WO2020007823A1 - Souches de saccharomyces cerevisiae exprimant des enzymes glucoamylase et xylanase exogènes et leur utilisation dans la production de bioéthanol - Google Patents

Souches de saccharomyces cerevisiae exprimant des enzymes glucoamylase et xylanase exogènes et leur utilisation dans la production de bioéthanol Download PDF

Info

Publication number
WO2020007823A1
WO2020007823A1 PCT/EP2019/067668 EP2019067668W WO2020007823A1 WO 2020007823 A1 WO2020007823 A1 WO 2020007823A1 EP 2019067668 W EP2019067668 W EP 2019067668W WO 2020007823 A1 WO2020007823 A1 WO 2020007823A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
saccharomyces cerevisiae
glucoamylase
xylanase
yeast
strain
Prior art date
Application number
PCT/EP2019/067668
Other languages
English (en)
Inventor
Georges Pignede
Maud PETIT
Benoît THOMAS
Sébastien HULIN
Original Assignee
Lesaffre Et Compagnie
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lesaffre Et Compagnie filed Critical Lesaffre Et Compagnie
Priority to EP19758897.3A priority Critical patent/EP3818074A1/fr
Priority to BR112020026979-4A priority patent/BR112020026979A2/pt
Priority to US17/257,107 priority patent/US11473072B2/en
Priority to CN201980051927.9A priority patent/CN112771069A/zh
Publication of WO2020007823A1 publication Critical patent/WO2020007823A1/fr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C07K14/39—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts
    • C07K14/395—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts from Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C12N1/18—Baker's yeast; Brewer's yeast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01003—Glucan 1,4-alpha-glucosidase (3.2.1.3), i.e. glucoamylase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01008—Endo-1,4-beta-xylanase (3.2.1.8)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • the present invention relates to yeast strains of Saccharomyces cerevisiae genetically modified so as to co-express genes encoding glucoamylases of fungal origin and of Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus, and a gene encoding a fungal xylanase.
  • Such strains find, in particular, application in the production of biofuel, in particular bioethanol.
  • the present invention also relates to a process for obtaining these yeasts and to the use of these yeasts in the production of bioethanol.
  • the so-called first generation bioethanol is produced by fermentation of hexoses (six-carbon sugars) contained in biomass rich in starch (corn kernels, barley, wheat, cassava, potato tubers, etc.) or in sucrose (cane sugar, sugar beet, sugar sorghum etc.), while so-called second generation bioethanol is generated by the transformation of cellulose and hemicellulose contained in agricultural residues such as cereal straws, corn stover, residues forest, wood, energy crops such as switchgrass or short or very short rotation coppice (poplar for example).
  • the industrial preparation includes the use of Saccharomyces cerevisiae yeast strains, which allow the glucose of the biomass to be fermented into ethanol with an alcoholic titer, high productivity and yield.
  • the process for converting starch to bioethanol includes pre-hydrolysis and liquefaction of starch from biomass, conversion of liquefied starch to fermentable sugars (by hydrolysis of starch), and fermentation of these sugars in ethanol - these last two stages are often carried out simultaneously.
  • the hydrolysis of starch requires the action of so-called amylolytic enzymes.
  • Saccharomyces cerevisiae yeasts are generally devoid of this type of enzyme
  • the production of ethanol from biomass composed of starch is carried out in two stages: a first stage of adding amylolytic enzymes to the biomass so as to pre-hydrolyze and liquefy the starch contained in the biomass, and a second step where other enzymes (amylolytic enzymes, enzyme cocktails, proteases, and / or trehalase, etc.) are used to hydrolyze the starch liquefied and a strain of Saccharomyces cerevisiae to ferment the fermentable sugars thus released.
  • enzymes amylolytic enzymes, enzyme cocktails, proteases, and / or trehalase, etc.
  • Saccharomyces cerevisiae comprising, integrated into their genome, exogenous glucoamylase genes.
  • These genetically modified Saccharomyces cerevisiae strains allow partial hydrolysis of liquefied starch and alcoholic fermentation to be carried out simultaneously (WO 2017/037362).
  • WO 2017/037362 Despite the increased performance of the modified Saccharomyces cerevisiae strains, there is still a need for new and improved yeast strains for the production of first generation ethanol.
  • the present invention relates to Saccharomyces cerevisiae yeast strains which have improved properties compared to specialized yeast strains commonly used in the production of first generation bioethanol, and also compared to Saccharomyces cerevisiae strains comprising, integrated into their genome, exogenous glucoamylase genes (WO 2017/037362). More specifically, the inventors of the present invention have developed a genetically modified strain of Saccharomyces cerevisiae, said strain co-expressing several heterologous glucoamylase genes, and a heterologous xylanase gene.
  • Saccharomyces cerevisiae strains according to the invention coexpress both a gene encoding a glucoamylase of fungal origin and a gene encoding the glucoamylase of Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus, as well as a xylanase gene of fungal origin.
  • the inventors have demonstrated that these strains are capable of hydrolyzing the liquefied starch extracted from the biomass while successfully fermenting the sugars resulting from this hydrolysis.
  • the use of a yeast strain according to the present invention makes it possible to replace all or part of the quantity of exogenous enzymes necessary during the conversion of the liquefied starch into bioethanol and produces bioethanol with a higher yield. that the strains known in the art.
  • the present invention relates to a yeast strain of Saccharomyces cerevisiae, characterized in that it co-expresses:
  • the fungal xylanase is an Aspergillus niger xylanase or a Trichoderma reesei xylanase.
  • the xylanase of fungal origin can be an AspergiUus niger xylanase which is coded by the nucleic sequence SEQ ID NO: 5 or which consists of the polypeptide sequence SEQ ID NO: 6 or a functional variant of the polypeptide sequence SEQ ID NO: 6.
  • the xylanase of fungal origin can be a Trichoderma reesei xylanase which is coded by the nucleic sequence SEQ ID NO: 7 or which consists of the polypeptide sequence SEQ ID NO: 8 or a functional variant of the polypeptide sequence SEQ ID NO: 8.
  • the glucoamylase of Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus is encoded by the nucleic sequence SEQ ID NO: 3 or consists of the polypeptide sequence SEQ ID NO: 4 or a functional variant of the polypeptide sequence SEQ ID NO: 4.
  • the glucoamylase of fungal origin is chosen from the group consisting of: a glucoamylase from Aspergillus niger, a glucoamylase from Saccharomycopsis fibuligera, a glucoamylase from Trichoderma reesei, a glucoamylase from Thermomyces lanuginosis, a glucoamylase from Rhiz and an Aspergillus oryzae glucoamylase.
  • the fungal glucoamylase can be an Aspergillus niger glucoamylase which is coded by the nucleic sequence SEQ ID NO: 1 or which consists of the polypeptide sequence SEQ ID NO: 2 or a functional variant of the polypeptide sequence SEQ ID NO: 2.
  • the yeast strain of Saccharomyces cerevisiae according to the invention comprises:
  • n is an integer between 2 and 10
  • p is an integer between 2 and 10.
  • m is 1 or 4.
  • n 6 and p is 4.
  • the gene encoding fungal xylanase, the gene encoding fungal glucoamylase, and the gene encoding Saccharomyces cerevisiae var glucoamylase. diastaticus are integrated within the genome of the yeast strain of Saccharomyces cerevisiae according to the invention.
  • the yeast strain of Saccharomyces cerevisiae according to the invention is the strain deposited on April 26, 2017 at the CNCM under the number 1-5201.
  • the present invention relates to a method for obtaining a yeast strain of Saccharomyces cerevisiae useful for the production of bioethanol, said method comprising the steps consisting in:
  • step (b) culture and ferment the yeast obtained in step (a) on a synthetic dextrin medium;
  • the present invention relates to a method for increasing the yield of bioethanol production of a yeast strain of Saccharomyces cerevisiae, said method comprising the steps consisting in:
  • step (b) genetically modifying the yeast of step (a) so that it additionally expresses a gene coding for a xylanase of fungal origin;
  • step (c) culture and ferment the yeast obtained in step (b) on a synthetic dextrin medium
  • the method for increasing the yield of bioethanol production of a yeast strain of Saccharomyces cerevisiae is characterized in that the yeast of Saccharomyces cerevisiae of step (a) is the yeast strain of Saccharomyces cerevisiae filed on July 9, 2015 at the CNCM under number 1-4997.
  • the present invention relates to a method for producing bioethanol from a biomass, said biomass method comprising the steps consisting in:
  • step (b) reacting the liquefied starch obtained in step (a) with a strain of yeast
  • Saccharomyces cerevisiae for producing bioethanol
  • step (c) extract the bioethanol produced in step (b).
  • the present invention also relates to the use of a yeast strain of Saccharomyces cerevisiae disclosed here, for the production of bioethanol.
  • the present invention relates to yeast strains Saccharomyces cerevisiae having a high yield in production of first generation bioethanol, in particular bioethanol produced from biomass comprising starch.
  • yeast strain refers to a relatively homogeneous population of yeast cells.
  • a yeast strain is obtained from a clone, a clone being a population of cells obtained from a single yeast cell.
  • a starting strain of Saccharomyces cerevisiae yeast is any strain of Saccharomyces cerevisiae which can be genetically modified to introduce the heterologous xylanase and glucoamylase genes according to the invention.
  • the starting Saccharomyces cerevisiae strain is a strain known to be useful in the production of bioethanol, such as, for example, the yeasts of Saccharomyces cerevisiae used by the first generation ethanol producers, which are yeasts specialized to optimize the profitability of the production process.
  • yeasts which are well known in the art, include: Ethanol Red ® (LEAF), Thermosacc ® (Lallemand), Angel Super Alcohol ® (Angel) and Fali ® (AB Mauri).
  • the expected qualities of these yeasts are their capacity to rapidly produce high concentrations of ethanol and to exhaust the sugars from the fermentation media over the temperature and pH ranges representative of industrial conditions.
  • the strains according to the present invention are improved strains compared to the Saccharomyces cerevisiae yeast strains previously developed by the present inventors, that is to say compared to Saccharomyces cerevisiae yeast strains where the introduction of a gene encoding the glucoamylase of Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus and a gene encoding a fungal glucoamylase had made it possible to obtain strains with excellent capacities for starch hydrolysis (WO 2017/037362).
  • glucoamylase an amino acid sequence which, when expressed, results in the formation of a functional glucoamylase protein.
  • glucoamylase is meant here an enzyme capable of hydrolyzing the ⁇ -1,4 glycosidic bonds of raw or soluble starch from the non-reducing end of amylose and amylopectin.
  • Amylases are also known by the name of amyloglucosidases or g-amylases (Medline reference: EC 3.2.1.3).
  • glucoamylase is capable of slowly hydrolyzing the ⁇ -1,6 bonds of amylopectin molecules, provided that the neighboring bond in the sequence is a bond a- 1,4.
  • fungal glucoamylase designates any glucoamylase originating from a fungus (fungus or fungus) and whose corresponding gene can be integrated into the genome of a yeast strain so that the expression of the gene results in the formation of a functional glucoamylase protein.
  • a glucoamylase of fungal origin can be chosen from commercial glucoamylases known for their good enzymatic activity.
  • a fungal glucoamylase can be selected from the group consisting of: a glucoamylase from Aspergillus niger, a glucoamylase from Saccharomycopsis fibuligera, a glucoamylase from Trichoderma reesei, a glucoamylase from Rhizopus oryzae, a glucoamylase of "Aspergillus oryzae and a glucoamylase Thermomyces lanuginosis.
  • glucoamylases are known to those skilled in the art, and their sequences are accessible under the following GenBank references (www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/): Trichoderma reesei (ETS06561 ), Rhizopus oryzae (BAA00033), Aspergillus oryzae (BAA00841), Thermomyces lanuginosus (ABQ23180).
  • the glucoamylase of fungal origin is a glucoamylase from Aspergillus niger or from Saccharomycopsis fibuligera.
  • the glucoamylase of Aspergillus niger is coded by the GLAA gene which has the nucleic sequence SEQ ID NO: 1, and has the protein sequence the sequence SEQ ID NO: 2.
  • the glucoamylase of Saccharomycopsis fibuligera is coded by the gene GLU0111 which has the nucleic sequence SEQ ID NO: 9, and has the protein sequence sequence SEQ ID NO: 10.
  • the glucoamylase of Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus is encoded by the STA1 gene which has the nucleic sequence SEQ ID NO: 3, and has the protein sequence the sequence SEQ ID NO: 4.
  • a yeast strain of Saccharomyces cerevisiae according to the invention is characterized in that it co-expresses:
  • such a strain of Saccharomyces cerevisiae can in particular be characterized in that it contains the nucleic sequence SEQ ID NO: 1 and the nucleic sequence SEQ ID NO: 3.
