ES2625501T3 - Procedimiento mejorado de producción de enzimas celulolíticas y/o hemicelulolíticas - Google Patents

Procedimiento mejorado de producción de enzimas celulolíticas y/o hemicelulolíticas Download PDF

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Abstract

Procedimiento de producción de enzimas celulolíticas y/o hemicelulolíticas por parte de un microorganismo celulolítico y/o hemicelulolítico que comprende al menos una fase de crecimiento en presencia de una fuente de carbono y al menos una fase de producción en presencia de un sustrato inductor, en el que dicho sustrato inductor es una mezcla de glucosa o de hidrolizados celulósicos, de lactosa y de xilosa, o una solución de hidrolizados hemicelulolíticos, estando el contenido de cada uno de los constituyentes de la mezcla definido por los siguientes límites: - del 40 al 65 % en peso de glucosa, - del 21 al 25 % en peso de lactosa y - del 10 al 39 % en peso de xilosa, siendo la suma de estos tres constituyentes igual a 100 %, y el microorganismo pertenece a la especie Trichoderma reesei, y está delecionado para la represión catabólica por la glucosa.

Description

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DESCRIPCION
Procedimiento mejorado de produccion de enzimas celulolfticas y/o hemicelulolfticas Ambito de la invencion
La invencion es relativa a un procedimiento de produccion de enzimas para la hidrolisis de biomasa lignocelulosica. Tecnica anterior
El aumento de las capacidades de produccion de bioetanol por sus cualidades de biocarburante es hoy en dfa un asunto de actualidad. Los objetivos de incorporacion estan siendo discutidos en el seno de la Union Europea sobre la base de une proposicion inicial de un 20 % de utilizacion de energfas renovables de aqu al 2020 con una incorporacion del 10% de biocarburantes segun unos criterios de duracion que debenan favorecer a los biocarburantes de segunda generacion producidos a partir de biomasa lignocelulosica.
La biomasa lignocelulosica se caracteriza por una estructura compleja constituida por tres poftmeros principales: la celulosa, la hemicelulosa y la lignina.
De forma clasica, el procedimiento de transformacion de biomasa en etanol comprende varias etapas. Un pretratamiento permite hacer accesible la celulosa y eventualmente las hemicelulosas, que son los objetivos de la hidrolisis enzimatica a las enzimas. El objetivo del pretratamiento es modificar las propiedades ffsicas y fisicoqmmicas del material lignocelulosico, con objeto de mejorar la accesibilidad de la celulosa atrapada en la matriz de lignina y hemicelulosa. La etapa de hidrolisis enzimatica permite la transformacion de la celulosa y de las hemicelulosas en azucares mediante la utilizacion de enzimas celulolfticas y/o hemicelulolfticas.
Los azucares obtenidos mediante la hidrolisis de la biomasa lignocelulosica son pentosas (xilosa y arabinosa principalmente), disacaridos (celobiosa) y glucosa, que pueden ser fermentados por los microorganismos. La glucosa puede ser, por ejemplo, facilmente transformada en etanol por la levadura Saccharomyces cerevisiae durante la etapa de fermentacion alcoholica.
Finalmente, una etapa de destilacion permite separar y recuperar el producto procedente de la fermentacion asf obtenido, por lo tanto, el etanol en el caso anterior, del mosto de fermentacion.
Los diferentes estudios tecnico-economicos demuestran la necesidad de reducir el coste relacionado con la etapa de hidrolisis enzimatica para llevar el coste del etanol producido a unos valores proximos a los del etanol obtenido a partir de almidon.
En el momento actual, las celulasas industriales son producidas principalmente por un hongo filamentoso, Trichoderma reesei, gracias a su fuerte poder de secrecion de celulasas.
Uno de los medios para la diminucion de los costes consiste en optimizar las condiciones operativas del procedimiento de produccion de las celulasas de forma que se aumente la productividad, o para obtener un coctel enzimatico que tenga una actividad espedfica mejorada.
