CN102083992B - 发酵含木素纤维素材料 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及发酵经水解的经预处理的含木素纤维素材料产生发酵产物的方法。

Description

发酵含木素纤维素材料
发明领域
本发明涉及基于含木素纤维素材料的发酵方法。
发明背景
由于化石燃料有限的储量和对温室气体排放的担忧，人们越来越多地关注使用可再生能源。
包含含木素纤维素材料的植物材料可由发酵生物(包括细菌、酵母和真菌)转化为可发酵的糖，并用作能源用于工业目的。例如，含木素纤维素材料可由酶转化为糖，且所得的糖可用作原料供工业微生物产生产物，如塑料和乙醇。
由含木素纤维素材料的发酵生成发酵产物(如乙醇)在本领域中是已知的，并且通常包括含木素纤维素材料的预处理、水解和发酵。
含木素纤维素材料的预处理导致例如，乙酸、酚类和呋喃由含木素纤维素材料释放，所述材料在水解和发酵期间可以不可逆地结合加入的酶。这些化合物也可对于发酵生物体的代谢是有毒的，并且抑制发酵生物体的性能。为了克服对酵母的这种抑制，实践中将水解物稀释，并在低干固体浓度的条件下发酵，从而实现了对所述抑制化合物浓度的相应的稀释。
通过增加pH可减少特别是乙酸和其它弱酸对酵母的毒性也是众所周知的。然而，为了控制腐败(spoilage)细菌的污染，对经水解的含木素纤维素材料的发酵通常在酸性pH(低于5.5)进行。因此，经水解的含木素纤维素材料的发酵通常在低pH和低干固体浓度进行。
需要从含木素纤维素材料产生发酵产物的改进的方法。
发明概述
本发明人现已发现，可在较高pH发酵经水解的含木素纤维素材料的醪液(mash)，并同时控制腐败细菌的污染。这是通过在发酵过程中使用非常高的干固体浓度来实现的。不拘于理论，相信虽然弱酸(如乙酸)对发酵生物的毒性在高pH时减少从而允许发酵生物的增殖，但是腐败细菌的生长受高浓度的其它抑制化合物控制。
因此，本发明在第一个方面涉及从含木素纤维素材料产生发酵产物的方法，包括下述步骤：(a)(i)预处理含木素纤维素材料的材料，(a)(ii)水解经预处理的含木素纤维素材料，(b)使用发酵生物发酵在步骤(a)中获得的水解物，和(c)任选地，回收所述发酵产物，其中，在步骤(b)中的发酵过程中，pH为5.5-9.0，而高的干固体浓度为至少20％。
在第二个方面，本发明涉及产生发酵产物的方法，所述方法包括：(a)提供经预处理的含木素纤维素材料的水解物，(b)将所述水解物与发酵生物相接触以产生发酵产物，和(c)任选地，回收所述发酵产物，其中，在步骤(b)中的发酵过程中，pH为5.5-9.0，而高的干固体浓度为至少20％。
在上述方面中，所述发酵生物优选酵母，而发酵产物优选乙醇。
上述方面步骤的具体细节如下所述(例如，在“预处理”、“水解”和“发酵”部分中)。
具体实施方式
含木素纤维素材料
本文使用的术语“含木素纤维素材料”指主要由纤维素、半纤维素和木质素组成的材料。该术语与“木素纤维素材料”同义。这种材料经常称为“生物质”。
本发明包括任何含木素纤维素材料。含木素纤维素材料可以是包含木质纤维素的任何材料。在一个优选实施方案中，含木素纤维素材料包含至少30wt.％，优选至少50wt.％，更优选至少70wt.％，甚至更优选至少90wt.％的木质纤维素。应理解的是，含木素纤维素材料还可以包含其它组分，如蛋白质材料、淀粉、糖，如可发酵的糖和/或不可发酵的糖。
通常在例如植物的茎、叶、壳、皮和穗轴或树的叶、枝和木材中发现含木素纤维素材料。含木素纤维素材料还可以是，但不限于，草本材料、农业残余物、林业残余物、城市固体废物、废纸，和纸浆和造纸厂残余物。在本文应理解的是，含木素纤维素材料可以是植物细胞壁材料的形式，其在混合的基体中包含木质素、纤维素和半纤维素。
在一个优选实施方案中，含木素纤维素材料包括玉米秸秆、玉米纤维、稻草、松木、木屑/刨花(woodchip)、杨木、甘蔗渣、纸和纸浆(pulp)处理废物中的一种或多种。
其它含木素纤维素材料的实例包括硬木，如杨木和桦木，软木，谷类草杆(cerealstraw)，如麦秆(wheatstraw)，柳枝稷(switchgrass)，城市固体废物，工业有机废物，办公用纸，或它们的混合物。
在一个优选实施方案中，木素纤维素材料是玉米秸秆或玉米纤维，优选通过蒸汽爆炸(steamexplosion)预处理，优选经酶法水解，并在约6的pH和约30％的干固体浓度用酵母发酵产生乙醇。所述乙醇优选回收用作燃料乙醇。
预处理
木素纤维素的结构对酶法水解而言不是直接可及的。因此，必须预处理含木素纤维素材料(例如，通过在充分的压力和温度条件下酸水解)以打破木质素的密封并破坏纤维素的晶体结构。这导致半纤维素和纤维素级分的溶解(solubilization)。然后可将纤维素和半纤维素用酶水解，例如，通过纤维素酶酶(纤维素分解酶)，以将糖聚合物转化为可发酵的糖，其使用发酵生物(例如，酵母)，可发酵为期望的发酵产物(如乙醇)。任选地，所述发酵产物可(例如，通过蒸馏)回收。
当预处理含木素纤维素材料时，产生了可能抑制酶和/或可能对发酵生物有毒性的降解产物。这些降解产物严重地减少了水解和发酵两者的速率。
预处理含木素纤维素材料的方法在本领域是众所周知的。本发明涵盖的方法的实例描述于下面“预处理”部分。
经预处理的木素纤维素降解产物包括木质素降解产物、纤维素降解产物和半纤维素降解产物。经预处理的木质素降解产物本质上可为酚。
半纤维素降解产物包括来自糖(如己糖和/或戊糖)的呋喃，所述糖包括木糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖和阿拉伯糖。半纤维素的实例包括木聚糖、半乳葡甘露聚糖(galactoglucomannan)、阿拉伯半乳聚糖(arabinogalactan)、阿拉伯葡糖醛酸木聚糖(arabinoglucuronoxylan)、葡糖醛酸木聚糖(glucuronoxylan)，及其衍生物和组合。
