CN1688198A - 使用高浓度糖混合物诱导基因表达 - Google Patents

使用高浓度糖混合物诱导基因表达 Download PDF

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Abstract

本发明公开了用于诱导基因(其表达由可诱导的启动子序列控制)表达的组合物、制备和使用该组合物的方法。

Description

使用高浓度糖混合物诱导基因表达
相关申请的交叉参考
本申请要求享有2002年9月10日提交的美国临时申请号60/409,466(代理编号GC774P)的优先权，其在这里整体引作参考。
关于在联邦研发支持下作出的发明的权利的声明
本工作的一部分内容得到了美国能源部(U.S.Department ofEnergy)主合同No.DE-AC36-99G010337下的国家可再生能源实验室(National Renewable Energy Laboratory)分包合同No.ZCO-0-30017-01的资助。因此，美国政府可以具有本发明的某些权利。
技术领域
本发明涉及用于提高来自细胞培养物的蛋白的生产的方法。发明人已经发现了能显著增加蛋白量的培养组分和条件，所述蛋白由在纤维素酶基因启动子序列控制下的基因生成。该改进的方法可以用于生产由自然存在的纤维素酶基因编码的蛋白和来自不同异源构建体的蛋白。
背景技术
丝状真菌和分解纤维素的细菌能生成胞外纤维素酶，这赋予该生物水解纤维素的β-(1，4)-连接的糖苷键生成葡萄糖的能力。这些酶给生物提供了利用纤维素(最丰富的植物多糖)来生长的能力。
丝状真菌里氏木霉(Trichoderma reesei)是有效的纤维素酶生产者。所以，已经开发了里氏木霉生产这些酶的能力，这可以用于生产商品，例如燃料乙醇、布料、洗涤剂、纤维和其它产品。
里氏木霉蛋白的分解纤维素的混合物属于最佳表征的微生物分解纤维素的途径。将含有这些混合物的纤维素酶分成两大类：内切葡聚糖酶(EG)和纤维二糖水解酶(CBH)。β-葡糖苷酶也是里氏木霉的纤维素酶混合物的一部分。
还已经开发了里氏木霉生产异源蛋白的能力。可操作地连接到里氏木霉的可诱导的cbh1启动子后，编码目标蛋白的基因可以被调节。已经在里氏木霉中分泌了外源多肽，它是作为与催化域的融合体，且带有cbh1的连接区(Nyyssonen等，Bio/technology11：591-595，1993)。
包含纤维素酶系统的基因的表达受到转录水平的调控和调节。该系统的成员协同作用，并且如上所述是有效地将纤维素水解成可溶寡糖所必须的。
木霉中的主要纤维素酶基因cbh1、cbh2、egl1和egl2的表达和生成取决于可获得的用于生长的碳源。纤维素酶基因受到葡萄糖的严格抑制，并且能由纤维素或二糖槐糖诱导数千倍。实际上，与含有葡萄糖的培养基相比，在含有诱导碳源(例如纤维素或槐糖)的培养基上可以将主要的纤维二糖水解酶1(cbh1)的表达水平上调数千倍(Ilmen等，App.Environ.Microbio.，1298-1306，1997)。
纤维素酶的商业规模的生产是通过固体培养或浸没培养，包括分批式、补料分批式和连续流工艺。工业生产纤维素酶的最成问题的且昂贵的方面是给木霉提供合适的诱导物。跟实验室规模的实验的情况一样，商业规模的纤维素酶的生产是通过使真菌在固体纤维素上生长来诱导，或通过在存在二糖诱导物(例如乳糖)的情况下培养生物来诱导。不幸的是，这两种诱导方法在工业规模都有缺陷，它们会导致与纤维素酶的生产相伴随的高成本。
纤维素酶的合成受到纤维素的诱导和葡萄糖的抑制。这样，影响在可诱导的启动子控制下的纤维素酶或异源蛋白的产率的关键因素是维持纤维素底物和葡萄糖浓度之间的适当平衡；至关重要的是合理地商业化地生产受调节基因的产物。尽管纤维素是有效的且不昂贵的诱导物，但是当木霉在固体纤维素上生长时很难控制葡萄糖的浓度。在低浓度的纤维素时，葡萄糖的生成会很少，难以满足有活性的细胞的生长和功能的代谢需要。另一方面，当葡萄糖的生成比消耗更快时，葡萄糖抑制会中止纤维素酶的合成。因而，需要昂贵的工艺控制方案来缓慢地添加底物并监视葡萄糖浓度(Ju和Afolabi，Biotechnol.Prog.，91-97，1999)。而且，由于纤维素物质的固体性质，难以实现连续输送底物。
Allen和Mortensen(Biotechnol.Bioeng.，2641-45，1981)已经证实，当将200IU/ml的来自海枣曲霉(Aspergillus phoenicis)的纯β-葡糖苷酶与50％葡萄糖浆一起孵育时，生成的溶液在用作碳源时具有诱导生成纤维素酶的能力。β-葡糖苷酶的纯化既耗时又昂贵。另外，与在本工作中所使用的相比，这些作者使用了超过20倍的β-葡糖苷酶量。
通过使用可溶底物和诱导物(例如乳糖或槐糖)，可以克服与使用纤维素作为诱导底物相伴随的一些问题。提供的乳糖必须是高浓度的，以便起到诱导物和碳源的功能(见Seiboth，等，Mol.Genet.Genomics，124-32，2002.)。龙胆二糖也可以用作诱导物。槐糖是比纤维素更有效的诱导物，但是槐糖价格昂贵且难以生产。因此，在比固体纤维素更容易处理和控制的同时，槐糖仍然使生产纤维素酶的成本昂贵得难以接受，因此用于商业化生产纤维素酶是不切实际的。显然，仍然需要方便的可溶的底物组合物，它还能提供低廉的在丝状真菌(例如里氏木霉)中诱导纤维素酶的方法。
另外，用低廉的诱导剂来调节可诱导的启动子表达内源基因或外源基因的能力具有巨大的商业价值。
发明概述
现在已经发现，当把全纤维素酶制品(whole cellulasepreparation)加入到浓葡萄糖溶液中、并将组合物在约50℃至约65℃孵育至少2天时，会生成含有可观量的纤维素酶基因表达的诱导物的糖混合物。令人惊奇的是，得到的复合混合物无需进一步纯化即足以诱导纤维素酶的生成。该发现是令人惊奇的，因为葡萄糖是里氏木霉的纤维素酶基因的抑制剂。该发现提供了纤维素酶基因表达的诱导物，它是乳糖或纯化的槐糖的低廉的替代品，也是比用于在里氏木霉中生产纤维素酶的固体纤维素更方便的替代品。
在一个实施方案中，本发明提供了一种用于诱导基因表达的组合物，所述基因的表达由纤维素酶基因启动子序列控制，其包括：(i)从约5％至约75％(重量/重量)的葡萄糖，优选地50％-70％的葡萄糖，和(ii)从约2g/L至约10g/L全纤维素酶制品总蛋白，优选地5g/L，其中在用于促进组合物中基因表达的诱导物的形成之前，将该组合物在约50℃至约70℃孵育几天。
在另一个实施方案中，诱导性补料组合物在使用前在约50℃至约65℃、优选地在约55℃孵育48小时。
在另一个实施方案中，诱导性补料组合物在使用前在约50℃至约65℃、优选地在约65℃孵育72小时。
在一个优选的实施方案中，从孵育浓葡萄糖溶液和全纤维素酶制品得到的孵育产物是含有槐糖的糖混合物。在另一个优选的实施方案中，孵育产物是含有龙胆二糖的糖混合物。
在一个实施方案中，本发明提供了一种用于生产蛋白的方法，所述蛋白的基因表达由可诱导的启动子序列控制，其中提供了细胞培养物，并向培养物中加入了通过孵育浓葡萄糖溶液和全纤维素酶制品得到的诱导性补料组合物，其量能有效诱导由可诱导的启动子序列控制的基因的表达。
