CN1973034A - 真菌脂肪分解酶 - Google Patents

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Abstract

与对甘油三酯的活性相比，具有对极性脂质更高活性比的真菌野生型脂肪分解酶，其中酶优选具有至少为4的磷脂∶甘油三酯的水解活性比。优选地，根据本发明的脂肪分解酶具有至少为1.5的糖脂∶甘油三酯的水解活性比。在一个实施方案中，根据本发明的真菌脂肪分解酶包含如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2或SEQ ID No.4或SEQ ID No.6所示的氨基酸序列、或与其具有至少90％同一性的氨基酸序列。本发明还包括编码真菌脂肪分解酶的核酸，其中核酸选自下列中的一种或多种：a)包含如SEQ ID No.3、SEQID No.5或SEQ ID No.7中所示的核苷酸序列的核酸；b)通过遗传密码子的简并性，与SEQ ID No.3、SEQ ID No.5或SEQ ID No.7的核苷酸序列相关的核酸；和c)包含与SEQ ID No.3、SEQ ID No.5或SEQ ID No.7中所示的核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列的核酸。

Description

真菌脂肪分解酶
发明领域
本发明涉及新的真菌脂肪分解酶，并涉及编码一种或多种新的真菌脂肪分解酶的一种或多种多核苷酸。本发明也涉及制备真菌脂肪分解酶的方法，及其用途。本发明还涉及经改善的食品的制备，特别是经改善的烘烤产品的制备。具体地说，本发明提供新的真菌脂肪分解酶，该酶能使食物产品(包括烘烤产品)具有更好的特性。
技术背景
多年来已经知道脂肪分解酶(E.C.3.1.1.x)在食品和/或饲料工业应用中的有益用途。
例如，在EP 0585988中声称脂肪酶加入生面团可引起保鲜效果的加强。有人提出从Rhizopus arrhizus获得的脂肪酶，在联合起酥油/脂肪进行使用时，加入生面团后可提高所得面包的品质。WO9404035教导了通过将脂肪酶加到生面团而不将任何额外的脂肪/油加到生面团，可改善面包松软性。Castello(P.ESEGP，1999年12月10日，赫尔辛基)报道了外源脂肪酶可调节面包体积。
在小麦粉中脂肪酶的底物是1.5-3％内源性小麦脂质，这是极性和非极性的脂质的复杂混合物。极性脂质可分为糖脂和磷脂。这些脂质由用两个脂肪酸和一个极性基团酯化的甘油组成。极性基团导致了这些脂质的表面活性。酶催化裂解这些脂质中的一个脂肪酸，可产生具有显著更高表面活性的脂质。众所周知具有高表面活性的乳化剂例如DATEM，被加入生面团时，是非常具功能性的。
脂肪分解酶水解来自食物中存在的脂质的一种或多种的脂肪酸，这引起在食品中形成强有力的乳化剂分子，这可提供商业上有价值的功能性。带来最重要的乳化剂特征的分子是部分水解的产物，例如溶血磷脂、溶血糖脂和单甘油酯分子。极性脂质水解产物，即溶血磷脂和溶血糖脂，是特别有益的。在面包制作中，这种原位衍生的乳化剂可与添加的乳化剂，例如DATEM，产生相等的功能性。
然而，也已经发现脂肪分解酶的活性引起游离脂肪酸的累积，这可在食品中产生有害的作用。脂肪分解酶的这种内在活性限制了它们的功能。
对面包体积的副作用经常解释为用量过大。用量过大可引起面筋弹性的下降，这可产生太坚硬的生面团，并因而引起体积缩小。另外，或者，所述的脂肪酶可降解被加到生面团的起酥油、油或乳脂，引起生面团和烘烤食品的变味。用量过大和变味已经被认为是游离脂肪酸、特别是短链脂肪酸在生面团中累积的结果。
高水平的游离脂肪酸(FFA)在原料或食物产品中的存在通常被认为是质量缺陷，并且在食品规范中食品加工者以及消费者通常包含最大量的FFA水平。过量FFA水平带来的影响可以为感官性缺陷和/或功能性缺陷。
在EP1193314中，发明人发现对糖脂具有活性的脂肪分解酶的用途特别有利于应用于面包制作中，因为作为部分水解产物的溶血糖脂具有很高的乳化剂作用，这与游离脂肪酸的有害累积相比，可明显引起较高比例的积极乳化剂作用。然而，也发现该酶对甘油三酯具有明显的非选择性活性，这产生不必要的高游离脂肪酸。
在WO02/094123中提出了这种高甘油三酯活性的问题，其中发明人发现通过选择对生面团中极性脂质(糖脂和磷脂)有活性的、但对甘油三酯或1-单-甘油酯基本上是无活性的脂肪分解酶，可实现改良的功能性。
商业上优选的脂肪酶来源是丝状真菌，例如曲霉属(Aspergillus spp.)和镰孢属(Fusarium spp.)。已经发现从丝状真菌分离的脂肪酶具有工业上的应用特征，并已经发现其通常在异源性生产系统例如在米曲霉(Aspergillusoryzae)、镰孢属(镰孢菌属)和酵母中表达。
在EP0130064中鉴定了来自尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)的脂肪酶，并且Hoshino等人((1992)Biosci.Biotech.Biochem 56：660-664)已经提出尖孢镰孢脂肪酶在食品应用中的应用。
EP0869167描述了尖孢镰孢脂肪酶的克隆和表达及其在烘烤中的用途。该酶被描述为具有磷脂酶活性。现在Novozymes A/S(丹麦)出售该酶，商品名为LipopanFTM。
WO02/00852公开了从F.venenatum、F.sulphureum、A.berkeleyanum、F.culmorum和F.solafni分离的五种脂肪酶以及它们的编码多核苷酸。所有的五种酶被描述为具有三酰甘油水解活性、磷脂酶活性和半乳糖脂酶活性。这些酶中的三种具有与EP0869167中描述的尖孢镰孢酶相等的活性：F.venenatum、F.sulphureum、F.culmorum。
因此，明显的是已经发现一些镰孢属脂肪酶(包括LipopanFTM)具有对极性脂质(包括磷脂和糖脂)的附带的活性(side activity)。尽管在EP0869167中被描述为磷脂酶(phospholipase)，来自尖孢镰孢的脂肪酶(lipase)具有高脂肪酶活性。该酶也具有糖脂酶(glycolipase)活性。然而，尽管对极性脂质具有显著的活性，但由于高脂肪酶(即甘油三酯)活性，通过利用该酶所获得的功能性是有限的。
Nagao等人(J.Biochem 116(1994)536-540)描述了来自异孢镰孢的脂肪酶；其中该酶的主要起水解甘油三酯的脂肪酶(E.C.3.1.1.3)的作用。这与根据本发明的酶很不相同。
已经生产具有特异氨基酸取代和融合的脂肪分解酶变体，其中一些与野生型亲本酶相比，对极性脂质具有增强活性。WO01/39602描述了所述的变体(称为SP979)，它是Thermomyces lanuginosus脂肪酶和EP0869167中描述的尖孢镰孢脂肪酶的融合体。已经发现与对甘油三酯的活性相比，该变体对磷脂和糖脂具有显著高的活性比。
然而，在本发明之前，还未教导天然的真菌脂肪分解酶特别是来自镰孢属(Fusarium spp.)的脂肪分解酶，其与对甘油三酯的活性相比，对极性脂质具有高活性比。
发明概述
在主要方面中，本发明涉及与对甘油三酯的活性相比，对极性脂质(磷脂和/或糖脂)具有更高活性比的真菌脂肪分解酶，特别是与对甘油三酯的活性相比，涉及对糖脂具有更高活性比的真菌脂肪分解酶。
在另外的主要方面中，本发明涉及与对甘油三酯的活性相比，对极性脂质(磷脂和/或糖脂)具有更高活性比的野生型真菌脂肪分解酶，特别是与对甘油三酯的活性相比，对糖脂具有更高活性比的野生型真菌脂肪分解酶。
在另外的主要方面中，本发明还涉及编码本文所述的新的真菌脂肪分解酶的核酸。
在一个主要方面中，本发明涉及制备食品(优选蛋制食品)的方法，方法包括将本发明的真菌脂肪分解酶加入一种或多种食品成分中。
本发明涉及制备生面团的方法，方法包括将根据本发明的真菌脂肪分解酶加入生面团的一种或多种组分中，并进行混和以形成生面团。
本发明另一个主要方面涉及从生面团制备烘烤食品的方法，方法包括将根据本发明的真菌脂肪分解酶加入生面团。
还提供制备根据本发明的真菌脂肪分解酶的方法，方法包括用包含编码真菌脂肪分解酶的核苷酸序列的重组核酸来转化宿主细胞，其中所述宿主细胞能表达编码真菌脂肪分解酶的多肽的核苷酸序列，在表达核酸的情况下培养转化的宿主细胞以及收获真菌脂肪分解酶。
在另外的主要的方面中，本发明提供在低温下可保持活性的脂肪分解酶，即低温型脂肪分解酶。
本发明的上述方面存在于权利要求书和下列注释中。
涉及可用于本发明的核苷酸序列的其它方面包括：包含本发明的序列的构建体；包含用于本发明的序列的载体；包含用于本发明的序列的质粒；包含用于本发明的序列的转化细胞；包含用于本发明的序列的转化组织；包含用于本发明的序列的转化器官；包含用于本发明的序列的转化宿主；包含用于本发明的序列的转化有机体。本发明也包括使用相同的方法表达用于本发明的核苷酸序列的方法，例如在宿主细胞中表达；包括转移宿主细胞的方法。本发明还包括分离核苷酸序列的方法，例如从宿主细胞中分离。
涉及本发明中用到的氨基酸序列的其它方面包括：编码用于本发明的氨基酸序列的构建体；编码用于本发明中的氨基酸序列的载体；编码用于本发明的氨基酸序列的质粒；表达用于本发明的氨基酸序列的转化细胞；表达用于本发明的氨基酸序列的转化组织；表达用于本发明的氨基酸序列的转化器官；表达用于本发明的氨基酸序列的转化宿主；表达用于本发明的氨基酸序列的转化有机体。本发明也包括使用本发明的方法纯化用于本发明的氨基酸序列的方法，例如在宿主细胞中表达；包括转移宿主细胞并然后纯化所述序列的方法。
为了便于参考，在以下合适的章节标题中现在讨论本发明的这些和另外方面。然而，每个章节中所提供的教导不必然被局限于每个特定的章节。
发明详述
在一个方面中，与对甘油三酯的活性相比，本发明提供对极性脂质具有更高活性比(ratio of activity)的野生型真菌脂肪分解酶(lipolytic enzyme)。
在一个方面中，本发明提供包含如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ IDNo.4、SEQ ID No.6中所示的氨基酸序列或与其具有至少90％同一性的氨基酸序列的真菌脂肪分解酶。
在另外的方面中，本发明提供编码包含如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ ID No.6中所示的氨基酸序列或与其具有至少90％同一性的氨基酸序列的真菌脂肪分解酶的核酸。
图37中显示了SEQ ID No.1，图38中显示了SEQ ID No.2，图40中显示了SEQ ID No.4以及图42中显示了SEQ ID No.6。
在另外的方面本发明提供编码真菌脂肪分解酶的核酸，其中核酸选自下列中的一种或多种：
a)包含如SEQ ID No.3、SEQ ID No.5或SEQ ID No.7中所示的核苷酸序列的核酸；
b)通过遗传密码子的简并性，与SEQ ID No.3、SEQ ID No.5或SEQ IDNo.7的核苷酸序列相关的核酸；和
c)包含与SEQ ID No.3、SEQ ID No.5或SEQ ID No.7中所示的核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列的核酸。
图39中显示了SEQ ID No.3，图41中显示了SEQ ID No.5以及图43中显示了SEQ ID No.7。
在本发明另一个方面提供了根据本发明的真菌脂肪分解酶在制作食品中的用途，例如用于生面团、烘烤食品、蛋、蛋制品、面条产品、乳酪产品、玉米粉圆饼(torfilla)产品、动物饲料产品、植物油或食用油。有利地的是，将本发明的酶加入食品中可随着游离脂肪酸的较低累积带来改进的乳化作用。
在另外的方面中，本发明提供根据本发明的真菌脂肪分解酶在制作生面团和/或烘烤食品中的用途，包括将所述的脂肪分解酶加入生面团中，并(任选地)烘烤生面团直到制成适于下列一种或多种的烘烤食品：减少生面团的粘性；提高生面团的可机械加工性；在烘烤食品的烘烤过程中减少起泡；改善面包体积和/或松软度；延长烘烤食品和/或生面团的保存期；提高烘烤食品和/或生面团的保鲜效果；改善烘烤食品的团粒结构(crumb structure)；减少烘烤食品的气孔不均一性；提高烘烤食品的气孔均一性；减少烘烤食品的平均孔径；提高生面团的面筋指数；改善烘烤产品的香味和/或气味，改善烘烤产品外壳的色泽。
有利地是，根据本发明的酶在低pH时比常规的脂肪分解酶具有更高活性，因此比常规的脂肪分解酶更有利地适于用于低pH的酸生面团环境中。
在本发明的另一个方面中，提供制作生面团和/或制作烘烤食品的方法，包括将根据本发明的真菌脂肪分解酶加入生面团并(任选地)烘烤生面团以制备烘烤产品。
在另外的方面中，本发明提供根据本发明的真菌脂肪分解酶在制作蛋制品中的用途，来用于改善质地、减少平均粒径、减少平均颗粒分布、改善热稳定性、改善微波性能和/或稳定性。
在本发明的另一个方面中，提供处理蛋或蛋制品的方法，该方法包括将根据本发明的真菌脂肪分解酶加入蛋或蛋制品中。
在本发明的另一个方面中，提供制作面条，或面条生面团或面条制品的方法，该方法包括将根据本发明的真菌脂肪分解酶加入面条、面条生面团或面条制品中。
在本发明一个方面中，提供根据本发明的真菌脂肪分解酶在制作面条或面条制品中的用途，来用于改善色泽/黄色、稳定色泽特征、降低亮度、减少脂肪含量、改善质地和口感(咀嚼性)、降低水活动性、降低断裂、提高核坚实性以及在加工中提高形状保持性中的一种或多种用途。
在本发明的另一个方面，提供制作玉米粉圆饼或玉米粉圆饼生面团的方法，该方法包括将根据本发明真菌脂肪分解酶加入玉米粉圆饼或玉米粉圆饼生面团中。
本发明的另外方面提供根据本发明的真菌脂肪分解酶在制作玉米粉圆饼或玉米粉圆饼生面团中的用途，来用于提高玉米粉圆饼的可滚动性(rollability)、提高玉米粉圆饼的可挠性、提高玉米粉圆饼和/或玉米粉圆饼生面团的保鲜特性、提高松软性和/或降低玉米粉圆饼和/或玉米粉圆饼生面团中的变味。
通过联合使用乳化剂例如DATEM，可提高脂肪分解酶在玉米粉圆饼和/或面条中的功能性。
在本发明的另一个方面中，提供处理奶、乳酪用乳、乳酪或乳酪制品的方法，该方法包括将根据本发明的真菌脂肪分解酶加入乳酪或乳酪制品中。
本发明还提供根据本发明的真菌脂肪分解酶在制作乳酪或乳酪制品中的用途，用于改善香味、质地和/或稳定性、减少乳酪中的脱油效应和/或提高乳酪生产中的乳酪产量中的一种或多种用途。
在本发明的另一个方面中，提供处理动物饲料的方法，该方法包括将根据本发明的真菌脂肪分解酶加入动物饲料中。
本发明还提供根据本发明的真菌脂肪分解酶在制作动物饲料中的用途，来用于改善下列中的一种或多种：饲料利用和/或饲料转化率、体重增加、可消化性、氮的摄取、干物质的代谢能力以及可口性。
在另外的方面中，本发明提供根据本发明的真菌脂肪分解酶在制备溶血磷脂(如溶血卵磷脂)过程中的用途，所述过程通过酶处理磷脂(如卵磷脂)来生产部分水解产物，即溶血磷脂。
在本发明的另一个方面中，提供制备溶血磷脂例如溶血卵磷脂的方法，该方法包括用根据本发明的真菌脂肪分解酶来处理磷脂(如卵磷脂)。
在另外的方面中，本发明提供根据本发明的真菌脂肪分解酶在制备溶血糖脂(例如双半乳糖甘油一酯(DGMG)或单半乳糖甘油一酯(MGMG))方法中的用途，其中用根据本发明的脂肪分解酶处理糖脂(如双半乳糖甘油二酯(DGDG)或单半乳糖甘油二酯(MGDG))，来生产部分水解产物，即溶血糖脂。
在另外的方面中，本发明提供根据本发明的真菌脂肪分解酶在制备溶血糖脂(例如双半乳糖甘油一酯(DGMG)或单半乳糖甘油一酯(MGMG))方法中的用途，其中用根据本发明的脂肪分解酶处理糖脂(如双半乳糖甘油二酯(DGDG)或单半乳糖甘油二酯(MGDG))，来生产部分水解产物，即溶血糖脂。
在另外的方面中，提供制备溶血糖脂(例如双半乳糖甘油一酯(DGMG)或单半乳糖甘油一酯(MGMG))的方法，该方法包括用根据本发明的真菌脂肪分解酶处理糖脂(如双半乳糖甘油二酯(DGDG)或单半乳糖甘油二酯(MGDG))。
本发明还提供植物油或食用油的酶促脱胶方法，包括用根据本发明的真菌脂肪分解酶处理食用油或植物油，来水解大部分的极性脂质(如磷脂和/或糖脂)。
为了避免疑惑，本领域普通技术人员应知道适于实施酶催化处理食用油的方法(例如参见EP0869167)。当实施本发明时可以适当地使用已知的方法，只要用根据本发明的酶替换已知酶。
在另外的方面中，本发明提供根据本发明的真菌脂肪分解酶在制作植物油或食用油中的用途，来用于降低植物油或食用油中的磷脂量、同时维持所述油的甘油三酯含量和/或防止或降低游离脂肪酸的累积。
在另外的方面中，本发明还提供根据本发明的真菌脂肪分解酶在包括处理磷脂来水解脂酰基的方法中的用途。
在另一个方面中，本发明提供根据本发明的真菌脂肪分解酶在用于降低食用油中磷脂含量的方法中的用途，包括用根据本发明的真菌脂肪分解酶处理食用油以便水解大部分磷脂、并从油中分离含有水解的磷脂的水相。
在另外的方面中，本发明提供在低温下保持活性的脂肪分解酶，即低温型脂肪分解酶。本发明另外的方面包括低温型脂肪分解酶在本发明的真菌脂肪分解酶的方法中以及本文中所述的用途。
优选地，与对甘油三酯的活性相比，根据本发明的真菌脂肪分解酶对极性脂质(如糖脂和/或磷脂)具有更高的活性比。
优选地，与对甘油三酯的活性相比，根据本发明的真菌脂肪分解酶对磷脂具有更高的活性比。
优选地，与对甘油三酯的活性相比，根据本发明的真菌脂肪分解酶对糖脂具有更高的活性比。
适当地，与对甘油三酯的活性相比，根据本发明的真菌脂肪分解酶对磷脂和磷脂都具有更高的活性比。
更优选地，与对甘油三酯的活性相比，根据本发明的真菌脂肪分解酶对双半乳糖甘油二酯(DGDG)具有更高的活性比。
优选地，根据本发明的真菌脂肪分解酶分别将DGDG或MGDG水解成DGMG或MGMG。
本文中提到的术语“对极性脂质更高的活性比”指与商业性酶LipopanFTM(Novozymes A/S，丹麦)相比，根据本发明的脂肪分解酶具有更高的极性脂质∶甘油三酯的水解活性比。
本文所用的术语“极性脂质”指磷脂和/或糖脂。优选地，本文中提到的术语“极性脂质”指磷脂和糖脂。
本文中提到的术语“对糖脂更高的活性比”和“对磷脂更高的活性比”指分别与用商业性酶Lipopan FTM(Novozymes A/S，丹麦)所得到的相应活性比相比，根据本发明的真菌脂肪分解酶具有更高的糖脂∶甘油三酯的水解活性比或磷脂∶甘油三酯的水解活性比。
优选地，根据本发明的脂肪分解酶可具有至少为4的极性脂质∶甘油三酯的水解活性比。合适的是，极性脂质∶甘油三酯的水解活性比可大于5。合适的是，极性脂质∶甘油三酯的水解活性比可大于8，优选大于9、更优选大于10、甚至更优选大于15。
优选地，根据本发明的真菌脂肪分解酶可具有至少为4的磷脂∶甘油三酯的水解活性比。合适的是，极性脂质∶甘油三酯的水解活性比可大于5。合适的是，极性脂质∶甘油三酯的水解活性比可大于8，优选大于9、更优选大于10、甚至更优选大于15。
优选地，根据本发明的真菌脂肪分解酶可具有至少为1.5、优选至少为1.8、优选至少为2、优选至少为3、优选至少为4的糖脂∶甘油三酯的水解活性比。适当地，糖脂∶甘油三酯的水解活性比可大于4。合适的是，糖脂∶甘油三酯的水解活性比可大于5。
在另外的方面中，本发明提供具有至少为4的极性脂质∶甘油三酯的水解活性比的真菌脂肪分解酶。合适的是，极性脂质∶甘油三酯的水解活性比可大于5。合适的是，极性脂质∶甘油三酯水解活性比可大于8，优选大于9、更优选大于10、甚至更优选大于15。
在另一个方面本发明提供具有至少为4的磷脂∶甘油三酯的水解活性比的真菌脂肪分解酶。合适的是，极性脂质∶甘油三酯的水解活性比可大于5。合适的是，极性脂质∶甘油三酯水解活性比可大于8，优选大于9、更优选大于10、更优选大于15。
在另外的方面中，本发明还提供具有至少为1.5、优选至少为1.8、优选至少为2、优选至少为3、优选至少为4、优选至少为5、优选至少为10、优选至少为15的糖脂∶甘油三酯的水解活性比的真菌脂肪分解酶。
与甘油三酯脂酶(E.C.3.1.1.3)的活性相比，根据本发明的真菌脂肪分解酶具有对极性脂质优选至少1.5倍的活性(如磷脂酶A2(E.C.3.1.1.4)的活性和/或磷脂酶A1(E.C.3.1.1.32)的活性和/或糖脂酶(E.C.3.1.1.26)的活性)、更优选至少2倍、更优选至少3倍、更优选至少4倍。
与甘油三酯脂酶(E.C.3.1.1.3)的活性相比，根据本发明的真菌脂肪分解酶优选具有至少1.5倍、更优选至少2倍、更优选至少3倍、更优选至少4倍的糖脂酶(E.C.3.1.1.26)的活性。
对于通过利用实施例3中详述的微烘烤分析而提供最适面包体积的剂量而言，将DGDG水解成甘油三酯(TG)的比例优选是至少1.7％、优选是至少1.8％、优选是至少2％、优选是至少3％、优选是至少4％、优选是至少5％、优选是至少10％、优选是至少20％、优选是至少40％、优选是至少50％。
本文中提到的术语“糖脂酶活性”包括“半乳糖脂酶活性”。
使用本文下列的分析法，可确定糖脂酶活性、磷脂酶活性和甘油三酯脂酶的活性。
半乳糖脂酶活性的测定(糖脂酶活性分析)：
底物：
将0.6％双半乳糖甘油二酯(Sigma D 4651)、0.4％Triton-X 100(SigmaX-100)以及5mM CaCl2溶于0.05M、pH7的HEPES缓冲液中。
分析过程：
将400μl底物加入1.5mL Eppendorf管并放入Eppendorf热混合器(Thermomixer)，37℃5分钟。当时间t＝0分钟时，加入50μl酶液。也可分析用水代替酶的空白。将样品在Eppendorf热混合器中以10*100rpm在37℃下混匀10分钟。当时间t＝10分钟时，将Eppendorf管放入另一个热混合器中并在99℃放置10分钟，来终止反应。
通过使用购自WAKO GmbH的NEFA C试剂盒分析样品中的游离脂肪酸。
通过分析条件下每分钟产生的微摩尔脂肪酸，来计算在pH 7时的酶活GLU。
磷脂酶活性的测定(磷脂酶活性分析)：
使用能产生可比较的结果的两种不同方法测量磷脂酶活性。根据本发明，这些方法中任何一种可用于测定磷脂酶活性。优选地，将PLU分析法用于测定任何酶的磷脂酶活性。
用于测定磷脂酶活性的“PLU分析法”：
底物：将0.6％的L-α卵磷脂、95％Plant(Avanti #441601)、0.4％Triton-X100(Sigma X-100)以及5mM CaCl2溶于0.05M、pH7的HEPES缓冲液中。
分析过程：
将400μl底物加入1.5mL Eppendorf管并放入Eppendorf热混合器，37℃5分钟。当时间t＝0分钟时，加入50μl酶液。也可分析用水代替酶的空白。将样品在Eppendorf热混合器中以10*100rpm在37℃下混匀10分钟。当时间t＝10分钟时，将热混合器管放入另一个热混合器中并在99℃放置10分钟，来终止反应。
通过使用购自WAKO GmbH的NEFA C试剂盒分析样品中的游离脂肪酸。
通过分析条件下每分钟产生的微摩尔脂肪酸，来计算在pH7时的酶活PLU-7。
用于测定磷脂酶活性的“TIPU分析法”
1TIPU(磷脂酶滴定单位)定义为在分析条件下每分钟释放1μmol游离脂肪酸的酶量。
通过分别从位点和2释放游离脂肪酸，磷脂酶A1和A2将卵磷脂转换成溶血卵磷脂。通过连续滴定在酶反应期间从卵磷脂释放的脂肪酸可测定磷脂酶活性，因为碱的消耗量等于释放的脂肪酸量。
底物：
4％卵磷脂、4％Triton X 100以及6mM CaCl2：通过磁力搅拌，将12g卵磷脂粉末(Avanti极性脂质#44160)和12g Triton X 100(Merck 108643)分散到约200ml脱矿物质水中。加入3.0ml 0.6M CaCl2(p.a.Merck 1.02382)。用脱矿质水调节体积至300ml，并用Ultra Thurax均质化乳状液。每天制备新鲜底物。
分析过程：
通过加入300μl酶来制备可产生滴定曲线的斜率在0.06和0.18ml/min之间的酶液。
已知活性的对照样品已包括在内。
将样品溶于脱矿质水，并以300rpm搅拌15分钟。在用0.05M NaOH调节pH至7.0之前，将25.00ml底物在37℃温育10-15分钟。将300μl酶液加入底物中，并使用pH-Stat滴定仪(Phm290，Mettler Toledo)通过0.05MNaOH进行连续滴定。以各自比例进行两种活性测定。
8分钟后终止滴定，并计算5和7分钟之间的滴定曲线的斜率。检测极限是3TIPU/ml的酶液。
计算：
根据下列方式计算磷脂酶活性(TIPU/g酶)：
TIPU / g = α · N · 10 6 μmol mol · 10 - 3 l ml · V 1 m · V 2 = α · N · 10 3 · V 1 m · V 2
其中：
α是在反应时间5至7分钟之间的滴定曲线的斜率(ml/min)；
N是所用的NaOH的当量浓度(mol/l)
V1是所溶解的酶体积(ml)；
m是加入V1的酶量(g)；
V2是加入底物的酶液体积(ml)。
三酰基甘油酯脂酶的活性测定：基于甘油三酯(三丁酸甘油酯)作为底物的分析(LIPU)：
根据食品化学药典(第四版，National Academy Press，1996，p803)测量基于三丁酸甘油酯的脂酶活性，其中修改了将样品溶于去离子水而不是甘氨酸缓冲液，并将起始pH(pH stat)设定为5.5而不是7。
1 LIPU定义为在分析条件下每分钟释放1 mol丁酸的酶量。
基于对半乳糖脂(GLU)、磷脂(PLU)和甘油三酯(LIPU)的活性分析，可以计算PLU/LIPU和GLU/LIPU的比值。
对Lipopan FTM和根据本发明衍生于异孢镰孢的脂肪分解酶进行分析，得到下列结果。
Lipopan FTM和样品209的相对活性比是：
                                LipopanF    样品209
磷脂/甘油三酯        PLU/LIPU   3           9
半乳糖脂/甘油三酯    GLU/LIPU   1           4
适当地，本文使用的术语“协同作用”或“协同效应”指与单独使用各个组分(即酶)相比，联合使用可产生更好的效果。可通过分别和联合加入各种组分(即，酶)来制备食品如生面团和/或烘烤食品并比较其效果，从而确定协同作用。
如本文所用的术语“真菌脂肪分解酶”指酶的天然来源是真菌。然而，为了免除疑惑，该术语可包括分离自真菌的、在真菌宿主(天然或非天然真菌)中表达的或在非真菌宿主中(例如在细菌或酵母)表达的真菌酶。
优选地，根据本发明的真菌脂肪分解酶是野生型酶。
如本文所用的术语“天然的”和“野生型”指天然存在的酶。也就是当和内源性产生的成熟蛋白质序列(在共转录和转录后剪切事件后)相比，通过内源性遗传密码表达的并从其内源性宿主有机体分离的酶，和/或异源性产生的、未突变(即，不含有氨基酸缺失、添加或取代)的酶。本发明的天然的和野生型蛋白质可由对异源表达密码子优化的多核苷酸编码，并且蛋白质也可包含被选择用于在宿主中表达的非内源性信号肽。
如本文所用的术语“非内源性信号肽”指在共转录剪切之前不天然存在于脂肪分解酶的新生多肽链中的信号肽。在根据本发明的脂肪分解酶中，非内源性信号肽的部分或整体例如前肽，可仍然附着于成熟多肽-这落入如本文所用的术语“野生型”的范围。
如上所述，如本文所用的术语“天然的”和“野生型”指天然存在的酶。然而，这不排除利用人工的或化学合成的多肽，所述多肽包含与天然存在的成熟脂肪分解酶相同的多肽序列。
如本文所用的术语“变体”指当与成熟蛋白质序列中的天然或野生型序列相比，通过非内源性遗传密码表达的、并导致一种或多种氨基酸改变(即，氨基酸缺失、添加或取代)的蛋白质。
根据本发明的真菌脂肪分解酶优选是在低温下保持活性的脂肪分解酶，即是低温型脂肪分解酶。
术语“低温型脂肪分解酶”指在5-15℃具有显著活性的酶，优选是在10℃具有显著活性的酶。
在一个实施方案中，根据本发明的低温型脂肪分解酶并不是如WO2004/064987中公开的包含氨基酸序列基序GDSX的脂肪分解酶，其中X是下列的一种或多种氨基酸残基：L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M或S。
根据本发明的低温型脂肪分解酶可以是如通过NEFA C法对游离脂肪酸的测定中所测定的，在10℃、和在脂肪分解酶最适pH的20％中的pH时，对卵磷脂底物具有至少5％、优选至少7％、更优选至少10％的相对活性的酶(参见实施例5，在pH7下实施)。实施例6提供用于确定脂肪分解酶最适pH的方法。
根据本发明的低温型脂肪分解酶可以是如通过NEFA C法对游离脂肪酸的测定中所测定的，在20℃、和在脂肪分解酶最适pH的20％中的pH时，对卵磷脂底物具有至少10％、优选至少15％、更优选至少20％、更优选至少25％以及最优选至少30％的相对活性的酶(参见实施例5，在pH7下实施)。实施例6提供用于确定脂肪分解酶最适pH的方法。
在5℃下，根据本发明的低温型脂肪分解酶也可显示对蛋黄卵磷脂的显著活性，其特征在于在酶剂量等于20U/g蛋黄、480分钟反应时间后，使用实施例9中描述的和图24和25中举例说明的测定法，低温型脂肪分解酶能释放至少1％、优选至少1.5％、更优选至少2％的游离脂肪酸。
优选地，从丝状真菌可获得根据本发明的真菌脂肪分解酶(优选获得)。更优选地，从镰孢属(Fusarium spp)可获得真菌脂肪分解酶(优选获得)。优选地，从异孢镰孢或半裸镰孢(Fusarium semitectum)可获得根据本发明的真菌脂肪分解酶。适当地，从异孢镰孢(CBS 782.83)或半裸镰孢(IBT 9507)可获得根据本发明的脂肪分解酶(优选获得)。
因此在一个方面中，根据本发明的脂肪分解酶优选是丝状真菌脂肪分解酶，优选丝状真菌野生型脂肪分解酶。
优选地，根据本发明的真菌脂肪分解酶包含与如SEQ ID No.1或SEQID No.2、SEQ ID No.4或SEQ ID No.6所示的氨基酸序列具有至少90％、优选至少95％、优选至少98％、优选至少99％的同一性的氨基酸序列。
优选地，编码根据本发明的真菌脂肪分解酶的核酸包含与SEQ IDNo.3、SEQ ID No.5或SEQ ID No.7中所示的核苷酸序列具有至少90％、优选至少95％、优选至少98％、优选至少99％的同一性的核苷酸序列。
优选地，根据本发明的真菌脂肪分解酶并不是包含了来自Thermomyces蛋白质或其部分的氨基酸序列与来自镰孢属蛋白质或其部分的氨基酸序列融合的融合蛋白。具体地说，优选根据本发明真菌脂肪分解酶不是包含来自Thermomyces lanuginosa蛋白质或其部分的氨基酸序列与来自Fusaiumoxysporum蛋白质或其部分的氨基酸序列融合的融合蛋白。
优选地，根据本发明的真菌脂肪分解酶不从Thermomyces lanuginosa中获得，和/或不是从Thermomyces lanuginosa中获得的该酶的变体。
优选地，根据本发明的真菌脂肪分解酶从异孢镰孢CBS 782.83或半裸镰孢(IBT 9507)的液体发酵培养基中分离。
适当地，通过液相层析纯化酶。
通过Edman裂解法和MALDI-TOF分析法，可确定纯化的真菌脂肪分解酶的氨基酸序列。
在小规模烘烤试验和半工业规模(pilot scale)烘烤试验中，已经测试了来自异孢镰孢CBS 782.83的部分纯化的脂肪分解酶，具有很好的效果。
