DE69731195T2

DE69731195T2 - Alkalisches, lipolytisches enzym

Info

Publication number: DE69731195T2
Application number: DE69731195T
Authority: DE
Inventors: Satoshi Hirayama; Rikako Nagareyama-shi TAIRA; Kim Borch; Thomas Sandal; Torben Halkier; M. Karen OXENBOLL; Ronfeldt Bjarne NIELSEN
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 1996-04-25
Filing date: 1997-04-22
Publication date: 2006-03-09
Anticipated expiration: 2017-04-23
Also published as: DE69731195D1; WO1997041212A1; AU2382397A; ATE279512T1; EP0897423B1; US6350604B1; EP0897423A1

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die Erfindung betrifft ein alkalisches lipolytisches Enzym, eine Waschmittelzusammensetzung (engl. detergent composition) umfassend das Enzym, Verfahren zur Herstellung des Enzyms, eine isolierte DNA-Sequenz kodierend für das Enzym, ein rekombinanter Expressionsvektor umfassend die DNA-Sequenz und Zellen umfassend die DNA-Sequenz oder den Vektor.
TECHNISCHER HINTERGRUND
Lipolytische Enzyme werden seit einer Anzahl von Jahren als Waschmittelzusätze verwendet, um Lipidflecken oder fettige Flecken zu entfernen.
So schlägt der Stand der Technik vor, verschiedene lipolytische Enzyme mit Lipase- oder Cutinase-Aktivität als Waschmittelzusätze zu verwenden. Beispiele schließen mikrobielle lipolytische Enzyme, die von Stämmen von Fusarium, z. B. F. oxysporum ( EP 130 064 ) und F. solani f. sp. pisi (WO 90109446), Humicola lanuginosa (auch als Thermomyces lanuginosus, EP 258 068 und EP 305 216 ), Pseudomonas, z. B. P. alcaligenes und P. pseudoalcaligenes ( EP 218 272 ), P. cepacia ( EP 331 376 ), P. mendocina (WO 88/09367), und Bacillus, z. B. B. subtilis (Dartois et al. (1993) Biochemica et Biophysica acta 1131, 253–260), B. stearothermophilus (JP 64/74992) und B. pumillus (WO 91/16422) abstammen.
Es ist Gegenstand dieser Erfindung, lipolytische Enzyme bereitzustellen, die eine gute Waschleistung und Stabilität in Waschmittellösung haben.
DARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Überraschenderweise haben wir gefunden, dass alkalische, lipolytische Enzyme aus den filamentösen Pilzen der Gattungen Gliocladium, Verticillium und Trichophaea erhalten werden können, und dass die lipolytischen Enzyme wirksam sind zum Verbessern der Wirkung von Waschmitteln (engl. detergents: Waschmittel, Reinigungsmittel, Detergentien). Die lipolytischen Enzyme haben eine gute Waschleistung und Stabilität in einer Waschlösung.
Full-length cDNA-Sequenzen, die jeweils für ein lipolytisches Enzym gemäß der Erfindung kodieren, wurden von drei Stämmen von Gliocladium sp., Verticillium sp. und Trichophaea saccata als Spenderorganismen erhalten. Die cDNA-Sequenzen wurden in das Plasmid pYES 2.0, vorliegend in Escherichia coli, kloniert, und die klonierten E. coli-Stämme wurden von den Erfindern hinterlegt, wie unten in der Tabelle gezeigt. Es wird angenommen, dass die für das lipolytische Enzym kodierende DNA-Sequenz, die von dem hinterlegten E. coli-Stamm beherbergt wird, die Sequenz in den unten angegebenen Positionen und Protokoll hat, und die Aminosäuresequenz, die davon abgeleitet ist, wird in den angegebenen Positionen und Protokoll gezeigt.