改进的方法可以用于生产自然存在的纤维素酶基因编码的蛋白和来自不同异源构建体的蛋白。这样的构建体包括表达载体，其中编码目标蛋白的基因可操作地连接到可诱导的启动子上。在一个实施方案中，可诱导的启动子是纤维素酶基因启动子。在第二个实施方案中，可诱导的启动子是槐糖-可诱导的启动子。在第三个实施方案中，可诱导的启动子是龙胆二糖-可诱导的启动子。在一个方面，可诱导的启动子是cbh1启动子。
在一个实施方案中，用于生产目标蛋白的方法能生产选自下述的蛋白：激素、酶、生长因子、细胞因子和抗体。在一个方面，该方法用于生产的蛋白是天然存在的纤维素酶。在另一个方面，该方法用于生产的蛋白的表达不是天然地由纤维素酶基因启动子序列控制。
在另一个实施方案中，生产蛋白的方法是使用丝状真菌。在一个方面，该真菌是木霉属。在一个方面，该真菌是里氏木霉。
在另一个实施方案中，用于生产目标蛋白的方法使用诱导组合物，该诱导组合物是这样制备的：将全纤维素酶制品加入到纤维二糖溶液中，并将纤维素酶-纤维二糖溶液在50℃至约70℃孵育至少2天以形成诱导性补料组合物。在一个方面，该溶液是在50℃至约65℃孵育至少2天以形成诱导性补料组合物。该组合物是含有可观量的纤维素酶基因表达的诱导物的糖混合物。
附图说明
图1说明了补加本发明的诱导组合物(□，正方形)与补加葡萄糖组合物(◆，菱形)相比对野生型里氏木霉(RLP-37)(见Sheir-Neiss和Montenecourt，Appl.Microbio.Biotechnol.，46-53，1984)生产纤维素酶的影响。
图2说明了用固定化酶(□，正方形)生产槐糖与用酶溶液(◆，菱形)相比的不同。最终葡萄糖浓度是约40％。蛋白加料是10g/L。详见实施例4。
图3说明了用固定化酶(■，正方形)生产槐糖与用酶溶液(△，三角形)相比的不同。最终葡萄糖浓度是约60％。蛋白加料是3.2g/L。详见实施例4。
图4对比了图2和3中使用相同的固定化酶的第二批实验和第一批实验得到的结果。第一批实验后回收的固定化酶在第二批实验中保留了活性。标识是：□(正方形)，第一批10g/L实验；◆(菱形)，第二批10g/L实验；△(三角形)，第一批3.2g/L实验；×，第二批3.2g/L实验。
图5显示了在25％纤维二糖中与在25％葡萄糖中相比的槐糖生产。在25％纤维二糖(□；正方形)或葡萄糖溶液(重量/重量)(●；圆点)中的槐糖生产。
图6显示了在不同全纤维素酶加样的情况下在60％葡萄糖溶液(重量/重量)中的槐糖生产。△(三角形)，2.5g/L，□(正方形)，5.0g/L，◆(菱形)，7.5g/L，×，10g/L全纤维素酶。
发明详述
丝状真菌里氏木霉是被最广泛地研究了的分解纤维素的生物之一(参见，例如Nevalainen和Penttila，Mycota，303-319，1995)。工业上，木霉属的纤维素分解酶用于多种目的，包括生产燃料乙醇、纸、人造丝、玻璃纸、洗涤剂和纤维。纤维素酶还用于提高动物饲料的营养价值，促进从植物细胞中提取有价值的组分(Mandels，Biochem.Soc.Trans.，414-16.1985)。因此，这些酶在许多有用产品的生产中起重要作用。
木霉属中的纤维素酶的生成取决于可获得的碳源。纤维素、乳糖和二糖槐糖会诱导里氏木霉合成纤维素酶。相反地，葡萄糖的存在会严格抑制纤维素酶基因的表达。提供用于工业规模生产的合适的诱导物是造成纤维素酶的高生产成本的主要问题因素。
现在已经发现，当把全纤维素酶制品加入到浓葡萄糖溶液中、并将组合物在约50℃至约75℃、优选地在约50℃至约65℃孵育至少2天时，会生成含有可观量的纤维素酶基因表达的诱导物的糖混合物，即诱导性补料组合物。该诱导性补料组合物含有约2～25g/L槐糖。另外，该诱导性补料组合物含有约35～60g/L龙胆二糖。令人惊奇的是，得到的混合物无需任何进一步纯化。它原样即可诱导纤维素酶的生成。该发现提供了工业上需要的乳糖或纯化槐糖的低廉的替代品，和比用于在丝状真菌中生产由可诱导的启动子调控的蛋白的固体纤维素更方便的替代品。更具体的观点是，本发明的组合物可用于木霉属的纤维素酶生产。
在生产诱导性补料组合物的一个替代方法中，可以将最终发酵液(全纤维素酶+细胞)加入到葡萄糖溶液(例如20％)中。细胞的存在不会影响槐糖的形成。这样，就无需使用回收的纤维素酶(即从细胞中分离出的纤维素酶制品)。可以使用在发酵结束时存在的酶混合物，尽管还存在细胞。
在一个实施方案中，本发明提供了一种包含浓葡萄糖溶液和全纤维素酶制品的组合物，它可以用作通过丝状真菌生产目标蛋白的诱导补料。在一个方面，目标蛋白是纤维素分解酶。在另一个方面，目标蛋白是异源蛋白。在一个实施方案中，该诱导补料会诱导里氏木霉生成纤维素酶。令人惊奇的是，该溶液能有效地诱导纤维素酶基因的表达，因为已知纤维素酶基因会被存在的葡萄糖所抑制。
在一个实施方案中，诱导补料是通过制备无菌的5％-75％(重量/重量)葡萄糖溶液来制作的。将来自里氏木霉的全纤维素酶制品加入到无菌葡萄糖溶液中，至终浓度为2g～20g总蛋白/L。最终的蛋白浓度可以是低至0.5g/L，高至50g/L。在一个方面，葡萄糖溶液中的β-葡糖苷酶活性高于1.5IU/ml。在一个方面，葡萄糖溶液中的β-葡糖苷酶活性低于200IU/ml。在另一个方面，葡萄糖溶液中的β-葡糖苷酶活性是在1.5IU/ml至200IU/ml之间。在另一个方面，葡萄糖溶液中的β-葡糖苷酶活性是在1.9IU/ml至200IU/ml之间。在另一个方面，葡萄糖溶液中的β-葡糖苷酶活性是在9.3IU/ml至200IU/ml之间。在另一个方面，葡萄糖溶液中的β-葡糖苷酶活性是在1.5IU/ml至180IU/ml之间。在另一个方面，葡萄糖溶液中的β-葡糖苷酶活性是在9.3IU/ml至180IU/ml之间。该溶液是在50℃-75℃、优选地在约50℃-65℃孵育。溶液是在搅拌下孵育8小时至7天。在一个实施方案中，孵育时间超过2天。在第二个实施方案中，孵育时间是2天。在第三个实施方案中，孵育时间是3天。收集最终无菌溶液，用于发酵补料。在一个实施方案中，诱导补料是用60％(重量/重量)葡萄糖溶液制备的。在另一个实施方案中，诱导补料是通过将全纤维素酶制品加入到葡萄糖溶液中至终浓度为2g总蛋白/L来制备的。
在这里，本发明的另一个目的是使宿主丝状真菌表达和分泌与所述宿主丝状真菌异源的目标蛋白。通过诱导基因(其表达由可诱导的启动子序列控制)生成的蛋白包括自然产生的纤维素酶蛋白以及多种异源蛋白。在一个优选的实施方案中，在可诱导的启动子序列控制下表达的蛋白是激素、酶、生长因子、细胞因子或抗体。
