BR112013000791A2

BR112013000791A2 - processo de produção de enzimas celulolíticas e hemicelulolíticas melhorado

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Publication number: BR112013000791A2
Application number: BR112013000791A
Authority: BR
Inventors: Ben Chaabane Fadhel; Monot Frédéric
Original assignee: Ifp Energies Now
Priority date: 2010-07-12
Filing date: 2011-06-16
Publication date: 2019-10-01
Also published as: WO2012007650A1; UA111473C2; FR2962444A1; EP2593543A1; HUE034274T2; RU2013105723A; CN102971418A; EP2593543B1; CA2805605C; US10457925B2; CN107603964A; RU2565560C2; US20170349888A1; ES2625501T3; CA2805605A1; BR112013000791B1; ZA201300164B; HRP20170749T1; US20130210119A1; PL2593543T3

Abstract

processo de produção de enzimas celulolíticas e hemicelulolíticas melhorado. a presente invenção refere-se a um processo de produção de enzimas celulolíticas e/ou hemocelulolíticas por um micro-organismo celullolítico e/ou hemicelulolítico, que compreende pelo menos uma fase de aumento em presença de uma fonte de carbono e pelo menos uma fase de produção em presença de um substrato indutor, no qual esse substrato indutor é uma mistura compreende de 40 a 65% em peso de glicose ou de hidrolisados celulósicos, de 21 a 25% em peso de lactose e de 10 a 39% em peso de xilose ou de uma solução de hidrolisado hemicelulósico, a soma desses três constituintes sendo igual a 100%.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para PROCESSO

DE PRODUÇÃO DE ENZIMAS CELULOLÍTICAS E HEMICELULOLITICAS

MELHORADO.

Domínio da invenção:

A invenção é relativa a um processo de produção de enzimas pela hidrólise de biomassa lignocelulósica.

Técnica anterior:

O aumento das capacidades de produção de bioetanol para suas qualidades de biocarburante é atualmente um assunto da atualidade. Os objetivos de incorporação estão em curso de discussão na união européia na base de uma preposição inicial de 20% de utilização de energias renováveis daqui até 2020 com uma incorporação de 10% de biocarburantes, segundo critérios de durabilidade que deveríam favorecer os biocarburantes de segunda geração produzidos a partir de biomassa lignocelulósica.

A biomassa lignocelulósica se caracteriza complexa constituída de três principais polímeros: A celulose a hemicelulose e a lignina.

De forma clássica, o processo de transformação da biomassa em etanol compreende várias etapas. Um pré-tratamento permite tomar a celulose e eventualmente as hemiceluloses que são o alvo da hidrólise enzimática acessíveis às enzimas. O pré-tratamento visa a modificar as propriedades físicas e físico-químicas do material lignocelulósico, virando melhorar a acessibilidade da celulose presa na matriz de lignina e de hemicelulose. A etapa de hidrólise enzimática permite a transformação da celulose e das hemiceluloses em açúcares pela utilização de enzimas celulolíticas e/ou hemicelulolíticas.

Os açúcares obtidos por hidrólise da biomassa lignocelulósica são pentoses (xilose, e arabinose principalmente), di-sacarídeos (celobiose), e glicose que podem ser fermentadas pelos micro-organismos. A glicose pode, por exemplo, ser facilmente transformado em etanol pelo lêvedo

Saccharomyces cerevisiae, quando da etapa de fermentação alcoólica.

Enfim, uma etapa de destilação permite separar e recuperar o

2/14 produto oriundo da fermentação assim obtida, portanto, o etanol no caso precedente, do mosto de fermentação.

Os diferentes estudos técnico-econômicos demonstram a necessidade de reduzir os custos ligados a etapa hidrólise-enzimática para levar o custo do etanol produzido a valores próximos do etanol obtido a partir do amido.

No momento atual, as celulases industriais são principalmente produzidas por um cogumelo filamentoso. Trichoderma reesei, em razão de seu forte poder de secreção das celulases.

Um dos meios de diminuição dos custos consiste em otimizar as condições operacionais do processo de produção de celulases, de forma a aumentar a produtividade ou a obter um coquetel enzimático que tem uma atividade específica melhorada.

As cepas selvagens de Trichoderma reesei tem no plural a faculdade de secretar, em presença de um substrato indutor, um complexo enzimático bem adaptado à hidrólise da celulose. As enzimas do complexo enzimático contêm três grandes tipos de atividades: as endoglicanases, as exoglucanases e as celobiases. Outras proteínas, tais como as xilanases, necessárias para a hidrólise da biomassa lignocelulósica são também produzidas pelo Trichoderma reesei. A presença de um substrato indutor é indispensável à expressão das enzimas celulolíticas e/ou hemicelulolíticas.

A regulagem dos genes de celulases sobre diferentes fontes de carbono, foi estudada em detalhes. A glicose exerce uma repressão catabólica sobre a produção de celulases. Esta é induzida em presença de celulose, de seus produtos de hidrólise como a celobiose ou de certos oligosacarídeos, notadamente di-sacarídeos como a lactose ou a soforose (llmén et al. 1997, Appl. Environ. Microbiol. Vol 63, p1298-1306). A natureza do substrato carbonado tem uma forte influência sobre a composição do complexo enzimático. Assim, a xilose, associada a um substrato carbonado indutor como a celulose ou a lactose permite melhorar significativamente a atividade dita xilanase, quando está presente em concentrações limitantes da ordem de 0,5 a 1mM (Mach-Aigner et al., 2010 Applied and

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Environmental Microbiology, Vol76 N°6, p1770-1776). A solubilização das hemiceluloses residuais (os xilanos) pelas xilanases permitiríam favorecer a hidrólise enzimática (Vàrnai et al., 2010 Enzyme and Microbial Technology

Vol 46 p185-193).

Para serem conseguidas boas produtividades em enzimas, é necessário fornecer uma fonte de carbono rapidamente assimilável para permitir um aumento rápido de trichoderma reesei, e um substrato indutor que permita a expressão das celulases e a secreção no meio de cultura. A celulose pode exercer esses dois papéis. Todavia, ela é de difícil utilização no estágio industrial e foi substituída por fontes de carbono solúveis tais como a lactose que exerce também o papel de substrato indutor.

Outros açúcares, tais como a celobiose ou a soforose, foram também descritos como indutores (llmen et al., (1997), Foreman et al. (2003) Biol Chem 278, p31988-31997, Pakula etal. (2005) Microbiology, 151, p135143), mas são muito onerosos para serem utilizados no estágio industrial.

De forma geral, foi constatado as produções de celulases por trichoderma reesei com substratos solúveis são muito inferiores aquelas com acento obtidas sob celulose em modo “batch” (isto é, em meio fechado) em razão do efeito repressor dos açúcares facilmente assimiláveis de elevada concentração.

A patente FR-B-2 2555 603, depositada em nome da requerente, propõe uma alimentação em contínuo dos substratos carbonados, permitindo destacar a repressão catabólicas, limitando a concentração residual nas culturas e otimizando a quantidade de açúcares, para se obter um melhor rendimento e uma melhor produtividade enzimática. O processo descrito nessa patente propõe acionar a alimentação com substrato, utilizando açúcares solúveis como fonte de carbono, eventualmente sob a forma de mistura. Todavia, um fornecimento contínuo limitando glicose ou xilose não associado à lactose ou a um outro indutor de se celulases (soforose, celobiose,...) não permite obter elevadas produtividades em enzimas.

A lactose permanece nos processos de produção industriais de enzimas celulolíticas, um dos substratos os mais apropriados. Além de ser

4/14 elevado, seu preço é muito flutuante e representa aproximadamente um terço do preço de custo das enzimas.

Uma das soluções consideradas e apresentadas na patente EPB-0 448 430 consiste em utilizar substratos carbonados oriundos da fieira, por exemplo os hemiceluloses hidrolisadas, como fonte de carbono indutora. Todavia, a produtividade permanece inferior de aproximadamente 50% em relação ao processo, utilizando a lactose sozinha como substrato indutor.

O pedido de patente WO 2009/026716 descreve um processo de produção de celulases no qual os derivados hemicelulolíticos representam mais de 40% da fonte de carbono e os açúcares indutores da produção de celulases representam entre 3 e 20% dessa mistura. Esse processo permite produzir pelo menos duas vezes mais celulases em relação a um processo que utiliza unicamente açúcares oriundos das hemiceluloses. Todavia, os desempenhos de produção de celulases descritas permanecem ainda inferiores a um processo que utiliza unicamente lactose.

As pesquisas atuais mostram que é necessário para melhorar os processos de produção de enzimas celulolíticas e/ou hemicelulolíticas desenvolver novos substratos indutores, pelo menos também desempenhos que aqueles que utilizam a lactose e com menor custo.

É nesse âmbito que se inscreve a presente invenção.

Resumo da Invenção:

A presente invenção descreve um processo de produção de enzimas celulolíticas e/ou hemicelulolíticas no qual o substrato indutor é uma mistura de glicose, lactose e xilose.

Descrição detalhada da invenção

O processo de produção de enzimas celulolíticas e/ou hemicelulolíticas por um micro-organismo celulolítico e/ou hemicelulolíticas, segundo o fato de a presente invenção compreender pelo menos uma fase de aumento em presença de uma fonte de carbono e pelo menos uma fase de produção em presença de um substrato indutor, no qual esse substrato indutor é uma mistura de glicose ou hidrolisados celulósicos, de lactose e de xilose ou de uma solução de hidrolisados hemicelulolíticos, os teores de

5/14 cada um dos constituintes da mistura sendo definidos pelos seguintes limites:

- de 40 a 65% em peso de glicose ou de hidrolisados celulósicos.

- de 21 a 25% em peso de lactose e

- de 10 a 39% em peso de xilose ou de uma solução de hidrolisados hemicelulósicos, a soma desses três constituintes sendo igual a 100%.

O substrato indutor é desprovido de qualquer outro açúcar que os constituintes listados acima. Assim, as proporções relativas de cada um constituintes são escolhidas de modo que a soma dos teores ponderais é igual a 100%.

Graças ao processo, de acordo com a invenção que utiliza uma mistura de açúcares particulares como substrato indutor, as concentrações finais em proteínas obtidas são de 50 a 60% superiores àquelas obtidas com a lactose utilizada como único substrato de produção. Eles são também aproximadamente 3 vezes superiores àquela obtida com misturas melhoradas ricas em xiloses, tais como descritos na técnica anterior WO 2009/026716.

O processo segundo a presente invenção utiliza uma mistura à base de glicose. Mais de 60% da lactose, indutora da produção de celulase pode ser substituída por glicose, conhecida por ser repressora da produção de celulases, com um desempenho final da mistura indutora melhorada. A glicose apresenta um custo muito menor do que a lactose e uma solubilidade na água de aproximadamente três vezes mais elevada. Portanto, é possível diminuir os volumes colocados em jogo. Assim, nesse processo, a glicose é, ao mesmo tempo utilizada na fase de aumento, mas também na fase de produção com altura de 60% da mistura que constitui o substrato indutor.

A glicose utilizada na mistura de açúcares pode ser também substituída por glicose oriunda da etapa de hidrólise enzimática da celulose, portanto diretamente oriunda do processo de transformação de biomassa lignocelulósica em etanol. Isto contribui para diminuir o custo da produção de

6/14 enzimas pela utilização de co-produtos do processo. Fala-se então de hidrolisados celulósicos.

A xilose utilizada na mistura que constitui o açúcar indutor pode ser substituída por uma solução de hidrolisados hemicelulolíticos, oriunda do processo de transformação de biomassa lignocelulósica em etanol e notadamente oriunda do pré-tratamento da biomassa.

Por outro lado, a possibilidade de utilizar uma mistura muito concentrada em açúcares permite vantajosamente limitar os riscos de contaminações.

O fato de acrescentar na mistura constituinte o substrato indutor da xilose permite aumentar muito a atividade xilanase do coquetel enzimático final. A xilose pode ser vantajosamente substituído por uma solução de hidrolisado hemicelulósico, oriunda da hidrólise das hemiceluloses, quando do pré-tratamento da biomassa lignocelulósica nos processos de produção de biocarburantes de segunda geração, e que pode ser concentrada se necessário.

De forma preferida, a mistura que constitui o substrato indutor compreende 50 a 65% em peso de glicose ou de hidrolisados celulósicos, 22 a 24% em peso de lactose e de 15 a 25% em peso de xilose ou de uma solução de hidrolisados hemicelulósicos, eventualmente oriunda do prétratamento da biomassa lignocelulósica, a soma dos constituintes sendo igual a 100%.

Muito preferencialmente o substrato indutor é uma mistura constituída de 60% em peso de glicose ou de hidrolisados celulósicos, 23% em peso de lactose e 17% em peso de xilose ou de hidrolisados hemicelulósicos.

O substrato carbonado utilizado durante a fase de aumento é escolhido dentre a glicose, a xilose, a lactose, os resíduos obtidos após a fermentação etanólica dos açúcares monômeros dos hidrolisados enzimáticos de biomassa celulósica e/ou um extrato bruto de pentoses hidrossolúveis provenientes eventualmente do pré-tratamento de uma biomassa celulósico.

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Muito preferencialmente, o substrato de aumento é a glicose.

As cepas industrias utilizadas pertencem à espécie Trichoderma reesei, modificadas para melhorar as enzimas celulolíticas e/ou hemicelulolíticas pelos processos de mutação-seleção. Citar-se-á por exemplo a cepa IFP CL847. Cepas melhoradas por técnicas de recombinação genéticas podem também ser utilizadas. Elas devem ser deletadas para a repressão catabólica pela glicose (Δ CRE1), como, por exemplo, CL847.

As cepas são cultivadas em bio-reatores agitados e areados em condições compatíveis com seu aumento e a produção de enzimas. As condições são tais que o pH é ajustado entre 3,5 e 6 e a temperatura entre 20 e 35 C. Escolher-se-á, de preferência, um pH de 4,8 e uma temperatura de 27 C, durante a fase de aumento e um pH de 4 e uma temperatura de 25°C durante a fase de produção. A taxa de aeração expressa em volume de ar/volume de meio reacional e por minuto ou wm aplicado durante o processo é está compreendido entre 0,3 e 1,5 min-1 e a velocidade de rotação ou rpm deve permitir regular a pressão em 02 entre 20% e 60%. Escolher-se-á, de preferência, uma aeração de 0,5 wm e uma agitação, permitindo regular a pressão em 02 a 30%.

Segundo sua natureza, o substrato carbonado escolhido para a obtenção da biomassa é introduzido no bio-reator, antes da esterilização deste para ter concentração inicial em açúcares de 15 a 60G/I.

Visando a fase de produção, uma solução aquosa contendo o substrato indutor constituído da mistura glicose /lactose/ xilose ou solução de hidrolisado hemicelulósico escolhido para a fase produção das enzimas é preparado a uma concentração de 350 a 600 g/L na solução utilizada.

Preferencialmente, a concentração está compreendida entre 450 e 550 g/L.

A solução aquosa é injetada após o esgotamento do substrato inicial, de forma a fornecer uma quantidade otimizada. O fluxo de introdução da solução de alimentação é de 30 a 45 mg por grama de células e por hora.

A concentração residual em açúcar no meio de cultura é inferior a 1 g/L durante a fase de produção (“fed-batch”), de forma a limitar a

8/14 produção de biomassa. De forma preferida, essa concentração é inferior a

0,5 g/L e ainda mais preferencialmente 0,1 g/L.

Exemplos

Dentre os exemplos que se seguem o exemplo 1 apresenta uma cultura que utiliza a glicose como substrato carbonada durante a fase de aumento de produção esse exemplo demonstra a baixa produção de proteínas obtida, quando esse açúcar é utilizado como único substrato carbonado mesmo se o fluxo for limitante durante a fase fed-batch (concentração residual em glicose próxima de 0). O segundo exemplo representa a fermentação de referência que a lactose como substrato carbonado durante a fase de aumento de produção que permite uma grande produção de proteínas. O exemplo 3 reproduz uma experiência utilizando em fase de produção uma mistura tal como descrito no pedido de patente WO 2009/026716 contendo uma grande proporção em xilose permitindo, segundo os autores, aumentar muito a produção das celulases em relação a uma experiência na qual a xilose ou os derivados hemicelulósicos são utilizados como únicos substratos carbonados. Os exemplos 4 a 6 são aqueles da patente, de acordo com o processo segundo a presente invenção.

Exemplo 1: Produção de enzimas sobre glicose (não de acordo com a invenção)

A produção de celulases é efetuada em bio-reator agitado mecanicamente. O meio mineral tem a seguinte composição: KOH 1,66 g./L, H3PO4 85 % 2 mL/L, (NH4)2SO4 2,8 g/L, MgSO4, 7 H2O 0,6 g/L, CaCL2 0,6 g/L, MnSO4 3,2 mg/L, ZnSO4, 7 H2O 2,8 mg/L, CoCI2 10 4,0 mg/L, FeSO4, 7 H2O 10 mg/L, milho íngreme 1,2 g/L, antiespuma 0,5 mL/L.

O bio-reator contendo o meio mineral é esterilizado a 120°C durante 20min, a fonte carbonada glicose é esterilizada à parte a 120°C durante 20 minutos depois acrescentada esterilmente no bio-reator de forma a ter uma concentração final de 30 g/L. O bio-reator é inseminado a 10% (v/v) com uma pré-cultura líquida da cepa de Trichoderma reesei CL847. O meio mineral da pré-cultura é idêntico àquele do bio-reator colocada à parte a adição de fitalato de potássio a 5g.L-1 para tamponar o pH. O aumento do

9/14 cogumelo em pré-cultura é feito, utilizando a glicose como substrato carbonado, à concentração de 30g/L. O aumento do inoculo dura de 2 a 3 dias e é efetuado a 28°C em incubador agitado. A transferência para o bioreator é realizada, se a concentração residual em glicose é inferior a 15 g/L.

A experiência efetuada em bio-reator comporta duas fases:

- uma fase de aumento sobre substrato carbonado glicose (concentração inicial = 30 g/L) a uma temperatura de 27°C e um pH de 4,8 (regulado pelo amoníaco 5.5 Μ). A aeração é de 0,5 wm e a agitação é aumentada entre 200 e 800 rpm em função da pO2 (pressão em oxigênio dissolvido), que é mantida superior a 30%.

- uma fase de produção de enzimas. Quando o substrato inicial do fermentador é esgotado e a solução de glicose a 250 g/L é injetada em contínuo ao fluxo de 30 a 40 mg por g de células e por hora até 164 horas. A temperatura é baixada a 25°C e o pH a 4 até o fim da cultura. O pH é regulado por adição de uma solução de amoníaco a 5.5 N que fornece o nitrogênio necessário à síntese das proteínas excretadas. O teor em oxigênio dissolvido é mantido acima de 15 a 20% por ação sobre a aeração e a agitação.

A produção de enzimas é seguida pela dosagem das proteínas extra-celulares pelo método de Lowry e padrão de BSA, após separação do micélio por filtragem ou centrifugação. As atividades celulolíticas determinadas são:

- A atividade filtro de papel (UPF: Unidade Filtro de Papel) que permite dosar a atividade global do pool enzimático endoglucanases e exoglucanases;

- As atividades aril β-glucosidase e xilanases para as atividades específicas.

A atividade UPF é medida sobre papel Whatman n°1 (Procedimento recomendado pela comissão biotecnológica IUPAC) à concentração inicial de 50 g/L; determina-se a tomada de teste da solução enzimática a analisar que libera o equivalente de 2 g/L de glicose (dosagem colorimétrica) em 60 minutos. O princípio da atividade filtro de papel é de

10/14 determinar por dosagem ao DNS (ácido dinitro-salicílico) a quantidade de açúcares reduzidos oriunda de um papel Whatman n°1 (Procedimento recomendado pela comissão biotecnológica IUPAC).

O substrato utilizado para determinar a atividade aril βglicosidade é o p-nitrofenil-P-D-gluco piranosídeo (PNPG). Ele é clivado pelo β-glicosidase que libera o p-nitrofenol.

Uma unidade de atividade aril β-glicosidase é definida como a quantidade de enzima necessária para produzir 1pmol de p-nitrofenol a partir de PNPG por minuto e é expresso em lU/mL. O princípio da dosagem da atividade xilanase se baseia na determinação por dosagem DNS da quantidade de açúcares reduzidos oriunda da solução xilanase hidrolisada. Esse método de dosagem utiliza as propriedades redutoras dos açúcares e principalmente da xilose. A atividade xilanase é expressa em lU/mL corresponde à quantidade de enzima necessária para produzir 1pmol de xilose por minuto.

As atividades específicas são obtidas, dividindo-se as atividades expressas em lU/mL pela concentração em proteínas. Elas são expressas em lU/mg.

As determinações analíticas sobre o mosto final do exemplo 1 dão os seguintes resultados:

As determinações analíticas sobre o mosto final dão os seguintes resultados:

Biomassa g/L 15.2

Proteínas g/L 2,9

UPF lU/mL 1,4

Xilanase 29.1 lU/mg β-glicosidade específica 0.35 lU/mg

A cepa CL847 é apresentada como sendo desreprimida na repressão catabólica exercida pela glicose sobre a produção de celulase (ela é deletada do gene CRE1). Aparece que o mesmo para um fed-batch conduzido em condições de limitação em glicose à produção final em proteínas é muito pequena.

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Exemplo 2: Produção de enzimas sobre lactose (não conforme à invenção).

A produção de enzimas é feita nas mesmas condições que no exemplo 1. O substrato carbonado durante as fases de aumento e produção é a lactose pura. A lactose é um indutor importante da produção de celulase. É o substrato que é mais utilizado industrialmente para a produção de celulases.

Após 30 horas de aumento, após o esgotamento do substrato inicial, a solução de fed-batch a 250 g/L é injetada em continuo ao fluxo de 35 mg por g de células e por hora até 164 horas.

Biomassa g/L 13.5

Proteínas g/L 37.8

UPF IU/mL22.1

Xilanase 408.5 lU/mL β-glicosidade específica 0.96 IU/mg

Exemplo 3: Produção com a mistura 97% xilose / 3% de açúcares indutores da produção de celulases ou CIC (não de acordo com a invenção)

A experiência foi feita nas mesmas condições que o exemplo 1, utilizando a xilose pura como único substrato carbonado no decorrer da fase de aumento e em fase de produção a mistura 97% xilose / 3% CIC apresentado no pedido de patente WO 2009/026716 A1. Os CIC (açúcares indutores da produção de celulases) são uma mistura de açúcares que permite a indução da produção das celulases. Sua composição é a seguinte: 56% gentiobiose, 14% soforose, 10% tre-halose, 6% celobiose, 6% maltotriose, 8% glicose.

Após esgotamento do substrato inicial, a mistura 97% de xilose /3% CIC a 360 g/L é injetada segundo a recomendações descritas no fluxo de 0,4 g de carbobo L-1 .h-1

As determinações analíticas sobre o mosto final dão os seguin12/14 tes resultados:

Biomassa 14 3 g/L

Proteínas 18.7 g/L

UPF 6.4 lU/mL

Xilanase 6000.1 lU/mL

UPF específica 0.34 IU/mg beta-Glicosidase específica 1,15 IU/mg

A produção final em proteínas está próxima daquela apresentada na patente WO 2009/026716 A1 na qual os autores obtiveram uma concentração final de proteínas de 25 g/L com a cepa P59G. A atividade específica FPase (0.34IU/mg) é fraca enquanto o que a atividade xilanase é muito elevada.

Exemplo 4: Produção com a mistura lactose (23%)/ glicose (60%)/ Xilose (17%) a 500 g/L (de acordo com a invenção).

A experiência do exemplo 4 é feita nas mesmas condições que no exemplo 1 com a glicose como substrato carbonado de aumento a 60 g/L. Utilizamos em seguida no decorrer da fase de produção em modo “fedbatch” uma solução na qual três substratos carbonados são misturados conforme as seguintes proporções: lactose (23%)/glicose(60%)/xilose(17%) a 500 g/L. Essa mistura foi injetada a 45mg.g'¹.h’¹. As determinações analíticas sobre o mosto final dão os seguintes resultados.

Biomassa 26.1 g/L

Proteínas 61.8 g/L

UPF 33.7 lU/mL

Xilanase 4017 lU/mL

UPF específica 0.55 lU/mg beta-Glicosidase específica 1,2 lU/mg

A produção final em proteínas é mais de 3 vezes superior àquela do exemplo 3. A atividade filtro de papel que é indicadora da atividade celulase é aproximadamente 5 vezes superior. A atividade xilanase é 10 vezes superior àquela do exemplo 2 realizada com a lactose como única substrato carbonado de aumento e de produção, mas aproximadamente

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50% inferior àquela do exemplo 3.

Exemplo 5: Utilização da mistura Lactose (23%)/ Glicose (60%)/ solução de açúcares em C5 (17%) a 500 g/L (de acordo com a invenção).

O exemplo 5 é conduzido nas mesmas condições que o exemplo 4. A glicose é utilizada durante a fase de aumento a uma concentração de 15g/L. A xilose da solução de Fed-Batch é substituída por uma solução hemicelulósica solúvel em solução de açúcares em C5, oriunda de uma palha de trigo impregnada de 0,08 N de ácido sulfúrico e pré-tratada por explosão ao vapor (19 bárias, 5 minutos). A mistura é injetada a 30mg.g'¹h’¹durante 170h.

As determinações analíticas sobre o mosto final dão os seguintes resultados.

Biomassa 19.1 g/L

Proteínas 57.3 g/L

UPF25.1 lU/mL

Xilanase 1151 lU/mL

UPF específica 0.44 lU/mg beta-Glicosidase específica 1,4 lU/mg

Essa experiência permitiu aumentar as produções em proteínas além de 50% em relação ao exemplo 2 e a atividade xilanase é quase 3 vezes superior. A maioria da lactose é substituída durante a fase de aumento e de produção por glicose e da solução de açúcares em C5. A concentração da glicose durante a fase de aumento é diminuída em relação ao exemplo 4, de 60 a 15 g/L. A concentração em biomassa é diminuída de 26 a 19 g/L, mas isto tem pouca incidência sobre a concentração final em proteínas entre (baixa de 7%). Tem-se assim portanto uma utilização ótima dos açúcares e uma diminuição notável do custo da fonte de carbono.

Exemplo 6: Utilização da mistura: Lactose (23%)/ Hidrolisados

C6 (56%)/ Xilose (21%) a 500 g/L (de acordo com a invenção).

Exemplo 6

O exemplo 6 é conduzido nas mesmas condições que o exemplo

4. A glicose é utilizada durante a fase de aumento a uma concentração de

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15g/L. A xilose da solução de Fed-Batch é substituída por uma solução de hidrolisado oriunda da hidrólise enzimática de uma palha de trigo impregnada de 0,08 N de ácido sulfúrico e pré-tratada por explosão ao vapor (19 bárias, 5 minutos). A hidrólise enzimática da palha de trigo foi levada a 50°C e com pH 4,8. Ela chegou a uma hidrólise de 95% da celulose em glicose.