抑制化合物(即，经预处理的木质纤维素降解产物)的实例，包括4-OH苯甲醇，4-OH苯甲醛，4-OH苯甲酸，三甲基苯甲醛，2-糠酸，香豆酸，阿魏酸，酚，愈创木酚，藜芦醚，连苯三酚(pyrogallollol)，连苯三酚单甲酯，香草醇，香草醛，异香草醛，香草酸，异香草酸，高香草酸(homovanillicacid)，藜芦醇，藜芦醛，藜芦酸，2-O-甲基五倍子酸，丁香醇，丁香醛，丁香酸，三甲基五倍子酸，高儿茶酚，乙基香草醛，木焦油醇，对甲基苯甲醚，茴香醛，茴香酸，糠醛，羟甲基糠醛，5-羟甲基糠醛，甲酸，乙酸，乙酰丙酸，桂皮酸，松柏醛，异丁子香酚，对苯二酚，丁子香酚或它们的组合。其它抑制化合物可见于，例如Luo等，2002，BiomassandBioenergy22：125-138。
可以以任何合适的方式预处理含木素纤维素材料。预处理可以在水解和/发酵前和/或期间进行。在一个优选实施方案中，在发酵前和/或期间，将经预处理的材料水解，优选酶水解。预处理的目的是分离和/或释放纤维素，半纤维素和/或木质素，并且这种方式可以改善水解速率(rateofhydrolysis)。预处理方法如湿氧化和碱预处理靶向(target)木质素，而稀酸和自水解靶向半纤维素。蒸汽爆炸(steamexplosion)是靶向纤维素的预处理的实例。
根据本发明，步骤(a)中的预处理可以是使用本领域公知技术的常规预处理步骤。合适的预处理的实例在下文描述。在一个优选实施方案中，预处理在含水浆料中发生。
预处理期间，含木素纤维素材料可以以10-80wt.％，优选20-70wt.％，特别是30-60wt.％，如约50wt.％的干固体浓度存在。
化学、机械和/或生物预处理
根据本发明，含木素纤维素材料在水解和/或发酵前可以进行化学、机械和/或生物预处理。机械预处理(经常称作物理处理)可以单独使用或者与随后或同时进行的水解(特别是酶水解)组合使用。
优选地，在水解和/或发酵前进行化学、机械和/或生物预处理。或者，化学、机械和/或生物预处理可以与水解同时进行，如与加入一种或多种纤维素酶(纤维素分解酶)或下述其它酶活性同时进行，以释放例如可发酵糖，如葡萄糖和/或麦芽糖。
在本发明的实施方案中，可洗涤经预处理的含木素纤维素材料。然而，洗涤不是必须的，且在优选的实施方案中可以去除。
化学预处理
术语“化学预处理”指促进纤维素、半纤维素和/或木质素的分离和/或释放的任何化学预处理。合适的化学预处理的实例包括用例如稀酸、石灰、碱、有机溶剂、氨、二氧化硫、二氧化碳处理。此外，湿氧化和控制pH的水热解(hydrothermolysis)也被认为是化学预处理。
在一个优选实施方案中，化学预处理是酸处理，更优选地，连续的稀酸和/或弱酸(mildacid)处理，如，用硫酸，或者另一种有机酸，如乙酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸、盐酸或它们的混合物处理。也可以使用其它酸。弱酸处理指处理pH在1-5，优选1-3的范围内。在具体的实施方案中，酸浓度为0.1至2.0wt.％的酸，优选硫酸。酸可以接触含木素纤维素材料，并且混合物可以在160-220℃，如165-195℃的温度保持数分钟至数秒钟的时间，例如1-60分钟，如2-30分钟或3-12分钟。可以加入强酸，如硫酸，用于去除半纤维素。这增强了纤维素的可消化性。
也涵盖其它技术。已经显示，纤维素溶剂处理可将约90％的纤维素转化成葡萄糖。也已经显示，当木质纤维素结构破坏时能极大地增强酶水解。碱性H2O2、臭氧、有机溶剂(organosolv)(使用含水醇中的Lewis酸、FeCl3、(Al)2SO4)、甘油、二烷(dioxane)、苯酚或乙二醇属于已知可破坏纤维素结构并促进水解的溶剂(Mosier等，2005，BioresourceTechnology96：673-686)。
本发明也涵盖用碱，例如NaOH、Na2CO3和/或氨等进行的碱性化学预处理。使用氨的预处理方法在例如WO2006/110891、WO2006/110899、WO2006/110900和WO2006/110901(通过提述并入本文)中描述。
湿氧化技术包括使用氧化剂，如：基于亚硫酸(sulphite)的氧化剂等。溶剂预处理的实例包括用DMSO(二甲基亚砜)等处理。化学预处理通常进行1至60分钟，如从5至30分钟，但是依赖于待预处理的材料，化学预处理可以进行更短或更长的时间。
合适的预处理方法的其它实例由Schell等，2003，Appl.BiochemandBiotechn.Vol.105-108：69-85，和Mosier等，2005，BioresourceTechnology96：673-686，和美国公开2002/0164730描述，所述文献通过提述全部并入本文。
机械预处理
术语“机械预处理”指可以促进纤维素、半纤维素和/或木质素从含木素纤维素材料分离和/或释放的任何机械(或物理)处理。例如，机械预处理包括各种类型的磨制(milling)、辐射(irradiation)、汽蒸/蒸汽爆炸，和水热解。
机械预处理包括粉碎(机械减小尺度)。粉碎包括干磨、湿磨和振动球磨。机械预处理可涉及高压和/或高温(蒸汽爆炸)。在本发明的一个实施方案中，高压指300至600psi，优选400至500psi，如约450psi范围内的压力。在本发明的一个实施方案中，高温指在约100至300℃，优选约140至235℃范围内的温度。在一个优选实施方案中，机械预处理是分批工艺的蒸汽枪(steamgun)水解器系统，其使用如上所定义的高压和高温。为此可使用SundsHydrolyzer(可由SundsDefibratorAB(Sweden)得到)。
组合的化学和机械预处理
在一个优选实施方案中，化学和机械预处理均进行。例如，预处理步骤可以涉及稀酸或弱酸处理和高温和/或高压处理。化学和机械预处理可以根据需要顺序或同时进行。
因此，在一个优选实施方案中，对含木素纤维素材料进行化学和机械预处理，以促进纤维素、半纤维素和/或木质素的分离和/或释放。
在一个优选实施方案中，预处理作为稀酸和/或弱酸蒸汽爆炸步骤进行。在另一个优选的实施方案中，预处理作为氨纤维爆炸步骤(或AFEX预处理步骤)进行。
生物预处理
