺入主要用于转化宿主细胞的任何常规已知的表达载体中，产生这种表达载体。此外，可以将包含以上启动子的表达载体引入到宿主细胞的染色体上或染色体外地保留。此外，可以使用任何表达载体如质粒载体、粘粒载体或噬菌体载体。除启动子之外，本文中所用的表达载体可以包含增强子、选择标志物、复制起始位点、多克隆位点 等。
当表达载体用于转化酵母(包括耐热性酵母)时，可以通过将目的基因掺入表达载体中产生重组载体。当使用这种重组载体转化宿主细胞时，基因的高水平转录在宿主细胞中发生。不具体地限制本文所用的宿主细胞；然而，优选地是酵母，包括耐热性酵母，并且特别优选地是耐热性酵母。
本文所用的选择标志物是引入以充当表达载体引入的标志物的基因。通常而言，使用编码荧光蛋白或产生颜色反应的酶的基因、弥补宿主营养缺陷型的基因或耐药基因。在本发明中，可以使用这种通常使用的选择标志物基因构建表达载体。
不具体地限制可以作为宿主使用的酵母；然而，优选地使用耐热性酵母。耐热性酵母指可以在比下文所述的通常可获得的酵母更高的温度范围内增殖的酵母。允许增殖的温度可以定义为可以维持某个增殖速率的上限温度。更具体地，耐热性酵母可以定义为允许增殖的温度是40℃或更高、优选地42℃或更高，和更优选地45℃或更高的酵母。
耐热性酵母的例子包括，但是不特别地限于马克斯克鲁维酵母、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、光滑假丝酵母(Candida glabrata)、东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)和汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)。
此外，可以作为宿主使用的酵母不限于以上耐热性酵母，并且可以使用通常可获得的酵母。通常可获得的酵母的例子包括休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)、树干毕赤酵母(Pichia stipitis)、嗜单宁管囊酵母(Pachysolen tannophilus)、酿酒酵母和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。特别地，优选酿酒酵母。
常规已知作为酵母转化方法的任何方法可以用作将包含本发明启动子的表达载体引入酵母的方法。可以在本发明中使用的方法的具体例子包括但不限于电穿孔法(Meth.Enzym.,194,第182页(1990))、球状质体法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75第1929页(1978))和乙酸锂法(J.Bacteriology,153,第163页(1983)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75第1929 页(1978),Methods in yeast genetics,2000版:A Cold Spring HarborLaboratory Course Manual)。
另外，位于本发明启动子下游的基因是意在宿主酵母如耐热性酵母中表达的基因。不具体地限制基因并且因此它可以是编码任何蛋白质的基因。例如，其例子包括编码参与基于纤维素的生物量糖化的多种酶的基因和编码参与利用来自生物量的糖进行乙醇发酵的多种酶的基因。基因的具体例子包括碱性蛋白酶基因、α-淀粉酶基因、抗坏血酸氧化酶基因、天冬氨酸蛋白酶基因、纤维二糖水解酶基因、纤维素酶基因、角质酶基因、内切葡聚糖酶基因、葡糖淀粉酶、β-葡糖苷酶基因，乙二醛氧化酶基因、漆酶基因、木质素氧化酶基因、木质素过氧化物酶基因、脂肪酶基因、锰过氧化物酶基因、1,2-α-甘露糖苷酶基因、核酸酶基因、果胶裂合酶基因、果胶甲酯酶基因、酸性磷酸酶基因、多聚半乳糖醛酸酶基因、木聚糖酶基因和β-木糖苷酶基因。
更具体地，编码参与来自生物量的糖的乙醇发酵的多种酶的基因的例子包括编码参与木糖代谢的酶的基因(即，木糖代谢相关基因)。木糖代谢相关基因包括编码将木糖转化成木糖醇的木糖还原酶的木糖还原酶基因、编码将木糖醇转化成木酮糖的木糖醇脱氢酶的木糖醇脱氢酶基因、编码使木酮糖磷酸化从而产生木酮糖-5-磷酸的木酮糖激酶的木酮糖激酶基因、和编码将木糖转化成木酮糖的木糖异构酶的木糖异构酶基因。此外，木酮糖激酶产生的木酮糖-5-磷酸进入磷酸戊糖途径，从而被代谢。
不特别地限制引入酵母基因组中的木糖代谢相关基因。然而，其例子包括：来自树干毕赤酵母的木糖还原酶基因和木糖醇脱氢酶基因；和来自酿酒酵母的木酮糖激酶基因(见Eliasson A等人，Appl.Environ.Microbiol,66:3381-3386和Toivari MN等人，Metab.Eng.3:236-249)。可以使用的木糖还原酶基因的其他例子包括源自热带假丝酵母(Candida tropicalis)或源自Candida prapsilosis的木糖还原酶基因。可以使用的木糖醇脱氢酶基因的例子包括源自热带假丝酵母或源自Candida prapsilosis的木糖醇脱氢酶基因。可以使用的木酮糖激酶基因的例子包括源自树干毕赤酵母的木酮糖 激酶基因。另外，可以使用源自鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)簇的木糖异构酶基因等。
除以上木糖代谢相关基因之外，编码参与来自生物量的糖的乙醇发酵的多种酶的基因可以是编码参与糖(如纤维二糖、半乳糖、乳糖、甘露糖和蔗糖)的乙醇发酵的多种酶的基因。
同时，可以使用本发明的启动子和酵母如耐热性酵母生产多种目的物质。这里，待生产的物质是由通过以上启动子以高水平转录的基因所编码的任何蛋白质和使用该蛋白质待生产的物质。使用该蛋白质待生产的物质的例子是该蛋白质作为代谢途径中的酶所涉及的代谢产物。
这里，不限制待生产的蛋白质，并且因此它可以是具有任何分子量的来自任何生物物种的具有任何等电点并且包含任何氨基酸序列的蛋白质。特别地，待生产的蛋白质的例子包括由来自高等生物基因编码的以下蛋白质：溶菌酶、凝乳酶、凝集素、白介素、乳铁蛋白、抗体药物如抗-Fas抗体、螨变应原、花粉变应原、用于降解木质生物量的纤维素降解酶，和细胞因子。
此外，当蛋白质是纤维素酶时，使用该蛋白质待生产的物质的例子是使用培养基中所含有的纤维素为底物，通过糖化反应获得的糖。另外，当在耐热性酵母中使用本发明的启动子高度表达编码参与乙醇发酵的多种酶的基因时，乙醇是待生产的物质。