Las cepas salvajes de Trichoderma reesei tienen la facultad de secretar, en presencia de un sustrato inductor, un complejo enzimatico bien adaptado para la hidrolisis de la celulosa. Las enzimas del complejo enzimatico contienen tres principales tipos de actividad: las endoglucanasas, las exoglucanasas y las celobiasas. Otras protemas, tales como las xilanasas, necesarias para la hidrolisis de la biomasa lignocelulosica, son igualmente producidas por Trichoderma reesei. La presencia de un sustrato inductor es indispensable para la expresion de las enzimas celulolfticas y/o hemicelulolfticas.
La regulacion de los genes de las celulasas sobre diferentes fuentes de carbono ha sido estudiada con detalle. La glucosa ejerce una represion catabolica sobre la produccion de celulasas. Esta es inducida en presencia de celulosa, de sus productos de hidrolisis, como la celobiosa o ciertos oligosacaridos, particularmente disacaridos, como la lactosa o la soforosa (llmen y al. 1997, Appl. Environ. Microbiol. Vol. 63, pags. 1298-1306). La naturaleza del sustrato carbonado tiene una fuerte influencia sobre la composicion del complejo enzimatico. Asf, la xilosa, asociada a un sustrato carbonado inductor como la celulosa o la lactosa, permite mejorar significativamente la actividad de xilanasa cuando esta presente a unas concentraciones limitantes del orden de entre 0,5 y 1 mM (Mach-Aigner y al., 2010 Applied and Environmental Microbiology, Vol. 76 n° 6, pags. 1770-1776). La solubilizacion de las hemicelulosas residuales (los xilanos) por parte de las xilanasas permitina favorecer la hidrolisis enzimatica (Varnai y al., 2010 Enzyme and Microbial Technology Vol. 46 pags. 185-193).
Para obtener unas buenas productividades en las enzimas es necesario aportar una fuente de carbono rapidamente asimilable para permitir un rapido crecimiento de Trichoderma reesei, y un sustrato inductor que permita la expresion de las celulasas y su secrecion en el medio de cultivo. La celulosa puede jugar estos dos papeles. No obstante, es
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diffcil de utilizar a escala industrial, y ha sido sustituida por fuentes de carbono solubles, tales como la lactosa, que igualmente juega el papel de sustrato inductor.
Otros azucares tales como la celobiosa o la soforosa han sido igualmente descritos como inductores (limen y al. (1997), Foreman y al. (2003) Biol Chem 278, pags. 31988-31997, Pakula y al. (2005) Microbiology, 151, pags. 135143) pero son demasiado costosos para ser utilizados a escala industrial.
De forma general, se ha constatado que las producciones de celulasas por parte de Trichoderma reesei con sustratos solubles son muy inferiores a las obtenidas con celulosa en modo « batch » (es decir, en un medio cerrado) debido al efecto represor de los azucares facilmente asimilables a una elevada concentracion.
La patente FR-B-2 555 603, depositada a nombre de la Demandante, propone una alimentacion continua de los sustratos carbonados que permite aumentar la represion catabolica limitando la concentracion residual en los cultivos y optimizando la cantidad de azucares, para obtener un mejor rendimiento y una mejor productividad enzimatica. El procedimiento descrito en esa patente propone comenzar la alimentacion con sustrato utilizando azucares solubles como fuente de carbono, eventualmente en forma de una mezcla. Sin embargo un aporte continuo limitante de glucosa o de xilosa no asociado a la lactosa o a otro inductor de celulasas (soforosa, celobiosa,...) no permite la obtencion de unas grandes productividades en enzimas.
La lactosa sigue siendo, en los procedimientos de produccion industriales de enzimas celulolfticas, uno de los sustratos mas apropiados. Ademas de ser elevado, su precio vana mucho y representa aproximadamente un tercio del precio de coste de las enzimas.
Una de las soluciones contempladas y presentadas en la patente EP-B-0 448 430 consiste en la utilizacion de sustratos carbonados procedentes del sector, por ejemplo, hemicelulosas hidrolizadas, como fuente de carbono inductora. Sin embargo, la productividad sigue siendo inferior a aproximadamente el 50 % con respecto al procedimiento que utiliza la lactosa como el unico sustrato inductor.
La solicitud de patente WO 2009/026716 describe un procedimiento de produccion de celulasas en el que los derivados hemicelulolfticos representan mas del 40 % de la fuente de carbono, y los azucares inductores de la produccion de celulasas representan entre el 3 y el 20 % de esta mezcla. Este procedimiento permite la produccion de al menos dos veces mas de celulasas con respecto a un procedimiento que utiliza unicamente dos azucares procedentes de las hemicelulosas. Sin embargo, los rendimientos de produccion de celulasas descritos siguen siendo todavfa inferiores a los de un procedimiento que utiliza unicamente lactosa.
Las investigaciones actuales demuestran que es necesario, para mejorar los procedimientos de produccion de enzimas celulolfticas y/o hemicelulolfticas, desarrollar nuevos sustratos inductores, que se comporten al menos como los que utilizan lactosa, y con un menor coste.
Es en este ambito en el que se inscribe la presente invencion.
Resumen de la invencion
La presente invencion describe un procedimiento de produccion de enzimas celulolfticas y/o hemicelulolfticas en el que el sustrato inductor es una mezcla de glucosa, lactosa y xilosa.
Descripcion detallada de la invencion
El procedimiento de produccion de enzimas celulolfticas y/o hemicelulolfticas por parte de un microorganismo celulolftico y/o hemicelulolftico segun la presente invencion comprende al menos una fase de crecimiento en presencia de una fuente de carbono y al menos una fase de produccion en presencia de un sustrato inductor, en el que dicho sustrato inductor es una mezcla de glucosa o de hidrolizados celulosicos, de lactosa y de xilosa, o de una solucion de hidrolizados hemicelulolfticos, estando definidos el contenido de cada uno de los constituyentes de la mezcla por los siguientes ftmites:
- del 40 al 65 % en peso de glucosa,
- del 21 al 25 % en peso de lactosa y -del 10 al 39 % en peso de xilosa,
siendo la suma de estos tres constituyentes igual a 100 %.
El sustrato inductor esta desprovisto de cualquier otro azucar distinto a los constituyentes indicados anteriormente. Asf, las proporciones relativas de cada uno de los constituyentes se eligen de forma que la suma de los contenidos ponderales sea igual a 100 %.
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Gracias al procedimiento segun la invencion, que utiliza una mezcla de azucares particulares como sustrato inductor, las concentraciones finales de protemas obtenidas son entre un 50 y un 60 % superiores a las obtenidas con la lactosa utilizada como unico sustrato de produccion. Igualmente son aproximadamente 3 veces superiores a las obtenidas con las mezclas mejoradas ricas en xilosas tales como las descritas en el documento de la tecnica anterior WO 2009/026716.
El procedimiento segun la presente invencion utiliza una mezcla a base de glucosa. Mas del 60 % de la lactosa, inductor de la produccion de celulosa, puede ser sustituido por glucosa, conocido por lo tanto por ser un represor de la produccion de celulasas, con un comportamiento final de la mezcla inductora mejorado. La glucosa presenta un coste mucho mas bajo que la lactosa, y una solubilidad en agua aproximadamente 3 veces mas elevada. Por lo tanto, es posible disminuir los volumenes implicados. Asf, en este procedimiento, la glucosa se utiliza a la vez en la fase de crecimiento e igualmente en la fase de produccion en una cantidad del 60 % de la mezcla que constituye el sustrato inductor.
La glucosa utilizada en la mezcla de azucares puede ser igualmente reemplazada por la glucosa procedente de la etapa de hidrolisis enzimatica de la celulosa, por lo tanto procedente directamente del procedimiento de transformacion de biomasa lignocelulosica en etanol. Esto contribuye a disminuir el coste de la produccion de enzimas mediante la utilizacion de los co-productos del procedimiento. Hablamos por lo tanto de hidrolizados celulosicos.
La xilosa utilizada en la mezcla que constituye el azucar inductor puede ser reemplazada por una solucion de hidrolizados hemicelulolfticos, procedente del procedimiento de transformacion de biomasa lignocelulosica en etanol, y procedente particularmente del pretratamiento de la biomasa.
Por otro lado, la posibilidad de utilizar una mezcla muy concentrada de azucares permite ventajosamente limitar los riesgos de contaminacion.
El hecho de anadir xilosa a la mezcla que constituye el sustrato inductor permite aumentar de forma importante la actividad de xilanasa del coctel enzimatico final. La xilosa puede ser ventajosamente sustituida por una solucion de hidrolizado hemicelulosico, procedente de la hidrolisis de las hemicelulosas durante el pretratamiento de la biomasa lignocelulosica en los procedimientos de produccion de biocarburantes de segunda generacion, y que puede estar concentrada si fuera necesario.
De una forma preferida, la mezcla que constituye el sustrato inductor comprende entre 50 y 65 % en peso de glucosa, entre 22 y 24 % en peso de lactosa y entre 15 y 25 % en peso de xilosa, procedente eventualmente de un pretratamiento de la biomasa lignocelulosica, siendo la suma de los constituyentes igual a 100 %.
Muy preferiblemente, el sustrato inductor es una mezcla constituida por 60 % en peso de glucosa, 23 % en peso de lactosa y 17 % en peso de xilosa.
El sustrato carbonado utilizado durante la fase de crecimiento se elige entre la glucosa, la xilosa, la lactosa, los residuos obtenidos despues de la fermentacion etanolica de los azucares monomeros de los hidrolizados enzimaticos de biomasa celulosica y/o un extracto bruto de pentosas hidrosolubles procedente eventualmente del pretratamiento de una biomasa celulosica.
Muy preferiblemente, el sustrato de crecimiento es glucosa.
Las cepas industriales utilizadas pertenecen a la especie Trichoderma reesei, modificadas para mejorar las enzimas celulolfticas y/o hemicelulolfticas mediante procesos de mutacion-seleccion. Se mencionara, por ejemplo, la cepa IFP CL847. Tambien pueden utilizarse cepas mejoradas mediante tecnicas de recombinacion genetica. Deben estar delecionadas para la represion catabolica por la glucosa (A CRE1), como, por ejemplo, la CL847.
Estas cepas se cultivan en biorreactores agitados y aireados en unas condiciones compatibles con su crecimiento y la produccion de las enzimas. Las condiciones son tales que el pH esta ajustado a entre 3,5 y 6, y la temperatura a entre 20 y 35 °C. Se elegira preferiblemente un pH de 4,8 y una temperatura de 27 °C durante la fase de crecimiento, y un pH de 4 y una temperatura de 25 °C durante la fase de produccion. El mdice de aireacion, expresado en volumen de aire por volumen de medio de reaccion y por minuto o vvm aplicado durante el procedimiento, esta comprendido entre 0.3 y 1.5 min-1, y la velocidad de rotacion o rpm debe permitir regular la presion de O2 a entre el 20 % y 60 %. Se elegira preferiblemente una aireacion de 0.5 vvm y una agitacion que permite regular la presion de O2 al 30 %.
Segun su naturaleza, el sustrato carbonado elegido para la obtencion de la biomasa es introducido en el biorreactor antes de la esterilizacion, o es esterilizado por separado y despues introducido en el biorreactor despues de la esterilizacion de este ultimo, para obtener una concentracion inicial de azucares de entre 15 y 60 g/l.
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Con respecto a la fase de produccion, se prepara una solucion acuosa que contiene el sustrato inductor constituido por la mezcla de glucosa/lactosa/xilosa o una solucion de hidrolizado hemicelulosico elegida para la fase de produccion de las enzimas a una concentracion de entre 350 y 600 g/l en la solucion de alimentacion utilizada.
Preferentemente, la concentracion esta comprendida entre 450 y 550 g/l.
La solucion acuosa es inyectada tras el agotamiento del sustrato inicial, de forma que se aporte una cantidad optimizada. El flujo de introduccion de la solucion de alimentacion es de entre 30 y 45 mg por gramo de celulas y por hora.
La concentracion residual de azucar en el medio de cultivo es inferior a 1 g/l durante la fase de produccion ("fed- batch"), de forma que se limite la produccion de biomasa. De forma preferida, esta concentracion es inferior a 0,5 g/l, y aun mas preferiblemente a 0,1 g/l.
Ejemplos
Entre los siguientes ejemplos, el ejemplo 1 presenta un cultivo que utiliza la glucosa como sustrato carbonado durante la fase de crecimiento y la fase de produccion. Este ejemplo muestra la baja produccion de protemas obtenida cuando se utiliza este azucar como unico sustrato carbonado, incluso si el flujo es limitante durante la fase de fed-batch (concentracion residual de glucosa proxima a 0). El segundo ejemplo representa la fermentacion de referencia mediante la utilizacion de lactosa como sustrato carbonado durante la fase de crecimiento y la fase de produccion, lo que permite una importante produccion de protemas. El ejemplo 3 reproduce un experimento que utiliza en la fase de produccion una mezcla tal como la descrita en la solicitud de patente WO 2009/026716 que contiene una elevada proporcion de xilosa que permite, segun los autores, aumentar en gran medida la produccion de las celulasas con respecto a un experimento en el que la xilosa o los derivados hemicelulosicos son utilizados como unicos sustratos carbonados. Los ejemplos 4 a 6 son de patentes conformes con el procedimiento segun la presente invencion.
Ejemplo 1: produccion de enzimas con glucosa (no conforme con la invencion)
La produccion de celulasas se lleva a cabo en un biorreactor agitado mecanicamente. El medio mineral tiene la siguiente composicion: KOH 1,66 g/l, H3PO4 al 85 % 2 ml/l, (NH4)2SO4 2,8 g/l, MgSO4 ■ 7 H2O 0,6 g/l, CaCl2 0,6 g/l, MnSO4 3,2 mg/l, ZnSO4 ■ 7 H2O 2,8 mg/l, CoCI2 10 4,0 mg/l, FeSO4 ■ 7 H2O 10 mg/l, Corn Steep 1,2 g/l, antiespumante 0,5 ml/l.
El biorreactor que contiene el medio mineral es esterilizado a 120 °C durante 20 minutos, la fuente carbonada glucosa es esterilizada aparte a 120 °C durante 20 minutos y despues anadida de forma esteril al biorreactor, de forma que se obtenga una concentracion final de 30 g/l. El biorreactor se cultiva al 10% (v/v) con un precultivo lfquido de la cepa de Trichoderma reesei CL847. El medio mineral del precultivo es identico al del biorreactor excepto por la adicion de ftalato de potasio a 5 gl-1 para tamponar el pH. El crecimiento del hongo del precultivo se realiza utilizando glucosa como sustrato carbonado, a una concentracion de 30 g/l. El crecimiento del inoculo dura entre 2 y 3 dfas y se realiza a 28 °C en una estufa de incubacion agitada. La transferencia al biorreactor se lleva a cabo cuando la concentracion residual de glucosa es inferior a 15 g/l.
El experimento realizado en el biorreactor comprende dos fases:
- una fase de crecimiento en el sustrato carbonado glucosa (concentracion inicial = 30 g/l) a una temperatura de 27 °C y a un pH de 4,8 (regulado por amomaco 5.5 M). La aireacion es de 0,5 vvm y la agitacion se aumenta hasta entre 200 y 800 rpm en funcion de la pO2 (la presion del oxfgeno disuelto), que se mantiene superior al 30 %.
- una fase de produccion de enzimas. Cuando el sustrato inicial del fermentador se ha agotado y se ha inyectado la solucion de glucosa a 250 g/l de forma continua con un caudal de entre 30 y 40 mg por g de celulas y por hora hasta 164 horas. La temperatura se reduce hasta 25 °C y el pH a 4 hasta el final del cultivo. El pH es regulado mediante la adicion de una solucion de amomaco 5.5 N que aporta el nitrogeno necesario para la smtesis de las protemas excretadas. El contenido en oxfgeno disuelto se mantiene por encima de entre el 15 y el 20% mediante una aireacion y una agitacion.
La produccion de enzimas esta seguida por la adicion de las protemas extracelulares mediante el metodo de Lowry y BSA estandar, despues de la separacion del micelio mediante una filtracion o una centrifugacion. Las actividades celulolfticas determinadas son:
- la actividad de papel de filtro (UPF: unidad de papel de filtro) que permite calcular la actividad global del conjunto enzimatico de endoglucanasas y exoglucanasas
- las actividades de aril p-glucosidasa y xilanasas para las actividades espedficas.
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La actividad de UPF se mide con un papel de Whatman n° 1 (procedimiento recomendado por la comision biotecnologica IUPAC) a una concentracion inicial de 50 g/l; se determina la muestra de ensayo de la solucion enzimatica que se va a analizar, que libera el equivalente a 2 g/l de glucosa (analisis colorimetrico) en 60 minutos. El principio de la actividad de papel de filtro es determinar mediante el analisis del DNS (acido dinitrosalidlico) la cantidad de azucares reducidos procedentes de un papel de Whatman n° 1 (procedimiento recomendado por la comision biotecnologica IUPAC).