Die Information wird nachstehend zusammengefasst:
Homologien der oben angegebenen DNA und Aminosäuresequenzen wurden durch Verfahren, die später in dieser Beschreibung beschrieben sind, berechnet. Die folgenden Homologien wurden zwischen Paaren von Sequenzen gefunden, Aminosäurehomologie an der oberen rechten Ecke und die DNA-Homologie an der unteren linken Ecke. (angegeben als DNA-Homologie/Aminosäure-Homologie):
Dementsprechend stellt die Erfindung in ihren verschiedenen Ausführungsformen bereit:

1. Ein lipolytisches Enzym, welches ist:
a) ein Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz hat wie gezeigt in den Positionen 1–200 von SEQ ID NO: 3, Positionen 1–202 von SEQ ID NO: 6, oder Positionen 1–201 von SEQ ID NO: 8, oder
b) ein Analog des Polypeptids definiert in (a), welches:
i) wenigstens 60% homolog mit besagtem Polypeptid ist, oder
ii) immunologisch reaktiv ist mit einem Antikörper, der gegen das besagte Polypeptid in gereinigter Form hergestellt wurde.
2. Ein alkalisches, lipolytisches Enzym, welches von einem Stamm von Gliocladium erhalten werden kann und das eine lipolytische Aktivität bei pH 10 in der Abwesenheit von Ca⁺⁺ von über 20% der lipolytischen Aktivität bei pH 10 in der Gegenwart von 50 mM Ca⁺⁺ hat.
3. Ein alkalisches, lipolytisches Enzym, welches von einem Stamm von Gliocladium erhalten werden kann, und das einen Grad an Hydrolyse von über 15% auf Baumwoll/Olivenöl-Stoffproben im Activity-in-Detergent-Test (AiD, Aktivität im Wachmittel) hat.
4. Ein alkalisches, lipolytisches Enzym, welches von einem Stamm der Gattung Verticillium erhalten werden kann und das mehr als 90% seiner Aktivität behält nach einer 30-minütigen Inkubation bei pH 10,2, 40°C in einer Lösung von 0,300 g/l C₁₄-C₁₆-Alkylsulfat, 0,650 g/l Alkoholethoxylat (C₁₂-C₁₄, 6 EO), 1,750 Zeolith P, 0,145 g/l Na₂CO₃, 0,020 g/l Acrylat/Maleat-Copolymer und 0,050 g/l Carboxymethyl-Cellulose.
5. Eine enzymatische Waschmittelzusammensetzung umfassend eine oberflächenaktive Substanz und das lipolytische Enzym der Erfindung.
6. Ein Verfahren zum Herstellen eines alkalischen, lipolytischen Enzyms, umfassend die Kultivierung eines ein lipolytisches Enzym produzierenden Stammes von Gliocladium, Verticillium oder Trichophaea in einem passenden Nährstoffmedium, gefolgt von der Gewinnung des alkalischen, lipolytischen Enzyms.
7. Ein Verfahren zum Herstellen eines alkalischen, lipolytischen Enzyms, umfassend:
a) Isolieren einer DNA-Sequenz, die für ein lipolytisches Enzym kodiert, aus einem ein lipolytisches Enzym produzierenden Stamm von Gliocladium, Verticillium oder Trichophaea,
b) Kombinieren des DNA-Fragmentes mit (einem) geeigneten Expressionssignal(en) in einem geeigneten Vektor,
c) Transformieren eines passenden heterologen Wirtsorganismus mit dem Vektor,
d) Kultivieren des transformierten Wirtsorganismus unter Bedingungen, die zur Expression des lipolytischen Enzyms führen, und
e) Gewinnen des lipolytischen Enzyms aus dem Kulturmedium.
8. Eine isolierte DNA-Sequenz, welche für das lipolytische Enzym der Erfindung kodiert.
9. Ein isoliertes, lipolytisches Enzym, das für eine DNA-Sequenz kodiert, welche umfasst:
a) die DNA-Sequenz gezeigt in den Positionen 114–713 von SEQ ID NO: 2, Positionen 133–738 von SEQ ID NO: 5 oder Positionen 161–763 von SEQ ID NO: 7, oder b) ein Analog der DNA-Sequenz definiert in a), welche
i) mindestens 60% homolog mit der besagten DNA-Sequenz ist, oder
ii) mit der besagten DNA-Sequenz bei 55°C hybridisiert.