如果待生产的物质通过胞外分泌产生，则可以在不破坏细胞的情况下通过标准方法收集该物质。此外，如果胞内产生待生产的物质，则将细胞破碎，并且随后可以根据标准方法收集该物质。如果待生产的物质是蛋白质，可以通过用本领域已知的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)直接分析培养基上清样品或细胞破碎后所获得的上清样品实施测量。在这种情况下，细胞培养期间生产的目的蛋白质分泌在培养基中，并且随后通过例如从细胞培养基移走不必要的组分纯化或分离该蛋白质。为了纯化目的蛋白，例如可以单独或组合地使用技术，如亲和层析、离子交换层析、疏水相互作用层析、乙醇沉淀、反相HPLC、阳离子交换树脂 (即，二氧化硅或DEAE)色谱、聚焦层析、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀法和凝胶过滤。
如果待生产的物质是乙醇，则从其中已经培养酵母的培养基收集乙醇。不特别地限制用于收集乙醇的方法，并且因此可以使用任何常规的已知方法。例如，在上文描述的乙醇发酵完成后，通过固-液分离将含有乙醇的液体层与含有重组酵母和固态组分的固相分离。随后，通过蒸馏分离/纯化液相中所含的乙醇。因此，可以收集高纯度乙醇。可以根据乙醇的使用目的适当地调节乙醇纯化的程度。
具体而言，本发明的启动子优选地用于通过所谓“同时糖化和发酵”使用基于纤维素的生物量生产乙醇。在这种情况下，本发明的启动子与编码酶的基因连接，所述酶参与用于基于纤维素的生物量中所含非葡萄糖的糖组分(例如，木糖)的乙醇发酵的反应，并且随后与基因连接的启动子被引入耐热性酵母(重组耐热性酵母)中。非葡萄糖的糖组分的实例包括木糖、纤维二糖、半乳糖、乳糖、甘露糖和蔗糖。
同时糖化和发酵指一种反应体系，其中用于降低培养基中所含多糖(如纤维素或半纤维素)的分子量的糖化反应和用于从糖化反应中产生的糖(主要地是单糖)合成乙醇的乙醇发酵同时进行。糖化反应例如是一种反应，其中涉及随机作用于纤维素链以产生纤维寡糖的内切葡聚糖酶、作用于纤维素链末端以产生纤维二糖的纤维二糖水解酶I和II以及作用于产生的寡聚糖以产生葡萄糖(即单糖)的β-葡糖苷酶。这些酶在一些情况下统称为纤维素酶。市售纤维素酶制剂可以用于同时糖化和发酵的糖化反应中。此外，水解半纤维素以获得低分子量物质的半纤维素酶可以用于同时糖化和发酵的糖化反应中。
已经引入本发明启动子和以上基因的耐热性酵母可以在处于高温范围内的最佳生长温度进行同时糖化和发酵。具体而言，以上基因可以在包括最佳生长温度的高温范围内表达，并且因此可以改进乙醇发酵时乙醇生产率。另外，包括用于耐热性酵母的最佳生长温度的高温范围对应于可以对上述纤维素酶、半纤维素等实现高反应速率的高温范围。因此，可以通 过在包括用于耐热性酵母的最佳生长温度的高温范围内实施同时糖化和发酵，改进糖化效率。换句话说，可以减少为实现目的糖化效率所需要的酶量。如上文描述，作为使用已经引入本发明启动子和以上基因的重组耐热性酵母同时糖化和发酵的结果，可以对使用基于纤维素的生物量的乙醇生产实现成本降低和乙醇产率改善。
此外，用于同时糖化和发酵的温度条件优选地包括，但不限于用于以上重组耐热性酵母的最佳生长温度。例如，用于同时糖化和发酵的温度条件可以是20℃至50℃，优选地30℃至50℃，并且更优选地35℃至45℃。此外，将培养溶液的pH优选地调节到4至6。另外，可以在培养期间进行搅动或搅拌。
实施例
下文参考以下实施例更详细地描述本发明，但是本发明的技术范围不限于此。
实施例1
在这个例子中，将作为耐热性酵母的马克斯克鲁维酵母中的PIR1基因启动子和CTR1基因启动子分离并通过报道分子测定法方法就启动子活性进行评价。
首先，根据标准方法制备马克斯克鲁维酵母的染色体DNA。使用获得的染色体DNA作为模板，KmCTR1-1085(TAGGATCAGGAGACAATCGATATTA(SEQ ID NO:3))和CLuc+30c-KmCTR1-1c2
(caaagcgacagccaagatcaaggtcttcatCTTGATTGTTCAATTGTCAATTGTC(SEQ ID NO:4))作为引物，以及KOD plus DNA聚合酶(Toyobo)，进行PCR。在完成PCR后，将反应溶液进行电泳以获得目的DNA条带。
此外，根据标准方法制备酿酒酵母RAK4296株(MATa his3 200leu2 0met150trp1-delta-63ura3 0::ScGAL10p-yCLuc-15C-LEU2)的染色体DNA。使用获得的染色体DNA作为模板，yCLuc+1 (ATGAAGACCTTGATCTTGGC(SEQ ID NO:5))和URA3-280c(CAGTCTGTGAAACATCTTTCTAC(SEQ ID NO:6))作为引物，以及KOD plus DNA聚合酶(Toyobo)，进行PCR。在完成PCR后，将反应溶液进行电泳以获得目的DNA条带。
使用上文获得的两个DNA片段的混合物和引物KmCTR1p-1086和URA3-280c进行融合PCR。因此，获得包含两个融合的DNA片段的DNA。如此获得的DNA片段具有包含融合在马克斯克鲁维酵母的CTR1基因启动子下游的萤光素酶基因的结构。此外，这种DNA片段含有URA3基因作为选择标志物基因。
类似地，使用马克斯克鲁维酵母的染色体DNA作为模板，KmPIR1-2867(GGAAAGAGTCGATGTGATTCGATGC(SEQ ID NO:7))和10tg-KmPIR1-1c(tgtgtgtgtgtgtgtgtgtgTGTATAAATCGGGGTATGTG(SEQ ID NO:8))作为引物，以及KOD plusDNA聚合酶(Toyobo)，进行PCR。在完成PCR后，将反应溶液进行电泳以获得目的DNA条带。
另外，使用酿酒酵母RAK4296株的染色体DNA作为模板，10CA-yCLuc+1(cacacacacacacacacacaATGAAGACCTTGATCTTGGC(SEQ ID NO:9))和URA3-280c作为引物，以及KOD plus DNA聚合酶(Toyobo)，进行PCR。在完成PCR后，将反应溶液进行电泳以获得目的DNA条带。
