CN102459581B - 蛋白质 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及制备变体脂肪分解酶的方法，其包括在宿主生物中表达核苷酸序列，所述核苷酸序列与编码真菌脂肪分解酶的核苷酸序列具有至少90％的同一性并且在对应于所编码氨基酸序列中的位置包含至少一个以下修饰：a)与原真菌脂肪分解酶相比在所述氨基酸序列中引入至少一个糖基化位点(或一个额外的糖基化位点)；b)在所述多肽的表面位置和所述酶活性位点(催化三联体)的远侧外环内的位置引入至少一个氨基酸，所述氨基酸更加亲水(与原氨基酸相比)；或c)在33、63、78、190、305、306或320位中的一个或多个位置的取代或插入，或者在311-312或307-319位中的一个或多个位置的删除，其中各氨基酸位置均对应于与SEQ ID No.2比对时所述氨基酸序列的位置；其中当所述核苷酸序列与编码SEQ ID No.22或SEQ ID No.23所示的真菌脂肪分解酶序列的核苷酸序列具有至少90％的同一性时，所述修饰不是在63位的取代并且所述删除不在311-312位。优选地，所述核苷酸序列与SEQ ID No.1具有至少90％同一性。本发明还涉及通过所述方法产生的多肽以及新核酸。

Description

蛋白质
技术领域
本发明涉及新的(变体)脂肪分解酶和一个或多个编码一个或多个新脂肪分解酶的多核苷酸。本发明还涉及产生脂肪分解酶的方法及其应用。本发明还涉及改良食品的制备，尤其是改良烘焙产品的制备。具体地，本发明涉及脂肪分解酶，所述酶能够赋予包括烘焙产品在内的食品产品改良的特征。 
背景技术
在食品和/或饲料工业中使用的脂肪分解酶(E.C.3.1.1.x)的有益用途已知多年。 
例如，在EP 0 585 988中主张向生面团中加入脂酶可改善保鲜效果，并且提出获自少根根霉菌(Rhizopus arrhizus)的脂酶在与起酥油/脂肪(shortening/fat)联用时，添加至生面团时能够改善所得面包的质量。WO94/04035中教导可通过在生面团中添加脂酶但向所述生面团添加任何脂肪或油即获得改善的面包柔软性。Castello，P.ESEGP 89-10 Dec.1999 Helsinki表明外源性脂酶可以改变面包体积。 
小麦粉中脂酶作用的底物是1.5-3％内源性小麦脂质，所述内源性小麦脂质是极性与非极性脂质的复杂混合物。极性脂质可分为糖脂和磷脂。这些脂质由两个脂肪酸所酯化的甘油和极性基团构成。所述极性基团促成这些脂质的表面活性。对这些脂质中的脂肪酸之一的酶切导致表面活性高出很多的脂质。已知诸如DATEM的具有高表面活性的乳化剂在添加到生面团中时产生显著作用。 
脂肪分解酶可从存在于食品中的脂质水解一种或多种脂肪酸，这可以在食品中产生有效的乳化剂分子，从而提供具有商业价值的功能性。提供最显著的乳化特性的分子是部分水解产物，诸如溶血磷脂(lyso-phospholipid)、溶血糖脂(lyso-glycolipid)和甘油单酯(mono-glyceride)分子。极性脂质水解产物，即溶血磷脂和溶血糖脂尤其有利。在制作面包时，这种原位产生的乳化剂可 起到与乳化剂(例如DATEM)等价的作用。 
但是，也发现脂肪分解酶的活性导致游离脂肪酸的蓄积，这会在食品中产生不良作用。脂肪分解酶的这一固有活性限制了其功能。 
对面包体积的负面影响往往以剂量过大(overdosing)来解释。剂量过大可导致面筋弹力下降，这使生面团过硬，并因此使面包体积缩小。另外，或可选地，这些脂酶能降解添加到生面团中的起酥油、油脂和乳脂，导致生面团和烘焙产品有不良风味。剂量过大和不良风味归因于面团中游离脂肪酸(尤其是短链脂肪酸)的蓄积。 
原料或食品产品中高水平游离脂肪酸(FFA)的存在普遍被认为是质量缺陷，食品生产商和消费者往往在食品规范中规定了FFA的最高水平。过量FFA水平所产生的作用会导致感官和/或功能上的缺陷。 
在WO2005/087918中鉴定了来自镰刀菌(Fusarium)物种，例如异孢镰刀菌(Fusarium heterosporum)CBS 782.83的新型真菌脂肪分解酶，并且发现其在某些应用中其具有优越的性质。这些酶在汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha)中表达并且显示主要水解出生面团中糖脂和磷脂sn-1位置的脂肪酸。 
一些真菌脂肪分解酶的问题是所述酶的表达可能受限并因此可能具有高生产成本。例如，适合工业规模活性的大量酶表达可能受到限制。工业上感兴趣于发现表达增强的新脂肪分解酶，特别是这能够在没有功能性和/或活性受损的情况下实现时。 
发明概述 
已经意外地发现，与制备出本发明新变体脂肪分解酶的野生型酶相比，本发明新变体脂肪分解酶显示了提高的表达。值得注意的是，所述提高的表达是在不损害酶功能性和/或活性和/或应用性的情况下实现的。此外，与野生型酶相比，新的变体脂肪分解酶还可以显示改善的功能性和/或活性。 
本发明人已经发现，通过改变(取代或插入)位于脂肪分解酶活性位点(催化三联体)的远侧外环中的一个或多个表面氨基酸，以用(与原氨基酸相比)更亲水的氨基酸代替所述表面氨基酸，或者引入亲水氨基酸，或者引入糖基化位点，随后，与野生型酶相比，可显著且惊人地提高所述变体酶的表达和/ 或功能性和/或活性。优选地，为了引入一个或多个糖基化位点，用Asn、Ser和/或Thr(或其组合)代替所述表面氨基酸。可选地，或者此外，可以通过插入选自Asn、Ser和/或Thr的一个或多个氨基酸修饰活性位点远侧的外环，以引入一个或多个糖基化位点。脂肪分解酶通常在脂肪和水之间(即亲水环境和疏水环境之间)的界面起作用，因此，脂肪分解酶在某些应用中的性能非常依赖于该界面以及水活性。不希望受理论约束，通过在远离酶活性位点的位置(即酶活性位点远侧的环中)改变脂肪分解酶表面的亲水性，可控制酶在脂肪/水界面内的朝向，从而使所述活性位点朝向酶的底物，即脂肪。因此，可修饰脂肪分解酶以优化酶在界面内的朝向，从而提高酶活性。此外，或者可选择地，通过引入糖基化位点可增强酶的折叠以及从宿主生物的表达和/或分泌，由此增强变体酶的表达。 
此外或者可选地，本发明人还发现了惊人地显著提高脂肪分解酶的表达和/或功能和/或活性的多种特异修饰。这些可包括加入糖基化位点和/或稳定酶的C-末端区域。在一些实施方式中，特异的修饰提高了表达，但不损害脂肪分解酶的功能性和/或活性。因此，与野生型(KLM1)酶相比，一些所述特异修饰提高了表达，而不损害变体酶的应用性能，所述野生型(KLM1)酶的前原序列(propresequence)在本文中示为SEQ ID No.2(其成熟形式为SEQ ID No.2的氨基酸31-305)。 
因此，一方面，本发明提供了制备变体脂肪分解酶的方法，其包括在宿主生物中表达核苷酸序列，所述核苷酸序列与编码真菌脂肪分解酶的核苷酸序列具有至少90％的同一性，或者通过一个或数个核酸的添加、删除或取代而不同于编码真菌脂肪分解酶的核苷酸序列，并且在对应于所编码的氨基酸序列中的位置包含至少一个以下修饰：a)与原真菌脂肪分解酶相比，在所述氨基酸序列中引入至少一个糖基化位点(或一个额外的糖基化位点)；b)在所述多肽的表面位置和在所述酶活性位点(催化三联体)的远侧外环内的位置引入至少一个氨基酸，所述氨基酸更加亲水(与原氨基酸相比)；或c)在33、63、78、190、305、306或320位中的一个或多个位置的取代或插入或者在311-312或307-319位中的一个或多个位置的删除，其中各氨基酸位置均对应于与SEQ ID No.2比对时所述氨基酸序列的位置；其中当所述核苷酸序列与编码SEQ ID No.22或SEQ ID No.23所示的真菌脂肪分解酶序列的核苷酸序列具 有至少90％的同一性或者通过一个或数个核酸的添加、删除或取代而不同于编码SEQ ID No.22或SEQ ID No.23所示的真菌脂肪分解酶序列的核苷酸序列时，所述修饰不是在63位的取代并且所述删除不在311-312位(其中比对时所述氨基酸位置编号为SEQ ID No.2所示)。 
所述方法可以通过在多肽的表面位置取代或插入一个或多个氨基酸而在所述表面位置引入至少一个氨基酸，其中所述取代或插入时用(与原氨基酸相比)更亲水的氨基酸。 
在另一个实施方式中，本发明提供了产生变体脂肪分解酶的方法，所述方法包括在宿主生物中表达核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID No.1具有至少90％的同一性，或者通过一个或数个核酸的添加、删除或取代而不同于SEQ ID No.1，并且在对应于所编码氨基酸序列中的位置包含至少一个以下修饰：a)在所述氨基酸序列中引入至少一个糖基化位点；b)在所述多肽的表面位置和在所述酶活性位点(催化三联体)的远侧外环内的位置引入至少一个亲水氨基酸；或c)在33、63、78、190、305、306或320位中的一个或多个位置的取代或插入，或者在311-312或307-319位中的一个或多个位置的删除，其中各氨基酸位置均对应于SEQ ID No.2的氨基酸序列的位置。 
本发明还提供了产生脂肪分解酶的方法，所述方法包括在宿主生物中表达包含SEQ ID No.8、SEQ ID No.6、SEQ ID No.4、SEQ ID No.10、SEQ ID No.12、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.18、SEQ ID No.20或SEQ ID No.26的核苷酸序列；或者与其具有至少98％(优选至少99％，合适地为至少99.5％，如至少99.8％)同一性的核苷酸序列；或者通过一个或数个核苷酸的添加、删除或取代而不同于SEQ ID No.8、SEQ ID No.6、SEQ ID No.4、SEQ ID No.10、SEQ ID No.12、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.18、SEQ ID No.20或SEQ ID No.26的核苷酸序列，或者通过遗传密码简并性而与SEQ ID No.8、SEQ ID No.6、SEQ ID No.4、SEQ ID No.10、SEQ ID No.12、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.18、SEQ ID No.20或SEQ ID No.26的核苷酸序列相关。 
本发明还提供了制备脂肪分解酶的方法，所述方法包括用编码对极性脂质内的酯键具有水解活性的多肽的重组核酸转化宿主细胞，其中所述核酸包括含SEQ ID No.8、SEQ ID No.6、SEQ ID No.4、SEQ ID No.10、SEQ ID No. 12、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.18、SEQ ID No.20或SEQID No.26的核苷酸序列；或者与SEQ ID No.4、SEQ ID No.6、SEQ ID No.8、SEQ ID No.10、SEQ ID No.12、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.18、SEQ ID No.20或SEQ ID No.26具有至少98％(优选至少99％，合适地为至少99.5％，如至少99.8％)同一性的核苷酸序列；或者通过一个或数个核苷酸的添加、删除或取代而不同于SEQ ID No.8、SEQ ID No.6、SEQ ID No.4、SEQ ID No.10、SEQ ID No.12、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.18、SEQ ID No.20或SEQ ID No.26的核苷酸序列，或者通过遗传密码简并性而与SEQ ID No.8、SEQ ID No.6、SEQ ID No.4、SEQ ID No.10、SEQ ID No.12、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.18、SEQ ID No.20或SEQ ID No.26的核苷酸序列相关，所述宿主细胞能够表达编码所述多肽的核苷酸序列；在表达所述核酸的条件下培养所转化的宿主细胞并收集所述脂肪分解酶。 
本发明提供了本发明核酸的增化表达，并因此提供了变体多肽的改良生产方法。 
在进一步的方面，本发明提供了通过本发明方法获得的多肽(前原多肽或成熟的脂肪分解酶)。 
在再进一步的方面，本发明提供了包含编码脂肪分解酶的核苷酸序列的核酸，并且所述核苷酸序列在对应于所编码氨基酸序列中的位置包含至少一个以下修饰：a)在所述氨基酸序列中引入至少一个糖基化位点；b)在所述多肽的表面位置和在所述酶活性位点(催化三联体)的远侧外环内的位置引入至少一个亲水氨基酸的；或c)在33、63、78、190、305、306或320位中的一个或多个位置的取代或插入或者在311-312或307-319位中的一个或多个位置的删除，其中各氨基酸位置均对应于SEQ ID No.2的氨基酸序列的位置，其中当所述核苷酸序列编码SEQ ID No.22或SEQ ID No.23所示的真菌脂肪分解酶序列的核苷酸序列时，所述修饰不是在63位的取代，并且所述删除不在311-312位(其中比对时氨基酸位置编号为SEQ ID No.2所示)。 
在另一方面，本发明提供了包含核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列与SEQ ID No.1具有至少90％的同一性，或者通过一个或数个核苷酸的添加、删除或取代而不同于SEQ ID No.1，并且在对应于所编码的氨基酸序列中的 位置包含至少一个以下修饰：a)在所述氨基酸序列中至少一个糖基化位点的引入；b)在所述多肽的表面位置和在所述酶活性位点(催化三联体)的远侧的外环内的位置的至少一个亲水氨基酸的引入；或c)在33、63、78、190、305、306或320位中的一个或多个位置的取代或插入，或者在311-312或307-319位中的一个或多个位置的删除，其中各氨基酸位置均对应于SEQ ID No.2的氨基酸序列的位置。 
本发明进一步提供了编码对极性脂质内的酯键具有水解活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包括SEQ ID No.8、SEQ ID No.6、SEQ ID No.4、SEQ ID No.10、SEQ ID No.12、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.18、SEQ ID No.20或SEQID No.26的核苷酸序列；或者与SEQ ID No.8、SEQ ID No.6、SEQ ID No.4、SEQ ID No.10、SEQ ID No.12、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.18、SEQ ID No.20或SEQID No.26具有至少98％(优选至少99％，合适地为至少99.5％，如至少99.8％)同一性的核苷酸序列；或者通过一个或数个核苷酸的添加、删除或取代而不同于SEQ ID No.4、SEQ ID No.6、SEQ ID No.8、SEQ ID No.10、SEQ ID No.12、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.18、SEQ ID No.20或SEQ ID No.26的核苷酸序列，或者通过遗传密码简并性而与SEQ ID No.4、SEQ ID No.6、SEQ ID No.8、SEQ ID No.10、SEQ ID No.12、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.18、SEQ ID No.20或SEQ ID No.26的核苷酸序列相关。 
在一个实施方式中，所述优选的核苷酸序列为SEQ ID No.8(突变体5)所示的核苷酸序列，或者通过遗传密码的简并性而与SEQ ID No.8相关的核苷酸序列。 
在再一方面，本发明提供了由本发明核酸或核苷酸序列编码的变体多肽。 
本发明另一方面提供了变体多肽，所述变体多肽对极性脂质中的酯键具有水解活性，并且包含与SEQ ID No.2的氨基酸33-296具有至少90％同一性，或者通过一个或数个氨基酸的添加、删除或取代而不同于SEQ ID No.2的氨基酸33-296的氨基酸序列，并且与SEQ ID No.2中所示的序列相比所述变体多肽已被修饰从而a)在所述氨基酸序列中引入至少一个糖基化位点；b)在所述多肽的表面位置和在所述酶活性位点(催化三联体)的远侧外环内的 位置引入至少一个亲水氨基酸；或c)在33、63、78或190位中的至少一个或多个位置取代或插入氨基酸，其中各氨基酸位置均对应于SEQ ID No.2中所示氨基酸序列的位置。 
另一方面，本发明提供了对极性脂质中的酯键具有水解活性，并且包含SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、SEQ ID No.11、SEQ ID No.13、SEQ ID No.17、SEQ ID No.19、SEQ ID No.21或SEQ ID No.25的氨基酸33-296(或氨基酸31-305)所示氨基酸序列的多肽。 
再一方面，本发明提供了前原多肽，当在宿主生物中进行翻译后加工时其产生了对极性脂质中的酯键具有水解活性的多肽，其中所述前原多肽包含SEQ ID No.9、SEQ ID No.7、SEQ ID No.5、SEQ ID No.11、SEQ ID No.13、SEQ ID No.15、SEQ ID No.17、SEQ ID No.19、SEQ ID No.21或SEQ ID No.25所示的氨基酸序列。 
一方面，本发明还提供了对极性脂质中的酯键具有水解活性的多肽，所述多肽可得自于包含SEQ ID No.9、SEQ ID No.7、SEQ ID No.5、SEQ ID No.11、SEQ ID No.13、SEQ ID No.15、SEQ ID No.17、SEQ ID No.19、SEQ ID No.21或SEQ ID No.25所示氨基酸序列的前原多肽。 
根据宿主生物，前原序列常常经历翻译后修饰。对于本发明的酶，所述生物较常除去前原序列的N-末端区，即除去SEQ ID No.9、SEQ ID No.7、SEQ ID No.5、SEQ ID No.11、SEQ ID No.13、SEQ ID No.15、SEQ ID No.17、SEQ ID No.19、SEQ ID No.21或SEQ ID No.25的氨基酸1-30的所有或部分。在一些实施方式中，所述宿主生物可以除去比SEQ ID No.9、SEQ ID No.7、SEQ ID No.5、SEQ ID No.11、SEQ ID No.13、SEQ ID No.15、SEQ ID No.17、SEQ ID No.19、SEQ ID No.21或SEQ ID No.25的氨基酸1-30所示的那些略多的氨基酸，例如除去氨基酸1-31、1-32或1-33。在一些情况下，所述宿主细胞可以引入可选的N-末端序列，所述序列可涵盖氨基酸1-30所示氨基酸的所有或部分或者可以包含完全不同的N-末端序列(例如EAEA或EA)。在一些情况下，通过宿主生物由前原序列产生的成熟酶在其N-末端可以为异基因(heterogen)。在一些实施方式中，所述翻译后修饰可以表示在前原序列的C-末端区中的修饰。例如，在成熟形式中，可以从SEQ ID No.9、SEQ ID No.7、SEQ ID No.5、SEQ ID No.11、SEQ ID No.13、SEQ ID No.15、 SEQ ID No.17、SEQ ID No.19、SEQ ID No.21或SEQ ID No.25除去氨基酸306-348的所有或部分。在一些实施方式中，宿主生物可以除去比SEQ ID No.9、SEQ ID No.7、SEQ ID No.5、SEQ ID No.11、SEQ ID No.13、SEQ ID No.15、SEQ ID No.17、SEQ ID No.19、SEQ ID No.21或SEQ ID No.25的氨基酸306-348所示的那些略多的氨基酸，例如除去氨基酸305-348或304-348或303-348。在一些情况下，通过宿主生物由前原序列产生的成熟酶在其C-末端可以为异基因。认为本发明包括可以从前原多肽获得的所有成熟形式的蛋白，所述前原多肽包含SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、SEQ ID No.11、SEQ ID No.13、SEQ ID No.15、SEQ ID No.17、SEQ ID No.19、SEQ ID No.21或SEQ ID No.25所示的氨基酸序列，尤其是从宿主生物里氏木霉(Trichoderma reesei)获得的那些。 