10. Ein rekombinanter Expressionsvektor umfassend die DNA-Sequenz der Erfindung.
11. Eine Zelle umfassend die DNA-Sequenz der Erfindung oder einen rekombinanten Expressionsvektor gemäß der 10. Ausführungsform der Erfindung.
12. Ein Verfahren zum Herstellen eines lipolytischen Enzyms, umfassend das Kultivieren der Zelle von Ausführungsform 11 der Erfindung unter Bedingungen, die die Herstellung des Enzyms erlauben, und die Gewinnung des Enzyms aus der Kultur.
13. Eine biologisch reine Kultur eines mikrobiellen Stammes, welcher Gliocladium sp. CBS 173.96, Gliocladium roseum CBS 126.96 oder 127.96 oder Verticillium sp. CBS 830.95 ist.
14. Escherichia coli-Stamm DSM 10591, DSM 10590 oder DSM 11298.

Vergleich mit dem Stand der Technik
Tilburg und Thomas, Application. Environ. Microbiol., Jan. 1993, S. 236–242 beschreiben die Herstellung einer Lipase durch G. virens; jedoch zeigen die Daten in dem Artikel, dass diese Lipase des Standes der Technik nicht alkalisch ist. US 4,985,365 und US 4,511,655 beschreiben die Verwendung einer Kulturbrühe von G. roseum IFO 5422 und G. virens IFO 6355, um carboxylische Ester bei saurem pH zu hydrolysieren. Der Stand der Technik beschreibt nicht die Herstellung einer lipolytischen Aktivität bei alkalischem pH durch Stämme von Gliocladium.
Der Stand der Technik beschreibt die Herstellung einer Lipase durch Verticillium cinnabarinum (auch genannt V. luteoalbum) DSM 63078 (Rapp & Backhaus, Enzyme Microb. Technol., 14, 938–943 (1992)) und Verticillium lecanii ATCC 26854 (JP-A 61-289884). Die Erfinder haben die beiden Stämme untersucht und gefunden, dass sie kein alkalisches lipolytisches Enzym produzieren.
Die folgende Literatur beschreibt die Lipase-Produktion durch den Stamm Verticillium ohne irgendwelche bestimmten Stämme zu identifizieren: Kunert & Lysek, Biologica (Bratislava), 42 (3), 285–293 (1987). Leger et al., J. Invertebr. Pathol., 48, 85–95 (1986). Jackson et al., Ann. appl. Biol., 106, 39–48 (1985). Roberts et al., Mycologia, 79 (2), 265–273 (1987). Trigiano, Mycologia, 71, 908–917 (1979). Jedoch beschreibt der Stand der Technik nicht die Produktion einer lipolytischen Aktivität bei alkalischem pH durch Stämme von Verticillium.
Eine Homologie-Suche wurde in Nukleotid- und Proteindatenbanken durchgeführt. Die höchste Homologie für das lipolytische Enzym und die DNA-Sequenzen der Erfindung wurde mit der Sequenz für Cutinase von Fusarium solani f. sp. pisi gefunden, welche von C. L. Soliday et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 3939–3943 (1984) beschrieben wurde.