使用上文获得的两个DNA片段的混合物和引物KmPIR1-2867和URA3-280c进行融合PCR。因此，获得包含两个融合的DNA片段的DNA。如此获得的DNA片段具有包含融合在马克斯克鲁维酵母的PIR1基因启动子下游的萤光素酶基因的结构。此外，这种DNA片段含有URA3基因作为选择标志物基因。
同时，以相似方式通过报道分子测定法就启动子活性而言评价酿酒酵母中的TDH3基因启动子。使用酿酒酵母RAK4920株(MATa his3 200leu20met15 0trp1-Δ-63ura3 0::ScTDH3p-yCLuc-15C-LEU2)的染色体DNA作为模板和URA3-290(GAGAAGGGCAACGGTTCATCATCTC(SEQ ID NO:10))和15G-yCLuc+1662c(gggggggggggggggCTACTTGCACTCATCTGGGA(SEQ ID NO：11))作为引物，将ScTDH3启动子添加的yCLuc(ATTO Corporation)进行PCR。在完成PCR后，将反应溶液进行电泳以获得目的DNA条带。此外，使用酿酒酵母BY4704株(MATa ade2-::hisGhis3-200leu2-0lys2-0met15-0trp1-63)的染色体DNA作为模板和15C-URA3-223(cccccccccccccccaagcttttcaattcatcttttttttttttg(SEQ ID NO：12))和URA3-280c作为引物，进行PCR。在完成PCR后，将反应溶液进行电泳以获得目的DNA条带。
使用上文获得的两个DNA片段的混合物和引物URA3-290和URA3-280c进行融合PCR。因此，获得包含两个融合的DNA片段的DNA。如此获得的DNA片段具有包含融合在马克斯克鲁维酵母的TDH3基因启动子下游的萤光素酶基因的结构。此外，这种DNA片段含有URA3基因作为选择标志物基因。
接着，将RAK4174株(马克斯克鲁维酵母leu2-ura3-)用上文获得的三种不同DNA片段的每种片段转化。转化按以下方式实施。首先，使用YPD培养基在28℃和150转/分钟实施振摇培养1日。将获得的培养物溶液(1.5ml)以12,000转/分钟离心1分钟。弃去上清液，并添加TF缓冲液(40％聚乙烯二醇3350，0.2M乙酸锂和0.1M二硫苏糖醇)(200微升)，随后搅拌混合15秒。随后，将混合物以12,000转/分钟离心1分钟并弃去上清液。将所得物悬浮于TF缓冲液(50微升)中。添加DNA(3微升)，随后在47℃热休克处理15分钟。将获得的细胞接种在缺乏尿嘧啶的固体培养基上并在28℃静置培养3日。随机选择固体培养基上培育的菌落按如下文描述的方式进行活性测量。
将通过用下述DNA片段转化RAK4174株所获得的菌株命名为“马克斯克鲁维酵母RAK5689菌株”，所述DNA片段具有包含融合在PIR1基因启动子下游的萤光素酶基因的结构。此外，将通过用下述DNA片段转化RAK4174株所获得的菌株命名为“马克斯克鲁维酵母RAK5686菌株”， 所述DNA片段具有包含融合在CTR1基因启动子下游的萤光素酶基因的结构。
将包含YP培养基和浓度2％的不同糖的每种培养物溶液在28℃培养48小时并采样，随后测量活性。将Cluc测量试剂盒(ATTO Corporation)和光度计GLOMAX 20/20LUMINOMETER(Promega)用于测量。本文所用的糖是葡萄糖、纤维二糖、半乳糖、乳糖、甘露糖、蔗糖和木糖。图1显示测量结果。在图1中，KmPIR1p表示马克斯克鲁维酵母PIR1启动子的启动子活性，KmCTR1p表示马克斯克鲁维酵母CTR1启动子的启动子活性，并且ScTDH3p表示酿酒酵母TDH3启动子的启动子活性。
如图1中所显示，发现马克斯克鲁维酵母的PIR1启动子和马克斯克鲁维酵母的CTR1启动子在马克斯克鲁维酵母中具有胜过通常作为高表达启动子使用的酿酒酵母的TDH3启动子的优异启动子活性。马克斯克鲁维酵母PIR1的启动子和马克斯克鲁维酵母的CTR1启动子之间的比较揭示使用选自以上的任一种糖时，与CTR1启动子相比，马克斯克鲁维酵母PIR1启动子显示优越的启动子活性。
另外，在这个实施例中，就活性而言评价源自马克斯克鲁维酵母的许多启动子。具体而言，使用以上文描述的方式制备的马克斯克鲁维酵母的染色体DNA和下表1中所列的引物组，进行PCR，随后电泳。因此，获得目的DNA条带。此外，使用酿酒酵母RAK4296株(MATahis3 200leu20met15 0trp1-Δ-63ura3 0::ScGAL10p-yCLuc-15C-LEU2)的染色体DNA、yCLuc+1和URA3-280c作为引物，KOD plus DNA聚合酶(Toyobo)，进行PCR，随后电泳。因此，获得目的DNA条带。使用如此获得的两个DNA片段的混合物进行融合PCR，从而获得包含两个已融合的DNA片段的DNA。将获得的DNA片段按上文描述的方式引入马克斯克鲁维酵母RAK4174株中。随后，确定YPD培养基中的启动子活性。
[表1]
在表1中，与该实施例中使用的启动子相对应的基因的名称在用于标注基因名称的“基因名称”列中书写，在“基因名称”列中使用4个字母和 至少一个数字字符的组合，如下文参考实验中所述那样。
图2A-C显示启动子的启动子活性测量结果，连同马克斯克鲁维酵母的PIR1启动子和马克斯克鲁维酵母的CTR1启动子的启动子活性测量结果。如图2A-C中所显示，发现马克斯克鲁维酵母的PIR1启动子和马克斯克鲁维酵母的CTR1启动子具有胜过许多其他基因启动子的优异启动子活性。此外，这个实施例中评价的TEF1基因、HSP26基因和PCK1基因是当如下文参考实施例中所述由马克斯克鲁维酵母吸收木糖或由马克斯克鲁维酵母吸收葡萄糖时相对高表达的基因。因此，将TEF1基因、HSP26基因和PCK1基因的启动子预测为能够在马克斯克鲁维酵母中诱导高表达的启动子。然而，如这个实施例中所述，发现与期望作为高表达启动子的这些启动子相比，马克斯克鲁维酵母的PIR1启动子和马克斯克鲁维酵母的CTR1启动子显示优异的启动子活性。
实施例2
在这个例子中，就功能性区域而言检验实施例1中评价的马克斯克鲁维酵母的PIR1启动子和马克斯克鲁维酵母的CTR1启动子。
具体而言，使用实施例1中制备的RAK5689株的染色体DNA作为模板、URA3-280c引物和表2中列出的每种引物，进行PCR。即，作为PCR的结果，合成了各自包含萤光素酶基因的DNA片段，其中所述萤光素酶基因与通过在5'末端侧上切割实施例1中评价的PIR1启动子获得的具有不同长度的不同DNA片段之一融合。将每个PCR扩增的片段引入马克斯克鲁维酵母RAK4174株中，随后按实施例1中描述的方式测量萤光素酶活性。