本发明还提供了本发明核酸增强脂肪分解酶从宿主生物的表达的用途。合适地，宿主生物可以为真菌，优选木霉(Trichoderma)，优选里氏木霉。合适地，与野生型核酸(即没有任何本发明修饰的核酸)相比，所述表达增强约2倍至约25倍。 
本发明进一步提供了制备食品的方法，所述方法包括向所述食品的一个或多个成分加入本发明的多肽。 
再一方面，本发明提供了制备烘焙产品的方法，所述方法包括向生面团中加入本发明的多肽并烘焙所述生面团以制备烘焙产品。 
本发明进一步提供了制备溶血磷脂的方法，所述方法包括用本发明的多肽处理磷脂以产生溶血磷脂。 
在再一实施方式中，本发明提供了制备溶血糖脂的方法，所述方法包括用本发明的多肽处理糖脂以产生溶血糖脂。 
本发明进一步提供了植物油或食用油的酶促脱胶方法，所述方法包括用本发明的多肽处理食用油或植物油以水解其中存在的大部分极性脂质。 
再一方面，本发明提供了通过本发明的方法获得的食品或烘焙产品。 
本发明的各方面描述在权利要求书和以下评述中。 
可用于本发明核苷酸序列的其它方面包括：包含本发明的序列的构建体；包含用于本发明的序列的载体；包含用于本发明的序列的质粒；包含用于本发明的序列的转化细胞；包含用于本发明的序列的转化组织；包含用于本发 明的序列的转化器官；包含用于本发明的序列的转化宿主；包含用于本发明的序列的转化生物。本发明还包括表达用于本发明的核苷酸序列的方法，所述方法利用所述核苷酸序列，例如在宿主细胞中的表达；包括用于转移所述核苷酸序列的方法。本发明还包括分离(例如从宿主细胞中分离)所述核苷酸序列的方法。 
涉及用于本发明氨基酸序列的其它方面包括：编码用于本发明的氨基酸序列的构建体；编码用于本发明的氨基酸序列的载体；编码用于本发明的氨基酸序列的质粒；表达用于本发明的氨基酸序列的转化细胞；表达用于本发明的氨基酸序列的转化组织；表达用于本发明的氨基酸序列的转化器官；表达用于本发明的氨基酸序列的转化宿主；表达用于本发明的氨基酸序列的转化生物。本发明还包括纯化用于本发明的氨基酸序列的方法，所述方法利用所述氨基酸序列，例如在宿主细胞中的表达；包括转移所述氨基酸序列的方法，然后纯化所述序列。 
为了便于参考，本发明的这些和进一步的方面在以下适当分标题下进行讨论。然而，各部分的教导并不必然局限于各具体的部分。 
发明详述 
对本文所用氨基酸位置的所有引用都通过参考氨基酸序列SEQ ID No.2而进行。换句话说，当考虑氨基酸位置编号时，通过与SEQ ID No.2的氨基酸序列比对，并且通过参考利用SEQ ID No.2作为参考序列的比对序列的位置编号可以确定氨基酸位置编号(参见，例如显示SEQ ID No.2(在图22中称为KLM1)与本文教导的其它序列的比对的图22)。 
合适地，本发明使用的宿主生物可以为真菌，优选来自木霉属，更优选来自里氏木霉种。 
在一个实施方式中，在修饰前所述真菌脂肪分解酶不包含任何糖基化位点。换句话说，本发明的方法可以用于向原始或天然不包含任何糖基化位点的脂肪分解酶中引入至少一个糖基化位点。 
合适地，本发明的变体多肽可以包含至少两个，合适地为至少三个糖基化位点。 
优选地，本发明的核苷酸序列或者在本发明的方法中使用的核苷酸序列 分别与SEQ ID No.1或与SEQ ID No.24，或者与SEQ ID No.24的第23-106位中所示的核苷酸序列；或者与SEQ ID No.24的第113-1063位中所示的核苷酸序列，或者与SEQ ID No.24的第113-929位中所示的核苷酸序列相比具有至少90％同一性(优选至少95％，更优选至少98％，合适的为至少99％，例如至少99.5％同一性)，但与SEQ ID No.1或与SEQ ID No.24，或者与SEQ ID No.24的第23-106位中所示的核苷酸序列；或者与SEQ ID No.24的第113-1063位中所示的核苷酸序列，或者与SEQ ID No.24的第113-929位中所示的核苷酸序列分别相比包含至少一个修饰，或者具有与上述任一序列的区别在于一个或数个核苷酸的添加、删除或取代的核苷酸序列。 
在一个实施方式中，当所述核苷酸序列与编码SEQ ID No.22或SEQ ID No.23中所示的真菌脂肪分解酶的核苷酸序列具有至少90％同一性，或者所述核苷酸序列与编码SEQ ID No.22或SEQ ID No.23中所示的真菌脂肪分解酶的核苷酸序列区别于一个或数个核苷酸的添加、删除或取代时，所述修饰不是在第63位的取代(例如其不是取代K63N)，并且所述删除不在第311-312位。编码SEQ ID No.22或SEQ ID No.23中所示的真菌脂肪分解酶的核苷酸序列在本文中如SEQ ID No 24或其部分(例如SEQ ID No.24的第23-106位中所示的核苷酸序列；或者SEQ ID No.24的第113-1063位中所示的核苷酸序列，或者SEQ ID No.24的第113-929位中所示的核苷酸序列)所示。 
在一个实施方式中，优选本发明的修饰对应于在多肽表面位置和所述酶活性位点的远侧外环中的位置引入至少一个糖基化位点。 
优选地，所述核苷酸序列经修饰，从而使位于所述多肽的表面位置和所述酶活性位点的远侧外环中的位置的一个或多个氨基酸被比原氨基酸更亲水的氨基酸取代。 
可选地，所述核苷酸序列可以被修饰，从而使一个或多个亲水氨基酸插入到所述多肽的表面位置和所述酶活性位点的远侧外环中的位置。 
在一个优选的实施方式中，所述核苷酸经修饰，从而在所编码的氨基酸中取代或插入一个或多个氨基酸以产生一个或多个共有序列Asn-Xxx-Ser或Asn-Xxx-Thr，其中Xxx可为除Pro外的任何氨基酸。 
在一个实施方式中，修饰核苷酸序列，从而在所编码的氨基酸序列中引 入一个或多个Asn、Ser或Thr。换句话说，本发明的核苷酸序列包含对应于向所编码的蛋白中引入一个或多个Asn、Ser或Thr的修饰。 
合适地，在本发明的方法或核酸中，可以引入至少两个，合适地为至少三个糖基化位点。 
本发明的核苷酸序列和本发明方法中的核苷酸序列可以进一步修饰，以与原脂肪分解酶相比，例如与包含SEQ ID No.2或其氨基酸33-296(或31-305)的脂肪分解酶相比，强化蛋白的C-末端加工。 
合适地，所述核苷酸序列或多肽可以包含C-末端加工，优选地以使所述多肽更稳定。 
在本申请中，认为所述多肽的C-末端是自第306位氨基酸之前，其中所述位置对应于比对时SEQ ID No.2的氨基酸序列的位置。 
合适地，如本发明所教导地，所述C-末端加工包含以下一个或多个：在第306或320位的取代或插入，或者在C-末端中的一个或多个KEX2位置的删除，其中各个位置对应于SEQ ID No.2的氨基酸序列的位置。合适地，所述C-末端加工可以包含至少一个C-末端KEX2位点的去除。不希望受理论限制，KEX2位点的去除引起蛋白水解加工的停止或蛋白水解加工速率的降低以及改良蛋白的稳定性而不使其活性受损。一个KEX2位点可见于第306位(与SEQ ID No.2比对时)。另一个KEX2位点可见于第311-312位(当与SEQ ID No.2比对时)。 
优选地，本发明的核苷酸序列或者用于本发明的核苷酸序列被修饰，从而在第33、63、78、190和305位中的一个或多个位置具有取代，其中所述氨基酸被N取代。 
合适地，本发明的核苷酸序列或者用于本发明的核苷酸序列可以被修饰，从而在第63、78、190和305位中的一个或多个位置具有取代，其中所述氨基酸被N取代。 
在一个实施方式中，本发明的核苷酸序列或者用于本发明的核苷酸序列可以被修饰，从而在第190、191和192位引入糖基化位点(从而使所述糖基化位点包含共有序列Asn-Xxx-Ser或者Asn-Xxx-Thr，其中Xxx为除Pro外的任何氨基酸)。 
在另一个实施方式中，本发明的核苷酸序列或者用于本发明的核苷酸序 列可以被修饰，从而在第33、34和35位引入糖基化位点(从而使所述糖基化位点包含共有序列Asn-Xxx-Ser或者Asn-Xxx-Thr，其中Xxx为除Pro外的任何氨基酸)。 
在另一个实施方式中，本发明的核苷酸序列或者用于本发明的核苷酸序列可以被修饰，从而在第63、64和65位引入糖基化位点(从而使所述糖基化位点包含共有序列Asn-Xxx-Ser或者Asn-Xxx-Thr，其中Xxx为除Pro外的任何氨基酸)。 
在另一个实施方式中，本发明的核苷酸序列或者用于本发明的用途的核苷酸序列可以被修饰，从而在第78、79和80位引入糖基化位点(从而使所述糖基化位点包含共有序列Asn-Xxx-Ser或者Asn-Xxx-Thr，其中Xxx为除Pro外的任何氨基酸)。 
所述糖基化位点可以通过单个氨基酸的修饰(例如插入或取代)而引入。可选地，为了引入糖基化位点，可以对多于一个氨基酸(例如2个或3个氨基酸)进行修饰(例如插入或取代)。 
合适地，本发明的核苷酸序列或者用于本发明的核苷酸序列可以被修饰，从而在第190位具有取代，其中所述氨基酸被N取代。 
在一个实施方式中，优选地，本发明的核苷酸序列包含本文SEQ ID No.8所示核苷酸序列的全部序列或部分(或者通过遗传密码的简并性与SEQ ID No.8相关的核苷酸序列)。本发明还进一步提供了由该核苷酸序列编码的多肽。 
在一个实施方式中，本发明的变体多肽或用于本发明的变体多肽包含SEQ ID No.9的氨基酸33-296(或31-304或31-305)中所示的氨基酸序列。 
合适地，本发明的核苷酸序列或者用于本发明的核苷酸序列可以被修饰，从而在第306位具有取代，其中所述氨基酸被除K或R或A以外的任意氨基酸取代，优选所述306位的取代是被氨基酸S取代。 
合适地，本发明的核苷酸序列或者用于本发明的核苷酸序列可以被修饰，从而在第320位具有取代，其中所述氨基酸被除T以外的任意氨基酸取代，优选所述320位的取代是被氨基酸E取代。 
本发明的变体多肽，无论是由本发明的核酸编码的变体多肽，还是通过本发明的方法产生的变体多肽，优选具有磷脂酶活性或者半乳糖酯酶活性。 
在一些实施方式中，优选对变体多肽或其编码核酸进行的修饰是在变体多肽上加入至少一个糖基化位点(或者多个糖基化位点)和/或涉及C-末端加工以稳定所述变体多肽C-末端的修饰。 
合适地，所述多肽在第33、63、78、190位，合适地在第63、78或190位的一个或多个位置包含取代。合适地，可以使用N进行所述取代。 
在一个实施方式中，本发明的变体多肽可以在第306位包含至少一个取代。优选地，使用除K或R之外的任何氨基酸进行第306位的取代。优选地，使用除K或R或A之外的任何氨基酸进行第306位的取代。在一个实施方式中，优选地使用不带电荷和/或亲水性氨基酸进行第306位的取代。合适地，可以使用氨基酸S进行第306位的取代。 
在一个实施方式中，本发明的核苷酸序列或者用于本发明的核苷酸序列可以被修饰，从而使所编码氨基酸序列中的以下位置得到修饰： 
R306S+G33N； 
R306S+K63N； 
R306S+G78N； 
R306S+A190N； 
R306S+K63N+G78N+A190N； 
R306S+ΔKR311-312； 
R306S+K63N+G78N+A190N+Δ311-312； 
R306S+K63N+G78N+A190N+Δ307-319； 
R 306 S + K 63 N + G 78 N + A 190 N + Δ 307 - 319 + · T 320 E ; 或者 
R 306 S + K 63 N + G 78 N + A 190 N + Δ 307 - 319 + · R 305 N
本领域技术人员将容易地预测，当骨架不是KLM1wt(如本文SEQ ID No.2所示)时，尽管可选骨架中的起始氨基酸不同，表中所示氨基酸在与SEQ ID No.2比对时位于相同的位置。 
为了避免争议，本文中使用的符号“Δ”表示该符号后所列的那些氨基酸的删除。 
在一些实施方式中，在所述多肽的表面位置或者所述酶活性位点(催化三联体)的远侧外环内的位置引入至少一个氨基酸(其与原氨基酸相比更亲水)优选是在所述多肽的表面位置或者所述酶活性位点(催化三联体)的远侧外环内 的位置引入至少一个糖基化位点(或者一个额外的糖基化位点)的。换句话说，加入糖基化位点使所述酶在已经加入的糖基化位点区域内更亲水。 
另一方面，本发明提供了本发明的变体多肽酶在制造食品，例如生面团、烘焙产品、蛋、基于蛋的产品、面条产品、奶酪产品、玉米饼产品、动物饲料产品、植物油或食用油中的应用。有利地，向所述食品中加入本发明的酶可以产生改良的乳化性，并且游离脂肪酸的聚集降低。 
另一方面，本发明提供了本发明的变体多肽在制造生面团和/或烘焙产品中的用途，包括向生面团加入所述脂肪分解酶，和(任选地)烘焙所述生面团以制备烘焙产品，用于下述中的一个或多个：降低生面团粘性；改善生面团的加工性；降低烘焙产品在烘焙中的起泡；改善面包体积和/或松软度；延长烘焙产品和/或生面团的寿命；改善烘焙产品和/或生面团的保鲜作用；改善烘焙产品的碎屑结构；降低烘焙产品的孔异质性；改善烘焙产品的孔均质性；降低烘焙产品的平均孔径；改良烘焙产品的味道和/或香味，改善烘焙产品的外皮颜色。 
另一方面，本发明提供了本发明的变体多肽在制造基于蛋的产品中的用途，用以改善结构、降低平均粒径、降低平均颗粒分布、改善热稳定性、改善微波性能和/或稳定性。 
在本发明的另一个方面，提供了处理蛋或基于蛋的产品的方法，所述方法包括向所述蛋或基于蛋的产品中加入本发明的变体多肽酶。 
在本发明的另一个方面，提供了制备面条或者生面片或者基于面条的产品的方法，其中所述方法包括向所述面条或者生面片或者基于面条的产品中加入本发明的变体多肽酶。 
在本发明的一个方面，提供了本发明的变体多肽酶在制造面条或基于面条的产品中的用途，用于下述中的一个或多个：改善颜色/黄色、稳定颜色性质、降低亮度、降低脂肪含量、改善结构和口感(bite)(咀嚼性)、降低水活性、降低断裂、提高中心硬度和改善在加工中的形状保持度。 
在本发明的另一方面，提供了制备玉米饼或玉米饼片的方法，所述方法包括向玉米饼或玉米饼片中加入本发明的变体多肽酶。 
本发明的另一方面提供了本发明的变体多肽酶在制造玉米饼或生玉米饼片的用途，用以改善玉米饼的可轧制性、提高玉米饼的柔韧性、改善玉米饼 和/或生玉米饼片的保鲜作用、改善玉米饼和/或生玉米饼片中的柔软性和/或降低异味。 
可以通过与乳化剂(例如DATEM)组合来改善玉米饼和/或面条中脂肪分解酶的功能性。 
在本发明的另一个方面，提供了处理乳(milk)、奶酪用乳、奶酪或基于奶酪的产品的方法，所述方法包括向所述奶酪或基于奶酪的产品中加入本发明的变体多肽酶。 
本发明再进一步提供了本发明的变体多肽酶在制造奶酪或基于奶酪的产品中的用途，用以改善味道、结构和/或稳定性，降低奶酪中的溢油作用(oiling-off effect)和/或提高奶酪生产中的奶酪产率。 
在本发明的另一方面，提供了处理动物饲料的方法，所述方法包括向所述动物饲料中加入本发明的变体多肽酶。 
本发明进一步提供了本发明的变体多肽酶在制造动物饲料中的用途，用以增强以下一个或多个：饲料利用性和/或转换效率、体重增重、消化性氮摄取、干物质的可代谢性和可口性。 
在本发明的进一步的方面，提供了本发明的变体多肽酶在制备溶血磷脂的方法中的用途，例如通过用所述酶处理磷脂(如卵磷脂)以产生部分水解产物，即溶血磷脂。 
在本发明的另一方面，提供了制备溶血磷脂，例如溶血卵磷脂的方法，所述方法包括用本发明的变体多肽酶处理磷脂(如卵磷脂)。 
在本发明的另一方面，提供了本发明的变体多肽酶在制备溶血糖脂(例如双半乳糖基甘油单酯(DGMG)或单半乳糖基甘油单酯(MGMG))的方法中的用途，其中通过利用本发明的脂肪分解酶处理糖脂(例如双半乳糖基甘油二酯(DGDG)或单半乳糖基甘油二酯(MGDG))以产生部分水解产物，即溶血糖脂。 
在另一方面，本发明提供了制备溶血糖脂(例如双半乳糖基甘油单酯(DGMG)或单半乳糖基甘油单酯(MGMG))的方法，所述方法包括利用本发明的变体多肽酶处理糖脂(例如双半乳糖基甘油二酯(DGDG)或单半乳糖基甘油二酯(MGDG))。 
本发明还提供了植物油或食用油的酶促脱胶方法，所述方法包括用本发明的变体多肽酶处理食用油或植物油以水解大部分的极性脂质(例如磷脂和/ 或糖脂)。 
为了避免疑问，本领域技术人员可知晓适合进行食用油的酶促脱胶的方法(例如参见EP 0 869 167)。在实施本发明时，可以合适地使用已知方法，前提是用本发明的酶代替已知酶。 
在本发明的另一方面提供了本发明的变体多肽酶在植物油或食用油的制造中的用途，用以降低植物油或食用油中磷脂的量同时保持油中甘油三酯的含量和/或防止或降低游离脂肪酸的蓄积。 
在另一方面，本发明提供了本发明的变体多肽酶在包括处理磷脂以水解脂肪酰基基团的方法中的应用。 
在另一方面，本发明提供了本发明的变体多肽酶在用以降低食用油中的磷脂含量的方法中的应用，所述方法包括用本发明的真菌脂肪分解酶处理所述油以水解大部分的磷脂，和从所述油分离含水解磷脂的水相。 
优选地，本发明的变体脂肪分解酶水解极性脂质(例如糖脂和/或磷脂)。换句话说，本发明的变体脂肪分解酶优选具有磷脂酶活性(例如磷脂酶A2(E.C.3.1.1.4)活性和/或磷脂酶A1(E.C.3.1.1.32)活性)和/或半乳糖脂酶或糖脂酶(E.C.3.1.1.26)活性。本发明的变体脂肪分解酶可以额外地水解甘油三酯。换句话说，本发明的变体脂肪分解酶可以额外的具有甘油三酯脂酶活性(E.C.3.1.1.3)。 
本文使用的术语“糖脂酶活性”包括“半乳糖脂酶活性”。术语糖脂和半乳糖脂可以在本文中交互使用，并且包括水解DGDG和MGDG，其分别被水解成DGMG或MGMG。 
本文使用的术语“极性脂质”表示磷脂和/或糖脂。优选地，本文使用的术语“极性脂质”表示磷脂和糖脂两者。 
合适地，本发明的变体脂肪分解酶可以具有磷脂酶活性(例如磷脂酶A2(E.C.3.1.1.4)活性和/或磷脂酶A1(E.C.3.1.1.32)活性)和/或半乳糖脂酶或糖脂酶(E.C.3.1.1.26)活性。 
利用下文描述的试验可以测定酶的糖脂酶活性、磷脂酶活性和/或甘油三酯脂酶活性。 
半乳糖脂酶活性的测定(糖脂酶活性试验)： 
底物： 
将0.6％双半乳糖基甘油二酯(Sigma D 4651)、0.4％Triton-X 100(Sigma X-100)和5mM CaCl2溶解在0.05M HEPES缓冲液(pH 7)中。 
试验过程： 
将400μl底物加入到1.5ml Eppendorf试管中，并在37℃的Eppendorf热混合仪中放置5分钟。在时间T＝0分钟时，加入50μl酶溶液。同时对以水替代酶的空白进行分析。使样品在37℃的Eppendorf热混合仪中以10*100rpm混合10分钟。在时间T＝10分钟时，将所述Eppendorf试管在另一个99℃的热混合仪中放置10分钟以终止反应。 
利用来自WAKO GmbH的NEFA C试剂盒分析样品中的游离脂肪酸。 
以在试验条件下每分钟产生脂肪酸的微摩尔数计算酶活性GLU(pH 7)。 
磷脂酶活性的测定(磷脂酶活性试验)： 
利用两种不同的方法测定磷脂酶活性，其结果相当。这两个方法中的任一个都可以用以测定本发明的磷脂酶活性。优选地，使用PLU测定任意酶的磷脂酶活性。 
