CN102105218A - 产生炭的方法及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及从含木素纤维素材料残余固形物产生活性炭的方法及所述活性炭的用途。

Description

产生炭的方法及其用途
技术领域
本发明涉及从含木素纤维素材料残余固形物产生活性炭的方法及其用途。
背景技术
活性炭或吸附性碳是具有很高内表面积的固体吸附剂。它们产生自多种含碳起始材料并且能够用于多种多样的工业应用，包括废水处理、溶剂回收、空气和气体净化、或其它希望从溶液去除杂质(如有机化合物)的应用。
从含木素纤维素材料或“生物质”产生发酵产物在本领域是已知的，包括预处理、水解和发酵所述含木素纤维素材料。
生物质的预处理产生不合需要的副产品，包括脂肪族酸、呋喃衍生物如糠醛(furfural)和5-羟甲基糠醛(HMF)、以及酚类化合物。这些化合物被称作“抑制剂”，并且已知负面影响发酵生物如酵母的发酵性能，且负面影响用于酶法水解经预处理的生物质的某些酶的性能。
已知多种从经预处理的生物质水解物去除所述抑制剂的方法，包括中和、用氢氧化钙进行过量浸灰处理(overliming with calcium hydroxide)、活性炭、离子交换树脂和使用漆酶的酶法解毒。这些方法通常称作解毒。经预处理的生物质水解物的解毒能够改善水解过程中酶的效率并且增加某些发酵生物的发酵性能。然而，这些解毒方法可能为困难、耗时且令人不敢问津的昂贵。在已知的方法中，使用活性炭是经常的选择，原因是该方法的速度和简便性。然而，在从生物质产生发酵产物(特别是乙醇)的方法中使用活性炭由于活性炭的成本仍然是花费高得惊人。
从生物质产生发酵产物的方法的另一种副产品是含有不可发酵材料的大量残余固形物。常常将这些固形物在发酵之前或之后从生物质粗水解物中去除，然后处理掉。有人表明残余固形物可以通过焚烧它们而产生热和能量来处理。然后产生的热和能量可用于从生物质产生发酵产物的方法中。这种处理方法实质上“再循环”所述残余固形物。然而，从各方法回收的残余固形物的量能够产生的热和能量比获得所述残余固形物的方法所需要的多。因此，存在必需处理的过量的残余固形物，或过量的热和能量。
非常期望使用活性炭以廉价和高效的方式解毒经预处理的生物质水解物，以及通过增加酶的效力(减少酶加载量)、增加发酵生物的发酵能力和减少处理残余固形物的需求来降低从含木素纤维素材料产生发酵产物的总体成本。
发明内容
本发明的一个方面涉及从含木素纤维素材料残余固形物产生活性炭的方法，其中所述方法包括：
i)预处理含木素纤维素材料；
ii)水解经预处理的含木素纤维素材料；
iii)回收残余固形物；
iv)从所述残余固形物产生活性炭。
附图简述
图1表明商业上可得到的活性炭对纤维素转化成葡萄糖的百分比(％)的作用。
图2表明从生物质残余固形物制备的炭对纤维素转化为葡萄糖的百分比(％)的作用。
发明详述
根据本发明，活性炭能够产生自从发酵方法回收的残余固形物，其中发酵产物是使用一种或多种发酵生物自含木素纤维素材料产生的。
如在本文中使用，“木素纤维素”或“含木素纤维素材料”意指主要由纤维素、半纤维素和木质素组成的材料。这种材料在本文中也称作“生物质”。
如在本文中使用，“残余固形物”或“不溶性固形物”意指在预处理、水解或发酵之后存在于生物质水解物中的不溶性物质。残余固形物的组成取决于生物质的来源，但是可以包括木质素和未转化的多糖，以及任何在预处理和/或水解之前或过程中添加的不溶性物质。如果将发酵生物加入水解物用于发酵，那么短语“不溶性固形物”还包括该发酵生物和任何其它在发酵之前或过程中添加的不溶性物质。在一个实施方案中，残余固形物在发酵之前去除。在另一个实施方案中，残余固形物在发酵之后去除。
热解(pyrolysis)是通过在缺乏氧或任何其它试剂的条件下加热来化学分解有机质的方法。在此处，术语“热解”意指在低氧或无氧环境中将含碳有机质加热并干馏(dry-distill)以产生富含碳的固形物的方法。这种方法也可以称作碳化。在一个实施方案中，炭是通过热解从生物质残余固形物制备的。根据本发明涵盖任何导致炭从生物质残余固形物形成的热解方法。合适方法的选择对本领域技术人员会是显而易见的。影响选择的因素包括，但不限于，可用的设备、残余固形物的量和残余固形物的来源。
根据本发明，回收并制成活性炭的残余固形物的量可以变化。因此，根据本发明，不是所有回收的残余固形物都必需转化成活性炭。而是残余固形物的一部分可以制成活性炭，而剩余部分可以用于任何其它目的，或者只是处理掉。其它用途包括，但不限于，使用所述残余固形物来提供热和能量、生物堆肥、有机肥料，作为碳纤维制造的底物、作为用于颗粒板/粗纸板(particle/chip board)的树脂和作为供水泥或类似的多孔建筑材料用的密封剂。
活性炭可以通过多种方法从炭制备。活化(activation)指碳的一种类型，作为经加工的结果，是极其多孔的并且具有非常大的表面积可用于吸附或化学反应。碳中的孔可以通过在蒸汽存在下进行加热的碳化过程中使挥发性物质挥发来产生。通常，活性炭通过碳化和活化两个过程产生。碳化之后炭的活化可以通过物理方法，如精细碾磨或研磨、蒸汽活化或蒸汽爆炸(steam explosion)来实现。在本发明的一个实施方案中，通过生物质残余固形物的热解形成的炭是通过蒸汽爆炸活化的。
活性炭也可以通过化学方法制备。通常，化学活化通过同时碳化和活化方法实现，即，通过在单一炉中的一系列步骤来实现。碳的化学活化通常包括用化学品如KOH、NaOH、H3PO4、ZnCl2、FeCl3、KCl、CaCl2和FeSO4浸渍碳源，接着在高温如650-900℃活化。在本发明的另一个实施方案中，活性炭是通过同时碳化和活化生物质残余固形物制备的。
在本发明的一个实施方案中，所述方法进一步包括：
i)预处理含木素纤维素材料；
ii)水解经预处理的含木素纤维素材料；
iii)将残余固形物与可发酵糖液分离；
iv)回收残余固形物；
v)从所述残余固形物产生活性炭；
vi)回收所述可发酵糖液；
vii)使用发酵生物发酵所述可发酵糖液。
为了增强酶功能或改善发酵生物的发酵能力，可以使用活性炭解毒来自预处理步骤和/或水解步骤的生物质水解物。活性炭可以是任何适于解毒生物质水解物的形式，并且这些形式包括，例如，粉末、粒状(例如用于填充床反应器)或挤出的(extruded)。使用活性炭解毒生物质水解物的方法是本领域熟知的，并且本发明涵盖所有使用活性炭解毒生物质水解物的方法。
在本发明的另一个实施方案中，所述方法进一步包括：
i)预处理含木素纤维素材料；
ii)使用活性炭解毒所述经预处理的含木素纤维素材料；
iii)水解经预处理的含木素纤维素材料；
iv)将残余固形物与可发酵糖液分离；
v)回收残余固形物；
vi)从所述残余固形物产生活性炭；
vii)回收所述可发酵糖液；
viii)使用发酵生物发酵所述可发酵糖液。
优选在水解之前用活性炭仅解毒经预处理的生物质的液相。例如，所述液相可以通过将固相和液相分离和再解毒液相(例如，通过向液相加入炭，后续通过任意手段如过滤或离心去除炭)来解毒。或者，可以将活性炭固定，例如，固定在柱或滤器上，而液相可以流经或通过(pass over or through)所述活性炭柱或滤器。在本发明的一个实施方案中，步骤i)的经预处理的含木素纤维素材料的固相和液相在解毒步骤之前分离；使用活性炭解毒液相；并且将去除了炭的经解毒的液相在水解之前与固相再组合。或者，可以通过任何方法解毒经预处理的含木素纤维素材料，其中活性炭可以在水解之前去除。这样的方法可以包括，例如，液相和固相的分离与液相的解毒同时进行，其中用于分离液相和固相的滤器是活性炭滤器。或者，经预处理的含木素纤维素材料的粗水解物可以通过使所述粗水解物通过活性炭柱来解毒，其容许固形物通过柱并且得以回收，同时使液体与柱中的活性炭接触然后被回收。
在本发明的另一个实施方案中，用于解毒经预处理的含木素纤维素材料的活性炭是根据本发明的方法制备的。例如，活性炭产生自从经预处理和水解的含木素纤维素材料收集的残余固形物，然后将所述活性炭用于后续的预处理和水解含木素纤维素材料的过程。
活性炭可以在解毒之后回收，并且可以再生以供后续使用。用于再生活性炭的方法是本领域已知的，并包括物理和化学方法两者。
活性炭在工业和消费品应用中都具有多种用途。这些应用包括，但不限于，纯化或过滤家庭饮用水；为家庭和办公室空间中的空气除臭；将它用作肥皂或其它清洁产品中的成分；医学应用如透析，消除真菌、病毒和细菌，促进从某些类型的食物中毒中恢复，吸附气体(特别是小肠中的)以缓解胃肠气胀和胀痛，降低尿酸水平以辅助痛风(gout)的治疗，降低血液胆固醇和血脂水平，治疗新生儿黄疸和称作卟啉症的罕见遗传病症，将它与水混合以制备糊剂来缓解昆虫叮咬的发痒，以及用于治疗人和其它动物中的药物过量和中毒；环境应用如废水处理和泄漏补救(spill remediation)，包括从水或土壤去除有机杀虫剂、石油产品和液压流体(hydraulic fluid)；食品应用如甘油纯化，酒(wine)/果汁脱色/除臭，食用油纯化，玉米和蔗糖脱色，和醇类纯化如伏特加；化学应用如贵金属回收，甘油纯化和回收，化学品或产物纯化，淤泥/土壤稳定化，催化剂支持/保护，胺的纯化，干洗溶剂纯化，工业用油纯化，溶剂回收；空气或气体纯化以从空气中去除油蒸汽(oil vapor)、气味和其它烃类，以及用于从溶液去除不想要的有机化合物，如从生物质水解物去除抑制剂。
待发酵的木素纤维素衍生的可发酵糖是来自预处理和/或水解步骤的液体形式(例如，滤出液)。在一个实施方案中，水解步骤和发酵步骤作为分开的水解和发酵步骤(SHF)进行。
在另一个实施方案中，水解和发酵步骤作为混合水解和发酵步骤(HHF)或作为同时水解和发酵步骤(SSF)进行。当采用HHF或SSF时，省略分离步骤，并且在发酵之后回收残余固形物。在本发明的另一个实施方案中，本发明的方法包括：
i)预处理含木素纤维素材料；
ii)同时水解经预处理的含木素纤维素材料和用发酵生物发酵可发酵糖(SSF)；
iii)回收残余固形物；和
iv)从所述残余固形物产生活性炭。
或者，在另一个实施方案中，本发明的方法包括：
i)预处理含木素纤维素材料；
ii)水解经预处理的含木素纤维素材料，然后同时水解经预处理的含木素纤维素材料和用发酵生物发酵可发酵的糖(HHF)；
iii)回收残余固形物；和
iv)从所述残余固形物产生活性炭。
在本发明的另一个实施方案中，在水解或发酵过程中可以存在能够将木糖转化为木酮糖的酶。在一个实施方案中，这种木糖到木酮糖的转化酶可以是木糖异构酶(有时称作葡萄糖异构酶)。合适的木糖异构酶的例子可以在下文的“木糖异构酶”部分中找到。将木糖转化为木酮糖是有利的，因为这容许一些常用的C6发酵生物，如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，在发酵C6糖(比如特别是葡萄糖)的同时，将木酮糖转化为期望的发酵产物，如乙醇。
含木素纤维素材料
木素纤维素生物质是包裹在木质素和半纤维素鞘中的纤维素纤维的复杂结构。木素纤维素的结构使其不易受到酶水解。为了增强酶水解，必需预处理木素纤维素，例如，通过在适当的压力和温度条件下的酸水解，从而破坏木质素密封，糖化和溶解半纤维素，并破坏纤维素的晶体结构。然后可以酶水解纤维素，例如，通过纤维素分解酶处理，以将糖聚合物转化成可以发酵成期望的发酵产物如乙醇的可发酵的糖。半纤维素分解酶处理也可以用来水解经预处理的生物质中的任何残余的半纤维素。
含木素纤维素材料可以是任何含有木素纤维素的材料。在一个优选的实施方案中，所述含木素纤维素材料含有至少30wt.％，优选至少50wt.％，更优选至少70wt.％，甚至更优选至少90wt.％木素纤维素。应理解含木素纤维素材料也可以包含其它组分，如蛋白质材料、淀粉和糖类如可发酵的或不可发酵的糖类或其混合物。
含木素纤维素材料通常存在于例如植物的茎、叶、皮(hull)、壳(husk)和穗轴中，或树木的叶、枝和木材中。含木素纤维素材料包括，但不限于，草本材料、农业残余物、林业残余物、市政固体废物、废纸、和纸浆和造纸厂残余物。应理解含木素纤维素材料可以是在混合基质中含有木质素、纤维素和半纤维素的植物细胞壁材料的形式。
在一个优选的实施方案中，含木素纤维素材料选自玉米纤维、稻草、松木、刨花、杨木、甘蔗渣、和纸和纸浆加工废物中的一种或多种。
合适的含木素纤维素材料的其他例子包括玉米秸秆、玉米穗轴、硬木如杨木和桦木、软木、谷物秸秆如麦秆、柳枝稷(switch grass)、芒草属(Miscanthus)、稻壳、市政固体废物(MSW)、工业有机废物、办公室用纸或其混合物。
在一个优选的实施方案中，含木素纤维素材料是玉米秸秆或玉米穗轴。在另一个优选的实施方案中，含木素纤维素材料是玉米纤维。在另一个优选的实施方案中，含木素纤维素材料是柳枝稷。在另一个优选的实施方案中，含木素纤维素材料是甘蔗渣。
预处理
可以以任何合适的方式预处理含木素纤维素材料。
预处理在水解或发酵之前进行。预处理的目的是为了分离或释放纤维素、半纤维素和木质素，并且这种方式改善了水解的速率或效力。包括湿氧化和碱预处理的预处理方法以木质素释放为目标，而稀酸处理和自水解以半纤维素释放为目标。蒸汽爆炸是以纤维素释放为目标的预处理的例子。
根据本发明，预处理步骤可以是使用本领域熟知技术的常规预处理步骤。在一个优选的实施方案中，预处理在水性浆料中进行。在预处理过程中所述含木素纤维素材料可以以10-80wt.％，优选20-70wt.％，特别是30-60wt.％，如大约50wt.％的量存在。
化学、机械和/或生物预处理
根据本发明，可以在水解之前或过程中以化学方式、机械方式、生物方式或其任意组合来预处理含木素纤维素材料。
优选所述化学、机械或生物预处理在水解之前进行。或者，所述化学、机械或生物预处理可以与水解同时进行，例如与一种或多种纤维素分解酶或其它酶活性的加入同时进行，以释放例如可发酵的糖类，如葡萄糖或麦芽糖。
化学预处理
短语“化学预处理”指任何促进纤维素、半纤维素或木质素的分离或释放的化学预处理。合适的化学预处理方法的例子包括用例如稀酸、石灰、碱、有机溶剂、氨、二氧化硫或二氧化碳的处理。另外，湿氧化和pH受控的水热解也是所考虑的化学预处理。
在一个优选的实施方案中，化学预处理是酸处理，更优选地，是连续的稀酸和/或弱酸(mild acid)处理，如用硫酸，或另一有机酸如乙酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸、盐酸或其混合物的处理。也可以使用其它酸。弱酸处理是指处理pH处于pH 1-5，优选pH 1-3。在一个具体的实施方案中，酸浓度为0.1-2.0wt.％的酸，并且优选硫酸。可以将酸与含木素纤维素材料接触，并且可以将所述混合物在160-220℃，如165-195℃的温度保持数分钟到数秒的一段时间，例如，1-60分钟，如2-30分钟或3-12分钟。可以应用强酸如硫酸的加入来去除半纤维素。这种强酸的加入使纤维素的可消化性增强。
根据本发明也涵盖其它化学预处理技术。已显示纤维素溶剂处理将大约90％的纤维素转化成葡萄糖。也显示了当木素纤维素结构被破坏时酶水解能够大幅增强。碱、H2O2、臭氧、有机溶剂(organosolv)(使用含水醇(aqueousalcohol)中的路易斯酸、FeCl3、(Al)2SO4)、甘油、二
Figure BDA0000044426790000081
烷(dioxane)、酚或乙二醇属于已知破坏纤维素结构并促进水解的溶剂(Mosier等，BioresourceTechnology 96(2005)，673-686页)。
使用碱例如NaOH、Na2CO3和氨等的碱性化学预处理也是本发明所涵盖的。使用氨的预处理方法在例如WO 2006/110891、WO 2006/110899、WO2006/110900和WO 2006/110901中描述，将它们通过提述并入本文。
湿氧化技术涉及氧化剂的使用，所述氧化剂如基于亚硫酸盐的氧化剂等。溶剂预处理的例子包括使用DMSO(二甲亚砜)的处理等。化学预处理通常进行1-60分钟，如5-30分钟，但也可以进行更短或更长的时间，其取决于要预处理的材料。
合适预处理方法的其它例子由Schell等，2003，Appl.Biochem andBiotechn.Vol.105-108，p.69-85和Mosier等，2005，Bioresource Technology 96：673-686，以及美国专利公开号2002/0164730描述，将这些参考文献通过提述并入本文。
机械预处理
短语“机械预处理”指任何促进纤维素、半纤维素或木质素从含木素纤维素材料分离或释放的机械或物理预处理。例如，机械预处理包括多种类型的磨制、照射、汽蒸/蒸汽爆炸和水热解。
机械预处理包括粉碎，即机械减小大小。粉碎包括干磨、湿磨和振动球磨(vibratory ball milling)。机械预处理可涉及高压和/或高温(蒸汽爆炸)。在本发明的一个实施方案中，高压是指范围在300-600psi，优选400-500psi，如大约450psi的压力。在本发明的一个实施方案中，高温是指范围在大约100-300℃，优选大约140-235℃的温度。在一个优选的实施方案中，机械预处理是一种分批过程的蒸汽枪水解仪系统(a batch-process，steam gunhydrolyzer system)，其使用如上限定的高压和高温。为此可使用Sunds水解仪(可从Sunds Defibrator AB(Sweden)获得)。
化学和机械组合预处理
在一个优选的实施方案中，以化学和机械两种方式预处理含木素纤维素材料。例如，预处理步骤可涉及稀酸或弱酸处理以及高温和/或高压处理。化学和机械预处理可以根据需要顺序进行或同时进行。
因此，在一个优选的实施方案中，对所述含木素纤维素材料进行化学和机械两种预处理以促进纤维素、半纤维素或木质素的分离或释放。
在一个优选的实施方案中，预处理是作为稀酸或弱酸蒸汽爆炸步骤进行的。在另一个优选的实施方案中，预处理是作为氨纤维爆炸步骤(或AFEX预处理步骤)进行的。
生物预处理
短语“生物预处理”指任何促进纤维素、半纤维素或木质素从含木素纤维素材料分离或释放的生物预处理。生物预处理技术可以涉及应用溶解木质素的微生物。参见，例如，Hsu，T.-A.，1996，Pretreatment of biomass，于Handbook onBioethanol：Production and Utilization，Wyman，C.E.编，Taylor&Francis，Washington，DC，179-212；Ghosh，P.和Singh，A.，1993，Physicochemical andbiological treatments for enzymatic/microbial conversion of lignocellulosic biomass，Adv.Appl.Microbiol.39：295-333；McMillan，J.D.，1994，Pretreating lignocellulosicbiomass：a review，于Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production，Himmel，M.E.，Baker，J.O.和Overend，R.P.编，ACS Symposium Series 566，American Chemical Society，Washington，DC，第15章；Gong，C.S.，Cao，N.J.，Du，J.和Tsao，G.T.，1999，Ethanol production from renewable resources，于Advances inBiochemical Engineering/Biotechnology，Scheper，T.编，Springer-Verlag BerlinHeidelberg，Germany，65：207-241；Olsson，L.和Hahn-Hagerdal，B.，1996，Fermentation of lignocellulosic hydrolyzates for ethanol production，Enz.Microb.Tech.18：312-331；和Vallander，L.和Eriksson，K.-E.L.，1990，Production ofethanol from lignocellulosic materials：State of the art，Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.42：63-95。
水解
在将经预处理的含木素纤维素材料发酵之前，可将其水解以将纤维素和半纤维素分解成可发酵的糖类。在一个实施方案中，在发酵之前将经预处理的材料水解，优选酶水解。
水解过程中的干固形物含量可以为5-50wt.％，优选10-40wt.％，优选20-30wt.％的范围。在一个优选的实施方案中，水解可以作为补料分批过程进行，在所述补料分批过程中将经预处理的含木素纤维素材料(即，底物)逐渐进料至例如含有酶的水解溶液中。
在一个优选的实施方案中，水解是通过酶法进行的。根据本发明，经预处理的含木素纤维素材料可以通过一种或多种纤维素分解酶来水解，如通过纤维素酶或半纤维素酶或其组合来水解。
在另一个实施方案中，水解使用包含一种或多种具有纤维素分解增强活性的多肽的纤维素分解酶制备物进行。在一个优选的实施方案中，所述具有纤维素分解增强活性的多肽是家族GH61A来源的。合适的纤维素分解酶制备物和具有纤维素分解增强活性的多肽的例子在下文的“纤维素分解酶”部分和“纤维素分解增强多肽”部分中描述。
由于含木素纤维素材料可以含有木质素、纤维素和半纤维素之外的组分，水解和/或发酵可以在存在其它酶活性的条件下进行，所述其它酶活性如蛋白酶活性、淀粉酶活性、糖生成酶活性和酯酶活性如脂肪酶活性。
酶水解优选在合适的含水环境中在能够由本领域技术人员容易地确定的条件下进行。在一个优选的实施方案中，水解在对于所考虑的酶为合适的(优选最佳的)条件下进行。
合适的过程时间、温度和pH条件可以由本领域技术人员容易地确定。优选地，水解在25-70℃，优选40-60℃，特别是大约50℃的温度进行。所述步骤优选在范围在pH 3-8，优选pH 4-6，特别是大约pH 5的pH进行。水解通常进行12-96个小时，优选16-72个小时，更优选24-48个小时。
发酵
根据本发明，来自经预处理和/或水解的含木素纤维素材料的可发酵糖可以通过一种或多种发酵生物发酵，所述发酵生物能够直接或间接地将糖类，如葡萄糖、木糖、甘露糖和半乳糖发酵成想要的发酵产物。发酵条件依赖于想要的发酵产物和发酵生物，并且能够由本领域普通技术人员容易地确定。
特别是在乙醇发酵的情况下，发酵可以进行1-48小时，优选1-24小时。在一个实施方案中，所述发酵在20-40℃，优选26-34℃，特别是大约32℃的温度进行。在一个实施方案中，pH大于5。在另一个实施方案中，pH为pH 3-7，优选4-6。然而，某些发酵生物，例如细菌发酵生物具有较高的最佳发酵温度。因此，在一个实施方案中，发酵在40-60℃，如50-60℃的温度进行。本领域技术人员能够容易地确定合适的发酵条件。
发酵可以在分批、补料分批或连续反应器中进行。补料分批发酵可以是固定体积或可变体积的补料分批。在一个实施方案中，采用补料分批发酵。补料分批发酵的体积和速率依赖于，例如，发酵生物、可发酵糖类的性质(identity)和浓度、和想要的发酵产物。这样的发酵速率和体积能够由本领域普通技术人员容易地确定。
SSF、HHF和SHF
水解和发酵可以作为同时水解和发酵步骤(SSF)进行。通常这种组合的/同时水解和发酵方法在对于所考虑的发酵生物合适的(优选最佳的)条件(例如，温度和/或pH)下进行。
水解和发酵也可以作为混合水解和发酵(HHF)进行。HHF通常以单独的部分水解步骤开始，并以同时水解和发酵步骤结束。单独的部分水解步骤是酶促纤维素糖化步骤，该步骤通常在对于所考虑的水解酶合适的(优选最佳的)条件(例如，在较高的温度)下进行。后续的同时水解和发酵步骤通常在适合于发酵生物的条件(通常在比单独水解步骤低的温度)下进行。
水解和发酵也可以作为分开的水解和发酵进行，其中在开始发酵之前完成水解。通常将此成为“SHF”。
回收
发酵之后，可选地将发酵产物以任何合适的方式从发酵培养物分离。例如，可以蒸馏所述培养物以提取发酵产物，或者可以通过微滤或膜过滤技术从发酵培养物提取发酵产物。或者，可以通过汽提回收发酵产物。回收方法是本领域熟知的。
发酵产物
本发明可以用于产生任何发酵产物。优选的发酵产物包括醇(例如，乙醇、甲醇、丁醇)；有机酸(例如，柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸)；酮(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氨酸)；气体(例如H2和CO2)；抗生素(例如，青霉素和四环素)；酶；维生素(例如，核黄素、B12、β-胡萝卜素)；和激素。
其它产物包括可消费醇工业产物，例如，啤酒和葡萄酒；乳制品工业产物，例如，发酵乳制品；皮革工业产物和烟草工业产物。在一个优选的实施方案中，发酵产物是醇，特别是乙醇。根据本发明获得的发酵产物，如乙醇，可优选用作燃料醇/乙醇。然而，在乙醇的情况下，还可以用作饮用乙醇。
发酵生物
短语“发酵生物”指适合于产生期望的发酵产物的任何生物，包括细菌和真菌生物。发酵生物可以是C6或C5发酵生物，或其组合。C6和C5两种发酵生物均为本领域熟知的。
合适的发酵生物能够将可发酵糖类(如葡萄糖、果糖、麦芽糖、木糖、甘露糖和/或阿拉伯糖)直接或间接发酵，即，转化成期望的发酵产物。
发酵生物的示例包括真菌生物如酵母。优选的酵母包括酵母属(genusSaccharomyces)的菌株，特别是酿酒酵母或葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)的菌株；毕赤酵母属(Pichia)，优选树干毕赤酵母(Pichia stipitis)的菌株如树干毕赤酵母CBS 5773，或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)的菌株；假丝酵母属(Candida)的菌株，特别是产朊假丝酵母(Candida utilis)、阿拉伯糖发酵假丝酵母(Candida arabinofermentans)、迪丹斯假丝酵母(Candida diddensii)、Candidasonorensis、休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)、热带假丝酵母(Candidatropicalis)或博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)的菌株。其它发酵微生物包括汉逊酵母属(Hansenula)，特别是多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)或异常汉逊酵母(Hansenula anomala)的菌株；克鲁维酵母属(Klyveromyces)，特别是脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)或马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)的菌株；和裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)，特别是粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的菌株。
优选的细菌发酵生物包括埃希氏菌属(Escherichia)，特别是大肠杆菌的菌株，发酵单胞菌属(Zymomonas)，特别是运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)的菌株；发酵细菌属(Zymobacter)，特别是棕榈发酵细菌(Zymobactor palmae)的菌株；克雷伯氏菌属(Klebsiella)特别是产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)的菌株；明串珠菌属(Leuconostoc)，特别是肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)的菌株；梭菌属(Clostridium)，特别是丁酸梭菌(Clostridium butyicum)的菌株；肠杆菌属(Enterobacter)，特别是产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)的菌株；和热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)，特别是热厌氧杆菌BG1L1(Appl.Microbiol.Biotech.77：61-86)和乙醇热厌氧杆菌(Thermoanarobacter ethanolicus)、嗜热解糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter thermosaccharolyticum)或马瑞氏热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter mathranii)的菌株。也考虑乳杆菌属(Lactobacillus)的菌株，还考虑谷氨酸棒杆菌R(Corynebacterium glutamicum R)、热葡糖苷酶芽孢杆菌(Bacillus thermoglucosidaisus)和热葡糖苷酶地芽孢杆菌(Geobacillusthermoglucosidasius)。
在一个实施方案中所述发酵生物是C6糖发酵生物，如例如酿酒酵母的菌株。
与木素纤维素衍生材料的发酵相关时，涵盖C5糖发酵生物。大多数C5糖发酵生物也发酵C6糖。C5糖发酵生物的实例包括毕赤酵母属菌株，如树干毕赤酵母菌种菌株。还已知C5糖发酵细菌。一些酿酒酵母菌株也发酵C5(和C6)糖。例子是经遗传修饰的酵母属菌种菌株，其能发酵C5糖，包括在例如Ho等，1998，Applied and Environmental Microbiology，第1852-1859页和Karhumaa等，2006，Microbial Cell Factories 5：18和Kuyper等，2005，FEMS Yeast Research 5：925-934中关注的菌株。
某些发酵生物的发酵性能可以通过发酵培养基中抑制剂的存在并因此降低乙醇产生能力来抑制。已知生物质水解物中的化合物和高浓度的乙醇抑制某些酵母细胞的发酵能力。预适应或适应方法可以减少这种抑制效果。酵母细胞的预适应或适应通常涉及在发酵之前连续培养酵母细胞以提高酵母的发酵性能和增加乙醇产生。酵母预适应和适应的方法是本领域已知的。这些方法可以包括，例如，使酵母细胞在生物质粗水解物存在下生长；使酵母细胞在抑制剂如酚类化合物、糠醛和有机酸的存在下生长；使酵母细胞在非抑制量的乙醇存在下生长；和为酵母培养物补充乙醛。在一个实施方案中，发酵生物是在发酵之前经过一种或多种预适应或适应方法的酵母菌株。
某些发酵生物如酵母需要足够的氮源以供增殖和发酵。能够使用的氮源有许多，并且这些氮源是本领域熟知的。在一个实施方案中，使用低成本氮源。这种低成本氮源可以是有机的，如尿素、DDG、湿饼或玉米醪，或者是无机的，如氨或氢氧化铵。
适合于乙醇产生的商业上可得到的酵母包括，例如ETHANOL REDTM酵母(可从Fermentis/Lesaffre，USA获得)，FALITM(可从Fleischmann’s Yeast，USA获得)，SUPERSTART和THERMO SACCTM鲜酵母(可从Ethanol Technology，WI，USA获得)，BIOFERM AFT和XR(可从NABC-North American BioproductsCorporation，GA，USA获得)，GERT STRAND(可从Gert Strand AB，Sweden获得)，和FERMIOL(可从DSM Specialties获得)。
发酵培养基
短语“发酵培养基”指进行发酵的环境，并且包含发酵底物，即，由发酵生物代谢的糖源，并且可以包括发酵生物。
发酵培养基可以包含供发酵生物用的营养物和生长刺激物。营养物和生长刺激物广泛用于发酵领域并且包括氮源，如氨；维生素和矿物质，或它们的组合。
在发酵之后，发酵培养基还可以包含发酵产物。
酶
即使在本发明的方法或过程的上下文中没有具体提及，也应理解所述酶以及其它化合物是以有效量使用的。
纤维素分解活性
短语“纤维素分解活性”如用于本文应理解为包含具有纤维二糖水解酶活性(EC 3.2.1.91)的酶，例如，纤维二糖水解酶I和纤维二糖水解酶II，以及具有内切葡聚糖酶活性(EC 3.2.1.4)和β-葡糖苷酶活性(EC 3.2.1.21)的酶。
至少三类酶对于纤维素转化成可发酵糖是重要的：随机切割纤维素链的内切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)；从纤维素链末端切割纤维二糖单元的纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)和将纤维二糖和可溶性纤维糊精转化成葡萄糖的β-葡糖苷酶(EC3.2.1.21)活性。在这三类涉及纤维素生物降解的酶中，纤维二糖水解酶似乎是降解天然晶体纤维素的关键酶。
在一个优选的实施方案中，纤维素分解活性可以是真菌来源的酶的制备物的形式，如来自木霉属(Trichoderma)的菌株，优选里氏木霉(Trichoderma reesei)的菌株；腐质霉属的菌株，如特异腐质霉(Humicola insolens)的菌株；或金孢子菌属(Chrysosporium)的菌株，优选Chrysosporium lucknowense的菌株。
在优选的实施方案中，纤维素分解酶制备物含有以下活性中的一种或多种：纤维素酶、半纤维素酶、纤维素分解酶增强活性、β-葡糖苷酶活性、内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶或木糖异构酶。
在一个优选的实施方案中，纤维素酶可以是如PCT/US2008/065417中所限定的组合物，将该申请通过提述并入本文。具体而言，在一个实施方案中是下文描述的实施例1中使用的纤维素酶组合物(纤维素酶制备物A)。在一个优选的实施方案中，纤维素分解酶制备物包含具有纤维素增强活性的多肽，优选家族GH61A多肽，优选WO 2005/074656(Novozymes)中公开的那种。纤维素分解酶制备物可进一步包含β-葡糖苷酶，如源自木霉属、曲霉属(Aspergillus)或青霉属(Penicillium)的菌株的β-葡糖苷酶，包括WO2008/057637中公开的具有β-葡糖苷酶活性的融合蛋白。在一个优选的实施方案中，纤维素分解酶制备物也可以包含CBH II酶，优选土生梭孢霉(Thielavia terrestris)纤维二糖水解酶II CEL6A。在另一优选的实施方案中，纤维素分解酶制备物也可以包含纤维素分解酶，优选源自里氏木霉或特异腐质霉的纤维素分解酶。
纤维素分解酶制备物也可以包含WO 2005/074656中公开的具有纤维素分解增强活性(GH61A)的多肽；β-葡糖苷酶(WO 2008/057637中公开的融合蛋白)和源自里氏木霉的纤维素分解酶。
在一个实施方案中，纤维素分解酶是商业上可得到的产品，可从NovozymesA/S，Denmark获得的
Figure BDA0000044426790000151
1.5L或CELLUZYMETM，或ACCELERASETM 1000(来自Genencor Inc.，USA)。
可以加入纤维素分解酶用于水解经预处理的含木素纤维素材料。纤维素分解酶可以在0.1-100FPU每克总固形物(TS)，优选0.5-50FPU每克TS，特别是1-20FPU每克TS的范围内剂量添加(dose)。在另一实施方案中，使用至少0.1mg纤维素分解酶每克总固形物(TS)，优选至少3mg纤维素分解酶每克TS，如5-10mg纤维素分解酶每克TS用于水解。
内切葡聚糖酶(EG)
术语“内切葡聚糖酶”指内-1，4-(1，3；1，4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(E.C.No.3.2.1.4)，其催化纤维素、纤维素衍生物(如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣淀粉中的1，4-β-D-糖苷键，混合型β-1，3-葡聚糖如谷物β-D-葡聚糖或木葡聚糖，以及其它含有纤维素成分的植物材料中β-1，4-键的内水解。内切葡聚糖酶活性可以使用羧甲基纤维素(CMC)水解根据Ghose，1987，PureandAppl.Chem.59：257-268的方法确定。
在一个优选的实施方案中，内切葡聚糖酶可以源自木霉属的菌株，优选里氏木霉的菌株；腐质霉属的菌株，如特异腐质霉的菌株；或金孢子菌属的菌株，优选Chrysosporium lucknowense的菌株。
纤维二糖水解酶(CBH)
术语“纤维二糖水解酶”指1，4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.91)，其催化纤维素、纤维寡糖、或任何含β-1，4-连接的葡萄糖的聚合物中1，4-β-D-葡糖苷键的水解，从链的还原端或非还原端释放纤维二糖。
纤维二糖水解酶的例子在上文中提到，包括源自里氏木霉、特异腐质霉的CBH I和CBH II；和来自土生梭孢霉的纤维二糖水解酶的CBH II(CELL6A)。
可以根据由Lever等，1972，Anal.Biochem.47：273-279和由van Tilbeurgh等，1982，FEBSLetters 149：152-156；van Tilbeurgh和Claeyssens，1985，FEBSLetters 187：283-288记载的方法测定纤维二糖水解酶活性。Lever等的方法适合于评估玉米秸秆中纤维素的水解，而van Tilbeurgh等的方法适合于依靠荧光性的二糖衍生物测定纤维二糖水解酶活性。
β-葡糖苷酶
在水解过程中可以存在一种或多种β-葡糖苷酶。
术语“β-葡糖苷酶”指β-D-葡糖苷葡糖水解酶(E.C.3.2.1.21)，其催化末端非还原性β-D-葡萄糖残基的水解，并释放β-D-葡萄糖。就本发明而言，β-葡糖苷酶活性是根据Venturi等，2002，J.Basic Microbiol.42：55-66记载的基本方法来测定的，只是使用了如本文所述的不同条件。一个单位的β-葡糖苷酶活性定义为在100mM柠檬酸钠、0.01％
Figure BDA0000044426790000161
20中，在50℃、pH 5条件下每分钟从作为底物的4mM对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷产生1.0微摩尔对硝基苯酚。
在一个优选的实施方案中，β-葡糖苷酶是真菌来源的，如木霉属、曲霉属或青霉属的菌株。在一种优选的实施方案中，β-葡糖苷酶源自里氏木霉，如由bgl1基因编码的β-葡糖苷酶(参见EP 562003的图1)。在另一优选的实施方案中，β-葡糖苷酶源自米曲霉(Aspergillus oryzae)(根据WO 2002/095014在米曲霉中重组产生)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)(根据WO 2002/095014的实施例22在米曲霉中重组产生)或黑曲霉(Aspergillus niger)(1981，J.Appl.Vol 3，157-163页)。
半纤维素酶
半纤维素能够通过半纤维素酶和/或酸水解分解从而释放其五碳和六碳糖组分。
在本发明的一个实施方案中，可以用一种或多种半纤维素酶处理木素纤维素衍生材料。
可以使用任何适合用于水解半纤维素(优选水解成木糖)的半纤维素酶。优选的半纤维素酶包括木聚糖酶、阿拉伯呋喃苷糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、葡糖醛酸糖苷酶、内切半乳聚糖酶、甘露聚糖酶、内切或外切阿拉伯聚糖酶、外切半乳聚糖酶和它们中两种或更多种的混合物。优选地，供本发明中使用的半纤维素酶是外切作用的半纤维素酶，并且更优选地，所述半纤维素酶是能够在pH 7以下，优选pH 3-7的酸性条件下水解半纤维素的外切作用半纤维素酶。适用于本发明中的半纤维素酶的例子包括VISCOZYMETM(可从Novozymes A/S，Denmark获得)。
在一个实施方案中，所述半纤维素酶是木聚糖酶。在一个实施方案中，所述木聚糖酶可以优选微生物来源的，如真菌来源的(例如，木霉属、多孔菌属(Meripilus)、腐质霉属、曲霉属、镰孢属(Fusarium))或来自细菌(例如，芽孢杆菌属(Bacillus))。在一个优选的实施方案中，所述木聚糖酶源自丝状真菌，优选源自曲霉属，如棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)的菌株；或腐质霉属，优选疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)的菌株。所述木聚糖酶可以优选为内切-1，4-β-木聚糖酶，更优选GH10或GH11的内切-1，4-β-木聚糖酶。商业木聚糖酶的例子包括来自Novozymes A/S，Denmark的SHEARZYMETM和BIOFEED WHEATTM。
半纤维素酶可以以有效水解半纤维素的量加入，如，以总固形物的约0.001-0.5wt.％，更优选TS的约0.05-0.5wt.％的量加入。
木聚糖酶可以以0.001-1.0g/kg DM(干物质)底物，优选以0.005-0.5g/kgDM底物，并且最优选0.05-0.10g/kg DM底物的量加入。
木糖异构酶
木糖异构酶(D-木糖酮异构酶)(E.C.5.3.1.5.)是催化从D-木糖到D-木酮糖的可逆性异构化反应的酶。一些木糖异构酶还转化从D-葡萄糖到D-果糖的可逆性异构化。因此，木糖异构酶有时称作“葡萄糖异构酶”。
本发明的方法或过程中使用的木糖异构酶可以是任何具有木糖异构酶活性的酶并且可以源自任何来源，优选细菌或真菌来源，如丝状真菌或酵母。细菌木糖异构酶的例子包括属于以下属或种的木糖异构酶：链霉菌属(Streptomyces)、游动放线菌属(Actinoplanes)、芽孢杆菌属和黄杆菌属(Flavobacterium)，以及栖热袍菌属(Thermotoga)，包括新阿波罗栖热袍菌(T.neapolitana)(Vieille等，1995，Appl.Environ.Microbiol.61(5)，1867-1875)和海栖热袍菌(T.maritime)。
真菌木糖异构酶的例子是源自担子菌纲(Basidiomycetes)的菌种。
优选的木糖异构酶源自假丝酵母属的酵母菌株，优选博伊丁假丝酵母的菌株，特别是由例如Vongsuvanlert等，1988，Agric.Biol.Chem.，52(7)：1817-1824公开的博伊丁假丝酵母木糖异构酶。木糖异构酶可以优选源自作为DSM 70034和ATCC 48180保藏的、在Ogata等，Agric.Biol.Chem，Vol.33，1519-1520页或Vongsuvanlert等，1988，Agric.Biol.Chem，52(2)，1519-1520页中公开的博伊丁假丝酵母(Kloeckera 2201)菌株。
在一个实施方案中，木糖异构酶源自链霉菌属的菌株，例如，源自鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)(美国专利No.4,687,742)；黄微绿链霉菌(S.flavovirens)、白色链霉菌(S.albus)、不产色链霉菌(S.achromogenus)、多刺链霉菌(S.echinatus)、威德摩尔链霉菌(S.wedmorensis)(均公开在美国专利No.3,616,221中)的菌株。其它木糖异构酶公开于美国专利No.3,622,463、美国专利No.4,351,903、美国专利No.4,137,126、美国专利No.3,625,828、匈牙利专利no.12,415、德国专利2,417,642、日本专利no.69,28,473和WO2004/044129中，将它们全部通过提述并入本文。
木糖异构酶可以为固定化形式或液体形式。优选液体形式。
商业上可得到的木糖异构酶的例子包括来自Novozymes A/S，Denmark的SWEETZYMETM T。
加入木糖异构酶以提供范围在0.01-100IGIU每克总固形物的活性水平。
纤维素分解增强活性
短语“纤维素分解增强活性”在本文定义为增强具有纤维素分解活性的蛋白质对木素纤维素衍生材料的水解的生物活性。就本发明而言，纤维素分解增强活性通过测量纤维素分解蛋白质在下述条件下水解木素纤维素衍生材料(例如，经预处理的含木素纤维素材料)所致的还原糖的增加或纤维二糖和葡萄糖总量的增加来测定的：1-50mg总蛋白质/g PCS(经与处理的玉米秸秆)中的纤维素，其中总蛋白质包含80-99.5％w/w纤维素分解蛋白/g PCS中的纤维素和0.5-20％w/w具有纤维素分解增强活性的蛋白质，在50℃历时1-7天，与使用相等的总蛋白质加载量但没有纤维素分解增强活性(1-50mg纤维素分解蛋白/g PCS中的纤维素)的对照水解比较。
所述具有纤维素分解增强活性的多肽以下述方式增强由具有纤维素分解活性的蛋白质所催化的木素纤维素衍生材料的水解：将达到同样水解程度所需的纤维素分解酶的量减少优选至少0.1倍，更优选至少0.2倍、更优选至少0.3倍、更优选至少0.4倍、更优选至少0.5倍、更优选至少1倍、更优选至少3倍、更优选至少4倍、更优选至少5倍、更优选至少10倍、更优选至少20倍、进一步更优选至少30倍、最优选至少50倍、并且甚至最优选至少100倍。
在一个优选的实施方案中，水解和/或发酵在存在纤维素分解酶与具有增强活性的多肽的组合的条件下进行。在一个优选的实施方案中，所述具有增强活性的多肽是家族GH61A多肽。WO 2005/074647公开了来自土生梭孢霉的具有纤维素分解增强活性的分离的多肽及其多核苷酸。WO 2005/074656公开了来自桔橙嗜热霉(Thermoascus aurantiacus)的具有纤维素分解增强活性的分离的多肽及其多核苷酸。美国专利公开No.2007/0077630公开了来自里氏木霉的具有纤维素分解增强活性的分离的多肽及其多核苷酸。
α-淀粉酶
根据本发明可以使用任何α-淀粉酶。优选的α-淀粉酶是微生物来源的，如细菌或真菌来源的。哪种α-淀粉酶最合适取决于方法条件，但是能够由本领域技术人员容易地确定。
在一个实施方案中，优选的α-淀粉酶是酸性α-淀粉酶，例如，真菌酸性α-淀粉酶或细菌酸性α-淀粉酶。短语“酸性α-淀粉酶”指以有效量加入的α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)在范围在3-7，优选3.5-6，或更优选4-5的pH具有最佳活性。
细菌α-淀粉酶
在另一优选的实施方案中，α-淀粉酶是芽孢杆菌属来源的。芽孢杆菌属α-淀粉酶可以优选源自地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)或嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)的菌株，但是也可以源自其它芽孢杆菌属菌种。涵盖的α-淀粉酶的具体例子包括WO 1999/19467中SEQ ID NO：4所示的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶、WO 1999/19467中SEQ ID NO：5所示的解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶和WO 1999/19467中SEQ ID NO：3所示的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(将所有序列通过提述并入本文)。在本发明的一个实施方案中，α-淀粉酶可以是分别与WO 1999/19467中SEQ ID NO：1、2或3所示的序列中的任一具有至少60％、优选至少70％、更优选至少80％、甚至更优选至少90％、如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性程度的酶。
芽孢杆菌属α-淀粉酶也可以是变体和/或杂合体，特别是WO 1996/23873、WO 1996/23874、WO 1997/41213、WO 1999/19467、WO 2000/60059和WO2002/10355中任一所记载的(将全部文献通过提述并入本文)。特别涵盖的α-淀粉酶变体在美国专利nos.6,093,562、6,297,038或美国专利no.6,187,576(通过提述并入本文)中公开，并且包括嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(BSGα-淀粉酶)变体，其在位置R179至G182具有一个或两个氨基酸的缺失，优选WO1996/023873中公开的双缺失-参见例如第20页第1-10行(通过提述并入本文)，优选与WO 1999/19467中公开的SEQ ID NO：3中所示的野生型BSG α-淀粉酶氨基酸序列相比对应于Δ(181-182)的双缺失，或是使用WO1999/19467中的SEQ ID NO：3来编号的氨基酸R179和G180的缺失(将所述文件通过提述并入本文)。甚至更优选的是芽孢杆菌属α-淀粉酶，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，其与WO 1999/19467中公开的SEQ ID NO：3中所列的野生型BSG α-淀粉酶氨基酸序列相比，具有相应于Δ(181-182)的双缺失，并且进一步包含N193F取代(也表示为I181*+G182*+N193F)。
细菌杂合α-淀粉酶
特别涵盖的杂合α-淀粉酶包含地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(WO 1999/19467中的SEQ ID NO：4所示)的445个C-末端氨基酸残基和源自解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶(WO 1999/19467中的SEQ ID NO：5中)的37个N-末端氨基酸残基，具有以下取代中的一个或多个，特别是全部：
G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S (使用WO 1999/19467的SEQ ID NO：4中的地衣芽孢杆菌编号方式)。还优选的是具有一种或多种以下突变(或在其它芽孢杆菌属α-淀粉酶骨架中的相应突变)的变体：H154Y、A181T、N190F、A209V和Q264S和/或在位置176和179之间两个残基的缺失，优选E178和G179的缺失(使用WO 1999/19467的SEQ IDNO：5编号方式)。
真菌α-淀粉酶
真菌α-淀粉酶包括源自曲霉属的菌株的α-淀粉酶，例如，米曲霉、黑曲霉和川地曲霉(Aspergillis kawachii)α-淀粉酶。
优选的酸性真菌α-淀粉酶是Fungamyl-样α-淀粉酶，其源自米曲霉菌株。根据本发明，术语“Fungamyl-样α-淀粉酶”指与WO 1996/23874中SEQ ID NO：10所示氨基酸序列的成熟部分显示高同一性的α-淀粉酶，即多于70％、多于75％、多于80％、多于85％、多于90％、多于95％、多于96％、多于97％、多于98％、多于99％或甚至100％同一性的α-淀粉酶。
另一优选的酸性α-淀粉酶源自黑曲霉菌株。在一个优选的实施方式中，酸性真菌α-淀粉酶是来自黑曲霉的α-淀粉酶，其作为“AMYA ASPNG”以原始登录号P56271公开于Swiss-prot/TeEMBL数据库，并且记载在WO1989/01969(实施例3)中。商业上可得到的源自黑曲霉的酸性真菌α-淀粉酶是SP288(可从Novozymes A/S，Denmark获得)。
其它涵盖的野生型α-淀粉酶包括源自根毛霉属(Rhizomucor)和多孔菌属的菌株，优选微小根毛霉(Rhizomucorpusillus)(WO 2004/055178，通过提述并入)或巨多孔菌(Meripilus giganteus)的菌株的那些α-淀粉酶。
在一个优选的实施方案中，α-淀粉酶源自川地曲霉并且由Kaneko等，1996，J.Ferment.Bioeng.81：292-298，“Molecular-cloning and determination of thenucleotide-sequence of a gene encoding an acid-stable α-amylase from Aspergilluskawachii″公开；并且进一步作为EMBL：#AB008370公开。
真菌α-淀粉酶也可为包含淀粉结合域(SBD)和α-淀粉酶催化域的野生型酶(即，非杂合体)，或其变体。在一个实施方案中，野生型α-淀粉酶源自川地曲霉的菌株。
真菌杂合α-淀粉酶
在一个优选的实施方案中，真菌酸性α-淀粉酶是杂合α-淀粉酶。真菌杂合α-淀粉酶的优选例子包括WO 2005/003311或美国专利公开no.2005/0054071(Novozymes)或美国专利申请no.60/638,614(Novozymes)中公开的α-淀粉酶，将其通过提述并入本文。杂合α-淀粉酶可以包含α-淀粉酶催化域(CD)和糖结合域/模块(CBM)，例如淀粉结合域，和任选的接头。
涵盖的杂合α-淀粉酶的具体例子包括美国专利申请no.60/638,614中实施例的表1至5中公开的那些，包括具有催化域JA118和罗耳阿太菌(Atheliarolfsii)SBD的Fungamyl变体(US 60/638,614中的SEQ ID NO：100)，具有罗耳阿太菌AMG接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶(US 60/638,614的SEQ IDNO：101)，具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶(其公开于美国申请no.11/316,535中的表5作为氨基酸序列SEQ ID NO：20、SEQID NO：72和SEQ ID NO：96的组合)(或作为WO 2006/069290的表5中的V039)，和带有罗耳阿太菌葡糖淀粉酶接头和SBD的巨多孔菌α-淀粉酶(US申请no.60/638,614中的SEQ ID NO：102)。其它特别涵盖的杂合α-淀粉酶是美国申请no.11/316,535或WO 2006/069290(各自通过提述并入本文)的实施例4中的表3、4、5和6中所列的任何一种。
涵盖的杂合α-淀粉酶的其它具体例子包括美国专利公开no.2005/0054071中公开的那些，包括第15页表3中公开的那些，如具有川地曲霉接头和淀粉结合域的黑曲霉α-淀粉酶。
涵盖的还有与任何上述α-淀粉酶显示高同一性的α-淀粉酶，即，与成熟酶序列多于70％，多于75％，多于80％，多于85％，多于90％，多于95％，多于96％，多于97％，多于98％，多于99％或甚至100％的同一性。
酸性α-淀粉酶可以根据本发明以0.1-10AFAU/g DS，优选0.10-5AFAU/gDS，特别是0.3-2AFAU/g DS的量加入。
商业α-淀粉酶产品
优选的包含α-淀粉酶的商业组合物包括来自DSM的MYCOLASE，BANTM、TERMAMYLTM SC、FUNGAMyLTM、LIQUOZYMETM X和SANTMSUPER、SANTM EXTRA L(Novozymes A/S)，和CLARASETM L-40,000、DEX-LOTM、SPEZYMETM FRED、SPEZYMETM AA和SPEZYMETM DELTA AA(Genencor Int.)，以及以商品名SP288出售的酸性真菌α-淀粉酶(可从Novozymes A/S，Denmark获得)。
糖源产生酶
短语“糖源产生酶”包括葡糖淀粉酶(作为葡萄糖产生者)、β-淀粉酶和产麦芽糖淀粉酶(作为麦芽糖生产者)。糖源产生酶能够产生糖，所述糖能够由所关注的发酵生物用作能源，例如，当用在产生发酵产物如乙醇的过程中时。产生的糖可以直接或间接转化成期望的发酵产物，优选乙醇。根据本发明，可以存在糖源产生酶的混合物。特别涵盖的混合物是至少有葡糖淀粉酶和α-淀粉酶(特别是酸性淀粉酶，甚至更优选酸性真菌α-淀粉酶)的混合物。在本发明的一个实施方案中，酸性真菌α-淀粉酶活性(AFAU)每葡糖淀粉酶活性(AGU)之间的比例(AFAU每AGU)可以为至少0.1，特别是至少0.16，如0.12至0.50或更高的范围。
葡糖淀粉酶
根据本发明使用的葡糖淀粉酶可以源自任何合适的来源，例如，源自微生物或植物。优选的葡糖淀粉酶是选自下组的真菌或细菌来源的：曲霉属葡糖淀粉酶，特别是黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶(Boel等，1984，EMBO J.3(5)，p.1097-1102)，及其变体，如WO 1992/00381、WO 2000/04136和WO 2001/04273(来自Novozymes，Denmark)中公开的那些；WO 1984/02921中公开的泡盛曲霉(A.awamori)葡糖淀粉酶，米曲霉葡糖淀粉酶(Agric.Biol.Chem.，1991，55(4)，941-949页)，及其变体或片段。其它曲霉属葡糖淀粉酶变体包括具有增强的热稳定性的变体：G137A和G139A(Chen等，1996，Prot.Eng.9，499-505)；D257E和D293E/Q(Chen等，1995，Prot.Eng.8，575-582)；N182(Chen等，1994，Biochem.J.301，275-281)；二硫键，A246C(Fierobe等，1996，Biochemistry，35，8698-8704；和在位置A435和S436引入Pro残基(Li等(1997)，Protein Eng.10，1199-1204。
其它葡糖淀粉酶包括罗耳阿太菌(先前表示为罗耳伏革菌(Corticium rolfsii))葡糖淀粉酶(参见美国专利no.4,727,026和(Nagasaka，Y.等，1998，“Purification andproperties of the raw-starch-degrading glucoamylases from Corticium rolfsii，ApplMicrobiol Biotechnol 50：323-330)，踝节菌属(Talaromyces)葡糖淀粉酶，具体而言源自埃默森踝节菌(Talaromyces emersonii)(WO 1999/28448)、Talaromycesleycettanus(美国专利no.Re.32,153)、杜邦踝节菌(Talaromyces duponti)、嗜热踝节菌(Talaromyces thermophilus)(美国专利no.4,587,215)。
涵盖的细菌葡糖淀粉酶包括来自梭菌属，特别是热解淀粉梭菌(C.thermoamylolyticum)(EP 135，138)和热硫化氢梭菌(C.thermohydrosulfuricum)(WO 1986/01831)以及WO 2006/069289(将其通过提述并入本文)中公开的瓣环栓菌(Trametes cingulata)的葡糖淀粉酶。
根据本发明还涵盖杂合葡糖淀粉酶。杂合葡糖淀粉酶的例子在WO2005/045018中公开。具体例子包括WO 2005/045018的实施例1的表1和4中公开的杂合葡糖淀粉酶，将其通过提述以其教导杂合葡糖淀粉酶的程度并入本文。
还涵盖与任何上述葡糖淀粉酶展现高同一性的葡糖淀粉酶，即，与成熟酶序列多于70％，多于75％，多于80％，多于85％，多于90％，多于95％，多于96％，多于97％，多于98％，多于99％或甚至100％的同一性。
商业上可得到的包含葡糖淀粉酶的组合物包括AMG 200L；AMG 300L；SANTM SUPER、SANTM EXTRA L、SPIRIZYMETM PLUS、SPIRIZYMETMFUEL、SPIRIZYMETM B4U和AMGTM E(来自NovozymesA/S)；OPTIDEXTM300(来自Genencor Int.)；AMIGASETM和AMIGASETM PLUS(来自DSM)；G-ZYMETM G900、G-ZYMETM和G990ZR(来自Genencor Int.)。
在一个实施方案中葡糖淀粉酶可以以0.02-20AGU/g DS，优选0.1-10AGU/g DS，特别是1-5AGU/g DS，如0.5AGU/g DS的量加入。
β-淀粉酶
术语“β-淀粉酶”(E.C 3.2.1.2)在传统上是给予外切作用的产麦芽糖淀粉酶的名称，其催化直链淀粉、支链淀粉和相关葡萄糖聚合物中1，4-α-糖苷键的水解。麦芽糖单元以逐步的方式从非还原性链末端连续去除，直到分子得到降解，或者在支链淀粉的情况下，直到到达分支点。释放的麦芽糖具有β异头构型，因此称作β-淀粉酶。
已经从多种植物和微生物中分离了β-淀粉酶(W.M.Fogarty和C.T.Kelly，Progress in Industrial Microbiology，vol.15，112-115页，1979)。这些β-淀粉酶的特征为具有范围在40℃-65℃的最佳温度和范围在4.5-7的最佳pH。商业上可得到的来自大麦的β-淀粉酶是来自Novozymes A/S，Denmark的NOVOZYMTMWBA和来自Genencor Int.，USA的SPEZYMETM BBA 1500。
产麦芽糖淀粉酶
淀粉酶也可以是产麦芽糖α-淀粉酶。产麦芽糖α-淀粉酶(葡聚糖1，4-α-麦芽糖水解酶(glucan 1，4-α-maltohydrolase)，E.C.3.2.1.133)能够将直链淀粉和支链淀粉水解成α-构型的麦芽糖。来自嗜热脂肪芽孢杆菌菌株NCIB 11837的产麦芽糖淀粉酶商业上可以从NovozymesA/S得到。产麦芽糖α-淀粉酶记载于美国专利Nos.4,598,048、4,604,355和6,162,628中，将它们通过提述并入。
在一个优选的实施方案中，产麦芽糖淀粉酶可以以0.05-5mg总蛋白/克DS或0.05-5MANU/g DS的量加入。
蛋白酶
蛋白酶可以在水解过程中同步(in step)加入，在发酵过程中同步加入，或在同时水解和发酵过程中加入。蛋白酶可以在发酵过程中加入以防止发酵生物特别是酵母絮凝。蛋白酶可以是任何蛋白酶。在一个优选的实施方案中，蛋白酶是微生物来源的，优选真菌或细菌来源的酸性蛋白酶。优选酸性真菌蛋白酶，但是也可以使用其它蛋白酶。
合适的蛋白酶包括微生物蛋白酶，如真菌和细菌蛋白酶。优选蛋白酶是酸性蛋白酶，即，特征为能够在低于pH 7的酸性条件下水解蛋白质的蛋白酶。
涵盖的酸性真菌蛋白酶包括源自曲霉属、毛霉属(Mucor)、根霉属(Rhizopus)、假丝酵母属、革盖菌属(Coriolus)、内座壳属(Endothia)、虫霉属(Enthomophtra)、耙齿菌属(Irpex)、青霉属(Penicillium)、丝核菌属(Sclerotium)和球拟酵母属(Torulopsis)。特别涵盖的是源自黑曲霉(参见，例如，Koaze等，1964，Agr.Biol.Chem.Japan，28，216)、斋藤曲霉(Aspergillus saitoi)(参见，例如，Yoshida，1954，J.Agr.Chem.Soc.Japan，28，66)、泡盛曲霉(Hayashida等，1977，Agric.Biol.Chem.，42(5)，927-933)、棘孢曲霉(WO 1995/02044)或米曲霉的蛋白酶，如pepA蛋白酶；和来自微小毛霉(Mucorpusillus)或米黑毛霉(Mucor miehei)的酸性蛋白酶。
还涵盖中性或碱性蛋白酶，如源自芽孢杆菌属菌株的蛋白酶。本发明涵盖的具体蛋白酶源自解淀粉芽孢杆菌并具有可在Swissprot以登录号P06832获得的序列。还涵盖与可在Swissprot以登录号P06832获得的氨基酸序列具有至少90％同一性，如至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或特别是至少99％同一性的蛋白酶。
还涵盖与WO 2003/048353中作为SEQ ID NO：1公开的氨基酸序列具有至少90％同一性，如至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或特别是至少99％同一性的蛋白酶。
还涵盖木瓜蛋白酶-样蛋白酶，如E.C.3.4.22.*(半胱氨酸蛋白酶)中的蛋白酶，如EC 3.4.22.2(木瓜蛋白酶)、EC 3.4.22.6(木瓜凝乳蛋白酶(chymopapain))、EC 3.4.22.7(萝藦蛋白酶(asclepain))、EC 3.4.22.14(猕猴桃蛋白酶(actinidain))、EC 3.4.22.15(组织蛋白酶L)、EC 3.4.22.25(甘氨酰内肽酶)和EC 3.4.22.30(番木瓜蛋白酶(caricain))。
在一个实施方案中，蛋白酶是源自曲霉属(如米曲霉)的菌株的蛋白酶制备物。在另一实施方案中，蛋白酶源自根毛霉属菌株，优选曼赫根毛霉。在另一涵盖的实施方案中，蛋白酶是蛋白酶制备物，优选源自曲霉属(如米曲霉)菌株的蛋白水解性制备物和源自根毛霉属(优选曼赫根毛霉)菌株的蛋白酶的混合物。
天冬氨酸蛋白酶记载于，例如，Hand-book of Proteolytic Enzymes，由A.J.Barrett，N.D.Rawlings和J.F.Woessner编，Aca-demic Press，San Diego，1998，第270章)。天冬氨酸蛋白酶的合适例子包括，例如，R.M.Berka等，Gene，96，313(1990))；(R.M.Berka等，Gene，125，195-198(1993))；和Gomi等，Biosci.Biotech.Biochem.57，1095-1100(1993)中公开的那些，将这些文献通过提述并入。
商业上可得到的产品包括
Figure BDA0000044426790000251
ESPERASETM、FLAVOURZYMETM、PROMIXTM、
Figure BDA0000044426790000252
NOVOZYMTM FM 2.0L和NOVOZYMTM 50006(可从Novozymes A/S，Denmark获得)和来自Genencor Int.，Inc.，USA的GC106TM和SPEZYMETM FAN。
所述蛋白酶可以以0.0001-1mg酶蛋白每g DS，优选0.001-0.1mg酶蛋白每g DS的量存在。或者，所述蛋白酶可以以0.0001-1LAPU/g DS，优选0.001-0.1LAPU/g DS和/或0.0001-1mAU-RH/g DS，优选0.001-0.1mAU-RH/g DS的量存在。
本申请描述和要求保护的发明的范围不受本文公开的具体实施方案的限制，因为这些实施方案旨在说明本发明的数个方面。任何等同的实施方案以及所述实施方案中一种或多种的组合意欲在本发明的范围内。根据上文的描述，除本文所示和描述的修饰之外对本发明的多种修饰对于本领域技术人员会是显而易见的。这些修饰也意欲落入所附权利要求的范围内。
此处引用了多篇文献，将它们公开的内容通过提述以整体并入。通过以下实施例进一步描述本发明，不应将这些实施例理解为对本发明范围的限制。例如，涵盖常规修饰以优化根据本发明的活性炭产生。
材料和方法
材料
纤维素酶制备物A：包含WO 2005/074656中公开的具有纤维素分解增强活性的多肽(GH61A)；β-葡糖苷酶(WO 2008/057637中公开的融合蛋白)和源自里氏木霉的纤维素分解酶制备物的纤维素分解组合物。纤维素酶制备物A公开在共同未决的(co-pending)申请PCT/US2008/065417中。
-未经洗涤的经预处理的玉米秸秆(PCS)：经酸催化，经蒸汽爆炸处理，获得自The National Renewable Energy Laboratory，Golden，CO。
方法
同一性测定
两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性通过参数“同一性”来描述。
两个氨基酸序列之间的同一性程度可以通过Clustal方法(Higgins，1989，CABIOS 5：151-153)使用LASERGENETM MEGALIGNTM软件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)及同一性表和以下多重比对参数来测定：缺口罚分为10且缺口长度罚分为10。配对比对参数为K元组(Ktuple)＝1，缺口罚分＝3，窗口＝5和对角线＝5。
两个核苷酸序列之间的同一性程度可以通过Wilbur-Lipman方法(Wilbur和Lipman，1983，Proceedings of the National Academy of Science USA 80：726-730)使用LASERGENETM MEGALIGNTM软件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)及同一性表和以下多重比对参数来测定：缺口罚分为10且缺口长度罚分为10。配对比对参数为K元组＝3，缺口罚分＝3，而窗口＝20。
从残余固形物制备活性炭
炭是通过从500g PCS水解反应中经由离心和/或用过滤来回收残余固形物而制备的。可以用自来水洗涤所述残余固形物，但这不是必需的。将所述残余固形物全部装填到10mL坩埚中，并且将所述带有压紧的残余固形物的坩埚颠倒并置于更大的坩埚碗(crucible bowl)中。将所述坩埚和碗中的固形物置于300-600℃的带通风的烘箱中过夜。从坩埚中取出炭样品，并用研钵和杵进行精磨。
实施例
实施例1
经解毒的PCS水解物中的纤维素转化
将经预处理的玉米秸秆用自来水稀释成15％总固形物(TS)并通过过滤收集液相并保留PCS固形物。通过将PCS液与10％w/w活性炭(Fisher Scientific)或NZ活性炭混合来解毒PCS液，并在室温、在150rpm搅拌下温育过夜。洗涤PCS固形物直到所得滤出液达到中性pH。将经洗涤的PCS固形物用自来水稀释成8％TS并且将所得的8％TS溶液与等体积的经解毒或未经处理的PCS液混合，产生4％TS底物溶液。向底物溶液加入4mg酶蛋白/g纤维素的纤维素酶制备物A并且在50℃温育48-72小时。在0h、5h、24h、48h和72h通过Trinder氏葡萄糖测定法(Trinder，P.，Ann.Clin.Biochem.，6，24(1969))测量葡萄糖浓度，并在0h和72h通过HPLC测定。计算相对于最大理论葡萄糖产量(yield)的实际葡萄糖百分比作为每种样品的纤维素转化百分比。结果总结在图1(Fisher Scientific)和2(NZ活性炭)中。

Claims (10)

1.一种从含木素纤维素材料残余固形物产生活性炭的方法，其中所述方法包括：
i)预处理含木素纤维素材料；
ii)水解经预处理的含木素纤维素材料；
iii)回收残余固形物；
iv)从所述残余固形物产生活性炭。
2.权利要求1的方法，其中所述活性炭产生自通过碳化或热解制备的炭。
3.权利要求1或2的方法，其中所述活性炭是通过物理方法活化的。
4.权利要求3的方法，其中所述物理方法是蒸汽爆炸。
5.权利要求1的方法，其中所述活性炭是通过同时碳化和活化制备的。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述方法进一步包括：
i)预处理含木素纤维素材料；
ii)水解经预处理的含木素纤维素材料；
iii)将残余固形物与可发酵糖液分离；
iv)回收残余固形物；
v)从所述残余固形物产生活性炭；
vi)回收所述可发酵糖液；
vii)使用发酵生物发酵所述可发酵糖液。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述方法进一步包含：
i)预处理含木素纤维素材料；
ii)使用活性炭解毒所述经预处理的含木素纤维素材料；
iii)水解经预处理的含木素纤维素材料；
iv)将残余固形物与可发酵糖液分离；
v)回收残余固形物；
vi)从所述残余固形物产生活性炭；
vii)回收所述可发酵糖液；
viii)使用发酵生物发酵所述可发酵糖液。
8.权利要求7的方法，其中所述经预处理的含木素纤维素材料的液相和固相是在解毒步骤ii)之前分离的。
9.权利要求8的方法，其中在解毒步骤中使用活性炭解毒所述经预处理的含木素纤维素材料的液相，并且将去除了所述炭的所述经解毒的液相在水解步骤之前与所述固相重新组合。
10.权利要求7的方法，其中所述活性炭产生自含木素纤维素材料的残余固形物。
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