[表2]
KmPIR1-2867 GGAAAGAGTCGATGTGATTCGATGC SEQ ID NO：7
KmPIR1p-2000 GCAAAGCCCGATCCGGTTCTAA SEQ ID NO：29
KmPIR1p-1023 CAATCCCCTCGTTTCTCGCTTA SEQ ID NO：30
KmPIR1p-500 GGAATCAGGAACCGAAGGCGTT SEQ ID NO：31
KmPIR1p-254 CGGTTTATCCACACCATACCAT SEQ ID NO：32
图3显示评价的DNA片段的长度和萤光素酶活性测量结果。如图3中所示，揭示了在PIR1基因上游具有约1000个核苷酸超过500个核苷酸长度的DNA片段显示显著的启动子活性。还揭示了在PIR1基因上游具有约2000个核苷酸长度的DNA片段还显示优异的启动子活性。特别地，揭示了实施例1中评价的DNA片段出显示最优异的启动子活性。
另外，如下检验CTR1启动子的功能性区域。具体而言，使用实施例1中制备的RAK5686株的染色体DNA作为模板、URA3-280c引物和表3中列出的每种引物，进行PCR。即，作为PCR的结果，合成了各自包含萤光素酶基因的DNA片段，其中所述萤光素酶基因与通过在5'末端侧上切割实施例1中评价的CTR1启动子获得的具有不同长度的不同DNA片段之一融合。将每个PCR扩增的片段引入马克斯克鲁维酵母RAK4174株中，随后按实施例1中描述的方式测量萤光素酶活性。
[表3]
KmCTR1-1085 TAGGATCAGGAGACAATCGATATTA SEQ ID NO：3
KmCTR1p-474 GCTAGAAAACCGTTGTAACACTG SEQ ID NO：33
KmCTR1p-429 CTCTCACATTGTTACTTTGAGC SEQ ID NO：34
KmCTR1p-384 GGTGCTGAAAAGTGCCTGTA SEQ ID NO：35
KmCTR1p-314 CTCTCTTTCTCTCTTCGTTTTTCTT SEQ ID NO：36
图4显示评价的DNA片段的长度和萤光素酶活性测量结果。如图4中所示，揭示了在CTR1基因上游具有约384个核苷酸超过314个核苷酸长度的DNA片段显示最显著的启动子活性。另外，发现在CTR1基因上游具有超过429个核苷酸长度的DNA片段显示优异的启动子活性，尽管所述启动子活性低于具有约384个核苷酸长度的DNA片段的启动子活性。
实施例3
在这个例子中，使用实施例1中评价的马克斯克鲁维酵母的PIR1启动子和马克斯克鲁维酵母的CTR1启动子作为引入外来基因至耐热性酵母中的启动子，从而评价它们的启动子活性。
[产生用XI基因转染的xyl1/xyl2双缺失突变体]
按下文描述的方式制备用于从马克斯克鲁维酵母DMKU3-1042株(也称作“RRAK35966”)缺失RAK6163xyl1缺失株(xyl1::ScURA3,leu2,his3)的xyl2基因并同时引入木糖异构酶(XI)基因的载体。本文所用的XI基因是通过全合成以下基因，同时相对于酵母中的密码子使用频率调整密码子使用频率所制备的RsXI-C1-opt(下文称作“RsXI”)基因：日本专利公开(Kokai)号2011-147445A中公开的来自黄胸散白蚁(Reticulitermessperatus)肠道内共生原生生物的XI基因，已知该基因在酿酒酵母中显示活性。此外，将PrimeSTAR Max DNA聚合酶(Takara Bio，Shiga，日本)根据制造商的方案用于PCR扩增。
使用马克斯克鲁维酵母DMKU3-1042株的基因组DNA作为模板并且分别使用引物Bss-XYL2U-F(gtaaaacgacggccagtgagcgcgccctgcaggatcgatctcttcctgctaaaaccaaaaacac(SEQID NO:37))和TDH3-XYL2U-R(aactgaaaaagcgtgttttttattcggttgataatttgtatttttgttat(SEQ ID NO:38))以及引物XYL2D-F(acatgtttcaaaactgtgattgaacgttatttatg(SEQ ID NO:39))和Bss-XYL2D-R((atgaccatgattacgccaagcgcgccctgcaggagggataggttccgctcctg(SEQID NO:40))，PCR扩增xyl2基因的1.0Kb上游片段(XYL2U(1.0kb))和xyl2基因的1.0Kb上游片段(XYL2D(1.0kb))。
接着，使用酿酒酵母S288C株的基因组DNA作为模板并分别使用引物TDH3-F(gaataaaaaacacgctttttcagttcgagtttatcattatc(SEQ ID NO:41))和TDH3-R(tttggtttgtttgtttatgtgtgtttattcgaaactaagttc(SEQ ID NO:42))、引物PGK1-F(tcgagattgaattgaattgaaatcgatagatc(SEQ ID NO:43))和PGK1-R(taaacttaaaatacgctgaacccgaac(SEQ ID NO:44))和引物PGK1t-LEU2-F(tcgggttcagcgtattttaagtttatcgaggagaacttctagtatatccac(SEQ ID NO:45))和XYL2D-LEU2-R(gttcaatcacagttttgaaacatgttcgactacgtcgtaaggccgtttctg(SEQ ID NO:46))，PCR扩增ScTDH3启动子(0.7Kb)、ScPGK1终止子(0.25Kb)和 ScLEU2标记(2.2Kb)。
使用包含接受全合成的RsXI基因的载体作为模板和引物TDH3-RsXI-F(aacacacataaacaaacaaaccaaaatgtctcaaatttttaaggatatccc(SEQ ID NO:47))和PGK1-RsXI-R(cgatttcaattcaattcaatctcgattattgaaacaaaatttggttaataatac(SEQ ID NO:48))，PCR扩增RsXI-C1(1.3kb)基因片段。