Die drei DNA-Sequenzen der Erfindung, die bereits in dieser Beschreibung beschrieben wurden, zeigen Homologie von 53–57% mit der obigen bekannten DNA-Sequenz und die bereits beschriebenen drei Aminosäuresequenzen der Erfindung zeigen Homologien von 50–53% mit der obigen bekannten Aminosäuresequenz. Die Berechnung der Homologie wurde wie später in dieser Beschreibung beschrieben durchgeführt. Unter Verwendung einer Formel, die in „Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, 1995 angegeben ist, wurde geschätzt, dass die Hybridisierung der obigen DNA der Erfindung und der nächsten DNA des Standes der Technik eine Schmelzpunkttemperatur von 50°C bei den Hybridisierungsbedingungen, die später in dieser Beschreibung angegeben sind, hat.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1–7 zeigen pH-Aktivitätskurven für lipolytische Enzyme von den folgenden Stämmen. Die pH-Kurven wurden mit gereinigten Enzymproben gemacht, mit der Ausnahme, dass diejenigen in 3–5 mit unverarbeiteten (engl. crude) Enzymproben gemacht wurden.
1: Gliocladium sp. NN140631
2: G. solani NN102998
3: G. roseum NN141784
4: G. aureum NN102987
5: G. roseum NN141961
6: Verticillium sp. CBS 830.95
7: T. saccata CBS 804.70
8 zeigt die Stabilität für das lipolytische Enzym von Verticillium sp. CBS 830.95 bei verschiedenen Temperaturen.
DETAILLIERTE OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Lipolytische Enzyme
Die Enzyme dieser Erfindung sind lipolytische Enzyme. Im vorliegenden Kontext ist beabsichtigt, dass der Begriff „lipolytisches Enzym" ein Enzym bezeichnet, das in Übereinstimmung mit den Recommendations (1992) der International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB) unter der Enzymklassifikationsnummer E. C. 3.1.1.-(Carboxylester-Hydrolasen) klassifiziert ist. Lipolytische Enzyme zeigen also eine hydrolytische Aktivität gegenüber mindestens einem der Typen von Ester-Bindungen, die im Zusammenhang von E. C. 3.1.1. erwähnt sind.
Die lipolytischen Enzyme der Erfindung haben vorzugsweise Lipase-Aktivität (mit Triglyceriden als Substrat) und/oder Cutinase-Aktivität (mit Cutin als Substrat, wie beschrieben in Kolattukudy, Science, vol. 208, 30. Mai 1980, pp. 990–1000 und Kolattukudy in „Lipases", Borgström und Brockman ed., Elsevier 1984, pp. 471–504).
Eigenschaften des lipolytischen Enzyms
Die Erfindung stellt lipolytische Enzyme bereit, die eine hohe Aktivität bei alkalischem pH in der Abwesenheit von Ca⁺⁺ haben. Vorzugsweise hat das alkalische, lipolytische Enzym der Erfindung eine lipolytische Aktivität bei pH 10 in der Abwesenheit von Ca⁺⁺ von über 20% (am meisten bevorzugt von über 50%) der lipolytischen Aktivität bei pH 10 in der Anwesenheit von 50 mM Ca⁺⁺. Und vorzugsweise haben die lipolytischen Enzyme eine lipolytische Aktivität bei pH 10 in der Abwesenheit von Ca⁺⁺ von über 50% der Aktivität bei pH 8 genauso wie pH 9 in der Abwesenheit von Ca⁺⁺. Ein solches Enzym kann aus einem Stamm von Gliocladium erhalten werden.
Kurven der lipolytischen Aktivität gegenüber dem pH mit und ohne Zusatz von Ca⁺⁺ sind in 1–7 für lipolytische Enzyme gemäß der Erfindung aus den folgenden Stämmen gezeigt: Gliocladium sp. NN140631, G. solani NN102998, G. roseum NN141784, G. aureum NN102987, G. roseum NN141961, Verticillium sp. CBS 830.95 und T. saccata CBS 804.70. Die Aktivität wurde mit der OPID-Methode bestimmt, die später in dieser Beschreibung beschrieben ist (außer dass 60 Minuten Inkubation für die Daten in 4 verwendet wurden). Die pH-Kurven wurden mit gereinigten Enzym-Proben gemacht, außer dass diejenigen in 3–5 mit ungereinigten (engl. crude) Enzym-Proben gemacht wurden.
Vorteilhafterweise sind die lipolytischen Enzyme der Erfindung im gesamten pH-Bereich 8–10 aktiv. Einige bevorzugte Enzyme haben eine ansteigende Aktivität bis pH 10, was auf ein pH-Optimum von über 10 hindeutet.
Die spezifische lipolytische Enzymaktivität beträgt 1800 LU pro A₂₈₀ für das lipolytische Enzym von Verticillium sp. CBS 830.95 Die spezifische Aktivität wird ausgedrückt als Lipase-Aktivität (LU) pro mg Protein, bestimmt aus der Absorption bei 280 nm.
Die Stabilität ist in 8 gezeigt, wie zum Ausdruck gebracht durch die Restaktivität nach Inkubieren des lipolytischen Enzyms von Verticillium sp. CBS 830.95 bei verschiedenen Temperaturen für 30 Minuten bei pH 9. Das Enzym ist völlig stabil für 30 Minuten bei pH 9 bei Temperaturen bis zu 50°C. Es wurde ferner gefunden, dass das Enzym völlig stabil ist über den gesamten pH-Bereich 6–10 bei 25°C für 24 Stunden völlig stabil ist.
Die Erfindung stellt ferner lipolytische Enzyme bereit, die eine hohe Stabilität in einer Waschmittellösung haben. Vorzugsweise behält das alkalische lipolytische Enzym der Erfindung mehr als 90% der Aktivität nach 30 Minuten Inkubation in 100 mM Glycin bei pH 10, 45°C oder in einer Test-Waschmittellösung, gezeigt in den Beispielen, bei pH 10,2, 40°C. Die lipolytischen Enzyme der Enzyme zeigen ferner eine gute Waschleistung gegenüber fettiger Verschmutzung während des Waschens von Textilien mit Waschmittel. Vorzugsweise ergibt das alkalische, lipolytische Enzym der Erfindung einen Grad an Hydrolyse von über 15% (am meisten bevorzugt von über 20%) auf Baumwolle/Olivenöl-Stoffproben im Activity-in-Detergent (AiD)-Test, der später in dieser Beschreibung beschrieben ist. Solch ein Enzym kann aus einem Stamm von Verticillium erhalten werden.
In dieser Beschreibung wird die lipolytische Enzym-Aktivität in Einheiten von LU, OPIDU und SLU ausgedrückt, wie sie durch die Methoden bestimmt werden, die unten beschrieben sind.
Charakterisierung des Enzymproteins
Der isoelektrische Punkt wurde durch isoelektrische Fokussierung für einige lipolytische Enzyme gemäß der Erfindung bestimmt, wie folgt:
Das Molekulargewicht (MW) wurde durch SDS-PAGE und durch Massenspektrometrie für einige lipolytische Enzyme gemäß der Erfindung bestimmt, wie folgt:
Die N-terminale Sequenz des lipolytischen Enzyms von G. solani NN102998 wurde für 35 Reste bestimmt, wie gezeigt in SEQ ID NO: 1. Die vollständige Aminosäuresequenz des lipolytischen Enzyms von Gliocladium sp. CBS 173.96 wurde aus der Bestimmung der DNA-Sequenz erschlossen und ist in Positionen 1–200 von SEQ ID NO: 3 gezeigt. Ein Vergleich der zwei Aminosäuresequenzen zeigt, dass die ersten 35 Aminosäuren der zwei Enzyme identisch sind, außer Position 20.
Die N-terminal Sequenz, die für das lipolytische Enzym von Verticillium sp. CBS 830.95 bestimmt wurde, ist in SEQ ID NO: 4 (Positionen 1–29) gezeigt; Xaa bezeichnet eine nicht bestimmte Aminosäure. Die vollständige Aminosäuresequenz dieses Enzyms, wie hergeleitet aus der DNA-Sequenz, ist in Positionen 1–202 von SEQ ID NO: 6 gezeigt.