多种丝状真菌可以用作表达宿主，包括下述的属：曲霉属(Aspergillus)，木霉属(Trichoderma)，链孢霉属(Neurospora)，青霉属(Penicillium)，头孢属(Cephalosporium)，绵霉属(Achlya)，束柄霉属(Podospora)，疫病霉属(Endothia)，毛霉属(Mucor)，旋孢腔菌属(Cochliobolus)和梨孢属(Pyricularia)。具体的表达宿主包括：里氏木霉，例如NRRL15709、ATCC13631、56764、56765、56466、56767，绿色木霉(Trichoderma viride)，例如ATCC32098和32086构巢曲霉(Aspergillus nidulans)，(Yelton，M.，等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，1470-1474；Mullaney，E.J.等(1985)Mol.Gen.Genet.199，37-45；John，M.A.和J.F.Peberdy(1984)Enzyme Microb.Technol.6，386-389；Tilburn，等(1982)Gene 26，205-221；Ballance，D.J.等，(1983)Biochem.Biophys.Res.Comm.112，284-289；Johnston，I.L.等(1985)EMBO J.4，1307-1311)黑曲霉(A.niger)，(KELLY，J.M.和M.Hynes(1985)EMBO 4，475-479)泡盛曲霉(Aspergillus awamori)，例如NRRL3112、ATCC22342、ATCC44733、ATCC14331和菌株UVK143f，米曲霉(Aspergillusoryzae)，例如ATCC11490，和粗糙脉孢霉(Neurospora crassa)(Case，M.E.等(1979)Proc.Natl.Acad.Scie.USA，76，5259-5263；Lambowitz美国专利号4,486,553；Kinsey，J.A.和J.A.Rambosek(1984)Molecular and Cellular Biology 4，117-122；Bull，J.H.和J.C.Wooton(1984)Nature 310，701-704)。
在一个优选的实施方案中，微生物宿主是木霉属、腐质霉属、镰刀菌属、曲霉属、链霉属、热单孢属、芽孢杆菌属或纤维单孢菌属的成员。
I.定义
“抗体”是指包含来自免疫球蛋白基因或其片段的构架区的多肽，它能特异性地结合和识别抗原。识别出的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因以及无数的免疫球蛋白可变区基因。轻链分为κ或λ。重链分为γ、μ、α、δ或ε，它们按顺序分别定义了免疫球蛋白类别IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。典型地，抗体或其功能等同物的抗原结合区对于结合的特异性和亲合力是最重要的。见，Paul，Fundamental Immunology。
示例性的免疫球蛋白(抗体)的结构单元包含四聚物。每个四聚物由两对相同的多肽链组成，每一对具有一个“轻链”(约25kD)和一个“重链”(约50-70kD)。每条链的N-端定义了约100～110个或更多氨基酸的可变区，它主要负责抗原的识别。术语“可变轻链”(VL)和“可变重链”(VH)分别是指这些轻链和重链。
“纤维素酶”或“纤维素分解酶”指细菌的或真菌的外切葡聚糖酶或外切纤维二糖水解酶，和/或内切葡聚糖酶，和/或β-葡糖苷酶。这三种不同类型的纤维素酶协同地将纤维素和其衍生物转变为葡萄糖。
许多微生物能生成水解纤维素的酶，包括腐木真菌木霉属、堆肥细菌热单胞菌(现在称作Thermobifida)属、芽孢杆菌属和纤维单孢菌属；链霉属和真菌腐质霉属；曲霉属和镰刀菌属。这些微生物生成的酶是具有三类功能(用于将纤维素转化成葡萄糖)的蛋白的混合物：内切葡聚糖酶(EG)、纤维二糖水解酶(CBH)和β-葡糖苷酶(BG)。
如这里所使用的，短语“全纤维素酶制品”和“全纤维素酶组合物”可互换地使用，指自然存在的和非自然存在的组合物。“自然存在的”组合物是通过自然存在的来源制备的，其包含一种或多种纤维二糖水解酶类、一种或多种内切葡聚糖酶类和一种或多种β-葡糖苷酶组分，其中这些组分中的每一种都与在所述来源中的比例相同。自然存在的组合物是由未针对纤维素分解酶进行修饰的生物生成的，所以该组分酶的比例相对于天然生物生成的没有变化。
“非自然存在的”组合物包括通过下述方法生成的那些组合物：(1)以自然比例或非自然(即改变的)比例将组分纤维素分解酶混合；或(2)修饰生物，使之过表达或次表达(underexpress)一种或多种纤维素分解酶；或(3)修饰生物，使之缺失至少一种纤维素分解酶。
用于本发明的全纤维素酶混合物可以缺失各EG和/或CBH中的一种或多种。例如，可以单独缺少EG1，或者与其它EG和/或CBH一起缺少。BG可以相对于天然水平过表达。本文中也包括BG的异源表达。
“碳限制”是一种状态，其中微生物仅仅具有足够的碳来生成目标蛋白产物，但是没有足够的碳来完全满足生物的需要，例如支持生长。因此，最大量的碳用于蛋白生成。
如这里所使用的，“启动子”和“纤维素酶启动子”是指核酸序列，其功能是指导下游基因的转录，它们在本文中可互换地使用。启动子通常适用于要表达目标基因的宿主细胞。启动子和其它转录和翻译调节核酸序列(也称作“调控序列”)是表达给定基因所必须的。通常，转录和翻译调节序列包括但不限于启动子序列、核糖体结合部位、转录起始序列和终止序列、翻译起始序列和终止序列、和增强子或活化剂序列。在一个方面，启动子是可诱导的启动子。在另一个方面，启动子是可以通过选自龙胆二糖、纤维素和槐糖的诱导物诱导的。在一个方面，启动子是里氏木霉cbh1启动子，它保藏在GenBank中，登记号为D86235。在另一个方面，启动子是来自里氏木霉的cbhII或木聚糖酶启动子。
如这里所使用的，“启动子序列”是能被用于表达目的的特定丝状真菌所识别的DNA序列。“启动子”定义为一列核酸调控序列，它指导核酸的转录。如这里所使用的，启动子包括临近转录起始位点的必需核酸序列，例如，在聚合酶II类启动子的情况下，是TATA元件。“组成型”启动子是在大多数环境条件和发育条件下有活性的启动子。“可诱导的”启动子是在环境的和发育的调节下有活性的启动子。用于本发明的可诱导的启动子例子是里氏木霉cbh1启动子。术语“可操作地连接”指核酸表达调控序列(例如启动子或转录因子结合部位阵列)和第二种核酸序列之间的功能连接，其中表达调控序列指导与第二种序列相对应的核酸的转录。
实例包括来自下述的启动子：泡盛曲霉或黑曲霉葡糖淀粉酶基因(Nunberg，J.H.等(1984)Mol.cell.Biol.4，2306-2315；Boel，E.等(1984)EMBO J.3，1581-1585)，这里的米赫毛霉(Mucormiehei)羧基蛋白酶基因，里氏木霉纤维二糖水解酶I基因(Shoemaker，S.P.等(1984)欧洲专利申请号EPO 0137280 A1)，构巢曲霉trpC基因(Yelton，M.等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA81，1470-1474；Mullaney，E.J.等(1985)Mol.Gen.genet.199，37-45)，构巢曲霉alcA基因(Lockington，R.A.等(1986)Gene 33，137-149)，构巢曲霉tpiA基因(McKnight，G.L.等(1986)Cell 46，143-147)，构巢曲霉amdS基因(Hynes，M.J.等(1983)Mol.cellBiol.3，1430-1439)，里氏木霉xln1基因，里氏木霉cbh2基因，里氏木霉eg1基因，里氏木霉eg2基因，里氏木霉eg3基因，和高等真核生物启动子，例如SV40早期启动子(Barclay，S.L.和E.Meller(1983)Molecular and Cellular Biology 3，2117-2130)。