对PCR扩增的每个基因片段进行琼脂糖凝胶电泳。切下具有目的大小的条带从而进行纯化。将如上纯化的XYL2U、XYL2D和ScTDH3启动子、ScPGK1终止子、ScLEU2标记物和RsXI基因片段混合，随后使用引物Bss-XYL2U-F和Bss-XYL2D-R进行融合PCR。因此，合成了包含串联连接的单个基因的DNA片段。随后，将获得的DNA片段用BssHII限制性酶消化并连接至pRS434GAP载体(Genbank：AB304854)的BssHII位点。如此，制备了pRS434XYL2d-RsXI(图5)。
使用pRS434XYL2d-RsXI作为模板和引物XYL2U-F(atcgatctcttcctgctaaaaccaaaaac(SEQ ID NO:49))和XYL2D-R(agggataggttccgctcctgttggg(SEQ ID NO:50))，PCR扩增XYL2U-TDH3p-RsXI-PGK1t-ScLEU2-XYL2D区域。用获得的DNA片段转化RAK6163。将转化体施加至SD-Leu琼脂培养基(酵母氮Basewo氨基酸(YNB)(Difco)(6.7g/l)，完整补充混合物(CSM)-Leu(Bio101)(0.77g/l)、葡萄糖(20g/l)和琼脂(20g/l))。将培育的菌落在SD-Leu琼脂培养基上再次划线以获得单菌落。进行直接菌落PCR以证实引入的基因片段已经在xyl2基因座正确地插入并且xyl2基因已经被缺失。该转化体命名为KM103株(xyl1::ScURA3,xyl2::RsXI-ScLEU2,his3)。
[通过多拷贝整合XI基因制备xyl1/xyl2双缺失突变体(即，ScTHD3启动子)]
已知线性DNA片段随机地整合在马克斯克鲁维酵母DMKU3-1042株的基因组上(Nonklang,S.等人，2008.High-temperature ethanol fermentation andtransformation with linear DNA in the thermotolerant yeast Kluyveromycesmarxianus DMKU3-1042.Appl Environ Microbiol74:7514-21)。鉴于此，尝试实施合成的线性DNA的多拷贝整合，其中通过在马克斯克鲁维酵母基因组上连接HIS3d标记物盒和XI表达盒制备所述合成的线性DNA。
首先，使用酿酒酵母S288C株的基因组DNA作为模板和引物HIS3d-F(caagataaacgaaggcaaagatgacagag(SEQ ID NO:51))和HIS3d-R-5GCG(cccccgggggcccccgcgcgcctcgttcagaatgacacgtatagaatg(SEQ ID NO:52))，PCR扩增HIS3d标记物片段。在反应完成后，对反应溶液进行琼脂糖凝胶电泳，并且切下并通过标准方法纯化目的DNA片段。
接着，使用pRS434XYL2d-RsXI(图5)作为模板和引物5GCG-TDH3p-700F
(gggggcccccggggggaataaaaaacacgctttttcagttcgagtttatcattatc(SEQ ID NO:53))和PGK1t-R(taaacttaaaatacgctgaacccgaacatagaaatatcg(SEQ ID NO:54))，PCR扩增ScTDH3p-RsXI-ScPGK1t片段。在反应完成后，对反应溶液进行琼脂糖凝胶电泳，并且切下并通过标准方法纯化目的DNA片段。
随后，将HIS3d标志物片段和ScTDH3p-RsXI-ScPGK1t片段混合并且使用引物HIS3d-F和PGK1t-R，通过融合PCR连接这两个片段。将获得的片段引入KM103株中。在SD-His(包含CSM-His而非用于SD-Leu培养基的CSM-Leu)琼脂培养基上培育菌落。通过精制菌落所获得的菌株命名为KM203株。具体而言，KM203株是通过多拷贝整合用于表达带ScTHD3启动子的XI基因的表达盒所获得的转化的菌株。
[通过多拷贝整合XI基因制备xyl1/xyl2双缺失突变体(使用KmPIR1和KmCTR1启动子)]
按下文描述的方式制备用于表达带KmPIR1启动子的XI基因的表达盒和用于表达带KmCTR1启动子的XI基因的表达盒。
首先，使用酿酒酵母S288C株的基因组DNA作为模板和引物Bss-HIS3d-F
(acgttgtaaaacgacggccagtgagcgcgccctgcagggaaggcaaagatgacagagcagaaagccc(SEQ ID NO:55))和HIS3d-R(gcgcgcctcgttcagaatgacacgtatagaatg(SEQ ID NO:56))，PCR扩增HIS3d标记物片段。
接着，使用马克斯克鲁维酵母DMKU3-1042株的基因组DNA作为模板并且分别使用引物HIS3-KmPIR1-2921F(acgtgtcattctgaacgaggcgcgctgtataaattgaaatgtttggattgaaaagggaagc(SEQ ID NO:57))和KmPIR1-1R(tgtataaatcggggtatgtgtgtgttggtaaaaacg(SEQ ID NO:58))以及引物HIS3-KmCTR1-521F(acgtgtcattctgaacgaggcgcgctcttggacaaaaaacgcatattgcgaggtttataac(SEQ ID NO:59))和KmCTR1-1R(cttgattgttcaattgtcaattgtcaatgggcttcttgtcgtc(SEQ ID NO:60))，PCR扩增KmPIR1启动子片段(2.92kb)和KmCTR1启动子片段(0.52kb)。
随后，使用pRS434XYL2d-RsXI(图5)作为模板并使用引物KmPIR1-RsXI-F
(acacacacataccccgatttatacaatgtctcaaatttttaaggatatcccagttattaaatatg(SEQ ID NO:61))和Bss-ScPGK1t-R(atgaccatgattacgccaagcgcgccctgcaggtaaacttaaaatacgctgaacccgaacatag(SEQ ID NO:62))，PCR扩增KmPIR1-RsXI-ScPGK1t片段。
对PCR扩增的以上每个DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳并且通过标准方法纯化目的DNA片段。将获得的HIS3d标志物片段、KmPIR1启动子片段和KmPIR1-RsXI-ScPGK1t片段混合并且使用引物Bss-HIS3d-F和Bss-ScPGK1t-R，通过融合PCR连接这三个片段。用限制性酶BssHII消化获得的片段。将消化的片段连接至pRS434GAP载体的BssHII位点，从而制备pRS434KmPIR1p-RsXI(图6)。
