CN101796247A - 脱毒和再循环在含木素纤维素材料的预处理中使用的洗涤溶液 - Google Patents

脱毒和再循环在含木素纤维素材料的预处理中使用的洗涤溶液 Download PDF

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Abstract

本发明涉及脱毒经预处理的含木素纤维素材料的方法，包括在洗涤溶液中洗涤经预处理的含木素纤维素材料，并在再循环使用过的洗涤溶液之前处理所述使用过的洗涤溶液以去除酶抑制剂和/或发酵生物的抑制剂。

Description

脱毒和再循环在含木素纤维素材料的预处理中使用的洗涤溶液
技术领域
本发明涉及包括脱毒和再循环在含木素纤维素材料的预处理中使用的洗涤溶液的方法。本发明还涉及使用发酵生物从含木素纤维素材料产生发酵产物的方法，包括本发明的脱毒方法。
发明背景
由于化石燃料的有限储量和对温室气体排放的担忧，对于使用可再生能源的关注越来越多。从含木素纤维素材料产生发酵产物是本领域已知的并且通常包括预处理、水解和发酵含木素纤维素材料。预处理导致从含木素纤维素材料释放降解产物，这些降解产物可能不可逆地结合并抑制在水解和发酵过程中加入的酶。这些化合物对于发酵生物的代谢也可能是有毒的，并且抑制发酵生物的性能。
已经提出通过蒸汽汽提来脱毒，但这是一个繁琐且昂贵的额外工序。还提出在水解之前洗涤经预处理的含木素纤维素材料。然而，抑制剂通常具有低溶解度，并且由于抑制剂的积累，洗涤水的再循环只能以非常有限的程度进行。所以洗涤需要大量的水。
因此，需要提供用于脱毒经预处理的含木素纤维素材料的方法以获得适于水解和发酵的底物。
发明内容
本发明涉及通过洗涤、再生并再循环使用过的洗涤溶液来脱毒经预处理的含木素纤维素材料的方法。所述使用过的洗涤溶液通过去除酶抑制剂和/或发酵生物的抑制剂而再生。本发明还涉及从含木素纤维素材料产生水解物和发酵产物的方法，该方法包括本发明的脱毒方法。
在第一个方面，本发明涉及用于产生经预处理和洗涤的含木素纤维素材料的方法，该方法包括步骤：a)对含木素纤维素材料进行预处理，b)在洗涤溶液中洗涤经预处理的含木素纤维素材料，c)分离掉使用过的洗涤溶液以获得经预处理和洗涤的含木素纤维素材料，连续重复步骤(a)到(c)，其中对步骤(b)中的使用过的洗涤溶液进行处理以在再循环至步骤(b)之前去除酶抑制剂和/或发酵生物的抑制剂。
在第二个方面，本发明涉及用于将含木素纤维素材料转化为包含单糖和寡糖的水解物的方法，该方法包括步骤：a)对含木素纤维素材料进行预处理，b)在洗涤溶液中洗涤经预处理的含木素纤维素材料，c)分离掉使用过的洗涤溶液以获得经预处理和洗涤的含木素纤维素材料，d)对经预处理和洗涤的含木素纤维素材料进行处理，所述处理导致纤维素和/或半纤维素的至少部分水解，以获得包含可发酵糖的水解物，并且连续重复步骤(a)到(d)，其中对步骤(b)中的使用过的洗涤溶液进行处理以在再循环至(b)之前去除酶抑制剂和/或发酵生物的抑制剂。
在第三个方面，本发明涉及用于将含木素纤维素材料转化为发酵产物的方法，该方法包括步骤：a)对含木素纤维素材料进行预处理，b)在洗涤溶液中洗涤经预处理的含木素纤维素材料，c)分离掉使用过的洗涤溶液以获得经预处理和洗涤的含木素纤维素材料，d)对经预处理和洗涤的含木素纤维素材料进行处理，所述处理导致纤维素和/或半纤维素的至少部分水解，以获得包含可发酵糖的水解物，e)将步骤(d)中的水解物与发酵生物接触以产生发酵产物，其中对步骤(b)中的使用过的洗涤溶液进行处理以在再循环至(b)之前去除酶抑制剂和/或发酵生物的抑制剂。
这些方法的优点包括：从预处理产生的可溶性糖(例如木糖、寡糖)能够在洗涤溶液中浓缩；提高的水解效率；增加酵母生长和/或改善的水解物发酵；缩短发酵中的迟滞期(lag phase)；以及显著降低洗涤溶液消耗。
发明详述
在第一个方面的一个实施方案中，本发明涉及用于产生经预处理和洗涤的含木素纤维素材料的方法，该方法包括步骤：a)对含木素纤维素材料进行预处理，b)在洗涤溶液中洗涤经预处理的含木素纤维素材料，c)分离掉使用过的洗涤溶液以获得经预处理和洗涤的含木素纤维素材料，重复步骤(a)到(c)，其中对步骤(b)中的使用过的洗涤溶液进行处理以在再循环至步骤(b)之前去除酶抑制剂和/或发酵生物的抑制剂。
在第二个方面的一个实施方案中，本发明涉及用于将含木素纤维素材料转化为包含单糖和寡糖的水解物的方法，该方法包括步骤：a)对含木素纤维素材料进行预处理，b)在洗涤溶液中洗涤经预处理的含木素纤维素材料，c)分离掉使用过的洗涤溶液以获得经预处理和洗涤的含木素纤维素材料，d)对经预处理和洗涤的含木素纤维素材料进行处理，所述处理导致纤维素和/或半纤维素的至少部分水解，以获得包含可发酵糖的水解物，并且重复步骤(a)到(d)，其中对步骤(b)中的使用过的洗涤溶液进行处理以在再循环至(b)之前去除酶抑制剂和/或发酵生物的抑制剂。
含木素纤维素材料
术语“含木素纤维素材料”用于本文是指主要由纤维素、半纤维素和木质素组成的材料。含木素纤维素材料常常被称作“生物质”。
木素纤维素的结构不是酶水解直接可及的。因此，必需对木素纤维素进行预处理，例如，在适当的压力、湿度和温度条件下通过酸水解进行，从而打破木质素密封(lignin seal)并破坏纤维素的晶态结构。这导致对半纤维素级分的溶解和糖化。然后可以将纤维素级分水解，例如通过纤维素酶进行酶水解，从而将糖类聚合物转化成单糖和寡糖，所述单糖和寡糖可以被发酵成期望的发酵产物，如乙醇。任选地回收所述发酵产物，例如通过蒸馏进行。
任何含木素纤维素材料都是本发明所预期的。所述含木素纤维素材料可以是含有木素纤维素的任何材料。在一个优选的实施方案中，含木素纤维素材料含有至少30wt-％，优选至少50wt.-％，更优选至少70wt-％，甚至更优选至少90wt-％木素纤维素。应该理解的是所述含木素纤维素材料也可包含其它组分，如纤维素材料，包括纤维素和半纤维素，并且也可以包含其它组分，如蛋白质材料(proteinaceous material)、淀粉、糖(如可发酵的糖和/或不可发酵的糖)。
含木素纤维素材料通常存在于，例如，植物的茎、叶、外皮(hull)、外壳(husk)和穗轴(cob)中，或树的叶、枝和木材中。含木素纤维素材料也可以是，但不限于，草本材料、农业残余物、林业残余物、市政固体废物、废纸以及纸浆和造纸工厂残余物(pulp and paper mill residue)。在本文中的理解是含木素纤维素材料可为在混合基质中含有木质素、纤维素和半纤维素的植物细胞壁材料的形式。
在一个优选的实施方案中，含木素纤维素材料包含木屑/木花(woodchip)、甘蔗渣(bagasse)、造纸或纸浆加工废物。
其它实例包括玉米秸秆、硬木(如杨木和桦木)、软木(如松木)、柳枝稷(switch grass)、谷类的茎秆和/或谷壳(如来自稻、小麦、大麦、黑麦等的秆)、市政固体废物(MSW)、工业有机废物、办公室用纸、或其混合物。
在一个优选的实施方案中，含纤维素材料是玉米秸秆。在另一个优选的方面，含纤维素材料是玉米纤维。
预处理
含木素纤维素材料可以以任何合适的方法预处理。预处理在水解和/或发酵之前进行。在一个优选的实施方案中，在预处理之后将经预处理的材料水解，优选以酶进行。预处理的目的是分离和/或释放纤维素、半纤维素和/或木质素，并且这种方法使水解速率改善。预处理方法如湿氧化(wet oxidation)和碱性处理靶向木质素，而稀酸和自水解(auto-hydrolysis)靶向半纤维素。蒸汽爆炸是靶向纤维素的预处理的一个例子。
根据本发明预处理步骤(a)可以是使用本领域熟知的技术的常规预处理步骤。在一个优选的实施方案中，预处理发生在含水浆料(aqueous slurry)中。含木素纤维素材料在预处理过程中可以以10-80wt.-％，优选20-70wt-％，特别是30-60wt.-％，如大约50wt-％的量存在。