测定磷脂酶活性的“PLU试验” 
底物 
将0.6％L-α磷脂酰胆碱95％Plant(Avanti#441601)、0.4％Triton-X 100(Sigma X-100)和5mM CaCl2溶解在0.05M HEPES缓冲液(pH＝7)中。 
试验过程： 
将400μl底物加入到1.5ml Eppendorf试管中，并在37℃的Eppendorf热混合仪中放置5分钟。在时间T＝0分钟时，加入50μl酶溶液。同时对以水替代酶的空白进行分析。使样品在37℃的Eppendorf热混合仪中以10*100rpm混合10分钟。在时间T＝10分钟时，将所述Eppendorf试管在另一个99℃的热混合仪中放置10分钟以终止反应。 
利用来自WAKO GmbH的NEFA C试剂盒分析样品中的游离脂肪酸。 
以在试验条件下每分钟产生脂肪酸的微摩尔数计算酶活性PLU-7(pH 7)。 
测定磷脂酶活性的“TIPU试验” 
1TIPU(滴定磷脂酶单位)定义为在试验条件下每分钟释放1μmol游离脂肪酸的酶量。 
磷脂酶A1和A2催化卵磷脂至溶血卵磷脂的转化，并分别从第1和2位释放游离脂肪酸。可通过连续滴定在酶作用过程中从卵磷脂释放的脂肪酸而测定磷脂酶活性，因为碱的消耗量等于脂肪酸的释放量。 
底物： 
在磁性搅拌下将4％卵磷脂、4％Triton-X 100和6mM CaCl2：12g卵磷脂粉(Avanti Polar Lipids#44160)和12g Triton-X 100(Merck 108643)分散在约200ml去矿物质水中。加入3.0ml 0.6M CaCl2(p.a.Merck 1.02382)。用去矿物质水将体积调整至300mL并利用Ultra Thurax对乳液进行匀质化。每天制备新鲜底物。 
试验条件： 
制备酶溶液，从而在加入300μl酶时在滴定曲线上产生0.06和0.18ml/分钟之间的斜率。 
包括活性已知的对照样品。 
样品溶解在去矿物质水中并以300rpm搅拌15分钟。 
在用0.05M NaOH调整pH至7.0之前，将25.00ml底物在37℃恒温10-15分钟。将300μL酶溶液加入至底物，并使用恒定pH滴定仪(Phm 290，MettlerToledo)进行使用0.05M NaOH的连续滴定。在每个比例(scaling)进行两个活性测定。 
8分钟后终止滴定，并计算5-7分钟之间滴定曲线的斜率。检测极限为3TIPU/ml酶溶液。 
计算： 
按照以下方式计算磷脂酶活性(TIPU/g酶)： 
TIPU / g = α · N · 10 6 μmol mol · 10 - 3 l ml · V 1 m · V 2 = α · N · 10 3 · V 1 m · V 2
其中： 
α为反应时间5-7分钟之间滴定曲线的斜率(ml/分钟) 
N为所用NaOH(mol/l)的标准化 
V1溶解了酶的体积(ml) 
m为加入至V1的酶量(g) 
V2加入至底物的酶溶液的体积(ml) 
三酰基甘油酯脂酶活性测定：基于作为底物的甘油三酯(三丁酸甘油酯)的实验： 
根据Food Chemical Codex，Forth Edition，National Academy Press，1996，p803测定基于三丁酸甘油酯的脂酶活性，但将样品溶解在去离子水中而非甘油缓冲液中，并且pH恒定设定点为5.5而非7。 
1LIPU被定义为在实验条件下每分钟能够释放1mol丁酸的酶量。 
本文中使用的术语“变体”是指未见于自然界的蛋白。通常，可以通过修饰天然存在的多肽(或编码其的核苷酸序列)产生变体多肽。因此，当与天然或野生型序列相比时，所述变体多肽包含一个或多个氨基酸改变(即氨基酸删除、添加或取代)。 
优选地，本发明的变体多肽获自可从丝状真菌获得(优选已从丝状真菌获得)的真菌脂肪分解酶。更优选地，所述真菌脂肪分解酶可获自(优选已获自)镰刀菌(Fusarium)。优选地，本发明的真菌脂肪分解酶可获自(优选已获自)异孢镰刀菌(Fusarium heterosporum)或尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)。合适地，本发明的真菌脂肪分解酶可获自(优选已获自)异孢镰刀菌(CBS 782.83)或尖孢镰刀菌(在WO98/26057或US 7,465,570中教导)。 
在一个实施方式中，优选地，所述修饰不是K63N，尤其当骨架来自尖孢镰刀菌时。 
因此，一方面，优选地，本发明的脂肪分解酶或变体多肽是真菌脂肪分解酶，优选丝状真菌脂肪分解酶。 
优选地，本发明的真菌脂肪分解酶或变体多肽不是包含与来自镰刀菌蛋白或其部分的氨基酸序列融合的来自嗜热菌(Thermomyces)蛋白或其部分的氨基酸序列的融合蛋白。特别地，优选本发明的真菌脂肪分解酶不是与来自尖孢镰刀菌蛋白或其部分的氨基酸序列融合的包含来自疏绵状嗜热丝孢菌 (Thermomyces lanuginosa)蛋白或其部分的的氨基酸序列融合蛋白。 
优选地，本发明的真菌脂肪分解酶不从疏绵状嗜热丝孢菌获得和/或不是从疏绵状嗜热丝孢菌获得的酶的变体。 
在烘焙实验中对本发明的变体多肽进行测试并与来自异孢镰刀菌CBS782.83的脂肪分解酶(SEQ ID No.2-这是前原序列，成熟序列为氨基酸32-296(根据宿主生物合适地为31-304或31-305)进行比较。该酶在本文中还被命名为KLM1并且构成了本文教导的变体多肽的“野生型”酶或骨架酶)进行比较，获得了非常好的结果。 
发现所述变体多肽的焙烤作用优于来自异孢镰刀菌CBS 782.83的真菌脂肪分解酶(包含SEQ ID No.2的氨基酸33-296(合适地为31-304或31-305)所示的氨基酸序列的酶；KLM1)。 
合适地，本文使用的术语“食品”表示适合人和/或动物食用的物质。 
合适地，本文使用的术语“食品”可以表示即食型食品。然而，可选择地或者另外，本文使用的术语食品可以表示用于制备食品的一种或多种食物材料。仅作为示例，术语食品包括由生面团产生的烘焙食品和在所述烘焙物品的制备中使用的生面团。 
在优选的方面，本发明提供了以上定义的食品，其中，所述食品选自以下一种或多种：蛋，基于蛋的产品，包括但不限于蛋，基于蛋的产品，包括但不限于蛋黄酱、色拉调料、沙司(sauce)、冰淇淋、蛋粉、改良蛋黄及由其制成的产品；烘焙食品，包括面包、蛋糕、甜面制品(sweet dough product)、层状面点(laminated dough)、液态奶蛋糊(liquid batter)、松饼、甜甜圈、饼干(biscuit)、薄脆饼干(cracker)和曲奇饼干；糖食(confectionary)，包括巧克力、糖果(candy)、焦糖(caramel)、halawa、胶皮糖(gum)，包括无糖胶皮糖和含糖甜胶皮糖、泡泡糖、软泡泡糖、口香糖和布丁；冷冻产品，包括冰糕(sorbet)，优选冷冻乳制品，包括冰淇淋和牛奶冻；乳制品，包括奶酪、黄油、乳、咖啡奶油(coffee cream)、生奶油(whipped cream)、蛋奶羹(custard cream)、奶饮品和酸奶；慕思(mousse)、生植物奶油(whipped vegetable cream)，食用油和脂肪，充气和无气搅打的产品(aerated and non-aerated whipped product)、水包油乳液、油包水乳液、人造黄油、起酥油(shortening)以及涂抹物(spread)，包括低脂和极低脂涂抹物；调料(dressings)、蛋黄酱、蘸料(dip)、基于奶油的沙 司(cream based sauce)、基于奶油的汤(cream based soup)、饮料、调味乳和沙司(sauce)。 
一方面，本发明的食品可以是生面团制品或烘焙产品，例如面包，油炸食品，小吃，蛋糕，馅饼，核仁巧克力饼(brownie)，曲奇，面条，方便面，玉米饼，小食品(snack items)诸如薄脆饼干，全麦饼干(graham cracker)，脆饼干(pretzel)，薯片he意大利面(pasta)。 
另一方面，本发明的食品可以为动物饲料。 
一方面，优选所述食品选自以下一种或多种：蛋，基于蛋的产品，包括蛋黄酱、色拉调料、沙司、冰淇淋、蛋粉、改良蛋黄及由其制成的产品。 
在本文提及的一些应用中，特别是食物应用，例如面包房应用中，本发明的脂肪分解酶可与一种或多种常规乳化剂一起使用，包括例如甘油单酯、脂肪酸甘油单酯和脂肪酸甘油二酯的二乙酰酒石酸酯、硬脂酰乳酸钠(SSL)和卵磷脂。 
此外或者可选地，本发明的酶可与一种或多种其它合适的食品级酶一起使用。因此，除了本发明的脂肪分解酶之外，至少一种另外的酶也可加入至烘烤食品和/或生面团中，这也落入本发明的范围内。所述另外的酶包括淀粉降解酶，例如内切淀粉酶或外切淀粉酶、支链淀粉酶、脱支酶，半纤维素酶包括木聚糖酶、纤维素酶，氧化还原酶例如葡萄糖氧化酶、吡喃糖氧化酶、巯基氧化酶或碳水化合物氧化酶，例如氧化麦芽糖的酶(例如己糖氧化酶(HOX))，脂酶、磷脂酶、己糖氧化酶、蛋白酶、以及酰基转移酶(例如在WO04/064987中描述的那些酶)。 
在食品生产中，特别优选本发明的脂肪分解酶与α淀粉酶组合使用。具体地，所述淀粉酶可以是非产麦芽糖淀粉酶，例如具有非产麦芽外切淀粉酶活性，尤其是葡聚糖1，4-α-麦芽四水解酶(glucan 1，4-α-maltotetrahydrolase)(EC3.2.1.60)活性(如WO05/003339中所公开的)的多肽。市场上可买到合适的非产麦芽糖淀粉酶，如PowersoftTM(购自Danisco A/S，丹麦)。也可利用产麦芽糖淀粉酶，例如NovamylTM(Novozymes A/S，丹麦)。在一个实施方式中，可在生面团和/或烘焙食品例如面包、蛋糕、甜甜圈、蛋糕甜甜圈(cake doughnuts)或百吉饼的生产中，联合使用α淀粉酶和本发明的脂肪分解酶。α淀粉酶和本发明的脂肪分解酶的组合也被认为是优选用于玉米饼(例如小麦 和/或玉米的玉米饼)的生产方法中。 
在另一个优选实施方式中，在食品产品的生产中可组合使用本发明的脂肪分解酶和木聚糖酶。GRINDAMYTM和POWERBake 7000是可购自DaniscoA/S的商业化木聚糖酶的实例。木聚糖酶的其它实例可见于WO03/020923和WO01/42433。 
优选地，根据本发明的脂肪分解酶可以与木聚糖酶和α淀粉酶组合使用。适当地，α淀粉酶可以是产麦芽糖或非产麦芽糖的α淀粉酶(例如GRINDAMYLTM或POWERSoft，可购自Danisco A/S)，或其组合。 
本发明的脂肪分解酶还可优选与氧化酶，例如麦芽糖氧化酶(MOX)，如己糖氧化酶(HOX)组合使用。在WO03/099016中描述了合适的方法。商业上可获得的麦芽糖氧化酶GRINDAMYLTM和SUREBake可购自Danisco A/S。 
任选地，α-淀粉酶例如非产麦芽外淀粉酶和/或产麦芽糖淀粉酶、和/或麦芽糖氧化酶(MOX)可与本发明的酶组合用于制备生面团、烘烤食品、玉米饼、蛋糕、方便面/油炸点心或乳制品如乳酪的方法中。 
通过本领域的已知方法，本发明的脂肪分解酶通常可包含在食品或其它组合物中。所述方法包括将脂肪分解酶直接加入至食品或组合物中，添加脂肪分解酶和稳定剂和/或载体的组合，和添加包含脂肪分解酶和稳定剂和/或载体的混合物。 
用于本发明的合适稳定剂包括但不限于无机盐(例如NaCl、硫酸铵)、山梨糖醇、乳化剂和去污剂(例如Tween 20、Tween 80、无甘油三酯的PanodanAB100、聚甘油酯、脱水山梨糖醇油酸单酯(sorbitanmonoleate))、油(例如菜籽油、葵花籽油和大豆油)、果胶、海藻糖以及甘油。 
适合用于本发的的载体包括但不限于淀粉、磨碎的小麦、小麦粉、NaCl以及柠檬酸盐。 
所附权利要求书和以下描述和实施例中进一步描述了其他优选的方面。 
优点 
本发明的方法、本发明的核酸和本发明的变体多肽的一个优点是，与野生型酶(例如由核苷酸序列SEQ ID No.1编码的KLM1)相比，所述核酸在商业化宿主物种例如里氏木霉中的表达显著提高。这带来的优点是生产变体的 成品降低。产量的提高是显著的：野生型在里氏木霉中的生产能力差，然而变体通常具有提高的表达水平。通常，变体的表达水平比野生型酶高约2倍-约25倍，优选约6倍-约25倍。 
意外地发现本发明的变体酶在烘焙应用中使用时具有优异的功能性。有利地，与来自真菌的其他脂肪分解酶，尤其是LipopanFTM和/或来自异孢镰刀菌的野生型酶(包含本文所示的和WO2005/087918所教导的SEQ ID No.2的氨基酸33-296(合适的为31-304或31-305)的氨基酸序列)相比，本发明的变体脂肪分解酶的使用导致生面团和/或烘焙产品的性质的显著提高。 
本发明的变体多肽的另一个优点是，与野生型酶(例如KLM1，包含本文所示的SEQ ID No.2的氨基酸33-296(合适的为31-304或31-305)的氨基酸序列)相比，其具有增强的活性和/或功能性。这可导致所述酶的“使用成本”降低。例如，与野生型酶相比，为了获得相同结果/效果所需的变体多肽的单位比例将显著降低。例如，认为变体多肽的剂量可以为野生型酶水平的约25％-75％，优选约25％-50％，优选约25％。 
本文使用的术语“修饰”(或“经修饰”)表示取代或插入(或经取代或插入)。 
技术效果 
对于烘烤食品例如面包、馒头和美国白面包(white pan bread)，添加本发明的脂肪分解酶可带来下列一种或多种：改善面包体积和松软度、延长保存期和/或保鲜效果、改善团粒结构、降低气孔不均匀性、降低平均孔径、改善香味和/或气味，以及改善外壳色泽。 
有利地，本发明的酶可用于代替食品(例如生面团和/或烘烤食品)中的乳化剂。 
本发明的脂肪分解酶可与乳化剂(例如DATEM、SSL、CSL、甘油单酯、聚山梨酸酯以及Tween)具有协同作用。因此，本发明脂肪分解酶可以与一种或多种乳化剂组合使用。有利地，与不使用本发明的酶所需要的乳化剂量相比，本发明的脂肪分解酶与一种或多种乳化剂的联合使用可降低使用的乳化剂总量。 
本发明的脂肪分解酶也可与水状胶质、瓜耳胶、黄原胶(xanthum)和果胶以及与麦芽糖氧化酶例如己糖氧化酶具有协同作用。 
例如对于甜甜圈、蛋糕甜甜圈、百吉饼、快餐饼以及松饼，当与一种或多种α-淀粉酶、产麦芽糖α-淀粉酶以及非产麦芽糖α-淀粉酶组合使用时，本发明脂肪分解酶的应用可带来协同作用。 
例如对于蛋糕、松糕以及棕榈蛋糕(paim cake)，当与一种或多种水状胶质(例如瓜耳胶)和/或一种或多种乳化剂(例如DATEM)组合使用时，本发明的脂肪分解酶的应用可带来协同作用。 
例如对于饼干，使用本发明的脂肪分解酶可带来改善的可滚动性和操作特性，特别是冷环境下(冷可滚动性)。 
有利地，例如在蛋黄酱及其他基于蛋的产品中，使用本发明的脂肪分解酶可导致改善质地、降低平均颗粒大小、和/或降低平均颗粒分布、提高热稳定性、提高微波性能和/或稳定性。 
在蛋糕中，使用本发明的酶可有利地导致改善松软度、体积，提高保存性能和保存期限。 
例如对于面条或面条产品(如方便面)，本发明的脂肪分解酶可带来一种或多种下列的特征：改善色泽/黄色、更加稳定的色泽特征、降低亮度、减少脂肪含量、改善质地和口感(咀嚼性)、降低水活性、减少折断、提高核心硬度以及提高加工期间的形状保持性。 
优选地，本发明的脂肪分解酶可用于降低面条或面条产品(例如方便面)的脂肪含量。 
例如在玉米饼中，使用本发明的酶可导致下列一种或多种：例如通过提高可塑性来降低玉米饼的可轧制性、提高保鲜性、提高松软度和/或减少异味。 
有利地，提高可滚动性和/或可塑性可降低玉米饼在滚动时破裂的可能性。 
例如在乳酪和/或基于乳酪的产品中，使用本发明的酶可导致下列一种或多种：改善香味、质地和/或稳定性，减少乳酪中的溢油效应和/或提高乳酪产量。 
本文所用的术语“溢油效应”指在乳酪熔化时释放的游离油。 
本发明的脂肪分解酶可用于生产低脂肪乳酪。有利地，本发明的酶可稳定乳中的脂肪稳定和/或增强香味 
例如在动物饲料中，本发明的酶可有利地导致下列一种或多种：提高饲 料在动物中的利用和/或转化效率、促进动物的体重增加、提高饲料的消化性、提高动物例如从饲料中的氮吸收、提高饲料的干物质代谢能力以及提高饲料的可口性。 
用途 
本发明的酶具有许多用途。 
特别地，本发明的变体多肽可用于食品的制作中。 
例如，本发明的变体多肽可特别用于蛋或基于蛋的产品的处理中。 
使用本发明的真菌脂肪分解酶来处理蛋或基于蛋的产品可提高稳定性，热处理过程(例如巴氏灭菌法)中的热稳定性，并导致相当的稠化。基于蛋的产品包括但不限于蛋糕、蛋黄酱、色拉调料、沙司和冰淇淋等。 
本发明的真菌脂肪分解酶在烘烤食品的制备中特别有用，例如由生面团制作的烘烤食品，包括面包、蛋糕、甜面团食品、分层生面团、液态奶蛋糊、松饼、甜甜圈、饼干、脆饼以及小甜饼。 
本发明的真菌脂肪分解酶还可用于改良面包的添加剂，如生面团组合物、生面团添加剂，生面团性质改进剂(conditioners)，通常在制作面包或其它烘烤产品的过程中加入至面粉和/或生面团中来提供面包或其它烘烤产品的改良品质的预混合物和类似制剂。 
因此，本发明还涉及包含本发明真菌脂肪分解酶的面包改良组合物和/或生面团改良组合物；还涉及包含所述面包改良组合物和/或生面团改良组合物的生面团或烘烤食品。 
除本发明的真菌脂肪分解酶之外，所述面包改良组合物和/或生面团改良组合物还可包含其它物质，该物质通常被用于烘烤中以提高生面团和/或烘烤产品的品质。 
所述面包改良组合物和/或生面团改良组合物可包含一种或多种常规烘烤剂，例如下列的一种或多种组分：奶粉、面筋、乳化剂、粒化脂肪、氧化剂、氨基酸、糖、盐、面粉或淀粉。 
合适的乳化剂的实例是：甘油单酯、脂肪酸甘油单酯及脂肪酸甘油二酯的二乙酰酒石酸酯、糖酯、硬脂酰乳酸钠(SSL)以及卵磷脂。 
所述面包和/或生面团改良组合物可进一步包含另一种酶，例如一种或多 种其它合适的食品级酶，包括淀粉降解酶例如内切淀粉酶或外切淀粉酶、支链淀粉酶、脱支酶，半纤维素酶包括木聚糖酶、纤维素酶，氧化还原酶例如葡萄糖氧化酶、吡喃糖氧化酶、巯基氧化酶，或碳水化合物氧化酶例如氧化麦芽糖的酶(例如己糖氧化酶(HOX))，脂酶、磷脂酶和己糖氧化酶、蛋白酶以及酰基转移酶(例如在WO04/064987中描述的那些酶)。 
本文所用的术语“改良的品质”指可通过本发明的变体多肽的作用而改良的任何品质。具体地说，使用本发明的变体多肽导致一种或多种下列特征：提高烘烤产品的体积、改善烘烤产品的团粒结构、在烘烤食品中保鲜品质、提高强度、提高稳定性、减少生面团的粘性和/或提高可机械加工性。 
通过与不添加本发明的变体多肽所制备的生面团和/或烘烤产品进行比较，或者通过与添加野生型酶(例如KLM1；包含本文SEQ ID No.2的氨基酸33-296(合适的为31-304或31-305)所示的氨基酸序列)所制备的生面团和/或烘烤产品进行比较，评价改良的品质。 
本文所用的术语“烘烤产品”包括由生面团制备的产品。可有利地通过本发明制作的烘烤食品(无论白色、浅色或深色的类型)的实例包括下列一种或多种：典型的是以块状或卷状或烤片形状的面包(包括白面包、全麦面包以及黑面包)、法式长棍面包、皮塔面包(pitta bread)、玉米饼、炸玉米粉卷(taco)、蛋糕、薄烤饼、饼干、脆面包、意大利面和面条等。 
本发明的生面团可以是发酵的生面团或将要进行发酵的生面团。可以通过多种方式发酵生面团，例如加入小苏打等、或加入合适的酵母培养物例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(面包酵母)培养物。 
本发明进一步涉及本发明的真菌脂肪分解酶用以生产意大利面生面团(优选由硬质小麦粉或类似品质的面粉生产)的用途。 
本发明的变体多肽适合用于植物油或食用油的酶脱胶用途。在植物油或食用油的加工中，用本发明的真菌脂肪分解酶处理食用油或植物油，以水解大部分的极性脂质(如磷脂和/或糖脂)。优选地，从极性脂质水解脂肪酰基。脱胶过程通常引起食用油中的极性脂质(特别是磷脂)含量的减少，这归因于大部分(即，超过50％)的极性脂质(如糖脂和/或磷脂)的水解。典型地，从油分离含有被水解的极性脂质(如磷脂和/或糖脂)的水相。合适地，食用油或植物油最初(用本发明的酶处理前)可具有50-250ppm的磷含量。 