类似地，使用pRS434XYL2d-RsXI(图5)作为模板和引物KmCTR1-RsXI-F(gacaattgacaattgaacaatcaagatgtctcaaatttttaaggatatcccagttattaaatatg(SEQ ID NO:63))和Bss-ScPGK1t-R，PCR扩增KmCTR1-RsXI-ScPGK1t片段。按上文描述的方式通过融合PCR连接这三个片段，即，如此获得 的片段和以上片段。将获得的片段连接至pRS434GAP载体的BssHII位点，从而制备pRS434KmCTR1p-RsXI(图7)。
随后，使用pRS434KmPIR1p-RsXI(图6)和pRS434KmCTR1p-RsXI(图7)作为模板和引物HIS3d-F和PGK1t-R，进行PCR。因此，扩增ScHIS3-KmPIR1p-RsXI-ScPGK1t片段和ScHIS3-KmCTR1p-RsXI-ScPGK1t片段。将获得的扩增片段分别引入KM103株中。在SD-His琼脂培养基上培育菌落。通过精制菌落所获得的菌株命名为KM303株和KM306株。具体而言，KM303株和KM306株是转化的菌株，其中使用KmPIR1启动子和KmCTR1启动子，已经通过多拷贝整合分别引入表达XI基因的表达盒。
[在木糖培养基中增殖用XI基因转染的xyl1/xyl2双缺失突变体]
将马克斯克鲁维酵母DMKU3-1042、RAK6163、KM103、KM203、KM303和KM306株分别接种至L形试管(5ml)中制备的含碳源(木糖)的SX培养基(YNB：6.7g/l；CSM：0.77g/l；木糖：20g/l)，随后进行增殖测试。使用生物光学记录仪TVS062CA(ADVANTEC，东京，日本)，在30℃和70转/分钟实施增殖测试。图8显示增殖测试结果。
如从图8理解，发现通过吸收培养基中的少量葡萄糖，RAK6163株、KM103株和KM203株已经略微地增殖直至约10小时；然而，这些菌株在10小时后不能增殖，表明它们不能利用木糖作为碳源增殖。结果表明xyl1缺失菌株(RAK6163)不能利用木糖作为碳源而增殖，并且由通过单拷贝整合或多拷贝整合引入到染色体上的ScTDH3启动子待表达的RsXI基因(即，KM103和KM203)不显示足以利用木糖作为碳源而增殖的XI活性。
同时，如从图8理解，KM303和KM306株能够利用木糖作为碳源增殖。结果表明由通过多拷贝整合引入到染色体上的KmPIR1启动子待表达的每个RsXI和由通过多拷贝整合引入到染色体上的KmCTR1启动子待表达的RsXI可以表达足以利用木糖作为碳源而增殖的XI活性。
此外，图9是显示与KM203株、KM303株和KM306株的增殖测试结果相比，W700M2株的增殖测试结果的曲线。这里，W700M2株是通过 改善PPP基因和XKS1基因在通常可获得的酿酒酵母W303-1B株中的表达并将ScHOR7p-RsXI整合至其中已经缺失GRE3基因的菌株中所产生的菌株。ScHOR7p-RsXI是酿酒酵母HOR7基因的启动子并且被称作高表达启动子。W700M2株是具有以上构造的基因重组体，并且因此它可以利用木糖作为碳源增殖。即，W700M2株可以用作这个实验中的阳性对照。如图9中所示，发现KM303和KM306菌株以及阳性对照，即W700M2菌株能够利用木糖作为碳源增殖。
以上结果揭示，当作为引入外来基因至耐热性酵母中的启动子使用时，马克斯克鲁维酵母PIR1启动子和马克斯克鲁维酵母CTR1启动子显示优异的启动子活性并且具有造成外来基因表达足够程度的能力。
[参考实验]
通过下一代序列转录分析就吸收木糖和吸收葡萄糖时的基因表达而言分析作为耐热性酵母的马克斯克鲁维酵母。
首先，将马克斯克鲁维酵母DMKU3-1042分别在YPD(2％葡萄糖)培养基和YPX(2％木糖)培养基中各培养18小时。在培养后，提取RNA并且使用Illumina GAII，通过单末端法，通过mRNA测序实施下一代序列转录分析。将获得的数据组装成制备的基因组序列草图。将绘制的区域提取并且计算每100-bp区域的读取数目，从而获得该区域的转录物量。
在这个实验中，按转录物量的顺序列出在YPD培养基或YPX培养基中表达的多于2000种基因。这里，在预测的马克斯克鲁维酵母ORF当中，将在酿酒酵母ORF当中找不到的ORF以4个字母和至少一个数字字符的组合命名。例如，作为mRNA测序的结果在酿酒酵母ORF当中找不到特定ORF时，这个特定ORF以4个字母和至少一个数字字符的组合命名，所述字母由来自ATG起始密码子的4个氨基酸的单字母记号限定，所述数字字符表示该ORF的核苷酸长度。例如，它可以命名为"MIFP960"或"MFRK1161”。根据这种命名法，在预测的马克斯克鲁维酵母ORF当中，与酿酒酵母ORF不对应的ORF可以在不重复使用相同名称的情况下命名。
以上实施例中所检验的马克斯克鲁维酵母PIR1基因和马克斯克鲁维酵母CTR1基因就每种培养基的转录物量而言排序在第10位之后。即，基于参考实验的结果，不能期望马克斯克鲁维酵母PIR1基因和马克斯克鲁维酵母CTR1基因的启动子作为高表达启动子发挥作用。同时，发现当吸收木糖或葡萄糖时，在实施例1中为比较所检验的TEF1基因、HSP26基因和PCK1基因比马克斯克鲁维酵母PIR1基因和马克斯克鲁维酵母CTR1基因更大程度地表达。因此，这些基因、HSP26基因和PCK1基因的启动子可以视作比马克斯克鲁维酵母PIR1基因和马克斯克鲁维酵母CTR1基因的启动子更有前景的候选高表达启动子。
另外，当吸收木糖和吸收葡萄糖时使用微阵列就基因表达而言评价马克斯克鲁维酵母。对于微阵列分析，使用Roche Diagnostics提供的Nimble Genmicroarray合同服务。作为RNA样品，将酵母在2.5ml YPD培养基或YPX(含有2％木糖替代用于YPD的葡萄糖)培养基中培养24小时并且随后使用QIAGEN RNAeasy微量试剂盒(Qiagen)制备。
作为微阵列分析的结果，揭示马克斯克鲁维酵母PIR1基因和马克斯克鲁维酵母CTR1在每种培养基中没有高度表达。特别地，马克斯克鲁维酵母PIR1基因甚至不排在前100个基因以内。基于这些结果，不可能期望马克斯克鲁维酵母PIR1基因和马克斯克鲁维酵母CTR1基因的启动子作为能够在耐热性酵母中高度表达的启动子发挥作用。