含木素纤维素材料可以根据本发明在水解和/或发酵之前以化学、机械和/或生物方法进行预处理。机械处理(常常称作物理处理)可以单独使用或与后续或同时的水解(特别是酶水解)组合使用。
优选地，所述化学、机械和/或生物预处理在水解和/或发酵之前进行。或者，所述化学、机械和/或生物预处理可以与水解同时进行，如与一种或多种纤维素酶或其它下文所述酶活性的加入同时进行，以释放例如可发酵的糖，如葡萄糖和/或麦芽糖。
术语“化学处理”是指任何促进纤维素、半纤维素和/或木质素的分离和/或释放的化学预处理。合适的化学预处理的实例包括用例如稀酸、石灰、碱、有机溶剂、氨、二氧化硫、二氧化碳进行的处理。另外，湿氧化和pH受控的水热解(hydrothermolysis)也是所考虑的化学预处理。
在一个优选的实施方案中，化学预处理是酸处理，更优选地，是连续的稀酸和/或弱酸(mild acid)处理，如用硫酸，或另一有机酸如乙酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸、氯化氢或其混合物进行的处理。也可以使用其它酸。弱酸处理是指处理pH处于1-5，优选pH 1-3。在一个具体的实施方案中，酸的浓度为0.1-2.0wt.％的酸，优选硫酸。可以将酸与含木素纤维素材料接触，并且可以将所述混合物在160-220℃，如165-195℃的温度保持一段时间，例如，1-60分钟，如2-30分钟或3-12分钟。可以应用强酸如硫酸的加入来去除半纤维素。这使纤维素的可消化性增强。
也可考虑其它技术。纤维素溶剂处理已显示其将大约90％的纤维素转化成葡萄糖。也显示了当木素纤维素结构被破坏时酶水解能够大幅增强。碱、H2O2、臭氧、有机溶剂(organosolv)(使用含水醇(aqueous alcohol)中的路易斯酸、FeCl3、(Al)2SO4)、甘油、二噁烷(dioxane)、酚或乙二醇属于已知破坏纤维素结构并促进水解的溶剂(Mosier等，Bioresource Technology 96(2005)，673-686页)。
使用碱例如NaOH、Na2CO3和/或氨等的碱性化学预处理也是本发明所预期的。使用氨的预处理方法在例如WO 2006110891、WO 2006110899、WO2006110900和WO 2006/110901中描述(将它们通过提述并入本文)。
湿氧化技术涉及氧化剂的使用，所述氧化剂如：基于亚硫酸盐的氧化剂等。溶剂预处理的实例包括使用DMSO(二甲亚砜)等的处理。化学预处理通常进行1-60分钟，如5-30分钟，但也可以进行更短或更长的时间，其取决于要预处理的材料。
合适预处理方法的其它实例由Schell等，(2003)Appl.Biochem andBiotechn.Vol.105-108，p.69-85，Mosier等，Bioresource Technology 96(2005)673-686，Ahring等，于WO2006032282和WO200160752中，Foody等，于WO2006034590中，和Ballesteros等，于美国公开20020164730号中描述，将这些参考文献通过提述全部并入本文。
术语“机械预处理”是指促进纤维素、半纤维素和/或木质素从木素纤维素材料分离和/或释放的任何机械(或物理)处理。例如，机械预处理包括多种类型的磨制、照射、汽蒸/蒸汽爆炸和其它水热处理。
机械预处理包括粉碎(机械减小大小)。粉碎包括干磨、湿磨和振动球磨(vibratory ball milling)。机械预处理可以包括高压和/或高温(蒸汽爆炸)。在本发明的一个实施方案中，高压是指范围在300-600psi，优选400-500psi，如大约450psi的压力。在本发明的一个实施方案中，高温是指范围在大约100-300℃，优选大约140-235℃的温度。在一个优选的实施方案中，机械预处理是一种分批过程的蒸汽枪水解仪系统(a batch-process，steam gun hydrolyzersystem)，其使用如上限定的高压和高温。为此可使用Sunds水解仪(可从SundsDefibrator AB(Sweden)获得)。
在一个优选的实施方案中，进行化学和机械预处理两者。例如，预处理步骤可以包括稀酸或弱酸处理以及高温和/或高压处理。化学和机械预处理可以根据需要顺次进行或同时进行。
因此，在一个优选的实施方案中，对所述含木素纤维素材料进行化学和机械预处理两者以促进纤维素、半纤维素和/或木质素的分离和/或释放。
在一个优选的实施方案中，机械预处理在蒸汽爆炸预处理之前进行。
在一个优选的实施方案中，预处理作为稀酸和/或弱酸蒸汽爆炸步骤进行。在另一个优选的实施方案中，预处理作为氨纤维爆炸步骤(或AFEX预处理步骤)进行。
如用于本发明中，术语“生物预处理”是指促进纤维素、半纤维素和/或木质素从含木素纤维素材料分离和/或释放的任何生物预处理。生物预处理技术可以包括应用溶解木质素的微生物(参见，例如，Hsu，T.-A.，1996，Pretreatmentof biomass，于Handbook on Bioethanol：Production and Utilization，Wyman，C.E.编，Taylor & Francis，Washington，DC，179-212；Ghosh，P.和Singh，A.，1993，Physicochemical and biological treatments for enzymatic/microbial conversion oflignocellulosic biomass，Adv.Appl.Microbiol.39：295-333；McMillan，J.D.，1994，Pretreating lignocellulosic biomass：a review，in Enzymatic Conversion of Biomassfor Fuels Production，Himmel，M.E.，Baker，J.O.和Overend，R.P.编，ACSSymposium Series 566，American Chemical Society，Washington，DC，第15章；Gong，C.S.，Cao，N.J.，Du，J.和Tsao，G.T.，1999，Ethanol production fromrenewable resources，于Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology，Scheper，T.编，Springer-Verlag Berlin Heidelberg，Germany，65：207-241；Olsson，L.和Hahn-Hagerdal，B.，1996，Fermentation of lignocellulosic hydrolysates forethanol production，Enz.Microb.Tech.18：312-331；和Vallander，L.和Eriksson，K.-E.L.，1990，Production of ethanol from lignocellulosic materials：State of the art，Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.42：63-95)。
脱毒经预处理的含木素纤维素材料的方法
当预处理含木素纤维素材料时，产生对于酶和发酵生物有毒和/或有抑制性的降解产物。这些化合物严重降低水解和发酵二者的速率。
为了去除酶和/或发酵生物的抑制剂而对经预处理的含木素纤维素材料进行的脱毒将改善酶水解和/或改善发酵过程中发酵生物的性能。换言之，依据本发明脱毒致使“含木素纤维素材料到发酵产物”的过程时间更短。