El sustrato utilizado para la determinacion de la actividad de aril p-glucosidasa es el p-nitrofenil-p-D-glucopiranosido (PNPG). Es escindido por la p-glucosidasa, lo que libera el p-nitrofenol.
Una unidad de actividad de aril p-glucosidasa se define como la cantidad de enzima necesaria para reducir 1 pmol de p-nitrofenol a partir de PNPG por minuto, y se expresa en lU/ml. El principio del analisis de la actividad de xilanasa se basa en la determinacion mediante el analisis del DNS de la cantidad de azucares reducidos procedentes de la solucion de xilanasa hidrolizada. Este metodo de analisis utiliza las propiedades reductoras de los azucares, y principalmente de la xilosa. La actividad de xilanasa se expresa en lU/ml, lo que se corresponde con la cantidad de enzima necesaria para producir 1 pmol de xilosa por minuto.
Las actividades espedficas se obtienen dividiendo las actividades expresadas en lU/ml por la concentracion de protemas. Se expresan en lU/mg.
Las determinaciones analfticas sobre el mosto final del ejemplo 1 proporcionan los siguientes resultados:
Las determinaciones analfticas sobre el mosto final proporcionan los siguientes resultados:
Biomasa g/l 15.2
Protemas g/l 2,9
UPF lU/ml 1,4
Xilanasa 29.1 lU/mg
p-Glucosidasa espedfica 0.35 lU/mg
La cepa CL847 se presenta desreprimida frente a la represion catabolica ejercida por la glucosa sobre la produccion de celulasa (tiene delecionado el gen CRE1). Parece que incluso para un fed-batch llevado a cabo en unas condiciones de limitacion de glucosa, la produccion final de protemas es muy baja.
Ejemplo 2: produccion de enzimas con lactosa (no conforme con la invencion)
La produccion de enzimas es realizada en las mismas condiciones que en el Ejemplo 1. El sustrato carbonado durante las fases de crecimiento y de produccion es la lactosa pura. La lactosa es un inductor importante de la produccion de celulasas. Este es el sustrato mas utilizado industrialmente para la produccion de celulasas.
Despues de 30 horas de crecimiento, tras el agotamiento del sustrato inicial, la solucion de fed-batch a 250 g/l es inyectada de forma continua con un caudal de 35 mg por g de celulas y por hora hasta 164 horas.
Las determinaciones analfticas sobre el mosto final proporcionan los siguientes resultados:
Biomasa g/l 13.5
Protemas g/l 37.8
UPF lU/ml 22.1
Xilanasa 408.5 lU/ml
p-Glucosidasa espedfica 0.96 lU/mg
Ejemplo 3: produccion con la mezcla de 97 % de xilosa / 3 % de azucares inductores de la produccion de celulasas o de CIC (no conforme con la invencion)
El experimento se ha llevado a cabo en las mismas condiciones que en el ejemplo 1 mediante la utilizacion de xilosa pura como unico sustrato carbonado en el transcurso de la fase de crecimiento, y en la fase de produccion, la mezcla de 97% de xilosa / 3% de CIC presentada en la solicitud de patente Wo 2009/026716 A1. Los CIC (azucares inductores de la produccion de celulasas) son una mezcla de azucares que permite la induccion de la produccion de las celulasas. Su composicion es la siguiente: 56% de gentiobiosa, 14% de soforosa, 10% de trehalosa, 6 % de celobiosa, 6 % de maltotriosa, 8 % de glucosa.
Tras el agotamiento del sustrato inicial, se inyecta la mezcla de 97 % de xilosa / 3 % de CIC a 360 g/l segun las recomendaciones descritas, con un caudal de 0.4 g de carbono L-1h-1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Las determinaciones analfticas sobre el mosto final proporcionan los siguientes resultados:
Biomasa 14.3 g/l
Protemas 18.7 g/l
UPF 6.4 lU/ml
Xilanasa 6000.1 lU/ml
UPF espedfica 0.34 lU/mg
p-Glucosidasa espedfica 1,15 lU/mg
La produccion final de protemas esta proxima a la presentada en la patente WO 2009/026716 A1, en la que los autores han obtenido una concentracion final de protemas de 25 g/l con la cepa P59G. La actividad espedfica de FPasa (0.34 lU/mg) es baja, mientras que la actividad de xilanasa es muy elevada.