发现来自异孢镰孢CBS 782.83的真菌脂肪分解酶的烘烤效果优于Lipopan FTM，这种效果与对甘油三酯的活性相比，对极性脂质(具体是糖脂，例如双半乳糖甘油二酯(DGDG))的增高的活性比有关。
另外，已经测试来自半裸镰孢IBT 9507的脂肪分解酶对生面团浆液中的面粉脂质的活性，具有很好的效果。
与Lipopan FTM相比，来自F.semitectum IBT 9507的脂肪分解酶显示对生面团中的半乳糖脂具有显著的活性，并对甘油三酯具有相对较小的活性。
适当地，如本文所用的术语“食品”指适于人和/或动物食用的物质。
适当地，如本文所用的术语“食品”指以可马上被食用的形式存在的食品。然而，作为选择或另外地，如本文所用的术语食品指用于制备食品的一种或多种食物材料。仅仅举例来说，术语食品包括由生面团产生的烘烤品以及用于制备所述烘烤品的生面团。在优选的方面中，本发明提供如以上定义的食品，其中食品选自下列
一种或多种：蛋、蛋制品，包括但不限于蛋黄酱、色拉调味料、调味汁、冰淇淋、蛋粉、改良的蛋黄及其制作的产品；烘烤品，包括面包、蛋糕、甜面团制品、分层生面团、液态奶蛋糊、松饼、油炸圈饼、饼干、脆饼以及小甜饼；糖果，包括巧克力、蜜饯、焦糖、芝麻酥糖(halaWa)；香糖，包括无糖香糖和加糖香糖、泡泡糖、软泡泡糖、香糖以及布丁；冰冻产品，包括果汁冰糕，优选冰冻乳制品，包括冰淇淋和牛奶冻；乳制品，包括乳酪、黄油、乳、低脂奶油(coffee cream)、生奶油、乳蛋糕乳脂、牛奶饮料以及酸乳酪；奶油冻、搅打过的植物奶油；食用油和脂肪、充气和非充气搅打食品、水包油乳化剂、油包水乳化剂、人造黄油、起酥油以及涂抹食品(spread)包括低脂以及极低脂涂抹食品；调味品、蛋黄酱、蘸酱(dip)、以奶油为基础的调味汁、以奶油为基础的汤、饮料、香料乳剂以及调味汁。
在一个方面中，根据本发明的食品是生面团产品或烘烤制品，例如面包、油炸制品、点心、蛋糕、馅饼、核仁巧克力饼、小甜饼、面条、方便面、玉米粉圆饼，和例如薄脆饼干、全麦饼干、椒盐卷饼、以及马铃薯片的点心，以及意大利面食。
在另一个方面中，根据本发明的食品可以是动物饲料。
在一个方面中，优选食品选自下列一种或多种：蛋、蛋制品，包括蛋黄酱、色拉调味料、调味汁、冰淇淋、蛋粉、改良的蛋黄及以其制作的食品。
在本文提到的一些应用中、特别是食物应用例如面包房应用中，根据本发明的脂肪分解酶可与一种或多种常规乳化剂进行使用，包括例如单酸甘油酯、脂肪酸甘油单酯和脂肪酸甘油二酯的二乙酰酒石酸酯、硬脂酰乳酸钠(SSL)以及卵磷脂。
在具有添加的脂肪的面包配方中，特别优选根据本发明的脂肪分解酶；这被认为是由于根据本发明的脂肪分解酶对甘油三酯的低活性，这引起减少游离脂肪酸的累积并对于短链甘油三酯而言，减少或避免了异味。
在本文范围中，术语“添加的脂肪”用于表明没有脂质或油加入面团中。
此外或者作为选择，根据本发明的酶可与一种或多种其它适宜的食品级酶进行使用。因此，除了本发明的脂肪分解酶之外，至少一种另外的酶可被加入烘烤食品和/或生面团中也落入本发明的范围内。所述另外的酶包括淀粉降解酶例如内淀粉酶或外淀粉酶、支链淀粉酶、脱支酶，半纤维素酶包括木聚糖酶、纤维素酶，氧化还原酶例如葡萄糖氧化酶、吡喃糖氧化酶、巯基氧化酶，碳水化合物氧化酶例如氧化麦芽糖的酶(例如己糖氧化酶(HOX))，脂肪酶、磷脂酶、己糖氧化酶、蛋白酶、以及酰基转移酶(例如在WO04/064987中描述的那些酶)。
在生产食品中，特别优选本发明的脂肪分解酶与α淀粉酶联合使用。具体地是，淀粉酶可以是非生麦芽糖淀粉酶，例如具有非生麦芽外淀粉酶活性，具体是葡聚糖1，4-α-maltotetrahydrolase(EC3.2.1.60)活性(如WO05/003339中所公开的)。市场上可买到合适的非生麦芽糖淀粉酶，如PowersoftTM(购自Danisco A/S，丹麦)。也可利用生麦芽糖淀粉酶，例如NovamylTM(Novozymes A/S，丹麦)。在一个实施方案中，可在生面团和/或所制作的烘烤食品例如面包、蛋糕、油炸圈饼、油炸饼(cake doughnuts)或百吉饼的生产中，联合使用α淀粉酶和本发明的脂肪分解酶。α淀粉酶联合本发明的脂肪分解酶，也被认为是优选用于玉米粉圆饼(例如小麦和/或玉蜀黍玉米粉圆饼)的生产方法中。
在另一个优选实施方案中，根据本发明的脂肪分解酶可联合木聚糖酶进行使用以生产食品产品。GRINDAMYTM和POWERBake 7000是购自Danisco A/S的、商业上可获得木聚糖酶的实例。在WO03/020923和WO01/42433中描述了木聚糖酶的其它实例。
优选地，根据本发明的脂肪分解酶可联合木聚糖酶和α淀粉酶进行使用。适当地，α淀粉酶可以是生麦芽或非生麦芽α淀粉酶(例如GRINDAMYLTM或POWERSoft，购自DaniscoA/S)，或其组合。
本发明的脂肪分解酶还可优选联合氧化酶进行使用，例如麦芽糖氧化酶(MOX)、例如己糖氧化酶(HOX)。在WO03/099016中描述了适宜的方法。商业上可获得的麦芽糖氧化酶GRINDAMYLTM和SUREBake购自DaniscoA/S。
任选地，α-淀粉酶例如非生麦芽外淀粉酶和/或生麦芽糖淀粉酶、和/或麦芽糖氧化酶(MOX)可联合根据本发明的酶用于制备生面团、烘烤食品、玉米粉圆饼、蛋糕、方便面/油炸点心、或乳制品例如乳酪的方法中。
通过本领域的已知方法，根据本发明的脂肪分解酶通常可包含在食品或其它组合物中。所述的方法包括将脂肪分解酶直接加入食品或组合物中，添加联合了稳定剂和/或载体的脂肪分解酶，和添加包含脂肪分解酶和稳定剂和/或载体的混合物。
用于本发明的合适的稳定剂包括但不限于无机盐(例如NaCl、硫酸铵)、山梨糖醇、乳化剂和去污剂(例如Tween 20、Tween 80、无甘油三酯的PanodanAB100、聚甘油酯、脱水山梨糖醇单油酸酯(sorbitanmonoleate))、油(例如菜籽油、葵花籽油和大豆油)、果胶、海藻糖以及甘油。
用于本发明的合适的载体包括但不限于淀粉、磨碎的小麦、小麦粉、NaCl以及柠檬酸盐。
通过来自Perten Instruments(瑞典)的Glutomatic 2200，测量面筋指数。测量面筋指数：发面后；立即称取15g生面团并放入Glutomatic，用500ml 2％NaCl溶液洗涤10分钟。然后将洗过的生面团转入面筋指数离心机2015，并测量两种面筋馏份，以及根据下列方程式计算面筋指数。
面筋指数＝(留在100目筛的面筋重量)/面筋总重。
相对于未添加多肽的生面团，优选在生面团中面筋指数增加至少5％，并且通过上述的Glutomatic 2200仪可确定面筋指数。
另外的优选方面存在于所附的权利要求和下列说明书及实施例中。
优点
令人惊讶的和意想不到的是，与以前确定的真菌脂肪分解酶(特别是LipopanFTM)相比，根据本发明的真菌脂肪分解酶对极性脂质(磷脂和/或糖脂)∶甘油三酯具有更高的活性比。这特别令人惊讶，因为在本发明之前没有已知的真菌野生型脂肪分解酶显示这种活性。尽管已经开展研究来调查脂肪分解酶变体(即，已暴露在非天然致突变作用和/或以其它方式进行改变的酶变体)，但没有预想到来自真菌的天然的、野生型酶具有这样高度有利的特征。
已经发现当用于烘烤应用中，所鉴定的酶具有优越的功能。与其它来自真菌的脂肪分解酶、特别是LipopanFTM相比，利用根据本发明的真菌脂肪分解酶可有利地引起显著提高生面团和/或烘烤产品的特性。
有利的是，在低温下保持活性的脂肪分解酶(即，低温脂肪分解酶)可适于低温应用中，因此无需加热底物。这在例如蛋黄的酶促处理、食用油的酶脱胶以及牛奶或乳制品的处理(例如在乳酪制造之前乳酪用乳的处理)中的应用中具有特别的优势。使用低温脂肪分解酶的更多优点在于食品和/或动物饲料中，其中在低操作温度下保持显著的活性使得在降低微生物、特别是细菌污染的风险下进行酶促处理。此外，当在低温下酶的稳定性更大时，这使得在工业应用中减少酶的有效剂量并延长酶的有效使用期。
技术效果
对于烘烤食品例如面包、馒头和美国白面包(white pan bread)，添加本发明的脂肪分解酶可带来下列一种或多种：改善面包体积和松软度、延长保存期和/或保鲜效果、改善团粒结构、降低气孔不均匀性、降低平均孔径、提高面筋指数、改善香味和/或气味，以及改善外壳色泽。
有利的是，根据本发明的酶可用于代替食品(例如生面团和/或烘烤食品)中的乳化剂。
根据本发明的脂肪分解酶可与乳化剂(例如DATEM、SSL、CSL、甘油一酯、聚山梨酸酯以及Tween)具有协同作用。因此，根据本发明脂肪分解酶可联合一种或多种乳化剂进行使用。有利的是，与当不使用根据本发明的酶所需要的乳化剂量相比，根据本发明的脂肪分解酶与一种或多种乳化剂的联合使用，可降低使用的乳化剂总量。
根据本发明的脂肪分解酶也可与水状胶质、瓜耳胶、xanthum和果胶以及与麦芽糖氧化酶例如己糖氧化酶具有协同作用。
例如对于油炸圈饼、油炸饼、百吉饼、快餐饼以及松饼，使用本发明的脂肪分解酶，当与一种或多种α-淀粉酶、生麦芽α-淀粉酶以及非生麦芽α-淀粉酶联合使用时，可带来协同作用。
例如对于蛋糕、松糕以及棕榈蛋糕(palm cake)，使用本发明的脂肪分解酶当与一种或多种水状胶质(例如瓜耳胶)和/或一种或多种乳化剂(例如DATEM)联合使用时可带来协同作用。
例如对于饼干，使用根据本发明的脂肪分解酶可带来改善的可滚动性和操作特性，特别是冷环境下(冷可滚动性)。
有利的是，例如在蛋黄酱及其他蛋制品中，使用根据本发明的脂肪分解酶可导致改善质地、降低平均颗粒大小、和/或降低平均颗粒分布、提高热稳定性、提高微波性能和/或稳定性。
在蛋糕中，使用本发明的酶可有利地导致改善松软度、体积，提高保存性能和保存期限。
例如对于面条或面条制品(如方便面)，本发明的脂肪分解酶可带来一种或多种下列的特征：改善色泽/黄色、更加稳定的色泽特征、降低亮度、减少脂肪含量、改善质地和感(咀嚼性)、降低水活性、减少折断、提高核心硬度以及在加工期间提高形状保持性。
优选地，本发明的脂肪分解酶可用于降低面条或面条制品(例如方便面)的脂肪含量。
例如在玉米粉圆饼中，使用根据本发明的酶可导致下列一种或多种：例如通过提高可塑性来降低玉米粉圆饼的可轧制性、提高保鲜度、提高松软度和/或降低异味。
有利的是，提高可滚动性和/或可塑性在滚动时可导致降低玉米粉圆饼破裂的可能性。
例如在乳酪和/或乳酪制品中，使用根据本发明的酶可导致下列一种或多种：改善香味、质地和/或稳定性，减少乳酪中的脱油效应和/或增加乳酪产量。
如本文所用的术语“脱油效应”指当乳酪熔化时释放游离油。
根据本发明的脂肪分解酶可用于生产低脂肪乳酪。有利的是，本发明的酶可使奶中的脂肪稳定和/或增强香味。
本发明的一个优点是酶可在低温下起作用(并且实际上具有高活性)。这具有许多优点，其中这取决于加入酶的用途。例如，在乳酪制作中，该功能可降低酶促处理期间的微生物污染和微生物生长的风险。该原因在于在酶促处理期间，乳酪可保持冷的状态。因此，根据本发明的脂肪分解酶可特别适于在低温下使乳酪成熟以改善香味。
例如在动物饲料中，根据本发明的酶可有利地导致下列一种或多种：提高动物中的饲料利用和/或饲料转化率、促进动物的体重增加、提高饲料的消化率、提高动物例如从饲料中的氮吸收、提高饲料的干物质代谢能力以及提高饲料的可性。
在食用油(例如植物油)的脱胶过程中，本发明的脂肪分解酶在低温下具有高活性。这可有利地在酶处理之前或之中降低加热油的需要。在处理期间这具有减少所需能量总量的有利效果。与甘油三酯相比，根据本发明的酶可提高对降低磷脂的选择性。在食用油(例如植物油)中，与对磷脂的活性相比，根据本发明的酶具有降低的对甘油三酯的水解活性。这导致更少的甘油三酯被水解(与常规的/磷脂酶相比)，并且导致在油产量中较少的损失和/或减少游离脂肪酸在油中的累积(与常规的脂肪分解/磷脂酶相比)。
用途
根据本发明的酶具有许多用途。
具体地说，根据本发明的真菌脂肪分解酶可用于食品的制作中。
例如，根据本发明的真菌脂肪分解酶可特别用于蛋或蛋制品的加工中。
磷脂酶，特别是磷脂酶A2(E.C.3.1.1.4)，已经多年被用于加工蛋或蛋制品(例如，参见美国4,034,124和Dutihl&Groger 1981 J.Sci.Food Agric.32，451-45)。在加工蛋或蛋制品期间，磷脂酶活性可导致起乳化剂作用的极性溶血卵磷脂的累积。
使用根据本发明的真菌脂肪分解酶来处理蛋或蛋制品，可提高稳定性，热处理过程(例如巴氏灭菌法)中的热稳定性，并导致相当的稠密。蛋制品包括但不限于蛋糕、蛋黄酱、色拉调味料、调味汁、冰淇淋等等。
根据本发明的真菌脂肪分解酶特别适于制作烘烤食品例如从生面团制作的烘烤食品，包括面包、蛋糕、甜面团食品、分层生面团、液态奶蛋糊、松饼、油炸圈饼、饼干、脆饼以及小甜饼。
，根据本发明的真菌脂肪分解酶也可用于改良面包的添加剂，如生面团组合物、生面团添加剂，面团性质改进剂，预混合物和在制作面包或其它烘烤食品的过程中通常加入面粉和/或生面团中来提供面包或其它烘烤食品的改良品质的相似制剂。
因此，本发明还涉及包含根据本发明的真菌脂肪分解酶在内的面包改良组合物和/或生面团改良组合物；也涉及包含所述的面包改良组合物和/或生面团改良组合物在内的生面团或烘烤食品。
除根据本发明的脂肪分解酶之外，面包改良组合物和/或生面团改良组合物可包括其它物质，该物质通常被用于烘烤来提高生面团和/或烘烤产品的品质。
面包改良组合物和/或生面团改良组合物可包括一种或多种常规烘烤剂，例如下列的一种或多种组分：奶粉、面筋、乳化剂、粒化脂肪、氧化剂、氨基酸、糖、盐、面粉或淀粉。
合适乳化剂的实例是：甘油一酯、脂肪酸甘油一酯及脂肪酸甘油二酯的二乙酰酒石酸酯、糖酯、硬脂酰乳酸钠(SSL)以及卵磷脂。
面包和/或生面团改良组合物还可包括另一种酶，例如一种或多种其它合适的食品级酶，包括淀粉降解酶例如内淀粉酶或外淀粉酶、支链淀粉酶、脱支酶，半纤维素酶包括木聚糖酶、纤维素酶，氧化还原酶例如葡萄糖氧化酶、吡喃糖氧化酶、巯基氧化酶，或碳水化合物氧化酶例如氧化麦芽糖的酶(例如己糖氧化酶(HOX))，脂肪酶、磷脂酶、己糖氧化酶、蛋白酶、以及酰基转移酶(例如在WO04/064987中描述的那些酶)。如本文所用的术语“改良的品质”指可通过本发明的真菌脂肪分解酶的作用而改良的任何品质。具体地说，使用根据本发明的真菌脂肪分解酶导致一种或多种下列特征：提高烘烤产品的体积、改善烘烤产品的团粒结构、在烘烤食品中抗变质的品质、提高生面团的强度、提高稳定性、减少生面团的粘性和/或提高生面团的可机械加工性。
通过与不添加根据本发明的脂肪分解酶所制作的生面团和/或烘烤产品进行比较，评价改良的品质。
如本文所用的术语“烘烤产品”包括从生面团制作的产品。有利地通过本发明制作的烘烤食品(无论白色、浅色或深色的类型)的实例包括下列一种或多种：典型的是以块状或卷状或烤片形状的面包(包括白面包、全麦面包以及黑面包)、法式长棍面包、pitta面包、玉米粉圆饼、炸玉米粉卷、蛋糕、薄烤饼、饼干、脆面包、意大利面食、面条等等。
按照本发明的生面团可以是发酵的生面团或将要进行发酵的生面团。
可以多种方式发酵生面团，例如加入小苏打等等、或加入合适的酵母培养物例如酿酒酵母(面包酵母)培养物。
本发明还涉及根据本发明的真菌脂肪分解酶在生产意大利面食生面团，优选从硬粒小麦面粉或类似品质的面粉制作所述的面团。
根据本发明的真菌脂肪分解酶可用于植物油或食用油的酶脱胶用途。
在植物油或食用油的加工中，用根据本发明的真菌脂肪分解酶处理食用油或植物油，以使得水解大部分极性脂质(如磷脂和/或糖脂)。优选地，从极性脂质水解脂酰基。脱胶过程通常引起食用油中的极性脂质(特别是磷脂)含量的减少，这归应于大部分(即，超过50％)极性脂质(如糖脂和/或磷脂)的水解。典型地，从油分离含有水解的极性脂质(如磷脂和/或糖脂)的水相。适当地，最初食用油或植物油(用根据本发明的酶进行预处理)可具有50-250ppm的含磷量。
此外，本发明指导了使用根据本发明的脂肪分解酶用于处理乳酪产品。
根据本发明的脂肪分解酶也特别适于制备动物饲料的用途。
如技术人员所知，如本文所用的术语“脱胶”指通过将磷脂(例如卵磷脂、磷酸脂质和滞留油)转化成水合性磷脂来炼制油。已被脱胶的油是更流动的，因此比未被脱胶的油具有更好的处理性质。
下表仅仅用于常规的指导，并提供适于在不同应用中所需的、根据本发明的脂肪分解酶的剂量水平的概述。例如，当与乳化剂联合使用时，该表还提供涉及适于根据本发明的脂肪分解酶的剂量水平的指导。当然，对本领域普通技术人员而言显而易见的是：使用适于任何某个应用的常规试验法，易于确定最适酶量、反应温度和反应时间。
  应用 “最适”剂量，面粉的TIPU/kg 联合乳化剂的最适剂量  剂量范围，面粉的TIPU/KG
  硬卷(Crusty rolls) 400 120  300-800
  面团直接烤制面包 400 120  300-800
  面团直接发酵法 120  75-250
  高速混匀-Tweedy法 120  300-800
  US sponge&dough pan bread ontop of DATEM 120  75-400
  麦饼 700 含乳化剂  400-2500
  蛋糕--海蛋糕绵 2000 含蛋糕乳化剂  1000-4000
  冻藏发酵(24hours) 120 含乳化剂  75-250
  馒头 200  150-500
  方便面  200-10,000
分离的
在一个方面中，序列优选是分离的形态。术语“分离的”指序列至少实质上不含至少一种与该序列在天然状态下相关的和如在天然状态下发现的其它组分。
纯化的
在一个方面中，序列优选是纯化的形态。术语“纯化的”指序列处于相对纯净的状态--如至少约90％的纯度、或至少约95％的纯度或至少约98％的纯度。
核苷酸序列
本发明范围包括编码具有如本文定义的特殊性质的酶的核苷酸序列。
如本文所用的术语“核苷酸序列”指寡核苷酸序列或多核苷酸序列及其变体、同系物、片段和衍生物(例如其部分)。核苷酸序列可以是基因组的或人工的或重组体来源，该序列可以是双链或单链，不管其代表有义或反义链。
本发明涉及的术语“核苷酸序列”包括基因组DNA、cDNA、合成DNA以及RNA。优选它是编码本发明的DNA、更优选是cDNA。
在优选的实施方案中，当涉及和包括在本发明的本身范围内时，核苷酸序列不包括当在其天然环境中并连接它的天然关联序列(这些相关序列也在它或它们的天然环境中)时的根据本发明的天然的核苷酸序列。为了便于参照，将这个优选实施方案称为“非天然核苷酸序列”。对于这一点，术语“天然核苷酸序列”指处于其天然环境中的、并当可操作连接到与它天然关联的完整启动子时的完整核苷酸序列，其中启动子也在它的天然的环境中。然而，本发明范围所包括的氨基酸序列可以在核苷酸序列在其天然有机体中表达之后分离和/或纯化。优选地，然而，本发明范围所包括的氨基酸序列可通过在其天然有机体中的核苷酸序列表达，但是其中核苷酸序列不受在该有机体中与它天然关联的启动子的控制。
核苷酸序列的制备
一般，使用重组DNA技术(即，重组DNA)制备本发明范围所包括的核苷酸序列。然而，在本发明另一种实施方案中，利用本领域中众所周知的化学法，可全部或部分合成核苷酸序列(参见Caruthers MH等，(1980)NucAcids Res Symp Ser 215-23和Horn T等，(1980)Nuc Acids Res Symp Ser225-232)。
从产生所述酶的任何细胞或有机体中，可鉴定和/或分离和/或纯化编码具有如文中所定义的特定特性的酶的核苷酸序列。在本领域中，用于鉴定和/或分离和/或纯化核苷酸序列的各种方法是众所周知的。例如，一旦已经鉴定和/或分离和/或纯化了合适的序列，可利用PCR扩增技术来制备更多的序列。
通过另外的实例，利用来自产生酶的有机体的染色体DNA或信使RNA，可构建基因组DNA和/或cDNA文库。如果酶的氨基酸序列或酶的部分氨基酸序列是已知的，可合成标记寡核苷酸探针并用于在从有机体制备的基因组文库中鉴定酶编码克隆。或者，将包含与另一种已知的酶基因同源的序列的标记寡核苷酸探针用于鉴定酶编码克隆。在后一种情况中，可使用低严谨的杂交和洗涤条件。
或者，通过将基因组DNA片段插入表达载体例如质粒中、用所得的基因组DNA文库转化酶阴性细菌、随后将转化的细菌铺在含有酶底物(如适于葡糖苷酶(麦芽糖酶)的麦芽糖)的琼脂平板上、由此鉴定表达酶的克隆，来鉴定酶编码克隆。
还在另外的选择中，通过已建立的标准方法，如根据Beucage S.L等((1981)Tetrahedron Letters22，p1859-1869)或Matthes等((1984)EMBO J.3，p801-805)所述的phosphoroamidite法可人工制备编码酶的核苷酸序列。例如，在phosphoroamidite法中，在例如自动DNA合成仪中合成寡核苷酸、纯化、退火，并连接和克隆在合适的载体中。
核苷酸序列可以为混合的基因组和合成来源，混合的合成和cDNA来源、混合的基因组和cDNA来源、根据标准技术通过连接合成来源、基因组来源或cDNA来源(视情况而定)的片段而制备。每个连接片段对应于全部核苷酸序列的各个部分。也可通过聚合酶链式反应(PCR)，使用特异性引物，来制备DNA序列，例如在美国专利4,683,202中或在Saiki R K等人(Science(1988)239，pp487-491)所述。
由于遗传密码的简并性，易于生产核苷酸序列，其中对于原始核苷酸序列编码的一些或所有氨基酸的三联体密码子使用，已经发生改变，从而产生与原始核苷酸序列具有低同源的、但编码与原始核苷酸序列编码的相同氨基酸序列或其变体。例如，对于多数氨基酸而言，遗传密码简并性位于三联体密码子的第三位(摆动位点)(参见Stryer，Lubert，Biochemistry，ThirdEdition，Freeman Press，ISBN 0-7167-1920-7)因此，所有三联体密码子已经在第三位发生“摆动”的核苷酸序列约66％相同于原始核苷酸序列。然而，修饰的核苷酸序列可编码与原始核苷酸序列相同、或变体一组氨基酸序列。
因此，本发明还涉及具有对编码三联体密码的至少一个氨基酸具有可替换的三联体密码使用、但编码与原始核苷酸序列编码的多肽序列相同、或变体的多肽序列。
此外，特定有机体通常具有用于编码氨基酸的三联体密码子的偏好性。优选的密码子选择表是普遍可得到的，并可用于制备密码子优化的基因。所述的密码子优化技术通常地用于优化在异源宿主中转基因的表达。
氨基酸序列
本发明范围也包括具有如本文中定义的特定特性的酶的氨基酸序列。
如本文所用的，术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”的意义是一样的。在有些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”的意义是一样的。在有些情况下，术语″氨基酸序列″与术语″酶″的意义是一样的。
可从合适的来源制备/分离氨基酸序列，或人工制备或利用重组DNA技术制备氨基酸序列。
本发明中所包括的酶可联合其它酶进行使用。因此本发明也包括酶的组合，其中组合包含本发明的酶和另一种酶的酶组合，其中另一种酶可以是根据本发明的另一种酶。
氨基酸序列当涉及并落入本发明的自身范围内时优选不是天然的酶。对于这一点，术语“天然酶”指在其天然环境中并通过其天然核苷酸序列得到表达的完整酶。
同一性/同源性
本发明也包括酶的任何氨基酸序列或编码所述酶的任何核苷酸序列的同系物的用途。
本文中，术语“同系物”指与氨基酸序列和核苷酸序列具有某种同源性的实体。本文中，术语“同源性”与“同一性”等同。本文中可交换使用这些术语。
在本文中，规定同源氨基酸序列包括是至少92％、优选至少95％、96％、97％、98％或99％相同于该序列的氨基酸序列。通常，同系物包括例如与目标氨基酸相同的活性位点等等。尽管也可根据相似性(即，具有相似的化学性质/功能的氨基酸残基)来判断同源性，但在本发明的范围中优选用序列同一性来表示同源性。
优选地，根据本发明的同源氨基酸序列是在至少30、更优选40个连续氨基酸区域上，具有至少90％同一性、更优选至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
在本文中，规定同源核苷酸序列包括是至少92％、优选至少95％、96％、97％、98％或99％相同于编码本发明的酶的核苷酸序列(目标序列)。通常，同系物包括例如与目标序列编码活性位点的相同的序列等等。尽管也可根据相似性(即，具有相似的化学性质/功能的氨基酸残基)来判断同源性，但在本发明的范围中优选用序列同一性来表示同源性。
根据本发明的同源氨基酸序列是在至少30、优选40、更优选60个连续氨基酸区域上，具有至少90％同一性、更优选至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
对于氨基酸序列和核苷酸序列，通过肉眼或更多地借助于可方便获得的序列比较程序，实施同源性比较。这些商业上可获得的计算机程序可计算两个或更多序列之间的％同源性。
可对连续序列计算％同源性即，将一条序列与另一条序列对齐，并将一条序列中的每个氨基酸直接与另一条序列中相应的氨基酸进行比较，每次比较一个残基。这称为“无空位(ungapped)”比对。通常，仅仅对于数目相对较少的残基进行所述的无空位比对。
尽管这是非常简单和一致的方法，但它未能考虑到一些情况：例如当进行全序列对比时，在一对在其它方面完全相同的序列对中的一个插入或缺失将引起随后的氨基酸残基无法对齐，因此可能导致极大地降低％同源性。因此，将大多数序列比较方法设计成可得到最佳对比结果，所述的对比考虑了可能的插入和缺失而不对同源性总分数过度罚分。通过在序列对比中插入“空位”来使局部同源性尽力最大化，可实现上述目的。
然而，这些更复杂的方法对存在于队列中的每个缺给予“空位罚分”，使得对于相同数目的相同氨基酸而言，具有尽可能少的空位的序列对比(这表明在两种被对比序列之间的较高相关性)与具有许多空位的序列比对相比，可获得较高分。通常使用“亲族空位代价”来对存在空位付出相对较高代价以及对空位中每个随后残基处以较小罚分。这是最普遍用到的空位计分系统。高空位罚分自然得到具有较少空位的最佳对比。大多数对比程序允许修饰空位罚分。然而，当使用这种软件用于序列比较时，优选使用默认值。例如，当使用GCG Wisconsin Bestfit程序包时，用于氨基酸序列的默认空位罚分是：空位是-12，每个延长是-4。
因此最大％同源性的计算首先需要产生最佳比对并考虑到空位罚分。用于实施所述对比的合适的计算机程序是GCG Wisconsin Bestfit程序包(Devereux等，1984 Nuc.Acids Research 12 p387)。可进行序列比较的其它软件的实例包括但不限于，BLAST程序包(参见Ausubel等，1999 ShorrProtocols in Molecular Biology，4th Ed-Chapter 18)、FASTA(Altschul等，1990 J.Mol.Biol.403-410)和GENEWORKS系列比较工具。BLAST和FASTA都可用于脱机和联机检索(参见Ausubel等.，1999，Short Protocols inMolecular Biology，pages 7-58 to 7-60)。
然而，对于一些应用，优选使用GCG Bestfit程序。被称为BLAST 2Sequences的新工具，也可用于比较蛋白质和核苷酸序列(参见FEMSMicrobiol Lett 1999 174(2)：247-50；FEMS Microbiol Lett 1999 177(1)：187-8and tatiana@ncbi.nlm .nih.gov)。
尽管可根据同一性测量最终的％同源性，比对过程本身通常不以“全或无”的配对比较为基础。相反，通常使用分等级的相似性计分矩阵，其中根据化学相似性或进化距离对每个成对比较进行计分。通常用到的这种矩阵的实例是BLOSUM62矩阵--BLAST程序系列的默认矩阵。GCGWisconsin程序通常使用公众默认值或用户符号比较表(如果提供的话)，具体详情参见用户手册。对于一些应用，对GCG程序包而言优选使用公众默认值，或对其它软件而言，优选使用默认矩阵例如BLOSUM62。
或者，使用在DNASISTM(Hitachi Software)中的多重对比特征，根据类似于CLUSTAL(Higgins DG&Sharp PM(1988)，Gene 73(1)，237-244)的算法，来计算百分比同源性。
一旦软件产生最佳对比结果，有可能来计算％同源性，优选是％序列同一性。通常软件作为序列比较的一部分进行此操作，并得到数值结果。
序列也可具有产生沉默突变并导致功能等价物的氨基酸残基的缺失、插入或取代。根据氨基酸性质(例如极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性、和/或残基的两亲性质)的相似性，可进行有意的氨基酸取代，因此这可用于将氨基酸分成功能性的组。可仅基于氨基酸的侧链特性将氨基酸分成组。然而，更有用的是也包括了突变数据。因此，出于结构原因，衍生的氨基酸组很可能是保守的。可以维恩图(Livingstone C.D.和Barton G.J.(1993)″Protein sequence alignments：a strategy for the hierarchical analysis of residueconservation″Comput.Appl Biosci.9：745-756)(Taylor W.R.(1986)″Theclassification of amino acid conservation″J.Theor.Biol.119；205-218)的形式描述这些氨基酸组。例如根据描述了公认的维恩图氨基酸分组的下表，可制备保守性取代。
组 亚组
疏水性 FWYHKMILVAGC 芳香族 FWYH
脂肪族 ILV
极性 WYHKREDCSTNQ 带电的 HKRED
正电荷的 HKR
负电荷的 ED
小 VCAGSPTND 微小 AGS
本发明也包括同源取代(本文提到的取代和替换都指存在的氨基酸残基与另一种残基进行互换)，其可发生相似对相似的取代，例如碱性对碱性、酸性对酸性、极性对极性等等。也可存在非同源取代，即从一个种类的残基到另一种类的残基，或者涉及包含非天然氨基酸，例如鸟氨酸(以下称为Z)、二氨基丁酸鸟氨酸(以下称为B)、正亮氨酸鸟氨酸(以下称为O)、吡啶丙氨酸、噻吩丙氨酸、萘基丙氨酸以及苯基甘氨酸。
也可通过非天然氨基酸进行取代。
变体氨基酸序列包括可插入序列的任何两种氨基酸残基之间的合适间隔子基团，包括烷基例如甲基、乙基或丙基，此外还有氨基酸间隔子例如甘氨酸或β-丙氨酸残基。本领域技术人员非常清楚另外形式的变体，其涉及以类肽形式存在的一种或多种氨基酸残基。为了消除疑惑，“类肽形式”用于指变体氨基酸残基，其中α-碳取代基在残基的氮原子上而不是α-碳上。类肽形式的肽的制备方法是本领域已知的，例如Simon RJ等人的“PNAS(1992)89(20)，9367-9371”和Horwell DC的“Trends Biotechnol.(1995)13(4)，132-134”。
用于本发明的核苷酸序列其中包括合成或修饰的核苷酸。本领域中对寡核苷酸的许多不同种类的修饰是已知的。这些修饰包括甲基磷酸酯和硫代磷酸酯主链和/或在分子的3′端和/或5′端掺入吖啶或聚赖氨酸链。出于本发明目的，可以理解的是本文描述的核苷酸序列可通过本领域中任何有效的方法进行修饰。可实施所述的修饰以增强本发明的核苷酸序列的体内活性或寿命。
本发明也包括与本文提到的序列或任何衍生物、片段或其衍生物互补的核苷酸序列的用途。如果序列与某个片段是互补的，则序列可作为探针来鉴定其它有机体中相似的编码序列等等。