如同本发明所使用的，术语“生物预处理”指可促进纤维素、半纤维素和/或木质素从含木质纤维素材料分离和/或释放的任何生物预处理。生物预处理技术可涉及应用溶解木质素的微生物(参见，例如，Hsu，1996，Pretreatmentofbiomass，于HandbookonBioethanol：ProductionandUtilization，Wyman编，Taylor&Francis，Washington，DC，179-212；Ghosh和Singh，1993，Physicochemicalandbiologicaltreatmentsforenzymatic/microbialconversionoflignocellulosicbiomass，Adv.Appl.Microbiol.39：295-333；McMillan，1994，Pretreatinglignocellulosicbiomass：areview，于EnzymaticConversionofBiomassforFuelsProduction，Himmel，Baker和Overend编，ACSSymposiumSeries566，AmericanChemicalSociety，Washington，DC，第15章；Gong，Cao，Du和Tsao，1999，Ethanolproductionfromrenewableresources，于AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology，Scheper编，Springer-VerlagBerlinHeidelberg，Germany，65：207-241；Olsson和Hahn-Hagerdal，1996，Fermentationoflignocellulosichydrolysatesforethanolproduction，Enz.Microb.Tech.18：312-331；及Vallander和Eriksson，1990，Productionofethanolfromlignocellulosicmaterials：Stateoftheart，Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.42：63-95)。
水解
在发酵前和/或与发酵同时，可以将经预处理的含木质纤维素材料水解，以分解(breakdown)纤维素和半纤维素。
水解期间的干燥固体含量可在5-50wt.％，优选10-40wt.％，优选20-30wt.％的范围内。在一个优选实施方案中，水解可以作为补料分批方法进行，其中将经预处理的含木素纤维素材料(底物)向例如包含酶的水解溶液中逐渐补料。
在一个优选实施方案中，水解以酶法进行。根据本发明，经预处理的含木质纤维素材料可以通过一种或多种水解酶(根据酶命名法为EC3类)水解，优选选自下组的一种或多种糖酶：纤维素酶、半纤维素酶，淀粉酶如α-淀粉酶、蛋白酶、糖生成酶(carbohydrate-generatingenzyme)如葡糖淀粉酶、酯酶如脂肪酶。在水解和/或发酵期间可存在α-淀粉酶、葡糖淀粉酶等，因为含木素纤维素材料可能包括一些淀粉。
用于水解的酶能直接或间接将糖聚合物转化成可发酵的糖，后者能发酵成为期望的发酵产物，如乙醇。
在一个优选实施方案中，糖酶具有纤维素酶的活性。合适的糖酶在下面的“酶”部分中描述。
可通过半纤维素酶和/或酸水解分解半纤维素聚合物，以释放其五碳糖和六碳糖组分。六碳糖(己糖)，如葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和甘露糖，通过合适的发酵生物体(包括酵母)可容易地发酵成为，例如乙醇、丙酮、丁醇、甘油、柠檬酸、富马酸等。优选用于乙醇发酵的是酿酒酵母菌种的酵母，优选对高水平乙醇，即，高至例如约10、12或15vol.％乙醇或者更多，如20vol.％乙醇有抗性的菌株。
在一个优选实施方案中，使用半纤维素酶，优选木聚糖酶、酯酶、纤维二糖酶或其组合水解经过预处理的含木质纤维素材料。
水解也可以在半纤维素酶和/或纤维素酶，和任选的下文“酶”部分中提及的一种或多种其它酶活性的组合存在的情况下进行。
可以在可由本领域技术人员容易确定的条件下，在合适的含水环境中进行酶处理。
在一个优选实施方案中，在适于所述酶的条件(优选最适条件)下进行水解。
合适的工艺时间、温度和pH条件可由本领域的技术人员容易地确定。优选地，水解在25-70℃，优选40-60℃，特别是约50℃的温度进行。优选地，该工艺在pH3-8，优选pH4-6，特别是约pH5的pH进行。
优选地，水解进行12-96小时，优选16-72小时，更优选24-48小时。
发酵
根据本发明，通过至少一种能将可发酵糖如葡萄糖、木糖、甘露糖和半乳糖直接或间接发酵成为期望发酵产物的发酵生物体，来发酵经预处理(和水解)的含木素纤维素材料。
发酵中的pH在5.5到9.0，优选在5.7到8.0，更优选5.8到7.0，且最优选在至少pH5.9到6.5的范围，如约pH6。pH可以使用任何合适的化合物调整。在一个优选实施方案中，使用NaOH调整pH。
发酵过程中的干固体浓度在约20％到高至约35％的范围，如至少20％、至少21％、至少22％、至少23％、至少25％、至少26％、至少27％、至少28％、至少29％，和高至约30％、高至31％、高至32％、高至33％或甚至高至34％。
发酵优选进行8至96小时，优选12至72小时，更优选从24至48小时。
在一个实施方案中，发酵在20至40℃，优选26至34℃，特别是约32℃的温度进行。在一个实施方案中，pH为pH5.5至9.0，优选从约pH6至6.5。
根据本发明，步骤(a)中的水解和步骤(b)中的发酵可同时(SSF方法)或顺次(SHF方法)，或作为混合水解和发酵(HHF)进行。
在一个优选实施方案中，水解和发酵作为同时水解和发酵步骤进行(SSF)。通常这意味着组合的/同时水解和发酵在对所述发酵生物合适(优选为最佳)的条件(例如，温度和/或pH)下进行。
在一个实施方案中，没有水解的单独保持阶段，意味着水解酶和发酵生物体一起加入。当发酵(例如，使用酵母属酵母的乙醇发酵)与水解同时进行时，温度优选为26℃-35℃，更优选30℃-34℃，如约32℃。根据本发明可以使用包含在不同温度的至少两个保持阶段的温度程序。
在另一个优选实施方案中，水解和发酵作为混合水解和发酵(HHF)进行。HHF一般以单独的部分水解步骤起始，并以同时水解和发酵步骤结束。所述单独的部分水解步骤是酶法纤维素糖化步骤，一般在对所述水解酶合适(优选为最佳)的条件(例如，在较高的温度)下进行。后续的同时水解和发酵步骤通常在对所述发酵生物合适的条件(通常在比所述单独水解步骤更低的温度)下进行。最后，水解和发酵步骤还可以以分开的水解和发酵来进行，其中在发酵起始之前完成所述水解。这常常称作“SHF”。
回收
发酵后，可以从发酵培养基/培养液(broth)分离发酵产物。可以蒸馏培养基/培养液以提取发酵产物，或者可以通过微滤或膜过滤技术从发酵培养基/培养液提取发酵产物。或者可以通过气提(stripping)回收发酵产物。回收方法是本领域中公知的。
发酵产物
本发明的方法可以用于产生任何发酵产物。特别期望的发酵产物包括醇(例如，乙醇、甲醇、丁醇)；有机酸(例如，柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡萄糖酸)；酮(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氨酸)；气体(例如，H2和CO2)；抗生素(例如，青霉素和四环素)；酶；维生素(例如，核黄素、B12、β-胡萝卜素)；和激素。
在一个优选实施方案中，发酵产物是醇，特别是乙醇。根据本发明获得的发酵产物，如乙醇，可以优选为燃料醇/乙醇。然而，在乙醇的情况中，其还可以用作饮料乙醇。
发酵生物体
术语“发酵生物体”指适于产生期望的发酵产物的任何生物体，包括细菌和真菌生物体。根据本发明的特别合适的发酵生物体能发酵，即，将糖如葡萄糖，直接或间接转化成期望的发酵产物。发酵生物体的实例包括真菌生物体，如酵母。优选的酵母包括酵母属的菌株，特别是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或葡萄汁酵母(Saccharomycesuvarum)的菌株；毕赤酵母属(Pichia)，特别是树干毕赤酵母(Pichiastipitis)或巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)的菌株；假丝酵母属(Candida)的菌株，特别是产朊假丝酵母(Candidautilis)、阿糖发酵假丝酵母(Candidaarabinofermentans)、迪丹斯假丝酵母(Candidadiddensii)或博伊丁假丝酵母(Candidaboidinii)的菌株。其它涵盖的酵母包括汉逊酵母属(Hansenula)，特别是多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)或异常汉逊酵母(Hansenulaanomala)的菌株；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)，特别是马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)或脆壁克鲁维酵母(Kluyveromycesfagilis)的菌株，和裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)，特别是粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)的菌株。
优选的细菌发酵生物体包括埃希氏菌属(Escherichia)，特别是大肠杆菌(Escherichiacoli)的菌株，发酵单孢菌属(Zymomonas)，特别是运动发酵单孢菌(Zymomonasmobilis)的菌株，发酵杆菌属(Zymobacter)，特别是棕榈发酵杆菌(Zymobactorpalmae)的菌株，克雷伯氏菌属(Klebsiella)，特别是产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)的菌株，明串珠菌属(Leuconostoc)，特别是肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)的菌株，梭菌属(Clostridium)，特别是丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)的菌株，肠杆菌属(Enterobacter)，特别是产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)的菌株，和热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)的菌株，特别是热厌氧杆菌BG1L1(Appl.Micrbiol.Biotech.77：61-86)和乙醇热厌氧杆菌(Thermoanarobacterethanolicus)。
商业上可用的酵母包括，例如，REDSTARTM或ETHANOLREDTM酵母(可由Fermentis/Lesaffre，USA获得)、FALI(可由Fleischmann’sYeast，USA获得)、SUPERSTART和THERMOSACCTM新鲜酵母(可由EthanolTechnology，WI，USA获得)、BIOFERMAFT和XR(可由NABC-NorthAmericanBioproductsCorporation，GA，USA获得)、GERTSTRAND(可由GertStrandAB，Sweden获得)和FERMIOL(可由DSMSpecialties获得)。
酶
在本发明方法的语境中，即使未特别提及，应理解酶(以及其它化合物)是以“有效量”使用。
纤维素分解酶
在发酵、水解、SHF或HHF过程中，可存在一种或多种纤维素分解酶。
本文所使用的术语“纤维素分解酶”应理解为包括纤维二糖水解酶(EC3.2.1.91)，例如，纤维二糖水解酶I和纤维二糖水解酶II，以及内切葡聚糖(EC3.2.1.4)和β-葡糖苷酶(EC3.2.1.21)。对上述酶进一步的描述参见下面的相关部分。
为了有效，对纤维素的消化可需要数种类型的酶合作发挥作用。通常需要至少三类酶来将纤维素转化为葡萄糖：内切葡聚糖酶(EC3.2.1.4)，其随机剪切纤维素链；纤维二糖水解酶(EC3.2.1.91)，其自纤维素链末端切割纤维二糖基单元，以及β-葡糖苷酶(EC3.2.1.21)，其将纤维二糖和可溶性纤维糊精转化为葡萄糖。在这三类涉及纤维素生物降解的酶中，纤维二糖水解酶是降解天然微晶纤维素的关键酶。在本文中，术语“纤维二糖水解酶I”定义为纤维素1，4-β-纤维二糖糖苷酶(亦称为外切葡聚糖酶、外切纤维二糖水解酶或1，4-β纤维二糖水解酶)活性，如酶分类EC3.2.1.91所定义，其通过从链的非还原末端释放纤维二糖来催化纤维素和纤维四糖中1，4-β-D-葡糖苷键的水解。对术语“纤维二糖水解酶II活性”的定义是相同的，只是纤维二糖水解酶II自链的还原末端进攻。
所述纤维素分解酶可包含糖结合模块(CBM)，其增强该酶与含木素纤维素纤维的结合，并增加该酶催化活性部分的功效。CBM定义为在对糖有活性的酶中邻接的氨基酸序列，其带有具糖结合活性的谨慎折叠(discreetfold)。关于CBM进一步的信息参见CAZy互联网服务器(见上)或Tomme等(1995)于EnzymaticDegradationofInsolublePolysaccharides(Saddler和Penner编)，Cellulose-bindingdomains：classificationandproperties.pp.142-163，AmericanChemicalSociety，Washington。
在一个优选实施方案中，所述纤维素分解酶可为如美国申请号60/941251中定义的纤维素分解制备物，该文件通过提述并入本文。在一个优选实施方案中，所述纤维素分解制备物包含具有纤维素分解增强活性的多肽(GH61A)，优选WO2005/074656中公开的桔橙嗜热霉(Thermoascusaurantiacus)GH61A(通过提述并入本文)。所述纤维素分解制备物可进一步包括β-葡糖苷酶，如源自腐质霉属(Humicola)、木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)和青霉属(Penicillium)菌株的β-葡糖苷酶，包括美国申请号US11/781,151或PCT/US2007/074038(Novozymes)中公开的特异腐质霉(Humicolainsolens)CEL45A内切葡聚糖酶核心/米曲霉(Aspergillusoryzae)β-葡糖苷酶融合蛋白。在一个实施方案中，所述纤维素分解制备物亦可包括CBHII，优选土生梭孢霉(Thielaviaterrestris)纤维二糖水解酶II(CEL6A)。在另一个实施方案中，所述纤维素分解酶制备物也可包含纤维素酶制备物，优选源自里氏木霉(Trichodermareesei)的。
在一个优选实施方案中，纤维素分解活性可源自真菌来源，如木霉属的菌株，优选里氏木霉菌株；或腐质霉属的菌株，如特异腐质霉的菌株，或金孢子菌属(Chrysosporium)的菌株，优选Chrysosporiumlucknowense的菌株。
在一个实施方案中，所述纤维素分解酶制备物包括WO2005/074656中公开的具有纤维素分解增强活性的多肽(GH61A)；纤维二糖水解酶，如土生梭孢霉纤维二糖水解酶II(CEL6A)；β-葡糖苷酶(例如，美国申请号60/832,511中公开的融合蛋白)，以及纤维素分解酶，例如，源自里氏木霉的。
在一个实施方案中，所述纤维素分解酶为商业上可得到的产品1.5L或CELLUZYMETM(可从NovozymesA/S，Denmark获得)或ACCELERASETM1000(可从GenencorInc.，USA获得)。
可添加纤维素分解酶用于水解经预处理的含木素纤维素材料。所述纤维素分解酶可以0.1-100FPU每克干固体，优选0.5-50FPU每克干固体，特别为1-20FPU每克干固体范围内的剂量添加。
所述纤维素分解酶可以1-1000EGU每克干固体，优选10-500EGU每克干固体，特别是50到200EGU每克干固体的剂量添加。
在另一个实施方案中，将至少1mg纤维素分解酶每克干固体(DS)，优选至少3mg纤维素分解酶每克干固体，如5-10mg纤维素分解酶每克干固体用于水解。
内切葡聚糖酶(EG)
内切葡聚糖酶(E.C.No.3.2.1.4)催化下述物质中1，4-β-D-糖苷键的内水解：纤维素、纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣淀粉、在混合β-1，3-葡聚糖如谷类β-D-葡聚糖或木葡聚糖中的β-1，4键，以及其它含有纤维素部分的植物材料。其官方名称为内-1，4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶，但在本说明书中使用其简称内切葡聚糖酶。内切葡聚糖酶活性可使用羧甲基纤维素(CMC)水解根据Ghose，1987，PureandAppl.Chem.59：257-268的方法确定。
在一个优选实施方案中，内切葡聚糖酶可源自木霉属的菌株，优选里氏木霉的菌株；腐质霉属的菌株，优选特异腐质霉的菌株；或金孢子菌属的菌株，优选Chrysosporiumlucknowense的菌株。
纤维二糖水解酶(CBH)
术语“纤维二糖水解酶”意指1，4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.91)，其在纤维素、纤维寡糖或任何含有β-1，4-连接的葡萄糖的聚合物中催化1，4-β-D-葡糖苷键的水解，自链的还原或非还原末端释放纤维二糖。
纤维二糖水解酶的实例为上面提及的，包括来自里氏木霉、特异腐质霉的CBHI和CBHII；来自土生梭孢霉的CBHII纤维二糖水解酶(CELL6A)。
纤维二糖水解酶活性可根据由Lever等，1972，Anal.Biochem.47：273-279和由vanTilbeurgh等，1982，FEBSLetters149：152-156；vanTilbeurgh和Claeyssens，1985，FEBSLetters187：283-288描述的方法来确定。所述Lever等的方法适用于评估玉米秸杆中纤维素的水解，而vanTilbeurgh等的方法适用于对于荧光二糖衍生物确定纤维二糖水解酶活性。
β-葡糖苷酶
一种或多种β-葡糖苷酶(有时称为“纤维二糖酶”)可在水解、发酵、SHF或HHF过程中存在。
术语“β-葡糖苷酶”意指β-D-葡糖苷葡糖水解酶(E.C.3.2.1.21)，其催化末端非还原性β-D-葡萄糖残基的水解，及β-D-葡萄糖的释放。就本发明而言，β-葡糖苷酶的活性根据由Venturi等，2002，J.BasicMicrobiol.42：55-66描述的基本方法确定，只是如本文所述使用不同的条件。一单位的β-葡糖苷酶活性定义为自4mM对-硝基苯基-β-D-吡喃葡糖苷作为底物在100mM柠檬酸钠，0.01％20中在50℃，pH5每分钟产生1.0微摩尔的对-硝基苯酚。