Claims (12)

1.PIR1启动子，其位于马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)染色体上的PIR1基因上游并且包含控制PIR1基因表达的区域，并且包含SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的PIR1启动子，其包含核苷酸序列，所述核苷酸序列由来自SEQID NO:1所示的核苷酸序列的3’末端的至少1000个核苷酸组成。
3.根据权利要求1所述的PIR1启动子，其包含核苷酸序列，所述核苷酸序列由来自SEQID NO:1所示的核苷酸序列的3’末端的至少2000个核苷酸组成。
4.核酸构建体，其包含根据权利要求1至3中任一项所述的PIR1启动子。
5.表达载体，其包含根据权利要求1至3中任一项所述的PIR1启动子。
6.根据权利要求5所述的表达载体，其还包含位于所述PIR1启动子下游的基因。
7.转化体，其中根据权利要求1至3中任一项所述的PIR1启动子插入在目的基因的上游。
8.根据权利要求7所述的转化体，其中目的基因是外来基因。
9.根据权利要求7所述的转化体，其中使用耐热性酵母细胞作为宿主细胞。
10.根据权利要求7所述的转化体，所述转化体能够引起基于纤维素的生物量糖化和乙醇发酵。
11.用于制备物质的方法，包括培养根据权利要求7至10中任一项所述的转化体和收集在培养后的培养基和/或转化体中产生的目的物质。
12.根据权利要求11所述的用于制备物质的方法，其中目的物质是通过乙醇发酵从糖制备的乙醇，所述糖是通过糖化基于纤维素的生物量获得的糖。
CN201380012169.2A 2012-03-02 2013-03-04 启动子及其用途 Expired - Fee Related CN104220600B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2012-046539 2012-03-02
JP2012046539A JP5878396B2 (ja) 2012-03-02 2012-03-02 新規プロモーター及びその利用
PCT/JP2013/001302 WO2013128948A1 (en) 2012-03-02 2013-03-04 Novel promoter and use thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104220600A CN104220600A (zh) 2014-12-17
CN104220600B true CN104220600B (zh) 2017-03-29

Family

ID=48045625

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380012169.2A Expired - Fee Related CN104220600B (zh) 2012-03-02 2013-03-04 启动子及其用途

Country Status (5)

Country Link
US (1) US9732338B2 (zh)
JP (1) JP5878396B2 (zh)
CN (1) CN104220600B (zh)
BR (1) BR112014021476A2 (zh)
WO (1) WO2013128948A1 (zh)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3344762A1 (en) * 2015-09-04 2018-07-11 Lallemand Hungary Liquidity Management LLC Yeast strains for the expression and secretion of heterologous proteins at high temperatures
CN108486105B (zh) * 2018-02-22 2021-10-26 复旦大学 一种马克斯克鲁维酵母启动子及其制备方法与应用
KR20200029954A (ko) 2018-09-11 2020-03-19 (주)가우비즈 지역축제 스마트 쇼핑을 위한 o2o 서비스 시스템 및 그 서비스 방법
FR3122436A1 (fr) 2021-04-30 2022-11-04 IFP Energies Nouvelles Insertion multicopies d’un gène d’intérêt dans le génome d’un champignon
CN117568349B (zh) * 2024-01-15 2024-04-30 上海昌进生物科技有限公司 真菌来源启动子元件p22及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011099263A1 (ja) * 2010-02-09 2011-08-18 国立大学法人山口大学 クルイベロマイセス・マルシアヌス由来の高発現プロモーター

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU5811194A (en) 1992-12-11 1994-07-04 Quest International B.V. The use of the (kluyveromyces marxianus) inulinase gene promoter for protein production
DE19943383B4 (de) 1999-09-10 2006-03-16 Tad Pharma Gmbh Regulatorische Sequenzen und Expressionskassetten für Hefen
WO2011078262A1 (ja) 2009-12-22 2011-06-30 株式会社豊田中央研究所 キシロースイソメラーゼ及びその利用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011099263A1 (ja) * 2010-02-09 2011-08-18 国立大学法人山口大学 クルイベロマイセス・マルシアヌス由来の高発現プロモーター