  • such a strain of Saccharomyces cerevisiae can in particular be characterized in that the glucoamylase of Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus has the protein sequence SEQ ID NO: 4 and the glucoamylase of Aspergillus niger has the protein sequence SEQ ID NO: 2.
  • a yeast strain of Saccharomyces cerevisiae according to the invention differs from the strain of Saccharomyces cerevisiae previously developed by the present inventors (WO 2017/037362) in that in addition to the gene encoding a glucoamylase of fungal origin; and the gene encoding the glucoamylase of Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus, it also co-expresses a gene coding for a xylanase of fungal origin.
  • xylanase an amino acid sequence which, when expressed, results in the formation of a functional xylanase protein.
  • xylanase is meant here a glycoside hydrolase enzyme which hydrolyzes the (l 4) -PD-xylosidic bonds in xylans, thus generating xylose.
  • Xylanases are also known by the name of endo- 1, 4- -xylanases (Medline reference: EC 3.2.1.8). These enzymes are involved in the breakdown of hemicellulose, one of the main constituents of cell walls in plants. They are produced in particular by fungi, bacteria, yeasts, seaweed, protozoa, snails, crustaceans, insects and certain seeds, but not by mammals.
  • xylanase is a xylanase of fungal origin.
  • xylanase of fungal origin designates any xylanase originating from a fungus (fungus or fungus) and the corresponding gene of which can be integrated into the genome of a yeast strain so that the expression of the gene results in the formation of a functional xylanase protein.
  • a xylanase of fungal origin can be chosen from commercial xylanases known for their good enzymatic activity.
  • a fungal xylanase can be selected from the group consisting of: an Aspergillus niger xylanase, an Aspergillus awamori xylanase, an Aspergillus tubingensis xylanase, an Aspergillus nidulans xylanase , and a Trichoderma reesei xylanase.
  • GenBank references www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/: Aspergillus niger (FJ785738), Aspergillus awamori (X78115), Aspergillus tubingensis (L26988), Aspergillus nidulans (Z49892), and Trichoderma reesei (X69573).
  • the xylanase of fungal origin is a Aspergillus niger or Trichoderma reesei xylanase.
  • the Aspergillus niger xylanase is encoded by the XYN1 gene which has the consensus nucleic sequence SEQ ID NO: 5, and has the protein sequence the sequence SEQ ID NO: 6.
  • Trichoderma reesei xylanase is encoded by the XYN2 gene which has the consensus nucleic sequence SEQ ID NO: 7, and has the protein sequence the sequence SEQ ID NO: 8.
  • fungal glucoamylase and “Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus "should not be interpreted strictly: they include the glucoamylases of fungal origin and of Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus which are coded by the nucleic sequences as described above, but also the functional variants of these glucoamylases.
  • xylanase of fungal origin encompasses xylanases of fungal origin which are encoded by the nucleic sequences as described above, but also the functional variants of these xylanases.
  • a functional variant of a glucoamylase or of a xylanase according to the invention has a protein sequence having a percentage identity of at least 80%, 90%, or 95%, more particularly 99%, with the protein sequence of said glucoamylase or xylanase, respectively.
  • the functional variants of the glucoamylase of Aspergillus niger have a protein sequence exhibiting a percentage identity of at least 80%, at least 90%, or at least 95%, more particularly at least minus 99%, with the sequence SEQ ID NO: 2; functional variants of the glucoamylase of Saccharomyces cerevisiae var.
  • diastaticus have a protein sequence having a percentage identity of at least 80%, at least 90%, or at least 95%, more particularly 99%, with the sequence SEQ ID NO: 4; the functional variants of the Aspergillus niger xylanase have a protein sequence having a percentage identity of at least 80%, at least 90%, or at least 95%, more particularly 99%, with the sequence SEQ ID NO: 6; and the functional variants of Trichoderma reesei xylanase have a protein sequence having a percentage identity of at least 80%, at least 90%, or at least 95%, more particularly 99%, with the sequence SEQ ID NO: 8.
  • Percent Identity is a comparison between amino acid sequences, and is determined by comparing two optimally aligned sequences on a comparison window. A person skilled in the art knows how to calculate a percentage of identity between two sequences and has many tools allowing this. One of the two sequences can have amino acid insertions, substitutions and deletions compared to the other sequence.
  • glucoamylase a variant which retains the enzymatic activity of glucoamylase and this with similar kinetics of starch hydrolysis.
  • functional variant of a xylanase a variant which retains the enzymatic activity of the xylanase, and this with similar kinetics of xylan hydrolysis.
  • the strains according to the invention can be generated by any suitable method.
  • Those skilled in the art know, for example, multiple methods allowing to introduce a gene into a yeast strain, in particular via the use of vectors comprising expression cassettes.
  • the term “vector” is intended to mean any DNA sequence into which it is possible to insert fragments of foreign nucleic acids, the vectors making it possible to introduce foreign DNA into a host cell.
  • Examples of vectors are plasmids, cosmids, vectors derived from viruses.
  • the vectors allow either the integration of heterologous genes directly into the yeast genome, or their expression in an independent plasmid.
  • the introduction of vectors into a host cell is a process widely known to those skilled in the art. Several methods are notably described in “Current Protocols in Molecular Biology”, 13.7.1-13.7.10; or in Ellis et al., Intégrative Biology, 2011, 3 (2), 109-118.
  • a strain of Saccharomyces cerevisiae according to the invention is prepared from a strain of Saccharomyces cerevisiae previously developed by the present inventors and described in WO2017 / 037362 (that is to say say from a strain already containing a gene coding for a glucoamylase of fungal origin and a gene coding for a glucoamylase from Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus).
  • a strain of Saccharomyces cerevisiae according to the invention is prepared by integrating the three genes into a strain of Saccharomyces cerevisiae such as, for example, a specialized strain - see above.
  • the gene encoding a glucoamylase of fungal origin, the gene encoding the glucoamylase of Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus, and the gene encoding a xylanase of fungal origin can be inserted within a single vector, or within two or three separate vectors.
  • a suitable vector can be a plasmid.
  • a vector used to introduce a gene into a strain of Saccharomyces cerevisiae may contain a selection marker.
  • selection marker is intended to mean a gene the expression of which gives the yeasts which contain it a characteristic which makes it possible to select them. It may for example be an antibiotic resistance gene or a gene allowing the growth of yeast in a particular medium.
  • a gene (glucoamylase or xylanase) according to the invention is generally operably linked to a promoter, a terminator and / or any other sequence necessary for its expression in yeast.
  • the terms “operationally linked” and “operably linked” are used interchangeably and refer to a functional link between the elements allowing the expression of the gene and possibly its regulation (regulatory sequences 5 ′ and 3 ′) and the sequence of the reporter gene that they control.
  • a person skilled in the art knows how to select the promoters, terminators and other sequences necessary for the expression of a gene in a yeast of Saccharomyces cerevisiae.
  • the expression of a gene is controlled by a so-called “strong” promoter (that is to say a promoter having a transcriptional potential high so that the gene is strongly expressed).
  • a strong promoter is for example the pADH1 promoter, the pTEF promoter, or the pTDH3 promoter.
  • a yeast strain of Saccharomyces cerevisiae according to the invention can comprise several copies of at least one of the glucoamylase genes of fungal origin, of Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus, and xylanase of fungal origin.
  • a strain of Saccharomyces cerevisiae according to the invention comprises, m copies of the gene encoding the xylanase of fungal origin; n copies of the gene encoding the fungal glucoamylase; and p copies of the gene encoding the glucoamylase of Saccharomyces cerevisiae var.
  • n and p can independently be equal to 2, 3 , 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 and m can be equal to 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10.
  • m is equal to 1 or 4.
  • n is equal to 6 and p is equal to 4.
  • the invention relates in particular to the yeast strain of Saccharomyces cerevisiae which has been deposited, by the present Applicant, at the CNCM (National Collection of Cultures of Microorganisms, Institut Pasteur, 25-28 rue du Do Budapest Roux, 75 724 Paris Cedex 15 ), under the Budapest Treaty, under number 1-5201 on April 26, 2017.
  • This strain comprises 6 copies of the glucoamylase gene from AspergiUus niger, 4 copies of the glucoamylase gene from Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus and 1 copy of the Aspergillus niger xylanase gene.
  • II Method for obtaining Genetically Modified Saccharomyces cerevisiae Strains Useful for the Production of Bioethanol
  • the present inventors have also developed a method for obtaining strains of Saccharomyces cerevisiae useful in the production of bioethanol.
  • the method includes the steps of:
  • step (b) culture and ferment the yeast from step (a) on a synthetic dextrin medium
  • (c) select at least one strain exhibiting fermentation kinetics in the synthetic dextrin medium at least equal to or greater than the fermentation kinetics of the strain of Saccharomyces cerevisiae deposited on July 9, 2015 at the CNCM under number 1-4997.
  • step (a) of genetic modification it is preferable to select the clones having correctly integrated the genes introduced.
  • the yeast from step (a) which is used in step (b) is a clone having correctly integrated the gene coding for xylanase of fungal origin, the gene coding for glucoamylase of fungal origin, and the gene encoding the glucoamylase of Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus.
  • Those skilled in the art know how to select such clones, for example by using a selection marker introduced into the starting Saccharomyces cerevisiae yeast.
  • the Examples provided in this document describe an example of a method for selecting clones.
  • a clone obtained in step (a) is cultured in a medium rich (in nutrients, medium type YPG), then the culture supernatant is transferred to a minimum medium containing xylan as carbon source.
  • a second yeast the CelluX TM yeast (which was deposited by the Applicant on December 12, 2013 at the CNCM under the number 1-4829), is added to the reaction medium.
  • a clone is selected (that is to say identified as having correctly integrated the introduced genes), if there is growth of the CelluX TM strain.
  • the yeast strain of Saccharomyces cerevisiae obtained in step (a) of the method described above is a strain according to the present invention. Its characteristics are therefore identical to those described in the previous section.
  • synthetic dextrin medium is understood here to mean a cell culture medium, preferably a culture medium for yeast cells, containing dextrins, as known to those skilled in the art. It is for example a culture medium containing starch dextrins (220 g / kg), yeast extract (5 g / kg), urea (2 g / kg), potassium dihydrogen phosphate (1 g / kg) as well as minerals and vitamins (such as vitamin B1 and vitamin B6).
  • step (c) the selection of an efficient and useful strain of Saccharomyces cerevisiae in the production of bioethanol is done by comparing its fermentation kinetics with that of the strain of Saccharomyces cerevisiae deposited by the present Applicant on 9 July 2015 at the CNCM under the number 1-4997.
  • the kinetics of fermentation can be easily measured by various techniques known to those skilled in the art. For example, the fermentation kinetics can be measured via fermentation monitoring by weighing over time.
  • the strain 1-4997 which serves as a reference, is one of the strains previously developed by the present inventors and described in WO 2017/037362.
  • the strain of Saccharomyces cerevisiae 1-4997 comprises at least 4 copies of the gene coding for glucoamylase from Aspergillus niger and at least 3 copies of the gene coding for glucoamylase from Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus.
  • a strain selected by a method according to the present invention therefore necessarily has identical or superior fermentation properties to the strain Saccharomyces cerevisiae 1-4997, in a synthetic dextrin medium. Consequently, the present inventors have also developed a method making it possible to increase the yield of bioethanol production of a yeast strain of Saccharomyces cerevisiae. III - Method to Increase the Production Yield in Bioethanol of a Saccharomyces cerevisiae Strains
  • the present invention therefore also relates to a method making it possible to increase the yield of bioethanol production of a yeast strain of Saccharomyces cerevisiae, said method comprising the steps consisting in:
  • step (b) genetically modifying the yeast of step (a) so that it additionally expresses a gene coding for a xylanase of fungal origin;
  • step (c) culture and ferment the yeast obtained in step (b) on a synthetic dextrin medium
  • the strain of step (a) can be any strain of Saccharomyces cerevisiae co-expressing a gene encoding a glucoamylase of fungal origin, and a gene encoding the glucoamylase of Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus.
  • the glucoamylase of fungal origin is selected from the group consisting of: a glucoamylase from Aspergillus niger, a glucoamylase from Saccharomycopsis fibuligera, a glucoamylase from Trichoderma reesei, a glucoamylase from Rhizopus oryzae, a glucoamylase from " oryzae and a glucoamylase Thermomyces lanuginosis as described above
  • the fungal glucoamylase whose exogenous gene is present in the strain of Saccharomyces cerevisiae of step (a) is a glucoamylase from Aspergillus niger , for example an Aspergillus niger glucoamylase encoded by the nucleic sequence SEQ ID NO: 1 or an Aspergillus niger glucoamylase consisting of the polypeptide sequence S
  • the glucoamylase of Saccharomyces cerevisiae var. diasta ticus whose exogenous gene is present in the strain of Saccharomyces cerevisiae of step (a) is a glucoamylase from Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus encoded by the nucleic sequence SEQ ID NO: 3 or a glucoamylase from Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus consisting of the polypeptide sequence SEQ ID NO: 4 or a functional variant of the polypeptide sequence SEQ ID NO: 4.
  • the strain of step (a) is a strain of Saccharomyces cerevisiae co-expressing a gene encoding a glucoamylase of fungal origin, and a gene encoding the glucoamylase of Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus, as described in WO 2017/037362.
  • the strain of step (a) is the yeast strain of Saccharomyces cerevisiae deposited, by the present Applicant, on July 9, 2015 at the CNCM under the number 1-4997.
  • Step (b) of genetic modification can be carried out by any method known to a person skilled in the art, as already indicated above.
  • a selection can be made of the clones having correctly integrated the gene coding for the xylanase of fungal origin, for example by using a selection marker.
  • Steps (c) and (d) of the method making it possible to increase the yield of bioethanol production of a yeast strain of Saccharomyces cerevisiae can be carried out as indicated for the selection method according to the invention.
  • the invention also relates to any yeast strain obtained by a method of selection or increase in yield according to the invention.
  • the invention also relates to a yeast obtained by culture of one of the strains of the invention.
  • the methods for cultivating a yeast strain are known in the art, and those skilled in the art know how to optimize the culture conditions for each strain according to its nature.
  • the yeast strains of the invention and the yeasts obtained by culture of these strains are particularly advantageous for producing bioethanol from biomass, in particular from biomass containing starch.
  • the present invention therefore relates to the use of a strain of Saccharomyces cerevisiae according to the present invention for the production of bioethanol from a biomass containing starch.
  • the present invention also relates to a method for producing bioethanol from a biomass containing starch, said method comprising the steps consisting in: (a) prehydrolyzing (i.e. partially hydrolyzing) and liquefying the starch from the biomass;
  • step (b) reacting the biomass containing the pre-hydrolyzed and liquefied starch obtained in step (a) with a yeast strain of Saccharomyces cerevisiae according to the present invention to produce bioethanol; and
  • biomass refers to all organic matter of plant origin that can become a source of energy after transformation.
  • the biomass comes from agricultural or agro-food products and / or co-products.
  • a biomass can come from corn, wheat, barley, rye, sorghum, cassava, triticale, potato, sweet potato, sugar cane, sugar beet, sugar sorghum.
  • the biomass contains starch.
  • the starch-rich biomasses can be chosen, or come from, for example, corn kernels, barley, wheat, cassava, potato tubers, etc.
  • Steps (a), (b) and (c) of the method according to the invention can be carried out as in the case of a conventional process for producing bioethanol. Such steps are known to those skilled in the art.
  • the invention is particularly applicable to the production of bioethanol as a fuel, but also to the production of bioethanol for the food, chemical, pharmaceutical and cosmetic industries.
  • Figure 1 (A) Loss of mass observed for transformants of the strain deposited at the CNCM under the number 1-4997 during fermentation in the “Alcohol Max” medium. (B) Loss of mass observed for the transformants of strain number 1-4997 during fermentation in the “Dextrin” medium.
  • Figure 2 (A) Comparison of the fermentation kinetics of the different strains studied. (B) Comparison of the values of ethanol contents, glycerol / ethanol mass ratios as well as ethanol yields calculated on the glucose potential of the substrate used for the fermentation of the different strains studied.
  • Figure 3 Comparison of total sugars measured at the end of fermentation for the different strains studied.
  • Example 1 Obtaining and Characterization of Transformants of Strain 1-4997 containing 1 or 4 copies of a Gene coding for Aspergillus niger Xylanase (XYN1) or of a gene coding for Trichoderma reesei Xylanase (XYN2)
  • the strategy implemented to clone a xylanase activity in the strain of Saccharomyces cerevisiae ER-GAND-8159-C1 is based on the use of a multi-integrative expression system. With this system, it is possible to simultaneously integrate one or more copies of a gene encoding a given xylanase at a given locus.
  • the inventors chose to integrate 1 copy or 4 copies of one of the two genes XYN1 from Aspergillus niger and XYN2 from Trichoderma reesei in order to measure a possible effect linked to the number of copies on xylanase activity.
  • Aspergillus niger xylanase Aspergillus niger xylanase (XYN1).
  • the XYN1 gene which codes for AspergiUus niger xylanase was previously amplified by PCR using genetic material derived from the AspergiUus niger strain ATCC10577.
  • the PCR product was then cloned into an expression vector (developed internally) under the dependence of a strong promoter pADH1 and the terminator tCYCl.
  • the plasmid obtained serves as a matrix for the generation of the expression modules, as described in paragraph B below.
  • Trichoderma reesei xylanase (XYN2).
  • the Trichoderma reesei xylanase which has been used is encoded by the XYN2 gene.
  • the sequence used is the cDNA version, freed of its introns and optimized through codons to improve the translation of the protein in the yeast Saccharomyces cerevisiae.
  • the plasmid which has the XYN2 gene dependent on the pADH1 / tCYCl pair, was used as a PCR matrix to synthesize the expression modules.
  • the strategy employed by the inventors consisted in simultaneously integrating several expression modules of the xylanase genes in a strain of Saccharomyces cerevisiae in a single step at a given locus, based on the natural capacity of the yeast to carry out homologous recombination in vivo.
  • the inventors defined the PCR primers to be used to integrate the modules at the BUD5 locus.
  • 1 or 4 expression modules for A niger xylanase or T. reesei xylanase, as well as a selection module have been integrated.
  • Each amplified module has recombinogenic sequences (Al, Bl, Cl and Dl) on either side of its promoter and its terminator. These sequences are provided by the floating tails of the PCR primers (Table 1) and allow the modules to align and recombine specifically by homology between these recombinogenic sequences.
  • sequences homologous to a given locus for example the BUD5 locus, at the 5 ′ and 3 ′ ends of the multi-integrative expression cassette allows the simultaneous integration of the expression modules and of the selection module by homologous recombination at this given locus.
  • the selection of the clones having correctly integrated the expression modules is carried out initially on the basis of the presence of the selection module in the integration cassette.
  • the selection module includes a strong promoter / terminator pair and a gene whose expression confers on the yeasts which contain it a characteristic making it possible to select them on a given medium. The inventors have thus isolated the clones resulting from each transformation. Table 1: Listing of Primers Used and Nomenclature of Synthetic Expression Modules.
  • Table 2 Mixing of modules before transformation of the strain 1-4997.
  • Solid Phenotypic Test In this test, 5 ⁇ L of culture supernatant (YPG 5%, 30 ° C., 24 hours, 150 rpm) were deposited on a medium containing birch xylan, and the halos of xylan hydrolysis were visualized after staining with Congo red 1% and discoloration with 1 M NaCl. Hydrolysis halos were observed for all the clones considered).
  • Liquid Phenotypic Test This phenotypic characteristic is based on the same principle as that used for the selection of transformants (see above).
  • ER-GAND-8159 is the strain deposited at the CNCM under the number 1-4997.
  • Ethanol Red® is a strain deposited at the CNCM on September 4, 2008, by this Applicant, under the number 1-4071.
  • the “Alcohol Max” medium contains: 280 g / kg of sucrose, 5 g / kg of yeast extract, 4.7 g / kg of di-basic ammonium phosphate (DAP), 11.5 g / kg of citric acid, 13.5 g / kg sodium citrate, as well as minerals and vitamins.
  • DAP di-basic ammonium phosphate
  • the transformants were evaluated in a dextrin medium.
  • the strain used as host to integrate the expression modules of the xylanases corresponds to the strain ER-GAND-8159 (CNCM 1-4997) which has 2 genes of different origin from glucoamylase
  • the dextrins being molecules resulting from l hydrolysis of starch, the clones secreting glucoamylases are capable of degrading them into glucose and thus of producing ethanol.
  • the fermentation conditions used were identical to those used with the YFAM medium.
  • dextrin medium is meant a synthetic medium containing dextrins, as known to a person skilled in the art. It is for example a synthetic medium containing starch dextrins (220 g / kg), yeast extract (5 g / kg), urea (2 g / kg), dihydrogen phosphate potassium (1 g / kg) as well as minerals and vitamins.
  • transformants of the ER-GAND-8159 strain have 1 copy or 4 copies of the Aspergillus niger or Trichoderma reesei xylanase genes, using the one-step multi-copy integration strategy by obtaining specifically designed expression modules.
  • the inventors endeavored to validate, by PCR, the genotype of the transformants obtained as well as their phenotype of xylan hydrolysis, and they ensured that their capacities for ethanol production and for hydrolysis of l starch had not been negatively impacted by the genetic modifications made.
  • Table 4 Composition of Sugars Available in the Liquefied Substrate.
  • the liquefied substrate has a total glucose potential measured by the enzymatic method of 226 g giU co S e / kg su b s trat ⁇
  • Yeast Creams from Strains Selected for Evaluation were cultivated on a Petri dish for 24 hours and then stored in the refrigerator before use. Each strain was then removed and used to seed 100 ml of acid medium (for example YM medium) in 250 ml flasks. The flasks were placed in an incubator at a temperature of 26 ° C for 24 hours. At the end of this incubation, each medium was placed in centrifugation at 4500 rpm for 5 minutes. After removal of the supernatant, 150 ml of sterile water were added to wash the yeasts.
  • acid medium for example YM medium
  • Figure 2 (A) shows the fermentative kinetics observed. It appears that with the exception of the strain ER-GAND-XTR-1C-c18 which exhibits a delay in the initial kinetics, all the strains exhibit a similar start of fermentation during the first 36 hours of fermentation. After 36 hours, the reference strain ER-GAND-8159 slows down, as does the strain ER-GAND-XTR-1C-cl3 (I-5265) whose kinetics are identical. The two strains expressing the xylanase gene of Asp ergillus niger continue the fermentation at a higher speed and produce a greater amount of C0 2 during the test. The ER-GAND-XTR-lC-cl8 strain which had an initial kinetic delay catches up with the reference at 54 hours of fermentation and exceeds it to finish slightly behind compared to the two ER-GAND-XAN strains.
  • Figure 2 (B) illustrates the values of ethanol, glycerol / ethanol mass ratio as well as the ethanol yield calculated on the glucose potential of the substrate used.
  • Table 5 below presents all of the data collected during the tests to compare performance with the benchmark.
  • the left part of the table presents the raw values and the right part presents the gain observed in relative to the reference.
  • the strains showing a gain in ethanol production therefore exhibit a reduction in the production of glycerol in parallel.
  • this reduction in glycerol does not explain the gain in alcohol; the gain in yield comes from a more efficient consumption of glucose from the medium made possible by the action of xylanase produced by each strain.
  • This result is confirmed by the measurements of total sugars at the end of fermentation presented in Ligure 3: the strains with an advantage over their ethanol yield also have a reduced residual sugar level.
  • the action of xylanase on the fermentation matrix is beneficial to the action of glucoamylases by allowing them better access to the starch in the medium while reducing the glycerol response of the strains.
  • This double gain in sugar leads to better production of ethanol.
  • the ER-GAND-XTR-lc strain has a similar advantage, although slightly less in this example.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

La présente invention concerne des souches de levure de Saccharomyces cerevisiae génétiquement modifiées de manière à co-exprimer un gène codant une glucoamylase d'origine fongique, un gène codant une glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus, et un gène codant une xylanase d'origine fongique. Le rendement de production de bioéthanol par ces souches est supérieur à celui de souches identiques, par ailleurs, mais ne comprenant pas le gène codant la xylanase d'origine fongique. La présente invention concerne également un procédé d'obtention de ces levures ainsi que l'utilisation de ces levures dans la production de bioéthanol

Description

Souches de Saccharomyces Cerevisiae Exprimant des Enzymes Glucoamylase et Xylanase Exogènes et leur Utilisation dans la Production de Bioéthanol
Domaine de l’Invention
La présente invention concerne des souches de levure de Saccharomyces cerevisiae génétiquement modifiées de manière à co-exprimer des gènes codant des glucoamylases d’origine fongique et de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus, et un gène codant une xylanase d’origine fongique. De telles souches trouvent, en particulier, application dans la production de biocarburant, notamment de bioéthanol. La présente invention concerne également un procédé d’obtention de ces levures ainsi que l’utilisation de ces levures dans la production de bioéthanol.
Contexte de l’Invention
La diminution des ressources en énergies non renouvelables et la préoccupation grandissante devant l’augmentation des émissions de gaz à effet de serre sont à l’origine de la nécessité de trouver des sources d’énergie alternatives aux carburants fossiles (pétrole, charbon, gaz). La biomasse végétale issue des forêts, des produits et/ou des co produits agricoles ou agro-alimentaires constitue une source de carbone considérable pour la production de molécules d’intérêt industriel. L’éthanol produit à partir des sucres fermentescibles contenus dans les végétaux est utilisé dans les véhicules dotés de moteurs à combustion. La production du bioéthanol a ainsi connu un développement rapide aux cours des dernières années, avec une production mondiale en bioéthanol qui a plus que doublé en moins de dix ans (49.5 milliards de litres produits en 2007 contre 102 milliards de litres en 2016 - www.ethanolrfa.org/resources/industry/statistics/, Renewable Fuels Association). Les Etats-Unis et le Brésil restent les deux plus grands pays producteurs de bioéthanol, leurs productions combinées représentant 85% de la production mondiale.
Le bioéthanol dit de première génération est produit par fermentation des hexoses (sucres à six carbones) contenus dans les biomasses riches en amidon (grains de maïs, orge, blé, manioc, tubercules de pomme de terre, etc.) ou en saccharose (canne à sucre, betterave sucrière, sorgho sucrier etc.), tandis que le bioéthanol dit de deuxième génération est généré par transformation de la cellulose et de l’hémicellulose contenues dans les résidus agricoles tels que les pailles de céréales, les cannes de maïs, les résidus forestiers, le bois, les cultures énergétiques telles que le panic érigé ou les taillis à courte ou très courte rotation (peuplier par exemple).
Seul le bioéthanol de première génération est préparé à l’échelle industrielle aujourd’hui. La préparation industrielle comprend l’utilisation de souches de levure Saccharomyces cerevisiae , qui permettent de fermenter le glucose de la biomasse en éthanol avec un titre alcoolique, une productivité et un rendement élevés. Le processus permettant la conversion d’amidon en bioéthanol comprend une pré-hydrolyse et une liquéfaction de l’amidon de la biomasse, la conversion de l’amidon liquéfié en sucres fermentescibles (par hydrolyse de l’amidon), et la fermentation de ces sucres en éthanol - ces deux dernières étapes étant souvent réalisées de façon simultanée. L’hydrolyse de l’amidon nécessite l’action d’enzymes dites amylolytiques. Comme les levures Saccharomyces cerevisiae sont généralement dépourvues de ce type d’enzymes, la production d’éthanol à partir de biomasse composée d’amidon est effectuée en deux étapes: une première étape d’addition d’enzymes amylolytiques à la biomasse de manière à pré-hydrolyser et liquéfier l’amidon contenu dans la biomasse, et une deuxième étape où l’on utilise d’autres enzymes (enzymes amylolytiques, cocktails enzymatiques, protéases, et/ou tréhalase, etc...) pour hydrolyser l’amidon liquéfié et une souche de Saccharomyces cerevisiae pour fermenter les sucres fermentescibles ainsi libérés.
Dans le but de simplifier la production de bioéthanol à partir de biomasse composée d’amidon, le présent Déposant a développé des souches de Saccharomyces cerevisiae comprenant, intégrés dans leur génome, des gènes de glucoamylases exogènes. Ces souches de Saccharomyces cerevisiae génétiquement modifiées permettent de réaliser simultanément l’hydrolyse partielle de l’amidon liquéfié et la fermentation alcoolique (WO 2017/037362). Malgré l’augmentation des performances des souches de Saccharomyces cerevisiae ainsi modifiées, il existe toujours un besoin de disposer de nouvelles souches de levure améliorées pour la production d’éthanol de première génération.
Résumé de l’Invention
D’une façon générale, la présente invention concerne des souches de levure Saccharomyces cerevisiae qui présentent des propriétés améliorées par rapport aux souches de levure spécialisées couramment utilisées dans la production de bioéthanol de première génération, et également par rapport aux souches de Saccharomyces cerevisiae comprenant, intégrés dans leur génome, des gènes de glucoamylases exogènes (WO 2017/037362). Plus spécifiquement, les Inventeurs de la présente invention ont développé une souche de Saccharomyces cerevisiae génétiquement modifiée, ladite souche co-exprimant plusieurs gènes de glucoamylases hétérologues, et un gène de xylanase hétérologue. En particulier, les souches de Saccharomyces cerevisiae selon l’invention co-expriment à la fois un gène codant une glucoamylase d’origine fongique et un gène codant la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus, ainsi qu’un gène de xylanase d’origine fongique. Les Inventeurs ont démontré que ces souches étaient capables d’hydrolyser l’amidon liquéfié extrait de la biomasse tout en réussissant à fermenter efficacement les sucres issus de cette hydrolyse. En effet, l’utilisation d’une souche de levure selon la présente invention permet de remplacer tout ou partie de la quantité d’enzymes exogènes nécessaires lors de la conversion de l’amidon liquéfié en bioéthanol et produit du bioéthanol avec un rendement plus élevé que les souches connues dans l’art.
Ainsi, selon un premier aspect, la présente invention concerne une souche de levure de Saccharomyces cerevisiae, caractérisée en ce qu’elle co-exprime :
un gène codant une xylanase d’origine fongique;
un gène codant une glucoamylase d’origine fongique; et
un gène codant la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus.
Dans certains modes de réalisation, la xylanase d’origine fongique est une xylanase d'Aspergillus niger ou une xylanase de Trichoderma reesei. En particulier, la xylanase d’origine fongique peut être une xylanase d 'AspergïUus niger qui est codée par la séquence nucléique SEQ ID NO: 5 ou qui consiste en la séquence polypeptidique SEQ ID NO: 6 ou un variant fonctionnel de la séquence polypeptidique SEQ ID NO: 6. Alternativement, la xylanase d’origine fongique peut être une xylanase de Trichoderma reesei qui est codée par la séquence nucléique SEQ ID NO: 7 ou qui consiste en la séquence polypeptidique SEQ ID NO: 8 ou un variant fonctionnel de la séquence polypeptidique SEQ ID NO: 8.
Dans certains modes de réalisation, la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus est codée par la séquence nucléique SEQ ID NO: 3 ou consiste en la séquence polypeptidique SEQ ID NO: 4 ou un variant fonctionnel de la séquence polypeptidique SEQ ID NO: 4. Dans certains modes de réalisation, la glucoamylase d’origine fongique est choisie dans le groupe consistant en: une glucoamylase d’ Aspergillus niger, une glucoamylase de Saccharomycopsis fibuligera, une glucoamylase de Trichoderma reesei , une glucoamylase de Thermomyces lanuginosis, une glucoamylase de Rhizopus oryzae et une glucoamylase d’ Aspergillus oryzae. En particulier, la glucoamylase d’origine fongique peut être une glucoamylase d’ Aspergillus niger qui est codée par la séquence nucléique SEQ ID NO: 1 ou qui consiste en la séquence polypeptidique SEQ ID NO: 2 ou un variant fonctionnel de la séquence polypeptidique SEQ ID NO: 2.
Dans certains modes de réalisation, la souche de levure de Saccharomyces cerevisiae selon l’invention comprend:
m copies du gène codant la xylanase d’origine fongique;
n copies du gène codant la glucoamylase d’origine fongique; et
p copies du gène codant la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus,
où m est un nombre entier compris entre 1 et 10, n est un nombre entier compris entre 2 et 10, et p est un nombre entier compris entre 2 et 10.
Dans certains modes de réalisation, m est 1 ou 4.
Dans certains modes de réalisation, n est 6 et p est 4.
Dans certains modes de réalisation, le gène codant la xylanase d’origine fongique, le gène codant la glucoamylase d’origine fongique, et le gène codant la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus sont intégrés au sein du génome de la souche de levure de Saccharomyces cerevisiae selon l’invention.
Dans certains modes de réalisation, la souche de levure de Saccharomyces cerevisiae selon l’invention est la souche déposée le 26 avril 2017 à la CNCM sous le numéro 1-5201.
Dans un autre aspect, la présente invention concerne une méthode d’obtention d’une souche de levure de Saccharomyces cerevisiae utile pour la production de bioéthanol, ladite méthode comprenant les étapes consistant à :
(a) modifier génétiquement une levure de Saccharomyces cerevisiae de manière à ce qu’elle co-exprime un gène codant une xylanase d’origine fongique, un gène codant une glucoamylase d’origine fongique, et un gène codant la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus ou obtenir une souche de levure de Saccharomyces cerevisiae telle que décrite ici;
(b) mettre en culture et faire fermenter la levure obtenue à l’étape (a) sur un milieu synthétique dextrine; et
(c) sélectionner au moins une souche présentant une cinétique de fermentation au moins égale ou supérieure à la cinétique de fermentation de la souche déposée le 9 juillet 2015 à la CNCM sous le numéro 1-4997.
Dans un autre aspect, la présente invention concerne une méthode pour augmenter le rendement de production en bioéthanol d’une souche de levure de Saccharomyces cerevisiae , ladite méthode comprenant les étapes consistant à:
(a) fournir une levure de Saccharomyces cerevisiae co-exprimant un gène codant une glucoamylase d’origine fongique, et un gène codant la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus,
(b) modifier génétiquement la levure de l’étape (a) de manière à ce qu’elle exprime en outre un gène codant une xylanase d’origine fongique;
(c) mettre en culture et faire fermenter la levure obtenue à l’étape (b) sur un milieu synthétique dextrine; et
(d) sélectionner au moins une souche présentant une cinétique de fermentation au moins égale ou supérieure à la cinétique de fermentation de la souche déposée le 9 juillet 2015 à la CNCM sous le numéro 1-4997.
Dans certains modes de réalisation, la méthode pour augmenter le rendement de production en bioéthanol d’une souche de levure de Saccharomyces cerevisiae est caractérisée en ce que la levure de Saccharomyces cerevisiae de l’étape (a) est la souche de levure de Saccharomyces cerevisiae déposée le 9 juillet 2015 à la CNCM sous le numéro 1-4997.
Dans un autre aspect, la présente invention concerne une méthode de production de bioéthanol à partir d’une biomasse, ladite biomasse méthode comprenant les étapes consistant à:
(a) préhydrolyser et liquéfier l’amidon de la biomasse;
(b) faire réagir l’amidon liquéfié obtenu à l’étape (a) avec une souche de levure de
Saccharomyces cerevisiae selon l’invention pour produire du bioéthanol; et
(c) extraire le bioéthanol produit à l’étape (b). Enfin, la présente invention concerne également l’iitilisation d’une souche de levure de Saccharomyces cerevisiae divulguée ici, pour la production de bioéthanol.
Une description plus détaillée de certains modes de réalisation préférés de l’invention est donnée ci-dessous.
Description Détaillée de l’Invention
Comme mentionné plus haut, la présente invention concerne des souches de levure Saccharomyces cerevisiae ayant un rendement élevé en production de bioéthanol de première génération, en particulier de bioéthanol produit à partir de biomasse comprenant de l’amidon.
I - Souches de Saccharomyces cerevisiae Génétiquement Modifiées
Une souche de levure Saccharomyces cerevisiae selon la présente invention est caractérisée en ce qu’elle co-exprime :
un gène codant une xylanase d’origine fongique;
un gène codant une glucoamylase d’origine fongique; et
un gène codant la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus.
L’expression“souche de levure” désigne une population relativement homogène de cellules de levure. Une souche de levure est obtenue à partir d’un clone, un clone étant une population de cellules obtenues à partir d’une seule cellule de levure. Dans le contexte de la présente invention, une souche de levure de Saccharomyces cerevisiae de départ est toute souche de Saccharomyces cerevisiae qui peut être modifiée génétiquement pour y introduire les gènes de xylanase et de glucoamylase hétérologues selon l’invention. Dans certains modes de réalisation préférés, la souche de Saccharomyces cerevisiae de départ est une souche connue pour être utile dans la production de bioéthanol, comme par exemple les levures de Saccharomyces cerevisiae utilisées par les producteurs d’éthanol de première génération, qui sont des levures spécialisées permettant l’optimisation de la rentabilité du procédé de production. Ces levures, qui sont bien connues de l’homme du métier, sont entre autres: Ethanol Red® (LEAF), Thermosacc® (Lallemand), Angel Super Alcohol® (Angel) et Fali® (AB Mauri). Les qualités attendues de ces levures sont leur capacité à produire rapidement de concentrations élevées en éthanol et d’épuiser les sucres des milieux de fermentation sur les plages de température et de pH représentatives des conditions industrielles. Comme indiqué plus haut, les souches selon la présente invention sont des souches améliorées par rapport aux souches de levure Saccharomyces cerevisiae précédemment développées par les présents Inventeurs, c’est-à-dire par rapport à des souches de levure Saccharomyces cerevisiae où l’introduction d’un gène codant la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus et d’un gène codant une glucoamylase d’origine fongique avait permis d’obtenir des souches avec d’excellentes capacités d’hydrolyse de l’amidon (WO 2017/037362).
Par“gène codant une glucoamylase”, on entend ici une séquence d’acides aminés qui, lorsqu’elle est exprimée, résulte en la formation d’une protéine de glucoamylase fonctionnelle.
Par“glucoamylase”, on entend ici une enzyme capable d’hydrolyser les liaisons glycosidiques a- 1,4 de l’amidon brut ou soluble à partir de l’extrémité non-réductrice de l’amylose et de l’amylopectine. Les amylases sont également connues sous la dénomination d’amyloglucosidases ou de g-amylases (Medline référence: EC 3.2.1.3). En plus d’agir sur les liaisons a- 1,4 de l’amidon, la glucoamylase est capable d’hydrolyser lentement les liaisons a- 1,6 des molécules d’amylopectine, à condition que la liaison voisine dans la séquence soit une liaison a- 1,4.
Le terme“glucoamylase d’origine fongique” désigne toute glucoamylase provenant d’un champignon (fongus ou mycète) et dont le gène correspondant peut être intégré dans le génome d’une souche de levure de telle sorte que l’expression du gène résulte en la formation d’une protéine de glucoamylase fonctionnelle. En particulier, une glucoamylase d’origine fongique peut être choisie parmi les glucoamylases commerciales connues pour leur bonne activité enzymatique. Dans le contexte de la présente invention, une glucoamylase d’origine fongique peut être sélectionnée dans le groupe consistant en : une glucoamylase d 'Aspergillus niger, une glucoamylase de Saccharomycopsis fibuligera, une glucoamylase de Trichoderma reesei, une glucoamylase de Rhizopus oryzae, une glucoamylase d" Aspergillus oryzae et une glucoamylase Thermomyces lanuginosis . Ces glucoamylases sont connues de l’homme du métier, et leurs séquences sont accessibles sous les références GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) suivantes: Trichoderma reesei (ETS06561), Rhizopus oryzae (BAA00033), Aspergillus oryzae (BAA00841), Thermomyces lanuginosus (ABQ23180). Dans certains modes de réalisation particuliers, la glucoamylase d’origine fongique est une glucoamylase d 'Aspergillus niger ou de Saccharomycopsis fibuligera. La glucoamylase d’ Aspergillus niger est codée par le gène GLAA qui possède la séquence nucléique SEQ ID NO: 1, et a pour séquence protéique la séquence SEQ ID NO: 2. La glucoamylase de Saccharomycopsis fibuligera est codée par le gène GLU0111 qui possède la séquence nucléique SEQ ID NO: 9, et a pour séquence protéique la séquence SEQ ID NO: 10.
La glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus est codée par le gène STA1 qui possède la séquence nucléique SEQ ID NO: 3, et a pour séquence protéique la séquence SEQ ID NO: 4.
Dans certains modes de réalisation, une souche de levure de Saccharomyces cerevisiae selon l’invention est caractérisée en ce qu’elle co-exprime :
un gène codant une xylanase d’origine fongique;
un gène codant une glucoamylase d 'Aspergillus niger ; et
un gène codant la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus. Ainsi, par exemple, une telle souche de Saccharomyces cerevisiae peut être en particulier caractérisée en ce qu’elle contient la séquence nucléique SEQ ID NO: 1 et la séquence nucléique SEQ ID NO: 3. Alternativement ou additionnellement, une telle souche de Saccharomyces cerevisiae peut être en particulier caractérisée en ce que la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus a la séquence protéique SEQ ID NO: 4 et la glucoamylase d’ Aspergillus niger a la séquence protéique SEQ ID NO: 2.
Une souche de levure de Saccharomyces cerevisiae selon l’invention se distingue de la souche de Saccharomyces cerevisiae précédemment développée par les présents Inventeurs (WO 2017/037362) en ce qu’en plus du gène codant une glucoamylase d’origine fongique; et du gène codant la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus, elle co-exprime en outre un gène codant pour une xylanase d’origine fongique.
Par“gène codant une xylanase”, on entend ici une séquence d’acides aminés qui, lorsqu’elle est exprimée, résulte en la formation d’une protéine de xylanase fonctionnelle.
Par“xylanase”, on entend ici une enzyme glycoside hydrolase qui hydrolyse les liaisons (l 4)-P-D-xylosidiques dans les xylanes, générant ainsi du xylose. Les xylanases sont également connues sous la dénomination d’endo- 1 ,4- -xylanases (Medline référence: EC 3.2.1.8). Ces enzymes interviennent dans la dégradation de l’hémicellulose, l’un des constituants principaux des parois cellulaires chez les plantes. Elles sont produites notamment par des mycètes, des bactéries, des levures, des algues marines, des protozoaires, des escargots, des crustacés, des insectes et certaines graines, mais pas par les mammifères.
Dans le contexte de la présence l’invention, la xylanase est une xylanase d’origine fongique. Le terme“xylanase d’origine fongique” désigne toute xylanase provenant d’un champignon (fongus ou mycète) et dont le gène correspondant peut être intégré dans le génome d’une souche de levure de telle sorte que l’expression du gène résulte en la formation d’une protéine de xylanase fonctionnelle. En particulier, une xylanase d’origine fongique peut être choisie parmi les xylanases commerciales connues pour leur bonne activité enzymatique. Dans le contexte de la présente invention, une xylanase d’origine fongique peut être sélectionnée dans le groupe consistant en: une xylanase d 'Aspergillus niger, une xylanase d 'Aspergillus awamori, une xylanase d 'Aspergillus tubingensis , une xylanase d’ Aspergillus nidulans, et une xylanase de Trichoderma reesei. Ces xylanases sont connues de l’homme du métier, et leurs séquences sont accessibles sous les références GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) suivantes: Aspergillus niger (FJ785738), Aspergillus awamori (X78115), Aspergillus tubingensis (L26988), Aspergillus nidulans (Z49892), et Trichoderma reesei (X69573).
Dans certains modes de réalisation particuliers, la xylanase d’origine fongique est une xylanase d" Aspergillus niger ou de Trichoderma reesei. La xylanase d" Aspergillus niger est codée par le gène XYN1 qui a la séquence nucléique consensus SEQ ID NO: 5, et a pour séquence protéique la séquence SEQ ID NO: 6. La xylanase de Trichoderma reesei est codée par le gène XYN2 qui a la séquence nucléique consensus SEQ ID NO: 7, et a pour séquence protéique la séquence SEQ ID NO: 8.
Les expressions “glucoamylase d’origine fongique”, et “glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus" ne doivent pas être interprétées de manière stricte : elles englobent les glucoamylases d’origine fongique et de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus qui sont codées par les séquences nucléiques telles que décrites ci-dessus, mais également les variants fonctionnels de ces glucoamylases. De même, le terme“xylanase d’origine fongique”, tel qu’utilisé ici, englobe les xylanases d’origine fongique qui sont codées par les séquences nucléiques telles que décrites ci-dessus, mais également les variants fonctionnels de ces xylanases. Typiquement, un variant fonctionnel d’une glucoamylase ou d’une xylanase selon l’invention a une séquence protéique présentant un pourcentage d’identité d’au moins 80%, 90%, ou 95%, plus particulièrement de 99%, avec la séquence protéique de ladite glucoamylase ou xylanase, respectivement. Par exemple, les variants fonctionnels de la glucoamylase d’ Aspergillus niger ont une séquence protéique présentant un pourcentage d’identité d’au moins 80%, d’au moins 90%, ou d’au moins 95%, plus particulièrement d’au moins 99%, avec la séquence SEQ ID NO: 2; les variants fonctionnels de la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus ont une séquence protéique présentant un pourcentage d’identité d’au moins 80%, d’au moins 90%, ou d’au moins 95%, plus particulièrement de 99%, avec la séquence SEQ ID NO: 4; les variants fonctionnels de la xylanase d’ Aspergillus niger ont une séquence protéique présentant un pourcentage d’identité d’au moins 80%, d’au moins 90%, ou d’au moins 95%, plus particulièrement de 99%, avec la séquence SEQ ID NO: 6; et les variants fonctionnels de la xylanase de Trichoderma reesei ont une séquence protéique présentant un pourcentage d’identité d’au moins 80%, d’au moins 90%, ou d’au moins 95%, plus particulièrement de 99%, avec la séquence SEQ ID NO: 8.
Le “pourcentage d’identité” est une comparaison entre des séquences d’acides aminés, et est déterminé en comparant deux séquences alignées de manière optimale sur une fenêtre de comparaison. L’homme du métier sait comment calculer un pourcentage d’identité entre deux séquences et dispose de nombreux outils le lui permettant. L’une des deux séquences peut présenter des insertions, substitutions et des délétions d’acides aminés par rapport à l’autre séquence.
Il est dans les compétences de l’homme du métier de sélectionner des variants fonctionnels des glucoamylases et xylanases selon l’invention. Par“variant fonctionnel d’une glucoamylase”, on entend un variant qui conserve l’activité enzymatique de la glucoamylase et ce avec des caractéristiques de cinétique d’hydrolyse de l’amidon similaires. Par“variant fonctionnel d’une xylanase”, on entend un variant qui conserve l’activité enzymatique de la xylanase, et ce avec des caractéristiques de cinétique d’hydrolyse du xylane similaires. Des méthodes permettant de mesurer et de comparer des cinétiques d’hydrolyse de l’amidon et d’hydrolyse du xylane sont décrites dans la partie expérimentale de la présente demande (voir aussi WO 2017/037362).
Les souches selon l’invention peuvent être générées par n’importe quelle méthode appropriée. L’homme du métier connaît, par exemple, de multiples méthodes permettant d’introduire un gène dans une souche de levure, notamment via l’utilisation de vecteurs comprenant des cassettes d’expression. On entend par“vecteur” toute séquence d’ADN dans laquelle il est possible d’insérer des fragments d’acides nucléiques étrangers, les vecteurs permettant d’introduire de l’ADN étranger dans une cellule hôte. Des exemples de vecteurs sont les plasmides, les cosmides, les vecteurs dérivés de virus. Les vecteurs permettent soit l’intégration des gènes hétérologues directement dans le génome de la levure, soit leur expression dans un plasmide indépendant. L’introduction de vecteurs dans une cellule hôte est un procédé largement connu de l’homme du métier. Plusieurs méthodes sont notamment décrites dans “Current Protocols in Molecular Biology”, 13.7.1-13.7.10 ; ou encore dans Ellis et al., Intégrative Biology, 2011, 3(2), 109-118.
Les modifications génétiques selon l’invention peuvent être réalisées simultanément ou séquentiellement. Ainsi, par exemple, dans certains modes de réalisation, une souche de Saccharomyces cerevisiae selon l’invention est préparée à partir d’une souche de Saccharomyces cerevisiae précédemment développée par les présents Inventeurs et décrite dans WO2017/037362 (c’est-à-dire à partir une souche contenant déjà un gène codant pour une glucoamylase d’origine fongique et un gène codant pour une glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus). Alternativement, dans d’autres modes de réalisation, une souche de Saccharomyces cerevisiae selon l’invention est préparée par intégration des trois gènes dans une souche de Saccharomyces cerevisiae comme, par exemple, une souche spécialisée - voir plus haut. Dans ces modes de réalisation, le gène codant une glucoamylase d’origine fongique, le gène codant la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus, et le gène codant une xylanase d’origine fongique peuvent être insérés au sein d’un seul et même vecteur, ou au sein de deux ou trois vecteurs séparés. Un vecteur approprié peut être un plasmide.
Dans le contexte de la présente invention, un vecteur utilisé pour introduire un gène dans une souche de Saccharomyces cerevisiae peut contenir un marqueur de sélection. On entend par“marqueur de sélection”, un gène dont l’expression confère aux levures qui le contiennent une caractéristique permettant de les sélectionner. Il peut s’agir par exemple d’un gène de résistance aux antibiotiques ou d’un gène permettant la croissance de la levure dans un milieu particulier.
Dans un vecteur, un gène (de glucoamylase ou de xylanase) selon l’invention est généralement lié opérationnellement à un promoteur, un terminateur et/ou toute autre séquence nécessaire à son expression dans la levure. Les termes“lié opérationnellement” et“lié de façon opérationnelle” sont utilisés indifféremment et font référence à un lien fonctionnel entre les éléments permettant l’expression du gène et éventuellement sa régulation (séquences régulatrices 5’ et 3’) et la séquence du gène rapporteur qu’elles contrôlent. L’homme du métier sait sélectionner les promoteurs, terminateurs et autres séquences nécessaires à l’expression d’un gène dans une levure de Saccharomyces cerevisiae.
Dans certains modes de réalisation particuliers de l’invention, l’expression d’un gène (de glucoamylase et/ou de xylanase) est contrôlée par un promoteur dit“fort” (c’est- à-dire un promoteur ayant un potentiel transcriptionnel élevé pour que le gène soit fortement exprimé). Dans le contexte de la présente invention, un promoteur fort est par exemple le promoteur pADHl, le promoteur pTEF , ou le promoteur pTDH3.
Une souche de levure de Saccharomyces cerevisiae selon l’invention peut comprendre plusieurs copies d’au moins un des gènes de glucoamylase d’origine fongique, de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus, et de xylanase d’origine fongique. D’une façon générale, une souche de Saccharomyces cerevisiae selon l’invention comprend, m copies du gène codant la xylanase d’origine fongique; n copies du gène codant la glucoamylase d’origine fongique; et p copies du gène codant la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus, où m est un nombre entier compris entre 1 et 10, n est un nombre entier compris entre 2 et 10, et p est un nombre entier compris entre 2 et 10. Ainsi, n et p peuvent indépendamment être égaux à 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 et m peut être égal à 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10. Dans certains modes de réalisation particuliers, m est égal à 1 ou 4. Dans les mêmes, ou d’autres, modes de réalisation particuliers, n est égal à 6 et p est égal à 4.
L’invention concerne en particulier la souche de levure de Saccharomyces cerevisiae qui a été déposée, par le présent Déposant, à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25-28 rue du Docteur Roux, 75 724 Paris Cedex 15), en vertu du traité de Budapest, sous le numéro 1-5201 le 26 avril 2017. Cette souche comprend 6 copies du gène de glucoamylase d 'AspergïUus niger, 4 copies du gène de glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus et 1 copie du gène xylanase d'Aspergillus niger. II - Méthode d’obtention de Souches de Saccharomyces cerevisiae Génétiquement Modifiées et Utiles pour la Production de Bioéthanol
Les présents Inventeurs ont parallèlement mis au point une méthode permettant d’obtenir des souches de Saccharomyces cerevisiae utiles dans la production de bioéthanol. La méthode comprend les étapes consistant à:
(a) modifier génétiquement une levure de Saccharomyces cerevisiae de manière à ce qu’elle co-exprime un gène codant une xylanase d’origine fongique, un gène codant une glucoamylase d’origine fongique, et un gène codant la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus ou obtenir une telle levure de Saccharomyces cerevisiae ;
(b) mettre en culture et faire fermenter la levure de l’étape (a) sur un milieu synthétique dextrine; et
(c) sélectionner au moins une souche présentant une cinétique de fermentation dans le milieu synthétique dextrine au moins égale ou supérieure à la cinétique de fermentation de la souche de Saccharomyces cerevisiae déposée le 9 juillet 2015 à la CNCM sous le numéro 1-4997.
Comme le reconnaîtra l’homme du métier, après l’étape (a) de modification génétique, il est préférablement procédé à une sélection des clones ayant correctement intégré les gènes introduits. Ainsi, la levure de l’étape (a) qui est utilisée dans l’étape (b) est un clone ayant correctement intégré le gène codant la xylanase d’origine fongique, le gène codant la glucoamylase d’origine fongique, et le gène codant la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus. L’homme du métier sait comment sélectionner de tels clones, par exemple en faisant usage d’un marqueur de sélection introduit dans la levure de Saccharomyces cerevisiae de départ. Les Exemples fournis dans le présent document décrivent un exemple de méthode de sélection des clones. Dans cet exemple, un clone obtenu à l’étape (a) est mis en culture dans un milieu riche (en nutriments, milieu type YPG), puis le surnageant de culture est transféré dans un milieu minimum contenant du xylane comme source de carbone. Une seconde levure, la levure CelluX™ (qui a été déposée par le Déposant le 12 décembre 2013 à la CNCM sous le numéro 1-4829), est ajoutée au milieu réactionnel. Un clone est sélectionné (c’est-à-dire identifié comme ayant correctement intégré les gènes introduits), s’il y a croissance de la souche CelluX™. Comme le reconnaîtra l’homme du métier, la souche de levure de Saccharomyces cerevisiae obtenue dans l’étape (a) de la méthode décrite ci-dessus est une souche selon la présente invention. Ses caractéristiques sont donc identiques à celles décrites dans la section précédente.
L’homme du métier sait conduire une réaction de fermentation d’une telle levure de Saccharomyces cerevisiae sur un milieu synthétique dextrine (étape (b)), et déterminer les conditions optimales pour la fermentation. On entend ici par “milieu synthétique dextrine” un milieu de culture cellulaire, préférablement un milieu de culture de cellules de levure, contenant des dextrines, tel que connu de l’homme du métier. Il s’agit par exemple d’un milieu de culture contenant des dextrines d’amidon (220 g/kg), de l’extrait de levure (5 g/kg), de l’urée (2 g/kg), du dihydrogénophosphate de potassium (1 g/kg) ainsi que des minéraux et des vitamines (comme la vitamine Bl et la vitamine B6).
Dans l’étape (c), la sélection d’une souche de Saccharomyces cerevisiae performante et utile dans la production de bioéthanol se fait par comparaison de sa cinétique de fermentation avec celle de la souche de Saccharomyces cerevisiae déposée, par le présent Déposant le 9 juillet 2015 à la CNCM sous le numéro 1-4997. Les cinétiques de fermentation peuvent être facilement mesurées par différentes techniques connues de l’homme du métier. Par exemple, la cinétique de fermentation peut-être mesurée via un suivi de fermentation par pesée au cours du temps.
La souche 1-4997, qui sert de référence, est l’une des souches précédemment développées par les présents Inventeurs et décrites dans WO 2017/037362. La souche de Saccharomyces cerevisiae 1-4997 comprend au moins 4 copies du gène codant la glucoamylase d’ Aspergillus niger et au moins 3 copies du gène codant la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus.
Une souche sélectionnée par une méthode selon la présente invention présente donc nécessairement des propriétés de fermentation identiques ou supérieures à la souche Saccharomyces cerevisiae 1-4997, dans un milieu synthétique dextrine. En conséquence, les présents Inventeurs ont également mis au point une méthode permettant d’augmenter le rendement de production en bioéthanol d’une souche de levure de Saccharomyces cerevisiae. III - Méthode pour Augmenter le Rendement de Production en Bioéthanol d’une Souches de Saccharomyces cerevisiae
La présente invention concerne donc également une méthode permettant d’augmenter le rendement de production en bioéthanol d’une souche de levure de Saccharomyces cerevisiae , ladite méthode comprenant les étapes consistant à :
(a) fournir (ou obtenir) une levure de Saccharomyces cerevisiae co-exprimant un gène codant une glucoamylase d’origine fongique, et un gène codant la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus,
(b) modifier génétiquement la levure de l’étape (a) de manière à ce qu’elle exprime en outre un gène codant une xylanase d’origine fongique;
(c) mettre en culture et faire fermenter la levure obtenue à l’étape (b) sur un milieu synthétique dextrine; et
(d) sélectionner au moins une souche présentant une cinétique de fermentation, dans le milieu synthétique dextrine au moins égale ou supérieure à la cinétique de fermentation de la souche déposée le 9 juillet 2015 à la CNCM sous le numéro 1-4997.
La souche de l’étape (a) peut être n’importe quelle souche de Saccharomyces cerevisiae co-exprimant un gène codant une glucoamylase d’origine fongique, et un gène codant la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus. Dans certains modes de réalisation, la glucoamylase d’origine fongique est sélectionnée dans le groupe consistant en: une glucoamylase d’ Aspergillus niger, une glucoamylase de Saccharomycopsis fibuligera, une glucoamylase de Trichoderma reesei, une glucoamylase de Rhizopus oryzae, une glucoamylase d" Aspergillus oryzae et une glucoamylase Thermomyces lanuginosis comme décrit plus haut. Dans certains modes de réalisation particuliers, la glucoamylase d’origine fongique dont le gène exogène est présent dans la souche de Saccharomyces cerevisiae de l’étape (a) est une glucoamylase d' Aspergillus niger , par exemple une glucoamylase d Aspergillus niger codée par la séquence nucléique SEQ ID NO: 1 ou une glucoamylase d Aspergillus niger consistant en la séquence polypeptidique SEQ ID NO: 2 ou un variant fonctionnel de la séquence polypeptidique SEQ ID NO: 2. Dans les mêmes ou d’autres modes de réalisation particuliers, la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus dont le gène exogène est présent dans la souche de Saccharomyces cerevisiae de l’étape (a) est une glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus codée par la séquence nucléique SEQ ID NO: 3 ou une glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus consistant en la séquence polypeptidique SEQ ID NO: 4 ou un variant fonctionnel de la séquence polypeptidique SEQ ID NO: 4.
Dans certains modes de réalisation particuliers, la souche de l’étape (a) est une souche de Saccharomyces cerevisiae co-exprimant un gène codant une glucoamylase d’origine fongique, et un gène codant la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus , telle que décrite dans WO 2017/037362. Par exemple, la souche de l’étape (a) est la souche de levure de Saccharomyces cerevisiae déposée, par le présent Déposant, le 9 juillet 2015 à la CNCM sous le numéro 1-4997.
L’étape (b) de modification génétique peut être effectuée par n’importe quelle méthode connue de l’homme du métier, comme déjà indiqué plus haut.
Comme indiqué plus haut, après l’étape (b) de modification génétique, il peut être procédé à une sélection des clones ayant correctement intégré le gène codant la xylanase d’origine fongique, par exemple en utilisation un marqueur de sélection.
Les étapes (c) et (d) de la méthode permettant d’augmenter le rendement de production en bioéthanol d’une souche de levure de Saccharomyces cerevisiae peuvent être effectuées comme indiqué pour la méthode de sélection selon l’invention.
L’invention concerne également toute souche de levure obtenue par une méthode de sélection ou d’augmentation de rendement selon l’invention. L’invention concerne aussi une levure obtenue par culture d’une des souches de l’invention. Les procédés de culture d’une souche de levure sont connus dans l’art, et l’homme du métier sait optimiser les conditions de culture pour chaque souche en fonction de sa nature.
Les souches de levure de l’invention et les levures obtenues par culture de ces souches sont particulièrement intéressantes pour produire du bioéthanol à partir de biomasse, en particulier à partir de biomasse contenant de l’amidon.
IV - Utilisation des Souches de Saccharomyces cerevisiae Génétiquement Modifiées pour la Production en Bioéthanol
La présente invention concerne donc l’utilisation d’une souche de Saccharomyces cerevisiae selon la présente invention pour la production de bioéthanol à partir d’une biomasse contenant de l’amidon. La présente invention concerne aussi une méthode de production de bioéthanol à partir d’une biomasse contenant de l’amidon, ladite méthode comprenant les étapes consistant à: (a) préhydrolyser (c’est-à-dire hydrolyser de façon partielle) et liquéfier l’amidon de la biomasse;
(b) faire réagir la biomasse contenant l’amidon pré-hydrolysé et liquéfié obtenu à l’étape (a) avec une souche de levure de Saccharomyces cerevisiae selon la présente invention pour produire du bioéthanol; et
(c) extraire le bioéthanol produit à l’étape (b).
Tel qu’utilisé ici, le terme“biomasse” désigne l’ensemble des matières organiques d’origine végétale pouvant devenir source d’énergie après transformation. Préférablement, dans le contexte de l’invention, la biomasse est issue des produits et/ou coproduits agricoles ou agro-alimentaires. Par exemple, une biomasse peut être issue du maïs, du blé, de l’orge, du seigle, du sorgho, du manioc, du triticale, de la pomme de terre, de la patate douce, de la canne à sucre, de la betterave sucrière, du sorgho sucrier. Dans le contexte de la présente invention, la biomasse contient de l’amidon. Les biomasses riches en amidon peuvent être choisies, ou être issues de, par exemple, grains de maïs, orge, blé, manioc, tubercules de pomme de terre, etc.
Les étapes (a), (b) et (c) de la méthode selon l’invention peuvent être réalisées comme dans le cas d’un procédé classique de production de bioéthanol. De telles étapes sont connues de l’homme du métier.
L’invention s’applique particulièrement à la production de bioéthanol en tant que carburant, mais aussi à la production de bioéthanol pour les industries alimentaires, chimiques, pharmaceutiques et cosmétiques.
A moins qu’ils ne soient définis d’une autre manière, tous les termes techniques et scientifiques utilisés dans la Description ont la même signification que celle couramment comprise par un spécialiste ordinaire du domaine auquel appartient cette invention. De même, toutes les publications, demandes de brevet, tous les brevets et toutes autres références mentionnés ici sont incorporés par référence.
Exemples
Les exemples suivants décrivent certains modes de réalisation de la présente invention. Cependant, il est entendu que les exemples et les figures ne sont présentés qu’à titre illustratif et ne limitent en aucun cas la portée de l’invention. Légende des Figures
Figure 1: (A) Perte de masse observée pour les transformants de la souche déposée à la CNCM sous le numéro 1-4997 au cours d’une fermentation dans le milieu“Alcool Max”. (B) Perte de masse observée pour les transformants de la souche numéro 1-4997 au cours d’une fermentation dans le milieu“Dextrine”.
Figure 2: (A) Comparaison des cinétiques de fermentation des différentes souches étudiées. (B) Comparaison des valeurs des teneurs en éthanol, des ratios massiques glycérol/éthanol ainsi que des rendements en éthanol calculés sur le potentiel en glucose du substrat utilisé pour la fermentation des différentes souches étudiées.
Figure 3: Comparaison des sucres totaux mesurés en fin de fermentation pour les différents souches étudiées.
Exemple 1: Obtention et Caractérisation de Transformants de la Souche 1-4997 contenant 1 ou 4 copies d’un Gène codant la Xylanase d’Aspergillus niger ( XYN1 ) ou d’un gène codant la Xylanase de Trichoderma reesei ( XYN2 )
La stratégie mise en œuvre pour cloner une activité xylanase dans la souche de Saccharomyces cerevisiae ER-GAND-8159-C1 (c’est-à-dire la souche déposée, par le Déposant, le 9 juillet 2015 à la CNCM sous le numéro 1-4997) repose sur l’utilisation d’un système d’expression multi-intégratif. Avec ce système, il est possible d’intégrer simultanément une ou plusieurs copies d’un gène codant une xylanase donnée à un locus donné. Les Inventeurs ont choisi d’intégrer 1 copie ou 4 copies d’un des deux gènes XYN1 d'Aspergillus niger et XYN2 de Trichoderma reesei afin de mesurer un éventuel effet lié au nombre de copies sur l’activité xylanase.
A. Obtention des Plasmides d’Expression
Xylanase d’Aspergillus niger ( XYN1 ). Le gène XYN1 qui code la xylanase d 'AspergïUus niger a été précédemment amplifié par PCR à partir de matériel génétique issu de la souche d’ AspergïUus niger ATCC10577. Le produit PCR a ensuite été cloné dans un vecteur d’expression (développé en interne) sous la dépendance d’un promoteur fort pADHl et du terminateur tCYCl. Le plasmide obtenu sert ensuite de matrice pour la génération des modules d’expression, comme décrit dans le paragraphe B ci-dessous.
Xylanase de Trichoderma reesei ( XYN2 ). La xylanase de Trichoderma reesei qui a été utilisée est codée par le gène XYN2. La séquence utilisée est la version ADNc, débarrassée de ses introns et optimisée au biais de codons pour améliorer la traduction de la protéine dans la levure Saccharomyces cerevisiae. Le plasmide qui possède le gène XYN2 sous dépendance du couple pADHl/tCYCl, a été utilisé comme matrice PCR pour synthétiser les modules d’expression.
B. Obtention des Modules d’Expression
La stratégie employée par les Inventeurs a consisté à intégrer simultanément plusieurs modules d’expression des gènes de xylanase dans une souche de Saccharomyces cerevisiae en une seule étape à un locus donné, en se basant sur la capacité naturelle de la levure à réaliser la recombinaison homologue in vivo. Les Inventeurs ont défini les amorces PCR à utiliser pour intégrer les modules au locus BUD5. Selon les souches développées, 1 ou 4 modules d’expression de la xylanase d’A niger ou de la xylanase T. reesei, ainsi qu’un module de sélection ont été intégrés.
Chaque module amplifié possède des séquences recombinogéniques (Al, Bl, Cl et Dl) de part et d’autre de son promoteur et de son terminateur. Ces séquences sont apportées par les queues flottantes des amorces PCR (Tableau 1) et permettent aux modules de s’aligner et recombiner spécifiquement par homologie entre ces séquences recombinogéniques.
La présence de séquences homologues à un locus donné, par exemple le locus BUD5, aux extrémités 5’ et 3’ de la cassette d’expression multi-intégrative permet l’intégration simultanée des modules d’expression et du module de sélection par recombinaison homologue à ce locus donné.
C. Obtention et Sélection des Transformants
Obtention des Transformants. Pour chaque construction, les différents modules (voir Tableau 2) ont été mis en mélange équimolaire afin d’intégrer au locus BUD5 de la souche 1-4997, 1 ou 4 copies des xylanases de A. niger ou de T. reesei ainsi qu’un module de sélection.
La sélection des clones ayant intégré correctement les modules d’expression est réalisée dans un premier temps sur la base de la présence du module de sélection dans la cassette d’intégration. Le module de sélection comprend un couple promoteur/terminateur fort et un gène dont l’expression confère aux levures qui le contiennent une caractéristique permettant de les sélectionner sur un milieu donné. Les Inventeurs ont ainsi isolé les clones issus de chaque transformation. Tableau 1: Listing des Amorces Utilisées et Nomenclature des Modules d’Expression Synthétisés.
Figure imgf000021_0001
Tableau 2: Mélange de modules avant transformation de la souche 1-4997.
Figure imgf000022_0001
Sélection des Transformants.