在一个优选实施方案中，所述β-葡糖苷酶为真菌来源的，如木霉属、曲霉属或青霉属的菌株。在一个优选实施方案中，所述β-葡糖苷酶源自里氏木霉，如由bgl1基因编码的β-葡糖苷酶(参见EP562003的图1)。在另一个优选实施方案中，所述β-葡糖苷酶源自米曲霉(根据WO02/095014在米曲霉中重组产生)，烟曲霉(Aspergillusfumigatus)(根据WO02/095014的实施例22在米曲霉中重组产生)，或黑曲霉(1981，J.Appl.3157-163)。
纤维素分解增强活性
术语“纤维素分解增强活性”在本文中定义为使具有纤维素分解活性的蛋白质对木素纤维素衍生材料的水解增强的生物活性。就本发明而言，通过测量与具有相等总蛋白加载量但没有纤维素分解增强活性(1-50mg纤维素分解蛋白/gPCS(经预处理的玉米秸)中的纤维素)的对照水解相比，在如下条件下由于纤维素分解蛋白对木素纤维素衍生材料(例如经预处理的含木素纤维素材料)的水解而发生的还原糖的增加或纤维二糖和葡萄糖总量的增加来测定纤维素分解增强活性：1-50mg总蛋白质/gPCS中的纤维素，其中总蛋白质的组成为(comprisedof)80-99.5％w/w纤维素分解蛋白/gPCS中的纤维素和0.5-20％w/w纤维素分解增强活性蛋白，在50℃进行1-7天。
具有纤维素分解增强活性的多肽通过降低达到相同程度水解所需的纤维素分解酶量来增强具有纤维素分解活性的蛋白质所催化的对木素纤维素来源材料的水解，所述纤维素分解酶量的降低优选至少0.1倍、更优选至少0.2倍、更优选至少0.3倍、更优选至少0.4倍、更优选至少0.5倍、更优选至少1倍、更优选至少3倍、更优选至少4倍、更优选至少5倍、更优选至少10倍、更优选至少20倍、更优选至少30倍、最优选至少50倍、甚至最优选至少100倍。
在一个优选的实施方案中，水解和/或发酵是在存在与具有增强活性的多肽组合的纤维素分解酶的情况下进行的。在一个优选的实施方案中，具有增强活性的多肽是家族GH61A多肽。WO2005/074647披露了来自土生梭孢霉的具有纤维素分解增强活性的分离的多肽及其多核苷酸。WO2005/074656披露了来自桔橙嗜热霉(Thermoascusaurantiacus)的具有纤维素分解增强活性的分离的多肽及其多核苷酸。美国申请公开号2007/0077630披露了来自里氏木霉的具有纤维素分解增强活性的分离的多肽及其多核苷酸。
半纤维素分解酶
根据本发明，可对所述经预处理的含木素纤维素材料进一步进行一种或多种半纤维素分解酶(例如，一种或多种半纤维素酶)处理。
半纤维素可由半纤维素酶和/或酸水解分解以释放其五和六碳糖组分。
在本发明的一个实施方案中，木素纤维素来源材料可用一种或多种半纤维素酶处理。
可使用任何适用于将半纤维素优选水解为木糖的半纤维素酶。优选的半纤维素酶包括木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶，葡糖醛酸糖苷酶、内切半乳聚糖酶、甘露聚糖酶，内切或外切阿拉伯糖酶、外切半乳聚糖酶以及它们两种以上的混合物。优选地，用于本发明的半纤维素酶为外作用的半纤维素酶，且更优选地，所述半纤维素酶为下述的外作用的半纤维素酶，其具有在pH小于7，优选3-7的酸性条件下水解半纤维素的能力。适用于本发明的半纤维素酶的实例包括VISCOZYMETM(可自NovozymesA/S，Denmark得到)。
在一个实施方案中，所述半纤维素酶为木聚糖酶。在一个实施方案中，所述木聚糖酶可优选为微生物来源的，如真菌来源的(例如，木霉属、亚灰树花菌属、腐质霉属、曲霉属、镰孢属(Fusarium))或来自细菌(例如，芽孢杆菌属)。在一个优选实施方案中，所述木聚糖酶源自丝状真菌，优选源自曲霉属，如棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)的菌株，或腐质霉属，优选疏棉状腐质霉(Humicolalanuginosa)的菌株。所述木聚糖酶可优选为内切-1，4-β-木聚糖酶，更优选GH10或GH11的内切-1，4-β-木聚糖酶。商业木聚糖酶的实例包括来自NovozymesA/S，Denmark的SHEARZYMETM和BIOFEEDWHEATTM。
半纤维素酶可以有效水解半纤维素的量添加，如，以约0.001到0.5wt.％的干固体(DS)，更优选约0.05到0.5wt.％的干固体的量添加。
木聚糖酶可以0.001-1.0g/kg干固体，优选以0.005-0.5g/kg干固体，且最优选0.05-0.10g/kg干固体的量添加。
其它酶
其它水解酶亦可在水解、发酵、SHF或HHF过程中存在。涵盖的酶包括α-淀粉酶；葡糖淀粉酶或其它糖源生成酶，如β-淀粉酶、产麦芽糖淀粉酶和/或α-葡糖苷酶；蛋白酶；或它们两种以上的混合物。
在本文中描述和要求保护的发明，其范围并不受在本文中公开的特定实施方案所限，因为这些实施方案的目的在于说明本发明的几个方面。应认为任何等同的实施方案处于本发明范围内。事实上，除了那些在本文中显示并描述的之外，由前述描述，多种对本发明的修饰对于本领域技术人员而言是显而易见的。应认为上述修饰亦落在所附权利要求的范围内。当出现冲突时，应以包括定义的本公开为准。
在本文中引用了多篇参考文件，其公开的内容通过提述以其整体并入。
方法和材料
使用羧甲基纤维素(CMC)作为底物测定纤维素酶活性
纤维素分解活性可以以内切葡聚糖酶单位(EGI)测定，用羧甲基纤维素(CMC)作为底物在pH6.0确定。
制备了底物溶液，在pH6.0的0.1M磷酸盐缓冲液中包含34.0g/lCMC(Hercules7LFD)。将待分析的酶试样溶解于相同的缓冲液中。将5ml底物溶液和0.15ml酶溶液混合，并转移至振动粘度计(vibrationviscosimeter)(例如，来自Sofraser，France的MIVI3000)中，在40℃恒温30分钟。
一个EGU定义为在这样的条件下将粘度降为一半时的酶量。酶试样的量应调整为在所述反应混合物中提供0.01-0.02EGU/ml。arch标准物定义为880EGU/g。