Ejemplo 4: produccion con la mezcla de lactosa (23 %) / glucosa (60 %) / xilosa (17 %) a 500 g/l (segun la invencion)
El experimento del ejemplo 4 se lleva a cabo en las mismas condiciones que en el ejemplo 1 con la glucosa como sustrato carbonado de crecimiento, a 60 g/l. A continuacion hemos utilizado, en el transcurso de la fase de produccion en modo "fed-batch", una solucion en la que se mezclan tres sustratos carbonados segun las siguientes proporciones: lactosa (23 %) / glucosa (60 %) / xilosa (17 %) a 500 g/l. Esta mezcla se ha inyectado a 45 mgg'1h'1. Las determinaciones analfticas sobre el mosto final proporcionan los siguientes resultados:
Biomasa 26.1 g/l
Protemas 61.8 g/l
UPF 33.7 lU/ml
Xilanasa 4017 lU/ml
UPF espedfica 0.55 lU/mg
p-Glucosidasa espedfica 1,2 lU/mg
La produccion final de protemas es mas de 3 veces superior a la del ejemplo 3. La actividad de papel de filtro, que es indicativa de la actividad de celulasa, es aproximadamente 5 veces superior.
La actividad de xilanasa es 10 veces superior a la del ejemplo 2 realizado con lactosa como unico sustrato carbonado de crecimiento y de produccion, pero aproximadamente un 50 % inferior a la del ejemplo 3.
Ejemplo 5: utilizacion de la mezcla de lactosa (23 %) / glucosa (60 %) / solucion de azucares C5 (17 %) a 500 g/l (segun la invencion)
El ejemplo 5 se lleva a cabo en las mismas condiciones que en el ejemplo 4. Se utiliza glucosa durante la fase de crecimiento a una concentracion de 15 g/l. La xilosa de la solucion de fed-batch es sustituida por una solucion hemicelulosica soluble o una solucion de azucares C5 procedente de paja de trigo impregnada con acido sulfurico 0,08 N y pretratada con una explosion de vapor (19 bar, 5 minutos). La mezcla es inyectada a 30 mgg'1h'1 durante 170 h.
Las determinaciones analfticas sobre el mosto final proporcionan los siguientes resultados:
Biomasa 19.1 g/l
Protemas 57.3 g/l
UPF 25.1 lU/ml
Xilanasa 1151 lU/ml
UPF espedfica 0.44 lU/mg
p-Glucosidasa espedfica 1,4 lU/mg
Este experimento ha permitido aumentar las producciones de protemas en mas del 50 % con respecto al ejemplo 2, y la actividad de xilanasa es casi 3 veces superior. La mayor parte de la lactosa es sustituida durante la fase de crecimiento y de produccion por glucosa y la solucion de azucares C5. La concentracion de glucosa durante la fase de crecimiento se ha reducido con respecto a la del ejemplo 4, desde 60 hasta 15 g/l. La concentracion de biomasa se ha disminuido desde 26 hasta 19 g/l, pero esto tiene poca incidencia sobre la concentracion final de protemas (reduccion del 7 %). Asf tenemos, por lo tanto, una utilizacion optima de los azucares y una disminucion notable del coste de la fuente de carbono.
Ejemplo 6: utilizacion de la mezcla: lactosa (23%) / hidrolizados C6 (56%) / xilosa (21 %) a 500 g/l (segun la invencion)
El ejemplo 6 se lleva a cabo en las mismas condiciones que en el ejemplo 4. Se utiliza glucosa durante la fase de crecimiento a una concentracion de 15 g/l. La glucosa de la solucion de fed-batch es sustituida por una solucion de hidrolizado procedente de la hidrolisis enzimatica de paja de trigo impregnada con acido sulfurico 0,08 N y pretratada
con una explosion de vapor (19 bar, 5 minutes). La hidrolisis enzimatica de la paja de trigo se ha llevado a cabo a 50 °C y a un pH de 4.8. Ha dado lugar a una hidrolisis del 95 % de la celulosa en glucosa.