此外，本发明还涉及本发明的变体多肽用于乳酪产品处理的用途。 
本发明的变体多肽还特别适于用于制备动物饲料。 
如技术人员所知，本文所用的术语“脱胶”指通过将磷脂(例如卵磷脂、磷酸脂质和吸着油)转化成水合性磷脂来精炼油。已被脱胶的油的流动性提高，并因此比未被脱胶的油具有更好的处理性质。 
下表仅仅用于一般的指导，并提供了可在不同应用中所需的本发明变体多肽的剂量水平的概述。该表还提供了例如关于当与乳化剂联合使用时，本发明脂肪分解酶的剂量水平的指导。当然，对本领域普通技术人员而言显而易见的是，对于任何给定应用，可使用常规试验方法容易地确定酶剂量、反应温度和反应时间的优化。 
糖基化 
意外地发现，通过引入甚至一个糖基化位点至脂肪分解酶(尤其是天然不含任何糖基化位点的脂肪分解酶)，例如本文教导的脂肪分解酶(如异孢镰刀菌酶(有时本文称为KLM1)和/或尖孢镰刀菌脂肪分解酶(有时本文称为Lipopan FTM))中，与野生型酶相比，所示酶的表达水平和/或功能性和/或活性 结果提高很多，当宿主细胞为木霉种，如里氏木霉时尤其如此。 
因此，本发明提供了修饰脂肪分解酶(尤其是包含氨基酸SEQ ID No.2的氨基酸40-290(优选35-300，更优选31-305)的脂肪分解酶)或编码脂肪分解酶的核苷酸序列(如本文SEQ ID No.1所示的核苷酸序列)，以在所述序列中取代或插入氨基酸，从而产生包含所加入的糖基化位点的变体多肽。应注意，SEQ ID No.2(KLM1的前原序列)所示的野生型酶或包含成熟序列的SEQ ID No.2的氨基酸33-296(合适地为31-304或31-305)的野生型酶天然不含任何糖基化位点。合适地，为了引入至少一个糖基化位点(合适地为多于一个糖基化位点)，对所述脂肪分解酶经进行修饰以取代或插入选自Asn、Ser、Thr的一个或多个氨基酸。 
应注意，来自异孢镰刀菌CBS 782.83的野生型酶(本文称为KLM1并且具有SEQ ID No.2所示的前原序列，其成熟序列包含SEQ ID No.2的氨基酸33-296(例如31-304或31-305))没有糖基化位点。令本发明人感到意外的是，甚至最温和的添加，即加入一个糖基化位点，也会带来表达、功能性和/或活性方面如此显著的改善。 
本文使用的术语“糖基化位点”表示序列Asn-Xxx-Ser或Asn-Xxx-Thr，其中Xxx为除脯氨酸外的任何氨基酸残基。 
当本文指糖基化位点时，其可以表示潜在的糖基化位点。换句话说，本文提供了适当的共有序列，即Asn-Xxx-Ser或Asn-Xxx-Thr，其中Xxx为变体酶中除脯氨酸外的任何氨基酸残基，并且当具有所述共有序列的此蛋白由真菌宿主分泌时，天冬酰胺的γ-酰胺很可能被糖基化(虽然所述蛋白的三维结构可调节糖基化的效率)。 
糖基化是连接糖类以产生多聚糖(游离的或者与蛋白和脂质连接的)的酶促过程。该酶促过程产生所有细胞的四个基础成分之一(和核酸、蛋白以及脂质)，并且还提供了调节膜蛋白和分泌蛋白的结构和功能的共翻译和翻译后修饰机制。在粗ER中合成的大多数蛋白发生糖基化。与糖化的非酶促化学反应相反，糖基化是酶引导的位点特异性过程。糖基化还作为O-GlcNAc修饰存在于细胞质和细胞核中。产生六个类型的多聚糖：与天冬酰胺侧链的酰胺氮相连的N-连接多聚糖，与丝氨酸和苏氨酸侧链的羟基氧相连的O-连接多聚糖，与丝氨酸的羟基氧相连的糖胺聚糖，其中的多聚糖与神经酰胺相连的 糖脂，与蛋白或脂质均不相连的透明质酸(hyaluronan)，和通过多聚糖连接而将蛋白连接至脂质的GPI锚。 
在本发明中，当指糖基化时，本文仅指N-连接糖基化。换句话说，本发明无意于涉及O-连接糖基化。 
对于N-连接寡糖，首先将14-糖前体加入至靶蛋白的多肽链中的天冬酰胺。该前体的结构对于多数真核细胞都是共有的，并且包含3个葡萄糖、9个甘露糖和2个N-乙酰葡糖胺分子。通过一系列复杂的反应将该支链连接至被称为多萜醇的载体分子，然后随其被移动至ER腔而被转移至多肽链上的适当位点。 
存在三种主要类型的N-连接糖：高甘露糖寡糖、复杂寡糖和杂合寡糖。 
高甘露糖本质上就是具有许多甘露糖残基的两个N-乙酰葡糖胺，大多数通常见于几乎所有连接至蛋白前的前体寡糖中。 
复杂寡糖得名的原因是其会包含几乎任何数量(包括超过原有的两个N-乙酰葡糖胺)的其他类型的糖。 
可以通过两种类型的寡聚物在蛋白的不同部分对所述蛋白进行糖基化。认为寡糖是高甘露糖寡糖还是复杂寡糖取决于其在高尔基体中与糖类修饰蛋白的可接近性。如果所述糖类相对不可接近，其将最可能保持其原始的高甘露糖形式。如果其可接近，可能的是许多甘露糖残基都将被切除，并且所述糖类将通过添加上文讨论的其他类型的基团而被进一步修饰。 
寡糖链通过寡糖酰基转移酶被连接至三肽共有序列Asn-Xxx-Ser或Asn-Xxx-Thr中的天冬酰胺，其中X可为除Pro外的任何氨基酸。该序列还被称为糖基化序列子(sequon)。连接后，一旦蛋白被正确折叠，从所述链除去三个葡萄糖残基并且可使蛋白从ER输出。然后将由此形成的糖蛋白传送至高尔基体，在此可以进行其他甘露糖残基的去除。 
在本发明中，当讨论修饰脂肪分解(骨架)酶(例如野生型酶如KLM1或Lipopan F或编码其的核苷酸序列)以取代或插入一个或多个氨基酸，从而使所形成的变体多肽包含至少一个糖基化位点(或者与所述骨架酶相比，包含包含至少一个额外的糖基化位点)时，本发明表示取代骨架酶中的氨基酸，或者在骨架中插入一个或多个氨基酸，从而引入一个或多个共有序列Asn-Xxx-Ser或Asn-Xxx-Thr，其中x可为除Pro外的任何氨基酸。 
在一个实施方式中，合适地，所述修饰可以为骨架序列中单个氨基酸的取代或引入。例如，所述骨架序列可以包含以下：Yyy-Xxx-Ser或Yyy-Xxx-Thr或Asn-Xxx-Zzz(其中Xxx不是Pro，Yyy不是Asn并且Zzz不是Ser或Thr)，并且可简单地需要用Asn取代氨基酸Yyy和用Ser或Thr取代Zzz，或者在Yyy后插入Asn，或者在Zzz前插入Ser或Thr。 
可选地，可改变骨架中的两个或三个氨基酸以产生单个糖基化共有序列。例如，所述骨架可以经修饰以取代或插入三个氨基酸Asn-Xxx-Ser或Asn-Xxx-Thr，其中X可为除Pro外的任何氨基酸。 
合适地，可以向所述骨架序列中引入多于一个糖基化位点(潜在的糖基化位点)，从而使所述变体多肽包含多于一个糖基化位点(或者与骨架序列相比多于额外的糖基化位点)。明显地，变体多肽中的糖基化位点(或其中的糖基化位点)的总数将取决于骨架酶中糖基化位点的数量和所添加的糖基化位点的数量。为了避免疑问，野生型KLM1酶(本文显示于SEQ ID No.2)不含任何糖基化位点，并因此在变体多肽中的糖基化位点数将通过所添加的糖基化位点的数量而确定。 
C-末端的稳定性 
合适地，本发明的变体多肽可以包括C-末端加工，优选以使所述多肽更稳定。合适地，所述C-末端加工可以包括除去C-末端KEX2位点。不期望受理论限制，认为除去KEX2位点引起蛋白水解加工的终止或速率的降低，并提高酶的稳定性而不使其活性受损。一个KEX2位点可见于第306位(当与SEQ ID No.2比对时)。另一个KEX2位点可见于第311-312位(当与SEQ ID No.2比对时)。 
合适地，多肽的C-末端始于第306位氨基酸(向前)。 
活性位点远侧的外环 
在本申请中教导，为了引入亲水氨基酸或引入一个或多个糖基化位点，氨基酸修饰(例如取代和/或插入)发生在位于所述多肽活性位点远侧的外环中的多肽表面氨基酸。 
在选择修饰位点时，优选所述位点是a)位于表面位置，b)非保守性氨 基酸，和c)不在紧邻活性位点(催化三联体)或者活性位点盖的位置。 
术语“外环”表示在蛋白三级结构中暴露在环状(in a loop)蛋白外表面的部分氨基酸序列。所述外环不参与形成所述酶的催化三联体或盖区。 
本文使用的术语“活性位点”与术语催化三联体同义。为了避免疑问，本文教导的脂肪分解酶中的催化三联体位于KLM1酶由S174、D228和H287形成催化三联体的位置。 
优选地，所述外环距离Ser174的α-碳大于约 优选大于约 例如大于约 大于约 大于约 优选大于约 为了避免疑问，所述酶的催化三联体和盖区距离Ser174的α-碳都小于约 
在一个实施方式中，所述多肽的活性位点远侧的外环对应于一个或多个以下氨基酸区(氨基酸位置对应于SEQ ID No.2中所示的编号-即通过比对脂肪分解酶和本文所示的SEQ ID No.2而获得的)：54-66、75-79、99-103、127-135、162-167、188-195和213-221。 
术语“活性位点的远侧”表示远离或者距蛋白活性位点一定距离。优选地，所述外环距离Ser174的α-碳至少约 优选大于约 例如大于约 大于约 大于约 优选大于约 
亲水性氨基酸 
根据侧链的极性，氨基酸的亲水性或疏水性有变化。选择比其他氨基酸更亲水的氨基酸属于本领域技术人员的常规技术。无论如何，提供下表作为指导： 
脂肪分解酶 
优选地，本发明的脂肪分解酶或变体脂肪分解酶对极性脂质中的酯键具有水解活性。 
优选地，本发明的脂肪分解酶或变体脂肪分解酶水解极性脂质(例如糖脂和/或磷脂)。换句话说，本发明的变体脂肪分解酶优选具有磷脂酶活性(例如磷脂酶A2(E.C.3.1.1.4)和/或磷脂酶A1(E.C.3.1.1.32)活性)和/或半乳糖酯酶或糖脂酶(E.C.3.1.1.26)活性。本发明的变体脂肪分解酶可以额外地水解甘油三酯。换句话说，本发明的变体脂肪分解酶可以额外地具有甘油三酯脂酶活性(E.C.3.1.1.3)。 
本文使用的术语“糖脂酶活性”包括“半乳糖脂酶活性”。术语糖脂和半乳糖脂可在本文交互使用，并且包括水解DGDG和MGDG，其分别被水解成DGMG或MGMG。 
本文使用的术语“极性脂质”表示磷脂和/或糖脂。优选地，本文术语的术语“极性脂质”表示磷脂和糖脂两者。 
合适地，本发明的变体多肽可以具有磷脂酶活性(例如磷脂酶A2(E.C.3.1.1.4)和/或磷脂酶A1(E.C.3.1.1.32)活性)和/或半乳糖酯酶或糖脂酶(E.C. 3.1.1.26)活性。 
可以利用以上所述的实验测定酶的糖脂酶活性、磷脂酶活性和三酰甘油酯脂酶活性。 
在一些实施方式中，在根据本发明进行修饰前所述脂肪分解酶不包含糖基化位点。 
在一个实施方式中，在根据本发明进行修饰前所述脂肪分解酶(即真菌脂肪分解酶)是α/β水解酶家族23的一员，更具体属于23.01亚家族(通过斯图加特大学脂酶工程化数据库进行分类-参见http://www.led.uni-stuttgart.de/)。该数据库整合了脂酶和具有相同a/b水解酶折叠的相关蛋白的序列和结构信息。 
分离 
在一方面，优选地，所述序列是分离形式的。术语“分离(的)”是指序列至少基本上不包含至少一种其它成分，这些成分原本与所述序列天然结合，并且一起见于自然界。 
在一个实施方式中，本发明的多肽和/或核苷酸序列是分离的。 
纯化 
一方面，优选所述序列是纯化的形式。术语“纯化(的)”是指所述序列处于相对纯化的状态-如至少约90％的纯度，或至少大约95％的纯度，或至少大约98％的纯度。 
在一个实施方式中，本发明的多肽和/或核苷酸序列是纯化的。 
核苷酸序列 
本发明的范围涵盖编码具有本文定义的特定性质的酶的核苷酸序列。 
本文所用的术语“核苷酸序列”是指寡核苷酸序列或多核苷酸序列及其变体、同源物、片段和衍生物(如其部分)。所述核苷酸序列可以是基因组或合成或重组来源，其可以是双链的或单链的(无论其代表正义链还是反义链)。 
与本发明有关的术语“核苷酸序列”包括基因组DNA、cDNA、合成的DNA和RNA。优选地，其指DNA，更优选为用于本发明的编码cDNA序列。 
在优选的实施方式中，本发明实质范围所涉及和涵盖的所述核苷酸序列不包括在处于其天然环境中且在与其天然相连的序列(同处于其天然环境中)连接时的本发明天然核苷酸序列。为了便于参考，本发明人将此优选实施方式称为“非天然核苷酸序列”。在此，术语“天然核苷酸序列”是指处于其天然环境中并在与其天然相连的完整启动子(该启动子同处于其天然环境中)可操作地连接的完整核苷酸序列。然而，包含在本发明的范围内的氨基酸序列可以在核苷酸序列在其天然生物体内翻译后被分离和/或纯化。然而，优选地，包含在本发明范围内的氨基酸序列可以在其天然生物体内由核苷酸序列表达，但其中所述核苷酸序列不处于在该生物体内与其天然相连的启动子的控制下。 
核苷酸序列的制备 
典型地，利用重组DNA技术(即重组DNA)制备包含在本发明范围内的核苷酸序列。然而，在本发明的可选的实施方式中，可利用本领域公职的化学方法(参见Caruthers MH等，(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 215-23和Horn T等，(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 225-232)，合成全部或部分核苷酸序列。 
可以从产生所述酶的任何细胞或生物鉴定和/或分离和/或纯化编码具有本文定义的特定性质的酶的核苷酸序列。本领域熟知用于鉴定和/或分离和/或纯化核苷酸序列的多种方法。举例来说，一旦鉴定和/或分离和/或纯化到合适的序列，则可通过PCR扩增技术来制备更多序列。 
进一步举例来说，可以使用来自产生酶的生物的染色体DNA或信使RNA来构建基因组DNA和/或cDNA文库。如果已知酶的氨基酸序列或酶的部分氨基酸序列，则可以合成带标记的寡核苷酸探针，并用于从由所述生物制备的基因组文库鉴定编码酶的克隆。可选地，可使用含有与另一个已知酶基因同源的序列的带标记寡核苷酸探针来鉴定编码酶的克隆。在后一种情况中，使用较低严谨度的杂交和洗涤条件。 
可选择地，可以通过以下鉴定编码酶的克隆：将基因组DNA片段插入表达载体(例如质粒)，用所产生的基因组DNA文库转化酶阴性细菌，然后将转化细菌涂布到含酶底物(如用于葡糖苷酶(麦芽糖酶)生成酶的麦芽糖)的琼脂平板上，从而鉴定表达酶的克隆，由此可鉴定编码酶的克隆。 
又或者，可通过成熟的标准方法合成制备编码酶的核苷酸序列，如Beucage S.L.等，(1981)Tetrahedron Letters 22，p 1859-1869所述的亚磷酰胺(phosphoroamidite)法，或Matthes等，(1984)EMBO J.3，p 801-805所述的方法。在亚磷酰胺法中，例如在自动DNA合成仪中合成寡核苷酸，纯化，退火，连接并克隆到合适的载体中。 
核苷酸序列可以是混合的基因组和合成来源的、混合的合成和cDNA来源的，或混合的基因组和cDNA来源的，其按照标准技术通过连接合成、基因组或cDNA来源的(如果合适)的片段来制备。每个连接的片段对应于完整核苷酸序列的不同部分。也可使用特定引物通过聚合酶链反应(PCR)来制备DNA序列，例如US 4,683,202或Saiki R K等，Science(1988)239，pp 487-491中所述。 
由于遗传密码的简并性，可以方便地产生如下核苷酸序列，其中对于由原核苷酸序列编码的部分或所有氨基酸，所用三联体密码子已被改变，从而产生与原核苷酸序列具有低同源性但编码如原核苷酸序列所编码的相同或变体氨基酸序列的核苷酸序列。例如，对于大多数氨基酸，遗传密码的简并性位于三联体密码子中的第三位(摆动位)(参见Stryer，Lubert，Biochemistry，第三版，Freeman Press，ISBN 0-7167-1920-7)，因此，其中所有三联体密码子在第三位都“摆动”的核苷酸序列与原核苷酸序列将具有约66％的同一性。然而，改变后的核苷酸序列将编码如原核苷酸序列所编码的相同、或变体一级氨基酸序列。 
因此，本发明进一步涉及如下任何核苷酸序列，对于至少一种编码氨基酸的三联体密码子具有可选择的三联体密码子使用，但编码如原核苷酸序列所编码多肽序列的相同、或变体多肽序列。 
另外，特定生物通常对使用哪些三联体密码子来编码氨基酸具有偏好。优选的密码子使用率表可广泛获得，并可用于制备密码子经过优化基因。这种密码子优化技术通常用于优化转基因在异源宿主中的表达。 
氨基酸序列 
本发明的范围还涵盖具有本文定义的特定特性的酶的氨基酸序列。 
本文中所用的术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质(蛋白)” 同义。在有些情况中，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义。在有些情况中，术语“氨基酸序列”与术语“酶”同义。 
可以由合适的来源制备/分离氨基酸序列，或者可以合成，或是可以使用重组DNA技术来制备。 
本发明所涵盖的酶可与其它酶联合使用。因此，本发明还包括酶的组合，其中该组合包含本发明的酶和另一个酶(其可以是根据本发明的另一个酶)。 
优选地，本发明实质范围所涉及和涵盖的氨基酸序列不是天然的酶。在这点上，术语“天然的酶”指在其天然环境中且由其天然核苷酸序列表达的完整的酶。 
序列鉴定或序列同源性 
在本文中，术语“同源物”表示与主题(subject)氨基酸序列和主题核苷酸序列具有一定同源性的实体。在本文中，术语“同源性”可以等同于“同一性”。 
同源性氨基酸序列和/或核苷酸序列应提供和/或编码保留酶的功能活性和/或增强酶活性的多肽。 
在本文中，所述同源序列包括与主题序列可以是至少75、85或90％相同的氨基酸序列，优选与主题序列至少95、98或99％相同。典型地，同源物将包含与主题氨基酸序列相同的活性位点等。尽管同源性也可认为是相似性(即具有相似化学特性/功能的氨基酸残基)，但是在本发明中，优选以序列同一性表示同源性。 
在本文中，所述同源序列包括与编码本发明多肽的核苷酸序列(主题序列)可以是至少75、85或90％相同的核苷酸序列，优选至少95、98或99％相同。典型地，同源物将包含与主题序列相同的编码活性位点等的序列。尽管同源性也可认为是相似性(即具有相似化学特性/功能的氨基酸残基)，但是在本发明中，优选以序列同一性表示同源性。 
可以通过目测，或者更常用的是借助易于获得的序列比较程序进行同源性比较。这些商业性计算机程序能计算两种或多种序列之间的％同源性。 
可以对毗邻序列计算％同源性，即将一种序列与其它序列进行对比，并将一种序列中的每一个氨基酸与其它序列中的相应氨基酸直接进行比较，每次一个残基。这称为“无缺口”对比。通常只对较短数目的残基进行这种无缺 口对比。 
尽管这是一种非常简单且可靠的方法，然而它未能考虑例如在其它方面相同的成对序列中一处插入或删除将引起后面的氨基酸残基无法进行对比，由此可能导致在进行整体对比时％同源性大大降低。因此，大多数序列比较方法设计成在考虑到可能的插入和删除的条件下生成最佳对比，不过度处罚整体同源性得分。这是通过在序列对比中插入“缺口”以设法使局部同源性最大化而实现的。 
可是，这些更加复杂的方法给对比中发生的每个缺口赋予“缺口罚分”，使得对于相同数目的相同氨基酸而言，具有尽可能少的缺口的序列对比(反映了两种比较序列之间的较高相关性)将获得比具有许多缺口的序列更高的得分。通常使用“仿射缺口罚分(affine gap costs)”，即对缺口的存在处以较高代价，而对缺口中的每一个后续残基处以较低罚分。这是最常用的缺口评分系统。高缺口罚分当然产生具有较少缺口的优化对比。大多数对比程序容许改进缺口罚分。可是，在使用这种软件进行序列比较时，优选使用缺省值。 
因此，最大％同源性的计算首先需要生成考虑缺口罚分的最佳对比。适合进行这种对比的计算机程序是Vector NTI AdvanceTM 11(Invitrogen Corp.)。可以进行序列比较的其他软件的实例包括但不限于BLAST软件包(参见Ausubel等，1999Short Protocols in Molecular Biology，4th Ed-第18章)和FASTA(Altschul等，1990J.Mol.Biol.403-410)。BLAST和FASTA二者都能进行离线和在线搜索(参见Ausubel等，1999，7-58至7-60页)。然而，对于有些应用，优选使用Vector NTI AdvanceTM 11程序。还可以使用称为BLAST 2Sequences的新工具来比较蛋白质和核苷酸序列(参见FEMS Microbiol Lett 1999 174(2)：247-50；和FEMS Microbiol Lett 1999 177(1)：187-8.)。 
尽管最终的％同源性可以根据同一性进行测量，然而对比过程自身通常不是基于“全是或全非”成对比较。相反，通常使用尺度相似性评分矩阵，其根据化学相似性或进化距离给每对比较赋予得分。常用的此类矩阵的实例是BLOSUM62矩阵，即BLAST程序套的缺省矩阵。Vector NTI程序通常使用公开的缺省值或定制的符号比较表，如果提供的话(其他细节见用户手册)。对于有些应用，优选使用Vector NTI AdvanceTM 11软件包的缺省值。 
可选地，可以使用以与CLUSTAL(Higgins DG和Sharp PM，1988，Gene  73(1)：237-244)类似的算法为基础的Vector NTI AdvanceTM 11(Invitrogen Corp.)中的多重对比特点来计算百分比同源性。 
一旦软件生成了最佳对比，即可计算％同源性，优选％序列同一性。软件通常将其作为序列比较的一部分来执行，并生成数值结果。 
如果在确定序列同一性时使用空位罚分，则优选使用程序的缺省参数进行成对比对。例如，以下参数是BLAST 2的成对比对的当前缺省参数： 
在一个实施方式中，优选地，可以使用如上文定义的打分参数设置的BLAST2(blastn)测定核苷酸序列和/或氨基酸序列的序列同一性。 
出于本发明的目的，同一性的程度基于相同序列元素的数目。本发明的氨基酸序列的同一性程度可通过本领域已知计算机程序，例如Vector NTI AdvanceTM 11(Invitrogen Corp.)适当地测定。对于成对比对，所用的评分参数优选为空位开放罚分为11、空位延伸罚分为1的BLOSUM62。 
合适地，在至少20个连续核苷酸上，优选在至少30个连续核苷酸上，优选在至少40个连续核苷酸上，优选在至少50个连续核苷酸上，优选在至少60个连续核苷酸上，优选在至少100个连续核苷酸上测定核苷酸序列的同一性程度。 
合适地，可以在完整的序列上测定核苷酸序列的同一性程度。 
所述序列也可以具有产生沉默改变和产生功能等价物的氨基酸残基的缺失、插入或取代。可以根据残基在极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质上的相似性来进行谨慎的氨基酸取代，只要保持该物质的二级结合活性即可。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的 氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；具有相似亲水性值的不带电荷的极性头基团的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。 
例如可以根据下表进行保守取代。在第二列中相同栏中的氨基酸，优选为在第三列中相同行中的氨基酸可以相互取代： 
本发明还涵盖可以发生的同源取代(本文所用的取代和替换均指现存氨基酸残基与可选残基的互换)，即相似取代，如碱性氨基酸取代碱性氨基酸、酸性氨基酸取代酸性氨基酸、极性氨基酸取代极性氨基酸等。也可以发生非同源取代，即从一类残基变成另一类残基，或者可选择地涉及包括非天然氨基酸，如鸟氨酸(下文称为Z)、二氨基丁酸鸟氨酸(下文称为B)、正亮氨酸鸟氨酸(下文称为O)、吡啶丙氨酸、噻吩丙氨酸、萘丙氨酸和苯甘氨酸。 
也可以使用非天然氨基酸进行替换。 
变体氨基酸序列可以包含可以在序列的任何两个氨基酸残基间插入的适合的间隔子基团，除了诸如甘氨酸或β-丙氨酸残基的氨基酸间隔子外，还包括烷基基团如甲基、乙基或丙基基团。本领域的技术人员可充分理解其它形式的变异，其涉及以类肽(peptoid)形式存在的一个或多个氨基酸残基。为了避免疑问，“类肽形式”用来指其中的α-碳取代基基团在残基的氮原子上而非在α-碳上的变体氨基酸残基。制备类肽形式的肽的方法是本领域内已知的，如Simon RJ等，PNAS(1992)89(20)，9367-9371和Horwell DC，Trends Biotechnol.(1995)13(4)，132-134。 
本发明所使用的或编码具有本文定义的特定性质的多肽的核苷酸序列可以在其内部包含合成的或修饰的核苷酸。本领域中已知对寡核苷酸的许多不 同类型的修饰。这些修饰包括甲基膦酸酯和硫代磷酸酯骨架和/或在分子的3’末端和/或5’末端添加吖啶或多赖氨酸链。出于本发明的目的，应该理解可以用本领域中可用的任何方法来修饰本文所述的核苷酸序列。为了增强核苷酸序列的体内活性或寿命，可以进行所述修饰。 
本发明还涵盖与本文所讨论的序列或其任何衍生物、片段或衍生物互补的核苷酸序列的应用。如果序列与其片段互补，此序列可以被用作探针以鉴定其它生物等中相同的编码序列。 
可以以多种方式获得与本发明的序列并非100％同源但却落入本发明范围中的多核苷酸。可以通过例如探测由一系列个体(如来自不同种群的个体)制备的DNA文库来获得本文所述序列的其它变体。此外，可以获得其它病毒/细菌或细胞同源物，特别是在哺乳动物细胞(如大鼠、小鼠、牛和灵长类细胞)中发现的细胞同源物，且所述同源物或其片段将通常能够选择性地与本文序列表中所示的序列杂交。可以通过探测从其它动物物种制备的cDNA文库或基因组DNA文库，并在中度至高度严谨条件下使用包含所附序列表中任何一个序列的全部或部分的探针探测所述文库来获得所述序列。类似的考虑用于获得本发明的多肽或核苷酸序列的物种同源物和等位基因变体。 
也可以使用简并PCR来获得变体和株系/物种同源物，所述简并PCR将使用设计为靶向变体和同源物中编码本发明序列中的保守氨基酸序列的序列。可以通过例如，比对来自多个变体/同源物的氨基酸序列来预测保守序列。可以使用本领域已知的计算机软件进行序列比对。例如广泛使用GCG Wisconsin PileUp程序。 
简并PCR中所用的引物可包含一个或多个简并位点，且其使用条件的严谨性可低于使用针对已知序列的单一序列引物克隆序列所用的那些条件。 
可选择地，也可以通过已表征序列的定点诱变来获得所述多核苷酸。例如当需要沉默密码序列的改变，从而为表达多核苷酸序列的特定宿主细胞优化密码子偏爱性时，这可能是有用的。为了引入限制性多肽识别位点，或改变由多核苷酸编码的多肽的性质或功能，可能需要其它序列改变。 
可以使用本发明的多核苷酸(核苷酸序列)制备引物，如PCR引物，用于选择性扩增反应的引物，探针，如使用放射性或非放射性标记物通过常规方法用显色标记物标记的探针，或可以将多核苷酸克隆到载体中。所述引物、 探针和其它片段的长度可以是至少15个，优选为至少20个，如至少25个，30个或40个核苷酸，且其也涵盖在如本文所用的术语多核苷酸之内。 
可以重组、合成或通过本领域技术人员可利用的任何方法来制备根据本发明的多核苷酸(如DNA多核苷酸)和探针。它们也可以通过标准技术进行克隆。 
通常，可通过合成方法来制备引物，该方法包括以每次一个核苷酸的方式逐步制备所需要的核酸序列。本领域中易于获得使用自动化技术来实现上述方法的技术。 
通常使用重组方法，如使用PCR(聚合酶链式反应)克隆技术来制备较长的多核苷酸。这包括制备位于所需要克隆的脂质靶向序列区域侧翼的一对引物(如约15至30个核苷酸)，使引物接触从动物或人细胞获得的mRNA或cDNA，在可以使所需区域扩增的条件下进行聚合酶链式反应，分离扩增的片段(如通过在琼脂糖凝胶上纯化反应混合物)，并回收扩增的DNA。可以设计引入使其包含合适的限制性酶识别位点，以便可以将扩增的DNA克隆到合适的克隆载体中。 
杂交 
本发明还涵盖与本发明的序列互补的序列，或能够与本发明的序列杂交或与其互补序列杂交的序列的用途。 
本文所用的术语“杂交”包括“一条核酸链通过碱基配对与互补链结合的过程”，以及在聚合酶链式反应(PCR)技术中进行扩增的过程。 
本发明还涵盖能够和与本文所讨论的主题序列、或其任何衍生物、片段或衍生物互补的序列杂交的所述核苷酸序列的应用。 
本发明还涵盖能够与本文所讨论的核苷酸序列杂交的序列的互补序列。 
杂交条件基于核苷酸结合复合物的解链温度(Tm)，如Berger和Kimmel(1987，Guide to Molecular Cloning Techniques，Methods in Enzymology，Vol.152，Academic Press，San Diego CA)中所教导，且给出了如下文所解释的定义的“严谨性”。 
最高严谨性通常出现在约Tm-5℃(比探针的Tm低5℃)；高严谨性在比Tm低约5℃至10℃；中等严谨性比Tm低约10℃至20℃；低严谨性出现在 比Tm低约20℃至25℃。如本领域技术人员的理解，最高严谨性杂交可以用于鉴定或检测相同的核苷酸序列，而中等(或低)严谨性杂交可以用于鉴定或检测相似或相关的多核苷酸序列。 
优选地，本发明涵盖能够在高严谨性条件或中等严谨性条件下与编码具有如本文定义特定性质的多肽的核苷酸序列杂交的序列的互补序列的用途。 
更优选地，本发明涵盖能够在高严谨性条件(如65℃和0.1×SSC{1×SSC＝0.15M NaCl、0.015M柠檬酸钠，pH 7.0})下与编码具有如本文定义的特定性质的多肽的核苷酸序列发生杂交的序列的互补序列的用途。 
本发明还涉及能够与本文讨论的核苷酸序列(包括本文讨论的那些序列的互补序列)杂交的核苷酸序列的用途。 
本发明还涉及能够与本文讨论的核苷酸序列(包括本文讨论的那些序列的互补序列)杂交的序列的互补核苷酸序列的用途。 
本发明的范围还包括能够在中等至最高严谨性条件下与本文所讨论的核苷酸序列杂交的多核苷酸序列的用途。 
在优选的方面，本发明涵盖能够在严谨性条件(如50℃和0.2×SSC)下与本文所讨论的核苷酸序列杂交的核苷酸序列或其互补序列的用途。 
在更优选的方面，本发明涵盖能够在高严谨性条件(如65℃和0.1×SSC)下与本文所讨论的核苷酸序列杂交的核苷酸序列或其互补序列的用途。 
生物活性 
优选地，变体序列等至少具有本文所述的序列的生物活性。 
本文使用的“生物活性”指具有天然存在序列的类似结构功能(但不一定是相同程度)和/或类似调控功能(但不一定是相同程度)和/或类似生物功能(但不一定是相同程度)的序列。 
重组的 
在一个方面，用于本发明的序列是重组序列，即利用重组DNA技术制备的序列。 
这些重组DNA技术在本领域普通技术人员的能力范围内。例如，J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，1989，Molecular Cloning：A Laboratory  Manual，第二版，1-3册，Cold Spring Harbor Laboratory Press的文献中描述了这些技术。 
合成的 
在一个方面，用于本发明的序列是合成的序列，即通过体外化学或酶促合成制备的序列。它包括但不限于用宿主生物(例如甲基营养型酵母毕赤酵母(Pichia)和汉逊酵母(Hansenula))的最优密码子使用得到的序列。 
酶的表达 
可以将用于本发明的核苷酸序列引入至重组的可复制载体中。该载体可用于在相容宿主细胞中和/或由相容宿主细胞复制并以酶的形式表达所述核苷酸序列。 
可以使用控制序列，如调控序列来控制表达。 
根据所使用的序列和/或载体，由宿主重组细胞通过表达核苷酸序列而生成的酶可以是分泌的，或者可以是包含在细胞内的。编码序列可以设计成含有信号序列，它指导序列所编码物质穿过特定原核或真核细胞膜的分泌。 
表达载体 
术语“表达载体”指能够在体内或在体外进行表达的构建体。 
优选地，将表达载体引入至合适宿主生物的基因组中。术语“引入”优选包括稳定的引入至基因组中。 
本发明的核苷酸序列可以存在于载体中，其中核苷酸序列可操作连接调控序列，该调控序列能够通过合适的宿主生物提供核苷酸序列的表达。 
可以按照下文所述将用于本发明用途的载体转化到合适的宿主细胞中，以提供本发明多肽的表达。 
载体例如质粒、粘粒或噬菌体载体的选择常常取决于待导入的宿主细胞。 
用于本发明用途的载体可以含有一种或多种选择性标记基因，例如赋予抗生素抗性的基因，如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性。可选择地，可以通过共转化来进行选择(如WO 91/17243中所述)。 
可以在体外使用载体，例如用于生成RNA或用于转染、转化、转导或 感染宿主细胞。 
因此，在进一步的实施方式中，本发明提供了制备本发明的核苷酸序列的方法，其中通过将本发明的核苷酸序列导入可复制载体，将载体导入相容宿主细胞，并在促使载体复制的条件下培养宿主细胞。 
载体可以进一步包含使得载体能够在所述宿主细胞中进行复制的核苷酸序列。这些序列的实例有质粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1和pIJ702的复制起点。 
在一个实施方式中，可以按照实施例中的描述使用pTrex3表达载体。 
调控序列 
在有些应用中，用于本发明用途的核苷酸序列可操作连接调控序列，所述调控序列能够通过例如所选择的宿主细胞产生核苷酸序列的表达。举例来说，本发明覆盖包含可操作地连接至此种调控序列的本发明核苷酸序列的载体，即所述载体是表达载体。 
术语“可操作地连接”指位置毗邻，其中所述组件的相互关系容许它们以其预期方式发挥功能。与编码序列“可操作地连接”的调控序列的连接方式使得能够在与控制序列相容的条件下实现编码序列的表达。 
术语“调控序列”包括启动子和增强子和其它表达调控信号。 
术语“启动子”采用本领域的常用含义，例如RNA聚合酶结合位点。 
还可以通过选择异源调控区，例如启动子、分泌前导序列和终止子区，来实现编码本发明酶的核苷酸序列的增强的表达。 
优选地，本发明的核苷酸序列可操作连接至少一个启动子。 
适合指导核苷酸序列在细菌、真菌或酵母宿主中转录的启动子的实例在本领域是熟知的。 
构建体 
术语“构建体”(与诸如“缀合物”、“盒”和“杂合物”等的术语同义)包含直接或间接与启动子相连的用于本发明的核苷酸序列。 
间接相连的实例在本发明的启动子和核苷酸序列之间提供合适的间隔区，例如内含子序列，如Sh1-内含子或ADH内含子。术语“融合”在本发明 中也是如此，包括直接或间接相连。在有些情况中，所述术语不包括编码蛋白质的核苷酸序列与通常相连的野生型基因启动子都处于其天然环境中时的天然组合。 
构建物甚至可以包含或表达容许选择基因构建体的标记。 
对于有些应用，优选本发明的构建体至少包含可操作地与启动子连接的本发明核苷酸序列。 
宿主细胞 
术语“宿主细胞”在涉及本发明时包括包含上文所述的核苷酸序列或表达载体且用于重组生产具有本文定义的特定特性的酶的任何细胞。 
因此，本发明的进一步的实施方式提供了用表达本发明酶的核苷酸序列转化或转染的宿主细胞。将要选择与所述载体相容的细胞，而且其可以是例如原核(例如细菌)、真菌、酵母或植物细胞。优选地，所述宿主细胞不是人类细胞。 
合适的细菌宿主生物的实例有革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌物种。 
根据编码本发明酶的核苷酸序列的性质和/或进一步加工所表达蛋白质的愿望，可优选真核宿主，例如酵母或其它真菌。然而，有些蛋白质或是难以由酵母细胞分泌，或是在有些情况中难以正确加工(例如在酵母中过度糖基化)。在这些情况中，应当选择不同的真菌宿主生物。 
使用合适的宿主细胞，例如酵母、真菌和植物宿主细胞，可以提供翻译后修饰(例如肉豆蔻酰化、糖基化、截短、脂化(lapidation)以及酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸磷酸化)，这可能是赋予本发明重组表达产物以最佳生物学活性所需要的。 
宿主细胞可以是蛋白酶缺陷型或蛋白酶阴性(minus)的菌株。 
可修饰宿主细胞的基因型以改善表达。 
宿主细胞修饰的实例包括蛋白酶缺陷型、补充罕见的tRNA和改变细胞质中的还原势(reductive potential)以增强二硫键的形成。 
例如，如Kane(Curr Opin Biotechnol(1995)，6，494-500″Effects of rare codon clusters on high-level expression of heterologous proteins in E.coli″)中所示例/描述的，宿主细胞大肠杆菌可过度表达罕见的tRNA以改善异源蛋白质 的表达。如Bessette(Proc Natl Acad Sci USA(1999)，96，13703-13708″Efficient folding of proteins with multiple disulphide bonds in the Escherichia coli cytoplasm″)中所示例/描述的，宿主细胞可以是许多还原酶缺陷的，由此有利于形成稳定的二硫键。 
在优选的实施方式中，宿主细胞是细菌，优选丝状真菌宿主序列，优选来自木霉属。在优选的实施方式中，优选宿主细胞为里氏木霉。 
已经意外地发现，通过使用里氏木霉作为宿主细胞可以显著提高本发明的变体多肽的表达。 
在本发明之前，已经通过在汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha)中表达而产生来自异孢镰刀菌的脂肪分解酶(即wt KLM1)。在考虑目的在于扩大酶生产规模的可选表达系统时，设想在里氏木霉中表达。然而，wt KLM1酶在里氏木霉中的生产能力差。 
然而，意外地，已经发现本发明的变体多肽在里氏木霉中具有显著提高的表达水平(比野生型KLM1酶好12至25倍)。这是显著的提高，其可以导致酶的商业规模生产成本的显著降低。 
在一个实施方式中，本发明提供了在里氏木霉中表达变体脂肪分解酶的方法，所述方法包括用编码对极性脂质中的酯键具有水解活性的多肽的核苷酸序列(例如，本发明的核苷酸序列)转化里氏木霉，培养里氏木酶以获得所述核苷酸序列的表达并收集所述多肽。 
生物 
涉及本发明的术语“生物”包括能够包含编码本发明酶的核苷酸序列和/或由其获得的产物，和/或其中启动子在本发明的核苷酸序列存在于生物中时能够容许表达所述核苷酸序列的任何生物。 
合适的生物可以包括原核生物、真菌、酵母或植物。 
涉及本发明的术语“转基因生物”包括包含编码根据本发明酶的核苷酸序列和/或由其获得的产物，和/或其中启动子能够容许本发明的核苷酸序列在生物内表达的任何生物。优选地，将核苷酸序列掺入到所述生物的基因组中。 
术语“转基因生物”不涵盖处于其天然环境中的天然核苷酸编码序列(此时天然核苷酸编码序列处于同样处于其天然环境中的其天然启动子的控制之 下)。 
因此，本发明的转基因生物包括包含编码本发明酶的核苷酸序列、本发明的构建体、本发明的载体、本发明的质粒、本发明的细胞、本发明的组织或其产物中的任何一种或组合的生物。 
例如，转基因生物还可以包含处于异源启动子的控制之下的本发明酶的编码核苷酸序列。 
宿主细胞/生物的转化 
如上所述，宿主生物可以是原核或真核生物。合适的原核宿主的实例包括大肠杆菌和枯草杆菌(Bacillus subtilis)。 
关于原核宿主转化的教导在本领域有很好的记录，例如见Sambrook等(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd edition，1989，Cold Spring Harbor Laboratory Press)。如果使用原核宿主，那么核苷酸序列可能需要在转化前进行合适的修饰，诸如清除内含子。 
可以使用本领域知道的多种方法转化丝状真菌细胞，例如包括以已知方式形成原生质体，转化原生质体，随后再生细胞壁的方法。EP 0 238 023中描述了使用曲霉(Aspergillus)作为宿主微生物的用途。在一个实施方式中优选里氏木霉为宿主生物。 
另一种宿主生物可以是植物。关于用于转化植物的一般技术的综述可见Potrykus(Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol[1991]42：205-225)和Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)。关于植物转化的进一步教导可见EP-A-0449375。 
以下部分介绍了关于转化真菌、酵母和植物的一般教导。 
转化的真菌 
宿主生物可以是真菌，例如丝状真菌。合适的这种宿主的实例包括属于嗜热菌属(Thermomyces)、支顶孢属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、毛霉属(Mucor)、链孢霉属(Neurospora)、木霉属(Trichoderma)等的任何成员。在一个实施方式中优选木霉作为宿主生物，优选里氏木霉。 
教导丝状真菌转化的综述见US-A-5741665，其表明用于转化丝状真菌和 培养所述真菌的标准技术是本领域熟知的。关于应用于粗糙链孢霉(N.crassa)的技术的综述见例如Davis和de Serres，Methods Enzymol(1971)17A：79-143。 
关于转化丝状真菌的进一步技术的综述见US-A-5674707。 
关于丝状真菌中的基因表达的综述见Punt等，(2002)Trends Biotechnol 2002 May；20(5)：200-6，Archer & Peberdy Crit Rev Biotechnol(1997)17(4)：273-306。 
转化的酵母 
在另一个实施方式中，转基因生物可以是酵母。 
关于在酵母中表达异源基因的原理的综述见例如Methods Mol Biol(1995)，49：341-54；和Curr Opin Biotechnol(1997)Oct；8(5)：554-60。 
在这个方面，可以使用酵母，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)作为异源基因表达的媒介(见FEMS Microbiol Rev(200024(1)：45-66)。 
关于在酿酒酵母中表达异源基因和分泌基因产物的原理的综述见EHinchcliffe E Kenny(1993，″Yeast as a vehicle for the expression of heterologous genes″，Yeasts，Vol 5，Anthony H Rose and J Stuart Harrison，Eds.，2nd edition，Academic Press Ltd.)。 
关于酵母的转化，已经开发了数种转化方案。例如，可以通过Hinnen等.，(1978，Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75，1929)；Beggs，J D(1978，Nature，London，275，104)；和Ito，H等(1983，J Bacteriology 153，163-168)的教导来制备本发明的转基因酵母。 
可以使用多种选择标记来选择经过转化的酵母细胞，诸如营养缺陷标记和显性抗生素抗性标记。 
转化的植物/植物细胞 
适合本发明的宿主生物可以是植物。关于一般技术的综述可以见Potrykus(Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol[1991]42：205-225)和Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)的文献。 
培养和生产 
可以在有益于生成所编码的酶且易于从细胞和/或培养基中回收酶的条件下培养经过本发明核苷酸序列转化的宿主细胞。 
用于培养细胞的培养基可以是适于培养所讨论宿主细胞且使得酶表达的任何常规培养基。 
由重组细胞生成的蛋白质可以展示在细胞表面上。 
可利用公知的方法，从宿主细胞分泌酶并方便地从培养基中回收。 
分泌 
通常希望表达宿主将酶分泌到培养基中，由此可以更加容易地回收酶。根据本发明，可以根据期望的表达宿主来选择分泌前导序列。杂合信号序列也可用于本发明。 
异源分泌前导序列的典型实例有来自真菌淀粉葡糖苷酶(AG)基因(glaA-18和24个氨基酸的两种形式，例如来自曲霉属)、α-因子基因(酵母，例如酵母属(Saccharomyces)、克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces)和汉逊氏酵母(Hansenula))或α-淀粉酶基因(杆菌属(Bacillus)))的那些分泌前导序列。 
举例来说，关于大肠杆菌中异源蛋白质分泌的综述见Methods Enzymol(1990)182：132-43。 
检测 
本领域已知用于检测和测定氨基酸序列表达的多个方案。实例包括酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射免疫测定法(RIA)和荧光激活细胞分选术(FACS)。 
本领域技术人员已知多种标记物和缀合技术，它们可用于多种核酸和氨基酸测定法中。 
许多公司，例如Pharmacia Biotech(Piscataway，NJ)、Promega(Madison，WI)和US Biochemical Corp(Cleveland，OH)都供应用于这些方法的商品化试剂盒和方案。 
合适的报告分子或标记物包括那些放射性核素、酶、荧光、化学发光或显色剂，以及底物、辅因子、抑制剂和磁性粒子等。教导这些标记物的用途 的专利包括US-A-3,817,837、US-A-3,850,752、US-A-3,939,350、US-A-3,996,345、US-A-4,277,437、US-A-4,275,149和US-A-4,366,241。 
另外，可以如US-A-4,816,567中所述生成重组免疫球蛋白。 
融合蛋白 
可以以融合蛋白的形式生成用于本发明用途的氨基酸序列，例如以有助于提取和纯化。融合蛋白配偶体的实例包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、6xHis、GAL4(DNA结合和/或转录激活结构域)和β-半乳糖苷酶。也可以方便地在融合蛋白配偶体与目的蛋白质序列之间包含蛋白水解切割位点，从而能够切除融合蛋白序列。 
优选地，融合蛋白将不会妨碍蛋白质序列的活性。 
关于大肠杆菌中的基因融合表达系统的综述见Curr.Opin.Biotechnol.1995 6(5)：501-6。 
在本发明的另一个实施方式中，可以将氨基酸序列与异源序列连接以编码融合蛋白。例如，为了筛选肽库获得能够影响物质活性的试剂，编码表达被商品化抗体识别的异源表位的嵌合物可能是有用的。 
大规模应用 
在本发明的一个优选实施方式中，将氨基酸序列用于大规模应用。 
优选地，培养宿主生物后产生的氨基酸序列的量为每升总细胞培养液体积1g至约25g，优选高于2.5g-约18g，优选高于8g。 
食物/食品 
本发明的组合物可用作或用于制备食物或食品。本文中，术语“食物”或“食品”以广义来使用，并包括用于人的食物以及用于动物的食物(即饲料)。在优选的方面，所述食物是供人食用的。 
所述食物可以是溶液的形式或作为固体，这取决于用途和/或应用模式和/或施用模式。 
食物成分 
本发明的组合物可用作食物成分。 
本文中所用的术语“食物成分”包括加到或可加到功能食物或食品中的配方，并包括能在需要例如酸化或乳化的极其多种产品中以低水平使用的配方。 
所述食物成分可以是溶液的形式或作为固体，这取决于用途和/或应用模式和/或施用模式。 
食物产品 
本发明的组合物可用于食物产品的制备中，例如糖果产品、乳制品、禽产品、鱼产品和烘焙产品中的一种或多种。 
本发明还提供了制备食物或食物成分的方法，该方法包括将本发明的脂肪分解酶与另一种食物成分混合。 
实施例
将参考以下附图，仅通过实施例的方式描述本发明。 
图1显示SEQ ID No.1，其是编码来自异孢镰刀菌CBS 782.83的脂肪分解酶(野生型)的合成DNA片段； 
图2显示来自异孢镰刀菌CBS 782.83的脂肪分解酶的蛋白前原序列SEQ ID No.2(野生型)-所述前原序列发生翻译后修饰，从而使所述酶的成熟形式包含SEQ ID No.2的氨基酸31-305，并且优选由SEQ ID No.2的氨基酸31-305组成。然而，在一些宿主生物中，所述蛋白可以经N-末端加工从而将多个额外的氨基酸添加至N-末端或C-末端。因此，所述酶的成熟形式可以是包含至少SEQ ID No.2的氨基酸31-305的酶。所述酶的成熟形式可以在本文中称为KLM 1。该酶被认为是野生型酶； 
图3显示了SEQ ID No.3，其是表达载体pTrex3的DNA序列，而表达载体pTrex3图示于图23； 
图4显示了SEQ ID No.4，其是被称为“mut 3”的多肽变体的DNA序列； 
图5显示了SEQ ID No.5，其是被称为“mut 3”的多肽变体的蛋白前原序列； 
图6显示了SEQ ID No.6，其是被称为“mut 4”的多肽变体的DNA序列； 
图7显示了SEQ ID No.7，其是被称为“mut 4”的多肽变体的蛋白前原序列； 
图8显示了SEQ ID No.8，其是被称为“mut 5”的多肽变体的DNA序列； 
图9显示了SEQ ID No.9，其是被称为“mut 5”的多肽变体的蛋白前原序列； 
图10显示了SEQ ID No.10，其是被称为“mut 345”的多肽变体的DNA序列； 
图11显示了SEQ ID No.11，其是被称为“mut 345”的多肽变体的蛋白前原序列； 
图12显示了SEQ ID No.12，其是被称为“mut 3459”的多肽变体的DNA序列； 
图13显示了SEQ ID No.13，其是被称为“mut 3459”的多肽变体的蛋白前原序列； 
图14显示了SEQ ID No.14，其是被称为“mut 9”的多肽变体的DNA序列； 
图15显示了SEQ ID No.15，其是被称为“mut 9”的多肽变体的蛋白前原序列； 
图16显示了SEQ ID No.16，其是被称为“mut 10”的多肽变体的DNA序列； 
图17显示了SEQ ID No.17，其是被称为“mut 10”的多肽变体的蛋白前原序列； 
图18显示了SEQ ID No.18，其是被称为“mut 11”的多肽变体的DNA序列； 
图19显示了SEQ ID No.19，其是被称为“mut 11”的多肽变体的蛋白前原序列； 
图20显示了SEQ ID No.20，其是被称为“mut 12”的多肽变体的DNA序列； 
图21显示了SEQ ID No.21，其是被称为“mut 12”的多肽变体的蛋白前原序列； 
图22显示了所述多肽变体(前原序列)和野生型酶的氨基酸序列的比对， 在本文示为a)SEQ ID No.2，称为KLM1wt的前原序列，b)如EP 0 867 167中教导的尖孢镰刀菌脂酶，本文示为SEQ ID No.22；该酶在本文中有时称为Lipopan FTM或“F.ox EP”，和进一步的如US 7,465,570中教导的尖孢镰刀菌脂酶的氨基酸序列-在本文中显示为SEQ ID No.23，该酶有时在本文中称为Lipopan FTM或“F.ox US”； 
图23以图示显示描述了表达载体pTrex3的结构，其中编码来自异孢镰刀菌CBS 782.83的脂酶的合成DNA片段(DNA序列SEQ ID No：1)已经用SacII和AscI消化并且克隆在SacII和AscI限制性位点之间； 
图24显示了野生型脂肪分解酶和四个单点糖基化突变体在微滴定盘中的表达； 
图25显示了野生型KLM 1脂肪分解酶，C-末端加工点突变体和两个单点糖基化突变体在补料分批发酵中的表达(184h)； 
图26显示了在DGGR试验(实施例1)中测定的来自CBS 782.83的脂肪分解酶多糖基化和/或在C-末端加工区中修饰的突变体的表达水平。活性表示为相对于野生型脂肪分解酶的活性； 
图27显示了来自CBS 782.83的脂肪分解酶多糖基化和/或在C-末端加工区中修饰的突变体的表达水平。KLM1：野生型脂肪分解酶。5、345、3459、9、10、11和12：在四删除(quad-deleted)的里氏木霉菌株中表达的突变体MUT5、MUT 345、MUT 3459、MUT 9、MUT 10、MUT 11、MUT 12。11ε和12ε：在里氏木霉的Endo-T删除株中表达的MUT11和MUT 12。 
图28显示了第一烘焙试验的结果，其显示了作为脂肪分解酶(KLM1、Mut4、Mut5和Mut9)和剂量(TIPU/kg面粉)的函数的面包体积(ml/g)； 
图29显示了第二烘焙试验的结果，其显示了作为脂肪分解酶(KLM1、Mut4、Mut5和Mut9)和和剂量(TIPU/kg面粉)的函数的面包体积(ml/g)； 
图30显示了EP 0 869 167中教导的尖孢镰刀菌脂酶的氨基酸序列(在本文中显示为SEQ ID No.22)，该酶有时在本文中称为Lipopan FTM或“F.ox EP”； 
图31显示了Mut 9、Mut345、Mut3459和Mut 11的烘焙试验的结果，该图显示了利用不同剂量(mg/kg面粉)的不同变体烘焙的面包的相对面包体积(％)； 
图32显示了比较KLM1脂肪分解酶的残基33-296的同源性模型(黑线) 与嗜热菌(Thermomyces)脂酶(pdb登陆号1DT3)的结构(浅线)的立体图。这两个结构的二级结构具有高保守性，其中所述同源性模型的催化三联体见于在嗜热菌脂酶中发现二级结构共有特征的相对位置。 
图33显示了表示相对于以棒状显示的催化三联体，第63、78和190位的取代相对位置(以实心空间示图显示)。可以看出这些位置见于远离催化三联体的环中； 
图34显示了基于同源性模型显示KLM1脂肪分解酶中远侧环的位置的立体图。这些环中并入了在以实心空间示图显示的第63、78和190位取代位并且远离以棒状显示的催化三联体。这些环包括残基54-66、75-79、99-103、127-135、162-167、188-195和213-221； 
图35显示了如US 7,465,570中SEQ ID No.1教导的孢镰刀菌脂酶的氨基酸序列，其在本文中显示为SEQ ID No.23，该酶有时在本文中被称为Lipopan FTM或“F.ox US”； 
图36显示了如EP 0 869 167中教导的尖孢镰刀菌脂酶的核苷酸序列，其在本文中显示为SEQ ID No.24，该酶有时在本文中被称为Lipopan FTM或“F.ox EP”； 
图37显示了SEQ ID No.25，其是被称为“mut 1”的多肽变体的蛋白前原序列；和 
图38显示了SEQ ID No.26，其是被称为“mut 1”的多肽变体的DNA序列。 
实施例1：利用1，2-O-二月桂基-消旋-甘油-3-戊二酸-试卤灵酯(1，2-O-dilauryl-rac-glycero-3-glutaric-resorufin ester)的脂酶试验(DGGR试验) 
通过混合4份缓冲液(50mM HEPES pH 8，0.4mg/ml MgCl2，1.2mg/mlCaCl2，2％阿拉伯树胶)和1份底物(二甲基亚砜中的664μM 1，2-O-二月桂基-消旋-甘油-3-戊二酸-试卤灵酯(DGGR，Fluka))制备底物溶液。将脂酶的合适稀释试样加入至微滴定板孔中的200μl底物溶液中。DGGR的水解导致在572nm吸收的改变，利用微滴定板读数仪对其进行实时跟踪。 
实施例2：来自异孢镰刀菌CBS 782.83的野生型脂肪分解酶(KLM1)的表达 
编码异孢镰刀菌CBS 782.83的脂肪分解酶的合成DNA片段(DNA序列-SEQ ID No：1；前原蛋白序列SEQ ID No：2)已经用SacII和AscI进行了消化并克隆到表达载体pTrex3的限制性位点SacII和AscI之间。 
pTrex3包含以下功能区： 
1.里氏木霉cbh1启动子和部分编码区。该DNA序列始于所述编码序列上游约1500bp的天然发生的XbaI位点，并结束于编码对应于CBHI信号肽的序列的cbhI基因内的天然发生的SfiI位点。 
2.位于工程化AscI位点之后的里氏木霉cbh1转录终止子区(约0.36kb)。 
3.2.75kb的构巢曲霉(Aspergillus nidulans)基因组DNA片段，包含启动子、编码区和amdS(乙酰胺酶)基因的终止子。天然XbaI位点位于该片段的3’-末端附近。 
4.约3.2kb的细菌DNA片段，包含colE1复制起点和氨苄青霉素抗性基因。 
图23以图示形式显示了pTrex3的结构。pTrex3的DNA序列作为SEQ ID No：3列出(参见图3)。 
使用XbaI和SspI切割通过将脂肪分解酶基因克隆至在pTrex3中而产生的载体(pTrex3(KLM1))，并且通过琼脂糖凝胶电泳纯化出包含脂肪分解酶表达盒和amdS标记物的4.5kb XbaI-XbaI DNA片段。使用纯化的片段，通过电穿孔转化里氏木霉的四删除的菌株(Δcbh1，Δcbh2，Δegl1，Δegl2，描述在WO05/001036中)的孢子(A.N.Miasnikov，S.Kim.Transformation of T.reesei spores by electroporation.Poster No 598.Abstracts of 25th Fungal Genetics Conference at Asilomar.March 17-22，2009，p 266)。在包含作为唯一氮源的乙酰胺的培养基(乙酰胺0.6g/l；氯化铯1.68g/l；葡萄糖20g/l；磷酸二氢钾15g/l；硫酸镁七水合物0.6g/l；氯化钙二水合物0.6g/l；硫酸铁(II)5mg/l；硫酸锌1.4mg/l；氯化钴(II)1mg/l；硫酸锰(II)1.6mg/l；琼脂20g/l；pH 4.25)上选择转化体。所转化的菌落在约1周内显现。将单个转化体转移到新鲜的乙酰胺选择平板上并生长2-4天。将在选择培养基上显示稳定生长的分离物接种到底部配备有微滤器(Millipore MultiScreen-GVTM)的微滴定板孔中的0.2ml葡萄糖-槐糖培养基(1％槐糖、0.6％葡萄糖、0.6％甘氨酸、3.3％PIPPS缓 冲液、0.47％(NH4)2SO4、0.5％KH2PO4、0.3％柠檬酸、0.1％MgSO4、500mg/lFeSO4、40mg/l ZnSO4、8mg/l CuSO4、3.5mg/l MnSO4、2mg/l硼酸)中。将平板在纯氧气的气氛下于25-28℃孵育4-6天。通过过滤分离培养基，并通过在十二烷基磺酸钠存在下的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)或DGGR实验进行分析。多个转化体都在SDS凝胶中产生了新的蛋白条带。该条带的估测分子量(约28kDa)对应于N-和C-末端(Nagao等.J.Biochem.124，1124-1129(1998))经加工的KLM1脂酶的预期分子量(28.6kDa)。产生28kDa条带的转化体克隆的培养基还包含显著的脂酶活性(在DGGR实验中测定)。在转化中作为受体的未转化里氏木霉的培养基中基本没有检测到脂酶活性。 
实施例3：突变形式的异孢镰刀菌CBS 782.83脂肪分解酶的表达 
利用基于PCR的标准技术构建了突变形式的脂肪分解酶基因。表1中列出并表明了突变基因的DNA和蛋白序列和脂肪分解酶的前原形式。所有突变体都具有R306S突变(突变0)。突变体1、3、4和5具有在不同位置引入的单个N-连接的糖基化位点共有序列(野生型脂肪分解酶(KLM1)没有N-连接的糖基化位点)。突变体9具有两个氨基酸残基(K311R312)的删除。其它所有突变体都包含多个糖基化位点。 
表1：异孢镰刀菌CBS 782.83脂肪分解酶突变体：核苷酸和前原蛋白序列以及表达载体 
(*)通过DNA测序证实. 