使用滤纸测定法(FPU法)测量纤维素酶活性
1.方法的来源
1.1本方法公开于Adney，B.和Baker，J.1996.LaboratoryAnalyticalProcedure，LAP-006，NationalRenewableEnergyLaboratory(NREL)的题为“MeasurementofCellulaseActivities”的文件。其基于供测定纤维素酶活性的IUPAC方法(Ghose，T.K.，MeasurementofCellulseActivities，Pure&Appl.Chem.59，pp.257-268，1987)。
2.步骤
2.1本方法如Adney和Baker，1996，见上所述进行，只是使用96孔板在显色后对吸光度值进行读数，如下所述：
2.2酶分析管：
2.2.1将一张卷起来的滤纸条(#1Whatman；1x6cm；50mg)添加至试管(13x100mm)底部。
2.2.2向试管添加1.0mL的0.05M柠檬酸钠缓冲液(pH4.80)。
2.2.3在循环水浴中将含有滤纸和缓冲液的试管在50℃(±0.1℃)温育5分钟。
2.2.4在温育后，将0.5mL柠檬酸盐缓冲液中的酶稀释液加入试管。酶稀释液设计为产生略微高于和低于2.0mg葡萄糖的目标值的值。
2.2.5通过轻柔涡旋振荡3秒将试管内容物混合。
2.2.6在涡旋振荡后，在循环水浴中将试管在50℃(±0.1℃)温育60分钟。
2.2.7在60分钟温育后立即将所述试管自水浴中移出，并向每个试管添加3.0mL的DNS试剂以终止反应。将试管涡旋振荡3秒混合。
2.3空白和对照
2.3.1通过将1.5mL的柠檬酸盐缓冲液加入试管来制备试剂空白。
2.3.2通过将卷起来的滤纸条置于试管底部并添加1.5mL的柠檬酸盐缓冲液来制备底物对照。
2.3.3通过将1.0mL的柠檬酸盐缓冲液与0.5mL的合适的酶稀释液混合来对每个酶稀释液制备酶对照。
2.3.4将试剂空白、底物对照和酶对照以与酶分析试管相同的方式，且与酶分析试管一起进行分析。
2.4葡萄糖标准物
2.4.1制备100mL葡萄糖储液(10.0mg/mL)，并冻结5mL的等分试样。在使用前，将等分试样融化并涡旋振荡以混合。
2.4.2如下所示在柠檬酸盐缓冲液中制备储液的稀释液：
Gl＝1.0mL储液+0.5mL缓冲液＝6.7mg/mL＝3.3mg/0.5mL
G2＝0.75mL储液+0.75mL缓冲液＝5.0mg/mL＝2.5mg/0.5mL
G3＝0.5mL储液+1.0mL缓冲液＝3.3mg/mL＝1.7mg/0.5mL
G4＝0.2mL储液+0.8mL缓冲液＝2.0mg/mL＝1.0mg/0.5mL
2.4.3通过将每个稀释液0.5mL添加至1.0mL的柠檬酸盐缓冲液中来制备葡萄糖标准物试管。
2.4.4葡萄糖标准物试管以与酶分析试管相同的方式，且与酶分析试管一起进行分析。
2.5显色
2.5.1在60分钟的温育和添加DNS后，将所有试管一起在水浴中煮沸5分钟。
2.5.2在煮沸后，将它们立即在冰/水浴中冷却。
2.5.3冷却后(whencool)，将试管简短地涡旋振荡，使得纸浆能够沉降。然后通过将来自试管的50微升添加到96孔板中的200微升ddH2O来稀释每个试管。将每个孔混匀，并在540nm处对吸光度进行读数。
2.6计算(实例在NREL文件中给出)
2.6.1通过将四个标准物(G1-G4)的葡萄糖浓度(mg/0.5mL)对A540作图来绘制葡萄糖标准曲线。使用线性回归(PrismSoftware)对此进行拟合，并使用该线的方程来确定在每个酶分析试管中产生的葡萄糖。
2.6.2绘制产生的葡萄糖(mg/0.5mL)对总酶稀释度(totalenzymedilution)的图，其中Y轴(酶稀释度)为对数标度。
2.6.3在产生恰高于和低于2.0mg葡萄糖的酶稀释度之间划线。由该线确定精确产生2.0mg葡萄糖的酶稀释度。
2.6.4如下计算滤纸单位/mL(FPU/mL)
FPU/mL＝0.37/产生2.0mg葡萄糖的酶稀释度
使用的酶：
纤维素酶制备物A：
纤维素分解组合物包含具有WO2005/074656中所公开的纤维素分解增强活性的多肽(GH61A)；米曲霉β-葡糖苷酶(以融合蛋白公开于US60/832,511)，和源自里氏木霉的纤维素分解酶制备物。纤维素酶制备物A公开于共同未决的美国申请号60/941,251，其以整体并入本文。
实施例
实施例1
使用蒸汽爆炸将玉米秸秆在200℃预处理5.4分钟。对未洗涤的PCS(经预处理的玉米秸秆)进行流加(fed-batch)水解工艺，其以批式水解(batchhydrolysis)起始，所述批式水解包括50g水和底物，起始干固体浓度为12.60％。纤维素酶组合物A以200EGU/g纤维素的浓度使用。所述PCS以三次附加的加载(loading)添加至终干固体浓度为30％。水解在50℃和pH5.0进行120小时。
将水解物在5000rpm离心20分钟，并收集上清。三种浓度的水解物，即5％干固体、15％干固体和30％干固体通过用水稀释来产生，并用3MNaOH调整至pH6.0。每个装有5ml水解物的小瓶以1g/L干酵母(酿酒酵母)接种，并在32℃发酵6日。每日取出10μl的试样用于非选择性的Luria-Bertani(LB)平板上的感染测试。所述平板在37℃温育过夜，并通过菌落计数确定污染水平。乙醇含量通过HPLC确定。结果示于表1和2。
所述结果显示，当发酵pH调整为高于6时，高的干固体水解物可显著减少污染的风险。
实施例2
使用蒸汽爆炸将玉米秸秆在200℃预处理5.4分钟。对未洗涤的PCS(经预处理的玉米秸秆)进行流加水解工艺，其以批式水解起始，所述批式水解包括50g水和底物，起始干固体浓度为12.6％。纤维素酶组合物A以200EGU/g纤维素的浓度使用。所述PCS以三次附加的加载添加至终干固体浓度为30％。水解在50℃和pH5.0进行120小时。
将水解物在5000rpm离心20分钟，并收集上清。两组四种浓度的水解物，即5％、15％、25％和30％干固体通过用水稀释来产生。一组保持在天然pH4.5，而另一组用3MNaOH调整至pH6.0。每个装有5ml水解物的小瓶用5/L干酵母(酿酒酵母)接种，并在32℃发酵9日。每日取出10μl的试样用于铺板在非选择性的Luria-Bertani(LB)平板上。所述平板在37℃温育过夜，并通过菌落计数确定污染水平。乙醇含量通过HPLC确定。结果示于表3到6。
当pH从4.5升至6时，低的干固体浓度(5％干固体和15％干固体)的污染水平增加。然而，在pH6的污染可通过增加干固体浓度(如至25％或30％干固体)来显著抑制。而且，通过将pH从4.5升至6.0，急剧改进了25％干固体和30％干固体的发酵。显然，在高的干固体水解物中抑制剂浓度的增加减少了细菌污染的水平。这允许在发酵过程中应用较高的pH来促进酵母生长。
实施例3
使用蒸汽爆炸将玉米秸秆在200℃预处理5.4分钟。对未洗涤的PCS进行流加水解工艺，其以批式水解起始，所述批式水解包括50g水和底物，起始干固体浓度为12.6％。纤维素酶组合物A以200EGU/g纤维素的浓度用于酶法水解。未洗涤的PCS以三次附加的加载添加至终干固体浓度为30％。水解在50℃和pH5.0进行120小时。
将水解物在5000rpm离心20分钟，并收集上清。三种浓度的水解物，即5％干固体、10％干固体、15％干固体、20％干固体、25％干固体和30％干固体通过用水稀释来产生，并用3MNaOH调整至pH4.5、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0。每个装有5ml水解物的小瓶用1g/L干酵母(酿酒酵母)接种，并在32℃发酵10日。每日取出10μl的试样用于铺板在非选择性的Luria-Bertani(LB)平板上。所述平板在37℃温育过夜，并通过菌落计数确定污染水平。乙醇含量通过二氧化碳重量减少(EtOH(g/L)＝(重量减少x1.05x1000)/(系统重量))来确定。结果示于表7-18。
所述结果显示，如果水解物的干固体为约20％或更高(如从17.5％到30％)，可显著减少在pH为约6或更高(例如，从5.5到9.0)时发酵过程中污染的风险。
在本文中描述和要求保护的发明并不局限于本文公开的特定方面的范围，因为这些方面的意欲作为本发明的几个方面的说明。任何等同的方面意欲在本发明的范围之内。事实上，从前述的说明中，除本文中显示和描述的那些之外，本发明的多种修改对本领域技术人员是显而易见的。这样的修改亦意欲落入所附权利要求的范围内。在冲突的情况下，以包括定义的本公开为准。
在本文中引用了多种参考文献，其公开通过提述以它们的整体并入。

Claims (28)

1.一种从含木素纤维素材料产生发酵产物的方法，包括下述步骤：
(a)(i)预处理含木素纤维素材料；
(ii)水解经预处理的含木素纤维素材料；
(b)使用酵母发酵在步骤(a)中获得的水解物；
其中，在步骤(b)中的发酵过程中，pH为5.5-9.0，并且在步骤(b)中的发酵过程中，干固体浓度为至少20％。
2.权利要求1的方法，进一步包括下述步骤：
(c)回收所述发酵产物。
3.一种产生发酵产物的方法，所述方法包括：
(a)提供经预处理的含木素纤维素材料的水解物，
(b)将所述水解物与酵母相接触产生发酵产物，
其中，在步骤(b)中的发酵过程中，pH为5.5-9.0，并且在步骤(b)中的发酵过程中，干固体浓度为至少20％。
4.权利要求3的方法，进一步包括下述步骤：
(c)回收所述发酵产物。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中在步骤(b)中的发酵过程中的pH在5.7到8.0的范围。
6.权利要求5的方法，其中在步骤(b)中的发酵过程中的pH在5.8到7.0的范围。
7.权利要求6的方法，其中在步骤(b)中的发酵过程中的pH在pH5.9到6.5的范围。
8.权利要求7的方法，其中在步骤(b)中的发酵过程中的pH在pH6。
9.权利要求1-4中任一项的方法，其中在发酵过程中所述干固体浓度在20％到35％的范围。
10.权利要求9中的方法，其中在发酵过程中所述干固体浓度为20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％，30％、31％、32％、33％或34％。
11.权利要求1-4中任一项的方法，其中步骤(a)中的水解物通过酸水解含木素纤维素材料产生。
12.权利要求1-4中任一项的方法，其中步骤(a)中的水解物通过酶法水解含木素纤维素材料产生。
13.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述含木素纤维素材料源自玉米。
14.权利要求13的方法，其中所述含木素纤维素材料为玉米秸秆和/或玉米纤维。
15.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述水解为酶法水解，其使用一种或多种选自下组的水解酶来进行：内切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、纤维二糖水解酶、纤维二糖酶、木聚糖酶、α-淀粉酶、α-葡糖苷酶、葡糖淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶或其混合物。
16.权利要求15的方法，其中酶法水解在25-70℃的温度进行。
17.权利要求16的方法，其中酶法水解在40-60℃的温度进行。
18.权利要求17的方法，其中酶法水解在50℃的温度进行。
19.权利要求1-4中任一项的方法，其中水解在pH3-8的pH进行。
20.权利要求19的方法，其中水解在pH4-6的pH进行。
21.权利要求20的方法，其中水解是在pH5的pH进行。
22.权利要求1-4中任一项的方法，其中水解进行12-96小时。
23.权利要求1-4中任一项的方法，其中发酵在25至40℃进行。
24.权利要求23的方法，其中发酵在30℃至38℃进行。
25.权利要求24的方法，其中发酵在32℃进行。
26.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述发酵进行8-96小时。
27.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述发酵产物是醇。
28.权利要求27的方法，其中所述发酵产物为乙醇。
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