以多种方法可获得与本发明的序列不是100％同源、但也落入本发明范围内的多核苷酸。例如通过探测由大量个体(例如来自不同群体的个体)制备的DNA文库，可得到本文所述序列的其它变体。此外，可获得其它同系物，所述的同系物及其片段通常能与本文序列表中所示的序列选择性杂交。通过探测由来自其它物种的基因组DNA所制备的cDNA文库，并且在中度至高度严谨的条件下，用包含所附序列表中的任何一条序列的全部或部分的探针，探测所述的文库可获得所述的序列。类似的考虑可用于获得本发明多肽或核苷酸序列的物种同系物和等位变体。
使用简并PCR也可获得变体和菌株/物种同系物，其中简并PCR使用设计成能靶向变体和编码本发明序列中保守氨基酸序列的同系物中的序列的引物。例如对来自几个变体/同系物的氨基酸序列进行比对，可预测保守序列。使用本领域已知的计算机软件可实施序列比对。例如GCG Wisconsin PileUp程序被普遍地使用。
简并PCR中用到的引物含有一种或多种简并位点，并且在与通过靶向已知序列的单序列引物来隆序列相比，更低的严谨条件下使用。
或者，通过位点定向诱变特征序列，可获得所述的多核苷酸。这在例如需要沉默密码子序列改变，来优化表达多核苷酸序列的特殊宿主细胞的密码子偏爱性时是有用的。可需要其它的序列突变来导入限制性内切酶识别位点，或改变由多核苷酸编码的多肽的性质或功能。
本发明的多核苷酸(核苷酸序列)可用于生产引物如PCR引物，用于可替换的扩增反应的引物、探针，如使用放射性的或非放射性的标记，通过传统方法用有展示作用的标记标记的探针，或可将多核苷酸克隆入载体。这种引物、探针及其它片段是至少15、优选是至少20、例如至少25、30或40核苷酸长度，同时落入如本文所用的术语本发明的多核苷酸的范围内。
可通过重组法、合成法或通过本领域技术人员可利用的任何方法，生产根据本发明的多核苷酸，例如DNA多核苷酸和探针。它们也可通过标准技术克隆。
通常，可通过合成方法生产引物，包括一次合成一个核苷酸来逐步制备预期的核酸序列。使用自动化技术用于完成引物生产的技术是本领域中易于得到的。
通常使用重组法例如使用PCR(聚合酶链式反应)克隆技术，生产更长的多核苷酸。可将引物设计成能含有合适的限制性内切酶识别位点以便将扩增的DNA克隆入合适的克隆载体。
生物学活性
优选地，变体序列等等至少具有与本文所示序列具同样的生物学活性。
如本文所用的“生物学活性”指具有与天然存在的序列相似的结构功能(但不必达到相同的程度)、和/或相似的调节功能(但不必达到相同的程度)、和/或相似的生物化学功能(但不必达到相同的程度)的序列。
杂交
本发明也包括与本发明的核酸序列互补的序列，或包括能与本发明的序列或与其互补序列杂交的序列。
如本文所用的术语“杂交”包括“将核酸链与互补链通过碱基配对连接的过程”以及包括如在聚合酶链式反应(PCR)技术中实施的扩增过程。
本发明也包括能与本文所示的核酸序列互补的序列进行杂交的核苷酸序列(或任何衍生物、片段或其衍生物)的用途。
术语“变体”也包括与能杂交本文所示的核苷酸序列的序列互补的序列。
优选地，术语“变体”包括与在严谨条件下(如50℃、0.2xSSC{1xSSC＝0.15M NaCl、0.015M柠檬酸钠，pH7.0})能杂交本文所示的核苷酸序列的序列互补的序列。
优选地，术语“变体”包括与在高度严谨条件下(如65℃、0.1xSSC{1xSSC＝0.15M NaCl、0.015M柠檬酸钠，pH7.0})能杂交本文所示的核苷酸序列的序列互补的序列。
本发明也涉及与本发明的核苷酸序列(包括与本文所示的序列互补的序列)杂交的核苷酸序列。
本发明也涉及与可与本发明的核苷酸序列(包括本文所示序列的互补序列)的杂交的序列发生互补的核苷酸序列。
在中等直到最高严谨的条件下，能与本文所示的核苷酸序列杂交的多核苷酸序列也落入本发明的范围内。
在优选的方面中，本发明包括在严谨条件下(如50℃、0.2xSSC)，能与本发明的核苷酸序列或其互补序列杂交的核苷酸序列。
在更优选的方面中，本发明包括在高严谨条件下(如65℃、0.1xSSC)，能与本发明的核苷酸序列或其互补序列杂交的核苷酸序列。
重组
在一个方面中，用于本发明的序列是重组序列，即使用重组DNA技术制备的序列。
这些重组DNA技术是在本领域普通技术人员的能力范围之内。在文献中解释了所示的技术，例如J.Sambrook、E.F.Fritsch和T.Maniatis的“1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition，Books 1-3，ColdSpring Harbor Laboratory Press”。
合成
在一个方面中，用于本发明的序列是合成的序列，即在体外通过化学法或酶促合成法制备的序列。它包括但不限于通过适于宿主有机体(例如毕赤氏酵母和汉逊酵母甲基营养酵母)的最佳密码子使用而制备的序列。
酶的表达
用于本发明的核苷酸序列可掺入重组可复制载体。在和/或从相容性宿主细胞中，载体可用于复制和以酶的形式表达核苷酸序列。
使用控制序列如调控序列来控制表达。
宿主重组细胞通过核苷酸序列的表达而产生的酶，可以是分泌性的或可包含于细胞内，这取决于使用的序列和/或载体。编码序列可设计成具有信号序列，所述信号序列可指导物质编码序列穿过特定的原核或真核细胞膜分泌。
表达载体
术语“表达载体”指能在体内或体外表达的构建体。
优选地，将表达载体掺入合适的宿主有机体的基因组中。术语“掺入”优选包括稳定地掺入基因组中。
本发明的核苷酸序列可存在于载体中，其中核苷酸序列可操作地连接到能利于通过合适宿主有机体表达核苷酸序列的调控序列。
可将用于本发明的载体转化入如下所述的合适宿主细胞，来提供本发明的多肽的表达。
载体的选择如质粒、粘粒或噬菌体载体，常常取决于它被导入的宿主细胞。
用于本发明的载体可含有一种或多种选择标记基因，例如赋予抗生素抗性(如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性)的基因。或者，通过共转化来完成选择(如WO91/17243中所述)。
载体可在体外使用，例如用于生产RNA或用于转染、转化、转导或感染宿主细胞。
因此，在另外的实施方案中，通过将本发明的核苷酸序列导入可复制载体、将载体导入相容性宿主细胞并在引起载体复制的条件下培育宿主细胞，本发明提供制备本发明的核苷酸序列的方法。
载体还进一步包含能使载体在所述的宿主细胞中复制的核苷酸序列。所述序列的实例是质粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1以及pIJ702的复制起点。
调控序列
在一些应用中，将用于本发明的核苷酸序列可操作地连接到能提供核苷酸序列(例如通过选择的宿主细胞)表达的调控序列。举例来说，本发明包括包含可操作地连接所述调控序列的本发明核苷酸序列的载体，即，载体是表达载体。
术语“可操作地连接”指所述的组分处于允许它们以预定方式起作用的相互关系中的并列位置。“可操作地连接”至编码序列的调控序列是在与控制序列相容的条件下实现编码序列表达的方式进行连接。
术语“调控序列”包括启动子和增强子及其它表达调控信号。
术语“启动子”用于本领域的常规意义使用，如RNA聚合酶结合位点。
通过选择异源调控区域(如启动子、分泌前导序列和终止子区域)，也可实现编码本发明的酶的核苷酸序列的增强表达。
优选地，将根据本发明的核苷酸序列可操作地连接至少一个启动子。
在细菌、真菌或酵母宿主中，用于指导核苷酸序列转录的合适启动子的实例是本领域中众所周知的。
构建体
术语“构建体”-其和术语例如“缀合物”、“盒”、“杂交物”同义-包括直接或间接附着于启动子的根据本发明的核苷酸序列。
间接附着的实例是提供了位于启动子和本发明的核苷酸序列之间的合适间隔区，例如内含子序列，例如Sh1内含子或ADH内含子。对于涉及本发明的术语“融合”而言同样是如此，该术语包括直接或间接的附着。有时，该术语不包括用于编码通常与野生型基因启动子有关的并当他们均在其天然环境中时的蛋白质的核苷酸序列的天然组合。
构建体甚至可含有或表达便于选择遗传构建体的标记。
对于一些应用，优选本发明的构建体至少包括可操作地连接启动子的本发明的核苷酸序列。
宿主细胞
本发明所涉及的术语“宿主细胞”，包括含有如上所述的核苷酸序列或表达载体、并用于重组产生具有本文所定义特定特性的酶的任何细胞。因此，本发明另外的实施方案提供用表达本发明的酶的核苷酸序列转化或转染的宿主细胞。可选择与所述载体相容的细胞，例如原核的(例如细菌)、真菌、酵母或植物细胞。优选宿主细胞不是人细胞。
合适的细菌宿主有机体的实例是革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌物种。
取决于编码本发明的酶的核苷酸序列的性质、和/或根据进一步加工表达的蛋白质的需要，优选真核宿主例如酵母或其它真菌。通常，酵母细胞优于真菌细胞，因为它们易于操作。然而，一些蛋白质很少从酵母细胞分泌，或有时不被适当地加工(如在酵母中的超糖基化)。在这些情况下，应选择不同的真菌宿主有机体。
使用适宜宿主细胞-例如酵母、真菌以及植物宿主细胞，可提供转录后修饰(如十四烷酰化、糖基化、截断、lapidation以及酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸磷酸化作用)，如当需要对本发明的重组表达产品给予最适生物活性时。
宿主细胞可以是蛋白酶缺陷型或蛋白酶负型菌株。
可修饰宿主细胞的基因型来提高表达。
宿主细胞修饰的实例包括蛋白酶缺陷、补充稀有tRNA以及修饰细胞质中还原能力以促进二硫键形成。
例如，宿主细胞E.coli可过表达稀有tRNA来提高异源蛋白质的表达，如Kane(Curr Opin Biotechnol(1995)，6，494-500″Effects of rare codon clusterson high-level expression of heterologous proteins in E.coli")举例说明/描述。宿主细胞可缺乏许多还原酶，因此有利于形成稳定的二硫化物键，如Bessette(Proc Natl Acad Sci USA(1999)，96，13703-13708″Efficient folding ofproteins with multiple disulphide bonds in the Escherichia coli cytoplasm")举例说明/描述。
有机体
涉及本发明的术语“有机体”包括可包含编码根据本发明的酶的核苷酸序列和/或由此获得的产品的任何有机体，并且/或者其中当存在于有机体中时，启动子可允许表达根据本发明的核苷酸序列。
合适的有机体可包括原核生物、真菌、酵母或植物。
涉及本发明的术语“转基因有机体”包括包含用于编码根据本发明的酶的核苷酸序列的任何有机体和/或由此获得的产物，并且/或者其中启动子允许在有机体中表达根据本发明的核苷酸序列。优选将核苷酸序列掺入有机体基因组中。
当核苷酸受到它们的、同样是在天然环境中的天然启动子控制时，术语“转基因有机体”不包括在天然环境中的天然核苷酸编码序列。
因此，本发明的转基因有机体包括可包含选择下列任何一个或其组合的有机体：编码根据本发明的酶的核苷酸序列、根据本发明的构建体、根据本发明的载体、根据本发明的质粒、根据本发明的细胞、根据本发明的组织或其产物。
例如，转基因有机体也可包括在异源启动子控制下的编码本发明的酶的核苷酸序列。
宿主细胞/有机体的转化
如早前所示，宿主有机体是原核或真核有机体。合适的原核宿主的实例包括大肠杆菌和枯草芽孢杆菌。
关于转化原核宿主的教导是本领域中熟知的，例如参见Sambrook等Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd edition，1989，Cold SpringHarbor Laboratory Press)。如果使用原核宿主，则可能需要在转化之前适宜地修饰核苷酸序列-例如除去内含子。
使用本领域中已知不同方法，转化丝状真菌细胞，例如涉及原生质体形成和转化原生质体、随后以已知方式再生细胞壁的方法。在EP0238023中描述了曲霉属用作宿主微生物。
另一种宿主有机体是植物。在Potrykus的论文(Annu Rev Plant PhysiolPlant Mol Biol[1991]42：205-225)和在Christou的论文(Agro-Food-IndustryHi-Tech March/April 1994 17-27)中可找到用于转化植物的常规技术评论。在EP-A-0449375中还可找到关于植物转化的教导。
在下文中列出了关于转化真菌、酵母和植物的常规教导。
转化的真菌
宿主有机体可以是真菌例如丝状真菌。合适的所述宿主实例包括属于Thermomyces、支顶孢属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、毛霉属(Mucor)、脉孢菌属(Neurospora)、木霉属(Trichoderma)等等的成员。
在US-A-5741665中评述了关于转化丝状真菌的教导，其中指出用于转化丝状真菌并培养真菌的标准技术是本领域中众所周知的。例如可在Davis和de Serres的“Methods Enzymol(1971)17A：79-143”中找到应用于N.crassa的技术的大量综述。
在US-A-5674707中还评述了关于转化丝状真菌的进一步教导。
在一个方面中，宿主有机体可以是曲霉属、例如黑曲霉。
例如，通过下列Turner G 1994(Vectors for genetic manipulation.In：Martinelli S.D.，Kinghorn J.R.(Editors)Aspergillus：50 years on.Progress inindustrial microbiology vol 29.Elsevier Amsterdam 1994.pp.641-666，)的教导，可制备根据本发明的转基因曲霉属。
在Punt等人的“(2002)Trends Biotechnol 2002 May；20(5)：200-6，Archer&Peberdy Crit Rev Biotechnol(1997)17(4)：273-306”，已经评述了在丝状真菌中的基因表达。
转化的酵母
在另一个实施方案中，转基因有机体可以是酵母。
例如，在“Methods Mol Biol(1995)，49：341-54，and Curr Opin Biotechnol(1997)Oct；8(5)：554-60”中，提供了在酵母中异源基因表达的原理的评述。
在这点上，酵母，例如酿酒酵母或毕赤氏酵母(参见FEMS Microbiol Rev(2000 24(1)：45-66)，可作为载体用于异源基因表达。
E Hinchcliffe E Kenny教导了在酿酒酵母中异源基因表达和基因产物的分泌的原理评述(1993，″Yeast as a vehicle for the expression of heterologousgenes″，Yeasts，Vol 5，Anthony H Rose and J Stuart Harrison，Eds.，2nd edition，Academic Press Ltd.)。
已经研究了酵母转化的几种转化方法。例如，通过下列Hinnen等人的“1978，Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75，1929”和Beggs，J D的“1978，Nature，London，275，104”以及Ito，H等人的“1983，JBacteriology 153，163-168”的教导，制备根据本发明的转基因酵母。
使用不同的选择标记(例如营养缺陷型标记、显性抗生素抗性标记)，可选择转化的酵母细胞。
转化的植物/植物细胞
用于本发明的宿主有机体可以是植物。在Potrykus的论文(Annu Rev PlantPhysiol Plant Mol Biol[1991]42：205-225)和Christou的论文(Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)中，可找到对常规技术的评述。
培养和生产
在利于生产所编码的酶的、并利于从细胞和/或培养基回收该酶的条件下，培养用本发明的核苷酸序列转化的宿主细胞。
用于培养细胞的培养基可以是适于培育所述的宿主细胞并获得酶的表达的任何常规培养基。
在细胞表面可显示由重组细胞产生的蛋白质。
酶可从宿主细胞分泌，并且使用公知方法可便利地从培养基回收酶。
分泌
通常，期望将酶从表达宿主分泌到更易于回收酶的培养基中。根据本发明，可基于期望的表达宿主选择分泌前导序列。本发明范围中也可使用杂交信号序列。
异源性分泌前导序列的典型实例是源自真菌淀粉葡萄糖苷酶(AG)基因(如来自曲霉属的18氨基酸和24氨基酸的glaA)、α因子基因(酵母，如酵母、克鲁维氏酵母和汉逊氏酵母)或α淀粉酶基因的序列。
举例来说，在Methods Enzymol(1990，182：132-43)中评述了异源蛋白质在大肠杆菌中的分泌。
检测
用于检测和测定氨基酸序列表达的各种方法是本领域中已知的。实例包括酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射免疫测定法(RIA)和荧光激活细胞分类法(FACS)。
各种标记和偶联技术对于本领域技术人员都是已知的，并可用于各种核酸和氨基酸测定中。
许多公司例如PharmaciaBiotech(Piscataway，NJ)、Promega(Madison，WI)和USBiochemicalCorp(Cleveland，OH)，提供用于这些方法的商业化试剂盒及操作步骤。
适宜的报告分子或标记包括放射性核素、酶、荧光、化学发光或显色剂，以及底物、辅因子、抑制剂、磁性颗粒等等。教导了使用所述标记的专利包括US-A-3,817,837、US-A-3,850,752、US-A-3,939,350、US-A-3,996,345、US-A-4,277,437、US-A-4,275,149以及US-A-4,366,241。
如US-A-4,816,567中所示，也可生产重组免疫球蛋白。
融合蛋白
根据本发明使用的氨基酸序列，可生产作为融合蛋白，例如有助于提取和纯化。融合蛋白配偶体的实例包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、6xHis、GAL4(DNA结合和/或转录激活区)以及(β-半乳糖苷酶)。也可方便地在融合蛋白配偶体和目的蛋白质序列之间含有允许除去融合蛋白序列的蛋白水解剪切位点。
优选地，融合蛋白不影响蛋白质序列的活性。
在“Curr Opin Biotechnol(1995)6(5)：501-6”中已经评述了在大肠杆菌中的基因融合表达系统。
在本发明的另一个实施方案中，氨基酸序列可连接异源序列以编码融合蛋白。例如，为了从肽库筛选能影响物质活性的试剂，编码可表达被商业上可获得的抗体识别的异源表位的嵌合物质可能是有用的。
大规模应用
在本发明的一个优选实施方案中，氨基酸序列用于大规模应用。
在培养宿主有机体后，优选以每升细胞培养物总体积1g至约每升2g的量生产氨基酸序列。
在培养宿主有机体后，优选以每升细胞培养物总体积100mg至约每升900mg的量生产氨基酸序列。
在培养宿主有机体后，优选以每升细胞培养物总体积250mg至约每升500mg的量生产氨基酸序列。
食品
本发明的组合物可用作(或用于制备)食品。本文中，术语“食品”以广义使用，并包括适于人的食品以及适于动物的食品(即，饲料)。在优选的方面中，食品用于人的食用。
食品可以是溶液或固体的形式，这取决于应用的用途和/或方式和/或服用的方式。
食品成分
本发明的组合物可用作食品成分。
如本文所用的术语“食品成分”，包括被或可被加入功能性食品(food)或食品(foodstuff)中的制剂，以及包括能在需要例如酸化或乳化的各种产品中以低水平使用的制剂。
食品成分可以是溶液或固体的形式，这取决于应用的用途和/或方式和/或服用的方式。
食品产品
本发明的组合物可用于制作食品产品，例如一种或多种：糖果产品、乳制品、禽制品、鱼制品和烘烤食品。
本发明也提供制作食品或食品成分的方法，方法包括将根据本发明的脂肪分解酶与另一种食品成分混合。
实施例
现在通过参照仅仅用于举例说明的下图，描述本发明：
图1显示IEC层析后，获得的脂肪酶活性(用阴影部分表示，标记为集合组B)和蛋白质(虚线)的图。
图2显示施加到凝胶上(NUPAGE，4-12％，Mes缓冲液，根据制造商的描述进行制备，Novex，美国)然后进行考马斯亮蓝染色的纯化真菌脂肪分解酶(泳道3-5)。
图3显示色谱图#61。
图4显示来自丁基琼脂糖凝胶柱的馏份的SDS-PAGE(P：集合组#172-174，100U/mL，1∶10稀释；Std＝标准蛋白质组)。
图5显示小烘烤试验，其中1)Chr#61级分9.2)集合组#172-#174；3)Chr.#61级分14.4)对照；5)脂肪酶#3044。
图6显示来自BS8948-2的生面团脂质双半乳糖甘油二酯(DGDG)和双半乳糖甘油一酯(DGMG)的气液色谱分析。
图7显示将所有CBS肽的氨基酸序列与异孢镰孢日本株(Nagao等，1994)的对比。在序列下方，分别用*和·标记相同和相似的(保守的)氨基酸。
图8显示融合了合成α信号序列的合成异孢镰孢(CBS 782.83)脂肪分解酶基因的核苷酸序列及翻译的氨基酸序列。在核苷酸序列下方是氨基酸序列。对含有限制性内切酶位点Eco RI和Bam HI的核苷酸进行下划线，并对翻译起始和终止密码子进行双下划线。箭头标示在α信号序列和脂肪分解酶基因之间的融合位点。箭头表明用于基因组装的引物。
图9显示含有融合了合成α信号序列(αss)的合成异孢镰孢(CBS782.83)脂肪分解酶基因(LIPASE)的汉逊酵母表达载体pB14示意图。URA3，是适于在汉逊酵母中筛选的尿嘧啶互补的乳清苷-5′-磷酸-脱羧酶基因。HARS，是适于在汉逊酵母中复制的自主复制序列。FMD-P，是适于在汉逊酵母中表达的FMD启动子。
图10显示筛选的含有合成异孢镰孢脂肪分解酶基因的多态汉逊酵母克隆的磷脂酶活性。将卵磷脂作为底物，并使用NEFA试剂盒(Roche)测定游离脂肪酸。
图11显示用增加剂量(PLU)的磷脂酶样品205和LipopanFTM烘烤的小面包。
图12显示生面团脂质的气液色谱分析。DGDG＝双半乳糖甘油二酯。DGMG＝双半乳糖甘油一酯。总和＝DGDG+DGMG(实施例3)。
图13显示HPTLC色谱图，A)参照：1.分馏的面粉脂质；2.水解的DGDG；3.DGDG。B)从生面团提取的脂质：4.对照；5.2000 PLU-7/kg的样品205；6.40ppm LipopanFTM。
图14显示在用衍生于异孢镰孢的脂肪分解酶处理的生面团中，异构体半乳糖-甘油一酯的气液色谱分析。
图15显示衍生于异孢镰孢的脂肪分解酶活性，其中通过在pH7.0、各种温度时对卵磷脂底物进行酶反应10分钟、并随后通过NEFA C法测定游离脂肪酸而测定脂肪分解酶活性。
图16显示衍生于异孢镰孢的脂肪分解酶活性，其中在3 TIPU/ml的50mM磷酸盐缓冲液中和各种温度(50 mM磷酸盐缓冲液，pH7.0)下温育30分钟后，通过在37℃、pH 7.0时对卵磷脂底物(无CaCl2)进行酶反应10分钟、并随后通过NEFA C法测定游离脂肪酸而测定脂肪分解酶活性。
图17显示衍生于异孢镰孢的脂肪分解酶活性，其中在37℃和各种pH(50mM磷酸盐缓冲液)下对卵磷脂底物(无CaCl2)进行酶反应10分钟并随后通过NEFA C法测定游离脂肪酸之后而测定脂肪分解酶活性。
图18显示衍生于异孢镰孢的脂肪分解酶活性，其中在3TIPU/ml的50mM磷酸盐缓冲液中和各种pH(50mM磷酸盐缓冲液)下温育30分钟后，通过在37℃、pH7.0时对卵磷脂底物(无CaCl2)进行酶反应10分钟、并随后通过NEFA C法测定游离脂肪酸而测定脂肪分解酶活性。
图19a和图19b显示通过SDS-PAGE法鉴定衍生于异孢镰孢的脂肪分解酶的分子量。
图20描述根据本发明的脂肪分解酶的最适温度。在各种温度下实施酶反应。
图21描述在酶修饰型蛋黄中与反应时间有关的卵磷脂量。A：30℃，B：40℃，C：50℃。通过LC/MS-MS分析卵磷脂量，并可用蛋黄百分率表示。
图22描述在酶修饰型蛋黄中与反应时间有关的溶血卵磷脂量。A：30℃，B：40℃，C：50℃。通过LC/MS-MS分析卵磷脂量，并可用蛋黄百分率表示。
图23描述在酶修饰型蛋黄中与反应时间有关的游离脂肪酸量。A：30℃，B：40℃，C：50℃。通过NEFAC法分析游离脂肪酸量，并可用蛋黄百分率表示。
图24描述用根据本发明的脂肪分解酶进行酶转化蛋黄(实施例4)。与反应时间有关的溶血卵磷脂(A)、游离脂肪酸(B)、卵磷脂(C)量。误差线表明两次测定的标准偏差(n＝2)。通过LC/MS-MS测定卵磷脂量和溶血卵磷脂量，并通过NEFA C法测定游离脂肪酸量。结果用蛋黄百分率表示。
图25描述用来自Novozymes A/S的LecitaseUltra磷脂酶进行酶转化蛋黄(实施例4)。与反应时间有关的溶血卵磷脂(A)、游离脂肪酸(B)、卵磷脂(C)量。误差线表明两次测定的标准偏差(n＝2)。通过LC/MS-MS测定卵磷脂量和溶血卵磷脂量，并通过NEFA C法游离脂肪酸量。结果可用蛋黄百分率表示。
图26显示来自修饰的蛋黄脂质提取物的薄层色谱分析(溶剂是氯仿∶甲醇∶水(65∶24∶4))(实施例4)。1：PC和LPC标准。2：在10℃、240分钟时，根据本发明的脂肪分解酶。3：在20℃、240分钟时，根据本发明的脂肪分解酶。4：在53℃、240分钟时，根据本发明的脂肪分解酶。5：在20℃、1440分钟时，根据本发明的脂肪分解酶。6：在10℃、4h时，LecitaseUltra。7：在20℃、240分钟时，LecitaseUltra。8：在53℃、4h时，LecitaseUltra。9：在20℃、1440分钟时，LecitaseUltra。10：对照样品。薄层色谱板的左侧所列的化合物是胆固醇(C)、甘油三酰酯(TG)、甘油二酰酯(DG)、游离脂肪酸(FFA)、甘油一酰酯(MG)、磷脂酰乙醇胺(PE)、卵磷脂(PC)、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)、以及溶血卵磷脂(LPC)。
图27描述在分别用本发明的脂肪分解酶和LecitaseUltra磷脂酶对蛋黄进行酶反应的期间，在溶血卵磷脂和游离脂肪酸含量变化的关系(实施例4)。结果以溶血卵磷脂的摩尔量523和游离脂肪酸的摩尔量283为基准。通过NEFA C法测定游离脂肪酸。通过LC/MS-MS测定溶血卵磷脂和卵磷脂。
图28显示来自修饰的蛋黄的脂质提取物的高效薄层色谱分析(溶剂是对-醚∶MTBE∶乙酸(50∶50∶1))(实施例4)。薄层色谱板的左边列出的化合物是甘油三酰酯(TG)、游离脂肪酸(FFA)、1，3甘油二酰酯(1，3DG)、1，2甘油二酰酯(1，2DG)、胆固醇(C)、甘油一酰酯(MG)、磷脂酰乙醇胺(PE)、卵磷脂(PC)、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)、以及溶血卵磷脂(LPC)。
图29显示用来自SanofaA/S的酶处理的蛋黄而制备的蛋黄酱进行薄层色谱分析(溶剂IV)(实施例5)。
图30显示用来自SanofaA/S的酶处理的蛋黄而制备的蛋黄酱在微波炉中进行热处理(实施例5)。样品1是添加水而不是酶液的对照，样品2含有30U/g的根据本发明的脂肪分解酶以及样品3含有30U/g的LecitaseUltra。
图31显示单独用不同浓度的、根据本发明的脂肪分解酶或联合PanodanM2020 DATEM乳化剂所烘烤的硬壳面包卷的具体体积，同时针对LipopanFTM和DATEM以及纯LipopanFTM或纯DATEM的组合进行了测试。
图32显示单独用不同浓度的、根据本发明的脂肪分解酶或联合PanodanA2020 DATEM或SSL P 55乳化剂所烘烤的硬壳面包卷的具体体积，并且针对LipopanFTM/SSL P 55或LipopanTM/DATEM以及纯Lipopan F、纯DATEM和纯SSL P 55的组合进行了测试。
图33显示F.semitectum(IBT 9507)脂肪酶cDNA的核苷酸序列(SEQ IDNo.5)和推导的氨基酸序列(SEQ ID No.4)。核苷酸序列上方为推导的氨基酸序列。箭头表示用于扩增cDNA的引物。
图34显示含有融合了α信号序列(αss)的F.semitectum脂肪酶(Lipase)的汉逊酵母表达载体pDB14-alp-sem示意图。AP(R)、URA3，是用于筛选的尿嘧啶互补的乳清苷-5′-磷酸-脱羧酶基因。HARS，是适于在汉逊酵母中复制的自主复制序列。FMD-P，是适于在汉逊酵母中表达的FMD启动子。
图35显示与温度有关的、来自半裸镰孢IBT9507的脂肪分解酶的磷脂酶活性。
图36显示与pH有关的、来自半裸镰孢IBT9507的脂肪分解酶的磷脂酶活性。
图37显示衍生于异孢镰孢的真菌脂肪分解酶的氨基酸序列(SEQ IDNo.1)。
图38显示衍生于异孢镰孢的真菌脂肪分解酶的、并包含N端信号序列(下划线)的氨基酸序列(SEQ ID No.2)。
图39显示编码根据本发明的、并衍生于异孢镰孢的真菌脂肪分解酶的核苷酸序列(SEQ ID No.3)。
图40显示衍生于半裸镰孢的脂肪分解酶的氨基酸序列(SEQ ID No.4)。
图41显示编码衍生于异孢镰孢的脂肪分解酶的核苷酸序列(SEQ IDNo.5)。
图42显示衍生于异孢镰孢的脂肪分解酶的氨基酸序列(SEQ ID No.6)，其中EAEA是最初来自α因子信号序列的前肽。
图43显示衍生于异孢镰孢的包含α因子信号序列的脂肪分解酶的核苷酸序列(SEQ ID No.7)。
实施例1.异孢镰孢脂肪分解酶的表达、纯化、测序和烘烤试验。
发酵
从Centraalbureau voor Schimmelcultures(荷兰)处获得异孢镰孢CBS782.83株。
培养基
葡萄糖-酵母抽提琼脂
酵母抽提物        4g/L
KH2PO4            1g/L
MgSO4，7H2O       0.5g/L
葡萄糖            15g/L
琼脂              20g/L
高压灭菌后加入葡萄糖
1.4  预发酵培养基
豆粉              50g/L
单水合葡萄糖      50g/L
KH2PO4            2g/L
Na2HPO4           3g/L
大豆油            1g/L
在带档板的500mL摇瓶中制备培养基，并每摇瓶加入100mL培养基。将大豆油分别加入每个烧瓶。
高压灭菌后加入葡萄糖。
制备培养基
蛋白胨            10g/L
Tween TM-80       12g/L
MgSO4，7H2O       2g/L
CaCl2，2H2O       0.1g/L
在带档板的500mL摇瓶中制备培养基，并每摇瓶加入100mL培养基。将TM-80分别加入每个烧瓶中。
高压灭菌前将pH调至6.0。
培养条件
将异孢镰孢CBS 782.83接种到葡萄糖-酵母提取物琼脂平板上，并在24℃进行培养直至产生孢子。
用含有良好孢子形成培养物的、4cm2的琼脂块接种含有预发酵培养基的摇瓶。将摇瓶在30℃和200 RPM下进行培养。生长三天后，用5mL来自预发酵摇瓶的液体发酵培养基分别接种30个生产培养基摇瓶。将生产培养基摇瓶在30℃和200 RPM下进行培养。
在生长2、3和4天后，收集十个生产培养基摇瓶。
通过离心随后将上清通过来自Gelman Laboratory的0.2μm过滤器(VacuCap 90 Filter Unit w/0.2μm Supor Membrane)进行过滤除菌，来除去生物量。过滤后，将滤液在-80℃冰冻并保藏，直到用于分析。
分析步骤
根据前述的“PLU分析法”，测定磷脂酶活性。
应用
TLC分析
在加热橱中活化薄层色谱板(110℃)1/2小时。
将100mL洗脱缓冲液倒入有盖的层析小室。用滤纸(Whatman 2)包裹室壁以用溶剂蒸汽饱和小室。
将薄层色谱板放入框架，并将样品加到距离底部2厘米的薄层色谱板上。然后将薄层色谱板放入有所选洗脱缓冲液的薄层色谱小室。当洗脱缓冲液到达距离平板底部14厘米时，取出薄层色谱板并在通风板(fume board)上干燥，随后放在加热橱中于110℃放置10分钟。
然后将薄层色谱板浸于显色剂中，并在加热橱中于110℃干燥15分钟。
洗脱缓冲液：
Nr.IV：氯仿∶甲醇∶H2O(65∶25∶4)
Nr.I：对-醚∶甲基叔丁醚(MTBE)∶乙酸(60∶40∶1)
显色缓冲液(钒酸盐缓冲液)：
将32g Na2CO3加入300mL H2O(1M)。
当在“BACO-LINE”烘箱中慢慢加热和烘烤6分钟时，加入并溶解18.2g五氧化钒(V2O5)。
溶液冷却至室温。
小心加入460mL 2.5M H2SO4(460mL H2O+61mL H2SO4)。
加水直至1000mL。
气相色谱
Perkin Elmer 8420毛细管气相色谱仪，配备有WCOT熔融硅柱(12.5m×0.25mm ID×0.1μm，5％苯基甲基硅酮(CP Sil 8 CB来自Crompack)。
载气：氦气。
注射器：1.5μL，并有裂口。
检测器：FID，385℃。
恒温箱程序：       1    2    3    4
恒温箱温度[℃]     80   200  240  360
等温时间[分钟]     2    0    0    10
温度速率[℃/分钟]  20   10   12
样品制备：将50mg小麦脂质溶于含有2mg/mL十七烷内标物的12mL庚烷：吡啶(2∶1)。将500μl样品转入曲管中。加入100μl MSTFA(N-甲基-N-三甲基甲硅烷-三氟乙酰胺)，并将反应物在90℃下温育15分钟。
计算：从这些组分的参照混合物，测定对于甘油一酸酯、甘油二酸酯、甘油三酯、游离脂肪酸以及半乳糖脂的反应系数。根据这些反应系数，计算生面团中的脂质。
小烘烤测试
将下列成分加入50g Brabrender混料罐并在30℃揉捏5分钟：50g面粉、10g干酵母、0.8g糖、0.8g盐、70ppm抗坏血酸以及水(直至400Brabender单位的生面团稠度)。在34℃静置10分钟。每个生面团称取15g的生面团。然后在可将生面团在木板和有机玻璃框之间进行滚轧的特殊装置中进行制模。将生面团在罐中于34℃下发面45分钟，并在Voss家庭烤箱中于225℃下烘烤8分钟。
烘烤后，面包冷却至室温并放置20分钟。称取面包，并通过油菜籽取代法测定体积。切开面包，评价团粒以及面包皮。
实验性烘烤试验(硬皮面包卷)
将改良的丹麦面粉1500g、压缩酵母90g、糖24g、盐24g、水400Brabender单位+2％在Hobart搅拌器中，用钩以低速2分钟和以高速9分钟进行捏制。生面团温度是26℃。称取1350克生面团。将生面团在30℃下静置10分钟，并用Fortuna模具进行制模。然后将生面团在34℃下发面45分钟。将生面团在Bago烤箱中于220℃烘烤18分钟并蒸12秒。冷却后，称取面团卷，并通过油菜籽取代法测量面包卷体积。
具体的面包体积
具体体积＝(面包体积，ml)/(面包重量，克)
结果与讨论
发酵
分析发酵样品的磷脂酶活性，结果如表1所示。
表1发酵结果
  ID   有机体     样品标记      PLU-7
  172  异孢镰孢CBS 782.83     a培养基D.2天  35
  173  异孢镰孢CBS 782.83     培养基D.3天   33
  174  异孢镰孢CBS 782.83     培养基D.4天   26
  a培养基D＝生产培养基
已经知道磷脂酶活性在第2天、第3天和第4天是几乎相同的，因此可集中所有的样品，并命名为JBS-2254-97-3。
纯化和测序
使用阴离子交换层析法从粗提物纯化磷脂酶：
根据制造商(Amersham Bio.)所述，制作层析柱(Q-Sepharose FF，1.5 X2.8cm，5mL凝胶)，然后在20mM tris/HCl缓冲液、0.1M NaCl(pH7.5，缓冲液A)中平衡。对样品(15mL)添加0.1M NaCl，并以3.5mL/分钟的流速施加到层析柱上。用0-0.6M NaCl线性梯度的缓冲液A洗脱脂肪分解酶(参见图1)。在整个过柱期间，收集3.5mL馏份。将10μl每种馏份进行点滴板测定。通过三丁酸甘油酯和卵磷脂点滴板测定法，来测定脂肪酶活性(将10μl每种馏份转入孔中，并将平板在40℃下温育。在琼脂糖胶中晕的形成可作为时间函数。也可将没有酶的空白加入一个孔中来用于对比)。然后将含有解脂活力的馏份进行SDS-PAGE(参见图2)和N末端分析。
根据MALDI-TOF和氨基酸测序法的酶促指纹图谱
用二硫苏糖醇还原蛋白质，并使用碘乙酰胺通过羧甲基化作用保护半胱氨酸残基。通过胰蛋白酶裂解蛋白质，并通过MALDI-TOF分析来检验胰蛋白酶肽的片段化方式。通过在C18反相高效液体色谱层析柱上层析来分离肽，并通过MALDI-TOF分析监测纯化度。根据以前在TR6452中详细所述，根据Edman降解法测定氨基酸序列。
已经确定异孢镰孢脂肪分解酶的全部氨基酸序列。通过胰蛋白酶的消化，可得到非常特殊的肽，其中确实可测定其分子量(MW)(MALDI-TOF)。根据Edman降解法也可确定所有肽的氨基酸序列。根据Edman降解法确定的氨基酸序列，包括异孢镰孢脂肪分解酶99.64％的多肽链。
表2中显示了MALDI-TOF和Edman降解法研究的概要。
表2来自异孢镰孢脂肪分解酶的胰蛋白酶肽的酶促指纹图谱和分子量，和根据Edman裂解法全部氨基酸序列的测定。
  异孢镰孢脂肪分解酶(2254-97-3)
编号 来自  序列  M+H计算值  M+H观察值
1 1-13  AVGVTSTDFTNFK  1387.5
2+ 14-33  FYIQHGAAAYCNSGTAAGAK  2059.2  2059.0
3+ 34-59  ITCSNNGCPTIESNGVTVVASFTGSK  2701.9
4+ 60-72  TGIGGYVSTDSSR  1300.4
5+ 73-73  K  147.2
6+ 74-80  EIVVAIR  780.0  780.0
7 81-86  GSSNIR  632.7
 8+  87-128  NWLTNLDFDQSDCSLVSGCGVHSGFQNAWAEISAQASAAVAK  4514.8
 9  129-130  AR  246.3
 10  131-131  K  147.2
 11  132-137  ANPSFK  663.8
 12+  138-158  VVATGHSLGGAVATLSAANLR  1966.3  1966.1
 13+  159-173  AAGTPVDIYTYGAPR  1552.7  1552.6
 14+  174-192  VGNAALSAFISNQAGGEFR  1910.1  1910.0
 15  193-197  VTHDK  599.7
 16  198-202  DPVPR  583.7
 17+  203-211  LPPLIFGYR  1076.3  1076.3
 18+  212-226  HTTPEYWLSGGGGDK  1605.7
 19+  227-235  VDYAISDVK  1010.1
 20a  236-274  VCEGAANLMCNGGTLGLDIDAHLHYFQATDACNAGGFSW*  4231.5  4233.2
 20b+  236-275  VCEGAANLMCNGGTLGLDIDAHLHYFQATDACNAGGFSW*R  4387.7  4387.8
+＝根据Edman测序法证实的                                        *＝氧化的色氨酸
序列覆盖率＝99.64％
在SEQ ID No.1中显示异孢镰孢脂肪分解酶的氨基酸全序列(参见图37)。
应用试验
通过在Amicon超滤装置上进行超滤(10kDa滤径)，将2升来自异孢镰孢的三种样品(表1)的集合组(标记的集合组#172-174)进行浓缩。250ml滞留物含有约100 PLU-7/ml。将滞留物调节至1M乙酸铵并施加到27ml丁基琼脂糖凝胶层析柱上(2.5cm id.)，并用缓冲液A(20mM TEA中的1M乙酸铵，pH7.4)和缓冲液B(20mM TEA，pH7.4)进行洗脱。图3中显示了纯化的色谱图(#61)。
图4中显示了通过SDS-PAGE，分析来自色谱图#61的馏份。
从该层析柱收集10mL馏份，并如表3中所示，进行分析磷脂酶活性。这些结果表明在色谱主峰洗脱的馏份中，具有相当高的磷脂酶活性量。少量活性不结合层析柱，而是在之前被洗脱的。尽管SDS胶不会跑得如此完美，可观察到馏份含有几种蛋白质，但是馏份14和馏份15含有一条主要带，预计这是真菌脂肪分解酶。
表3
    色谱#61.     PLU-7
    馏分8     32
    馏分9     89
    馏分10     69
    馏分11     51
    馏分12     39
    馏分13     81
    馏分14     23
    馏分15     17
来自色谱#61的馏份9和馏份14可用于小烘烤试验，并且在小烘烤试验中测试了未纯化的集合组#172-174。表4显示了这些烘烤实验的结果。结果清楚地表明：就改善面包体积而言，来自异孢镰孢CBS 782.83的、纯化的脂肪分解酶产生很好的烘烤结果。未纯化的样品也利于很好的面包体积。如图5所示，异孢镰孢脂肪分解酶也可很大改善面包的团粒结构，并评价其优于来自Pseudomonas cepacia#3044的脂肪酶。
表4
样品 酶 PLU-7/50g面粉 面包体积，mL/g
1 Chr#61馏分9 100U 4.33
2 集合组#172-174 100U 4.33
3 Chr#61馏分14 100U 4.60
4 对照 0 3.29
5 脂肪酶，#3044     40ppm     4.38
用水饱和的丁醇抽提微烘烤实验中的生面团，并通过薄层色谱分析脂质。薄层色谱分析证实脂肪酶#3044比来自异孢镰孢样品的脂肪分解酶，具有对甘油三酯更高的活性。游离脂肪酸(FFA)的数量，也高于脂肪酶#3044。在溶剂IV中的薄层色谱表明：与甘油三酯水解脂肪酶#3044相比，组分(DGMG)在用异孢镰孢处理生面团脂质的样品中含量明显更高。
在实验性烘烤试验中，也可测试来自异孢镰孢的纯化馏份，其结果如表5所示。
表5在实验性烘烤试验中来自异孢镰孢的纯化层析馏份的用途和对面包体积的影响。
   NO.     具体体积(ccm/g)
   1     对照     5.11
   2     500U异孢镰孢集合组#172-#174     6.28
   3     1000U异孢镰孢集合组#172-#174     6.79
   4     40ppm#3044(假单孢菌)     5.27
   5     2000U异孢镰孢集合组#172-#174     6.24
   6     4000U异孢镰孢集合组#172-#174     4.95
   7     1000U2254-97C61     6.95
   8     40ppm#3016(LipopanFTM)     6.97
用水饱和的丁醇抽提来自烘烤试验的生面团，并通过气液色谱(GLC)分析生面团脂质，其结果如表6所示。
表6  生面团脂质的气液色谱分析。GL＝甘油。FFA＝游离脂肪酸。MGMG＝单半乳糖甘油一酯。DAG＝甘油二酯。DGMG＝双半乳糖甘油一酯。MGDG＝单半乳糖甘油二酯。DGDG＝双半乳糖甘油二酯。TRI＝甘油三酯。
                                GL FFA MGMG DAG DGMGMGDG DGDG TRI
对照  0.120  0.152  0.0015  0.0771  0.0195  0.0644  0.172  0.770
500U异孢镰孢集合组#172-#174 0.121 0.250 0.012 0.059 0.057 0.030 0.139 0.792
1000U异孢镰孢集合组#172-#174 0.121 0.277 0.018 0.056 0.087 0.010 0.102 0.738
40ppm#3044  0.127  0.368  0.002  0.132  0.022  0.066  0.173  0.276
2000U异孢镰孢集合组#172-#174 0.122 0.320 0.018 0.060 0.119 0.013 0.062 0.723
4000U异孢镰孢集合组#172-#174 0.128 0.332 0.021 0.065 0.146 0.010 0.033 0.739
1000U 2254-97 C61  0.125  0.287  0.019  0.067  0.088  0.016  0.099  0.655
40ppm#3016  0.124  0.284  0.017  0.058  0.086  0.014  0.101  0.723
在表7中显示了与甘油三酯水解作用相比，DGDG水解作用比率。
在图6中，也图解说明了半乳糖脂的气液色谱分析。
气液色谱结果证实在生面团中，由异孢镰孢产生的DGMG量高于40ppm Lipopan F(#3016)的产生量。结果也表明MGDG比DGDG具有更高程度的水解的作用。结果也表明与正常甘油三酯水解酶如来自P.cepacia的#3044相比，水解的甘油三酯的数量更低。试验规模的烘烤结果和脂质分析证实来自异孢镰孢CBS 782.83的脂肪分解酶，对于在生面团中双半乳糖甘油二酯(DGDG)和双半乳糖甘油一酯(DGMG)的形成具有明显的水解活性。
表7与来自异孢镰孢的纯化层析馏份的甘油三酯水解作用相比，DGDG的水解作用比率
  dTRI     dDGDG    dDGDG/dTRI
对照
500U异孢镰孢集合组#172-#174 0 0.033 n/a
1000U异孢镰孢集合组#172-#174 0.032 0.07 2.19
40ppm#3044   0.494   0     n/a
2000U异孢镰孢集合组#172-#174 0.047 0.11 2.34
4000U异孢镰孢集合组#172-#174 0.031 0.139 4.4
1000U 2254-97 C61   0.115   0.073     0.63
40ppm#3016   0.047   0.071     1.5
4.结论
研究中，通过在摇瓶中发酵，生产来自异孢镰孢CBS 782.83的真菌脂肪分解酶。纯化酶并测定氨基酸序列。该酶与来自F.oxysporum的商业化脂肪酶(LipopanFTM)具有约83％同源性。就改善面包体积和团粒结构而言，该酶在烘烤试验中可产生很好的结果。对生面团脂质分析，证实在生产半乳糖苷甘油一酯期间，酶对半乳糖脂是有活力的。不进行任何剂量优化，烘烤结果表明来自异孢镰孢CBS 782.83的真菌脂肪分解酶至少相当于商业化酶LipopanF，并且比较DGDG对甘油三酯的活性表明与LipopanFTM相比，该酶在生面团环境中具有优越的酶活性。
实施例2.在多态汉逊酵母中，构建和表达编码来自异孢镰孢(CBS782.83)的脂肪分解酶的合成基因。
测定从异孢镰孢(CBS 782.83)分离的真菌脂肪分解酶的氨基酸序列，并用于设计和克隆适于在多态汉逊酵母中表达的合成脂肪分解酶基因。为了有利于高表达，优化合成基因的密码子以符合多态汉逊酵母的密码子偏爱性。合成密码子优化的α-因子信号序列，同时克隆到合成脂肪分解酶基因的上游。将组配的构建体转移入表达载体pB14并转化入多态汉逊酵母。pB14是无抗生素抗性基因的质粒，因此可用于生产元件中。
筛选大量的生产脂肪分解酶的镰孢菌属菌株，其中当与甘油三酯相比，所述的菌株对半乳糖脂和/或磷脂具有高活性比。
已经筛选了几种菌株以生产目的脂肪分解酶。这些当中是异孢镰孢(CBS 782.83)。因此已分离来自该菌株的脂肪分解酶并已确定其氨基酸序列。将氨基酸序列反向翻译为核酸序列，这可用于设计并构建适于在多态汉逊酵母中表达的合成基因。
实验
研究中用到的汉逊酵母株是尿嘧啶营养缺陷型多态汉逊酵母株RB11(odcl)，购自Rhein Biotech GmbH(Düsseldorf，德国)。
根据MALDI-TOF和氨基酸测序法的酶促指纹图谱。
从异孢镰孢(CBS 782.83)分离具有脂肪分解酶活性的蛋白质。用二硫苏糖醇还原蛋白质，并用碘乙酰胺通过羧甲基化作用保护半胱氨酸残基。通过胰蛋白酶裂解蛋白质，并通过MALDI-TOF分析法检定胰蛋白酶肽的片段化方式。通过在C18反相高效液体色谱层析柱上进行层析来分离肽，并通过MALDI-TOF分析法监测纯化度。根据以前在TR6452中详细地描写，通过Edman降解法测定氨基酸序列。
合成脂肪分解酶基因的设计和构建
通过与异孢镰孢日本株(Nagao等，1994)进行比对，对肽片段的氨基酸序列进行排序。因此，将得到的完整氨基酸序列反向翻译成核酸序列，以显示所有可能的密码子。根据在多态汉逊酵母中表达的基因的密码子偏好表，对于每个密码子，选择最适于在多态汉逊酵母中表达的密码子。合成每个约100核苷酸长、包括全长基因的合成寡核苷酸，并通过PCR组装该基因。用上游引物(alps.cbss)和下游引物(cbss.t)最终扩增该基因，其中设计上游引物具有α因子信号序列3′端的最5′的核苷酸以允许框内融合，设计下游引物具有适于克隆目的的Bam HI限制性内切酶位点(表8)。
用寡核苷酸以偏好密码子同样合成编码酵母α交配因子信号序列的核苷酸序列，并通过PCR扩增。用上游引物(alpsynt)和下游引物(cbss.alps)最终扩增α信号序列，其中设计上游引物具有适于克隆目的的Eco RI限制性内切酶位点，设计下游引物具有合成的脂肪分解酶基因5′端的最5′序列以允许框内融合(表8)。
为了将合成的α因子信号序列融合到合成的脂肪分解酶基因，混合这两种片段，并用外引物alpsynt和cbss.t重新扩增(表8)。将PCR产物克隆入载体pCR 2.1-TOPO(Invitrogen)，并使用BigDye Terminatorv3.0循环测序试剂盒(Applied Biosystems)和ABI Prism 3100 Genetic分析仪(AppliedBiosystems)测定插入片段的核苷酸序列。
表8.用于扩增和组装合成的异孢镰孢(CBS 782.83)的脂肪分解酶基因和合成的α信号序列的引物序列。下划线的是导入的、用于克隆目的的限制性内切酶位点。所包括的允许合成的脂肪分解酶基因和合成的α信号融合的核苷酸加以双下划线。
脂肪分解酶在多态汉逊酵母中的表达。
将组合的α信号序列/脂肪分解酶基因在FMD启动子之后插入汉逊酵母表达载体pB14(无抗生素抗性基因的质粒)，来在汉逊酵母表达合成的异孢镰孢(CBS 782.93)脂肪分解酶基因。在E.coli中形成期望的组装质粒结构后，将质粒通过电穿孔法转化入感受态多态汉逊酵母细胞。在YND平板上筛选转化子，并通过在YND液体培养基中以1∶200稀释度传代3次和8次，进一步选择基因多次整合的菌落。最后，通过在YPD培养基中转移两次，来稳定选择的培养物。为了进一步选择高表达的培养物，将显示高水平表达的各个培养物铺平板以形成单个菌落，其中测定每个菌落的表达水平。
为了确定脂肪分解酶基因的表达水平，将选择的克隆在含1.8％甘油和0.2％葡萄糖的YPD中于24℃培养2天。
酶活性
分析培养基样品对作为底物的卵磷脂或DGDG的脂肪分解酶活性，并使用等比例缩小至适于微滴度板的体积的NEFA试剂盒(Roche)来测定释放的游离脂肪酸。
结果
根据MALDI-TOF的酶促指纹图谱和氨基酸测序
已经确定异孢镰孢脂肪分解酶的整个氨基酸序列(参见SEQ ID No.1，图37)。用胰蛋白酶进行酶切消化，可得到可被明确测定分子量(MALDI-TOF)的非常具体的肽。也通过Edman降解法测定所有肽的氨基酸序列。通过Edman裂解法测定的氨基酸序列包含异孢镰孢(CBS 782.83)脂肪分解酶的99.64％多肽链。将所有肽的氨基酸序列比对异孢镰孢日本株的脂肪酶(Nagao等，1994 J.Biochem.116：536-540)，由此表明鉴定成熟蛋白质的氨基酸序列的肽排序。图7显示了比对。表9显示MALDI-TOF和Edman降解法的研究概要，其中根据与Nagao序列的比对进行肽排序。
异孢镰孢 磷脂酶(2254-97-3) 部分裂解
编号 来自 序列 M+H计算值 M+H观测值 肽 M+H计算值 M+H观测值
1 1-13  AVGVTSTDFTNFK 1387.5
2+ 14-33  FYIQHGAAAYCNSGTAAGAK 2059.2 2059 1+2 3427 3427
3+ 34-59  ITCSNNGCPTIESNGVTVVASFTGSK 2701.9
 4+ 60-72  TGIGGYVSTDSSR  1300.4  3+4+5  4111  4112
 5+ 73-73  K  147.2
6+ 74-80 EIVVAIR 780.0  780.0 4+5+6 2209 2209
 7 81-86  GSSNIR  632.7
8+ 87-128  NWLTNLDFDQSDCSLVSGCGVHSGFQNAWAEISAQASAAVAK 4514.8 7+8 5129 5129
9 129-130 AR 246.3 8+9 4743 4743
10 131-131 K 147.2
11 132-13 ANPSFK 663.8
12+ 138-158 VVATGHSLGGAVATLSAANLR 1966.3 1966  10+11+12 2739 2739
13+ 159-17 AAGTPVDIYTYGAPR 1552.7 1552
14+ 174-192 VGNAALSAFISNQAGGEFR 1910.1 1910
15 193-19 VTIIDK 599.7
16 198-20 DPVPR 583.7
17+ 203-211 LPPLIFGYR 1076.3 1076  15+16+17 2221 2221
18+ 212-226 HTTPEYWLSGGGGDK 1605.7
19+ 227-23 VDYAISDVK 1010.1 18+19 2596 2596
20a  236-274  VCEGAANLMCNGGTLGLDIDAHLHYFQATDACNAGGFSW* 4231.5 4232
 20b+  236-275  VCEGAANLMCNGGTLGLDIDAHLHYFQATDACNAGGFSW*R 4387.7 4387
表9.通过Edman裂解来自异孢镰孢(CBS 782.83)脂肪分解酶的胰蛋白酶肽，对整个氨基酸序列进行酶促指纹图谱和分子量测定。由Edman降解法确定的肽序列标示为+。氧化色氨酸表示为*。序列覆盖度＝99.64％。
与其它镰孢属脂肪酶的同一性
异孢镰孢(CBS 782.83)脂肪分解酶的氨基酸和核苷酸序列与来自其它镰孢菌属脂肪酶的序列对比，显示在一些镰孢菌属脂肪酶之间的关系(表10)。
脂肪酶同一性 异孢镰孢(Nagao同上) 尖孢镰孢(Lipopan FTM)
异孢镰孢(CBS 782.83)氨基酸(SEQ ID No.1) 58.7％ 85.1％
异孢镰孢(CBS 782.83)核苷酸序列(SEQ ID No.3) 61.8％ 69.2％
表10.异孢镰孢(CBS 782.83)脂肪分解酶与其它镰孢菌属脂肪酶相比的氨基酸和核苷酸同一性。
对脂肪分解酶基因和α信号序列的合成寡核苷酸进行混合和PCR扩增，产生被克隆和测序的DNA片段。使用表8所示的引物并通过重扩增，将含有正确序列的片段用于组装全长基因。图8中显示具有其翻译的氨基酸序列的、组装的核苷酸序列，并用箭头表示引物。
利用导入的限制性内切酶位点，将含有组装的基因构建体的DNA片段转移入汉逊酵母表达载体pB14。图9图解显示得到的质粒pB14-alps.cbss。
在选择的克隆中，真菌脂肪分解酶活性的表达。
对于已经过选择处理的克隆，分析脂肪分解酶的表达。将培养2天的培养物上清的10微升样品与DGDG或卵磷脂温育10分钟，并通过NEFA试剂盒分析10微升的这些反应。图10中显示单菌落分离后，在克隆中的3个克隆结果。
已测定来自异孢镰孢(CBS 782.83)株的脂肪分解酶的氨基酸序列，并已构建和优化了编码该脂肪分解酶的合成基因以适于在多态汉逊酵母中表达。将编码成熟酶的基因融合于衍生于酵母交配α因子的合成信号序列。以前已描述了α信号序列联合汉逊酵母pB14载体的FMD启动子，可适于表达镰孢属的脂肪酶。
实施例3：异孢镰孢CBS 782.83脂肪分解酶在多态汉逊酵母中的表达和产物在烘烤试验中的鉴定
以补料分批法，对含有来自丝状真菌异孢镰孢CBS782.83的脂肪分解酶编码基因的多态汉逊酵母株B14：8-3，8(DCDK0172)进行发酵。发酵160小时后，磷脂酶活性达到1200U/mL。基于发酵制备了三种产物和进一步测试。将产物称为下列：样品205、-206和-209。
在小规模烘烤实验中，测试来自异孢镰孢的、在H.polymorpha表达的脂肪分解酶样品205。通过气液色谱和高效薄层色谱分析烘烤实验中的生面团。
小规模烘烤得到的烘烤结果证实脂肪分解酶样品205对面包体积和团粒结构有很强的改善作用。脂肪分解酶分析证实脂肪分解酶样品205对双半乳糖甘油二酯(DGDG)具有强水解活性，同时伴随双半乳糖甘油一酯(DGMG)的累积。
该酶对生面团中甘油三酯仅有较小活性。
在试验规模烘烤试验中，测试样品206和样品209，并证实对于增加面包体积和改善团粒结构而言，脂肪分解酶具有良好的烘烤性能。根据烘烤试验表明在直接面团法中，样品206表现稍好于样品209，然而这两种产物并没有进行直接相互比较，因此必须进行更多的烘烤试验来证实这点。
2.实验
发酵
微生物
本研究使用如在实施例2中所述通过含有来自异孢镰孢CBS 782.83的脂肪分解酶基因的质粒转化的H.polymorpha株。构建物中用到的启动子是来自H.polymorpha的甲酸脱氢酶启动子。
培养基和培养条件
YNB甘油培养基
用于制备生物反应器发酵接种物和用于在摇瓶中培养的培养基含有：1.7g/L酵母氮基(Yeast Nitrogen Base)(DIFCO，底特律，美国，0335-15-9)、5g/L(NH4)2SO4、10g/L甘油、以及作为缓冲液的0.1M2-[N-吗啉代]乙磺酸(MES)。用4M NaOH调节pH至6.1(MES的pKa)(高压灭菌前)。高压灭菌后，酵母氮基和(NH4)2SO4经过滤除菌加至培养基。该培养基用于在摇瓶中培养(在总体积500mL的摇瓶中，加250mL培养基)。
YNB琼脂
用于存贮培养物(在25％(w/v)甘油中于-80℃保藏)铺平板的确定成份培养基含有：1.7g/L酵母氮基(DIFCO，底特律，美国，0335-15-9)、5g/L(NH4)2SO4、10g/L甘油、以及20g/L琼脂(DIFCO，底特律，美国，0140-01)。高压灭菌后将酵母氮碱和(NH4)2SO4经过滤除菌加至培养基。
YPD培养基
营养丰富培养基用于在发酵罐中检查污染。培养基含有：10g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨以及20g/L甘油。
发酵
研究中实施三次发酵：HET0401、HET0402以及HET0410，所有使用上述的菌株。在三次发酵之间的差异在于分批培养基和补料培养基的成分。对于三次发酵而言，其它所有参数都相同。
用于在6L发酵罐中发酵的分批培养基(3L)含有：13.3g/L NH4H2PO4、3.0g/L MgSO4H2O、3.3g/L KCl、0.3g/L NaCl、15g/L甘油、以及3mL/LADDAPTFoamstop Sin 260(ADD APT Chemicals AG、Helmond、荷兰)、1.0g/LCaCl22H2O、67mg/L(NH4)2Fe(SO4)26H2O、5mg/L CuSO45H2O、20mg/LZnSO47H2O、21mg/L MnSO4H2O、67mg/L EDTA)、0.65mg/L NiSO46H2O、0.65mg/L CoCl2、0.65mg/L H3BO4、0.65mg/L KI、0.65mg/L Na2MoO42H2O)、2mg/L D-生物素以及0.67g/L盐酸氯化硫胺素。
除上述分批培养基之外，发酵HET0402在分批培养基中含有10g/L蛋白胨。
除上述分批培养基之外，发酵HET0410在分批培养基中含有10g/LBacto胰蛋白胨。
补料培养基HET0401和HET0402：
补料培养基含有635g/kg甘油和130g/kg甲酸。
补料培养基HET0410：
补料培养基含有570g/kg甘油，120g/kg甲酸以及95g/kgBacto胰蛋白胨。
通过添加25％(w/v)氨水控制pH。
在公司自己建造的6L发酵罐中以补料分批法进行发酵。使用下列发酵条件：pH5、通风1vvm、温度26℃并以400至700rpm进行搅拌。
用在25℃和180rpm下生长的、并具有OD600约为10的2*250mL YNB甘油培养物接种发酵罐。
在发酵中，根据释放的二氧化碳积累量以及根据下列方程式来控制补料流速：
Feed-flow[g/h]＝0，AcCO2＜0.45
Feed-flow[g/h]＝1.33·V·AccCO2，0.45≤AccCO2≤3.25
Feed-flow[g/h]＝4.33·V，3.25≤AccCO2
V：The fermemation broth volume[L]
AccCO2：The accumulated CO2 evolution[moles]
收集
通过在16000×g离心10分钟、随后将上清经过来自Gelman Laboratory的0.2μm滤菌器(VacuCap 90 Filter Unit w 0.8/0.2μm Supor Membrane)进行过滤除菌，来收集发酵物。产物于4℃保存直到用于烘烤试验。
分析步骤
脂肪酶活性的测定
将发酵样品(10mL)在9000×g离心10分钟，并根据本文前面所教导的“PLU分析”将上清用于分析磷脂酶活性。
生物量生长
通过将10mL培养液在预称重容器中以9000×g离心10分钟，来测定培养液中的生物量浓度。离心后，除去上清并将生物量在100℃干燥24小时然后称重。以每升培养液的细胞干重g来计算生物量浓度。
酶鉴定和小烘烤试验
酶和面粉
样品205：来自HET0401的样品7(发酵161小时)
磷脂酶Lipopan F，#2938
面粉：改良(Reform)2003055
小烘烤试验
将下列组分加入50g Brabrender混料罐并在30℃揉捏5分钟：50g面粉、10g干酵母、0.8g糖、0.8g盐、70ppm抗坏血酸以及水(直至400Brabender单位的生面团稠度)。在34℃静置10分钟。每个生面团称取15g的生面团。然后在可将生面团在木板和有机玻璃框之间进行滚轧的特殊装置上进行铸模。将生面团在罐中于34℃下发面45分钟，并在Voss家庭烤箱中于225℃下烘烤8分钟。
烘烤后，面包冷却至室温放置20分钟后，称取面包，并通过菜籽取代法测定体积。也可切开面包，以用于评价团粒以及面包皮。
提取脂质
立刻冰冻10g经充分发面的生面团并且冷冻干燥。在咖啡磨碎机中磨碎冷冻干燥的生面团，并穿过800微米筛。称取1.5g冷冻干燥的生面团放入有螺旋盖的15mL离心管。加入7.5ml水饱和的丁醇(WSB)。将离心管放入沸水浴槽10分钟。将离心管放入Rotamix并以45rpm于室温旋转20分钟。然后再次放入沸水浴槽10分钟并于室温开启Rotamix30分钟。以3500g将管离心5分钟。将5ml上清转入小管中。在氮蒸汽中蒸干WSB。
气相色谱
根据以上实施例1中的分析步骤所述，实施气相色谱。
高效薄层色谱
进样器：LINOMAT 5，CAMAG进样器。
高效薄层色谱板：10×10cm，Merck no.1.05633
使用前，将色谱板在烤箱中于180℃干燥20-30分钟。
进样：使用LINOMAT 5进样器，将1.0μL1％的于CHCl3∶MeOH＝85∶15中的溶液加到高效薄层色谱板上。
洗脱缓冲液：
No.IV：氯仿∶甲醇∶H2O(65∶25∶4)
No.I：P-醚∶甲基叔丁醚(MTBE)∶乙酸(60∶40∶1)
进样/洗脱时间：洗脱缓冲液I 11分钟，洗脱缓冲液IV 18分钟。
将色谱板在烤箱于180℃干燥10分钟，冷却并在6％乙酸铜、16％H3PO4中显色。在180℃额外干燥10分钟并直接评价。
烘烤试验
待测产物：
#3016-含8700 LIPU/g的Lipopan F
ID                       菌株/宿主                            发酵
样本206，含390LIPU/g     异孢镰孢/H.polymoha    HET0401+HET0402
样本209，含950LIPU/g     异孢镰孢/H.polymorpha  HET0410
配方：
用改良面粉2003159制备硬壳卷
                    Bakers％            数量，g
面粉-改良2003159    100                 2000
水                  58.5                1170
干酵母              6                   120
盐                  1.6                 32
糖                  1.6                 32
抗坏血酸            10ppm               0.02
标准α淀粉酶
GRINDAMYLTM A1000   90ppm               0.180
烘烤步骤：
Diosna搅拌器系统
·缓慢干拌1分钟
·缓慢搅拌2分钟+快速搅拌4分钟
·发面温度：26℃
·称取1350g
·在加热箱中静置10分钟
·铸模：Fortuna 3/17/7
·发面：45分钟，34℃，85％相对湿度
·烘烤：Bago烤箱中，220℃处理13分钟，蒸汽处理13秒钟+放汽处理5分钟
·MIWE stone deck：prog.nrl
·烘烤后，在称重和测定体积之前，硬壳卷冷却25分钟。
结果与讨论
发酵生理学和磷脂酶产生
与HET0401-0402相比，将胰蛋白胨加入HET0410的分批培养基和补料培养基，可引起生物量的快速生成并最终得到较高水平的生物量。
就磷脂酶活性产生而言，HET0401和HET0402几乎是相同的，然而在HET0410中磷脂酶生产率明显更高。
收集
在发酵168小时(HET0401-0402)和161小时(HET0410)后，收集发酵物。将产物保存于4℃直至用于烘烤试验中。将HET0401的一些产物称为样品205，其含有约700PLU-7/mL。将来自HET0401和HET0402的一些产物集中一起，并称为样品206。该产物含有约390PLU-7/mL。与HET0401和HET0402的终产物相比，样品206的酶活降低，可由贮存和过滤除茵所引起。将HET0410的产物称为样品209，其含有约950PLU-7/mL。
酶鉴定和小烘烤试验
在小烘烤试验中，测试来自发酵物HET0401的脂肪分解酶样品205。
以不同剂量与对照和LipopanFTM相比。表11显示该烘烤试验中，面包的具体体积。图11中显示了这些面包的照片。
表11在小烘烤试验中，来自异孢镰孢的脂肪分解酶(样品205)。对面包体积的影响。
  剂量     面包体积
  样品   PLU-7/kg面粉     mL/g
  205   0     3.56
  205   200U/kg     3.98
  205   500U/kg     4.87
  205   1000U/kg     5.05
  205   1500U/kg     5.13
  205   2000U/kg     4.82
  205   5000U/kg     5.05
  205   10000U/kg     4.51
  Lipopan F   40ppm     4.57
烘烤结果证实样品205对改善面包体积具有很强的效果，并且在40ppm的标准剂量时，其体积效果优于Lipopan FTM。
从图11也可得知，样品205有助于大力改善团粒结构和色泽。
将来自该烘烤试验的、已充分发面的生面团进行冷冻干燥，并用水饱和的丁醇进行提取，以及通过气液色谱和高效薄层色谱分析分离的脂质。
生面团脂质的气液色谱分析(表12)证实脂肪分解酶样品205伴随双半乳糖甘油一酯(DGMG)累积的对双半乳糖甘油二酯(DGDG)的水解效果。该酶对DGMG的活性相当低，因为DGDG(mmol％＝mmol/100g冷冻干燥生面团)和DGMG(mmol％)的总摩尔量在酶量增加时保持不变。气液色谱结果也表明样品205对甘油三酯的极低活性。
表12生面团脂质的气液色谱分析。FFA＝游离脂肪酸。MGMG＝单半乳糖甘油一酯。DGMG＝双半乳糖甘油一酯。MGDG＝单半乳糖甘油二酯。DGDG＝双半乳糖甘油二酯。TRI＝甘油三酯。
样品(S-) ％ ％ ％ ％ ％ ％ mmol％ mmol％ mmol％
FFA MGMG DGMG MGDG DGDG TRI DGMG DGDG DGMG+DGDG
0US-205 0.232 0.002 0.023 0.013 0.214 0.641 0.034 0.228 0.262
200US-205 0.321 0.007 0.050 0.038 0.193 0.660 0.074 0.205 0.279
500US-205 0.384 0.012 0.069 0.021 0.132 0.610 0.101 0.140 0.241
1000US-205 0.418 0.014 0.117 0.008 0.087 0.614 0.173 0.093 0.265
1500US-205 0.444 0.016 0.140 0.011 0.057 0.600 0.206 0.060 0.267
2000US-205 0.438 0.026 0.148 0.011 0.039 0.594 0.218 0.041 0.259
5000US-205 0.456 0.022 0.171 0.011 0.012 0.533 0.252 0.013 0.264
10000US-205 0.453 0.017 0.163 0.013 0.009 0.547 0.241 0.010 0.251
40ppm LipopanF 0.372 0.017 0.077 0.027 0.134 0.577 0.114 0.142 0.256
mmol％＝mmol/100g冻干的生面团
比较烘烤结果和脂质分析结果，有趣的是：注意到将DGDG完全水解成DGMG却得不到最好的烘烤效果，但结果表明将DGDG部分水解成DGMG，可产生最好的烘烤性能。
高酶量产生更多的DGMG，但也会产生更多的游离脂肪酸，这预计会产生负面的烘烤效果，这就是为什么优选仅仅部分水解DGDG的另一种解释。表13显示从表12计算得到的DGDG与甘油三酯的比值。比较结果说明：当使用DGDG对甘油三酯活性的比例是最大时的剂量，可获得最好的烘烤效果。
表13.来自气液色谱分析生面团脂质的DGDG和甘油三酯水解的比例
样品(S) dTRI dDGDG dDGDG/dTRI 面包体积
mL/g
0US-205 3.56
200US-205 0 0.023 3.98
500US-205 0.031 0.088 2.84 4.87
1000US-205 0.027 0.135 0.030 5.05
1500US-205 0.041 0.168 4.1 5.13
2000US-205 0.047 0.187 3.98 4.82
5000US-205 0.108 0.215 1.99 5.05
10000US-205 0.094 0.218 2.3 4.51
40ppm LipopanF 0.064 0.086 1.34 4.57
如图13所示，也可通过高效薄层色谱分析一些脂质样品。样品4、样品5和样品6是来自烘烤试验的生面团脂质。高效薄层色谱分析证实，脂肪分解酶样品205可水解DGDG并形成DGMG。
使用上文教导的测定法，LipopanF和样品209的极性脂质：甘油三酯的相对活性比是：
磷脂/甘油三酯(PLU/LIPU)        LipopanF＝3
                               样品209＝9
半乳糖脂/甘油三酯(GLU/LIPU)    LipopanF＝1
                               样品209＝4
在小规模烘烤试验中，异孢镰孢CBS 782.83脂肪分解酶可产生具有强烈地增加面包体积和改善团粒结构的很好效果。在生面团中，脂质分析证实了伴随DGMG的累积的对DGDG的强水解活性。在生面团中，异孢镰孢CBS 782.83脂肪分解酶表现对甘油三酯的低活性。
实施例4.对在多态汉逊酵母中表达的异孢镰孢CBS 782.83脂肪分解酶的脂质底物的活性鉴定和位点特异性。
如在实施例3中所述，在多态汉逊酵母中表达来自异孢镰孢的、根据本发明的脂肪分解酶。
分析步骤
利用本文前述的“PLU分析法”，测定 磷脂酶活性。
利用本文前述的半乳糖脂酶测定法，测定 半乳糖脂酶活性。
利用本文前述的LIPU测定法，测定 甘油三酯(三丁酸甘油酯)的活性。
对葵花籽油(LUSol，pH-stat pH6)的活性：
试剂：
将8.4阿拉伯树胶溶于100ml去离子水中并加入100ml 30mM CaCl2。在用Turrax搅拌器进行混合的期间(20000rpm)，缓缓加入36g葵花籽油。)
测试：
在量杯中，将20ml向日葵油乳剂在30℃中平衡5分钟。用pH恒定器调节pH至6.3-6.5。加入2毫升酶液，并连续加入0.05N NaOH并将pH在6.5保持10分钟。计算作为时间函数的、加入的0.05NaOH的曲线斜率。
1LUSol定义为在测定条件下每分钟可释放1μmol脂肪酸的酶量。
根据上述的方法，分析脂肪分解酶对不同底物的活性。结果如表14所示。
表14.根据本发明的异孢镰孢脂肪分解酶对不同脂质底物的活性。
活性 底物 pH 温度 单位/ml
LIPU 三丁酸甘油酯 5.5 30 754
LUSol 葵花籽油 6.5 30 48
PLU-7 磷脂酰胆碱 7 37 4650
GLU 双半乳糖甘油二酯 7 37 1600
在生面团中，在多态汉逊酵母中表达的异孢镰孢脂肪分解酶主要在半乳糖脂和磷脂的sn-1位点水解脂肪酸。通过将不同浓度的酶加入面包生面团，来研究酶的特异性。将已充分发面的生面团进行冰冻及冷冻干燥，并用水饱和的丁醇抽提生面团脂质。
通过气液色谱和高效液体色谱分析法来分析生面团脂质。
根据气液色谱分析，有可能分析双半乳糖甘油二酯(DGDG)和双半乳糖甘油一酯(DGMG)。还有可能分析双半乳糖甘油一酯(1：双半乳糖1-甘油一酯和2：双半乳糖2-甘油一酯，参见以下结构式)的位点异构体。通过气液色谱分离并定量这些组分。
1：R1＝H，R2＝脂肪酰基
2：R1＝脂肪酰基，R2＝H
Figure A20058001531900732
在烘烤试验中，为了生产硬壳卷，加入不同剂量的脂肪分解酶，并在已充分发面的生面团中分析半乳糖脂。表15显示了和图14图解说明了异构体双半乳糖甘油一酯的总量。
表15.在烘烤测试中，使用异孢镰孢脂肪分解酶的异构体双半乳糖甘油一酯的总量。
    酶量TIPU/kg面粉   双半乳糖2-甘油一酯％，基于生面团干重   双半乳糖1-甘油一酯％，基于生面团干重
    0     0.0102     0.0399
    200     0.0092     0.0167
    400     0.0071     0.0100
    400     0.0067     0.0057
    800     0.0103     0.0063
    1000     0.0071     0.0060
    1200     0.0081     0.0053
    1500     0.0064     0.0057
    2000     0.0084     0.0047
结论
根据表15和图14的结果，可以得出结论说，在生产双半乳糖2-甘油一酯期间，双半乳糖甘油二酯主要在1-位点发生水解。也观测到双半乳糖1-甘油一酯的少量增加。众所周知，在脂质中将发生酰基脂肪酸从2位点到1位点的酰基转移作用。该酰基转移作用取决于温度，并且在双半乳糖-2-甘油一酯与双半乳糖1-甘油一酯之间存在作为时间函数的平衡。该现象可解释：也观测到双半乳糖1-甘油一酯的少量增加的事实。
实施例五.测定衍生于异孢镰孢的脂肪分解酶的最适温度和稳定性。
在各种温度下，根据如下所述的改良PLU-7法，测定衍生于F.Heterosporum的、并在多态汉逊酵母中表达的喷雾干燥的脂肪分解酶的酶活。底物是0.6％磷脂酰胆碱、0.4％ Triton X-100、6mM CaCl2、50mMHEPES(pH7.0)的乳状液。用脱矿质水将喷雾干燥的脂肪分解酶酵素(ferment)稀释至3TIPU/ml。将400μl底物在10、20、30、40、50、45、50和60℃恒温加热5分钟，并加入50μl样品。刚好10分钟后，通过在99℃温育另一个10分钟来终止酶反应。最后，通过NEFAC法(Wako Chemicals GMbH，Neuss，德国)测定游离脂肪酸量。根据制造商的方法，制备显色剂A和显色剂B。将10μl再分散抽提的脂质和100μl试剂A移液到微量滴定板，并在37℃温育10分钟。将200μl试剂B加到微量滴定板上并在37℃温育10分钟。测定540nm的吸光度。使用读出的吸光度和基于油酸的标准曲线，测定游离脂肪酸量。结果如图15所示。
在各种温度下测定喷雾干燥的脂肪分解酶酵素的酶稳定性。用50mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)将喷雾干燥的脂肪分解酶酵素稀释到3TIPU/ml。在20、30、37、40以及45℃中温育30分钟后，将样品在冰上保存。随后，根据如下所述的改良PLU-7法测定磷脂酶活性。底物是0.6％磷脂酰胆碱、0.4％Triton X-100、以及50mM磷酸盐缓冲液的乳状液。省去CaCl2以防止磷酸钙的沉淀，这并不影响酶活。在37℃将400μl底物恒温加热5分钟，并加入50μl样品。刚好10分钟后，通过在99℃温育另一个10分钟来终止酶反应。最后，根据NEFAC法(Wako Chemicals GmbH，Neuss，德国)测定游离脂肪酸量。根据制造商的方法制备显色剂A和显色剂B。将10μl再分散抽提的脂质和100μl试剂A移液到微量滴定板，并在37℃温育10分钟。将200μl试剂B加到微量滴定板上并在37℃温育10分钟。测定540nm的吸光度。使用读出的吸光度和基于油酸的标准曲线，测定游离脂肪酸量。结果如图16所示。
实施例6.确定衍生于异孢镰孢的脂肪分解酶的最适pH和稳定性。
在各种pH下测定衍生于异孢镰孢并在汉逊酵母Polymorpha中表达的喷雾干燥的脂肪分解酶的酶活。底物是0.6％磷脂酰胆碱、0.4％Triton X-100、以及50mM磷酸盐缓冲液(pH4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0以及10.0)的乳状液。省去CaCl2以防止磷酸钙的沉淀，这并不影响酶活。用脱矿质水将喷雾干燥的脂肪分解酶酵素稀释至3TIPU/ml。在37℃将400μl底物恒温加热5分钟，并加入50μl样品。刚好10分钟后，通过在99℃温育另一个10分钟来终止酶反应。最后，根据NEFAC法(Wako ChemicalsGmbH，Neuss，德国)测定游离脂肪酸量。根据制造商的方法制备显色剂A和显色剂B。将10μl再分散抽提的脂质和100μl试剂A移液到微量滴定板，并在37℃温育10分钟。将200μl试剂B加到微量滴定板上并在37℃温育10分钟。测定540nm的吸光度。使用读出的吸光度和基于油酸的标准曲线，测定游离脂肪酸量。结果如图[17]所示。
在各种pH下测定喷雾干燥的脂肪分解酶酵素的酶稳定性。用pH4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0以及10.0的50mM磷酸盐缓冲液将喷雾干燥的脂肪分解酶酵素稀释至3TIPU/ml。在37℃温育30分钟后，将样品在冰上保存。随后，根据如下所述的改良PLU-7法测定磷脂酶活性。底物是0.6％磷脂酰胆碱、0.4％Triton X-100、以及50mM磷酸盐缓冲液(pH7)的乳状液。省去CaCl2以防止磷酸钙的沉淀，这并不影响酶活。在37℃将400ul底物恒温加热5分钟，并加入50μl样品。刚好10分钟后，通过在99℃温育另一个10分钟来终止酶反应。最后，根据NEFAC法(Wako ChemicalsGmbH，Neuss，德国)测定游离脂肪酸量。根据制造商的方法制备显色剂A和显色剂B。将10μl再分散抽提的脂质和100μl试剂A移液到微量滴定板，并在37℃温育10分钟。将200μl试剂B加到微量滴定板上并在37℃温育10分钟。测定540nm的吸光度。使用读出的吸光度和基于油酸的标准曲线，测定游离脂肪酸量。结果如图18所示。
实施例7.测定衍生于异孢镰孢的纯化脂肪分解酶的分子量。
将衍生于异孢镰孢的、根据本发明的纯化脂肪分解酶在SDS-PAGE胶上电泳(图19a和图19b)。如表15所示，根据Novex标准指示物计算分子量。
表15：测定根据本发明的脂肪分解酶的分子量。
样品 Rf   Mw(kDa) log Mw  计算
Novex标准 0.910.820.71 3.06.014 0.480.781.15  Log Mw(kDa)＝-5,30·Rf 3+7,50·Rf 25,00·Rf+2,7986r2＝0,9989
 0.660.550.470.380.310.230.13  172838496298188     1.231.451.581.691.791.992.27
根据本发明的脂肪分解酶 0.52 log Mw＝-5.30·0.523+7.50·0.522-5.00·0.52+2.80-Mw＝29.9kDa
计算出脂肪分解酶分子量是29.9kDa。
实施例8.测定衍生于异孢镰孢的脂肪分解酶的等电点(pI)。
根据氨基酸序列SEQ ID NO.6，理论上测定衍生于异孢镰孢的脂肪分解酶的等电点(pI)。
使用来自Informax(Invitrogen，CA，美国)的软件Vector NTI Suite 9进行计算，结果是pI＝6.40。
实施例9.在不同温度下，通过异孢镰孢CBS 782.83脂肪分解酶，鉴定在蛋黄中卵磷脂向溶血卵磷脂的酶转化。
通过释放游离脂肪酸，脂肪分解酶可将卵磷脂(磷脂酰胆碱)转化成溶血卵磷脂(溶血磷脂酰胆碱)。在蛋黄中，卵磷脂酶转化成溶血卵磷脂可产生更好的乳化性质，因为溶血卵磷脂是比卵磷脂更好的乳化剂。当制作耐热的蛋黄酱及其他食品和食物应用时，例如但不限于蛋糕和乳酪的成熟，蛋黄的良好乳化性质很重要。
酶的制备：
将来自发酵物HET0420的、并在多态汉逊酵母中表达的异孢镰孢CBS782.83脂肪分解酶在小麦淀粉上进行喷雾干燥。通过本文以前所述的TIPU测定法，确定得到的酶制剂具有1265U/g的磷脂酶活性。通过将喷雾干燥的酶粉溶于脱矿质水中，制备10％(w/v)或20％(w/v)酶储液。搅拌15分钟后，将溶液在1370×g离心五分钟。上清作为酶储液。
酶反应：
建立两种不同实验来确定用于在蛋黄中将卵磷脂酶转化成溶血卵磷脂的酶量、反应温度和反应时间的最适组合。在第一个实验中，用根据本发明的脂肪分解酶在下列三种温度下实施酶反应：30℃、40℃和50℃，每个反应使用下列四种剂量：5U/g蛋黄、10U/g蛋黄、20U/g蛋黄以及30U/g蛋黄。
在第二个实验中，分别使用根据本发明的脂肪分解酶和来自NovozymesA/S(丹麦)的LecitaseUltra，在下列五种温度下并使用30U/g蛋黄的酶量，实施酶反应：5℃、10℃、15℃、20℃、以及53℃。在53℃下，也测试60U/g蛋黄的酶量。
在两种实验中，将来自DanAEg(Christiansfeld，丹麦)的10.0g巴氏杀菌的蛋黄转入Wheaton管中，并放入加热块恒温箱直至合适的温度。在磁力搅拌器上连续地混合样品。当时间t＝0时，将酶储液加入根据表16的蛋黄中。重复实施每个实验。从根据表17的蛋黄/酶液取出1.0g样品。根据表17的时间进行温育后，在样品中加入7.5ml有机溶剂(CHCl3∶MeOH＝2∶1)来终止酶促反应。
表[16]：将酶储液加入蛋黄直至获得不同酶量，包括对照。加入脱矿质水至总量2.35ml来忽略在加入不同体积酶储液后的任何体积差异。
样品 蛋黄量 酶活 储液酶活 加入的酶储液体积 加入的脱矿物质H2O体积
对照脂肪分解酶  10.0g10.0g10.0g10.0g10.0g10.0g   0U50U100U200U300U600U  -127U/ml127U/ml127U/ml127U/ml253U/ml     0ml0.40ml0.80ml1.60ml2.35ml2.35ml  2.35ml1.95ml1.55ml0.75ml0ml0ml
 LecitaseUltra  10.0g10.0g   300U300U   3620U/ml3620U/ml     83μl165μl     2,25ml2,20ml
表[17]：在不同实验中，样品提取物的反应时间。
反应温度 酶量   反应时间(分钟)
5℃、10℃、15℃、20℃30℃40℃50℃53℃53℃ 30U/g5、10、20和30U/g5、10、20和30U/g5、10、20和30U/g30U/g60U/g 60 120 240 360 480 1440 -30 60  120 240 360 -    -30 60  120 240 360 -    -30 60  120 240 360 -    -15 30  60  90  120 240  -15 30  60  90  120 240  330
提取脂质：
加入7.5ml有机溶剂(CHCl3∶MeOH＝2∶1)至样品中不但终止酶反应，而且提取脂质。此外，在用Whirley搅拌器分散样品1分钟之前，加入0.2ml脱矿物质水。然后以110×g将样品离心十分钟。将约3ml有机相转入另一个管中，并将该提取的脂质用于各种分析。样品保存于-18℃。
游离脂肪酸的测定：
在氮气中于50℃蒸发100μl提取的脂质溶液。加入1.0ml脱矿质水并用Whirley搅拌器分散脂质。使用来自WAKO Chemicals GmbH(Neuss，德国)的NEFA C试剂盒测定游离脂肪酸量。根据制造商的方法制备显色剂A和显色剂B。将10μl再分散的提取脂质和100μl溶液A移液到微量滴定板。将平板在37℃温育10分钟。将200μl溶液B加入微量滴定板，并将平板在37℃温育10分钟。测量540纳米的吸光度。使用读出的吸收度和基于油酸的标准曲线，测定游离脂肪酸量。
通过LC/MS-MS测定卵磷脂和溶血卵磷脂：
材料
丙酮、甲醇、氯仿全部来自Lab Scan(都柏林，爱尔兰)，96％乙醇来自De Danske Spritfabrikker，以及甲酸来自AppliChem(Darmstadt，德国)。
仪器
高效液体色谱系统由四级泵(G1311A)、毛细泵(G1376A)、自动进样器(G1377A)、以及柱室(G1316A)组成，所有都来自Agilent Technologies(Waldbronn，德国)。使用来自LC Packings(Amsterdam，荷兰)的AcurateTM流体分流器(ACM-CU-CR)来将层析柱流出物分流到质谱仪，并导入极性补充溶剂。质谱仪是来自Thermo Finnigan(San Jose，CA，美国)的LCQ Deca离子阱。层析柱是来自Thermo Hypersil-Keystone的Hypersil SI，100×4.6mm id，5μm。
色谱分析和MS条件
流动相
A：不使用
B：氯仿
C：甲醇/甲酸(1000/0，190)
D：氯仿/甲醇/水/甲酸(300/550/150/0，190)
补充物：乙醇96％
 流速[ml/min]  时间[min]  B[％]  C[％]  D[％]
 0.60.60.60.60.6  028916  40004040  60006060  010010000
注射体积是5μl，柱温是45℃。
流体分流器
LC-流速：      0.60ml/分钟
补充物流速：   100μl/分钟
ELSD/FC管：    100cm×0.100mm id(SS)
MS管：        100cm×150μm(FS-150-MS)
分流比(split)是约20∶1
MS条件
MS参数设置：
参数 值
毛细管温度[℃]鞘气体流速辅助气体流速源极性电源电压[kV]SIM微扫描(micro Scans)SIM最大离子时间[毫秒] 325704ESI正相6.05200
MS检测器设置：
参数 值
持续时间[分钟]调谐方法 15LPC_544_SIM_00.LCQTune
扫描事件(Scan Event)1-SIM范围 质量间隔(Mass Interval)
  LPC(16:0)-H+LPC(18:2)-H+PC(34:2)-H+PC(36:4)-H+   494.0-498.0517.0-527.0；541.0-549.0778.0-86.0801.0-13.0
标准和样品制备
溶血磷脂酰胆碱(LPC)(蛋，鸡)(89865)和磷脂酰胆碱(PC)(植物)(441601)来自Avanti Polar Lipids，Inc，Alabaster，AL，美国。制备PC和LPC储液(10mg/20ml CHCl3/MeOH)。制备本文中的稀释度以包括50μg/ml到2.5μg/ml浓度范围。将从1g蛋黄提取的7.5μl脂质在1.5ml CHCl3∶MeOH(1∶1)中进行重建。
薄层色谱分析：
如实施例1中所述，实施薄层色谱分析。
为了观察不同的甘油酯，通过自动的薄层色谱进样器4(CAMAG)将2μl脂质提取物以3mm带加到高效薄层色谱二氧化硅60板(Merck)中。将二氧化硅板放入具有洗脱缓冲液I(P-醚∶甲基叔丁醚∶乙酸(50∶50∶1))的水平显色室(CAMAG)中。将20ml洗脱缓冲液用于气相，5ml用于洗脱板，并且洗脱板直到距离上样位置约5cm处。将板在加热橱(160℃)中干燥5分钟。最后，将薄层色谱板浸在显色剂(在16％水性H3PO4中的6％Cu(CH3COO)2)并在加热橱(160℃)碳化10分钟。
结果
为了确定用于在蛋黄中将卵磷脂酶转化成溶血卵磷脂的酶量、反应温度和反应时间的最适组合，在三种不同温度和五种不同反应时间下测试四种不同酶量。
根据本文未包括的初期试验，四种酶量使用5U/g、10U/g、20U/g、30U/g，以及反应时间使用30分钟、60分钟、120分钟、240分钟、360分钟。参见图20，根据适于脂肪分解酶的最适温度曲线，三种温度选择30℃、40℃和50℃。
通过高效液体色谱和图21和图22所述，分析作为反应时间的函数的、在酶处理的蛋黄中卵磷脂量和溶血卵磷脂量。在图23中，在酶处理的蛋黄中游离脂肪酸量被描述为反应时间的函数。
实验表明对于根据本发明的脂肪分解酶将卵磷脂转化成溶血卵磷脂而言，最适的是使用20U/g蛋黄的脂肪分解酶在30℃下反应120分钟。选择20U/g蛋黄量应归于在30U/g蛋黄反应120分钟到反应240分钟期间，观察到LPC水平的下降。
根据该结果，检验根据本发明的脂肪分解酶和LecitaseUltra在温度低于30℃时是否对蛋黄脂质起作用，并比较它们在53℃时的活性，所述的53℃是目前工业上使用LecitaseUltra的温度。
在蛋黄中，测试在五种不同温度(5℃、10℃、15℃、20℃以及53℃)和六种不同反应时间时卵磷脂对溶血卵磷脂的酶转化。测试30U/g蛋黄的酶量，因为涉及酶成本的缘故这是商业目的中最高的剂量，并且因为在该测试温度下预计反应速率很低。通过TIPU测定所有已提到的酶单位。30U/g蛋黄也是LecitaseUltra的推荐剂量。此外，在53℃下测试60U/g蛋黄酶量。使用的反应时间是60分钟、120分钟、240分钟、360分钟、480分钟以及1440分钟。然而，在53℃下反应时间是15分钟、30分钟、60分钟、90分钟、120分钟以及240分钟。在53℃下使用60U/g样品时，也可使用330分钟反应时间。
在图24和图25中，分别使用根据本发明的脂肪分解酶和LecitaseUltra磷脂酶，把在酶处理的蛋黄中溶血卵磷脂量、游离脂肪酸量和卵磷脂量描述为反应时间的函数。通过LC-MS测定样品的卵磷脂含量和溶血卵磷脂含量，并通过NEFA C法测定游离脂肪酸含量。如图24和图25中所示，对照样品中的FFA量(结果未显示)与溶血卵磷脂和卵磷脂总量在实验期间保持不变。
图24显示，用根据本发明的脂肪分解酶对蛋黄进行酶反应的结果。在53℃时，用30U/g蛋黄反应达到1.7％(w/w)的LPC水平30分钟后，脂肪分解酶作用停止(图24b)。分别用30U/g蛋黄和60U/g蛋黄，FFA水平是1.0％(w/w)和1.3％(w/w)。在使用30U/g蛋黄反应240分钟后，使用LecitaseUltra，在15-240分钟期间，LPC量和FFA量增加(图19)，并产生2.7％(w/w)的LPC。在分别使用30和60U/g蛋黄反应240分钟后，FFA的水平是1.4％(w/w)和2.1％(w/w)。在使用60U/g蛋黄反应330分钟后，LecitaseUltra作用停止。本发明的脂肪分解酶比LecitaseUltra具有更高初始反应速率。
在20℃和53℃时，初始反应速率与本发明的的脂肪分解酶相似(图24)。在温度5-20℃时，LPC量和FFA量在实验期间增加。尽管在温度低于20℃时，初速度随温度的降低而显著地降低。在20℃时，用30U/g蛋黄反应60分钟后，达到3.3％(w/w)的LPC水平和1.6％(w/w)的FFA水平。该水平与在53℃时用LecitaseUltra反应240分钟相似。在20℃反应1440分钟之后，不可能重悬浮用于FFA分析的无溶剂的脂质提取物。在5℃和10℃反应1440分钟之后，带有脂肪分解酶的样品具有不能进行搅拌的高度粘性。这很可能归因于FFA的结晶。在上述任何实验中，观察不到在TN 6642中用30U/g蛋黄在30℃下反应120到240分钟所看到的LPC水平的降低。
与LecitaseUltraat在53℃时的初速度相比，在20℃时用LecitaseUltra磷脂酶对蛋黄进行酶反应，可产生明显下降的初速度和更低的温度(图25)。在20℃时，用30U/g蛋黄反应1440分钟后，达到3.0％(w/w)的LPC水平和1.5％(w/w)的FFA水平。该水平与在53℃反应240分钟的水平相似。
图26显示从酶处理的蛋黄提取脂质的薄层色谱分析。该分析证实了来自LC-MS的结果，并表明根据本发明的脂肪分解酶和lecitaseUltra磷脂酶可提高溶血卵磷脂量。
通过脂肪分解酶催化的酶促反应，可产生等量的溶血卵磷脂和游离脂肪酸。可能的和不必要的副反应是甘油三酰酯的水解反应。图27中显示了在酶促反应期间，溶血卵磷脂量和游离脂肪酸量之间的变化关系。
使用LecitaseUltra，可有等量形成溶血卵磷脂和游离脂肪酸的良好相关性(图27)。然而，在大多数用LecitaseUltra处理的样品中，很少有反应。用本发明的脂肪分解酶对蛋黄进行酶反应，导致在40mM以上的溶血卵磷脂水平和60mM以上的游离脂肪酸水平时，每形成一个溶血卵磷脂则产生一个以上的游离脂肪酸。使用LecitaseUltra的最大转化率是30mM溶血卵磷脂和25mM游离脂肪酸。表18中显示，具有游离脂肪酸对溶血卵磷脂的比值低于0.8或高于1.2(n/n)以及LPC含量高于1.0％(w/w)时的样品。
表18：具有游离脂肪酸(FFA)对溶血卵磷脂(LPC)比值低于0.8或高于1.2(n/n)以及LPC含量高于1％(w/w)时的样品。用脂肪分解酶或LecitaseUltra处理样品。通过NEFAC法测定FFA。通过LC-MS测定LPC和PC。
酶     温度(℃)   反应时间(分钟) ΔFFA/ΔLPC(n/n) ％LPC(w/w) ％FFA(w/w) ％PC(w/w)
脂肪分解酶   5     1440     1.99     3.0     2.9     2.0
脂肪分解酶   10     480     1.97     2.3     2.3     2.5
脂肪分解酶脂肪分解酶脂肪分解酶   151515     4803601440     1.481.641.98     4.13.64.2     3.53.44.7     0.61.00.1
脂肪分解酶脂肪分解酶脂肪分解酶LecitaseUltra   20202020     603604801440     0.671.301.430.72     3.34.75.03.0     1.63.64.11.5     2.00.30.32.0
脂肪分解酶脂肪分解酶脂肪分解酶脂肪分解酶脂肪分解酶LecitaseUltraLecitaseUltra   53535353535353     1560902403012060     0.690.700.710.720.720.610.62     1.51.71.81.71.82.41.6     0.91.01.01.01.01.10.9     3.72.62.72.83.02.32.9
通常在延长的反应时间中或在含有低于1.0％PC(w/w)的样品中，可发现具有游离脂肪酸对溶血卵磷脂的比值高于1.2(n/n)和LPC含量高于1.0％(w/w)的样品。在所有样品中，脂肪分解酶样品在15℃时具有提高的游离脂肪酸对溶血卵磷脂比值。这表明在延长的反应时间中或当PC含量低时，酶改变了底物特异性。这可归因于在蛋黄中发现了磷脂酰乙醇胺、双半乳糖甘油二酰酯或甘油三酰酯的水解作用。通常在53℃的反应温度中，可发现具有游离脂肪酸对溶血卵磷脂的比值低于0.8(n/n)和LPC含量高于1.0％(w/w)的样品(表18)。这可通过酯交换反应进行解释。
图28表明在延长的反应时间或低浓度的PC时，本发明的脂肪分解酶确实具有对甘油三酰酯和1，3甘油二酰酯的水解活性。1，2甘油二酰酯的累积表明脂肪酶活性是1，3特异性的。甘油一酯的形成表明在20℃时LecitaseUltra具有对甘油三酰酯或甘油二酰酯的水解效应。不可能确定本发明的脂肪分解酶或LecitaseUltra磷脂酶是否具有最高的甘油三酰酯水解度，这因为LPC的形成水平千差万别。降低脂肪分解酶的酶量和反应时间可减少水解作用。表18A显示用于图28中的泳道1-30中的实验材料的反应时间、温度和酶量。
表18A
泳道编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27   28   29   30
酶* B K K L B K K L B K K B K K K K L L L L B K K K L L L   B   K   L Chol. PCLPC   MG，DG FFA Mix
反应时间(h) 8 24 24 8 24 24 8 24 4 6 8 24 4 6 8 24 1 2 4 1 2 4   4   4
温度(℃) 5 5 5 5 10 10 10 10 15 15 15 20 20 20 20 20 20 20 20 20 53 53 53 53 53 53 53   53   53   53
剂量(U/g) 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30   60   60   60
                *)B：空白，K：根据本发明的脂肪分解蛋白，L：LecitaseUltra磷脂酶
对技术人员显而易见的是，使用常规试验方法，可容易地确定适于任何指定的食物应用的最适酶量、反应温度和反应时间。
结论
使用根据本发明的脂肪分解酶和LecitaseUltra磷脂酶，对来自DanAEgA/S的蛋黄进行酶反应，来测定卵磷脂向溶血卵磷脂的转化。在五种温度下(5-20℃以及53℃)和六种不同反应时间(60-1440分钟，但在53℃是15-240分钟)时，使用30U/g蛋黄的酶量，实施该操作以测定酶活性。53℃是目前工业上使用的、用于LecitaseUltra处理蛋黄的温度。
在所有的测试温度中，根据本发明的脂肪分解酶比LecitaseUltra具有更高的初始反应速率。在53℃时，仅仅反应30分钟后，脂肪分解酶停止反应。在53℃、以30U/g蛋黄的酶量分别使用脂肪分解酶和lecitaseUltra时，LPC水平是1.7和2.7％(w/w)。在20℃时使用脂肪分解酶仅仅反应60分钟后，LPC达到3.3％(w/w)的水平。
在低温(5-20℃)下，使用脂肪分解酶，卵磷脂向溶血卵磷脂的转化明显高于LecitaseUltra。与在15℃和更高温度相比，在10℃和更低温度时，脂肪分解酶的反应速度明显降低。在5℃时脂肪分解酶是有活性的。在反应24小时后，可检测到形成了超过2％(w/w)的溶血卵磷脂。同样，与在较高温度时相比，具有脂肪分解酶的样品在10℃和更低温度时更加粘稠。
在延长反应时间或当PC含量很低时，发现脂肪分解酶改变了底物特异性并水解除磷脂之外的磷脂酰-乙醇胺、双半乳糖甘油二酰酯或甘油三酰酯。通过使用更低的酶量和缩短反应时间可避免该情况，并证实需要彻底优化所述每个产品的处理条件。在53℃时，酯交换反应可解释使用脂肪分解酶和LecitaseUltra，每溶血卵磷脂可产生低于一个当量的游离脂肪酸。
总之，根据本发明的脂肪分解酶是适于在低温对蛋黄进行酶反应的潜在的候选物。所观测的低温活性也用于其它应用中。
实施例10.使用异孢镰孢CBS 782.83脂肪分解酶制备蛋黄酱
蛋黄酱的制备：
将如实施例4所述制备的6.25g脂肪分解酶溶于50mL脱矿质水，这相当于150U/mL的磷脂酶活性。搅拌15分钟后，将溶液以1370×g离心五分钟。根据表19，将上清用于酶反应来自Sanofa A/S的150g蛋黄。根据该表，用LecitaseUltra(Novozymes A/S，丹麦)处理来自Sanofa A/S的另一个150g蛋黄。在30℃下通过缓慢搅动180分钟，来实施酶反应。如实施例4中所述，进行脂质提取。
表19：分别使用根据本发明的脂肪分解酶和LecitaseUltra，对来自SanofaA/S的蛋黄进行酶反应。所用的脂肪分解酶溶液具有150U/mL活性，LecitaseUltra具有34500U/mL的磷脂酶活性。
样品 蛋黄量 加入的脂肪分解酶  加入的LecitaseUltra 加入的脱矿质水  蛋黄U/g
对照 150g 30.0mL  0
脂肪分解酶 150g 30.0 mL  30
LecitaseUltra 150g  0.13mL 29.9mL  30
使用Koruma搅拌器(Disho V60/10)，通过酶改变来自SanofaA/S的蛋黄来制作蛋黄酱。在加工期间，将蛋黄酱在95℃加热五分钟。
表20：用于制作蛋黄酱的成分。
成分 蛋黄酱对照 蛋黄酱脂肪分解酶 蛋黄酱LecitaseUltra
水 34.5％ 34.5％ 34.5％
油 50.0％ 50.0％ 50.0％
盐 1.0％ 1.0％ 1.0％
糖 3.0％ 3.0％ 3.0％
山梨酸钾 0.1％ 0.1％ 0.1％
Grindsted FF 1102 1.7％ 1.7％ 1.7％
蛋黄1 4.23％
蛋黄2 4.23％
蛋黄3 4.23％
醋10％ 4.00％ 4.00％ 4.00％
芥末 1.50％ 1.50％ 1.50％
总计 100％ 100％ 100％
薄层色谱分析：
如上所述，实施薄层色谱分析。
确定蛋黄酱的颗粒大小：
将2.0g蛋黄酱样品溶于22.5g 0.2％SDS中，并以300rpm搅拌最少30分钟。然后在Malvern Mastersizer上测定颗粒大小分布。
结果：
为了用酶改变的蛋黄生产蛋黄酱，使用来自Sanofa A/S的蛋黄。该蛋黄含有8％盐(与来自DanAEg的蛋黄的0％相比)。初期试验(不显示)表明在来自Sanofa A/S的蛋黄中较高盐浓度影响脂解活力，因此使用30U/g的酶量而不是20U/g。
薄层色谱分析经酶改变的来自Sanofa A/S的蛋黄的脂质提取物(图29)，表明根据本发明的脂肪分解酶减少卵磷脂量，同时提高溶血卵磷脂量(图29)。比较起来，当使用LecitaseUltra时，卵磷脂向溶血卵磷脂的转化可以忽略不计。卵磷脂对溶血卵磷脂的高转化率显示，薄层色谱与对经酶改变的来自Sanofa A/S的蛋黄的脂质提取物的游离脂肪酸测定具有很好的相关性。使用脂肪分解酶释放的游离脂肪酸量比使用LecitaseUltra释放的游离脂肪酸量高3.5倍。
表21：在经酶改变的来自SanofaA/S的蛋黄中的游离脂肪酸量。通过NEFA C法分析游离脂肪酸量，并表示为蛋黄百分率。
样品 游离脂肪酸(％(w/w))
对照 0.39
脂肪分解酶 2.4
LecitaseUltra 0.68
分析蛋黄酱中油珠的尺寸分布，来评价来自SanofaA/S、不同酶改变的蛋黄的乳化性质。从中可知，与通过LecitaseUltra处理的蛋黄或未处理的蛋黄所产生的蛋黄酱相比，通过使用根据本发明的脂肪分解酶处理蛋黄而产生的蛋黄酱，具有最小平均粒径以及粒径分布最窄范围。小的平均粒径和粒径分布窄范围表明良好的乳化性质，因此用脂肪分解酶改变的蛋黄具有最好的乳化性质。
表22：在通过来自Sanofa A/S、用酶处理的蛋黄而制作的蛋黄酱中的粒径分布。
样品 平均粒径(μm) 10％quantile(μm) 90％quantile(μm)
对照 13.7  2.0  21.5
脂肪分解酶 4.4  1.2  7.3
LecitaseUltra 13.3  1.8  21.9
为了评价通过酶改变来自Sanofa A/S的蛋黄而制备的乳化剂热稳定性，将蛋黄酱在微波炉中加热4秒钟。如图30中所示，含有酶改变蛋黄的蛋黄酱产生耐热的乳化剂，而含有未处理的蛋黄的对照在微波炉热处理中被析出，因此乳化剂是不耐热的。
结论
薄层色谱分析和酶修饰来自SanofaA/S的蛋黄的游离脂肪酸的测定，与通过酶改变来自Sanofa A/S的蛋黄而制备的蛋黄酱的粒径分布和热稳定性测试非常相关。用根据本发明的脂肪分解酶改变的蛋黄，具有卵磷脂向溶血卵磷脂的最高转化率，并具有最高量的游离脂肪酸。正如期望的，卵磷脂：溶血卵磷脂的比值改变产生耐热的并具有最适粒径分布的蛋黄酱。
使用LecitaseUltra来改变来自SanofaA/S的蛋黄，不会对卵磷脂：溶血卵磷脂比值或游离脂肪酸高含量带来很大变化。蛋黄酱的粒径分布反映了卵磷脂向溶血卵磷脂的转化不显著，这与未改变的蛋黄的情况相似。然而，使用LecitaseUltra而发生的卵磷脂：溶血卵磷脂比值的变化，足以使蛋黄酱耐热。
在30℃下，用30U/g脂肪分解酶改变来自Sanofa A/S的蛋黄120分钟，可显示卵磷脂向溶血卵磷脂的高转化率，并且用该蛋黄制作的蛋黄酱是耐热的并具有最适粒径分布。比较起来，在30℃下，用30U/g LecitaseUltra处理来自Sanofa A/S的蛋黄120分钟，可显示在卵磷脂：溶血卵磷脂比值中仅仅微小的改变，并且所制作的蛋黄酱具有类似于用未处理的蛋黄制作的蛋黄酱的粒径分布，但事实上它是耐热的。因此在蛋黄酱的生产中，根据本发明的脂肪分解酶优于LecitaseUltra。
实施例11.对衍生于异孢镰孢的脂肪分解酶与乳化剂的组合进行应用测试用于制备硬壳卷
在该测试中，以单独或联合PanodanA2020 DATEM及GRINDSTEDSSL P55使用根据本发明和衍生于异孢镰孢的脂肪分解酶酵素来用于烘烤硬壳卷，其中上述两种乳化剂都来自Danisco A/S。将对具体面包体积的效果，与来自Novozymes的Lipopan FTM对具体面包体积的单独或联合了乳化剂的效果进行比较。
应用
使用下列配方和烘烤步骤，烘烤硬壳卷。
  烘烤配方面粉-丹麦改良2004002水干酵母盐糖抗坏血酸来自Danisco A/S的标准α淀粉酶/GRINDAMYLTM A1000   量2000g1140g120g32g32g0ppm75ppm     面粉的Bakers％1005761.61.600.150
烘烤步骤
Diosna搅拌系统
1.缓慢干拌1分钟
2.缓慢搅拌2分钟+快速搅拌4分钟
3.发面温度：26℃
4.称取生面团：1350g
5.在加热箱中，于30℃静置10分钟。
6.铸模：Fortuna 3/17/7模具
7.发面：45分钟，34℃，85％相对湿度
8.烘烤：Bago烤箱中，220℃处理13分钟，蒸汽处理13秒钟+放汽处理5分钟
9.MIWE stone deck：prog.nr 1
10.烘烤后，在称重之前，硬壳卷冷却25分钟。通过菜籽取代法测量面包卷的体积。
具体面包体积：
具体体积＝面包的 体积，ccm/面包的重量，g
根据面粉加入喷雾干燥的脂肪分解酶。先将面粉与水、抗坏血酸和干酵母混合后，将酶加入面粉中。在步骤1中混合所有其它的干燥成分。
结果
将衍生于异孢镰孢的、并喷雾干燥的脂肪分解酶与来自Danisco A/S的PanodanM2020 DATEM进行组合使用，并针对Lipopan FTM/DATEM以及纯Lipopan FTM或纯DATEM的组合进行了测试。结果如表23和图31所示。
表23
样品对照Lipopan FTM     数量10ppm30ppm40ppm  具体体积，g/ccm5,895,987,548,18
脂肪分解酶PAN M2020PAN M2020+脂肪分解酶PAN M2020+脂肪分解酶PAN M2020+Lipopan FTM     96ppm191ppm287ppm383ppm478ppm0.3％0.15％0.15％96ppm0.15％191ppm0.15％10ppm   6,076,27,068,138,017,896,57,688,297,69
将衍生于异孢镰孢的、并冷冻干燥的脂肪分解酶与PanodanM2020和GRINDSTEDSSL P55进行组合使用，并针对Lipopan FTM/SSL或LipopanFTM/DATEM以及纯Lipopan FTM、纯DATEM和纯SSL的组合进行了测试。
结果如表24和图32中所示。
表24
样品对照0,3％PanodanA20200,3％SSL P55 数量0.3％0.3％   具体体积，g/ccm5,987.987.78
 Lipopan FTMLipopan FTM+0.15％PanodanA2020Lipopan FTM+0.15％SSL P55脂肪分解酶脂肪分解酶+0.15％PanodanA202(脂肪分解酶+0.15％PanodanA202(脂肪分解酶+GRINDSTEDSSL P55 15ppm40ppm15ppm0.15％15ppm0.15％43ppm86ppm30ppm0.15％43ppm0.15％43ppm0.15％   6.427.778,448,625,936,437,867,868,1
结论
表23和图31的结论是：根据本发明的、并喷雾干燥的脂肪分解酶的最适剂量是约383ppm脂肪分解酶，并且该产品可联合低剂量的DATEM乳化剂以低剂量进行使用。在平行试验中，表明当脂肪分解酶量在574ppm到1912ppm时，具体面包体积下降(数据未显示)。根据本发明的、383ppm脂肪分解酶的表现类似于40ppm Lipopan FTM。当与乳化剂联合使用时，根据本发明的脂肪分解酶的表现也与Lipopan FTM水平相同。根据使用如前所述的TIPU测定法的磷脂酶活性的测定结果，10ppm Lipopan FTM是约每公斤面粉120 TIPU，并且本发明的96ppm脂肪分解酶相当于每公斤面粉117TIPU。
此外，根据表24和图32的试验结果，我们推断根据本发明的脂肪分解酶可联合SSL以及DATEM进行使用，并从而提高低乳化剂水平的效果。在相同剂量时，可将根据本发明的脂肪分解酶功能与Lipopan FTM的功能比较。再次确定联合乳化剂的磷脂酶活性的最适水平是约每公斤面粉100-150TIPU。
总结起来，根据本发明的纯脂肪分解酶的最适剂量是约每公斤面粉500TIPU，并且当联合乳化剂时，脂肪分解酶水平应是脂肪分解酶最适水平的1/5至1/4，即约每公斤面粉120TIPU。
实施例12.衍生于异孢镰孢的脂肪分解酶用于制备小麦玉米粉圆饼(wheat torfilla)的应用测试。
如下列实施例所述，测试了根据本发明的和衍生于异孢镰孢的脂肪分解酶对通过延胡索酸(美国方法)制备的小麦玉米粉圆饼的可滚动(rollability)的作用。
使用表25中的成分烘烤小麦玉米粉圆饼：
表25：制备小麦玉米粉圆饼的配方
配方：                        类型：              剂量(面粉％)克
面粉 标准型(no.2004068) 100 3000
糖 1.0 30
脂肪(起酥油、人造黄油、油) 起酥油 8.7 267
盐 1.5 45
山梨酸钾 0.3 9
丙酸钙 0.3 9
小苏打 0.9 27
酸水 延胡索酸 0.848 24144
制备小麦玉米粉圆饼生面团的步骤：
1.所需生面团温度：32℃
2.在Kemper搅拌器中，于室温进行揉捏。
3.把所有干燥成分放入搅拌罐(任选地，包含脂肪分解酶和/或乳化剂)。
4.干拌1分钟
5.加水。
6.以1档速度搅拌11分钟
7.称取：1350g×3
8.在glimek切块机/面包成圆机上成形成生面团球。
9.在32℃静置10分钟。
10.根据下列设置在玉米粉圆饼(torfilla)烤箱CFO 40中烘烤：顶部：230℃，中部：228℃以及底部：160℃。
11.在20℃、80％相对湿度中冷却12分钟。
将根据本发明的脂肪分解酶以逐渐增加的浓度加入生面团(试验no.3-7)。为了对比，包括对照(试验no.1)和使用来自Danisco A/S的Panodan205乳化剂(试验no.2)。参见表26。
当加入时，将脂肪分解酶、Panodan205以及L-半胱氨酸加入第一个混合过程(上面步骤3和步骤4)。可加入L-半胱氨酸来提高所制作的生面团的伸展性，从而在烘烤之前改进生面团的压面(pressing)加工。
表26.试验设置
成分试验no. 脂肪分解酶 PANODAN205 L-半胱氨酸(ppm)
1 10
2 1.03％ 10
3 100ppm 10
4 200ppm 10
5 400ppm 10
6 1200ppm 10
7 2400ppm 10
通过在室温下进行的冰冻可滚动性测试，评价圆饼，其中圆饼绕着不同直径的木棍进行滚动，开始时使用最大直径的木棍。通过圆饼可绕其不间断地环绕滚动的木棍数目来表示可滚动性。数目越多，可滚动性越好。
肉眼评价  穿透
样品 可滚动性  作用力(g)
1-第7天 2-1-1  432
2-第7天 1-1-1  421
3-第7天 1-1-1  369
4-第7天 2-2-2  439
5-第7天 2-2-1  489
6-第7天 2-1-2  448
7-第7天 2-2-2  533
从该结果，我们得出结论：与控制系统相比，根据本发明的、200ppm或更多的剂量的分解脂肪的蛋白质似乎可产生改善的可滚动性。使用前述的TIPU测定法，可测定为了改善可轧制性所需的活性水平(200ppm剂量)相当于约每公斤面粉650TIPU单位。从该结果，还可得出结论：用于实施穿透测试的作用力在脂肪分解酶的较高水平是增加的，意味着提高了圆饼的抗性。通过利用由Stable Micro System生产的质地分析器TAXT2进行穿透测试，其中测量用于穿透/破碎圆饼所需的作用力。
用下列参数设置仪器：
在Compression中测试作用力
预测试速度      10mm/s
测试速度        2mm/s
测试后速度      10mm/s
破碎测试距离    1mm
距离            25mm
作用力          1g
时间            5秒
测压仪          5kg
温度            20-22℃(室温)
实施例13.在多态汉逊酵母中对编码半裸镰孢(Fusarium Semitectum)(IBT9507)的脂肪分解酶的合成基因的分子克隆、序列分析和异源表达。
用引物通过PCR从基因组DNA克隆F.semitectum脂肪分解酶基因片段，其中从比对的来自不同镰孢菌属株的脂肪分解酶蛋白质序列中的氨基酸保守区设计引物。使用计算机程序CODEHOP(Rose等，2003(Nucleic AcidRes.，18:3763-3766))来设计简并PCR引物。
为了克隆基因末端，使用5′和3′RACE法(Frohman等，1988 Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:8998-9002)。从通过1％葵花籽油诱导的F.semitectum培养物分离全部RNA，并使用用CODEHOP引物得到的基因片段的序列设计所用的引物。
将通过上述方法获得的三种片段在计算机芯片上组装来显示全长cDNA序列。1236个核苷酸长度的cDNA序列的分析显示开放读码框包含352个氨基酸(图33)。
为了在汉逊酵母中表达F.semitectum脂肪分解酶基因，向基因提供来自酵母α交配因子的信号序列，并在FMD启动子之后插入汉逊酵母表达载体pB14中的。将得到的质粒pB14-alp.sem(在图34中图解说明)通过电穿孔法转入多态汉逊酵母感受态细胞。在YND平板上选择转化子，并通过在YND液体培养基中以1∶200稀释度传代10次，进一步选择多次整合基因的菌落。最后，将选择的培养物在YPD培养基中传代两次。
为了确定脂肪分解酶基因的表达水平，将选择的克隆在含1.8％甘油和0.2％葡萄糖的YPD中于37℃培养2天。
实施例14.半裸镰孢脂肪分解酶活性的最适pH和温度的测定
在用于测定磷脂酶和半乳糖脂酶活性的生面团匀浆的功能分析中，使用如实施例8中所述来自半裸镰孢IBT 9507的、并在多态汉逊酵母中表达的根据本发明的脂肪分解酶，并且研究了该酶活性与pH和温度变化的关系。
分析步骤
气相色谱分析
在有盖的12ml离心管中称取0.8克小麦粉。加入含酶的水1.5ml。在Whirley仪上混合样品，并放入加热箱于30℃加热60分钟。加入6mln-丁醇∶乙醇9∶1，再次混合样品直至面粉在溶剂中均匀分布。然后将管放入水浴槽中于95℃加热10分钟。然后再次混合并放在旋转仪上以45rpm旋转45分钟。然后以2000g离心样品10分钟，并将2ml上清转入10ml的打兰杯中。在氮蒸汽中于70℃蒸干溶剂。通过气液色谱分析分离的脂质。
根据实施例1中所述，实施气相色谱和半乳糖脂酶活性测定。
最适温度
磷脂酶活性
对于作为温度的函数的活性测定，如实施例1中所述实施磷脂酶测定，但温度设定为30℃、37℃、45℃、52℃或60℃。
最适pH
磷脂酶活性
对于作为pH的函数的活性测定，如实施例1中所述实施磷脂酶测定，但将0.6％L-α磷脂酰胆碱95％Plant(Avanti#441601)和0.4％Triton-X100(Sigma X-100)溶于pH5、pH6、pH7、pH8或pH9的0.05M磷酸盐缓冲液中。
结果
将根据本发明的、来自半裸镰孢IBT9507的脂肪分解酶用于分析磷脂酶活性PLU-7和半乳糖脂酶活性GLU，结果如表27中所示。
表27.半裸镰孢的酶活
    分析     活性
    磷脂酶半乳糖脂酶     0.8PLU-7/ml1.3GLU/ml
根据所述的方法，在生面团匀浆实验中，通过加入1PLU-7至0.8克面粉，测试半裸镰孢IBT9507。也制备有水而没有酶的对照样品，以及有Lipopan FTM的样品。通过气液色谱分析从生面团提取的脂质，结果如表28所示。
表28.生面团脂质的气液色谱分析，％基于面粉重量。FFA＝游离脂肪酸，MGMG＝单半乳糖甘油一酯，DGMG＝双半乳糖甘油一酯，MGDG＝单半乳糖甘油二酯，DGDG＝双半乳糖甘油二酯，TRI＝甘油三酯。
酶 剂量   FFA％   MGMG％   DGMG％   MGD％   DGDG％   TRI％
对照半裸镰孢Lipopan FTM 01PLU-7/gg面粉1PLU-7/gg面粉   0,1480,2680,229   0,0070,0010,027   0,0250,1200,090   0,0470,0330,016   0,1600,0450,069   0,5160,4460,415
表28中的结果表明与Lipopan FTM相比，来自半裸镰孢的脂肪酶对半乳糖脂具有显著的活性，并对甘油三酯具有相对较少的活性。
也分析半裸镰孢IBT9507对于作为温度(表29)和pH(表30)的函数的活性。
表29.作为温度的函数的半裸镰孢磷脂酶活性
    温度，℃     相对活性，PLU
    3037455260     7992100202
表30.作为pH的函数的半裸镰孢磷脂酶活性
    pH     相对活性，PLU
56789 67831008017
表29和表30中所列的活性也在图35和图36中得到图解举例说明。
结论
根据本发明的、来自半裸镰孢的脂肪分解酶对生面团中半乳糖脂显示很强的活性，并且其对甘油三酯的活性低于Lipopan FTM的甘油三酯活性。该酶酶活的最适温度是约45℃并且最适pH是7。
实施例15：在动物饲料中，根据本发明的脂肪分解酶的用途。
为了评价根据本发明的脂肪分解酶效力，在肉仔鸡(broiler chicken)完全生产时期的正常饲料中使用各种剂量水平的酶。
总结：
初步的结果认为在肉仔鸡的食物中加入根据本发明的脂肪分解酶是用于提高禽类表现、提高营养物保留以及减少氮排泄的有效营养策略。具体地说，初步研究认为将根据本发明的脂肪分解酶加到动物的食物中，可促进体重增加、饲料转化率、动物的干物质和氮代谢能力。
处理细节
处理数目 8
每个处理的重复试验 0-21天，13次重复试验22-42天，9次重复试验
每重复试验的禽类 0-21天，8只/重复试验(大笼6只， 小笼2只)22-42天，2只/重复试验(大笼2只)
禽种 肉仔鸡
饲料 糠或麸
性别 雄
试验范围 0-42天
食物形状(粒状/浆状) 浆状
用到的食物抗球虫剂/生长促进剂 无
禽类称重时期/饲料称重时期 0、21和42天/0、21和42天
放养密度(只/m2)
光设置 0-4天23小时光，4-21天16小时光，22-31天20小时光和32-42天23小时光
房间温度设置
房间湿度设置
接种疫苗设置 Elancoban(幼雏(Starter)定量)
通风空气变化/小时
日料配方和试验时间表
  成分玉米黑麦SBM(48％CP)大豆油盐DL蛋氨酸盐酸赖氨酸石灰石磷酸二钙维生素/矿物质TiO2总计营养供应(计算值)CP(％)ME(kcal/kg)ME(MJ/kg)钙(％)磷(％)平均磷(Av.Phos)(％)     幼雏(Starter)(％55.555.0033.471.850.410.210.051.181.480.500.30100.0021.503000.012.550.900.680.40   肥育鸡(Finisher)(％)59.229.0024.793.060.330.140.101.151.410.500.30100.0018.063125.013.080.850.630.38
脂肪(％)纤维(％)甲硫氨酸(％)半胱氨酸(％)甲硫氨酸+半胱氨酸(％)赖氨酸(％)Try(％)Na(％)     4.482.590.550.360.911.200.250.18     5.732.480.430.320.751.000.200.15
将食物制成含或不含根据本发明的脂肪分解酶的浆状物。
任意提供食物和水。在试验期间，始终连续对测试食物进行补料。任选以330克/吨对饲料样品补充根据本发明的脂肪分解酶。当混合饲料时，酶以干酶形式加入。
对如下进行观察：
活重(笼养(cage basis))：    第0、21和42天
体重增加：                  第0-21天、22-42天、0-42天
饲料摄取：                  第0-21天、22-42天、0-42天
FCR(食物转化率)：           第0-21天、22-42天、0-42天
收集肠内容物：              第21天和42天
测定饲料和禽类的总笼重，以及在每个分析时期各笼的禽总死亡重量和数量。不校正死亡数而测定每笼的饲料消耗量。以每只活重和总重(包括死亡的重量)的全部消耗量为基础测定饲料转化率数据。
在开始研究之前，检查动物不健康和病害的病征。从研究中除去任何似乎情况不佳的个体。
使用随机化技术，将研究动物分配到它们的处理组。在开始投放测试饲料前，逐一确定动物和它们的围栏。
使用合适的统计测试法，将处理组的数据与它们的相关对照组数据进行比较，并设定低于0.05的概率水平来表示显著性。
通过方差分析和最小显著差异检测来分析体重、食物摄入和食物转化率。
动物
处理数：          2
重复次数：        第13至21天和第9至42天
每次重复的动物：  第8至21天和第2至42天
物种：            肉仔鸡
动物饲料：        糠皮
性别：            雄
待测动物天龄：    0-42天
待测动物重：      ～40克
食物/禽舍
食物信息：        参见上文
食物形状：        浆状
幼雏球虫抑制剂：  无
肥育鸡球虫抑制剂：无
幼雏生长促进剂：  无
肥育鸡生长促进剂：无
主要测量安排
变量：体重增加、饲料转化、营养消化性
时间：第0-21天、22-42天
酶/添加剂