所述抑制剂是木素纤维素降解产物，包括木质素降解产物、纤维素降解产物和半纤维素降解产物。木质素降解产物本质上可以是含酚的(phenolic)。半纤维素降解产物包括来自糖(如己糖和/或戊糖)的呋喃类，包括木糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖(rhamanose)和阿拉伯糖。半纤维素的例子包括木聚糖、半乳葡甘露聚糖(galactoglucomannan)、阿拉伯半乳聚糖(arabinogalactan)、阿拉伯葡糖醛酸木聚糖(arabinoglucuronoxylan)、葡糖醛酸木聚糖以及它们的衍生物和组合。抑制性化合物的例子，即，经预处理的木素纤维素降解产物的例子，包括4-OH苯甲醇、4-OH苯甲醛、4-OH苯甲酸、三甲基苯甲醛、2-糠酸(2-furoicacid)、香豆酸、阿魏酸、苯酚、愈创木酚(guaiacol)、藜芦醚(veratrole)、焦酚(pyrogallollol)、焦桔酚单甲醚(pyrogallol mono methyl ether)、香草醇、香草醛、异香草醛、香草酸、异香草酸、高香草酸、藜芦醇、藜芦醛、藜芦酸、2-O-甲基没食子酸、丁香醇、丁香醛、丁香酸、三甲基没食子酸、高儿茶酚、乙基香草醛、甲氧甲酚、对甲基茴香醚、茴香醛、茴香酸、糠醛、羟甲基糠醛、5-羟甲基糠醛、甲酸、乙酸、乙酰丙酸、桂皮酸、松柏醛、异丁香油酚、氢醌、丁子香酚或它们的组合。
根据本发明的第一、第二和第三个方面，通过用洗涤溶液洗涤将对酶和/或发酵生物有毒和/或有抑制性的化合物从经预处理的含木素纤维素材料去除。洗涤溶液优选是洗涤水溶液。洗涤溶液可以是基本上纯的水溶液，或是含有大量添加剂的水，所述添加剂例如诸如洗涤剂和/或有机溶剂，以改善对对酶和/或发酵生物有毒和/或有抑制性的化合物的提取和/或溶解度。合适的有机溶剂是乙醇或甲醇。
洗涤溶液优选在5-70℃的温度，优选10-50℃，并且更优选15-30℃，例如，在20-25℃的温度应用。
当将使用过的洗涤溶液与经洗涤的PCS分离时，洗涤步骤结束。使用过的洗涤溶液的分离可以通过任何合适的方法来实现，包括但不限于排干、过滤、离心和挤压。
根据本发明的第一、第二和第三方面，对使用过的洗涤溶液进行处理以在再循环至洗涤步骤之前去除酶抑制剂和/或发酵生物的抑制剂。所述处理使使用过的洗涤溶液再生从而产生可用的洗涤溶液。在一个优选的实施方案中，通过将使用过的洗涤溶液与树脂或树脂的组合接触来对其进行处理。树脂的组合可以作为两种或更多种树脂的混合物应用，和/或其可以是先后应用的两种或更多种树脂。树脂可以是具有极性、弱极性或非极性官能团的树脂。树脂可以是强酸性阳离子交换剂、弱酸性阳离子交换剂、强碱性阴离子交换剂或弱碱性阴离子交换剂。优选的官能团包括-SO3、-COOH、-N+(CH3)3、-N(CH3)2和-NH2。树脂可以是炭树脂(charcoal resin)。合适的树脂可以选自下组：树脂D380、H103、AB-8、D101、NKA、NKA9、D301T、D296R和D401，它们可以从日本NanKai Chemical Industry获得。尤其优选的树脂是D380和H103。在一个优选的实施方案中，通过将使用过的洗涤溶液与活性炭接触来对其进行处理。
在一个优选的实施方案中，使所述使用过的洗涤溶液通过包含树脂和/或活性炭的柱子。
水解
在发酵之前和/或在发酵的同时，可以对所述经预处理和洗涤的含木素纤维素材料进行水解以将纤维素和半纤维素分解成糖和/或寡糖。
水解过程中的干固体含量可以在5-50wt-％，优选10-40wt-％，优选20-30wt-％的范围内。在一个优选的实施方案中，水解可以作为补料分批过程进行，在该过程中将经预处理的含木素纤维素材料(底物)逐渐加料至例如含酶水解溶液中。可以将经预处理的含木素纤维素材料在一个或多个不同的批次中，作为一个或多个不同的连续流，或作为一个或多个不同批次和一个或多个不同连续流的组合供应给含酶水解溶液。
在一个优选的实施方案中，水解用酶进行。根据本发明，可以通过一种或多种水解酶(根据酶命名法的EC 3类)，优选一种或多种选自下组的糖酶来水解经预处理的含木素纤维素材料：纤维素酶，半纤维素酶，淀粉酶，如α-淀粉酶，糖生成酶，如葡糖淀粉酶，酯酶，如脂肪酶，或蛋白酶。α-淀粉酶、葡糖淀粉酶和/或类似的酶可以存在于水解和/或发酵过程中，因为含木素纤维素材料可能包括一些淀粉。
用于水解的酶能够将糖类聚合物直接或间接转化为可发酵的糖，所述可发酵的糖能够被发酵成期望的发酵产物，如乙醇。
在一个优选的实施方案中，所述糖酶具有纤维素酶酶活性。合适的糖酶在下文的“酶”部分中描述。
可以通过半纤维素酶和/或酸水解将半纤维素聚合物分解以释放其五碳糖和六碳糖组分。六碳糖(己糖)，如葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和甘露糖能够通过合适的发酵生物(包括酵母)容易地发酵成例如乙醇、丙酮、丁醇、甘油、柠檬酸、延胡索酸等。优选用于乙醇发酵的是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)种的酵母，优选对高水平乙醇有抗性的菌株，所述高水平乙醇即高达例如约10、12或15vol.％的乙醇或更多的，如20vol.％的乙醇。
在一个优选的实施方案中，使用半纤维素酶，优选木聚糖酶、酯酶、纤维二糖酶或它们的组合来水解经预处理的含木素纤维素材料。
水解也可以在存在半纤维素酶和/或纤维素酶的组合，和任选地一种或多种下文“酶”部分中提及的其它酶活性的条件下进行。
酶处理可以在合适的含水环境中在本领域技术人员能够容易确定的条件下进行。在一个优选的实施方案中，水解在对于所讨论的酶合适的，优选最佳的条件下进行。合适的过程时间、温度和pH条件能够由本发明所属领域技术人员容易地确定。优选地，水解在25℃-70℃，优选40℃-60℃，特别是大约50℃的温度进行。所述过程优选在pH 3-8，优选pH 4-6，特别是大约pH 5进行。
优选地，水解进行12-144小时，优选16-120小时，更优选24-96小时，如32-48小时。
根据本发明，步骤(c)中的水解和步骤(d)中的发酵可以同时进行(SHHF方法)或顺序进行(SHF方法)。
发酵
根据本发明，将经预处理(和水解)的含木素纤维素材料通过至少一种发酵生物发酵，所述发酵生物能够将可发酵的糖(如葡萄糖、木糖、甘露糖和半乳糖)直接或间接发酵成期望的发酵产物。
优选将发酵进行8-96小时，优选12-72小时，更优选24-48小时。
在一个实施方案中，发酵在20-40℃，优选26-34℃，特别是大约32℃的温度进行。在一个实施方案中，pH为pH 3-6，优选大约pH 4-5。
根据本发明期望的是同时水解和发酵(SHF)。在一个实施方案中，水解不存在单独的保持阶段(holding stage)，意思是水解酶和发酵生物是一起加入的。当发酵(例如，使用酵母属(Saccharomyces)酵母的乙醇发酵)与水解同时进行时，温度优选为26℃-35℃，更优选30℃-34℃，如大约32℃。根据本发明可以应用包含温度不同的至少两个保持阶段的温度程序。
在洗涤经预处理的含木素纤维素材料的过程中，溶解的糖可能在再循环的洗涤水溶液中积累。可以将这些糖分离出并用合适的发酵生物发酵。由于溶解的糖将包含来自半纤维素降解的C5糖，如木糖，优选的发酵生物能够将C5糖转化成期望的发酵产物。
本发明的方法可以作为分批方法、补料分批方法或作为连续方法进行。优选地，将发酵步骤作为连续发酵进行。
回收
在发酵之后，可以将发酵产物从发酵液分离。可以蒸馏发酵液以提取发酵产物，或者可以通过微滤或膜过滤技术从发酵液提取发酵产物。或者可以通过汽提回收发酵产物。回收方法是本领域熟知的。
发酵产物
本发明的方法可以用于产生任何发酵产物。特别期望的发酵产物包括醇(例如，乙醇、甲醇、丁醇)；有机酸(例如，柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸)；酮(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氨酸)；气体(例如H2和CO2)；抗生素(例如，青霉素和四环素)；酶；维生素(例如，核黄素、B12、β-胡萝卜素)；和激素。