当核酸与另一个核酸序列建立了功能关系时，它是“可操作地连接的”。例如，如果它能表达为参与多肽分泌的蛋白原(preprotein)，则编码分泌前导序列(即信号肽)的DNA是可操作地连接到了多肽的DNA；如果能影响序列的转录，则启动子或增强子是可操作地连接到了编码序列；或者，如果能促进翻译，则核糖体结合部位是可操作地连接到了编码序列。通常，“可操作地连接”是指连接的DNA序列是邻接的，在分泌前导序列的情况下，是邻接的且处于阅读相。但是，增强子不是必须邻接的。连接是通过在方便的限制位点的拼接实现的。如果不存在这样的位点，则根据常规操作使用合成的寡核苷酸接头或连接物。
如这里所使用的，术语“基因”指参与生成多肽链的DNA片段，它们包含或不包含在编码区之前和之后的区域，例如5′未翻译的(5′UTR)或“前导”序列和3′UTR或“尾”序列，以及在各编码片段(外显子)之间的插入序列(内含子)。
基因可以编码治疗上有意义的蛋白或肽，例如生长因子、细胞因子、配体、受体和抑制剂，以及疫苗和抗体。基因可以编码商业上重要的工业蛋白或肽，例如酶，例如蛋白酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、纤维素酶、氧化酶和脂肪酶。目标基因可以是自然存在的基因、突变的基因或合成的基因。
当提及(例如)细胞、核酸、蛋白或载体时使用的术语“重组的”表示，已经通过导入外源的核酸或蛋白或改变天然核酸或蛋白修饰了的细胞、核酸、蛋白或载体，或者该细胞是源自这样修饰的细胞。因此，例如，重组细胞能表达在细胞的天然(非重组的)形式中不存在的基因，或者能表达否则会被异常表达、次表达或根本不表达的天然基因。
术语“分泌信号序列”是指编码多肽(“分泌肽”)的DNA序列，它作为更大的多肽的组分，指导更大的多肽穿过细胞的分泌途径(它是在其中合成的)。通常在穿过分泌途径的过程中，剪切更大的多肽除去该分泌肽。
“诱导”是指用存在的“诱导物”增强基因的转录，从而导致细胞或生物以显著提高的速度合成目标蛋白。为了检测对目标蛋白的诱导，将用潜在的诱导物处理的细胞与没有诱导物的对照样品相对比。将对照样品(未用诱导物处理)指定了相对蛋白活性值100％。当相对于对照组(未用诱导物处理)的活性值大于100％、大于110％、更优选地150％、更优选地200-500％(即相对于对照组高出了2-5倍)或更优选地高出了1000-3000％时，即实现了多肽的诱导。
本发明的“丝状真菌”是真核微生物，包括真菌门亚门的所有丝状形式(见Alexopoulos，C.J.(1962)，Introductory Mycology，NewYork：Wiley)。这些真菌的特征在于营养菌丝体，其细胞壁由几丁质、纤维素和其它复合多糖组成。本发明的丝状真菌在形态学上、生理学上和遗传上与酵母区别开。丝状真菌的营养生长是通过菌丝伸长，且碳分解代谢是好氧的。相反，酵母(例如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽，且碳分解代谢可以是发酵的。酿酒酵母(s.cerevisiae)具有突出的非常稳定的二倍期，然而二倍期仅仅在丝状真菌(例如曲霉菌属和链孢霉属)的减数分裂前短时间地存在。酿酒酵母具有17个染色体，这与构巢曲霉和粗糙链孢霉分别有8和7个染色体不同。关于酿酒酵母和丝状真菌之间的区别的新的说明包括酿酒酵母不能处理曲霉和木霉的内含子，也不能识别丝状真菌的许多转录调节子(Innis，M.A.等(1985)Science，228，21-26)。
“葡糖苷酶”指其终产物是葡萄糖的任何酶。
在提及核酸部分时使用的术语“异源的”是指，该核酸包含两个或多个亚序列，它们在天然情况下通常彼此不存在这样的关系。例如，该核酸典型地是重组生成的，其具有两个或多个例如来自无关基因的序列以制作新的功能核酸，例如启动子是来自一个来源，编码区来自另一个来源。类似地，异源蛋白一般是指两个或多个亚序列，它们在天然情况下通常彼此不存在这样的关系(例如融合蛋白)。
“孵育产物”是指在高温下保持或孵育特定时间段后的溶液。
“诱导物”是能使细胞比在没有该诱导物存在时生成更大量的酶或其它物质的任何化合物。
“诱导补料”是指补充给微生物的溶液，它会造成或诱导目标蛋白产物的生成。
如这里使用的术语“分离的”或“纯化的”是指从至少一种天然地与其伴随的组分中分离出的核酸或氨基酸。
II.目标蛋白或所需蛋白
术语“目标蛋白”和“所需蛋白”在这里可以互换地使用。本发明特别适用于增强蛋白的胞内和/或胞外生产。蛋白可以是同源的或异源的。可以通过本发明生产的蛋白包括但不限于激素、酶、生长因子、细胞因子、抗体等。
激素包括但不限于促卵泡激素、促黄体激素、促肾上腺皮质激素释放因子、促生长素抑制素、促性腺激素、血管加压素、催产素、促红细胞生成素、胰岛素等。
生长因子是能结合到细胞表面受体上的蛋白，其主要结果是激活细胞的增殖和/或分化。生长因子包括但不限于血小板衍生生长因子、表皮生长因子、神经生长因子、成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子、转化生长因子等。
细胞因子是一个独特的生长因子家族。细胞因子主要从白细胞分泌，可以刺激体液的和细胞的免疫反应，以及激活吞噬细胞。细胞因子包括但不限于集落刺激因子、白细胞介素(IL-1(α和β)，IL-2至IL-13)和干扰素(α、β和γ)。
人白细胞介素-3(IL-3)是15kDa的蛋白，含有133个氨基酸残基。IL-3是种属特异性的集落刺激因子，它能刺激来自骨髓培养物的巨核细胞、中性白细胞和巨噬细胞的菌落形成。
抗体包括但不限于来自任何种属(要从中大量生产)的免疫球蛋白。特别优选的抗体是人抗体。免疫球蛋白可以来自任何种类，即G、A、M、E或D。
另外，“目标蛋白”或“目标多肽”是指要由宿主细胞表达和分泌的蛋白。目标蛋白可以是直到现在已知能在原核生物中表达的任何蛋白。在一个实施方案中，表达和分泌的目标蛋白包括含有信号肽的蛋白。目标蛋白可以是与宿主同源的或异源的。因此，目标蛋白可以是分泌的多肽，更具体地是选自下述的酶：淀粉分解酶、蛋白水解酶、纤维素分解酶、氧化还原酶和植物壁降解酶。这些酶的实例包括淀粉酶、蛋白酶、木聚糖酶、脂肪酶、漆酶、酚氧化酶、氧化酶、角质酶(cutinase)、纤维素酶、半纤维素酶、酯酶、过氧化酶、过氧化氢酶、葡萄糖氧化酶、植酸酶、果胶酶、葡糖苷酶、异构酶、转移酶、半乳糖苷酶和几丁质酶。分泌的多肽还可以是激素、生长因子、受体、疫苗、抗体等。在一个实施方案中，分泌的多肽是纤维素分解酶。
III.分子生物学
在一个实施方案中，本发明提供了在里氏木霉的纤维素酶基因启动子控制下的异源基因的表达。因此，本发明依赖于重组遗传学领域的常规技术。公开了在本发明中使用的一般方法的基础文章包括：Sambrook等，Molecular cloning，A Laboratory Manual(第2版，1989)；Kriegler，Gene Transfer and Expression：A LaboratoryManual(1990)；和Ausubel等，编，Current Protocols inMolecular Biology(1994))。
在转化至里氏木霉细胞中进行复制和/或表达之前，典型地将含有丝状真菌的纤维素酶基因启动子序列的异源基因克隆到中间载体中。这些中间载体典型地是原核生物载体，例如质粒或穿梭载体。
为了高水平地表达克隆的基因，异源基因离启动子的距离优选地与在自然存在的纤维素酶基因中的大致相同。但是，如本领域已知的，可以对该距离作一些变化而不损害启动子的功能。
本领域的技术人员能够认识到，可以通过替换、取代、添加或消除一个或多个核苷酸来修饰天然启动子而不改变其功能。本发明的实践包括但不限于启动子的这些改变。
表达载体/构建体典型地含有转录单元或表达盒，其含有表达异源序列所需的所有其它元件。因而，典型的表达盒含有可操作地连接到异源核酸序列和有效地进行转录产物的聚腺苷酸化作用所需的信号上的启动子、核糖体结合部位和翻译终止区。该盒的其它元件可以包括增强子，在将基因组DNA用作结构基因时，还包括具有功能拼接供体和受体位点的内含子。
本发明的实践不受在遗传重构体中选择的启动子的限制。但是，示例性的启动子是里氏木霉cbh1、cbh2、eg1、eg2、eg3、eg5、xln1和xln2启动子
除了启动子序列外，表达盒还应当包含位于结构基因下游的转录终止区，以提供有效的终止。终止区可以与启动子序列得自相同的基因，或者从不同的基因得到。
尽管似乎所有真菌终止子都可以在本发明中起作用，优选的终止子包括：来自构巢曲霉trpC基因(Yelton，M.等(1984)PNAS USA 81：1470-1474，Mullaney，E.J.等(1985)MGG 199：37-45)、泡盛曲霉或黑曲霉葡糖淀粉酶基因(Nunberg，J.H.等(1984)Mol.CellBiol.4：2306，Boel，E.等(1984)EMBO J.3：1581-1585)和米赫毛霉羧基蛋白酶基因(欧洲专利局公开号0 215 594)的终止子。
用于将遗传信息运送到细胞内的具体表达载体不是特别重要的。可以使用用于真核生物或原核生物细胞表达的任何常规载体。标准的细菌表达载体包括噬菌体λ和M13以及质粒，例如基于pBR322的质粒、pSKF、pET23D，和融合表达系统，例如MBP、GST和LacZ。还可以将抗原决定簇标记加入到重组蛋白中，以提供方便的分离方法，例如c-myc。
典型地包含在表达载体中的元件还包括复制子、编码抗生素抗性的基因(以便筛选包含重组质粒的细菌)和在质粒的非基本区中的独特限制性位点(以便插入异源序列)。选择的具体抗生素抗性基因不是至关重要的，本领域已知的许多抗性基因中的任何一个都是适合的。优选地选择原核生物的序列，这样它们不会影响DNA在里氏木霉中的复制或整合。
本发明的转化方法会将全部或部分转化载体稳定地整合进丝状真菌的基因组中。但是，还包括导致能维持染色体外的转化载体的自主复制的转化。
可以用许多标准转染方法来生产能表达大量异源蛋白的里氏木霉细胞系。一些公开的用于将DNA构建体导入木霉属的能生成纤维素酶的菌株中的方法包括：Lorito，Hayes，DiPietro和Harman，1993，curr.genet.24：349-356；Goldman，Van Montagu和Herrera-Estrella，1990，curr.genet.17：169-174；Penttila，Nevalainen，Ratto，Salminen和Knowles，1987，Gene 6：155-164，对于曲霉属是Yelton，Hamer和Timberlake，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：1470-1474，对于镰刀菌属是Bajar，Podila和Kolattukudy，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：8202-8212，对于链霉属是Hopwood等，1985，The John Innes Foundation，Norwich，UK，对于芽孢杆菌属是Brigidi，DeRossi，Bertarini，Riccardi和Matteuzzi，1990，FEMS Microbiol.Lett.55：135-138)。
但是，可以使用任何熟知的能将外源核苷酸序列导入宿主细胞中的方法。这包括使用磷酸钙转染、1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物、原生质体融合、电穿孔、微弹轰击、脂质体、微注射、原生质载体、病毒载体，任何其它熟知的用于将克隆的遗传DNA、cDNA、合成的DNA或其它外来遗传物质导入宿主细胞的方法(见，例如Sambrook等，同上)。还包括使用美国专利号6,255,115所述的土壤杆菌介导的转染方法。唯一需要的是，使用的具体基因工程方法能成功地将至少一个基因导入能表达外源基因的宿主细胞中。
将表达载体导入细胞中以后，将转染的细胞在有利于表达由纤维素酶基因启动子序列控制的基因的条件下培养。可以如下所述培养大批的转化细胞。最后，使用标准技术从培养物中回收产物。
因此，本发明在这里提供了目标多肽的表达和增强的分泌，该多肽的表达由纤维素酶基因启动子序列控制，包括自然存在的纤维素酶基因、融合DNA序列和各种异源构建体。本发明还提供了高水平地表达和分泌这种目标多肽的方法。
IV.丝状真菌
丝状真菌包括真菌门和卵菌门亚门的所有丝状形式。丝状真菌的特征在于营养菌丝体，其细胞壁由几丁质、葡聚糖、脱乙酰壳多糖、甘露聚糖和其它复合多糖组成，其营养生长是通过菌丝伸长，且碳分解代谢是好氧的。
在本发明中，丝状真菌母细胞可以是(但不限于)下述种属的细胞：木霉属，例如长柄木霉(Trichoderma longibrachiatum)(里氏木霉)，绿色木霉，康宁木霉(Trichoderma koningii)，哈茨木霉(Trichoderma harzianum)；青霉属；腐质霉属，包括Humicolainsolens；金孢子菌属，包括C.lucknowense；胶霉属；曲霉属；镰刀菌属，链孢霉属，肉座菌属和裸孢壳属(Emericella)。如这里所使用的，术语“木霉属物种”或“木霉属”是指以前或者现在归入木霉属的任何真菌菌株。
在一个优选的实施方案中，丝状真菌母细胞是黑曲霉、泡盛曲霉、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)或构巢曲霉细胞。
在另一个优选的实施方案中，丝状真菌母细胞是里氏木霉细胞。
V.蛋白表达
本发明的蛋白是通过培养用表达载体转化的细胞来生产的，所述载体含有其表达由纤维素酶基因启动子序列控制的基因。本发明更具体地用于增强蛋白的胞内和/或胞外生产。蛋白可以是同源的或异源的。可以通过本发明生产的蛋白包括但不限于激素、酶、生长因子、细胞因子、抗体等。