用到的酶(1)：来自半裸镰孢和/或异孢镰孢的脂肪分解酶-330克/吨
实施例16：评价异孢镰孢CBS 782.83脂肪分解酶对由中国面粉制造 方便面质量的影响。
导言
在东南亚最近5-8年中，方便面(IN)市场出现显著的发展，在欧洲和美国也出现一定程度的发展。甚至在传统上以水稻和/或意大利面为主的市场的地区中，该发展是明显的(Food Navigator，2000)。IN的最新流行主要归因于其可承受的成本、方便和干净的生产过程。
具有平均蛋白含量(9-11％)、低灰分值(～0.50％)、高L*(85)光泽以及b*(＞8.0)黄色和高淀粉糊粘度(＜750 BU)的面粉，可生产奶油色/黄色方便面(IN)，并具有期望的口感特征。所吃的有几种不同类型的面条，每种具有可影响成品质量的特殊面粉质量特性。
由于最终产品的巨大数量和顾客期待的广泛性，满足最终用户的需求在面粉工业中是极富挑战性的。正确剂量的特别设计的成分和添加剂在改进最终成品的味道、质地、外观、保存期限和/或营养价值中起非常重要的作用。
虽然不能低估煮熟的面条的色泽和质地的重要性，顾客正具有更强的辨别力和健康意识，并寻找在不牺牲质量情况下的低脂替代品。
用根据本发明的脂肪分解酶对中国面粉进行测试，以评价对IN脂肪含量的影响，并研究在加工期间质地和色泽的变化。
材料与方法
将用于IN生产的标准的农业食品技术方法和延伸的评价法用于该项目。中国面粉作为对照面粉并在每天开始时进行测定。使用AACC(美国临床化学协会)批准的方法，测定中国面粉的蛋白含量、水分、灰度、色泽、湿面筋以及淀粉酶活力。生面团流变学测试包括：淀粉测定记录图、拉伸曲线图(牵引45分钟)、面团吹泡张力曲线图以及淀粉粘焙力曲线图。
IN生产概括如下：
每批IN由350g面粉制成，并在逐步加入含有1％氯化钠和0.2％碱性盐(比值6∶4的碳酸钾∶碳酸钠)的33份水性盐溶液的期间，进行低速混合。对于给定剂量的样品，在加入水性盐溶液之前，将面粉与已测数量的成份进行彻底混合。
将易碎的生面团以中速进一步混合4分钟，并压片8次。用钢制压实机开始压片，随后通过两个塑料槽纹辊，以及最后通过五个不锈钢光面辊，每次滚轧之间30％减低(reduction)比。最终的面片厚度是1.35mm。在切割之前，将面片再一次压片。在切割辊和传送带之间的速度差异，导致形成紧密卷曲物。将紧密卷曲的面条链蒸两分钟，并在棕榈油中于180℃进行两面油炸1分钟。冷却面条块并装进箝紧封口的袋中，以备进一步分析。
在生产的几个阶段收集样品以备分析。使用Minolta Chromameter和游标卡尺，分别测定面包屑的色泽和粒径。用Minolta Chromameter记录面片和成品的色泽，并拍摄两者的数码照片(未显示)。对蒸过的面条进行水活度测量。通过测定蒸过的面条的重量测量水活度，面条重量的测定在蒸过之后立刻进行，或在烤箱中于900℃干燥而完全除去水分之后进行，然后用干燥前和干燥后的重量差来除以干燥后的重量来测定水分含量。
使用对本领域技术人员所知的标准农业食品技术步骤，测量最适烹饪时间、烹饪产量、烹饪损耗(重量分析法)、煮熟的面条的色泽和质地(硬度)。也可对煮熟的面条的质地进行质地剖面(profile)分析(TPA)，以便测量粘结性、弹性和咀嚼性。
粘结性定义为相对于产品在第一次变形中的表现其抵抗第二次变形的能力。用第二次压缩中的工作面积除以第一次压缩中的工作面积对其加以测量，因此没有测量单位。在这种情况下，粘结性涉及“咬起来硬的”产品，这对于IN不是所期望的性质。
弹性定义为在第一次压缩中产品已变形之后，产品能物理回弹的多少程度。以几种方式测量弹性，但最典型通过产品的检测高度对第二次压缩的距离进行。
咀嚼性仅仅适用于固体产品，并以胶粘性乘以弹性进行计算。咀嚼性是与胶粘性互相排斥的。
代表每个剂量等级的一个面条块在咖啡磨碎机中研碎，并通过酸水解法(或者可使用适于测定脂肪含量的其它标准方法)将同质的子样品用于脂肪分析。
结果与讨论
面粉的蛋白含量和色泽(涉及亮度、L*)落在用于生产方便面的可接受范围内。对于IN生产而言，水吸收稍微有点高；然而，由于面条生面团是相当易碎的，因此它不影响机械加工性。
面粉具有良好的单(拉伸曲线图)和双(面团吹泡张力曲线图)轴伸展性，这对面条的食用品质具有正面影响。淀粉粘焙力测量法的最大粘度是870BU，这对于IN是合意的。
含有第二高剂量的脂肪分解酶的IN的烹饪损耗，高于对照和含有最小量的根据本发明的脂肪分解酶的IN。具有最大量脂肪分解酶的IN的脂肪含量明显低于对照和具有最小量脂肪分解酶的试验性IN。一些试验性IN的弹性和咀嚼性优于对照。根据这些数据，在不同剂量下进一步研究脂肪分解酶。
结论
从这些研究中，可得到的一些突出点是：
将根据本发明的脂肪分解酶加入IN中，并不显著地影响面包屑大小、生面团粘性、可机械加工性或加工性能。重要的是，提高脂肪分解酶剂量，引起IN脂肪含量的减少。与对照相比，当剂量增加时，脂肪分解酶可提高面条硬度，而不影响粘结性。脂肪分解酶对烹饪过的面条的黄色具有积极效果。
因此在IN中，脂肪分解酶可减少脂肪含量、改善烹饪过的面条的质地以及增强其黄色。
所有在上述说明书中提到的出版物在此处引用作为参考。对本领域技术人员显而易见的是，不脱离本发明的范围和精神下，可对本发明所述的方法和系统进行各种修饰和改变。尽管通过具体优选实施方案描述了本发明，应当理解的是所要求保护的发明不应该不正当地被限制于所述的具体实施方案。事实上，用于实施本发明所述方式的各种修饰(对于生物化学和生物技术领域或相关领域的技术人员是显而易见的)，意味着落入下列权利要求的范围内。

Claims (19)

1.一种真菌野生型脂肪分解酶，相对于甘油三酯而言，其对于极性脂质具有更高活性。
2.根据权利要求1中所述的真菌脂肪分解酶，其中所述的酶具有至少为4的磷脂∶甘油三酯水解活性比。
3.根据权利要求1中所述的真菌脂肪分解酶，其中所述的酶具有至少为1.5的糖脂∶甘油三酯水解活性比。
4.一种真菌脂肪分解酶，其中所述的酶包含如SEQ ID No.1或SEQ IDNo.2所示的氨基酸序列或与上述序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
5.根据前述任何一项权利要求中所述的真菌脂肪分解酶，其中可从丝状真菌获得该酶。
6.根据前述任何一项权利要求中所述的真菌脂肪分解酶，其中可从镰孢属获得该酶。
7.根据权利要求6中所述的真菌脂肪分解酶，其中可从异孢镰孢获得该酶。
8.根据权利要求7中所述的真菌脂肪分解酶，其中可从异孢镰孢CBS782.83获得该酶。
9.编码根据权利要求4-8中任何一项所述的真菌脂肪分解酶的核苷酸序列。
10.一种编码真菌脂肪分解酶的核酸，其中核酸选自下列中的一种或多种：
a)包含如SEQ ID No.3中所示的核苷酸序列的核酸；
b)通过遗传密码子的简并性与SEQ ID No.3的核苷酸序列相关的核酸；或
c)包含与SEQ ID No.3中所示的核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列的核酸。
11.一种制作食品的方法，包括将根据权利要求1-8中任何一项所述的真菌脂肪分解酶加入一种或多种食品成分中。
12.一种制作烘烤食品的方法，包括将根据权利要求1-8中任何一项所述的真菌脂肪分解酶加入生面团中，并烘烤生面团直到制成烘烤食品。
13.根据权利要求11中所述的方法，其中食品是下列中的一种或多种：蛋或蛋制品；烘烤食品；糖果；冷冻产品；包括乳酪的乳制品；奶油冻；搅打的植物乳脂；食用油和脂肪；充气和非充气的搅打的产品；水包油乳化剂和油包水乳化剂；人造黄油；起酥油；涂抹食品，包括低脂以及极低脂涂抹食品；调味品；蛋黄酱；蘸酱；以奶油为基础的调味汁；以奶油为基础的汤；饮料；香料乳剂以及调味汁。
14.一种制备溶血磷脂的方法，包括用根据权利要求1-8中任何一项所述的真菌脂肪分解酶处理磷脂来产生溶血磷脂。
15.一种制备溶血糖脂的方法，包括用根据权利要求1-8中任何一项所述的真菌脂肪分解酶处理糖脂来产生溶血糖脂。
16.一种对植物油或食用油进行酶促脱胶的方法，包括用根据权利要求1-8中任何一项所述的真菌脂肪分解酶处理食用油或植物油，来水解其中存在的大部分极性脂质。
17.通过根据权利要求11的方法所获得的食品。
18.通过权利要求12的方法所获得的烘烤食品。
19.一种真菌脂肪分解酶，如通常在上文所描述的，并参照说明书和附图。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102459581A (zh) * 2009-06-25 2012-05-16 丹尼斯科公司 蛋白质
CN109072204A (zh) * 2016-04-29 2018-12-21 焙乐道有限责任公司 改善的烘焙制品
CN109414029A (zh) * 2016-07-11 2019-03-01 焙乐道有限责任公司 改进的烘焙组合物
CN110685020A (zh) * 2019-11-11 2020-01-14 南宁雄晋生物科技有限公司 一种用于天然彩色蚕丝脱胶固色的复合酶及其使用方法
CN115152957A (zh) * 2022-06-30 2022-10-11 东莞市永恒食品有限公司 一种低糖黄油蛋卷及其制作方法

Families Citing this family (58)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6936289B2 (en) 1995-06-07 2005-08-30 Danisco A/S Method of improving the properties of a flour dough, a flour dough improving composition and improved food products
AU752215B2 (en) 1998-07-21 2002-09-12 Dupont Nutrition Biosciences Aps Foodstuff
US7312062B2 (en) 1998-11-27 2007-12-25 Novozymes A/S Lipolytic enzyme variants
CA2444960C (en) 2001-05-18 2011-08-09 Danisco A/S Method of improving dough and bread quality
US20050196766A1 (en) 2003-12-24 2005-09-08 Soe Jorn B. Proteins
MXPA05007653A (es) 2003-01-17 2005-09-30 Danisco Metodo.
US7955814B2 (en) 2003-01-17 2011-06-07 Danisco A/S Method
US7718408B2 (en) 2003-12-24 2010-05-18 Danisco A/S Method
US7906307B2 (en) 2003-12-24 2011-03-15 Danisco A/S Variant lipid acyltransferases and methods of making
GB0716126D0 (en) 2007-08-17 2007-09-26 Danisco Process
GB0405637D0 (en) 2004-03-12 2004-04-21 Danisco Protein
AU2005263954B2 (en) 2004-07-16 2011-04-07 Dupont Nutrition Biosciences Aps Enzymatic oil-degumming method
WO2007090829A2 (en) * 2006-02-06 2007-08-16 Novozymes A/S Screening method for selecting lipolytic enzymes as bakery improvers
BRPI0708229A2 (pt) * 2006-02-23 2011-05-17 Dsm Ip Assets Bv lipases e seus usos
WO2008006781A2 (en) 2006-07-14 2008-01-17 Novozymes A/S Polypeptides having lipase activity and polynucleotides encoding same
RU2470996C2 (ru) * 2007-01-11 2012-12-27 ДАНИСКО ЮЭс ИНК., ДЖЕНЕНКОР ДИВИЖН Способ получения белка
JP5124593B2 (ja) 2007-01-25 2013-01-23 デュポン ニュートリション バイオサイエンシーズ エーピーエス 形質転換バチルス・リケニフォルミス細胞からの脂質アシルトランスフェラーゼの製造
US8338133B2 (en) 2007-01-30 2012-12-25 Mitsubishi-Kagaku Foods Corporation DNA encoding glyceroglycolipid lipase
EP2235151B1 (en) * 2007-12-21 2012-09-12 DuPont Nutrition Biosciences ApS Process for edible oil refining using a lipid acyltransferase
US8637101B2 (en) 2008-02-29 2014-01-28 Dsm Ip Assets B.V. Lipases with high specificity towards short chain fatty acids and uses thereof
AR075137A1 (es) 2009-01-16 2011-03-09 Danisco Generacion enzimatica de lipidos funcionales a partir de cereales o flujos secundarios de cereales
BRPI1012562B1 (pt) 2009-03-31 2020-10-27 Dupont Nutrition Biosciences Aps método para reduzir a cor e/ou sabor desagradável e/ou desenvolvimento de mau cheiro em um farelo de cereal solubilizado
GB0922467D0 (en) * 2009-04-24 2010-02-03 Danisco Feed supplement
US20120058222A1 (en) * 2009-05-19 2012-03-08 Danisco A/S Use
WO2011114251A1 (en) 2010-03-18 2011-09-22 Danisco A/S Foodstuff
DK2401923T3 (da) * 2010-06-30 2013-06-10 Loders Croklaan Bv Forarbejdning af vegetabilske olier
WO2012021735A2 (en) * 2010-08-11 2012-02-16 Menon & Associates, Inc. Pharmaceutical products from gungal strains
EP2486799A1 (en) * 2011-02-14 2012-08-15 DSM IP Assets B.V. Method to produce cake with lipolytic enzyme and alpha-amylase
WO2012130969A1 (en) * 2011-03-29 2012-10-04 Novozymes A/S Process for production of a baked product
US20140031272A1 (en) 2011-04-08 2014-01-30 Danisco Us Inc. Compositions
JP6216495B2 (ja) * 2011-04-19 2017-10-18 三菱ケミカルフーズ株式会社 小麦粉膨化食品の製造方法
PT2731451T (pt) 2011-07-12 2018-11-27 Impossible Foods Inc Métodos e composições para produtos de consumo
US20140220217A1 (en) 2011-07-12 2014-08-07 Maraxi, Inc. Method and compositions for consumables
AU2012281069B2 (en) 2011-07-12 2016-10-13 Impossible Foods Inc. Methods and compositions for consumables
EP4345161A3 (en) * 2011-10-28 2024-06-12 Danisco Us Inc Variant maltohexaose-forming alpha-amylase variants
WO2013135822A1 (en) * 2012-03-14 2013-09-19 Novozymes A/S Method of baking
US10039306B2 (en) 2012-03-16 2018-08-07 Impossible Foods Inc. Methods and compositions for consumables
DK2840900T3 (da) * 2012-04-25 2019-09-09 Novozymes As Fremgangsmåde til bagning
WO2013181647A2 (en) 2012-06-01 2013-12-05 Danisco Us Inc. Compositions and methods of producing isoprene and/or industrrial bio-products using anaerobic microorganisms
US8442792B1 (en) 2012-10-26 2013-05-14 Elbex Video Ltd. Method and apparatus for calibrating intelligent AC outlets
EP2943077B1 (en) 2013-01-11 2018-10-31 Impossible Foods Inc. Non-dairy ricotta cheese replica
CA3212857A1 (en) 2013-01-11 2014-07-17 Impossible Foods Inc. Methods and compositions for affecting the flavor and aroma profile of consumables
ES2728307T3 (es) 2013-06-21 2019-10-23 Danisco Us Inc Composiciones y métodos para la transformación clostridial
CN111500552A (zh) 2014-03-12 2020-08-07 诺维信公司 具有脂肪酶活性的多肽和编码它们的多核苷酸
CA2944459C (en) 2014-03-31 2023-03-14 Impossible Foods Inc. Ground meat replicas
GB201522603D0 (en) 2015-12-22 2016-02-03 Dupont Nutrition Biosci Aps Composition
CA3045071A1 (en) * 2016-11-30 2018-06-07 Novozymes A/S Method of baking
WO2018114912A1 (en) * 2016-12-21 2018-06-28 Dsm Ip Assets B.V. Lipolytic enzyme variants
WO2018114941A1 (en) * 2016-12-21 2018-06-28 Dsm Ip Assets B.V. Lipolytic enzyme variants
WO2018114938A1 (en) * 2016-12-21 2018-06-28 Dsm Ip Assets B.V. Lipolytic enzyme variants
EP3559221A1 (en) 2016-12-21 2019-10-30 DSM IP Assets B.V. Lipolytic enzyme variants
EP3461350A1 (en) 2017-09-28 2019-04-03 DuPont Nutrition Biosciences ApS A food composition with enhanced shelf stability
WO2019121874A1 (en) 2017-12-19 2019-06-27 Dupont Nutrition Biosciences Aps Composition comprising lecithin and triglycerides
PE20211298A1 (es) 2017-12-19 2021-07-20 Dupont Nutrition Biosci Aps Modificacion enzimatica mejorada de fosfolipidos en alimentos
EP4225046A1 (en) * 2021-05-07 2023-08-16 The Better Meat Company Enhanced aerobic fermentation methods for producing edible fungal mycelium blended meats and meat analogue compositions
WO2023092018A1 (en) 2021-11-17 2023-05-25 Dupont Nutrition Biosciences Aps Improved enzymatic modification of galactolipids in food
CN115074180A (zh) * 2022-05-18 2022-09-20 中国农业科学院油料作物研究所 油料提质生香的预处理装置及方法
WO2024015974A1 (en) * 2022-07-15 2024-01-18 Dupont Nutrition Biosciences Aps Improved enzymatic modification of phospholipids in food

Family Cites Families (253)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AT110768B (de) 1927-09-29 1928-10-10 Patiag Patentverwertungs Und I Windkraftmaschine.
US2888385A (en) 1952-11-28 1959-05-26 Grandel Felix Process of making a preparation containing lipases and oxidases
US3260606A (en) 1964-04-29 1966-07-12 Taiyo Food Co Ltd Enzymatic treatment of egg
GB1092775A (en) 1965-07-07 1967-11-29 Knud Aunstrup Preparation of amyloglucosidase
US3368903A (en) 1966-02-18 1968-02-13 Vanderbilt Co R T Baked goods dough and method
CH461935A (fr) 1966-05-03 1968-08-31 Menzi Robert Procédé de fabrication de pâtes alimentaires séchées
DE1900959A1 (de) 1969-01-09 1970-08-27 Unilever Nv Verfahren zur Herstellung von Pflanzenphosphatiden mit universeller Emulgierkraft
US3634195A (en) 1969-09-08 1972-01-11 Miles Lab Production of lipase
NL154598B (nl) 1970-11-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking.
US3817837A (en) 1971-05-14 1974-06-18 Syva Corp Enzyme amplification assay
GB1375783A (zh) 1972-02-04 1974-11-27
GB1442418A (en) 1972-12-14 1976-07-14 Procter & Gamble Method of cleansing polyester-containing fabrics
IL46862A (en) 1974-04-08 1977-12-30 Baxter Travenol Lab Lipolytic enzyme flavoring system for fat-containing food
US3939350A (en) 1974-04-29 1976-02-17 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Fluorescent immunoassay employing total reflection for activation
US3973042A (en) 1974-05-10 1976-08-03 Cornell Research Foundation, Inc. Flavor development by microbial lipases in pasteurized milk blue cheese
US3996345A (en) 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
GB1525929A (en) 1974-11-25 1978-09-27 Unilever Ltd Stabilised emulsions comprising phospholipoprotein
GB1577933A (en) 1976-02-11 1980-10-29 Unilever Ltd Fat process and composition
US4160848A (en) 1977-04-18 1979-07-10 Pennwalt Corporation Antistaling agent for bakery products
JPS6049477B2 (ja) 1977-04-19 1985-11-01 協和醗酵工業株式会社 グリセロ−ル酸化酵素およびその製造法ならびにグリセロ−ル酸化酵素を用いるグリセロ−ルの定量法
US4277437A (en) 1978-04-05 1981-07-07 Syva Company Kit for carrying out chemically induced fluorescence immunoassay
US4275149A (en) 1978-11-24 1981-06-23 Syva Company Macromolecular environment control in specific receptor assays
JPS5850719B2 (ja) 1978-10-18 1983-11-11 協和醗酵工業株式会社 トリグリセライドの定量方法
US4399218A (en) 1980-02-05 1983-08-16 Boehringer Mannheim Gmbh Method and reagent for the determination of glycerin
US4366241A (en) 1980-08-07 1982-12-28 Syva Company Concentrating zone method in heterogeneous immunoassays
EP0064855B1 (en) 1981-05-07 1986-09-17 Unilever Plc Fat processing
JPS6030488B2 (ja) 1982-11-10 1985-07-17 協和醗酵工業株式会社 生地の改良剤およびそれを含有してなる生地
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
DK289083A (da) 1983-06-23 1984-12-24 Novo Industri As Lipase, fremgangsmaade til fremstilling deraf og anvendelse deraf
DK402583D0 (da) 1983-09-05 1983-09-05 Novo Industri As Fremgangsmade til fremstilling af et immobiliseret lipasepraeparat og anvendelse deraf
DK152763C (da) 1983-09-05 1988-10-24 Novo Industri As Fremgangsmaade til fremstilling af et immobiliseret lipasepraeparat
US4707364A (en) 1984-01-27 1987-11-17 Miles Laboratories, Inc. Composition for accelerating cheese aging
US4636468A (en) 1984-06-25 1987-01-13 Genencor, Inc. Lipolytic enzyme derived from a aspergillus microorganism having an accelerating effect on cheese flavor development
CA1262654A (en) 1984-08-10 1989-11-07 Takaoki Torigoe Food quality improving agent
NL8402979A (nl) 1984-09-28 1986-04-16 Tno Werkwijze voor het bestrijden van vaatverwelkingsziekten bij gewassen, in het bijzonder de iepeziekte.