各突变或变体脂肪分解酶与野生型酶(KLM1；SEQ ID No.2)相比的修饰示于下表2。所有编号均参照野生型前原-KLM1的序列(本文示为SEQ ID No.2)。 
表2： 
脂肪分解酶基因的所有突变形式都已经以与野生型脂肪分解酶基因相同的方式克隆到pTrex3中(利用SacII和AscI限制性位点)。按照实施例2的描述进行里氏木霉的转化，转化体的选择和培养。对表达各突变体的至少50个稳定转化体进行分析。对于每种类型，选择脂酶产生水平最高的一个转化体。 
实施例4：用于里氏木霉的Endo T基因的破坏盒的构建 
利用专利申请WO 2006/050584的信息鉴定里氏木霉的基因组序列中的Endo T基因(http://genome.igi-psf.org/Trire2/Trire2.home.html)。利用引物SK915(5’-CTGATATCCTGGCATGGTGAATCTCCGTG-3’)和SK916(5’-CATGGCGCGCCGAGGCAGATAGGCGGACGAAG-3’)通过PCR对其5’-侧翼区(1.9Kb)进行扩增。利用引物SK917(5’-CATGGCGCGCCGTGTAAGTGCGTGGCTGCAG-3’)和SK918(5’-CTGATATCGATCGAGTCGAACTGTCGCTTC-3’)通过PCR扩增3’-侧翼区(1.7Kb)。在所有PCR反应中，均使用PfuII Ultra(Stratagene)作为聚合酶。按照手册中列出的以下方案，利用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)对PCR反应产物进行纯化。利用限制性核酸内切酶AscI 消化两个扩增的DNA片段，然后利用QIAquick试剂盒对消化的DNA进行纯化。混合两个DNA片段并作为模板用于使用引物SK915和SK918的融合PCR反应。利用Zero Blunt TOPO PCR克隆试剂盒(Invitrogen)将该反应的产物3.6kb DNA片段克隆至pCR-Blunt II TOPO载体中。通过限制性分析证实所产生的质粒(pCR-BluntII-TOPO(5’-3’侧翼))的结构。已经利用PCR引物SK949(5’-GTTTCGCATGGCGCGCCTGAGACAATGG-3’)和SK946(5’-CACAGGCGCGCCGATCGCCATCCCGTCGCGTC-3’)以及作为模板的pTrex-葡糖淀粉酶载体(WO 2008/039370，实施例2)扩增了赋予氯嘧磺隆抗性的里氏木霉乙酰乳酸合酶(ALS)基因。PCR反应产物用QIAquick试剂盒纯化、用AscI消化、再次纯化并与用相同酶消化并进行类似纯化的pCR-BluntII-TOPO(5’-3’侧翼)连接。通过限制性分析获得插入物在所产生的质粒pCR-BluntII-TOPO(5’侧翼-ALS标记物-3’侧翼)中的方向。利用相同的技术和引物MC40(5’-CTATGACATGCCCTGAGGCGATGCTGGCCAGGTACGAGCTG-3’)和MC41(5’-CAGCCTCGCGGTCACAGTGAGAGGAACGGGGTGAAGTCGTATAAG-3’)扩增额外的里氏木霉染色体序列片段(称为“3’-重复”)。该序列位于里氏木霉染色体上包含在pCR-BluntII-TOPO(5’-3’侧翼)中的3’-侧翼区的更下游区域。利用In-Fusion Dry-Down PCR克隆试剂盒(Clontech)将该PCR的0.46kb产物(3’-重复)克隆至pCR-BluntII-TOPO(5’侧翼-ALS标记物-3’侧翼)中的ALS基因的上游。利用PasI和BstEII消化pCR-BluntII-TOPO(5’侧翼-ALS标记物-3’侧翼)以插入3’重复。所产生的构建体pCR-BluntII-TOPO(5’侧翼-ALS标记物-3’重复-3’侧翼)作为模板用于使用引物(CTAGCGATCGCGTGTGCACATAGGTGAGTTCTCC)和SK1009：(CTAGCGATCGCGCAGACTGGCATGCCTCAATCAC)的PCR。利用来自Invitrogen的相应试剂盒将7.5kb DNA产物克隆至pCR-BluntII-TOPO载体中。用AsiSI消化所产生的质粒，并通过制备性琼脂糖凝胶电泳纯化7.5kb DNA片段(Endo-T删除盒)。 
实施例5：里氏木霉中Endo-T基因的破坏和用脂肪分解酶表达构建体转化所产生的突变体 
里氏木霉的四删除菌株(Δcbh1，Δcbh2，Δegl1，Δegl2)描述于WO05/001036中。通过 等( M.等.1987.A versatile transformation system  for the cellulolytic filamentous fungus T.reesei.Gene 61：155-164)描述的转化方法，利用删除盒(实施例4的删除盒)转化该菌株。在含有200ppm氯嘧磺隆的Modified Vogel培养基上选择转化体(WO 2008/039370)。在液体培养基中培养转化体，并通过SDS凝胶电泳分析培养物上清。鉴定在凝胶上大多数蛋白条带的迁移率都呈现增长变化的两个克隆(#11和#74)。从这两个菌株和里氏木霉的亲本四删除菌株中分离染色体DNA。利用引物对MC 42plus MC 48(5′-CTCGCCATCTGACAACCTACAAATC-3′和5′-CTAGTACCCTGAGTTGTCTCGCCTCC-3′)和MC 45plus MC 50(5′-CCTCTACCATAACAGGATCCATCTG-3′和5′-CGTGAGCTGATGAAGGAGAGAACAAAGG-3′)对这些DNA制备物进行PCR分析。利用从克隆#74分离的DNA获得了预期大小(2.9和2.3kb)的产物。使该克隆进行连续两轮纯化(通过分离单孢子的子代)。从纯化的转化体#74分离DNA。重复PCR分析，证实了Endo-T基因的成功删除。用pTrex3(MUT10)、pTrex3(MUT11)和pTrex3(MUT12)转化所产生的里氏木霉突变株。按照实施例3的描述进行转化体的筛选和孢子纯化。 
实施例6：生产带有单个工程化糖基化位点的异孢镰刀菌CBS 782.83的脂肪分解酶突变形式 
按照上文所述(实施例2)，将所选择的表达野生型脂肪分解酶和突变体3、4和5(参见实施例2和3)的最佳转化体在微滴定板中培养4天。还利用标准补料分批过程(WO 2004/035070)，在发酵罐中对这些突变体中的两个以及野生型脂肪分解酶和MUT 0(仅携带R306S突变)的生产情况进行测试。包含单个工程化糖基化位点的所有三个突变体均以比野生型酶更高的水平表达，尤其是在发酵罐中长时间(184小时)补料分批培养的情况下(参见图24和图25以及表3)。 
表3： 
  脂肪分解酶变体   在MTP中的表达水平，4天(*)   在发酵罐中的表达水平(*)
  野生型   1.0   1.0
  MUT0   n.d.   1.2
  MUT1   1.3   n.d.
  MUT3   1.9   n.d.
  MUT4   2.3   8.3
 
  MUT5   2.1   10.8
(*)在DGGR试验(实施例1)中测定的相对活性值(野生型＝1) 
实施例6：生产具有多个糖基化位点和C-末端糖基化加工位点修饰的异孢镰刀菌CBS 782.83的脂肪分解酶突变形式 
按照实施例2的描述，在里氏木霉的四删除菌株中表达编码突变体MUT345、MUT3459、MUT9、MUT10、MUT11和MUT12(表1)的基因。还在里氏木霉的Endo-T删除菌株(参见实施例5)中表达编码突变体MUT 11和MUT 12的基因。按照实施例2的描述，根据脂肪分解酶产物筛选至少50个稳定的转化体。通常，各组的转化体包含对于给定突变体具有相似最高水平表达脂肪分解酶的5-6个克隆。对于各类型突变体，选择一个此类转化体。在一个试验中将所选择的最佳转化体都培养在MTP中7天，并通过SDSPAGE和活性试验分析(参见实施例1)。结果(图25和表4)显示所测试的所有突变体均以高于野生型脂肪分解酶的水平表达。与仅具有单个工程化N-连接糖基化位点的MUT 5相比，多糖基化突变体在整体上没有显示表达水平的显著提高。明显的特例为MUT 12，其产生的重组蛋白为MUT 5或该系列的其它突变体的约2倍。 
表4： 
  脂肪分解酶变体   在MTP中的表达水平，7天(*)
  野生型   1.0
  MUT5   10.52
  MUT 345   9.12
  MUT 3459   3.74
  MUT 9   2.90
  MUT 10   6.08
  MUT 11   9.80
  Endo-T变体菌株中的MUT 11   1.25
  MUT 12   17.55
  Endo-T变体菌株中的MUT 12   5.10
(*)在DGGR试验(实施例1)中测定的相对活性值(野生型＝1) 
实施例7：异孢镰刀菌CBS 782.83的脂肪分解酶的突变形式的应用 
为了评价脂肪分解酶变体的功能性，按照下述在试验性烘焙应用中对这些突变体进行评价。 
材料和方法
酶
以下酶用于烘焙试验(表5)。 
表5用于应用试验的酶样品及其活性(TIPU/ml)。KLM1等同于在里氏木霉中表达的异孢镰刀菌CBS 782.93的野生型脂肪分解酶的成熟形式，其中包含本文SEQ ID No.2的氨基酸31-305的氨基酸，Mut4、Mut5和Mut9是实施例3中描述的变体，其在里氏木霉中表达并因此经翻译后修饰成该酶的成熟形式。表达产物用在以下试验中。 
  样本ID   TIPU/ml
  KLM1   500
  Mut4   125
  Mut5   111
  Mut9   610
酶试验(TIPU)
利用以下试验进行所用酶的磷脂酶活性测定： 
1TIPU(磷脂酶滴定单位)定义为在试验条件下每分钟释放1μmol游离脂肪酸的酶量。 
磷脂酶A1和A2催化卵磷脂转至溶血卵磷脂的转化，并分别从第1和2位释放游离脂肪酸。可通过连续滴定在酶反应期间从卵磷脂释放的脂肪酸测定磷脂酶活性，因为碱的消耗量等于释放的脂肪酸量。 
底物： 
在磁性搅拌下，将4％卵磷脂、4％Triton X 100以及6mM CaCl2：12g卵磷脂粉末(Avanti极性脂质#44160)和12g Triton X 100(Merck 108643)分散到约200ml去矿物质水中。加入3.0ml 0.6M CaCl2(p.a.Merck 1.02382)。用去矿物质水调节体积至300ml，并用Ultra Thurax对乳页进行匀质化。每天制备新鲜底物。 
试验过程： 
制备酶溶液，从而在加入300μl酶时在滴定曲线上产生0.06和0.18ml/分钟之间的斜率。 
包括活性已知的对照样品。 
将样品溶于去矿物质水，并以300rpm搅拌15分钟。在用0.05M NaOH调节pH至7.0之前，将25.00ml底物在37℃温育10-15分钟。将300μL酶溶液加入至底物，并使用恒定pH滴定仪(Phm 290，Mettler Toledo)进行使用0.05M NaOH的连续滴定。在每个比例进行两个活性测定。8分钟后终止滴定，并计算5-7分钟之间滴定曲线的斜率。检测极限是3TIPU/ml的酶溶液。 
计算： 
根据下列方式计算磷脂酶活性(TIPU/g酶)： 
TIPU / g = α · N · 10 6 μmol mol · 10 - 3 l ml · V 1 m · V 2 = α · N · 10 3 · V 1 m · V 2
其中： 
α为反应时间5-7分钟之间滴定曲线的斜率(ml/分钟) 
N为所用NaOH(mol/l)的标准化 
V1溶解了酶的体积(ml) 
m为加入至V1的酶量(g) 
V2加入至底物的酶溶液的体积(ml)。 
烘焙方案：
配方： 
  组分   ％   g
  小麦面粉   100   2000
  压缩新鲜酵母   6   120
  盐   1.6   32
  糖   1.6   32
  水   400BU-2％   1090
设备： 
混合仪：Diosna 
加热箱 
模制(Moulding)：Glimek搓圆机(rounder) 
醒发箱 
烤箱：/MIWE 
方法： 
1.将所有干成分在碗中混合1分钟-加水 
2.混合程序：2分钟慢-5.5分钟快 
3.生面团温度必须为约26℃ 
4.称量1350g-模制 
5.在30℃的加热箱中静置10分钟 
6.“Glimek搓圆机”上的模制-如机器面板上的设置 
7.在34°，85％RH发面45分钟 
8.烘焙 
9.烘焙后将面包卷(roll)冷却25分钟，随后测量并测定体积 
烘焙试验：
利用野生型脂酶和变体脂酶进行两个烘焙试验。试验设置列于表6和表7。 
表6.第一烘焙试验设定，其包括给予不同剂量(TIPU/kg面粉)的不同脂肪水解酶(KLM1(wt)、Mut4、Mut5或Mut9)的12个生面团。 
  烘焙   变体ID   TIPU/kg面粉
  1   KLM1   225
  2   KLM1   450
  3   KLM1   900
  4   对照   0
  5   MUT4   225
  6   MUT4   450
  7   MUT4   900
  8   MUT5   225
  9   MUT5   450
  10   对照   0
  11   MUT5   900
  12   MUT9   225
表7.第二烘焙试验设定，其包括给予不同剂量(TIPU/kg面粉)的不同脂肪水解酶酶(KLM1(wt)、Mut4、Mut5或Mut9)的12个生面团。 
  烘焙   变体ID   TIPU/kg面粉
  1   KLM1   225
  2   KLM1   450
  3   MUT4   56
  4   MUT4   112
  5   MUT4   225
  6   MUT5   56
  7   MUT5   112
  8   MUT5   225
  9   对照   0
  10   MUT9   56
  11   MUT9   112
  12   MUT9   225
脂质修饰的分析：
发面(参见烘焙配方)后收集面团并立即冷冻。此后，冻干所冷冻的生面团样本并在磨咖啡机中碾磨。从生面团样本提取脂质并通过以下方法分析： 
脂质提取 
将6.0mL水饱和的丁醇∶乙醇(85∶15(v/v))添加至1g样本中，然后置于涡旋器上混合15秒，之后在35rpm的转子混合仪上放置5分钟。之后，将样本在97℃水浴中放置10分钟，之后在转子混合仪上以35rpm混合1小时。然后将样本以1370g离心10分钟。然后将上清(含所提取脂质的有机相)转移至新的玻璃试管中。 
对于HPTLC，在氮气覆盖下，将1.5mL所提取的脂质在70℃蒸发，然后重新分散在400μL己烷∶异丙醇(3∶2(v/v))中。将3μL重新分散的提取脂质置于TLC盘中，参见下文。 
HPTLC方法： 
通过干燥(160℃，20-30分钟)活化HPTLC板(20x 10cm，Merck no.1.05641)，并将利用自动HPTLC上样器(ATS4，CAMAG)上样标准品和样品。利用自动显色室(ADC2，CAMAG)(7cm)进行板洗脱。洗脱后，使板干燥(160℃，10分钟)，冷却，并浸渍在显色液(含6％乙酸铜的16％H3PO4)中(10秒)。干燥(160℃，6分钟)后，利用TLC扫描仪目视评价(TLC Scanner 3，CAMAG)。 
结果：
第一烘焙实验的结果示于表8和图28。 
表8：第一烘焙实验：作为脂肪分解酶(KLM1、Mut4、Mut5和Mut9)和剂量(TIPU/kg面粉)的函数的面包体积(ml/g) 
图28显示了第一烘焙实验的结果，显示作为脂肪分解酶(KLM1、Mut4、Mut5和Mut9)和剂量(TIPU/kg面粉)的函数的面包体积(ml/g)。 
从表8和图28可以看出，所有三个脂肪分解酶变体均以显著低于野生型(KLM1)的酶剂量都增加了面包体积。根据第一烘焙实验的结果，进行第二烘焙实验，其中脂肪分解酶变体的剂量低于野生型脂酶(KLM1)。该实验的结果示于表9和图29。 
表9.第二烘焙实验：作为脂肪分解酶(KLM1、Mut4、Mut5和Mut9)和剂量(TIPU/kg面粉)的函数的面包体积(ml/g) 
图29显示了第二烘焙实验的结果，作为脂肪分解酶(KLM1、Mut4、Mut5和Mut9)和剂量(TIPU/kg面粉)的函数的面包体积(ml/g)。 
从第二烘焙实验可以看出，脂肪分解酶变体有利于以更少的活性剂量实现了与野生型脂肪分解酶相同的面包体积，这表明其在面包制备中的性能优于野生型脂肪分解酶。 
通过脂质分析证明，变体脂肪分解酶和野生型(KLM1)的上述烘焙性能与 脂质修饰紧密地相互关联。所有三个变体脂肪分解酶都促进半乳糖脂部分(双半乳糖基甘油二酯(DGDG))显著高地转变生成溶血成分(双半乳糖基甘油单酯(DGMG))。 
除上述实验外，还利用同一方法和Mut 9、Mut345、Mut3459和Mut 11的物质进行了烘焙实验，并且图31显示了此实验的结果，即用不同剂量(mg/kg面粉)的不同变体烘焙的面包的相对面包体积(％)。 
从这些数据可以看出，更少的活性剂量的变体脂肪分解酶的烘焙性促成了与野生型脂肪分解酶相同或比野生型脂肪分解酶更好的面包体积，这表明其在面包制备中的性能优于野生型脂肪分解酶(KLM1)。 
实施例8：KLM1脂肪分解酶的同源模型 
为了鉴定修饰位点，制备了显示KLM1脂肪分解酶的3-D结构的3-D模型。 
将脂肪分解酶的氨基酸序列(本文示为SEQ.ID No.2(KLM1))与蛋白数据库(Protein Data Bank，www.rcsb.org)中所有已知的酶结构比较，发现具有最高序列同源性的已知结构为疏绵状嗜热丝孢菌脂酶(登陆号1DT3)。KLM1脂肪分解酶的氨基酸序列与存在于蛋白资料库结构中嗜热丝孢菌(Thermomyces)脂酶的269个残基上具有仅40％序列同一性。 
利用加拿大魁北克蒙特利尔的化学计算机化小组(Chemical Computing Group of Montreal，Quebec Canada)提供的计算机程序包MOE 的同源性模建特征和MOE程序包中的程序缺省值，产生了KLM1脂肪分解酶的残基33-296的模型。将所产生的模型与嗜热丝孢菌脂酶的基础结构进行比较(图32)。在整体上与KLM1脂肪分解酶的整体折叠和催化三联体残基具有很好的一致性，S174、D228和H287的催化三联体残基与嗜热丝孢菌脂酶的三联体重叠。 
KLM1的催化三联体为S174、D228和H287。 
图32显示了比较KLM1脂肪分解酶的残基33-296的同源模型(黑线)与嗜热丝孢菌脂酶的结构(pdb登陆号1DT3)(浅色线)的立体图。这两个结构在二级结构上与同源模型中相对于见于嗜热丝孢菌脂酶中二级结构共有特征的位置的催化三联体具有高保守性。 
三个取代的位置(即在K63、G78和A190)位于同源模型中。 
K63、G78和A190在催化三联体远侧的环内引入糖基化位点。图33中显示这些位点与催化三联体的相对位置。在第63位的取代位于由C54和C66之间二硫键形成的环内。第78位见于终止于第75位的预期螺旋和起始于残基79的中心混合β片层的β链之间的相邻环内。第190位见于从残基188和螺旋末端以及残基195(其是中心混合β片层的另一个β链的起点)延伸出来的另一个环内。 
图33显示了显示第63、78和190位的取代(在实心空间示图显示)与以棒状显示的催化三联体的相对位置的立体图。可以看出，这些位置见于催化三联体远侧的环中。 