酶包括但不限于水解酶，例如蛋白酶、酯酶、脂肪酶、酚氧化酶、通透酶、淀粉酶、支链淀粉酶、木聚糖酶、纤维素酶、葡萄糖异构酶、漆酶和蛋白质二硫键异构酶。
激素包括但不限于促卵泡激素、促黄体激素、促肾上腺皮质激素释放因子、促生长素抑制素、促性腺激素、血管加压素、催产素、促红细胞生成素、胰岛素等。
生长因子是能结合到细胞表面受体上的蛋白，其主要结果是激活细胞的增殖和/或分化。生长因子包括但不限于血小板衍生生长因子、表皮生长因子、神经生长因子、成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子、转化生长因子等。
细胞因子是一个独特的生长因子家族。细胞因子主要从白细胞分泌，可以刺激体液的和细胞的免疫反应，以及激活吞噬细胞。细胞因子包括但不限于集落刺激因子、白细胞介素(IL-1α和β，IL-2至IL-13)和干扰素(α、β和γ)。
人白细胞介素-3(IL-3)是15kDa的蛋白，含有133个氨基酸残基。IL-3是种属特异性的集落刺激因子，它能刺激来自骨髓培养物的巨核细胞、中性白细胞和巨噬细胞的菌落形成。
抗体包括但不限于来自任何种属(要从中大量生产)的免疫球蛋白。特别优选的抗体是人抗体。免疫球蛋白可以来自任何种类，即IgG、IgM、IgA、IgD或IgE。
还可以以形成嵌合分子的方式修饰本发明的目标蛋白，所述的嵌合分子包含与另一个异源多肽或氨基酸序列相融合的目标蛋白。在一个实施方案中，这样的嵌合分子包含目标蛋白与标记多肽的融合体，所述的标记多肽提供了能被抗标记-抗体选择性地结合的抗原决定簇。抗原决定簇标记通常位于目标蛋白的氨基-或羧基-端。
本领域熟知多种标记多肽和它们各自的抗体。实例包括多-组氨酸(多-his)或多-组氨酸-甘氨酸(多-his-gly)标记；HIS6和金属鳌合标记，流感HA标记多肽和其抗体12CA5(Field等，Mol.cell.Biol.8：2159-2165(1988))；c-myc标记和它们的8F9、3C7、6E10、G4、B7和9E10抗体(Evan等，Molecular and Cellular Biology 5：3610-3616(1985))；和单纯疱疹病毒糖蛋白D(gD)标记和其抗体(Paborsky等，Protein Engineering 3(6)：547-553(1990))。其它的标记多肽包括FLAG-肽(Hopp等，BioTechnology 6：1204-1210(1988))；KT3抗原决定簇肽(Martin等，Science 255：192-194(1992))；微管蛋白抗原决定簇肽(Skinner等，J.Biol.chem.266：15163-15166(1991))；和T7基因10蛋白肽标记(Lutz-Freyermuth等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：6393-6397(1990))。
在一个替代实施方案中，嵌合分子可以包含目标蛋白与免疫球蛋白或免疫球蛋白特定区域的融合体。对于二价形式的嵌合分子，这样的融合可以是在IgG分子的Fc区。
适于表达所述基因的条件包括给培养物提供本发明的诱导性补料组合物。用于生产蛋白的最佳条件根据选择的宿主细胞和要表达的蛋白而变。本领域的技术人员通过常规的实验或优化可以容易地确定这样的条件。
典型地在表达后纯化或分离目标蛋白。可以以本领域技术人员已知的多种方法来分离或纯化目标蛋白，具体取决于在样品中存在的其它组分。标准纯化方法包括电泳的、分子的、免疫学的和色谱学的技术，包括离子交换色谱、疏水色谱、亲合色谱和反相HPLC色谱，和色谱聚焦。例如，可以使用标准的抗-目标蛋白抗体柱来纯化目标蛋白。还可以使用超滤和渗滤技术，并联合蛋白浓缩。要了解关于合适的纯化技术的一般指导，见：Scopes，Protein Purification(1982)。需要达到的纯化度随目标蛋白的用途而变。在有些情况下，无需纯化。
VI.发酵
本发明依赖于培养真菌和细菌的发酵方法。用于生产纤维素酶的发酵方法本身是本领域已知的。例如，可以通过固体培养或浸没培养(包括分批式、补料分批式和连续流工艺)来生产纤维素酶。
培养是在生长培养基中完成的，所述培养基含有水性的矿物盐介质、有机生长因子、碳源和能源物、分子氧，当然还含有要使用的一种或多种特定微生物的起始接种物。
除了碳源和能源、氧、可同化的氮和微生物的接种物以外，必须提供合适量的合适比例的矿物营养物，以确保合适的微生物生长，使微生物转化过程中的细胞对碳源和能源的同化作用最大化，在发酵液中实现最大的细胞产量和最大的细胞密度。
如本领域已知的，水性矿物介质的组成可以在较宽的范围内变化，部分地取决于使用的微生物和底物。除了氮以外，矿物介质应当包括合适的、可溶的、可同化的离子和化合形式的合适量的磷、镁、钙、钾、硫和钠，还应当优选地有合适的、可溶的、可同化的形式的某些微量元素，例如铜、锰、钼、锌、铁、硼和碘，这都是本领域已知的。
发酵反应是一个好氧过程，其中需要的分子氧是通过含有分子氧的气体(例如空气、富氧空气或者甚至基本上纯的分子氧)来供给，这样的气体能使发酵罐的内含物维持合适的氧分压，有效地促进微生物的优势生长。实际上，通过使用产氧的烃底物，可以减少微生物生长所需氧。尽管如此，还是必须提供用于生长的分子氧，因为底物的同化和相应的微生物的生长部分地是氧化过程。
尽管通气速度可以在可观的范围内变化，通常是以每分钟向每发酵液体积通入约0.5-10、优选地约0.5～7体积(在使用的压强下，在25℃)的含氧气体的速度来通气。该量的计算基础是，具有正常氧含量的供给反应器的空气，对于纯氧，各自的范围是约0.1-1.7或优选地约0.1～1.3体积(在使用的压强下，在25℃)氧/发酵液体积/分钟。
用于微生物转化工艺的压强可以较大地变化。压强范围通常是约0-50psig、目前优选地约0～30psig、更优选地至少略微超过大气压，以平衡设备和运行成本与达到的氧溶解度。比大气压更大是有利的，因为这样的压强确实能提高溶解氧在水性发酵液中的浓度，这反过来又能加快细胞的生长速度。同时，这又被另一事实所平衡，即较高的气压也会增加设备和运行成本。
发酵温度可以有一定的变化，对于丝状真菌(例如里氏木霉)，温度范围通常是约20～40℃，通常优选地是约25～34℃，具体取决于选择的微生物菌株。
微生物还需要可同化的氮源。可同化的氮源可以是任何含氮的化合物，或能释放出氮(以适合于被微生物代谢利用的形式)的化合物。尽管可以采用许多有机氮源化合物(例如蛋白水解物)，通常可以使用便宜的含氮化合物(例如氨、氢氧化铵、脲)和各种铵盐(例如磷酸铵、硫酸铵、焦磷酸铵、氯化铵)或各种其它的铵化合物。氨气本身对于大规模操作是方便的，可以通过以合适的量向水性发酵液(发酵培养基)中鼓泡来使用。同时，这样的氨还可以用于辅助控制pH。
水性微生物发酵液(发酵混合物)的pH应当在示例性的范围约2.0～8.0中。对于丝状真菌，pH范围通常是约2.5～8.0，对于里氏木霉，pH范围通常是约3.0～7.0。对特定微生物优选的pH范围在一定程度上取决于采用的培养基，以及具体的微生物，因而本领域的技术人员能够容易地确定随着培养基变化的pH变化。