同样期望的产物包括可消费醇工业产物，例如，啤酒和葡萄酒；乳制品工业产物，例如，发酵乳制品；皮革工业产物和烟草工业产物。在一个优选的实施方案中，发酵产物是醇，特别是乙醇。根据本发明获得的发酵产物(如乙醇)优选可为燃料醇/乙醇。然而，在乙醇的情况下，它也可用作饮用乙醇。
发酵生物
术语“发酵生物”是指任何适合用于产生期望的发酵产物的生物，包括细菌和真菌生物。根据本发明特别合适的发酵生物能够将糖(如葡萄糖)直接或间接发酵(即，转化)成期望的发酵产物。同样合适的是能够将C5糖(如木糖)转化成期望的发酵产物的发酵生物。发酵生物的实例包括真菌生物，特别是酵母。优选的酵母包括酵母属菌种的菌株，特别是酿酒酵母或葡萄汁酵母(Saccharomycesuvarum)的菌株；毕赤酵母属(Pichia)，优选树干毕赤酵母(Pichia stipitis)的菌株，如树干毕赤酵母CBS 5773；假丝酵母属(Candida)的菌株，特别是产朊假丝酵母(Candida utilis)、迪丹斯假丝酵母(Candida diddensii)或博伊丁假丝酵母(Candidaboidinii)的菌株。其它期望的酵母包括发酵单孢菌属(Zymomonas)的菌株；汉逊酵母属(Hansenula)，特别是异常汉逊酵母(H.anomala)的菌株；克鲁维酵母属(Klyveromyces)，特别是脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)的菌株；和裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)，特别是粟酒裂殖酵母(S.pombe)的菌株。
商业上可以获得的酵母包括，例如，ETHANOL REDTM酵母(可从Fermentis/Lesaffre，USA获得)，FALI(可从Fleischmann’s Yeast，USA获得)，SUPERSTART和THERMOSACCTM鲜酵母(可从Ethanol Technology，WI，USA获得)，BIOFERM AFT和XR(可从NABC-North American BioproductsCorporation，GA，USA获得)，GERT STRAND(可从Gert Strand AB，Sweden获得)，和FERMIOL(可从DSM Specialties获得)。安琪酵母(可从中国(赤峰)安琪酵母有限公司)。
酶
尽管在关于本发明方法的上下文中没有具体提到，但是应理解酶(以及其它化合物)是以“有效量”使用的。
纤维素酶
术语“纤维素酶”如用于本文应理解为包含纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)，例如，纤维二糖水解酶I和纤维二糖水解酶II，以及内切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)和β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.21)。
为了效率，对纤维素和半纤维素的消化需要几种类型的酶共同作用。至少三类酶是将纤维素转化为可发酵的糖所必需的：内切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)，其随机切割纤维素链；纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)，其从纤维素链末端切割纤维二糖单元；和β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.21)，其将纤维二糖和可溶性纤维糊精转化成葡萄糖。在纤维素生物降解中涉及的这三类酶中，纤维二糖水解酶是降解天然结晶纤维素的关键酶。术语“纤维二糖水解酶I”在本文定义为纤维素1，4-β-纤维二糖酶(也称做外切葡聚糖酶、外切纤维二糖水解酶或1，4-β-纤维二糖水解酶)活性，如酶类别EC 3.2.1.91中所定义，其通过从链的非还原端释放纤维二糖来催化纤维素和纤维四糖中1，4-β-D-葡糖苷键的水解。术语“纤维二糖水解酶II活性”的定义是相同的，只是纤维二糖水解酶II从链的还原端攻击。
内切葡聚糖酶(EC No.3.2.1.4)催化纤维素、纤维素衍生物(如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣淀粉、混合型β-1，3葡聚糖如谷类β-D-葡聚糖或木葡聚糖中的β-1，4连接和其它含纤维素成分的植物材料中的1，4-β-D-糖苷键的内水解。公认名称是内切-1，4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(endo-1，4-β-D-glucan4-glucano hydrolase)，但是在本说明书中使用缩写的术语内切葡聚糖酶。
纤维素酶可以包含糖结合模块(CBM)，其增强酶与含纤维素纤维的结合并增加酶的催化活性部分的效力。将CBM定义为谨慎折叠的糖活性酶内具有糖结合活性的连续氨基酸序列。更多关于CBM信息参见CAZy互联网服务器(见上文)或Tomme等，(1995)于Enzymatic Degradation of Insoluble Polysaccharides(Saddler，J.N.&Penner，M.编)中，Cellulose-binding domains：classification andproperties.142-163页，American Chemical Society，Washington。
在一个优选的实施方案中，纤维素酶活性可以源自真菌来源，如木霉属(Trichoderma)菌株，优选里氏木霉(Trichoderma reesei)菌株；腐质霉属(Humicola)菌株，如特异腐质霉(Humicola insolens)菌株；或金孢子属(Chrysosporium)菌株，优选Chrysosporium lucknowense菌株。
在一个优选的实施方案中，纤维素酶可以是一种如共同待审的美国申请60/94l,251号中所限定的制备物，将该申请通过提述并入本文。在一个优选的实施方案中，包含具有增强纤维素分解的活性的多肽(GH61A)的纤维素酶制备物，优选WO2005074656中公开的制备物。纤维素酶制备物还可以包含β-葡糖苷酶，如US 60/832,511中公开的融合蛋白。在一个实施方案中，纤维素酶制备物还包含CBH II，优选土生梭孢霉纤维二糖水解酶II CEL 6A。在一个实施方案中，纤维素酶制备物还包含一种纤维素酶制备物，优选源自里氏木霉的纤维素酶制备物。在一个优选的实施方案中，纤维素酶制备物是共同待审的美国申请60/941,251号中公开的实施例1中的纤维素酶制备物A。
在一个实施方案中，纤维素酶是商业上可以获得的产品
Figure GPA00001042906500121
1.5L或CELLUZYMETM(Novozymes A/S，Denmark)。
可以加入纤维素酶用于水解经预处理的含木素纤维素材料。纤维素酶可以以0.1-100FPU每克干固体(DS)，优选0.5-50FPU每克DS，特别是1-20FPU每克DS范围内的剂量加入。
半纤维素酶
半纤维素可以通过半纤维素酶和/或酸水解分解以释放其五碳糖和六碳糖成分。在本发明的一个实施方案中，可以用一种或多种半纤维素酶处理木素纤维素衍生材料。
可以使用任何适合用于水解半纤维素的半纤维素酶。优选的半纤维素酶包括木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、葡糖醛酸糖苷酶、内切半乳聚糖酶、甘露聚糖酶、内切或外切阿拉伯糖酶、外切半乳聚糖酶、和它们中两种或更多种的混合物。优选地，用于本发明的半纤维素酶是外切作用的半纤维素酶，并且更优选地，所述半纤维素酶是能够在pH 7以下，优选pH 3-7的酸性条件下水解半纤维素的、外切作用的半纤维素酶。适合用于本发明的半纤维素酶的实例包括VISCOZYMETM(可从Novozymes A/S，Denmark获得)。
阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)催化α-L-阿拉伯糖苷中末端非还原性α-L-阿拉伯呋喃糖苷残基的水解。
半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)，阿拉伯半乳聚糖内切-1，4-β-半乳糖苷酶，催化阿拉伯半乳聚糖中1，4-D-半乳糖苷键的内水解。
果胶酶(EC 3.2.1.15)催化果胶酸(或其盐或酯)和其他聚半乳糖醛酸中1，4-α-D-半乳糖苷醛酸键(1，4-α-D-galactosiduronic linkage)的水解。
木葡聚糖酶(xyloglucanase)催化木葡聚糖(xyloglucan)的水解。
半纤维素酶可以以有效水解半纤维素的量加入，例如，以干固体(DS)的约0.001-0.5wt.-％，更优选DS的约0.05-0.5wt.-％的量加入。
α-淀粉酶
根据本发明可以使用α-淀粉酶。在一个优选的实施方案中，所述α-淀粉酶是酸性α-淀粉酶，例如，真菌酸性α-淀粉酶或细菌酸性α-淀粉酶。术语“酸性α-淀粉酶”是指以有效量加入的α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)在3-7，优选3.5-6，或更优选4-5范围内的pH具有最佳活性。
细菌α-淀粉酶
根据本发明，细菌α-淀粉酶优选源自芽孢杆菌属(genus Bacillus)。
在一个优选的实施方案中所述芽孢杆菌α-淀粉酶源自地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)或嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)的菌株，但是也可以源自其它芽孢杆菌属的菌种(Bacillus sp.)。期望的α-淀粉酶的具体实例包括WO9919467中SEQ ID NO：4中所示的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶，WO9919467中SEQ ID NO：5中所示的解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶和WO9919467中SEQ ID NO：3中所示的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(将全部这些序列通过提述并入本文)。在本发明的一个实施方案中所述α-淀粉酶可以是分别与WO9919467中的SEQ ID NOS：1、2或3中所示序列中的任一具有至少60％，优选至少70％，更优选至少80％，甚至更优选至少90％，如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性程度的酶。
芽孢杆菌属α-淀粉酶也可以是变体和/或杂合体(hybrid)，特别是在WO9623873、WO9623874、WO9741213、WO9919467、WO0060059和WO0210355的任一篇中所描述的(将全部这些文献通过提述并入本文)。特别期望的α-淀粉酶变体公开在美国专利第6,093,562、6,297,038或6，187,576号中(通过提述并入本文)并包括在位置R179至G182中缺失一个或两个氨基酸的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(BSG α-淀粉酶)变体，优选在WO1996023873中公开的双缺失-参见例如，第20页，第1-10行(通过提述并入本文)，优选对应于与WO9919467中公开的SEQ ID NO：3中所示野生型BSG α-淀粉酶氨基酸序列相比的δ(181-182)，或对应于使用WO9919467中的SEQ ID NO：3进行编号时缺失氨基酸R179和G180(将所述参考文献通过提述并入本文)。甚至更优选的是芽孢杆菌属α-淀粉酶，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，其与WO9919467中公开的SEQ ID NO：3中所示野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列相比，具有对应于δ(181-182)的双缺失并且还包含N193F取代(也表示为I181*+G182*+N193F)。
细菌杂合α-淀粉酶
特别期望的杂合α-淀粉酶包含地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(示于WO9919467的SEQ ID NO：4中)的445个C-末端氨基酸残基和源自解淀粉芽孢杆菌(示于WO9919467的SEQ ID NO：5中)的α-淀粉酶的37个N-末端氨基酸残基，具有一个或多个(尤其是全部)以下取代：
G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S(使用WO9919467的SEQ ID NO：4中的地衣芽孢杆菌编号方式)。同样优选的是具有以下突变(或在其它芽孢杆菌属α-淀粉酶骨架中的相应突变)中的一个或多个的变体：H154Y、A181T、N190F、A209V和Q264S和/或在第176至179位的两个残基的缺失，优选E178和G179的缺失(使用WO9919467的SEQ IDNO：5的编号方式)。
真菌α-淀粉酶
真菌α-淀粉酶包括源自曲霉属(genus Aspergillus)菌株的α-淀粉酶，如，米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑曲霉(Aspergillus niger)和川地曲霉(Aspergilliskawachii)α-淀粉酶。
优选的酸性真菌α-淀粉酶是源自米曲霉菌株的Fungamyl样α-淀粉酶。根据本发明，术语“Fungamyl样α-淀粉酶”是指与WO9623874中SEQ ID NO：10中所示氨基酸序列的成熟部分显示高同一性，即至少70％、至少75％、至少80％、至少85％至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％同一性的α-淀粉酶。
另一优选的酸性α-淀粉酶源自黑曲霉菌株。在一个优选的实施方案中，所述酸性真菌α-淀粉酶是在Swiss-prot/TeEMBL数据库中以原始登录号P56271作为“AMYA_ASPNG”公开的来自黑曲霉并且记载在WO8901969(实施例3)中的一种酸性真菌α-淀粉酶。商业上可以获得的源自黑曲霉的酸性真菌α-淀粉酶是SP288(可从Novozymes A/S，Denmark获得)。
其它期望的野生型α-淀粉酶包括源自根毛霉属(Rhizomucor)和多孔菌属(Meripilus)的菌株的那些，优选源自微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)(将WO2004055178通过提述并入)或巨多孔菌(Meripilus giganteus)。
在一个优选的实施方案中，α-淀粉酶源自川地曲霉并且由Kaneko等J.Ferment.Bioeng.81：292-298(1996)“Molecular-cloning and determination of thenucleotide-sequence of a gene encoding an acid-stable α-amylase from Aspergilliskawachii.″公开，并且还作为EMBL：#AB008370公开。
真菌α-淀粉酶也可为包含淀粉结合域(SBD)和α-淀粉酶催化域的野生型酶(即，非杂合体)或其变体。在一个实施方案中，野生型α-淀粉酶源自川地曲霉的菌株。
真菌杂合α-淀粉酶
在一个优选的实施方案中，真菌酸性α-淀粉酶是杂合α-淀粉酶。真菌杂合α-淀粉酶的优选实例包括在WO2005003311或美国专利公开第2005/0054071号(Novozymes)或美国专利申请第60/638,614号(Novozymes)中公开的那些，将所述专利或申请通过提述并入本文。杂合α-淀粉酶可以包含α-淀粉酶催化域(CD)和糖结合域/模块(CBM)，例如淀粉结合域，和任选的接头。
期望的杂合α-淀粉酶的具体实例包括在美国专利申请第60/638,614号中实施例的表1至5中公开的那些，包括具有催化域JA118和罗耳阿太菌(Atheliarolfsii)SBD的Fungamyl变体(US 60/638,614中的SEQ ID NO：100)，具有罗耳阿太菌AMG接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶(US 60/638,614中的SEQ IDNO：101)，具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶(其作为氨基酸序列SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：72和SEQ ID NO：96的组合公开在美国专利申请第11/316,535号的表5中，并且也作为SEQ ID NO：13公开于本文)或如WO2006069290的表5中的V039，和具有罗耳阿太菌葡糖淀粉酶接头和SBD的巨多孔菌α-淀粉酶(US 60/638,614中的SEQ ID NO：102)。其它特别期望的杂合α-淀粉酶是美国申请第11/316,535号和WO2006069290(通过提述并入本文)中实施例4的表3、4、5和6中所列的那些中的任一。
期望的杂合α-淀粉酶的其它具体实例包括在美国专利公开第2005/0054071号中公开的那些，包括在第15页表3中公开的那些，如具有川地曲霉接头和淀粉结合域的黑曲霉α-淀粉酶。
期望的还有与上文提及的α-淀粉酶中的任一显示高同一性的α-淀粉酶，即，与成熟酶序列显示至少70％、至少75％、至少80％、至少85％至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％同一性。
酸性α-淀粉酶可以根据本发明以0.1-10AFAU/g DS，优选0.10-5AFAU/gDS，尤其是0.3-2AFAU/g DS的量加入。
商业α-淀粉酶产品
优选的包含α-淀粉酶的商业组合物包括来自DSM的MYCOLASE，BANTM、TERMAMYLTMSC、FUNGAMYLTM、LIQUOZYMETMX和SANTMSUPER、SANTM EXTRA L(Novozymes A/S)，以及CLARASETM L-40,000、DEX-LOTM、SPEZYMETM FRED、SPEZYMETM AA和SPEZYMETM DELTA AA(Genencor Int.)，还有以商品名SP288出售的酸性真菌α-淀粉酶(可从Novozymes A/S，Denmark获得)。
糖源产生酶
术语“糖源产生酶(carbohydrate-source generating enzyme)”包括葡糖淀粉酶(为葡萄糖生成者)，β-淀粉酶和产麦芽糖淀粉酶(为麦芽糖生成者)。糖源产生酶能够产生能被所述的发酵生物用作能源的糖，例如，当使用在本发明的方法中用于产生发酵产物(如乙醇)时。可以将生成的糖直接或间接转化为期望的发酵产物，优选乙醇。根据本发明，可以使用糖源产生酶的混合物。特别期望的混合物是至少有葡糖淀粉酶和α-淀粉酶(尤其是酸性淀粉酶，甚至更优选酸性真菌α-淀粉酶)的混合物。在本发明的一个实施方案中，酸性真菌α-淀粉酶活性(AFAU)与葡糖淀粉酶活性(AGU)的比例(AFAU比AGU)可以为至少0.1，特别是至少0.16，如在0.12-0.50或更多的范围内。
葡糖淀粉酶
本发明使用的葡糖淀粉酶可以源自任何合适的来源，例如，源自微生物或植物。优选的葡糖淀粉酶是真菌或细菌来源的，其选自下组：曲霉属葡糖淀粉酶，特别是黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶(Boel等(1984)，EMBO J.3(5)，p.1097-1102)，或其变体，如在WO9200381、WO0004136和WO0104273中公开的那些(来自Novozymes，Denmark)；泡盛曲霉(A.awamori)葡糖淀粉酶(在WO8402921中公开)，米曲霉葡糖淀粉酶(Agric.Biol.Chem.(1991)，55(4)，p.941-949)，或其变体或片段。其它曲霉属葡糖淀粉酶变体包括热稳定性增强的变体：G137A和G139A(Chen等(1996)，Prot.Eng.9,499-505)；D257E和D293E/Q(Chen等(1995)，Prot.Eng.8,575-582)；N182(Chen等(1994)，Biochem.J.301，275-281)；二硫键，A246C(Fierobe等(1996)，Biochemistry，35，8698-8704)；和在A435和S436位置引入Pro残基(Li等(1997)，Protein Eng.10，1199-1204)。
其它葡糖淀粉酶包括罗耳阿太菌(之前称为罗耳伏革菌(Corticium rolfsii))葡糖淀粉酶(参见美国专利第4,727,026号和(Nagasaka，Y.等(1998)“Purificationand properties of the raw-starch-degrading glucoamylase s from Corticium rolfsii，Appl Microbiol Biotechnol 50：323-330)，踝节菌属(Talaromyces)葡糖淀粉酶，特别是源自埃默森踝节菌(Talaromyces emersonii)(WO9928448)、Talaromycesleycettanus(美国专利第Re.32,153号)、杜邦踝节菌(Talaromyces duponti)、嗜热踝节菌(Talaromyces thermophilus)(美国专利第4,587,215号)的那些。
期望的细菌葡糖淀粉酶包括来自梭菌属(genus Clostridium)，特别是热解淀粉梭菌(C.thermoamylolyticum)(EP 135,138)、热硫化氢梭菌(C.thermohydrosulfuricum(WO86/01831))的葡糖淀粉酶，和来自公开在WO2006069289(其通过提述并入本文)中的瓣环栓菌(Trametes cingulata)的葡糖淀粉酶。
根据本发明期望的还有杂合葡糖淀粉酶。实例是WO2005045018中公开的杂合葡糖淀粉酶。具体实例包括实施例1的表1和4中公开的杂合葡糖淀粉酶(该杂合体通过提述并入本文)。
期望的还有与上文提及的葡糖淀粉酶显示高同一性的葡糖淀粉酶，即，与成熟酶序列展现至少70％、至少75％、至少80％、至少85％至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％同一性。
商业上可以获得的包含葡糖淀粉酶的组合物包括AMG 200L；AMG 300L；SANTM SUPER、SANTM EXTRA L、SPIRIZYM4ETM PLUS、SPIRIZYMETMFUEL、SPIRIZYMETM B4U和AMGTM E(来自Novozymes A/S)；OPTIDEXTM300(来自Genencor Int.)；AMIGASETM和AMIGASETM PLUS(来自DSM)；G-ZYMETM G900、G-ZYMETM和G990ZR(来自Genencor Int.)。
在一个实施方案中，葡糖淀粉酶可以以0.02-20AGU/g DS，优选0.1-10AGU/g DS，尤其是1-5AGU/g DS，如0.5AGU/g DS的量加入。
产麦芽糖淀粉酶
淀粉酶也可以是产麦芽糖α-淀粉酶。“产麦芽糖α-淀粉酶”(葡聚糖1，4-a-麦芽水解酶，E.C.3.2.1.133)能够将直链淀粉(amylose)和支链淀粉(amylopectin)水解成α-构型的麦芽糖。来自嗜热脂肪芽孢杆菌菌株NCIB 11837的产麦芽糖淀粉酶商业上可从Novozymes A/S获得。产麦芽糖α-淀粉酶记载在美国专利第4,598,048、4,604,355和6,162,628中，将它们通过提述并入本文。
在一个优选的实施方案中，产麦芽糖淀粉酶以0.05-5mg总蛋白/gDS或0.05-5MANU/g DS的量加入。
蛋白酶
根据本发明蛋白酶可以是任何蛋白酶。在一个优选的实施方案中，蛋白酶是微生物来源，优选真菌或细菌来源的酸性蛋白酶。
合适的蛋白酶包括微生物蛋白酶，如真菌和细菌蛋白酶。优选的蛋白酶是酸性蛋白酶，即，其特征为能够在低于pH7的酸性条件下水解蛋白质的蛋白酶。
期望的酸性真菌蛋白酶包括源自曲霉属、毛霉属(Mucor)、根霉属(Rhizopus)、假丝酵母属、革盖菌属(Coriolus)、内座壳属(Endothia)、虫霉属(Enthomophtra)、耙菌属(Irpex)、青霉属(Penicillium)、小核菌属(Sclerotium)和球拟酵母属(Torulopsis)的真菌蛋白酶。特别期望的是源自黑曲霉(参见，例如，Koaze等，(1964)，Agr.Biol.Chem.Japan，28,216)、斋藤曲霉(Aspergillus saitoi)(参见，例如，Yoshida，(1954)J.Agr.Chem.Soc.Japan，28，66)、泡盛曲霉(Hayashida等，(1977)Agric.Biol.Chem.，42(5),927-933)、棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)(WO95/02044)或米曲霉的蛋白酶，如pepA蛋白酶；和来自微小毛霉Mucor pusillus)和米黑毛霉(Mucor miehei)的酸性蛋白酶。
期望的还有中性或碱性蛋白酶，如源自曲霉属菌株的蛋白酶。对于本发明可以考虑的一种具体蛋白酶源自解淀粉芽孢杆菌且具有可在Swissprot按登录号P06832获得的序列。还可以考虑与可在Swissprot按登录号P06832获得的氨基酸序列具有至少90％同一性，如至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或特别是至少99％同一性的蛋白酶。
期望的还有与如WO2003048353中SEQ.ID.NO：1所公开的氨基酸序列具有至少90％同一性，如至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或特别是至少99％同一性的蛋白酶。
还可以考虑木瓜蛋白酶样蛋白酶如E.C.3.4.22.*之内的蛋白酶(半胱氨酸蛋白酶)，如EC 3.4.22.2(木瓜蛋白酶)、EC 3.4.22.6(木瓜凝乳蛋白酶(chymopapain))、EC 3.4.22.7(萝藦蛋白酶(asclepain))、EC 3.4.22.14(猕猴桃蛋白酶(actinidain))、EC 3.4.22.15(组织蛋白酶L)、EC 3.4.22.25(甘氨酰内肽酶)和EC 3.4.22.30(番木瓜蛋白酶(caricain))。
蛋白酶可以以0.1-1000AU/kg dm，优选1-100AU/kg DS并最优选5-25AU/kg DS的量加入。
材料和方法
酶：
纤维素酶制备物A：WO2005074656中公开的包含具有增强纤维素分解的活性的多肽(GH61A)的纤维素分解组合物；米曲霉β-葡糖苷酶(在公开于US 60/832,511中的融合蛋白中)，和源自里氏木霉的纤维素分解酶制备物。纤维素制备物A是在共同待审的美国专利第60/941,251号中公开的。
同一性的测定
用参数“同一性”来描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。
两个氨基酸序列之间的同一性程度可以通过Clustal法(Higgins，1989，CABIOS 5：151-153)使用LASERGENETM MEGALIGNTM软件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)来确定，其中使用同一性表和以下多重比对参数：缺口罚分为10，且缺口长度罚分为10。配对比对参数是K元组(Ktuple)＝1，缺口罚分＝3，窗口(windows)＝5，和对角线(diagonals)＝5。
两个核苷酸序列之间的同一性程度可以通过Wilbur-Lipman法(Wilbur和Lipman，1983，Proceedings of the National Academy of Science USA 80：726-730)使用LASERGENETM MEGALIGNTM软件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)来确定，其中使用同一性表和以下多重比对参数：缺口罚分为10，且缺口长度罚分为10。配对比对参数是K元组＝3，缺口罚分＝3，和窗口＝20。
实施例
实施例1
使用蒸汽爆炸将玉米秸秆在205℃预处理5.4分钟。将DS为38％的经预处理的玉米秸秆(PCS)666g与2L洗涤水溶液(水与PCS的重量比率(weight ration)为3∶1)混合并在搅拌下于室温温育30分钟。将来自PCS的使用过的洗涤溶液通过8层粗滤布(cheese cloth)挤出并通过32层粗滤布过滤。获得了约1800ml使用过的洗涤溶液。将所述使用过的洗涤溶液通过在烧杯中与500g树脂D380(使用过的洗涤溶液与树脂的平均比例为约3∶1)在摇动下温育60分钟来进行处理。D380是一种大孔弱碱性阴离子交换剂。在使用之前，以常规方式洗涤所述树脂。将经处理的洗涤溶液再循环以洗涤新一批600g未经洗涤的PCS，然后进行分离、过滤和树脂处理并再循环用于又一次洗涤。将此洗涤溶液再循环5次以洗涤5批未经洗涤的PCS。作为对照处理，将使用过的洗涤溶液进行5次不用树脂处理的再循环。从每次洗涤回收了约90％的洗涤溶液。后续PCS部分的大小(size)相应地降低以保持恒定的水相对于PCS的重量比率。
对经洗涤的PCS进行补料分批水解过程，以包含110g水和初始干固体浓度为12％的底物的分批水解开始。加入青霉素控制细菌污染。利用纤维素酶组合物A以138EGU/g纤维素的浓度进行酶水解。加入3份额外加载量的经洗涤的PCS至最终重量为350克且最终干固体浓度为25％。所述补料分批水解过程在50℃和pH 4.8进行。除非具体指明，否则总水解时间为96小时。结果示于表1。
对水解产物投料(pitch with)安琪干酵母(0.5％w/w)、0.25％尿素并在32℃发酵6天。结果示于表2。
Figure GPA00001042906500211
Figure GPA00001042906500212
本文在此描述和要求保护的发明不限于本文公开的具体实施方案的范围，因为这些实施方案意欲说明本发明的几个方面。任何等同的实施方案意欲在本发明的范围内。事实上，除本文说明和描述的那些实施方案之外，对本发明的多种修改对于本领域技术人员来说是从前述说明中显而易见的。这些修改也意欲落入所附权利要求的范围。在冲突的情况下，以包括定义在内的本公开为准。
本文引用了多篇参考文献，将它们的内容通过提述以其整体并入。
实施例2
使用蒸汽爆炸将玉米秸秆在200℃处理5.4分钟。将DS为32.12％的经预处理玉米秸秆(PCS)666g与2L洗涤水溶液(水与PCS的重量比率为3∶1)混合并在搅拌下于室温温育30分钟。将来自PCS的使用过的洗涤溶液通过8层粗滤布挤出并通过32层粗滤布过滤。获得了约1800ml使用过的洗涤溶液。将所述使用过的洗涤溶液通过在烧杯中与500g树脂D380和H103(使用过的洗涤溶液与树脂的平均比例约为3∶1)在摇动下温育60分钟来进行处理。D380是一种大孔弱碱性阴离子交换剂，而H103是大孔非极性树脂。在使用之前，以常规方式洗涤所述树脂。将经处理的洗涤溶液再循环以洗涤新一批600g未经洗涤的PCS，然后进行分离、过滤和树脂处理并再循环用于又一次洗涤。将此洗涤溶液再循环5次以洗涤5批未经洗涤的PCS。作为对照处理，将使用过的洗涤溶液进行5次不用树脂处理的再循环。从每次洗涤回收了约90％的洗涤溶液。后续PCS部分的大小相应地降低以保持恒定的水相对于PCS的重量比率。
对经洗涤的PCS进行补料分批水解过程，以包含50g水和初始干固体浓度为12.60％的底物的分批水解开始。加入青霉素控制细菌污染。利用纤维素酶组合物A以45mg EP/g纤维素的浓度进行酶水解。加入3份额外加载量的经洗涤的PCS至最终重量为300克且最终干固体浓度为30％。所述补料分批水解过程在50℃和pH 4.8进行。在72小时、96小时和120小时取样用于糖分析。结果示于下表1。
将水解产物离心并通过滤纸过滤。对经过滤的水解产物投料干酵母(0.5％w/w)和0.25％尿素并在32℃发酵7天。结果示于下表2。
Figure GPA00001042906500221
Figure GPA00001042906500222

Claims (36)

1.用于产生经预处理和洗涤的含木素纤维素材料的方法，该方法包括步骤：
a)对含木素纤维素材料进行预处理，
b)在洗涤溶液中洗涤经预处理的含木素纤维素材料，
c)分离掉使用过的洗涤溶液以获得经预处理和洗涤的含木素纤维素材料，
并连续地重复步骤(a)到(c)，其中对步骤(b)中的使用过的洗涤溶液进行处理以在再循环至步骤(b)之前去除酶抑制剂和/或发酵生物的抑制剂。
2.用于将含木素纤维素材料转化为包含单糖和寡糖的水解物的方法，该方法包括步骤：
a)对含木素纤维素材料进行预处理，
b)在洗涤溶液中洗涤经预处理的含木素纤维素材料，
c)分离掉使用过的洗涤溶液以获得经预处理和洗涤的含木素纤维素材料，
d)对经预处理和洗涤的含木素纤维素材料进行处理，所述处理导致纤维素和/或半纤维素的至少部分水解，以获得包含单糖和/或寡糖的水解物，
并且连续地重复步骤(a)到(d)，其中对步骤(b)中的使用过的洗涤溶液进行处理以在再循环至步骤(b)之前去除酶抑制剂和/或发酵生物的抑制剂。
3.用于将含木素纤维素材料转化为发酵产物的方法，该方法包括步骤：
a)对含木素纤维素材料进行预处理，
b)在洗涤溶液中洗涤经预处理的含木素纤维素材料，
c)分离掉使用过的洗涤溶液以获得经预处理和洗涤的含木素纤维素材料，
d)对经预处理和洗涤的含木素纤维素材料进行处理，所述处理导致纤维素和/或半纤维素的至少部分水解，以获得包含可发酵糖的水解物，
e)将步骤(d)中的水解物与发酵生物接触以产生发酵产物，
并且连续地重复步骤(a)到(e)，其中对步骤(b)中的使用过的洗涤溶液进行处理以在再循环至步骤(b)之前去除酶抑制剂和/或发酵生物的抑制剂。
4.权利要求3的方法，进一步包括如下步骤，所述步骤包括从得自步骤(e)的发酵培养基回收发酵产物，例如通过蒸馏回收。
5.前述权利要求中任一项的方法，其中所述含木素纤维素材料来源于选自包含如下各项的组的材料：玉米秸秆，玉米纤维，硬木，如杨木和桦木，软木，谷类茎秆，如麦秆，柳枝稷，稻壳，城市固体废物，工业有机废物，办公用纸，或它们的混合物。
6.前述权利要求中任一项的方法，其中对步骤(a)中的含木素纤维素材料进行化学和/或机械预处理。
7.前述权利要求中任一项的方法，其中使用酸对步骤(a)中的含木素纤维素材料进行化学预处理。
8.前述权利要求中任一项的方法，其中步骤(a)中的预处理是酸预处理，其使用有机酸，优选硫酸、乙酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸和/或它们的混合物进行。
9.前述权利要求中任一项的方法，其中用0.1-2.0wt.％的酸，优选硫酸，对步骤(a)中的含木素纤维素材料进行酸预处理。
10.前述权利要求中任一项的方法，其中在高温和/或高压下对步骤(a)中的含木素纤维素材料进行机械预处理。
11.前述权利要求中任一项的方法，其中对步骤(a)中的含木素纤维素材料进行水热预处理。
12.前述权利要求中任一项的方法，其中对步骤(a)中的含木素纤维素材料进行水热预处理，所述预处理包括300-600psi，优选400-500psi，如大约450psi的高压。
13.前述权利要求中任一项的方法，其中对步骤(a)中的含木素纤维素材料施加约100-300℃，优选约140-235℃的高温。
14.前述权利要求中任一项的方法，其中通过蒸汽爆炸、稀酸蒸汽爆炸和/或湿氧化对步骤(a)中的含木素纤维素材料进行预处理。
15.前述权利要求中任一项的方法，其中步骤(b)中的洗涤溶液是洗涤水溶液。
16.前述权利要求中任一项的方法，其中步骤(b)的洗涤溶液包含水、有机溶剂、或水和有机溶剂的混合物。
17.前述权利要求中任一项的方法，其中在再循环至步骤(b)之前通过将步骤(b)中的使用过的洗涤水溶液与树脂柱接触来处理所述洗涤水溶液。
18.前述权利要求的方法，其中所述树脂包含-NH2作为官能团。
19.前述权利要求的方法，其中所述树脂是D380树脂和/或H103树脂。
20.前述权利要求中任一项的方法，其中所述酶抑制剂和/或发酵生物的抑制剂是萜类化合物、醛、多羟基芳族化合物、4-OH苯甲醇、4-OH苯甲醛、4-OH苯甲酸、三甲基苯甲醛、2-糠酸、香豆酸、阿魏酸、苯酚、愈创木酚、藜芦醚、焦酚、焦桔酚单甲醚、香草醇、香草醛、异香草醛、香草酸、异香草酸、高香草酸、藜芦醇、藜芦醛、藜芦酸、2-O-甲基没食子酸、丁香醇、丁香醛、丁香酸、三甲基没食子酸、高儿茶酚、乙基香草醛、甲氧甲酚、对甲基茴香醚、茴香醛、茴香酸、或它们的组合。
21.前述权利要求中任一项的方法，其中将再循环的洗涤水溶液中积累的溶解糖分离出并以C5发酵生物发酵。
22.前述权利要求中任一项的方法，其中步骤(d)中的水解包括酸水解。
23.前述权利要求中任一项的方法，其中步骤(d)中的水解包括酶水解。
24.前述权利要求中任一项的方法，其中水解和/或发酵是使用一种或多种选自下组的水解酶进行的：纤维素酶、半纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶、酯酶；如内切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、纤维二糖水解酶、纤维二糖酶、木聚糖酶、α-淀粉酶、α-葡糖苷酶、葡糖淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶，或它们的混合物。
25.前述权利要求中任一项的方法，其中所述α-淀粉酶是酸性淀粉酶和/或真菌α-淀粉酶，优选酸性真菌α-淀粉酶。
26.方法，其中水解是在25℃-70℃，优选40℃-60℃，特别是大约50℃的温度进行的。
27.前述权利要求中任一项的方法，其中水解是在pH 3-8，优选pH 4-6，特别是大约pH 5进行的。
28.前述权利要求中任一项的方法，其中水解进行12-96小时。
29.前述权利要求中任一项的方法，其中发酵是在25℃-40℃，优选大约30至大约38℃，特别是大约32℃进行的。
30.前述权利要求中任一项的方法，其中发酵过程中的pH为3-7，优选pH 4-6，特别是pH 4-5。
31.前述权利要求中任一项的方法，其中发酵进行8-96小时。
32.前述权利要求中任一项的方法，其中步骤e)中的发酵生物是酵母。
33.前述权利要求中任一项的方法，其中所述发酵产物是醇，优选乙醇。
34.前述权利要求中任一项的方法，其中步骤(c)中的水解和步骤(d)中的发酵是同时进行的(SHHF方法)或顺序进行的(SHF方法)。
35.前述权利要求中任一项的方法，其中发酵是在大约25℃至大约40℃，优选大约30至大约38℃，特别是大约32℃进行的。
36.前述权利要求中任一项的方法，其中发酵过程中的pH是3-7，优选pH 4-6，特别是pH 4-5。
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