JPS61181390A (ja) 1985-02-06 1986-08-14 Amano Pharmaceut Co Ltd 酵素によるグリセライドの製造法
US4689297A (en) 1985-03-05 1987-08-25 Miles Laboratories, Inc. Dust free particulate enzyme formulation
US5219733A (en) 1985-03-06 1993-06-15 Yoshikawa Oil & Fat Co., Ltd. Process for preparing fatty acid esters
DE3672270D1 (de) 1985-03-06 1990-08-02 Yoshikawa Oil & Fat Verfahren zur herstellung von fettsaeureestern.
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
JPS61242542A (ja) 1985-04-22 1986-10-28 Fuji Oil Co Ltd チ−ズ風味材の製造法
US5310679A (en) 1985-05-13 1994-05-10 Artiss Joseph D Composition for reducing turbidity in samples of biological fluids
GB8514708D0 (en) 1985-06-11 1985-07-10 Unilever Plc Enzymatic detergent composition
GB8514707D0 (en) 1985-06-11 1985-07-10 Unilever Plc Enzymatic detergent composition
DK154572C (da) 1985-08-07 1989-04-24 Novo Industri As Enzymatisk detergentadditiv, detergent og fremgangsmaade til vask af tekstiler
GB8525012D0 (en) 1985-10-10 1985-11-13 Cpc International Inc Carbohydrate refining process
GB2185990B (en) 1986-02-05 1990-01-24 Unilever Plc Margarine fat
US5766912A (en) 1986-03-17 1998-06-16 Novo Nordisk A/S Humicola lipase produced in aspergillus
US5874558A (en) 1986-03-17 1999-02-23 Novo Nordisk Nucleic acid encoding a recombinant humicola sp. lipase
DK122686D0 (da) 1986-03-17 1986-03-17 Novo Industri As Fremstilling af proteiner
US5536661A (en) 1987-03-10 1996-07-16 Novo Nordisk A/S Process for the production of protein products in aspergillus
JPS62262997A (ja) 1986-05-02 1987-11-16 ノボ　ノルディスク　アクティーゼルスカブ ワツクスの製造方法
JPS6344892A (ja) 1986-08-13 1988-02-25 Kao Corp 油脂類のエステル交換反応方法
US4810414A (en) 1986-08-29 1989-03-07 Novo Industri A/S Enzymatic detergent additive
DK157560C (da) 1986-08-29 1990-06-11 Novo Nordisk As Enzymatisk detergentadditiv, detergent indeholdende det enzymatiske detergentadditiv og fremgangsmaade til vask af tekstiler.
EP0260573A3 (de) 1986-09-18 1989-03-22 Lucas Meyer GmbH & Co Verfahren zur Herstellung eines hydrolysierten Lecithins, sowie Anwendung des hydrolysierten Lecithins
US5273898A (en) 1986-10-17 1993-12-28 Noro Nordisk A/S Thermally stable and positionally non-specific lipase isolated from Candida
US5108457A (en) 1986-11-19 1992-04-28 The Clorox Company Enzymatic peracid bleaching system with modified enzyme
KR900003014B1 (ko) 1986-12-27 1990-05-04 도오아 야꾸힌 고오교오 가부시끼가이샤 양식어(養殖魚)용 사료 첨가제
US5219744A (en) 1987-08-26 1993-06-15 Ajinomoto Co., Inc. Process for modifying fats and oils
DE3854249T2 (de) 1987-08-28 1996-02-29 Novo Nordisk As Rekombinante Humicola-Lipase und Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Humicola-Lipasen.
DE3872196T3 (de) 1987-12-21 2000-04-20 Dsm Nv Methode zur Verbesserung von Mehlteig.
DK6488D0 (da) * 1988-01-07 1988-01-07 Novo Industri As Enzymer
DK77788A (da) 1988-02-16 1989-08-17 Novo Industri As Fremgangsmaade til fremstilling af kokosnoedolie
JP3079276B2 (ja) 1988-02-28 2000-08-21 天野製薬株式会社 組換え体ｄｎａ、それを含むシュードモナス属菌及びそれを用いたリパーゼの製造法
EP0334462B2 (en) 1988-03-25 2002-04-24 Genencor International, Inc. Molecular cloning and expression of genes encoding lipolytic enzymes
US5232846A (en) 1988-08-09 1993-08-03 Unitika Ltd. Method for producing a thermostable lipoprotein lipase from streptomyces
GB8906837D0 (en) 1989-03-23 1989-05-10 Unilever Plc Bread improvers
DE3920561A1 (de) 1989-06-23 1991-01-10 Knoll Ag Verfahren zur vermeidung von verdauungsstoerungen bei pflanzenfressenden tieren
US5213968A (en) 1989-08-21 1993-05-25 Nestec S.A. Process for preparing emulsifying agents
DK0426211T3 (da) 1989-09-29 1994-01-31 Unilever Plc Næringsmiddelprodukt indeholdende tørret lyso-phospholipoprotein
US5677160A (en) 1989-10-30 1997-10-14 Henkel Corporation Fat splitting process
US5288619A (en) 1989-12-18 1994-02-22 Kraft General Foods, Inc. Enzymatic method for preparing transesterified oils
JPH03262492A (ja) 1990-03-06 1991-11-22 P Macneil Gerald モノグリセリドの製造方法
DK19991D0 (da) 1991-02-06 1991-02-06 Novo Nordisk As Proteinpraeparationer
KR100225087B1 (ko) 1990-03-23 1999-10-15 한스 발터라벤 피타아제의 식물내 발현
ATE118545T1 (de) 1990-05-09 1995-03-15 Novo Nordisk As Eine ein endoglucanase enzym enthaltende zellulasezubereitung.
US5814501A (en) 1990-06-04 1998-09-29 Genencor International, Inc. Process for making dust-free enzyme-containing particles from an enzyme-containing fermentation broth
EP0468731A1 (en) 1990-07-26 1992-01-29 Oriental Yeast Co., Ltd. Bread improver and method of producing bread
US5869438A (en) 1990-09-13 1999-02-09 Novo Nordisk A/S Lipase variants
ES2121786T3 (es) 1990-09-13 1998-12-16 Novo Nordisk As Variantes de lipasa.
US5892013A (en) 1990-09-13 1999-04-06 Novo Nordisk A/S Lipase variants
CA2058056C (en) 1990-12-21 1996-11-05 Chiaki Saito Method of decreasing cholesterol concentration in food
PH31068A (en) 1991-03-07 1998-02-05 Ici Plc Process for the production of terephthalic acid.
DE4112440C1 (zh) 1991-04-16 1992-10-22 Diagen Institut Fuer Molekularbiologische Diagnostik Gmbh, 4000 Duesseldorf, De
ES2121854T3 (es) 1991-05-01 1998-12-16 Novo Nordisk As Enzimas estabilizadas.
DE4115938A1 (de) 1991-05-16 1992-11-19 Metallgesellschaft Ag Enzymatisches verfahren zur verminderung des gehaltes an phosphorhaltigen bestandteilen in pflanzlichen und tierischen oelen
CA2077020A1 (en) 1991-09-03 1993-03-04 Yoshikazu Isono Process for producing lipoprotein-containing substance having reduced lipid content and food containing substance thus produced
US5879920A (en) 1991-10-07 1999-03-09 Genencor International, Inc. Coated enzyme-containing granule
ES2082354T3 (es) 1991-11-11 1996-03-16 Akzo Nobel Nv Procedimiento para la preparacion de granulados de sal.
EP0558112A1 (en) 1992-02-25 1993-09-01 Unilever N.V. Enzymic diglyceride removal
CA2079839A1 (en) 1992-02-28 1993-08-29 Vincent Destefanis Calcium peroxide and ascorbic acid containing compositions as replacements for bromate in breadmaking
GB2267033B (en) 1992-03-07 1996-01-24 David Garnett Lysophospholipid Animal Feed Supplement
DK42092D0 (zh) 1992-03-27 1992-03-27 Novo Nordisk As
DK73592D0 (da) 1992-06-03 1992-06-03 Novo Nordisk As Nyt enzym
DK0575133T4 (da) 1992-06-16 2008-10-20 Sankyo Lifetech Company Ltd Hidtil ukendt Phospholipase A1, fremgangsmåde til fremstilling deraf og anvendelsen deraf
DK88892D0 (da) 1992-07-06 1992-07-06 Novo Nordisk As Forbindelse
EP0580252A2 (en) 1992-07-20 1994-01-26 Quest International B.V. Improvements in or relating to pectin methyl esterase
EP0585988B1 (en) 1992-07-27 1996-03-13 Gist-Brocades N.V. Enzyme product and method for improving bread quality
DK104592D0 (da) 1992-08-21 1992-08-21 Novo Nordisk As Fremgangsmaade
AU666443B2 (en) 1992-12-10 1996-02-08 Dsm N.V. Production of heterologous proteins in filamentous fungi
CA2152342A1 (en) 1992-12-22 1994-07-07 Miyoko Hashida Alkaline lipases
DK154292D0 (da) 1992-12-23 1992-12-23 Novo Nordisk As Nyt enzym
JP2937746B2 (ja) 1993-04-25 1999-08-23 昭和産業株式会社 油脂の精製方法
ZA943640B (en) 1993-06-07 1995-01-26 Buckman Labor Inc Synergistically stabilized liquid enzymatic compositions
JP2859520B2 (ja) 1993-08-30 1999-02-17 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ リパーゼ及びそれを生産する微生物及びリパーゼ製造方法及びリパーゼ含有洗剤組成物
EP0650669B1 (en) 1993-10-29 2002-01-09 Dsm N.V. Baking improver compositions
EP0652289A1 (en) 1993-11-05 1995-05-10 Unilever Plc Random interesterification of triglyceride fats
DE4339556C1 (de) 1993-11-19 1995-02-02 Metallgesellschaft Ag Verfahren zum Entschleimen von Pflanzenöl mittels Enzymen
EP1090553A3 (en) 1993-12-24 2001-04-18 Dsm N.V. Dry yeast compositions
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
US6117679A (en) 1994-02-17 2000-09-12 Maxygen, Inc. Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination
EP0746608B1 (en) 1994-02-21 2003-08-20 Novozymes A/S Method for production of an immobilized enzyme preparation and use of the immobilized enzyme preparation
KR970701264A (ko) 1994-02-22 1997-03-17 안네 제케르 지질분해효소의 변이체 제조방법(a method of preparing a viriant of a lipolytic enzyme)
US5834280A (en) 1994-05-03 1998-11-10 Novo Nordisk A/S Glucose oxidases obtained from a cladosporium
US5741665A (en) 1994-05-10 1998-04-21 University Of Hawaii Light-regulated promoters for production of heterologous proteins in filamentous fungi
EP0682116B1 (en) 1994-05-11 1997-12-17 Amano Pharmaceutical Co., Ltd. Ascorbate oxidase, gene encoding the same, process for producing the same, and reagent composition using the same
WO1995034222A1 (fr) 1994-06-16 1995-12-21 Firmenich S.A. Procede d'aromatisation et composition aromatisante
EP0687414B1 (en) 1994-06-17 2000-11-08 Dsm N.V. Bread improving composition
AU3697995A (en) 1994-10-26 1996-05-23 Novo Nordisk A/S An enzyme with lipolytic activity
AU3741995A (en) 1994-10-26 1996-05-23 Novo Nordisk A/S Enzymatic detergent composition
US5830736A (en) 1994-10-26 1998-11-03 Novo Nordisk A/S Lipolytic enzyme
GB2296011B (en) 1994-12-13 1999-06-16 Solvay Novel fusarium isolate and lipases, cutinases and enzyme compositions derived therefrom
US6093562A (en) * 1996-02-05 2000-07-25 Novo Nordisk A/S Amylase variants
CA2212791C (en) 1995-02-22 2001-01-23 Chris Ritter Process for reducing sterols and free fatty acids from animal fat
JPH08228778A (ja) 1995-02-27 1996-09-10 Showa Denko Kk 新規なリパーゼ遺伝子及びそれを用いたリパーゼの製造方法
JP3359777B2 (ja) 1995-03-06 2002-12-24 日清製粉株式会社 油揚げ即席麺およびその製造方法
US5919746A (en) 1995-03-30 1999-07-06 Novo Nordisk A/S Alkaline lipolytic enzyme
AU5002096A (en) 1995-03-30 1996-10-16 Novo Nordisk A/S Alkaline lipolytic enzyme
US5989599A (en) 1995-04-24 1999-11-23 Nestec S.A. Process for the interesterification of phospholipids
EP0743017B1 (en) 1995-05-15 2004-09-29 DSM IP Assets B.V. Application of phospholipases in animal feed
GB2301103B (en) 1995-05-23 1999-12-22 Danisco An enzyme system comprising ferulic acid esterase
AU699331C (en) * 1995-06-07 2005-08-25 Dupont Nutrition Biosciences Aps A method of improving the properties of a flour dough, a flour dough improving composition and improved food products
US6936289B2 (en) * 1995-06-07 2005-08-30 Danisco A/S Method of improving the properties of a flour dough, a flour dough improving composition and improved food products
GB0211975D0 (en) 2002-05-24 2002-07-03 Danisco Method
GB0112226D0 (en) * 2001-05-18 2001-07-11 Danisco Method of improving dough and bread quality
ZA964616B (en) 1995-06-07 1996-12-12 Bioteknologisk Inst Recombinant hexose oxidase a method of producing same and use of such enzyme
US6495357B1 (en) 1995-07-14 2002-12-17 Novozyme A/S Lipolytic enzymes
WO1997004079A1 (en) 1995-07-14 1997-02-06 Novo Nordisk A/S A modified enzyme with lipolytic activity
DE19527274A1 (de) 1995-07-26 1997-01-30 Metallgesellschaft Ag Enzymatisches Verfahren zur Entschleimung von pflanzlichen Ölen mit Aspergillus-Phospholipase
AU6655196A (en) 1995-08-11 1997-03-12 Novo Nordisk A/S Novel lipolytic enzymes
EP0866796B1 (en) 1995-09-22 2000-11-29 Amersham Pharmacia Biotech UK Limited Improvements in or relating to mutagenesis of nucleic acids
ATE212189T1 (de) 1995-12-01 2002-02-15 Unilever Nv Mikrowellen erhitzbare knusperige brötchen
US6344328B1 (en) 1995-12-07 2002-02-05 Diversa Corporation Method for screening for enzyme activity
US6361974B1 (en) 1995-12-07 2002-03-26 Diversa Corporation Exonuclease-mediated nucleic acid reassembly in directed evolution
US5756328A (en) 1995-12-20 1998-05-26 Cornell Research Foundation, Inc. Acyltransferase and cDNA encoding acyltransferase
US5942430A (en) 1996-02-16 1999-08-24 Diversa Corporation Esterases
US6001586A (en) 1996-03-29 1999-12-14 Genencor International, Inc. Compartmentalization method for screening microorganisms
WO1997041212A1 (en) 1996-04-25 1997-11-06 Novo Nordisk A/S Alkaline lipolytic enzyme
DE19620649A1 (de) 1996-05-22 1997-11-27 Roehm Gmbh Rekombinant hergestellte Lysophospholipase aus Aspergillus
JPH10155493A (ja) 1996-10-04 1998-06-16 Sankyo Co Ltd アスペルギルス属由来のホスホリパーゼａ１をコードする遺伝子
JP3182381B2 (ja) 1996-10-25 2001-07-03 日清製粉株式会社 麺類の機械製麺法
DE19648343C1 (de) 1996-11-22 1998-02-12 Roehm Gmbh Verfahren zur Herstellung von Backwaren mit verbesserter Frischhaltung
JP3582265B2 (ja) 1996-11-28 2004-10-27 味の素株式会社 改質穀粉及びこれを使用した穀粉加工食品
US6103505A (en) 1996-12-09 2000-08-15 Novo Nordisk A/S Method for reducing phosphorus content of edible oils
WO1998026057A1 (en) * 1996-12-09 1998-06-18 Novo Nordisk A/S Reduction of phosphorus containing components in edible oils comprising a high amount of non-hydratable phosphorus by use of a phospholipase, a phospholipase from a filamentous fungus having phospholipase a and/or b activity
DE19701348A1 (de) 1997-01-16 1998-07-23 Roehm Gmbh Protein mit Phospholipaseaktivität
US5821102A (en) 1997-01-21 1998-10-13 Novo Nordisk Biotech Inc. Nucleic acids encoding polyeptides having absidia lipase activity
DE69841719D1 (de) 1997-04-09 2010-07-22 Danisco Lipase und Verwendung davon zur Verbesserung von Teigen und Backwaren
EP0882797B1 (en) 1997-06-04 2003-07-16 Loders Croklaan B.V. Preparation of symmetrical triglycerides aba
RU2140751C1 (ru) 1997-06-11 1999-11-10 Ассоциация "Ассоя" Пищевая добавка для производства хлеба и хлебобулочных изделий
JP4121186B2 (ja) 1997-06-16 2008-07-23 株式会社日立製作所 セラミックス管の検査方法及びその装置
EP0913468A3 (en) 1997-07-22 2001-06-13 Dsm N.V. Bread improving comüposition
EP0897667B2 (en) 1997-07-31 2008-11-12 DSM IP Assets B.V. Bread improving composition
EP0913092B1 (en) 1997-10-31 2005-05-11 Amano Enzyme Inc. Dough composition and preparation thereof
ATE254170T1 (de) 1997-12-23 2003-11-15 Novozymes As Verfahren zur immobilisierung von enzymen
US6156548A (en) 1997-12-23 2000-12-05 Novo Nordisk A/S Immobilization of enzymes with a fluidized bed for use in an organic medium
AU3247699A (en) 1998-02-17 1999-09-06 Novo Nordisk A/S Lipase variant
CA2324653A1 (en) 1998-04-08 1999-10-21 Novo Nordisk A/S An enzymatic oil-degumming process
US6815190B1 (en) * 1998-04-12 2004-11-09 Novozymes A/S Cutinase variants
WO1999053769A1 (en) 1998-04-20 1999-10-28 Novo Nordisk A/S Preparation of dough and baked products
US6365204B1 (en) 1998-04-20 2002-04-02 Novozymes Preparation of dough and baked products
US6866837B2 (en) 1998-06-05 2005-03-15 Mallinckrodt Inc. Radiolabeled peptides for the diagnosis and treatment of breast and prostate tumors and metastases of such tumors
US20030074695A1 (en) * 1998-06-24 2003-04-17 Farese Robert V. Plant diacylglycerol O-acyltransferase and uses thereof
BR9911800A (pt) * 1998-07-02 2001-02-28 Calgene Llc Proteìnas de diacil glicerol acil transferase
SE510497C2 (sv) 1998-07-15 1999-05-31 Biofeed Thailand Co Ltd Funktionellt födoämne innehållande mikroorganismer
AU752215B2 (en) 1998-07-21 2002-09-12 Dupont Nutrition Biosciences Aps Foodstuff
JP3414652B2 (ja) 1998-10-12 2003-06-09 敷島製パン株式会社 小麦粉焼成品、その製造方法および品質改良剤
CN1085252C (zh) * 1998-11-05 2002-05-22 无锡轻工大学发酵工程发展公司 微生物脂肪酶酶法合成酯的方法
US6489154B1 (en) 1998-11-10 2002-12-03 Novozymes Biotech, Inc. Polypeptides having lysophospholipase activity and nucleic acids encoding same
RU2235775C2 (ru) 1998-11-27 2004-09-10 Новозимс А/С Способ получения варианта липолитического фермента и липолитический фермент (варианты)
WO2000032758A1 (en) 1998-11-27 2000-06-08 Novozymes A/S Lipolytic enzyme variants
US7312062B2 (en) * 1998-11-27 2007-12-25 Novozymes A/S Lipolytic enzyme variants
JP2000226335A (ja) 1998-12-04 2000-08-15 Amano Pharmaceut Co Ltd 経口用酵素製剤、酵素含有食材及び酵素製剤の服用方法
BRPI9915832B1 (pt) 1998-12-04 2016-09-13 Novozymes As "variante de uma cutinase de cepa dsm 1800 de humicola insolens precursora, sequência de dna, vetor, célula hospedeira microbiana transformada, processos para produzir uma variante, para hidrólise enzimática de um oligômero cíclico de poli(etileno tereftalato), para tingir pano ou fio de poliéster, para melhorar o acabamento funcional de um fio ou pano contendo pet, e, composilão detergente".
US6399121B1 (en) * 1999-03-16 2002-06-04 Novozymes A/S Process for producing cheese
DE60018267T3 (de) 1999-03-16 2014-02-06 Novozymes A/S Verfahren zur herstellung von käse
AU5060900A (en) 1999-06-02 2000-12-28 Novozymes A/S Chemically modified lipolytic enzyme
EP1057415A1 (en) 1999-06-04 2000-12-06 Societe Des Produits Nestle S.A. Lipase-treated pasta and manufacturing process
US6511052B1 (en) * 1999-08-06 2003-01-28 E. I. Du Pont De Nemours And Company Humidifying gas induction or supply system
US6254645B1 (en) 1999-08-20 2001-07-03 Genencor International, Inc. Enzymatic modification of the surface of a polyester fiber or article
US6337187B1 (en) * 1999-11-05 2002-01-08 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 18891, a novel human lipase
AU783277B2 (en) 1999-10-14 2005-10-06 Novozymes A/S Lysophospholipase from aspergillus
US6146869A (en) 1999-10-21 2000-11-14 Novo Nordisk Biotech, Inc. Polypeptides having phospholipase B activity and nucleic acids encoding same
CA2392116A1 (en) 1999-12-03 2001-06-07 Danisco A/S Method of improving dough and bread quality
GB2358784B (en) 1999-12-03 2004-06-30 Danisco Method of improving dough and bread quality
GB9928968D0 (en) 1999-12-07 2000-02-02 Danisco Enzyme
US7078205B2 (en) * 2000-02-17 2006-07-18 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid sequences encoding melanoma associated antigen molecules, aminotransferase molecules, atpase molecules, acyltransferase molecules, pyridoxal-phosphate dependent enzyme molecules and uses therefor
DE10119972A1 (de) 2000-04-15 2002-05-23 Nikolaus Weber Enzymatisches Verfahren zur Herstellung von Fettsäuresterylestern aus Dämpferdestillaten der Fettraffination und Tallöl
US7226770B2 (en) 2000-04-28 2007-06-05 Novozymes A/S Lipolytic enzyme variant
US6558715B1 (en) * 2000-10-31 2003-05-06 Novozymes Biotech, Inc. Methods for using lipases in baking
US6506588B2 (en) 2000-06-26 2003-01-14 Novozymes, A/S Lipolytic enzymes
US6511837B2 (en) 2000-06-26 2003-01-28 Novozymes A/S Lipolytic enzymes
WO2002000852A2 (en) 2000-06-26 2002-01-03 Novozymes A/S Lipolytic enzyme
US6509182B2 (en) 2000-06-26 2003-01-21 Novozymes A/S Lipolytic enzymes
US6432898B1 (en) 2000-10-31 2002-08-13 Novozymes Biotech, Inc. Polypeptides having lipase activity and nucleic acids encoding same
CA2416191A1 (en) 2000-07-03 2002-01-10 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. Novel lipase
WO2002003805A1 (en) * 2000-07-06 2002-01-17 Novozymes A/S Method of preparing a dough or a baked product made from a dough, with addition of lipolytic enzymes
DK1309677T4 (da) 2000-08-11 2012-06-25 Genencor Int Bacillustransformation, transformanter og mutantbiblioteker
CA2421820A1 (en) * 2000-09-25 2002-01-03 Novozymes A/S Methods for processing crustacean material
US6660491B2 (en) * 2000-11-24 2003-12-09 Ikeda Food Research Co., Ltd. Process for producing dietary sterol fatty acid esters
EP1363506B1 (en) 2001-02-21 2005-11-23 Novozymes A/S Production of starchy food products
CA2444960C (en) * 2001-05-18 2011-08-09 Danisco A/S Method of improving dough and bread quality
US6645749B2 (en) 2001-05-25 2003-11-11 Novozymes A/S Lipolytic enzyme
US7630836B2 (en) 2001-05-30 2009-12-08 The Kitasato Institute Polynucleotides
ES2345973T3 (es) 2001-07-11 2010-10-07 Cognis Ip Management Gmbh Lipasa/aciltransferasa a partir de candida parapsilosis.
EP1285969B1 (en) 2001-08-22 2006-10-11 Härting, Thomas Francis Process for producing sterol or stanol esters by enzymatic transesterification in solvent and water-free media
DE10142014B4 (de) * 2001-08-28 2004-11-11 Degussa Bioactives Deutschland Gmbh & Co. Kg Verfahren zur Herstellung von Phosphatidylserin
GB0121387D0 (en) 2001-09-04 2001-10-24 Danisco Modified hydrolases
US7226771B2 (en) 2002-04-19 2007-06-05 Diversa Corporation Phospholipases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
SE0201581D0 (sv) 2002-05-29 2002-05-29 Scandinavian Biotechnology Res New improved acyltransferase
AU2003250528A1 (en) * 2002-05-30 2003-12-19 Council Of Scientific And Industrial Research Process for the pre-treatment of vegetable oils for physical refining
EP1519653A1 (en) 2002-07-03 2005-04-06 Novozymes A/S Treatment of dough with a lipoxygenase and a lipolytic enzyme
US7550280B2 (en) 2002-08-19 2009-06-23 Dsm Ip Assets B.V. Lipases and uses thereof
CA2403025A1 (en) * 2002-10-08 2004-04-08 Cognis Deutschland Gmbh & Co. Kg Enzymes with lipase/acyltransferase activity
GB2379165A (en) 2002-10-22 2003-03-05 Dsm Nv Animal feed
JP4300839B2 (ja) 2002-11-14 2009-07-22 セイコーエプソン株式会社 画像処理装置、画像処理方法および画像処理プログラム
BRPI0317124B1 (pt) 2002-12-11 2016-05-17 Novozymes As composição detergente, e, processos para lavar um tecido e uma superfície dura
EP1573052B1 (en) 2002-12-12 2008-03-19 Novozymes A/S Method of selecting a lipolytic enzyme
US20060042019A1 (en) 2002-12-23 2006-03-02 Novozymes North America, Inc. Method of treating polyester fabrics
US7955814B2 (en) 2003-01-17 2011-06-07 Danisco A/S Method
MXPA05007653A (es) 2003-01-17 2005-09-30 Danisco Metodo.
DK2287317T3 (en) 2003-01-17 2015-01-05 Dupont Nutrition Biosci Aps A process for preparing a protein ester or an ester of a protein subunit
WO2004064997A1 (en) 2003-01-23 2004-08-05 Inotech Ag New microcapsules useful as extraction means in particular for extracting water or soil contaminants
NZ542924A (en) 2003-04-28 2008-01-31 Novozymes As Method of producing a phospholipase which comprises processing an expressed fungal peptide so as to cleave off a peptide from the C- terminal end and/or a peptide from the N-terminal end to obtain a core peptide
WO2004111216A2 (en) * 2003-06-19 2004-12-23 Novozymes A/S Phospholipase variants
WO2005005977A2 (en) 2003-06-30 2005-01-20 Applera Corporation Fluorescent phospholipase assays and compositions
MXPA06000365A (es) 2003-07-07 2006-03-28 Danisco Aditivo alimentario que comprende variantes de exoamilasa no maltogenica de pseudomonas.
JP4327536B2 (ja) 2003-09-01 2009-09-09 レシップ株式会社 券硬貨投入口及びそれを備えた券硬貨分離装置
MXPA06005652A (es) 2003-12-03 2006-08-17 Genencor Int Perhidrolasa.
CN1898386A (zh) 2003-12-24 2007-01-17 丹尼斯科公司 蛋白质
JP5697294B2 (ja) 2003-12-24 2015-04-08 デュポン ニュートリション バイオサイエンシーズ エーピーエス 糖脂質アシル基転移酵素変異体及びその製造方法
US7718408B2 (en) 2003-12-24 2010-05-18 Danisco A/S Method
US7906307B2 (en) 2003-12-24 2011-03-15 Danisco A/S Variant lipid acyltransferases and methods of making
EP1718724B1 (en) 2004-02-24 2008-08-27 Novozymes A/S Enzyme stabilization in liquid detergents
GB0405637D0 (en) 2004-03-12 2004-04-21 Danisco Protein
AU2005263954B2 (en) 2004-07-16 2011-04-07 Dupont Nutrition Biosciences Aps Enzymatic oil-degumming method
ATE342951T1 (de) 2004-08-06 2006-11-15 Smet Engineering N V De Verfahren zum rückgewinnen von öl
US7811979B2 (en) 2004-09-21 2010-10-12 Novozymes A/S Subtilases
EP2298872A3 (en) 2004-09-30 2011-08-10 Novozymes A/S Polypeptides having lipase activity and polynucleotides encoding same
DE102005039836A1 (de) 2005-08-23 2007-03-01 Cognis Ip Management Gmbh Sterolesterpulver
EP1788080A1 (en) 2005-11-22 2007-05-23 Süd-Chemie Ag Use of a thermostable phospholipase in the degumming of an oil or fat, and a method for obtaining a thermostable phopholipase
CN101200754B (zh) 2007-12-07 2010-06-02 中国农业科学院油料作物研究所 无溶剂系统中固定化全细胞酶催化生产植物甾醇酯的方法

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102459581A (zh) * 2009-06-25 2012-05-16 丹尼斯科公司 蛋白质
CN102459581B (zh) * 2009-06-25 2014-10-29 杜邦营养生物科学有限公司 蛋白质
CN109072204A (zh) * 2016-04-29 2018-12-21 焙乐道有限责任公司 改善的烘焙制品
CN109414029A (zh) * 2016-07-11 2019-03-01 焙乐道有限责任公司 改进的烘焙组合物
CN109414029B (zh) * 2016-07-11 2022-09-09 焙乐道有限责任公司 改进的烘焙组合物
CN110685020A (zh) * 2019-11-11 2020-01-14 南宁雄晋生物科技有限公司 一种用于天然彩色蚕丝脱胶固色的复合酶及其使用方法
CN110685020B (zh) * 2019-11-11 2020-09-04 南宁雄晋生物科技有限公司 一种用于天然彩色蚕丝脱胶固色的复合酶及其使用方法
CN115152957A (zh) * 2022-06-30 2022-10-11 东莞市永恒食品有限公司 一种低糖黄油蛋卷及其制作方法

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Publication number Publication date
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