尽管发酵混合物在发酵罐中的平均保留时间可以部分地根据采用的发酵温度和培养物而明显变化，其范围通常是约24～500小时、优选地目前约24～400小时。
优选地，发酵以这样的方式进行：控制含碳底物作为限制因素，由此较好地将含碳底物转化为细胞，避免细胞受到一定量的未转化的底物的污染。后者对于水溶性的底物不成问题，因为任何残余物都可以容易地洗掉。但是，在非水溶性的底物的情况下，它会成为问题，需要增加产物处理步骤，例如合适的洗涤步骤。
如上所述，达到该水平的时间不是至关重要的，可以随具体微生物和进行的发酵工艺而变化。但是，本领域熟知如何确定发酵培养基中的碳源浓度或者理想的碳源水平是否已达到。
尽管可以分批式地或连续操作地进行发酵，更优选地是进行补料分批式操作，因为它容易控制、能生产均匀量的产物且最经济地使用所有设备。
如果需要，在将水性矿物介质补加到发酵罐中之前，可以将部分或全部碳源和能源物和/或部分可同化的氮源物(例如氨)加入到水性矿物介质中。
优选地将引入到反应器中的每一物流控制在预定的速度，或者对可以通过监视(例如碳源和能源物的浓度、pH、溶解氧、发酵罐尾气中的氧或二氧化碳、通过光密度可以检测到的细胞密度等)检测到的需要作出反应。各种物质的补料速度可以变化，以得到尽可能快的细胞生长速度，同时经济地利用碳源和能源，以得到相对于底物消耗尽可能高的微生物细胞产量。
在分批式或优选的补料分批式操作中，所有的设备、反应器或发酵装置、罐或容器、管道、辅助循环或冷却装置等都先灭菌，通常是通过采用蒸汽，例如在约121℃进行至少约15分钟。然后在存在所有需要的营养物(包括氧和含碳底物)的情况下，向灭完菌的反应器中接种选择的微生物的培养物。采用的发酵罐的种类不是至关重要的，虽然目前优选的是在15L Biolafitte(Saint-Germain-en-Laye，法国)中操作。
通过本领域已知的方法，还可以从发酵液中收集和纯化纤维素酶。发酵液通常含有细胞碎片(包括细胞)、各种悬浮固体和其它的生物污染物，以及需要的纤维素酶产物，优选地通过本领域已知的方法将它们从发酵液中除去。
用于这样的除去以生成无细胞的滤液的合适方法包括常规的固液分离技术，例如离心、过滤、透析、微滤、旋转真空过滤、或其它已知的方法。在进行结晶之前，还可以优选地使用超滤、蒸发或沉淀等技术进一步浓缩发酵液或无细胞的滤液。
对上清液或滤液中的蛋白组分的沉淀，可以借助于盐(例如硫酸铵)来完成，随后通过多种色谱方法(例如离子交换色谱、亲合色谱)或技术领域已知的类似方法进行纯化。
实施例
下面的实施例用于解释而不是限制要求保护的发明。
实施例1
本实施例解释了如何制备用于刺激里氏木霉表达纤维素酶基因的诱导性补料组合物。孵育是在溶液pH下进行的，即5.0。对于β-葡糖苷酶，发现在pH 4.0-6.5孵育最佳。
(i)在121℃、2.2巴压强下，将60％(重量/重量)葡萄糖溶液灭菌30分钟。
(ii)将无菌的全纤维素酶制品加入到葡萄糖溶液中，至终浓度为10g总蛋白/L。
(iii)将含有葡萄糖和全纤维素酶混合物的罐在65℃、75RPM搅拌下维持3天。
(iv)孵育完后，将无菌溶液收集到用于发酵补料的合适容器中。
发现得到的诱导性补料组合物含有16.1g/L槐糖、47.5g/L龙胆二糖和约600g/L葡萄糖。可能存在其它的糖，但是未予以分析。
还从20％和60％葡萄糖溶液制备了诱导补料溶液。葡萄糖溶液浓度越高，最终的槐糖浓度越高。
已经在2g和10g总蛋白/L的终浓度使用了全纤维素酶制品。蛋白加样越多，最终的槐糖浓度越高。见图6。但是，完全可以预见，如果将溶液孵育更长的时间，用低浓度的全纤维素酶制品进行更长的反应，能达到相同的槐糖水平。
孵育温度也会影响槐糖的生成。例如，当在65℃孵育组合物时，槐糖浓度是在50℃孵育组合物时的2倍。
实施例2
下面的实施例详细说明了如何制备葡萄糖/槐糖补料并在发酵过程中用于生产纤维素酶。
I.生产葡萄糖/槐糖补料
溶解60％(重量/重量)葡萄糖溶液，在121℃灭菌30分钟。将温度降至65℃，加入10g总蛋白(先前通过里氏木霉生产的全纤维素酶)/L。缓慢搅拌混合物，并在65℃维持3天。在该60％葡萄糖溶液中测得槐糖含量是12g/L。
II.发酵
将1.5ml里氏木霉RL-P37冷冻孢子悬浮液接种到0.8L发酵液中作为种子瓶。48小时后，将该瓶分成0.4L的2份，并分别转入装在两个不同的15L Biolafitte发酵罐中的2x7L发酵培养基。生长培养基具有下述组成：
    培养基组分     g/L
    KH2PO4     4
    (NH4)2SO4     6.35
    MgSO4·7H2O     2
    CaCl2·2H2O     0.53
    葡萄糖     50
    玉米浸渍固体(Roquette)     6.25
    微量元素     1ml/L
微量元素：5g/L FeSO4·7H2O；1.6g/L MnSO4·H2O；1.4g/LZnSO4·7H2O。
发酵罐运行条件：25℃，750RPM，8标准升/分钟(SLM)气流。
在实验罐的分批式阶段，加入葡萄糖/槐糖来代替葡萄糖，但是在对照组中使用纯葡萄糖。这种分批式加入的葡萄糖在约20小时时耗尽，在该时刻细胞停止生长，开始碳限制补料。以0.25g/分钟加入40％葡萄糖/槐糖补料，向对照罐中补加40％纯的葡萄糖溶液(从上述的补料原液中稀释)。分批式阶段刚刚结束后，在葡萄糖/槐糖罐中(而不在葡萄糖对照罐中)诱导与纤维素酶的生产直接相关(基于我们对总胞外蛋白和纤维素酶活性的对比)的总蛋白。这样，在葡萄糖上用里氏木霉RL-P37生产纤维素酶需要用全纤维素酶预处理葡萄糖。见图1。
实施例3
下面的实施例详细说明了如何制备葡萄糖/槐糖补料并在发酵过程中用于从丝状真菌生产异源蛋白。
使用实施例1的方法制备诱导性补料组合物。
如下构建用于转化里氏木霉的表达质粒。用T4 DNA聚合酶剪平编码目标蛋白的基因的末端，并插入木霉表达载体pTEX的Pmel限制位点，所述的pTEX见PCT公开号WO 96/23928(其公开文本在这里引作参考)，其含有用于基因表达的CBHI启动子和终止子和用作转化体的选择标记的木霉属pyr4基因。线状DNA片段只含有CBH1启动子、编码目标蛋白的基因、CBH1终止子和选择标记pyr4，其是用凝胶分离的，用于转化里氏木霉的尿嘧啶核苷营养缺陷型菌株(见美国专利号5,472,864)，该菌株具有所述4个主要的纤维素酶基因缺失。在不含尿嘧啶核苷的木霉属最小平板上分离稳定的转化体。在28～30℃，使转化体在装有50ml Proflo培养基的摇瓶上生长4天，通过本领域技术人员已知的方法检测目标蛋白的表达。Proflo培养基的组成为(g/L)：Proflo 22.5；乳糖30.0；(NH4)2SO4 6.5，KH2PO4 2.0；MgSO4·7H2O 0.3；CaCl2 0.2；CaCO3 0.72；微量金属原液1.0ml/l和10％吐温802.0ml/l。使用的微量金属原液含有(g/L)：FeSO4·7H2O5.0；MnSO4·H2O 1.6；ZnSO4·7H2O 1.4；CoCl2·6H2O)2.8。
如实施例2所述将摇瓶分装到15L发酵罐中。通过诱导性补料组合物(而不是葡萄糖溶液)诱导了目标蛋白的表达。
实施例4
本实施例详细说明了如何固定化酶来生产诱导补料溶液。
根据美国专利号5,541,097所述的方法，固定化含有β-葡糖苷酶的全纤维素酶培养基。简单而言，向在500ml水中的10gm皂土中加入11ml 10％PEI。分开地，将20ml全纤维素酶(200g总蛋白/L)加入到250ml 0.02M醋酸盐缓冲液(pH 5.5)中。然后在维持pH 5.5的情况下，将4.44ml 50％戊二醛(Fischer，试剂级)加入到酶溶液中。2小时后，将酶复合物加入到皂土复合物中，得到约750ml的总体积。将该混合物在4℃混合过夜。然后在布氏漏斗上收集复合物，并用大量水洗涤。然后将滤饼重新悬浮在0.02M醋酸盐缓冲液中，终重量为175gm。
难以对固定化以后的残余的酶活性进行定量，因为全纤维素酶含有超过5种不同的酶，每种酶各有不同的活性(已经证实固定化的酶能减少大麦粉浆的粘度，所以知道存在纤维素酶活性)。因此，纤维素酶的加样是以固定化了的酶的量(而不是残余活性的量)为基础来完成的。测得最终的浆中含有0.022g总蛋白/g浆。
在两种不同的酶加样和葡萄糖浓度下，检测了从固定化的纤维素酶生产的槐糖：
1)23g浆+29.5ml 67％(重量/重量)葡萄糖＝10g/L蛋白加样，在40.7％葡萄糖
2)7.6g浆+44.8ml 67％(重量/重量)葡萄糖＝3.2g/L蛋白加样，在60％葡萄糖
将每个52.5ml体积加入到250ml Erlenmeyer摇瓶中，在100RPM搅拌并在65℃孵育几天。
在两种情况中的任何一种下，槐糖的生产速度都低于对照情况(其中加入了相同量的酶溶液作为固定化酶)(图2-3)。这不足为怪，可以想象酶在固定化以后丧失了一些酶活性。但是，固定化的很大的优点是，酶可以用于进行多批葡萄糖/槐糖补料。图4表明，将固定化的酶离心除去葡萄糖溶液，重复上述实验，在第一次和第二次实验中得到了相同的最终槐糖滴度。这表明，该酶在使用了至少2次(且可能更多次)以后仍然有活性。因此，尽管固定化会损失一些酶活性，能重复利用酶多次的能力使纤维素酶固定化成为用于葡萄糖/槐糖生产的最有吸引力的替代方案。
实施例5
本实施例详细说明了如何使用纤维二糖作为起始碳源来生产诱导补料溶液。
该实验的操作与在摇瓶中生产槐糖的其它实施例(50ml在250ml瓶中，65℃，100RPM)基本相同，下述条件除外。图5对比了在25％纤维二糖与在25％葡萄糖中生产的槐糖。
如果槐糖本质上是“真正的”诱导物，它最可能必须从纤维二糖形成，因为里氏木霉在本质上非常难以利用即使中等水平的葡萄糖(通过转糖苷作用形成槐糖时需要葡萄糖)。图5显示了与10g/L纤维素酶一起孵育的25％(重量/重量)纤维二糖(与25％葡萄糖对比)。从纤维二糖生产的槐糖峰值大于10g/L，是单独通过葡萄糖生产的浓度的3倍。但是，槐糖又被降解到与单独从葡萄糖生产的相似的水平(4.1g/L对2.5g/L)。该行为似乎表明槐糖与葡萄糖(在纤维二糖被水解约29小时后，只剩下葡萄糖)达到了平衡。
非常不可能的是，β-葡糖苷酶在本质上利用了足够的葡萄糖浓度来形成大量槐糖。细胞更可能利用高浓度的纤维二糖(纤维素的分解产物)。图5表明，从纤维二糖生成的槐糖是从葡萄糖生成的三倍。在约29小时时，槐糖水平水平趋于下降，同时纤维二糖完全转化为葡萄糖和其它的转糖苷作用产物(纤维二糖数据未显示)。这支持了一个假想机制，其中纤维二糖被分解成2个葡萄糖分子，然后在离开活性部位之前重排和转糖苷化。随着纤维二糖实验的进行，槐糖的分解速度超过了槐糖从葡萄糖转糖苷作用生成的速度，槐糖水平几乎下降到葡萄糖水平，4.1g/L对2.5g/L。该数据有力地支持了这种可能性：少量的槐糖是通过β-葡糖苷酶剪切纤维二糖而形成的。
应当理解，本文所述的实施例和实施方案仅仅用于解释目的，本领域的技术人员能够明白根据它们作出的各种改进或变化，并且包括在本申请的精神和范围以及所附权利要求书的范围内。为了所有目的，将本文中引用的所有文献、专利和专利申请在这里整体并入作为参考。

Claims (33)

1.一种生产诱导性补料组合物的方法，所述方法包括下述步骤：
a.将第一种溶液与全纤维素酶制品混合，得到第一种混合物；和
b.将第一种混合物在一定的温度孵育足够的时间，生成诱导性补料组合物。
2.如权利要求1的方法，其中第一种溶液是含有约5％至约75％(重量/重量)葡萄糖的浓葡萄糖溶液。
3.如权利要求1的方法，其中第一种溶液是含有约50％至约75％(重量/重量)葡萄糖的浓葡萄糖溶液。
4.如权利要求1的方法，其中第一种溶液是含有约5％至约40％(重量/重量)纤维二糖的纤维二糖溶液。
5.如权利要求1的方法，其中第一种溶液是含有约20％至约40％(重量/重量)纤维二糖的纤维二糖溶液。
6.如权利要求1的方法，其中全纤维素酶制品是约2g/L至约10g/L的蛋白。
7.如权利要求1的方法，其中全纤维素酶制品是约5g/L的蛋白。
8.如权利要求1的方法，其中温度是约50℃至约75℃.
9.如权利要求1的方法，其中孵育溶液8～500小时。
10.如权利要求1的方法，其中孵育溶液48～72小时。
11.通过权利要求1的方法生产的诱导性补料组合物。
12.如权利要求11的诱导性补料组合物，含有糖混合物。
13.如权利要求11的诱导性补料组合物，含有槐糖。
14.如权利要求11的诱导性补料组合物，含有龙胆二糖。
15.一种生产蛋白的方法，包括给宿主细胞提供权利要求11的诱导性补料组合物。
16.如权利要求15的方法，其中生产的蛋白是内源纤维素酶。
17.如权利要求15的方法，其中的宿主细胞已经用表达构建体转化，所述构建体包含可操作地连接到编码目标蛋白的基因上的启动子。
18.如权利要求17的方法，其中启动子是可诱导的启动子。
19.如权利要求17的方法，其中启动子是纤维素酶基因启动子。
20.如权利要求19的方法，其中启动子是来自里氏木霉的cbh1启动子。
21.如权利要求18的方法，其中可诱导的启动子是槐糖-可诱导的启动子。
22.如权利要求18的方法，其中可诱导的启动子是龙胆二糖-可诱导的启动子。
23.如权利要求17的方法，其中目标蛋白是异源蛋白。
24.如权利要求23的方法，其中的异源蛋白选自激素、酶、生长因子、细胞因子和抗体。
25.如权利要求15的方法，其中宿主细胞是丝状真菌。
26.如权利要求25的方法，其中的真菌选自木霉属、腐质霉属、镰刀菌属、曲霉属、链孢霉属、青霉属、头孢属、绵霉属、束柄霉属、疫病霉属、毛霉属、旋孢腔菌属和梨孢属。
27.如权利要求26的方法，其中的真菌是木霉属物种。
28.如权利要求27的方法，其中的真菌是里氏木霉。
29.如权利要求26的方法，其中的真菌是青霉属物种。
30.如权利要求29的方法，其中的真菌是绳状青霉(Penicilliumfuniculosum)。
31.如权利要求15的方法，其中的宿主细胞是细菌。
32.如权利要求31的方法，其中的细菌选自链霉菌属、热单胞菌属、芽孢杆菌属和纤维单孢菌属。
33.如权利要求1的方法，其中的全纤维素酶制品是固定化的。
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