除了在第63、78和190位具有取代的环外，在所述模型中可以鉴定出相对于酶活性位点具有类似毗邻位置的其他数个环。这些环中的三个见于环75-79和188-195之间，这些环由出现在中心片层的两个β链之间的残基99-103形成，介于形成另一个二硫键连接环的C129-C135与出现在螺旋末端和中心螺旋的另一条链的起点之间的162-167之间。在所述螺旋和中心螺旋残基213-221的链之间还有另一个这种环。这些环与催化三联体的相对位置显示于图34。 
图34为显示基于同源模型的KLM1脂肪分解酶中的远侧环的位置的立体图。这些环具有以实心空间示图显示的第63、78和190位的取代位置，并且远离以棒状显示的催化三联体。这些环包括残基54-66、75-79、99-103、127-135、162-167、188-195和213-221。 
所有在上述说明书中提到的出版物在此处引用作为参考。对本领域技术人员显而易见的是，不脱离本发明的范围和精神下，可对本发明所述的方法和系统进行各种修饰和改变。尽管通过具体优选实施方案描述了本发明，应当理解的是所要求保护的发明不应该不正当地被限制于所述的具体实施方案。事实上，用于实施本发明所述方式的各种修饰对于生物化学和生物技术领域或相关领域的技术人员是显而易见的，并落入下列权利要求的范围内。 

Claims (63)

1.制备变体脂肪分解酶的方法，其包括在宿主生物中表达核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有至少95％的同一性并编码真菌脂肪分解酶并且在所编码氨基酸序列中的位置33、63、78、190、305、306或320中的一个或多个位置引入至少一个取代或在位置311-312或307-319中的一个或多个位置引入至少一个删除，其中各氨基酸位置的编号均对应于当与SEQ ID No.2比对时所述氨基酸序列的位置。
2.产生脂肪分解酶的方法，其包括在宿主生物中表达如SEQ ID No.8、SEQ ID No.6、SEQ ID No.4、SEQ ID No.10、SEQ ID No.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.18、SEQ ID No.20或SEQ ID No.26所示的核苷酸序列；或者与其具有至少98％同一性的核苷酸序列；或者核酸，在该核酸中，在原始核苷酸序列SEQ ID No.8、SEQ ID No.6、SEQ ID No.4、SEQ ID No.10、SEQ ID No.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID No.16、SEQ IDNo.18、SEQ ID No.20或SEQ ID No.26中某些或全部氨基酸的三联体密码子使用由于遗传密码的简并性而被改变，使得核酸编码与原始核苷酸序列编码的氨基酸序列相同的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述核苷酸序列被修饰，从而在所编码的氨基酸中取代或插入一个或多个氨基酸以产生一个或多个共有序列Asn-Xxx-Ser或Asn-Xxx-Thr，其中Xxx为除Pro外的任何氨基酸。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述核苷酸序列被修饰，从而在所编码的氨基酸序列中引入一个或多个Asn、Ser或Thr。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，引入至少2个糖基化位点。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，引入至少3个糖基化位点。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述核苷酸序列被进一步修饰以与SEQ ID No.2相比增强了所述变体脂肪分解酶的C-末端加工。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述C-末端为从306位氨基酸向前，其中所述位置对应于比对时SEQ ID No.2的氨基酸序列中的位置。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其中所述C-末端加工包括以下一个或多个：在306位或320位的取代或插入或者在所述C-末端的一个或多个KEX2位的删除，其中各位置均对应于SEQ ID No.2的氨基酸序列的位置。
10.根据权利要求7或8中任一项所述的方法，其中所述C-末端加工包括以下一个或多个：在306位或320位的取代，或者在311-312或307-319位的一个或多个位置的删除，其中各位置均对应于SEQ ID No.2的氨基酸序列的位置。
11.根据权利要求1所述的方法，所述核苷酸序列被修饰，从而在33、63、78、190和305位中的一个或多个位置具有取代，其中所述氨基酸被N取代，其中所述位置对应于比对时SEQ ID No.2的氨基酸序列中的位置。
12.根据权利要求1所述的方法，所述核苷酸序列被修饰，从而在306位具有取代，其中所述氨基酸被除K或R或A以外的任意氨基酸取代，其中所述位置对应于比对时SEQ ID No.2的氨基酸序列中的位置。
13.根据权利要求12所述的方法，其中306位的取代是被氨基酸S取代。
14.根据权利要求1所述的方法，所述核苷酸序列被修饰，从而在320位具有取代，其中所述氨基酸被除T以外的任意氨基酸取代，其中所述位置对应于比对时SEQ ID No.2的氨基酸序列中的位置。
15.根据权利要求14所述的方法，其中320位的取代是被氨基酸E取代。
16.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述宿主生物为真菌。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述宿主生物为来自木霉属(Trichoderma)的真菌。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述宿主生物为来自里氏木霉(Trichoderma reesei)种的真菌。
19.通过前述任一项权利要求所述的方法获得的多肽。
20.包含核苷酸序列的核酸，其中，所述核苷酸序列与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有至少95％的同一性并编码脂肪分解酶并且在所编码的氨基酸序列的位置33、63、78、190、305、306或320中的一个或多个位置具有至少一个取代或在位置311-312或307-319中的一个或多个位置具有至少一个删除，其中各氨基酸位置的编号均对应于SEQ ID No.2的氨基酸序列的位置。
21.根据权利要求20所述的核酸，其中，所述脂肪分解酶在修饰前不包含任何糖基化位点。
22.根据权利要求20所述的核酸，其中，所述核苷酸序列包含至少一个修饰，所述修饰对应于一个或多个氨基酸的取代或插入以提供一个或多个共有序列Asn-Xxx-Ser或Asn-Xxx-Thr，其中Xxx是所编码的蛋白中除Pro外的任何氨基酸。
23.根据权利要求20所述的核酸，其中，所述核苷酸序列包含修饰，所述修饰对应于在所编码的蛋白中引入一个或多个Asn、Ser或Thr。
24.根据权利要求20所述的核酸，其包含编码至少两个糖基化位点的密码子。
25.根据权利要求20所述的核酸，其包含编码至少三个糖基化位点的密码子。
26.根据权利要求20所述的核酸，其中，所述核苷酸序列在所述序列的C-末端区包含修饰以与SEQ ID No.2相比增强了所述脂肪分解酶的C-末端加工。
27.根据权利要求26所述的核酸，其中，所述C-末端包含编码第306位氨基酸向前的核苷酸序列，其中所述位置对应于比对时SEQ ID No.2的氨基酸序列中的位置。
28.根据权利要求26-27中任一项所述的核酸，其中，所述C-末端区的修饰包含一个或多个修饰，所述修饰导致在第306位或320位的取代或插入，或者在所编码蛋白的C-末端中的一个或多个KEX2位置的删除，其中各位置均对应于SEQ ID No.2的氨基酸序列的位置。
29.根据权利要求26-27中任一项所述的核酸，其中，所述修饰包含导致以下一个或多个的修饰：在第306位或320位的取代，或在311-312或307-319位的一个或多个位置的删除，其中各个位置均对应于SEQ ID No.2的氨基酸序列的位置。
30.根据权利要求20所述的核酸，其中，所述核苷酸序列包含修饰，所述修饰导致在第63、78、190和305位中的一个或多个位置的取代，其中在所编码的蛋白中所述氨基酸被N取代，其中所述位置对应于比对时SEQ IDNo.2的氨基酸序列中的位置。
31.根据权利要求20所述的核酸，其中，所述核苷酸序列包含修饰，所述修饰导致在所编码蛋白的第306位发生取代，其中所述取代是被除K或R或A的任何氨基酸取代，其中所述位置对应于比对时SEQ ID No.2的氨基酸序列中的位置。
32.根据权利要求31所述的核酸，其中，第306位的取代是被氨基酸S取代。
33.根据权利要求20所述的核酸，其中，所述核苷酸序列包含修饰，所述修饰导致在第320位发生取代，其中所述氨基酸被除T外的任何氨基酸取代，其中所述位置对应于比对时SEQ ID No.2的氨基酸序列中的位置。
34.根据权利要求33所述的核酸，其中，第320位被氨基酸E取代。
35.编码对极性脂质中的酯键具有水解活性的多肽的核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列为SEQ ID No.8、SEQ ID No.6、SEQ ID No.4、SEQ ID No.10、SEQ ID No.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.18、SEQID No.20或SEQ ID No.26；或者与SEQ ID No.8、SEQ ID No.6、SEQ IDNo.4、SEQ ID No.10、SEQ ID No.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.18、SEQ ID No.20或SEQ ID No.26具有至少98％同一性的核苷酸序列；或者核酸，在该核酸中，在原始核苷酸序列SEQ ID No.8、SEQ IDNo.6、SEQ ID No.4、SEQ ID No.10、SEQ ID No.12、SEQ ID NO.14、SEQID No.16、SEQ ID No.18、SEQ ID No.20或SEQ ID No.26中某些或全部氨基酸的三联体密码子使用由于遗传密码的简并性而被改变，使得核酸编码与原始核苷酸序列编码的氨基酸序列相同的氨基酸序列。
36.编码对极性脂质中的酯键具有水解活性的多肽的核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列为SEQ ID No.8、SEQ ID No.6、SEQ ID No.4、SEQ ID No.10、SEQ ID No.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.18、SEQID No.20或SEQ ID No.26；或者与SEQ ID No.8、SEQ ID No.6、SEQ IDNo.4、SEQ ID No.10、SEQ ID No.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.18、SEQ ID No.20或SEQ ID No.26具有至少99％同一性的核苷酸序列；或者核酸，在该核酸中，在原始核苷酸序列SEQ ID No.8、SEQ IDNo.6、SEQ ID No.4、SEQ ID No.10、SEQ ID No.12、SEQ ID NO.14、SEQID No.16、SEQ ID No.18、SEQ ID No.20或SEQ ID No.26中某些或全部氨基酸的三联体密码子使用由于遗传密码的简并性而被改变，使得核酸编码与原始核苷酸序列编码的氨基酸序列相同的氨基酸序列。
37.编码对极性脂质中的酯键具有水解活性的多肽的核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列为SEQ ID No.8、SEQ ID No.6、SEQ ID No.4、SEQ ID No.10、SEQ ID No.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.18、SEQID No.20或SEQ ID No.26；或者与SEQ ID No.8、SEQ ID No.6、SEQ IDNo.4、SEQ ID No.10、SEQ ID No.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.18、SEQ ID No.20或SEQ ID No.26具有至少99.5％同一性的核苷酸序列；或者核酸，在该核酸中，在原始核苷酸序列SEQ ID No.8、SEQ IDNo.6、SEQ ID No.4、SEQ ID No.10、SEQ ID No.12、SEQ ID NO.14、SEQID No.16、SEQ ID No.18、SEQ ID No.20或SEQ ID No.26中某些或全部氨基酸的三联体密码子使用由于遗传密码的简并性而被改变，使得核酸编码与原始核苷酸序列编码的氨基酸序列相同的氨基酸序列。
38.编码对极性脂质中的酯键具有水解活性的多肽的核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列为SEQ ID No.8、SEQ ID No.6、SEQ ID No.4、SEQ ID No.10、SEQ ID No.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.18、SEQID No.20或SEQ ID No.26；或者与SEQ ID No.8、SEQ ID No.6、SEQ IDNo.4、SEQ ID No.10、SEQ ID No.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.18、SEQ ID No.20或SEQ ID No.26具有至少99.8％同一性的核苷酸序列；或者核酸，在该核酸中，在原始核苷酸序列SEQ ID No.8、SEQ IDNo.6、SEQ ID No.4、SEQ ID No.10、SEQ ID No.12、SEQ ID NO.14、SEQID No.16、SEQ ID No.18、SEQ ID No.20或SEQ ID No.26中某些或全部氨基酸的三联体密码子使用由于遗传密码的简并性而被改变，使得核酸编码与原始核苷酸序列编码的氨基酸序列相同的氨基酸序列。
39.变体多肽，其由权利要求20-38中任一项所述的核酸或核苷酸序列编码。
40.变体多肽，其对极性脂质中的酯键具有水解活性且其氨基酸序列与SEQ ID No.2的氨基酸33-296具有至少95％同一性，并且所述氨基酸序列与SEQ ID No.2所示的序列相比已经被修饰以在位置33、63、78、190、305、306或320中的一个或多个位置引入一个取代或在位置311-312或307-319中的一个或多个位置引入一个删除，其中各氨基酸位置的编号均对应于SEQID No.2的氨基酸序列的位置。
41.根据权利要求40所述的多肽，其中，取代或插入了一个或多个氨基酸，从而产生一个或多个共有序列Asn-Xxx-Ser或Asn-Xxx-Thr，其中Xxx为除Pro外的任何氨基酸。
42.根据权利要求40中任一项所述的多肽，其中，引入一个或多个Asn、Ser或Thr。
43.根据权利要求40中任一项所述的多肽，其中，在第33、63、78、190位中的一个或多个位置的修饰是用氨基酸N取代所述位置的氨基酸，其中所述位置对应于比对时SEQ ID No.2的氨基酸序列中的位置。
44.根据权利要求40中任一项所述的多肽，其中，引入了至少两个糖基化位点。
45.根据权利要求40中任一项所述的多肽，其中，引入了至少三个糖基化位点。
46.根据权利要求19、39-45中任一项所述的多肽，其中，所述变体多肽具有磷脂酶活性或者半乳糖脂酶活性。
47.根据权利要求19、39-45中任一项所述的多肽，其中，除了以下修饰外：
G33N
K63N；
G78N；
A190N；
K63N+G78N+A190N；
所述多肽包含SEQ ID No.2所示氨基酸序列的氨基酸33-296。
48.前原多肽，其在宿主生物体内进行翻译后加工时产生对极性脂质中的酯键具有水解活性的多肽，其中所述前原多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.9、SEQ ID No.7、SEQ ID No.5、SEQ ID No.11、SEQ ID No.13、SEQ IDNO.15、SEQ ID No.17、SEQ ID No.19、SEQ ID No.21或SEQ ID No.25所示。
49.对极性脂质中的酯键具有水解活性的多肽，其中，所述多肽得自于其氨基酸序列如SEQ ID No.9、SEQ ID No.7、SEQ ID No.5、SEQ ID No.11、SEQ ID No.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID No.17、SEQ ID No.19、SEQID No.21或SEQ ID No.25所示的前原多肽。
50.权利要求20-38任一项所述核酸的用途，用以增强脂肪分解酶在宿主生物的表达。
51.根据权利要求50的用途，其中，所述宿主生物是真菌。
52.根据权利要求51的用途，其中，所述宿主生物是木霉(Trichodermaspp.)。
53.根据权利要求52的用途，其中，所述宿主生物是里氏木霉(Trichoderma reesei)。
54.制备食品的方法，所述方法包括添加权利要求19或39-47或49中任一项所述的多肽至所述食品的一种或多种成分中。
55.制备烘焙产品的方法，所述方法包括添加权利要求19或39-47或49中任一项所述的多肽至生面团中和烘焙所述生面团以制备所述烘焙产品。
56.根据权利要求54所述的方法，其中，所述食品是以下一种或多种：蛋或基于蛋的产品；烘焙产品；面条；玉米饼；生面团；糖食；冷冻产品；乳制品，包括奶酪；慕思；生植物奶油；食用油和脂肪；充气和无气搅打的产品，水包油乳液和油包水乳液；人造黄油；起酥油；涂抹物，包括低脂和极低脂肪涂抹物；调味品；蛋黄酱；蘸料，基于奶油的沙司；基于奶油的汤；饮料；调味乳和沙司。
57.制备溶血磷脂的方法，其包括用权利要求19或39-47或49中任一项所述的多肽处理磷脂以产生溶血磷脂。
58.制备溶血糖脂的方法，其包括用权利要求19或39-47或49中任一项所述的多肽处理糖脂以产生溶血糖脂。
59.植物油或食用油的酶促脱胶方法，其包括用权利要求19或39-47或49中任一项所述的多肽处理食用油或植物油以水解其中存在的大部分极性脂质。
60.通过权利要求54或56所述的方法获得的食品。
61.通过权利要求55所述的方法获得的烘焙产品。
62.面包改良组合物或生面团改良组合物，其包含权利要求19、39-47或49中任一项所述的多肽。
63.生面团或烘焙产品，其包含权利要求62所述的面包改良组合物或生面团改良组合物。
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