Se han disuelto lactosa y xilosa en esta solucion de forma que se consiga en la mezcla:
5
lactosa (23 %) / hidrolizados C6 (56 %) / xilosa (21 %) a 500 g/l
La mezcla es inyectada a 30 mgg'1h'1 durante 170 h durante la fase de fed-batch.
Las determinaciones analfticas sobre el mosto final proporcionan los siguientes resultados:
10
Biomasa 16.1 g/l Protemas 43.1 g/l UPF 31.4 lU/ml Xilanasa 6595.1 lU/ml 15 UPF espedfica 0.73 lU/mg
p-Glucosidasa espedfica 1,2 lU/mg
El coctel enzimatico obtenido es de muy buena calidad, ya que la actividad final de FPasa esta proxima a la actividad obtenida en el ejemplo 4, incluso si la concentracion de protemas es mas baja. La actividad final de FPasa 20 es aproximadamente 5 veces superior a la obtenida con el ejemplo 3, y aproximadamente un 50 % superior a la obtenida para el ejemplo 2, en el que se utiliza lactosa como unico sustrato carbonado durante la fase de fed-batch.

Claims (9)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    REIVINDICACIONES
    1. Procedimiento de produccion de enzimas celuloltticas y/o hemicelulolfticas por parte de un microorganismo celulolftico y/o hemicelulolttico que comprende al menos una fase de crecimiento en presencia de una fuente de carbono y al menos una fase de produccion en presencia de un sustrato inductor, en el que dicho sustrato inductor es una mezcla de glucosa o de hidrolizados celulosicos, de lactosa y de xilosa, o una solucion de hidrolizados hemicelulolfticos, estando el contenido de cada uno de los constituyentes de la mezcla definido por los siguientes lfmites:
    - del 40 al 65 % en peso de glucosa,
    - del 21 al 25 % en peso de lactosa y -del 10 al 39 % en peso de xilosa,
    siendo la suma de estos tres constituyentes igual a 100 %, y
    el microorganismo pertenece a la especie Trichoderma reesei, y esta delecionado para la represion catabolica por la glucosa.
  2. 2. Procedimiento segun la reivindicacion 1 en el que el aporte del sustrato inductor se lleva a cabo en solucion, siendo la concentracion del sustrato inductor en la solucion de alimentacion utilizada durante la fase de produccion de entre 350 y 600 g/l.
  3. 3. Procedimiento segun la reivindicacion 2 en el que la concentracion esta comprendida entre 450 y 550 g/l.
  4. 4. Procedimiento segun una de las reivindicaciones anteriores en el que la mezcla que constituye el sustrato inductor comprende del 50 al 65 % en peso de glucosa, del 22 al 24 % en peso de lactosa y del 15 al 25 % en peso de xilosa, siendo la suma de los constituyentes de la mezcla igual a 100 %.
  5. 5. Procedimiento segun la reivindicacion 4 en el que el sustrato inductor es una mezcla constituida por 60 % en peso de glucosa, 23 % en peso de lactosa y 17 % en peso de xilosa.
  6. 6. Procedimiento segun una de las reivindicaciones anteriores en el que el sustrato carbonado utilizado durante la fase de crecimiento se elige entre la glucosa, la xilosa, la lactosa, los residuos obtenidos despues de la fermentacion etanolica de los azucares monomeros de los hidrolizados enzimaticos de biomasa celulosica y/o un extracto bruto de pentosas hidrosolubles procedente eventualmente del pretratamiento de una biomasa celulosica.
  7. 7. Procedimiento segun una de las reivindicaciones anteriores en el que el pH esta ajustado a entre 3,5 y 6 y la temperatura esta comprendida entre 20 y 35 °C.
  8. 8. Procedimiento segun una de las reivindicaciones anteriores en el que el flujo de introduccion de la solucion de alimentacion es de 30 a 45 mg por gramo de celulas y por hora.
  9. 9. Procedimiento segun una de las reivindicaciones anteriores en el que la concentracion residual de azucar en el medio de cultivo durante la fase de produccion es inferior a 1 g/l, preferiblemente a 0,5 g/l y muy preferiblemente a 0,1 g/l.
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