Lactose e xilose foram dissolvidas nessa solução, de forma a chegar à mistura : Lactose (23%)/ Hidrolisados C6 (56%)/ xilose (21%) a 500 g/L

A mistura é injetada a 30mg.g'¹.h’¹, durante 170h durante a fase fed-batch.

Biomassa 16.1 g/L

Proteínas 43.1 g/L

UPF 31.4 lU/mL

Xilanase 6595.1 lU/mL

UPF específica 0.73 lU/mg beta-Glicosidase específica 1,2 lU/mg

O coquetel enzimático obtido é de muito boa qualidade, já que a atividade FPase final é próxima da atividade obtida no exemplo 4, mesmo se a concentração em proteínas é menor. A atividade FPase final é de aproximadamente 5 vezes superior àquela obtida com o exemplo 3 e aproximadamente 50% superior àquela obtida quando do exemplo 2 no qual a lactose é utilizada como único substrato carbonado, quando da fase Fed-Batch.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Processo de produção de enzimas celulolíticas e/ou hemocelulolíticas por um micro-organismo celulolítico e/ou hemicelulolítico compreendendo pelo menos uma fase de aumento em presença de uma fonte de carbono e pelo menos uma fase de produção em presença de um substrato indutor, no qual esse substrato indutor é uma mistura de glicose ou hidrolisados celulósicos, de lactose e de xilose ou de uma solução de hidrolisados hemicelulolíticos, os teores de cada um dos constituintes da mistura sendo definidos pelos seguintes limites:

- de 40 a 65% em peso de glicose ou de hidrolisados celulósicos.

- de 21 a 25% em peso de lactose e

- de 10 a 39% em peso de xilose ou de uma solução de hidrolisados hemicelulósicos, a soma desses três constituintes sendo igual a 100%.
2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, no qual o microorganismo pertence à espécie Trichoderma reesei, e é deletado para a repressão catabólica pela glicose.
3. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, no qual o fornecimento de substrato indutor é feito em solução, a concentração em substrato indutor na solução de alimentação utilizada durante a fase de produção sendo de 350 a 600 g/L.
4. Processo, de acordo com a reivindicação 3, no qual a concentração está compreendida entre 450 a 550 g/L.
5. Processo, de acordo com uma das reivindicações precedentes, no qual a mistura que constitui o substrato indutor compreende 50 a 65% em peso de glicose ou de hidrolisados celulósicos, 22 a 24% em peso de lactose e de 15 a 25% em peso de xilose ou de uma solução de hidrolisados hemicelulósicos, a soma dos constituintes da mistura sendo igual a 100%.
6. Processo, de acordo com a reivindicação 5, no qual o substrato indutor é uma mistura constituída de 60% em peso de glicose ou de hidrolisados celulósicos, 23% em peso de lactose em peso de 17% de

2/2 xilose ou de hidrolisados hemicelulósicos.
7. Processo, de acordo com uma das reivindicações precedentes, no qual o substrato carbonado utilizado durante a fase de aumento é escolhido dentre a glicose, a xilose, a lactose, os resíduos obtidos após

5 fermentação etanólica dos açúcares monômeros dos hidrolisados enzimáticos de biomassa celulósica e/ou um extrato bruto de pentose hidro-solúveis provenientes eventualmente do pré-tratamento de uma biomassa celulósica.
8. Processo, de acordo com uma das reivindicações precedentes, no qual o pH é ajustado entre 3,5 e a temperatura está compreendida

10 entre 20 e 35°C.
9. Processo, de acordo com uma das reivindicações precedentes, no qual o fluxo de introdução da solução de alimentação é de 30 a 45 mg por grama de células e por hora.
10. Processo, de acordo com uma das reivindicações preceden-
15 tes, no qual a concentração residual em açúcar no meio de cultura durante a fase de produção é inferior a 1 g/L, preferencialmente a 0,5 g/L e muito preferencialmente a 0,1 g/L.