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Construction of efficient centromeric，multicopy and expression vectors for the yeast Kluyveromyces marxianus using homologous elements and the promoter of a purine-cytosine-like permease;Ball Maria M et al;《J. Mol. Microbiol. Biotechnol》;19911101;第1卷(第2期);摘要，第348页右栏前三段，第352页左栏第2段 *
Construction of efficient centromeric，multicopy and expression vectors for the yeast Kluyveromyces marxianus using homologous elements and the promoter of a purine-cytosine-like permease;Ball Maria M et al;《J. Mol. Microbiol. Biotechnol》;19991101;第1卷(第2期);摘要，第348页右栏前三段，第352页左栏第2段 *
Kluyveromyces marxianus：a yeast emerging from its sister’s shadow;Lane M M et al;《Fungal Biology Reviews》;20100201;第24卷(第1-2期);第23页右栏第2段 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN104220600A (zh) 2014-12-17
US9732338B2 (en) 2017-08-15
JP5878396B2 (ja) 2016-03-08
BR112014021476A2 (pt) 2017-07-18
US20150031103A1 (en) 2015-01-29
JP2013179899A (ja) 2013-09-12
WO2013128948A1 (en) 2013-09-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108949601B (zh) 利用木糖生产达玛烯二醇和原人参二醇的重组酿酒酵母菌及构建方法
Wisselink et al. Novel evolutionary engineering approach for accelerated utilization of glucose, xylose, and arabinose mixtures by engineered Saccharomyces cerevisiae strains
JP6087854B2 (ja) 組換え酵母を用いたエタノールの製造方法
CN104220600B (zh) 启动子及其用途
WO2011065539A1 (ja) バイオマスからのエタノールの生産方法
US20130295631A1 (en) Combinatorial design of highly efficient heterologous pathways
CN102459566A (zh) 过表达atp降解酶的重组酿酒酵母菌株中乙醇产量的提高和生物质积累的减少
Xia et al. Combined strategy of transcription factor manipulation and β-glucosidase gene overexpression in Trichoderma reesei and its application in lignocellulose bioconversion
CN104024419A (zh) 使用了重组酵母的乙醇的制造方法
JP5590140B2 (ja) 組換え酵母を用いたエタノールの製造方法
JP6616311B2 (ja) キシロースからエタノールを生産する酵母
CN106434700B (zh) 一种提高乙醇产率的酿酒酵母spt15定点饱和基因突变方法
CN105087631A (zh) 一种提高酿酒酵母木糖吸收和利用能力的方法
JP6697780B2 (ja) ストレス応答プロモーター
CN113684191A (zh) 梨头霉甾体11β-羟化酶CYP5311B2突变体构建及其应用
WO2020138020A1 (ja) 組換え酵母及びこれを用いたエタノールの製造方法
WO2020023890A1 (en) Increased alcohol production from yeast producing an increased amount of active crz1 protein
CN105492612A (zh) 重组纤维素糖化酶混合物和重组酵母复合菌株及其用途
WO2014021163A1 (ja) 組換え酵母を用いたエタノールの製造方法
CN115058350B (zh) 一种引入钾离子转运体提高s-腺苷甲硫氨酸产量的方法
US20230220426A1 (en) Methods and compositions for enhanced ethanol production in yeast cells
CN109913381B (zh) 一种利用调控细胞周期转录因子提高发酵乙醇产率的方法
JP2017085918A (ja) キシロースからエタノールを生産する酵母
Pereira Bioethanol: Robust production strains for process intensification
Mande Evaluation of five saccharomyces cerevisiae promoter during growth on xylose

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20170329

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee