CN103717759A

CN103717759A - 糖液的制造方法

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Publication number: CN103717759A
Application number: CN201280036546.1A
Authority: CN
Inventors: 南野淳; 栗原宏征; 山田胜成
Original assignee: Toray Industries Inc
Current assignee: Toray Industries Inc
Priority date: 2011-07-29
Filing date: 2012-07-27
Publication date: 2014-04-09
Anticipated expiration: 2032-07-27
Also published as: RU2014107687A; AU2012291169B9; BR112014002091A2; AU2012291169B2; US20140178937A1; JPWO2013018694A1; US9163294B2; RU2597199C2; EP2749656A1; JP6007791B2; EP2749656B1; WO2013018694A1; AU2012291169A1; CA2842151C; DK2749656T3; CA2842151A1; CN103717759B; MY166315A; ES2567325T3; EP2749656A4

Abstract

使通过将含纤维素的生物质进行水解而获得的糖水溶液通过截留分子量600～2,000的超滤膜进行过滤，在透过侧除去发酵抑制物质，从非透过侧回收糖液，从而可制造发酵抑制物质量极其少的糖液。

Description

糖液的制造方法

技术领域

本发明涉及由含纤维素的生物质制造糖液的方法。

背景技术

以糖为原料的化学品的发酵生产工艺被应用于各种工业原料的生产中。作为成为该发酵原料的糖，目前在工业上使用着源自甘蔗、淀粉、甜菜等食用原料的糖，但是考虑到今后世界人口增加会导致食用原料价格高涨，或者考虑到与食用进行竞争这样的伦理性方面，因而今后的课题是构筑如下工艺：有效率地由可再生的非食用资源即含纤维素的生物质制造糖液的工艺、或者将所获得的糖液作为发酵原料从而有效率地转换为工业原料的工艺。

作为由生物质获得糖的现有技术，通常已知有如下方法：使用浓硫酸将生物质中的纤维素、半纤维素水解至以葡萄糖、木糖为代表的单糖的方法(专利文献1、2)，在实施了提高生物质的反应性的前处理之后，利用酶反应进行水解的方法(专利文献3、4)。在该情况下，在含纤维素的生物质的水解方面存在有如下问题：在进行纤维素或者半纤维素成分等的分解的同时，也进行所生成的葡萄糖、木糖等糖的分解物反应，也生成糠醛、羟基甲基糠醛等呋喃化合物或者甲酸、乙酸等有机酸这样的副产物。这些化合物在利用微生物进行的发酵工序中起到抑制性作用，引发微生物的增殖抑制，降低发酵产物的收率，因而被称为发酵抑制物质，在利用源自含纤维素的生物质的糖液作为发酵原料时造成大问题。作为在糖液制造过程中除去这样的发酵抑制物质的方法，已知有利用纳滤膜和/或反渗透膜将发酵抑制物质除去的方法(专利文献5)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特表平11-506934号公报

专利文献2：日本特开2005-229821号公报

专利文献3：日本特开2001-95594号公报

专利文献4：日本特许第3041380号公报

专利文献5：WO2010/067785号

发明内容

发明所要解决的课题

本发明人发现了，如前述那样在利用纳滤膜、反渗透膜将源自含纤维素的生物质的糖液中所含的发酵抑制物质除去时，存在有不能将发酵抑制物质全部除去的情况，推定其原因是，在源自含纤维素的生物质的糖液中可能包含不易通过纳滤膜、反渗透膜而除去的未鉴定的发酵抑制物质。本发明的课题在于提供一种糖液的制造方法，是从源自含纤维素的生物质的糖液中除去不易通过以往的方法除去的发酵抑制物质，从而制造出发酵抑制物质量极其少的糖液的方法。

用于解决问题的方案

本发明人对上述课题进行了深入研究，结果发现如下事实，从而完成了本发明：作为在由含纤维素的生物质制造糖液的工序中生成的发酵抑制物质，新鉴定出包含香豆酸、阿魏酸、松柏醛、2,3-二氢苯并呋喃这样的具有与单糖同等的分子量或者分子量大的物质，并且可通过超滤膜将它们有效率地除去。

即，本发明包含以下的[1]～[6]。

[1]一种糖液的制造方法，其特征在于，是以含纤维素的生物质作为原料来制造糖液的方法，其包含如下工序：

工序(1)：将含纤维素的生物质进行水解，制造糖水溶液的工序，

工序(2)：使由工序(1)获得的糖水溶液通过截留分子量600～2,000的超滤膜进行过滤，在透过侧除去发酵抑制物质，从非透过侧回收糖液的工序。

[2]根据[1]所述的糖液的制造方法，其特征在于，前述发酵抑制物质包含选自香豆酸、阿魏酸以及2,3-二氢苯并呋喃中的一种或者二种以上。

[3]根据[1]或者[2]所述的糖液的制造方法，其特征在于，在前述工序(2)中，将糖水溶液调整为pH5以下进行过滤。

[4]根据[1]至[3]所述的糖液的制造方法，其特征在于，前述工序(2)中使用的超滤膜的功能层的材质是聚醚砜。

[5]根据[1]至[4]中任一项所述的糖液的制造方法，其特征在于，其包含如下工序：使由工序(2)获得的糖液和/或包含发酵抑制物质的透过液通过纳滤膜和/或反渗透膜进行过滤，从非透过侧回收浓缩糖液的工序。

[6]一种化学品的制造方法，其特征在于，使用通过[1]至[5]中任一项所述的糖液的制造方法而获得的糖液作为发酵原料。

发明的效果

根据本发明可以以高纯度·高收率制造含有葡萄糖、木糖等糖的糖液。其结果，通过使用由本发明获得的精制糖液作为发酵原料，可提高各种化学品的发酵生产的效率。

附图说明

图1为利用超滤膜或者纳滤膜将通过含纤维素的生物质的稀硫酸处理而获得的糖水溶液进行浓缩而得到的糖液的、以葡萄糖消耗速度为指标的发酵试验结果。

图2为利用超滤膜或者纳滤膜将通过含纤维素的生物质的蒸煮爆碎处理而获得的糖水溶液进行浓缩而得到的糖液的、以葡萄糖消耗速度为指标的发酵试验结果。

图3为对于通过含纤维素的生物质的水热处理而获得的糖水溶液，将超滤膜的透过液进行膜浓缩，从而提高了以木糖消耗速度为指标的发酵性的结果。

图4为将含纤维素的生物质的通过稀硫酸而获得的硫酸水溶液通过超滤膜，将所获得的透过液进行膜浓缩，从而提高了以木糖消耗速度为指标的发酵性的结果。

具体实施方式

[工序(1)]

本发明中的含纤维素的生物质是指，包含5重量％以上纤维素的源自生物的资源。具体而言，作为例子可列举出蔗渣、柳枝稷、象草、蔗茅、玉米秸秆、稻秸、麦秸等草本系生物质，树木、废建材等木质系生物质等。这些含纤维素的生物质由于含有作为芳香族高分子的木质素以及纤维素、半纤维素，因而也被称作木质纤维素。通过将含纤维素的生物质中所含的作为多糖成分的纤维素、半纤维素进行水解，从而可获得包含可用作制造化学品用发酵原料的单糖的糖液，具体而言可获得以木糖以及葡萄糖为主要成分的糖液。

关于含纤维素的生物质的水解处理，具体而言，作为化学处理方法，列举出由高温高压的稀硫酸、亚硫酸盐等进行处理的酸处理，用氢氧化钙、氢氧化钠等碱性水溶液进行处理的碱处理，用液氨或氨气或氨水溶液进行处理的氨处理，由加压热水进行处理的水热处理。另外，在这些水解处理的基础上还可进行基于糖化酶的水解处理。

一般而言，酸处理具有将木质素溶解，进一步先从结晶性低的半纤维素成分发生水解，接着将结晶性高的纤维素成分分解这样的特征，因而可获得含有大量源自半纤维素的木糖的液体。另外，处理次数没有特别限定，但是通过设定2阶段以上的酸处理工序，从而可选择性地设定适于半纤维素、纤维素的水解条件，可提高分解效率以及糖收率。酸处理中使用的酸只要是引起水解的酸则没有特别限定，但是从经济性的观点考虑优选为硫酸。酸的浓度优选为0.1～100重量％，更优选为0.5～15重量％。可将反应温度设定为100～300℃的范围，将反应时间设定为1秒～60分钟的范围。在酸处理后的液体成分中大量地包含以由水解获得的源自半纤维素的成分为主要成分的单糖及其寡糖。特别是如果由50％以上、更优选80％以上的浓硫酸发挥作用，则可将半纤维素、纤维素一起水解并且也可通过一个阶段进行水解处理。另外，在酸处理后利用糖化酶进一步水解的情况下，可将在酸处理后获得的固体成分与液体成分分开而分别进行，也可在混合了固体成分与液体成分的状态下进行。另外，由于在通过酸处理而获得的固体成分以及液体成分中包含使用过的酸，因此为了进行基于糖化酶的水解反应，优选预先将酸处理物进行中和。

碱处理是利用碱水溶液具体而言利用氢氧化物盐(但是，除了氢氧化铵以外)的水溶液将含纤维素的生物质进行反应的处理方法。通过碱处理，可主要地除去对纤维素、半纤维素的基于糖化酶的反应进行阻碍的木质素。作为所使用的氢氧化物盐，优选为氢氧化钠或氢氧化钙。碱水溶液的浓度优选为0.1～60重量％的范围，将其添加于含纤维素的生物质中，通常在100～200℃处理，优选在110～180℃的温度范围处理。处理次数没有特别限定，也可进行1次或多次。进行二次以上的情况下，也可在不同的条件下实施各次的处理。另外，由于利用碱处理而获得的前处理物中包含碱，因而在进一步利用糖化酶进行水解的情况下优选预先进行中和。

氨处理是使氨水溶液或者100％氨(液体或气体)与源自纤维素的生物质反应的处理方法，例如，可使用日本特开2008-161125或日本特开2008-535664中记载的方法。可以说，在氨处理中，通过使氨与纤维素成分反应，使得纤维素的结晶性发生崩溃，从而大幅提高与糖化酶的反应效率。通常，按照相对于含纤维素的生物质成为0.1～15重量％的范围的浓度的方式将氨添加于含纤维素的生物质中，在4～200℃优选在60～150℃进行处理。处理次数没有特别限定，也可进行1次或多次。另外，将通过氨处理获得的前处理物进一步进行基于糖化酶的水解反应的情况下，优选预先进行氨的中和或氨的除去。

水热处理是利用100～400℃的加压热水将含纤维素的生物质处理1秒～60分钟的方法。通常，按照处理后的在25℃的常温下不溶于水的含纤维素的生物质相对于含纤维素的生物质与水的合计总重量为0.1～50重量％的浓度的方式进行。压力依赖于处理温度因而没有特别限定，但是优选为0.01～10MPa。另外，在水热处理中根据加压热水的温度而使得向热水溶出的溶出成分不同。一般而言，如果升高加压热水的温度，则从含纤维素的生物质中最先流出单宁、木质素的第1组，接着在140～150℃以上时流出半纤维素的第2组，进一步在超过约230℃时则流出纤维素的第3组。另外，也有时会在流出的同时引起半纤维素、纤维素的水解反应。利用因加压热水的温度而导致的流出成分的不同，提高糖化酶相对于纤维素、半纤维素的反应效率，因而也可改变处理温度而进行多阶段的处理。此处，在通过水热处理而获得的组分之中，将包含溶出到加压热水中的成分的水溶物称为热水可溶部分，将除去了热水可溶部分的部分称为热水不溶部分。

热水不溶部分是：溶出了很多的木质素和半纤维素成分结果获得的、主要包含二糖以上的纤维素(C6)成分的固体成分。除了主要成分的纤维素之外，还有时会包含半纤维素成分、木质素成分。它们的含有比率根据水热处理的加压热水的温度、处理生物质的种类而变化。热水不溶部分的含水率为10％至90％，更优选为20％至80％。

热水可溶部分是包含溶出到液体状态或浆料状态的加压热水中的半纤维素、木质素、单宁、一部分纤维素成分的水溶物，是液体状态或浆料状态。在热水可溶部分中大量含有水解得到的多糖、寡糖、单糖。可将它们直接用作糖水溶液，或者利用糖化酶进一步水解而用作糖水溶液。

另外，在前述水解处理方法之前，也可实施如下前处理：使用切碎机(cutter mill)、锤磨机(hammer mill)等机械性地切断纤维的粉碎处理，利用球磨机、喷射磨机等进行的微粉碎处理，利用研磨机进行的湿式处理，机械化学处理，利用水蒸汽进行短时间蒸煮并且在瞬间将压力开放而通过体积膨胀进行粉碎的蒸煮爆碎处理等。这是因为，通过粉碎而增加纤维素、半纤维素的露出面积，从而提高基于糖化酶的水解反应的效率。

糖化酶如果是具有纤维素或者半纤维素分解活性的酶则没有特别限制，但优选属于木霉属的丝状菌所产生的糖化酶。木霉属丝状菌是在细胞外分泌多种糖化酶的微生物，优选为源自里氏木霉(Trichoderma reesei)的糖化酶。另外也优选：除了包含具有纤维素或者半纤维素分解活性的酶之外，还包含对纤维素或半纤维素的分解进行辅助的酶。作为对纤维素或半纤维素的分解进行辅助的酶，可例示出：纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β葡糖苷酶、木聚糖酶、木糖苷酶、生物质溶胀酶等。使用糖化酶进行的水解反应优选在pH为3～7的附近进行，更优选在pH5附近。反应温度优选为40～70℃。另外，优选在基于酶的水解结束时进行固液分离，除去未分解的固体成分。作为除去固体成分的方法，存在有离心分离法、膜分离法等，没有特别限定。另外，也可将多种这样的固液分离进行组合而使用。

对于由工序(1)获得的糖水溶液，为了防止工序(2)中的超滤膜的堵眼、污损，优选在供给于工序(2)之前事先除去固体成分、寡糖、多糖、单宁、糖化酶、源自生物质的蛋白质成分等水溶性高分子。除去这些成分的方法没有特别限制，但是作为优选的除去方法，列举出：使糖水溶液通过精密过滤膜和/或截留分子量大于2,000的超滤膜进行过滤，从而在非透过侧过滤分离出固体成分、水溶性高分子的方法。优选除去。作为过滤的方法，存在有压滤、真空过滤、离心过滤等，没有特别限定。另外，作为过滤操作，大致划分为恒压过滤、恒流量过滤、非恒压非恒流量过滤，没有特别限定。另外，作为过滤操作，为了有效率地除去固体成分，也可使用二次以上的精密过滤膜或者截留分子量大于2,000的超滤膜的多阶段性过滤。

精密过滤膜是指平均细孔径为0.01μm～5mm的膜，被简称为微过滤膜、MF膜等，在除去糖水溶液中所含的固体成分时优选使用。此处所使用的精密过滤膜可以是无机膜也可以是有机膜，列举出纤维素、纤维素酯、聚砜、聚醚砜、氯化聚乙烯、聚丙烯、聚烯烃、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸甲酯、聚偏二氟乙烯、聚四氟乙烯等有机材料，或者不锈钢等金属，或者陶瓷等无机材料。

超滤膜是指在后述的工序(2)中详述的超滤膜，通过使用截留分子量大于2,000的超滤膜，在除去糖水溶液中所含的水溶性高分子特别是糖化酶时优选使用。

[工序(2)]

已知，在工序(1)中将含纤维素的生物质进行了水解的情况下，除了生成糖之外还生成发酵抑制物质。发酵抑制物质是指通过含纤维素的生物质的水解而生成的化合物，并且在用于以糖液为原料制造化学品的发酵工序中，具有引起化学品的生产量、蓄积量、或者生产速度的降低现象的作用的物质。关于由发酵抑制物质导致的发酵抑制的程度，根据糖水溶液中存在的发酵抑制物质的种类、以及它们的量，微生物所受到的抑制的程度也不同，另外根据所使用的微生物种、或者作为其生产物的化学品的种类，其抑制的程度也不同，因而在本发明中特别没有限定。

一直以来，乙酸、甲酸等有机酸、糠醛、羟基甲基糠醛(HMF)等呋喃系化合物、香草醛、4-羟基苯甲酸等酚系化合物作为发酵抑制物质而被人们所知，但本发明人发现了，除了一直以来所知晓的发酵抑制物质之外，香豆酸、阿魏酸、2,3-二氢苯并呋喃等也成为发酵抑制物质。因而，工序(2)的特征在于，通过使由工序(1)获得的糖水溶液通过特定的截留分子量的超滤膜进行过滤，从而在透过侧除去发酵抑制物质，从非透过侧回收糖液。

本说明书中所说的超滤膜是指截留分子量为600～200,000的分离膜，被简称为超滤膜(ultrafiltration membrane)、UF膜等。另外，关于截留分子量，如在日本膜学会编的膜学实验系列第III卷人工膜编编集委员/木村尚史·中尾真一·大矢晴彦·仲川勤(共立出版、1993年)92页中记载的“以溶质的分子量为横轴，以阻止率为纵轴，将数据进行曲线绘制，将所得到的曲线称为截留分子量曲线。而且，将阻止率成为90％的分子量称为膜的截留分子量。”所写那样，作为显示超滤膜的膜性能的指标而为本领域技术人员所周知。另外，在分离膜的技术领域中，人们认为截留分子量为600～1,000的范围的分离膜是纳滤膜与超滤膜的分界区域，因而根据文献，也存在有将截留分子量处于600～1,000的范围的分离膜称为纳滤膜的情况，也存在有称为超滤膜的情况。在本说明书中，将截留分子量处于600～200,000的范围的分离膜称为超滤膜，将截留分子量小于600并且与通常定义为“使一价离子透过并且将二价离子阻止的膜”的膜相适用的膜称为纳滤膜。

本发明的特征在于使用截留分子量600～2,000的超滤膜。在截留分子量大于2,000的超滤膜的情况下，糖的大部分和发酵抑制物质都穿出到透过侧，另外，在截留分子量小于600的膜时，则作为新鉴定出的发酵抑制物质的香豆酸、阿魏酸、2,3-二氢苯并呋喃除去到透过侧的除去性能降低，因而不优选。

超滤膜的材质没有特别限定，但列举出纤维素、纤维素酯、聚砜、磺化聚砜、聚醚砜、磺化聚醚砜、氯化聚乙烯、聚丙烯、聚烯烃、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸甲酯、聚偏二氟乙烯、聚四氟乙烯等有机材料，不锈钢等金属，或陶瓷等无机材料。其中考虑到疏水性物质的除去性，优选为有机性的膜。其中优选聚醚砜。这是因为判明了，聚醚砜的膜将所希望的糖与发酵抑制物质分离的分离性能良好。进一步优选为磺化聚醚砜。这是因为，与没有磺化的情况相比糖的阻止率变高。

所使用的超滤膜的形态没有特别限定，可以为螺旋型、中空纤维型、管型、平膜型中的任一个。

作为在本发明中使用的超滤膜的具体例子，列举出DESAL公司的G-5型、GH型、GK型，Synder公司的SPE1，KOCH公司制的PM1000、PM2000、MPS-36、SR2，Alfalaval制GR95Pp、ETNA01PP，日东电工株式会社制的NTR-7450(截留分子量600～800、参照WaterResearch37(2003)864-872。)、NTR-7410(截留分子量1,000～2,000、参照卫生工学讨论会论文集，5：246-251(1997)。)等。

前述超滤膜的过滤处理中的过滤压也依存于糖水溶液的浓度，但优选为0.1MPa以上8MPa以下的范围。过滤压如果低于0.1MPa则存在有膜透过速度降低的可能，如果高于8MPa则存在有对膜的损伤造成影响的可能。另外，如果是0.5MPa以上6MPa以下则膜透过通量高，因而可有效率地使糖溶液透过，因此更优选。

前述超滤膜的过滤处理中的膜透过通量优选为0.2m/D以上4.0m/D以下。这是因为，为0.2m/D以下时，则无法进行超滤膜的浓缩，为2.0m/D以下时，则膜的污损变显著。另外，如果是0.5m/D以上2.0m/D以上，则容易进行基于超滤膜的过滤，因此更优选。

前述超滤膜的过滤处理中的糖水溶液的pH没有特别限定，但是从发酵抑制物质的透过性的观点考虑，优选为pH5以下，更优选为pH4以下。另外，pH为1以下时则在调整pH时需要大量的酸，因而从经济性的观点来看优选将pH的下限值设为1。关于糖水溶液的pH调整，特别是在包含香豆酸、阿魏酸这样的芳香族化合物并且具有羧酸基的物质作为发酵抑制物质的情况下效果是显著的。

关于前述超滤膜的过滤处理中从非透过侧回收的糖液，可直接用作后述的发酵工序的原料，另外，也可将该糖液进一步供于WO2010/067785号中记载的基于纳滤膜和/或反渗透膜的过滤处理而在非透过侧将糖进行浓缩，然后将该浓缩糖液用作后述的发酵工序的原料。

另外，在前述超滤膜的过滤处理中，存在有糖在透过侧损失一部分的情况，但在该情况下，可将从透过侧回收的包含发酵抑制物质的透过液供于WO2010/067785号中记载的基于纳滤膜和/或反渗透膜的过滤处理，从而从非透过侧回收浓缩糖液。利用本工序获得的浓缩糖液也用作后述的发酵工序的原料。另外，关于通过基于纳滤膜和/或反渗透膜的过滤处理而获得的浓缩糖液，在预先由截留分子量为600～2,000的超滤膜进行了过滤处理的情况下，与没有进行过滤处理的情况下、由截留分子量超过2,000的超滤膜进行了过滤处理的情况相比，也确认有后述的发酵工序中的发酵性能提高的倾向。可认为这是因为，在源自含纤维素的生物质的糖水溶液中包含微量的分子量2,000附近的未知的发酵抑制物质，其利用纳滤膜、反渗透膜而被浓缩。

[发酵工序]

由工序(2)获得的糖液中包含有可以以代谢产物的方式制造化学品的微生物或者培养细胞的生长用的碳源即葡萄糖和/或木糖，另一方面，香豆酸、阿魏酸、2,3-二氢苯并呋喃等发酵抑制物质的含量极其少，因此可有效地用作用于制造化学品的发酵原料，特别是用作碳源。发酵工序可按照WO2010/067785号中记载的发酵工序而实施。

作为通过发酵工序获得的化学品，如果是上述微生物、培养细胞在培养液中生产的物质则没有限制，作为具体例子，可列举醇、有机酸、氨基酸、核酸等在发酵工业中大量生产的物质。例如，作为醇，可列举乙醇、丁醇、1,3-丙二醇、2,3-丁二醇、1,4-丁二醇、丙三醇等，作为有机酸，可列举乙酸、乳酸、丙酮酸、琥珀酸、苹果酸、衣康酸、柠檬酸，如果是核酸，则可列举肌苷、鸟苷等核苷，肌苷酸、鸟苷酸等核苷酸，以及尸胺等二胺化合物。另外，本发明也可适用于生产酶、抗生物质、重组蛋白这样的物质。

实施例

(参考例1)单糖浓度的测定方法

关于各实施例、比较例中所获得的糖液中所含的单糖浓度(葡萄糖浓度、木糖浓度)，在以下所示的条件下利用HPLC进行分析，通过与标准品的比较来定量。

柱：Luna NH₂(Phenomenex公司制)

流动相：超纯水：乙腈=25：75(流速0.6mL/min)

反应液：没有

检测方法：RI(差示折射率)

温度：30℃。

(参考例2)发酵抑制物质的浓度的测定方法

关于糖液中所含的发酵抑制物质之中的呋喃系发酵抑制物质(HMF、糠醛)以及酚系发酵抑制物质(香豆酸、阿魏酸、2,3-二氢苯并呋喃)的浓度，在以下所示的条件下利用HPLC进行分析，通过与标准品的比较来定量。

柱：Synergi HidroRP4.6mm×250mm(Phenomenex公司制)

流动相：乙腈-0.1重量％H₃PO₄(流速1.0mL/min)

检测方法：UV(283nm)

温度：40℃。

关于糖液中所含的发酵抑制物质之中的有机酸(乙酸、甲酸)，在以下所示的条件下利用HPLC进行分析，通过与标准品的比较来定量。

柱：Shim-Pack SPR-H与Shim-Pack SCR101H(株式会社岛津制作所制)的串联

流动相：5mM对甲苯磺酸(流速0.8mL/min)

反应液：5mM对甲苯磺酸、20mM Bistris、0.1mM EDTA·2Na(流速0.8mL/min)

检测方法：电导率

温度：45℃。

(参考例3)含纤维素的生物质的基于稀硫酸处理·酶处理的水解工序

作为含纤维素的生物质，使用了稻秸。将前述含纤维素的生物质浸于硫酸1％水溶液，在150℃进行了30分钟高压釜处理(日东高压制)。处理后，进行固液分离，分离为硫酸水溶液和硫酸处理纤维素。接着将硫酸处理纤维素以固体成分浓度成为10重量％的方式与稀硫酸处理液进行搅拌混合，然后利用氢氧化钠将pH调整为5附近。向该混合液中，添加源自里氏木霉的糖化酶即“Accellerase DUET”(Danisco Japan株式会社制)作为糖化酶，一边在50℃搅拌混同1天，一边进行了水解反应。其后，进行离心分离(3000G)，分离除去未分解纤维素或者木质素，获得了稀硫酸处理糖水溶液。进一步稀硫酸处理糖水溶液中所含的发酵抑制物质以及单糖的组成分别如表1～3所示。

表1

表1发酵抑制物质的定量1 单位[g/L]

	甲酸	乙酸	HMF	糠醛
					稀硫酸处理糖水溶液	0.1	2.4	0.125	0.875

表2

表2发酵抑制物质的定量2 单位[g/L]

	香豆酸	阿魏酸	2,3-二氢苯并呋喃
				稀硫酸处理糖水溶液	0.15	0.075	0.01

表3

表3单糖的定量单位[g/L]

	葡萄糖	木糖
			稀硫酸处理糖水溶液	25	12

(参考例4)含纤维素的生物质的基于蒸煮爆碎处理·酶处理的水解工序

作为含纤维素的生物质，使用了稻秸。将前述含纤维素的生物质100g投入2L蒸煮爆碎试验机(日本电热株式会社制)并投入蒸气，在2.5MPa保持2.5分钟将容器内一下子进行大气开放，进行爆碎处理并回收了样品。此时的容器内的温度为225℃。此时的处理物的含水率为84.4％。按照固体成分浓度成为10重量％的方式加入水并且添加1当量的氢氧化钠水溶液将pH调整为5.0，添加作为糖化酶的“Accellerase DUET”而保持在50℃进行搅拌而反应了1天。将所获得的糖水溶液的组成示于表4～6。

表4

表4发酵抑制物质的定量1 单位[g/L]

	甲酸	乙酸	HMF	糠醛
					蒸煮爆碎处理糖水溶液	1.7	2.3	0.29	0.24

表5

表5发酵抑制物质的定量2 单位[g/L]

	香豆酸	阿魏酸	2,3-二氢苯并呋喃
				蒸煮爆碎处理糖水溶液	0.15	0.11	0.08

表6

表6单糖的定量单位[g/L]

	葡萄糖	木糖
			蒸煮爆碎处理糖水溶液	34	5

(参考例5)含纤维素的生物质的基于氨处理·酶处理的水解工序

作为含纤维素的生物质，使用了稻秸。将前述含纤维素的生物质投入于小型反应器(耐压硝子工业制、TVS-N230ml)，利用液氮进行了冷却。向该反应器中流入浓度100％的氨气，将试样完全地浸没于100％的液氨。关上反应器的盖，在室温下放置了15分钟左右。接着，在150℃的油浴中处理了1小时。处理后，从油浴取出反应器，在通风装置(draft)中立刻泄漏前述氨气后，进一步用真空泵将反应器内抽真空至10Pa并且将前述含纤维素的生物质干燥。该处理含纤维素的生物质以固体成分浓度成为15重量％的方式与纯水搅拌混合，然后利用硫酸将pH调整为5附近。向该混合液中，添加“Accellerase DUET”作为糖化酶，一边在50℃搅拌混同3天，一边进行了水解反应。其后，进行离心分离(3000G)，获得了分离除去了未分解纤维素或者木质素的糖水溶液。进一步糖水溶液中所含的发酵抑制物质以及单糖的组成如表7～9所示。

表7

表7发酵抑制物质的定量1 单位[g/L]

	甲酸	乙酸	HMF	糠醛
					氨处理糖水溶液	1.1	0.5	0.012	0.005

表8

表8发酵抑制物质的定量2 单位[g/L]

	香豆酸	阿魏酸	2,3-二氢苯并呋喃
				氨处理糖水溶液	0.03	0.008	0.005

表9

表9单糖的定量单位[g/L]

	葡萄糖	木糖
			氨处理糖水溶液	40	24

(参考例6)含纤维素的生物质的基于水热处理·酶处理的水解工序

作为含纤维素的生物质，使用了稻秸。将前述含纤维素的生物质浸于水，一边搅拌一边在180℃进行了20分钟高压釜处理(日东高压株式会社制)。此时的压力为10MPa。在处理后，使用离心分离(3000G)将溶液成分与处理生物质成分进行了固液分离。溶液成分的pH为4.0。接着使用氢氧化钠将溶液成分调整为pH5.0，添加“Accellerase DUET”作为糖化酶，一边在50℃搅拌混同1天，一边进行水解反应从而获得了水热处理液。进一步水热处理液中所含的发酵抑制物质以及单糖的组成如表10～12所示。

表10

表10发酵抑制物质的定量1 单位[g/L]

	甲酸	乙酸	HMF	糠醛
					水热处理液	1.1	2.2	0.12	0.5

表11

表11发酵抑制物质的定量2 单位[g/L]

	香豆酸	阿魏酸	2,3-二氢苯并呋喃
				水热处理液	0.2	0.13	0.03

表12

表12单糖的定量单位[g/L]

	葡萄糖	木糖
			水热处理液	7	15

(参考例7)发酵的评价方法

使用酵母株(树干毕赤酵母(Pichia stipitis)、NBRC1687)进行了发酵试验。按照葡萄糖浓度为25g/L的方式稀释，然后按照成为表13的组成的方式加入添加物而调制培养基，进行过滤器灭菌(millipore、Stericup0.22μm)，将所得到的培养基用于发酵。培养条件为：接种量为0.5％，在28℃条件下以150rpm摇动烧瓶而培养了72小时。发酵抑制性根据酵母株的葡萄糖的消耗速度来评价。作为酵母株的葡萄糖的消耗速度的评价方法，在从培养开始起的16、24、40、48、64、72小时的时间点，在洁净台内在灭菌状态下将培养基成分取出，将该培养基进行离心分离，然后通过过滤器，利用参考例1记载的HPLC分析而进行了葡萄糖浓度的定量。

表13

组成	组成成分浓度
		葡萄糖	25g/L
酵母提取物(Bacto Yeast Extract)	10g/L
		胨	20g/L

(实施例1)

使用孔径0.08μm的精密过滤膜将参考例3记载的稀硫酸处理糖水溶液进行过滤，利用超滤膜将精密过滤膜的透过液进行了过滤处理。所使用的超滤膜使用了“NTR-7450”(日东电工株式会社制、材质：磺化聚醚砜、截留分子量：600～800)、“NTR-7410”(日东电工株式会社制、材质：磺化聚醚砜、截留分子量：1,000)、“SPE1”(Synder制、材质：聚醚砜、截留分子量：1,000)、GE OSMONICS制的GH系列(材质：聚乙二醇、截留分子量：1,000)、“GR95Pp”(Alfalaval制、材质：聚醚砜、截留分子量：2,000)、GE制的GK系列(材质：聚乙二醇、材质：2,000)。关于每个膜，分别准备1.5L的稀硫酸糖化液的精密过滤膜透过液，使用平膜过滤单元“SEPA-II”(GE OSMONICS制)，在膜面线速度20cm/秒、过滤压3MPa的条件下进行了过滤处理直至从非透过侧回收的液量成为0.5L。将结果示于表14。其结果判明了，虽然利用超滤膜处理将单糖浓缩，但是不仅没有浓缩低分子性的甲酸、乙酸、HMF、糠醛，而且也几乎没有浓缩香豆酸、阿魏酸、2,3-二氢苯并呋喃。另外，从由超滤膜的非透过液侧回收的糖液之中选出几种(A～C)，在参考例7的条件下进行了发酵试验。将结果示于图1。

(比较例1)

对于与实施例1同样的过滤处理，使用截留分子量相比于实施例1而言高的作为超滤膜的“SPE3”(Synder制、材质：聚醚砜、截留分子量：3,000)、作为纳滤膜的“UTC-60”(Toray株式会社制、材质：哌嗪聚酰胺)、HL系列(GE OSMONICS制、材质：复合膜)、DK系列(GE OSMONICS制、材质：复合膜)而进行了过滤试验。将结果示于表14。判明了，在使用了截留分子量3,000的超滤膜的情况下，单糖的浓缩率极端恶化。另外，利用纳滤膜进行了浓缩，结果在浓缩液的浓度上存在若干的差异，但是将香豆酸、阿魏酸、2,3-二氢苯并呋喃浓缩，在发酵试验(D)中，与实施例1的使用了超滤膜的情况下(A～C)相比葡萄糖消耗速度也慢。

表14

(实施例2)

对于参考例4记载的蒸煮爆碎处理糖水溶液的精密过滤膜的透过液，实施了与实施例1同样的过滤处理。将结果示于表15。进一步将通过参考例7的方法进行的发酵结果(E～G)示于图2。

(比较例2)

使用与比较例1相同的膜对蒸煮爆碎处理糖化液的精密过滤膜的透过液进行了过滤处理。将液组成的结果记载于表15，将发酵试验的结果记载于图2。与实施例1与比较例1的比较结果同样，在使用了截留分子量3,000的超滤膜的情况下，单糖的浓缩率极端恶化，另外，在使用了纳滤膜的情况下，在浓缩液的浓度方面存在若干的差异，但是将香豆酸、阿魏酸、2,3-二氢苯并呋喃浓缩，在发酵试验(H)中，与实施例2的使用了超滤膜的情况相比葡萄糖消耗速度也慢。

表15

(实施例3)

对于参考例5记载的氨处理糖水溶液的精密过滤膜的透过液，实施了与实施例1同样的浓缩试验。将结果示于表16。

(比较例3)

使用与比较例1相同的膜对氨处理糖水溶液的精密过滤膜的透过液进行了过滤处理。将液组成的结果记载于表16。与实施例1与比较例1的比较结果同样，在使用了截留分子量3,000的超滤膜的情况下，单糖的浓缩率极端恶化，另外，在使用了纳滤膜的情况下，在浓缩液的浓度方面存在若干的差异，但是将香豆酸、阿魏酸、2,3-二氢苯并呋喃浓缩了。

表16

(实施例4)

对于由参考例6调制的水热处理糖水溶液，将在利用超滤膜“NTR-7450”或者“NTR-7410”进行过滤处理之前使用与不使用截留分子量：10,000的超滤膜(アプライドメンブレイン制、材质：聚醚砜)作为第二超滤膜进行过滤处理的两种情况进行了比较。将结果示于表17。判明了，在实施了第二超滤膜处理的情况下，由“NTR-7450”或者“NTR-7410”进行超滤膜处理时的膜透过通量(在处理时间中平均化而得到)大幅增加，进一步非透过侧的单糖的浓缩倍率改善。

表17

(实施例5)

对于由参考例6调制的水热处理糖水溶液的精密过滤膜透过液1.5L，利用超滤膜“NTR-7410”(日东电工株式会社制、材质：磺化聚醚砜、截留分子量：1,000)进行了与实施例1同样的过滤处理，将此时的非透过侧的浓缩液(0.5L)以及透过侧的滤液(1.0L)的发酵抑制物质与单糖的组成示于表18。而后，利用纳滤膜“UTC-60”(Toray株式会社制、材质：哌嗪聚酰胺)将该滤液进行过滤处理，将非透过侧的浓缩液(0.33L)的发酵抑制物质与单糖的组成示于表19。对于该浓缩液，按照成为表20的组成的方式，添加试剂而调制，进行与参考例7同等的发酵试验，测定木糖消耗速度，将所得到的结果示于图3(参照图3的J。)。

(比较例4)

对于由参考例6调制的水热处理糖水溶液的精密过滤膜透过液1.5L，利用纳滤膜“UTC-60”进行了过滤处理，将所得到的非透过侧的浓缩液0.75L的发酵抑制物质与单糖的组成示于表19。对于该浓缩液，与实施例5同样地按照成为表20的组成的方式添加试剂而调制，供给于发酵试验，将结果(木糖消耗速度)示于图3(参照图3的J)。

判明了，在实施例5中获得的糖液中，香豆酸、阿魏酸、2,3-二氢苯并呋喃的浓度有点浓，但在木糖消耗速度方面相比于比较例4而言发酵性良好。推定出这是因为，在糖水溶液中存在有不透过截留分子量为600～2,000的超滤膜的未鉴定的发酵抑制物质。另外，根据实施例5判明了，不仅截留分子量为600～2,000的超滤膜的非透过侧的糖液，而且使透过侧的滤液通过纳滤膜和/或反渗透膜进行过滤而从非透过侧获得的第二浓缩糖液也是发酵性好的糖液。

表18

表19

表20

组成	组成成分浓度
		葡萄糖	15g/L
木糖	25g/L
		酵母提取物(Bacto Yeast Extract)	10g/L
胨	20g/L

(参考例8)基于糖水溶液pH的发酵抑制物质除去性能的评价

通过调整参考例6记载的水热处理液的pH，对糖水溶液中的发酵抑制物质的基于超滤膜的透过率进行了比较研究。所谓发酵抑制物质的透过率，将各成分的滤液侧的浓度除以膜处理时的非透过侧的浓度而得的值，再乘以100，将所得到的值以比例(％)的方式表示。向水热处理液中添加稀硫酸或者氢氧化钠后，产生沉淀，因而进行离心处理，进一步进行精密过滤膜处理，然后在平膜过滤单元“SEPA-II”(GE OSMONICS制)上设置超滤膜“NTR-7410”(日东电工株式会社制、材质：磺化聚醚砜、截留分子量：1,000)，在膜面线速度20cm/秒、过滤压2MPa的条件下进行了过滤处理。另外，为使滤液侧的浓度稳定而需要花费时间，因此在20分钟将滤液的液体返回到原水侧，将经过20分钟后的稳定的滤液进行取样，求出透过率，结果发现了，如表21那样，通过将pH调整为5以下，从而大幅地提高香豆酸、阿魏酸的具有芳香族与羧酸这两者的发酵抑制物的除去性能。

表21

(实施例6)

对于由参考例3获得的硫酸水溶液，按照成为pH4.0的方式利用氨进行中和并进行精密过滤膜处理，对于所得到的透过液1.5L，利用超滤膜“NTR-7450”(日东电工株式会社制、材质：磺化聚醚砜、截留分子量：600～800)与实施例1同样地进行了过滤处理，将此时的非透过侧的浓缩液(0.5L)以及透过侧的滤液(1.0L)的发酵抑制物质与单糖的组成示于表22。而且，利用纳滤膜“UTC-60”(Toray株式会社制、材质：哌嗪聚酰胺)将该滤液进行过滤处理，将非透过侧的浓缩液(0.33L)的发酵抑制物质与单糖的组成示于表23。对于该浓缩液，按照成为表24的组成的方式添加试剂而调制，进行与参考例7同等的发酵试验，将测定木糖消耗速度而得到的结果示于图4(参照图4的L)。

(比较例5)

对于由参考例3获得的硫酸水溶液，按照成为pH4.0的方式利用氨进行中和并进行精密过滤膜处理，对于所得到的透过液1.5L，利用纳滤膜“UTC-60”进行了过滤处理，将所得到的非透过侧的浓缩液0.75L的发酵抑制物质与单糖的组成示于表22。对于该浓缩液，与实施例6同样地按照成为表24的组成的方式添加试剂而调制，供给于发酵试验，将所得的结果(木糖消耗速度)示于图4(参照图4的K。)。

判明了，由实施例6获得的糖液中香豆酸、阿魏酸、2,3-二氢苯并呋喃的浓度有点浓，但是在木糖消耗速度方面相比于比较例5而言发酵性是良好。推定出这是因为，在糖水溶液中存在有不透过截留分子量为600～2,000的超滤膜的未鉴定的发酵抑制物质。另外，根据实施例6判明了，不仅截留分子量为600～2,000的超滤膜的非透过侧的糖液，而且使透过侧的滤液通过纳滤膜和/或反渗透膜进行过滤而从非透过侧获得的第二浓缩糖液也是发酵性好的糖液。

表22

表23

表24

组成	组成成分浓度
		葡萄糖	6g/L
木糖	40g/L
		酵母提取物(Bacto Yeast Extract)	10g/L
胨	20g/L
		pH	6.5

产业上的可利用性

根据本发明，可从源自含纤维素的生物质的糖水溶液中有效率地除去发酵抑制物质，另一方面可以以高纯度·高收率制造包含葡萄糖、木糖等单糖的精制糖液，因而在将该精制糖液作为发酵原料的情况下，可提高各种化学品的发酵生产的效率。

符号说明

A利用超滤膜“NTR-7450”将稀硫酸处理糖水溶液进行过滤处理而获得的糖液

B利用超滤膜“SPE1”将稀硫酸处理糖水溶液进行过滤处理而获得的糖液

C利用超滤膜“GR95Pp”将稀硫酸处理糖水溶液进行过滤处理而获得的糖液

D利用纳滤膜“UTC-60”将稀硫酸处理糖水溶液进行过滤处理而获得的糖液

E利用超滤膜“NTR-7450”将蒸煮爆碎处理糖水溶液进行过滤处理而获得的糖液

F利用超滤膜“SPE1”将蒸煮爆碎处理糖水溶液进行过滤处理而获得的糖液

G利用超滤膜“GR95Pp”将蒸煮爆碎处理糖水溶液进行过滤处理而获得的糖液

H利用纳滤膜“UTC-60”将蒸煮爆碎处理糖水溶液进行过滤处理而获得的糖液

I利用纳滤膜“UTC-60”将水热处理糖水溶液进行过滤处理而获得的浓缩糖液

J对于利用超滤膜“NTR-7410”将水热处理糖水溶液进行过滤处理而获得的透过液，利用纳滤膜“UTC-60”进行过滤处理而获得的浓缩糖液

K利用纳滤膜“UTC-60”将硫酸水溶液进行过滤处理而获得的浓缩糖液

L对于利用超滤膜“NTR-7450”将硫酸水溶液进行过滤处理而获得的透过液，利用纳滤膜“UTC-60”进行过滤处理而获得的浓缩糖液。

Claims

1.一种糖液的制造方法，其特征在于，是以含纤维素的生物质作为原料来制造糖液的方法，其包含如下工序：

2.根据权利要求1所述的糖液的制造方法，其特征在于，所述发酵抑制物质包含选自香豆酸、阿魏酸以及2,3-二氢苯并呋喃中的一种或者二种以上。

3.根据权利要求1或2所述的糖液的制造方法，其特征在于，在所述工序(2)中，将糖水溶液调整为pH5以下进行过滤。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的糖液的制造方法，其特征在于，所述工序(2)中使用的超滤膜的功能层的材质是聚醚砜。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的糖液的制造方法，其特征在于，其包含如下工序：

使由工序(2)获得的糖液和/或包含发酵抑制物质的透过液通过纳滤膜和/或反渗透膜进行过滤，从非透过侧回收浓缩糖液的工序。

6.一种化学品的制造方法，其特征在于，使用通过权利要求1～5中任一项所述的糖液的制造方法而获得的糖液作为发酵原料。