(a) Criblage Fonctionnel par rapport à V Activité Xylanase. Le criblage des transformants obtenus a été réalisé en 2 étapes. Dans un premier temps, les transformants obtenus ont été mis en culture dans un milieu minimum contenant du xylane de bouleau. En effet, les clones secrétant une xylanase active ont la capacité à hydrolyser le xylane du milieu en xylose. Après cette première étape de croissance des transformants, un inoculum de CelluX™, levure capable de consommer le xylose, a été ajouté dans chaque puits. Les puits dans lesquels une croissance de CelluX™ est observée sont identifiés comme contenant un clone sécrétant une activité xylanase. Cette approche permet d’identifier les transformants présentant le phénotype recherché. Pour ce faire, la densité optique (DO à 600nm) des cultures est mesurée en fin de croissance.
(b) Validation des Transformants Sélectionnés par PCR. Avant évaluation en fermentation, le génotype a été vérifié pour 2 transformants par construction parmi ceux identifiés comme présentant un phénotype [Xylanase]+. Un panel de réactions PCR, visant à confirmer la présence des différents gènes théoriquement présents dans les constructions obtenues, a été réalisé sur les ADN génomiques des transformants sélectionnés. D. Caractérisation Phénotypique (Activité Xylanase) des Clones Sélectionnés
Test Phénotypique Solide. Dans ce test, 5 pL de surnageant de culture (YPG 5%, 30°C, 24 heures, 150 rpm) ont été déposés sur un milieu contenant du xylane de bouleau, et les halos d’hydrolyse du xylane ont été visualisés après coloration au rouge Congo 1% et décoloration au NaCl 1 M. Des halos d’hydrolyse ont été observés pour tous les clones considérés).
Test Phénotypique Liquide. Cette caractéristique phénotypique repose sur le même principe que celui mis en œuvre pour la sélection des transformants (voir ci-dessus). Dans ce test, 5 pL de surnageant issue d’une culture (YPG 5%) a été incubée à 50°C toute le nuit en présence de xylane de bouleau (vol/vol), puis le mélange a été inoculé avec une suspension calibrée à DOÔOO nm=0,05 de CelluX™. Des prélèvements, effectués avant et après ensemencement avec la CelluX™, ont été analysés en HPLC pour déterminer la concentration en xylose au cours de la croissance cellulaire de CelluX™.
Les résultats obtenus dans le test phénotypique en milieu liquide ont confirmé la corrélation entre la croissance de la CelluX™ et la consommation du xylose pour les clones considérés.
Tableau 3: Détermination de la Consommation de Xylose et Mesure de la Croissance
Cellulaire de la CelluX™ pour les Différents Transformants Sélectionnés.
Figure imgf000023_0001
(a) ER-GAND-8159 est la souche déposée à la CNCM sous le numéro 1-4997.
(b) sXYN = solution de xylanase de T. reesei 12 U/pL
(c) Ethanol Red® est une souche déposée à la CNCM le 4 septembre 2008, par le présent Déposant, sous le numéro 1-4071. E. Evaluation des Clones Sélectionnés en Fermentation
Détermination des Performances vis-à-vis de la Production d’Ethanol en Milieu “ Alcool Max (YFAM). Afin de déterminer si l’intégration des modules d’expression de la xylanase d’A niger et de la xylanase de T. reesei a eu un impact sur la capacité des transformants à produire de l’éthanol, ils ont été caractérisés dans un milieu dit“alcool max” qui contient 280 g/kg de saccharose (voir composition ci-dessous), ce qui permet de mesurer leur potentiel de production d’éthanol dans des conditions d’évaluation données.
Le milieu“Alcool Max” contient: 280 g/kg de saccharose, 5 g/kg d’extrait de levure, 4,7 g/kg de phosphate d’ammonium di-basique (D.A.P.), 11,5 g/kg d’acide citrique, 13,5 g/kg de citrate de sodium, ainsi que des minéraux et des vitamines.
Le suivi des pertes de masse n’a pas mis en évidence d’impact négatif de l’intégration des modules d’expression“xylanase” sur le potentiel de production d’alcool maximal des transformants, que ce soit d’un point de vue cinétique ou en point final, à l’exception du clone 1 qui possède 4 copies du gène XYN1 d’A. niger qui est très légèrement impacté au niveau cinétique (voir Figure 1(A)).
Fermentation en Milieu Dextrine. Afin de déterminer si les transformants sélectionnés ont conservé leur capacité à dégrader l’amidon via la production de glucoamylase, les transformants ont été évalués dans un milieu dextrine. En effet, la souche utilisée comme hôte pour intégrer les modules d’expression des xylanases correspond à la souche ER-GAND-8159 (CNCM 1-4997) qui possède 2 gènes d’origine différente de glucoamylase Les dextrines étant des molécules issues de l’hydrolyse de l’amidon, les clones secrétant des glucoamylases sont capables de les dégrader en glucose et ainsi de produire de l’éthanol. Les conditions de fermentation utilisées étaient identiques à celles mises en œuvre avec le milieu YFAM.
Par“milieu dextrine”, on entend un milieu synthétique contenant des dextrines, tel que connu de l’homme du métier. Il s’agit par exemple d’un milieu synthétique contenant des dextrines d’amidon (220 g/kg), de l’extrait de levure (5 g/kg), de l’urée (2 g/kg), du dihydrogénophosphate de potassium (1 g/kg) ainsi que des minéraux et des vitamines.
Tous les clones testés dans le milieu de fermentation dextrine ont conservé leur capacité à dégrader l’amidon quand on les compare à Ethanol Red® qui n’a pu fermenter que le glucose présent au départ dans le milieu (de l’ordre de 10 g/L) (voir Figure 1(B)). On note également que le clone ER-GAND-XTR-4c cl 10, qui possède 4 copies du gène XYN2 qui code la xylanase de T. reesei, et le clone ER-GAND-XTR-lc cl8, qui possède 1 copie de ce gène, et dans une moindre mesure le clone ER-GAND-XTR-4c cl2, qui possède 4 copies de ce gène, voient leur cinétique de perte de masse négativement impactée par rapport au témoin ER-GAND-8159, ce qui n’est pas le cas pour le clone ER- GAND-XTR-lc cl3 (CNCM 1-5265) avec une seule copie de XYN2, pour lequel la perte de masse est plus rapide sur les premières 24 heures et identique au témoin sur les 40 heures de fermentation qui suivent. Ces résultats suggèrent un effet lié au clone considéré plus qu’ils ne mettent en évidence un réel impact négatif de l’intégration du gène XYN2.
En revanche, les quatre transformants testés ER-GAND-XAN qui possèdent soit 1 copie, soit 4 copies du gène XYN1 (A. niger) voient leur cinétique de production de perte de masse significativement améliorée sur les premières 24 heures par rapport au témoin ER-8159-GAND-8159 (CNCM 1-4997).
Quatre transformants ont été déposés à la CNCM : la souche ER-GAND-XAN-1C cll déposée, le 26 avril 2017, à la CNCM sous le numéro d’accession 1-5201, la souche ER-GAND-XAN-4C cl9 déposée, le 20 décembre 2017, à la CNCM sous le numéro d’accession 1-5264, la souche ER-GAND-XTR-1C cl3 déposée, le 20 décembre 2017, à la CNCM sous le numéro d’accession 1-5265, et la souche ER-GAND-XTR-4C cl2 déposée, le 20 décembre 2017, à la CNCM sous le numéro d’accession 1-5266.
F. Conclusion
L’étude décrite dans cet Exemple a permis d’obtenir des transformants de la souche ER-GAND-8159. Ces transformants possèdent 1 copie ou 4 copies des gènes de xylanase d'Aspergillus niger ou de Trichoderma reesei , en utilisant la stratégie d’intégration multi- copies en une seule étape via l’obtention de modules d’expression spécifiquement conçus. Dans un deuxième temps, les Inventeurs se sont attachés à valider, par PCR, le génotype des transformants obtenus ainsi que leur phénotype d’hydrolyse du xylane, et ils se sont assurés que leurs capacités de production d’éthanol et d’hydrolyse de l’amidon n’avaient pas été négativement impactées par les modifications génétiques réalisées.
Exemple 2: Evaluation des Performances Fermentaires des Souches sur un
Substrat de Production de Bioéthanol
A. Préparation d’un Hydrolysat de Maïs pour Evaluation des Souches Présentant une Activité Xylanase. Afin de mettre en œuvre les souches générées dans cette étude, un milieu de fermentation pour production de bioéthanol a été préparé. Ce milieu est défini pour se rapprocher des substrats du marché utilisant le maïs. Pour cela, des gritz de maïs (« Crème de Maïs » - MQ-FT-19, moulins Waast) ont été mis en suspension de manière à obtenir un mélange à environ 30% de matière sèche dans l’eau. Le pH de cette suspension a ensuite été ajusté à 6 au moyen d’une solution d’hydroxyde de potassium à 40%, et une enzyme de type a-amylase (Liquozyme SC-DS, Novozymes) a été ajoutée à hauteur de 0,85 mL d’enzyme par kg de gritz mobilisé. Un traitement thermique de liquéfaction a ensuite été appliqué à la suspension pendant une durée de 3 heures à 85°C. Une composition type en sucres libérés après traitement thermique est présentée dans le Tableau 4 ci-dessous (matière sèche mesurée: 29,1%).
Tableau 4 : Composition en Sucres Disponibles dans le Substrat Liquéfié.
Figure imgf000026_0001
Le substrat liquéfie présente un potentiel total de glucose mesuré par méthode enzymatique de 226 ggiUcoSe/kgsubstrat·
B. Evaluation de la Performance en Production d’Ethanol des Souches Modifiées par Addition de Gènes Xylanase
Quatre transformants ont été testés pour leur performance en fermentation alcoolique (2 clones intégrant la xylanase d 'AspergïUus niger, l’un possédant 1 copie du gène et l’autre possédant 4 copies du gène; et 2 clones possédant chacun 1 copie du gène de la xylanase de Trichoderma reseii) sur le substrat liquéfié, en comparaison de la souche de référence ER-GAND-8159 (CNCM 1-4997).
Préparation de Crèmes de Levures à Partir des Souches Choisies pour l’Evaluation. Chacune des cinq souches retenues pour l’évaluation ont été cultivées sur boîte de Pétri pendant 24 heures puis conservées au réfrigérateur avant utilisation. Chaque souche a ensuite été prélevée et utilisée pour ensemencer 100 mL de milieu acide (par exemple milieu YM) dans des ballons de 250 mL. Les ballons ont été placés dans un incubateur une température de 26°C pendant 24 heures. A l’issue de cette incubation, chaque milieu a été placé en centrifugation à 4500 rpm pendant 5 minutes. Après élimination du surnageant, 150 mL d’eau stérile ont été ajoutés pour procéder au lavage des levures. Une seconde centrifugation a alors été réalisée, puis après élimination du surnageant, le culot a été repris dans 20 mL d’eau stérile, homogénéisé au vortex puis stocké au froid avant d’être utilisé pour ensemencer les échantillons des tests de fermentation.
Réalisation des Essais de Fermentation. Pour chaque souche évaluée, 100 g de substrat liquéfié ont été placés en ballon de 250 mL. Un ajout d’azote minéral a été effectué sous la forme d’urée à hauteur de 0,5 g d’azote par kg de substrat. Le pH a alors été ajusté à 5 à l’aide d’une solution d’acide sulfurique 0,5 N. Chaque souche stockée sous forme de crème a ensuite été ajoutée dans le milieu à hauteur de 0,5 g de matière sèche de crème par kg de substrat. Une fois les souches ajoutées dans leurs ballons respectifs, les essais ont été placés en incubateur à 32°C, sous une agitation orbitale de 100 rpm.
Le suivi des essais a été réalisé par acquisition en ligne de la pression de C02 générée par la fermentation, exprimée en perte de masse équivalente. En fin de fermentation, les moûts ont été prélevés et analysés par HPLC pour mesurer les concentrations des différents composés biochimiques et déterminer les bilans fermentaires.
Résultats Obtenus. La Figure 2(A) présente les cinétiques fermentaires observées. Il apparaît qu’à l’exception de la souche ER-GAND-XTR-lC-cl8 qui présente un retard sur les cinétiques initiales, toutes les souches présentent un début de fermentation similaire pendant les 36 premières heures de fermentation. Après 36 heures, la souche référence ER-GAND-8159 ralentit, de même que la souche ER-GAND-XTR-lC-cl3 (I- 5265) dont la cinétique est identique. Les deux souches exprimant le gène xylanase d’ Asp ergillus niger poursuivent la fermentation à une vitesse supérieure et produisent une quantité supérieure de C02 lors du test. La souche ER-GAND-XTR-lC-cl8 qui avait un retard cinétique initial rattrape la référence à 54 heures de fermentation et la dépasse pour terminer légèrement en retrait par rapport aux deux souches ER-GAND-XAN.
En fin de fermentation, des analyses ont été réalisées afin de mesurer les gains de performance des nouveaux transformants. La Figure 2(B) illustre les valeurs de teneur en éthanol, de ratio massique glycérol/éthanol ainsi que le rendement en éthanol calculé sur le potentiel en glucose du substrat utilisé.
On observe que les transformants ER-GAND-XAN présentent un avantage sur la production d’éthanol (meilleur titre et meilleur rendement) ainsi qu’une production réduite de glycérol. Concernant les souches ER-GAND-XTR, seul le clone 8 présente un avantage sur ces mêmes paramètres, le clone 3 étant similaire à la référence en termes de performances.
Le Tableau 5 ci-dessous présente l’ensemble des données collectées lors des tests pour comparer les performances à la référence. La partie gauche du tableau présente les valeurs brutes et la partie droite présente le gain observé en relatif par rapport à la référence.
Les souches présentant un gain en production d’éthanol présentent donc parallèlement une réduction dans la production de glycérol. Cependant, cette réduction du glycérol ne permet pas d’expliquer le gain d’alcool; le gain de rendement provient d’une consommation plus efficace du glucose du milieu rendue possible par l’action de la xylanase produite par chaque souche. Ce résultat est confirmé par les mesures de sucres totaux en fin de fermentation présentés dans la Ligure 3: les souches présentant un avantage sur leur rendement en éthanol ont également un taux de sucres résiduels réduit.
Tableau 5: Résultats des Tests de Performance des Transformants
Figure imgf000028_0001
C19 = ER-GAND-XAN-4C-cl9 (1-5264); C13 = ER-GAND-XTR- lC-cl3 (1-5265); et C18 = ER-GAND-XTR- 1C-C18. Conclusion. L’introduction des gènes codant pour la xylanase d 'Aspergïllus niger dans la souche ER-GAND-8159 (14997) a permis d’améliorer significativement la performance en production d’éthanol. Le gain de rendement mesuré en fermentation sur un hydrolysat de maïs se situe entre 2,5% et 2,6% par rapport à la souche de référence. L’action de la xylanase sur la matrice de fermentation est bénéfique à l’action des glucoamylases en leur permettant un meilleur accès à l’amidon du milieu tout en réduisant la réponse en glycérol des souches. Ce double gain de sucre (réduction du flux dirigé vers le glycérol et accroissement du glucose libéré par les glucoamylases) conduit à une meilleure production d’éthanol. La souche ER-GAND-XTR-lc présente un avantage similaire, bien que légèrement moindre dans cet exemple.
{original sous forme électronique)
(Cette feuille ne fait pas partie de la demande internationale ni ne compte comme une feuille de celle-ci)
Figure imgf000030_0001
Figure imgf000030_0002
29
FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26) (original sous forme électronique)
(Cette feuille ne fait pas partie de la demande internationale ni ne compte comme une feuille de celle-ci)
Figure imgf000031_0001
30
FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26) (original sous forme électronique)
(Cete feuille ne fait pas partie de la demande internationale ni ne compte comme une feuille de celle-ci)
Figure imgf000032_0001
RÉSERVÉ À L’OFFICE RÉCEPTEUR
Figure imgf000032_0002
RÉSERVÉ AU BUREAU INTERNATIONAL
Figure imgf000032_0003
31
FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26)

Claims

Revendications
1. Souche de levure de Saccharomyces cerevisiae, caractérisée en ce qu’elle co exprime :
un gène codant une xylanase d’origine fongique;
un gène codant une glucoamylase d’origine fongique; et
un gène codant la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus.
2. Souche de levure de Saccharomyces cerevisiae selon la revendication 1, caractérisée en ce que la xylanase d’origine fongique est une xylanase d 'Aspergillus niger ou une xylanase de Trichoderma reesei.
3. Souche de levure de Saccharomyces cerevisiae selon la revendication 2, caractérisée en ce que la xylanase d’origine fongique est une xylanase d’ Aspergillus niger qui est codée par la séquence nucléique SEQ ID NO: 5 ou qui consiste en la séquence polypeptidique SEQ ID NO: 6 ou un variant fonctionnel de la séquence polypeptidique SEQ ID NO: 6.
4. Souche de levure de Saccharomyces cerevisiae selon la revendication 2, caractérisée en ce que la xylanase d’origine fongique est une xylanase de Trichoderma reesei qui est codée par la séquence nucléique SEQ ID NO: 7 ou qui consiste en la séquence polypeptidique SEQ ID NO: 8 ou un variant fonctionnel de la séquence polypeptidique SEQ ID NO: 8.
5. Souche de levure de Saccharomyces cerevisiae selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus est codée par la séquence nucléique SEQ ID NO: 3 ou consiste en la séquence polypeptidique SEQ ID NO: 4 ou un variant fonctionnel de la séquence polypeptidique SEQ ID NO: 4.
6. Souche de levure de Saccharomyces cerevisiae selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que la glucoamylase d’origine fongique est choisie dans le groupe consistant en: une glucoamylase d’ Aspergillus niger , une glucoamylase de Saccharomycopsis fibuligera, une glucoamylase de Trichoderma reesei, une glucoamylase de Thermomyces lanuginosis, une glucoamylase de Rhizopus oryzae et une glucoamylase d 'Aspergillus oryzae.
7. Souche de levure de Saccharomyces cerevisiae selon la revendication 6, caractérisée en ce que la glucoamylase d’origine fongique est une glucoamylase d’ Aspergillus niger qui est codée par la séquence nucléique SEQ ID NO: 1 ou qui consiste en la séquence polypeptidique SEQ ID NO: 2 ou un variant fonctionnel de la séquence polypeptidique SEQ ID NO: 2.
8. Souche de levure de Saccharomyces cerevisiae selon l’une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce qu’elle comprend:
m copies du gène codant la xylanase d’origine fongique;
n copies du gène codant la glucoamylase d’origine fongique; et p copies du gène codant la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus,
où m est un nombre entier compris entre 1 et 10, n est un nombre entier compris entre 2 et 10, et p est un nombre entier compris entre 2 et 10.
9. Souche de levure de Saccharomyces cerevisiae selon la revendication 8, caractérisée en ce que m est 1 ou 4.
10. Souche de levure de Saccharomyces cerevisiae selon la revendication 8 ou la revendication 9, caractérisée en ce que n est 6 et p est 4.
11. Souche de levure de Saccharomyces cerevisiae selon l’une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que le gène codant la xylanase d’origine fongique, le gène codant la glucoamylase d’origine fongique, et le gène codant la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus sont intégrés au sein du génome de ladite souche de levure.
12. Souche de levure de Saccharomyces cerevisiae selon la revendication 1, caractérisée en ce qu’elle est la souche déposée le 26 avril 2017 à la CNCM sous le numéro 1-5201.
13. Méthode d’obtention d’une souche de levure de Saccharomyces cerevisiae utile pour la production de bioéthanol, ladite méthode comprenant les étapes consistant à : (a) modifier génétiquement une levure de Saccharomyces cerevisiae de manière à ce qu’elle co-exprime un gène codant une xylanase d’origine fongique, un gène codant une glucoamylase d’origine fongique, et un gène codant la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus ou obtenir une souche de levure de Saccharomyces cerevisiae selon l’une quelconque des revendications 1 à 11 ;
(b) mettre en culture et faire fermenter la levure obtenue à l’étape (a) sur un milieu synthétique dextrine; et
(c) sélectionner au moins une souche présentant une cinétique de fermentation au moins égale ou supérieure à la cinétique de fermentation de la souche déposée le 9 juillet 2015 à la CNCM sous le numéro 1-4997.
14. Méthode pour augmenter le rendement de production en bioéthanol d’une souche de levure de Saccharomyces cerevisiae , ladite méthode comprenant les étapes consistant à:
(a) fournir une levure de Saccharomyces cerevisiae co-exprimant un gène codant une glucoamylase d’origine fongique, et un gène codant la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus,
(b) modifier génétiquement la levure de l’étape (a) de manière à ce qu’elle exprime en outre un gène codant une xylanase d’origine fongique;
(c) mettre en culture et faire fermenter la levure obtenue à l’étape (b) sur un milieu synthétique dextrine; et
(d) sélectionner au moins une souche présentant une cinétique de fermentation au moins égale ou supérieure à la cinétique de fermentation de la souche déposée le 9 juillet 2015 à la CNCM sous le numéro 1-4997.
15. Méthode selon la revendication 14, caractérisée en ce que la levure de Saccharomyces cerevisiae de l’étape (a) est la souche de levure de Saccharomyces cerevisiae déposée le 9 juillet 2015 à la CNCM sous le numéro I- 4997.
16. Méthode de production de bioéthanol à partir d’une biomasse, ladite méthode comprenant les étapes consistant à:
(a) préhydrolyser et liquéfier l’amidon de la biomasse; (b) faire réagir l’amidon liquéfié obtenu à l’étape (a) avec une souche de levure de Saccharomyces cerevisiae selon l’une quelconque des revendications 1 à 12 pour produire du bioéthanol; et
(c) extraire le bioéthanol produit à l’étape (b).
17. Utilisation d’une souche de levure de Saccharomyces cerevisiae selon l’une quelconque des revendications 1 à 12, pour la production de bioéthanol.
PCT/EP2019/067668 2018-07-02 2019-07-02 Souches de saccharomyces cerevisiae exprimant des enzymes glucoamylase et xylanase exogènes et leur utilisation dans la production de bioéthanol WO2020007823A1 (fr)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP19758897.3A EP3818074A1 (fr) 2018-07-02 2019-07-02 Souches de saccharomyces cerevisiae exprimant des enzymes glucoamylase et xylanase exogènes et leur utilisation dans la production de bioéthanol
BR112020026979-4A BR112020026979A2 (pt) 2018-07-02 2019-07-02 Cepas de saccharomyces cerevisiae que expressam enzimas glucoamilase e xilanase exógena e seu uso na produção de bioetanol
US17/257,107 US11473072B2 (en) 2018-07-02 2019-07-02 Saccharomyces cerevisiae strains expressing exogenous glucoamylase and xylanase enzymes and their use in the production of bioethanol
CN201980051927.9A CN112771069A (zh) 2018-07-02 2019-07-02 表达外源葡糖淀粉酶和木聚糖酶的酿酒酵母菌株及其在生产生物乙醇中的用途

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR1856080 2018-07-02
FR1856080A FR3083245B1 (fr) 2018-07-02 2018-07-02 Souches de saccharomyces cerevisiae exprimant des enzymes glucoamylase et xylanase exogenes et leur utilisation dans la production de bioethanol

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2020007823A1 true WO2020007823A1 (fr) 2020-01-09

Family

ID=65200895

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2019/067668 WO2020007823A1 (fr) 2018-07-02 2019-07-02 Souches de saccharomyces cerevisiae exprimant des enzymes glucoamylase et xylanase exogènes et leur utilisation dans la production de bioéthanol

Country Status (6)

Country Link
US (1) US11473072B2 (fr)
EP (1) EP3818074A1 (fr)
CN (1) CN112771069A (fr)
BR (1) BR112020026979A2 (fr)
FR (1) FR3083245B1 (fr)
WO (1) WO2020007823A1 (fr)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009137574A2 (fr) * 2008-05-06 2009-11-12 Archer Daniels Midland Company Développement de souches de la levure tolérante de la chaleur hansenula polymorpha pouvant effectuer une fermentation alcoolique de l'amidon et du xylane par l'expression d'enzymes dégradant l'amidon et le xylane
WO2017037362A1 (fr) 2015-08-31 2017-03-09 Lesaffre Et Compagnie Souches de levure co-exprimant des glucoamylases exogenes, leur procede d'obtention et leur utilisation pour produire du bioethanol

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BRPI0414370A (pt) * 2003-09-15 2006-11-14 Genencor Int enzimas modificadas, processos para produzir enzimas modificadas e usos das mesmas
WO2011153516A2 (fr) * 2010-06-03 2011-12-08 Mascoma Corporation Levure à expression d'enzymes saccharolytiques pour la transformation biologique consolidée au moyen d'amidon et de cellulose
DK3481948T3 (da) * 2016-07-08 2024-02-05 Novozymes As Xylanasevarianter og polynukleotider, der koder for dem

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009137574A2 (fr) * 2008-05-06 2009-11-12 Archer Daniels Midland Company Développement de souches de la levure tolérante de la chaleur hansenula polymorpha pouvant effectuer une fermentation alcoolique de l'amidon et du xylane par l'expression d'enzymes dégradant l'amidon et le xylane
WO2017037362A1 (fr) 2015-08-31 2017-03-09 Lesaffre Et Compagnie Souches de levure co-exprimant des glucoamylases exogenes, leur procede d'obtention et leur utilisation pour produire du bioethanol

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ELLIS ET AL., INTEGRATIVE BIOLOGY, vol. 3, no. 2, 2011, pages 109 - 118
PRETORIUS L S: "DIE GENETIESE MANIPULASIE VAN DIE GIS SACCHAROMYCES CEREVISIAE VIR DIE MOONTLIKE OMSKAKELING VAN POLISAKKARIEDRYKE LANDBOUGEWASSE EN NYWERHEIDSAFVAL NA ENKELSELPROTEIEN EN BRANDSTOFETANOL. THE GENETIC MANIPULATION OF THE YEAST SACCHAROMYCES WITH THE AIM OF CONVERTING POLYSACCHARIDE-RICH AGRICULTURAL", SUID-AFRIKAANSE TYDSKRIF VIR NATUURWETENSKAP EN TEGNOLOGIE, SUID-AFRIKAANSE AKADEMIE VIR WETENSKAP EN KUNS, ZA, vol. 13, no. 3, 1 September 1994 (1994-09-01), pages 66 - 80, XP002016323, ISSN: 0254-3486 *
VORONOVSKY A Y ET AL: "Development of strains of the thermotolerant yeast Hansenula polymorpha capable of alcoholic fermentation of starch and xylan", METABOLIC ENGINEERING, ACADEMIC PRESS, US, vol. 11, no. 4-5, 1 July 2009 (2009-07-01), pages 234 - 242, XP026439226, ISSN: 1096-7176, [retrieved on 20090418] *

Also Published As

Publication number Publication date
CN112771069A (zh) 2021-05-07
BR112020026979A2 (pt) 2021-04-06
FR3083245A1 (fr) 2020-01-03
US11473072B2 (en) 2022-10-18
FR3083245B1 (fr) 2022-06-17
US20210261934A1 (en) 2021-08-26
EP3818074A1 (fr) 2021-05-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2342329B1 (fr) Variants de beta-glucosidase a activite amelioree et leurs utilisations
EP3344763B1 (fr) Souches de levure co-exprimant des glucoamylases exogenes, leur procede d'obtention et leur utilisation pour produire du bioethanol
EP3090042B1 (fr) Souches de levures pour la production d'éthanol de première génération
EP3158071B1 (fr) Variants d'exoglucanases a activite amelioree et leurs utilisations
EP2593543B1 (fr) Procédé de production d'enzymes cellulolytiques et/ou hémicellulolytiques amélioré
WO2017144590A1 (fr) Biocatalyseur pour la production d'éthanol à partir de maïs
EP2235192B1 (fr) Complémentation du sécrétome de Trichoderma reesei limitant les contaminations microbiologiques dans le cadre de la production d'éthanol par fermentation
EP3174979B1 (fr) Procede de production d'un cocktail enzymatique a partir de moût de champignon
EP3818074A1 (fr) Souches de saccharomyces cerevisiae exprimant des enzymes glucoamylase et xylanase exogènes et leur utilisation dans la production de bioéthanol
US9546386B2 (en) Glucose and xylose co-fermenting microorganism that expresses active glucoamylase
EP3071692B1 (fr) Variants d'endoglucanases a activite amelioree et leurs utilisations
CN104583385A (zh) 产生减小量哌珀霉素的真菌细胞
EP3071693B1 (fr) Variants d'endoglucanases a activite amelioree et leurs utilisations
EP2904098A1 (fr) PRÉPARATION MULTI-ENZYMATIQUE CONTENANT LE SÉCRÉTOME D'UNE SOUCHE D'ASPERGILLUS JAPONICUS& xA;
WO2022028929A1 (fr) Procédé de production d'alcool par hydrolyse enzymatique et fermentation de biomasse lignocellulosique
FR2529569A1 (fr) Microorganismes, notamment e. coli, transformes par une sequence d'adn originaire de c. thermocellum, compositions a activite cellulolytique issues de ces micro-organismes et procede pour les obtenir
WO2013088003A1 (fr) Procédé de production d'alcool a partir de biomasse lignocellulosique par complementation des enzymes cellulolytiques et hemicellulolytiques de trichoderma reesei par le champignon podospora anserina

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 19758897

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01A

Ref document number: 112020026979

Country of ref document: BR

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2019758897

Country of ref document: EP

Effective date: 20210202

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 112020026979

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20201229