Die Aminosäuresequenz des lipolytischen Enzyms von T. saccata CBS 804.70, gezeigt in Positionen 1–201 von SEQ ID NO: 8, wurde aus der DNA-Sequenz hergeleitet und die Position des N-Terminus wurde durch einen Vergleich mit der hochhomologen Sequenz von Gliocladium sp. CBS 173.96 hergeleitet.
Lipolytische Aktivität gemäß der LU-Methode
Eine Lipase-Einheit (Lipase Unit, LU) ist die Menge an Enzym, welche 1 μmol von titrierbarer Fettsäure pro Minute mit Tributyrin als Substrat und Gummi arabicum als Emulgator bei 30,0°C, pH 7,0 (Phosphatpuffer) freisetzt.
Lipase-Aktivität gemäß der OPID-Methode
Die lipolytische Enzymaktivität ohne freies Ca⁺⁺ in dem Bereich von pH 7–10 wird mit einer Substratemulsion von Olivenöl: 2% PVA-Lösung (1 : 3) bei 40°C für 10 Minuten getestet, bei einem spezifizierten pH. Am Ende der Reaktion wird die Reaktionsmischung mit Chloroform : Methanol (1 : 1) unter sauren Bedingungen extrahiert, und die während der Reaktion freigesetzte Fettsäure wird durch TLC-FID-Analyse gemessen (Latroscan). Eine Einheit (OPIDU) ist definiert als die Freisetzung von einem μmol Fettsäure pro Minute.
In jedem Test wurden 10 mM EDTA zusammen mit 200 mM Puffer (Tris-HCl-Puffer bei pH 7 und 8, Diethanolamin-Puffer bei pH 8, 9 und 10) verwendet.
Lipolytische Aktivität gemäß der SLU-Methode
Die lipolytische Aktivität kann unter Verwendung von Olivenöl als Substrat bestimmt werden. In dieser SLU-Methode wird die Lipase-Aktivität bei 30°C und pH 9 mit einer stabilisierten Olivenöl-Emulsion (Sigma Katolog-Nr. 800-1) als Substrat gemessen in einem 5 mM Tris-Puffer enthaltend 40 mM NaCl und 5 mM Calciumchlorid. 2,5 ml des Substrates werden mit 12,5 ml Puffer gemischt, der pH wird auf 9 eingestellt, 0,5 ml der verdünnten Lipase-Probe werden hinzugefügt, und die Menge an gebildeter Oleinsäure wird durch Titration mit einem pH-Messgerät verfolgt.
Eine SLU ist die Menge an Lipase, welche ein 1 μmol an titrierbarer Oleinsäure pro Minute unter diesen Bedingungen freisetzt.
Activity-in-Detergent (AiD)-Test

Ausrüstung: Wasserbad mit 150 ml Bechergläsern. Rühren wird durch einen Rührapparat (engl. agitator) erhielt.
Dosierung des lipolytischen Enzyms: 0 & 12500 LU/l.
Substrat: 6 Stücke (3.5*3.5 cm) Baumwolle mit 6 μl Olivenöl
Waschmittel: 0.5 g/l flüssiges Modell Waschmittel (siehe unten) aufgelöst in 0,36 mM Ca²⁺/Mg²⁺ (5 : 1), eingestellt auf pH 10. 100 ml pro Becherglas.

Verfahren: Die Test-Stoffproben werden zu der Waschmittellösung hinzugefügt, wonach die Proben für 60 min. bei 30°C gerührt werden. Das übrige Waschmittel auf den Stoffproben wird durch Spülen in Leitungswasser für 15 min. entfernt. Die Stoffproben werden in eine Flasche gegeben, die 10 ml Tetrahydrofuran und 6,25 μl 4 M HCl enthielt, und über Nacht verdampft, wonach die Proben in Tetrahydrofuran wieder aufgelöst werden. Die Wirkung des lipolytischen Enzyms wird bestimmt:
Durch Messen des Grades an Hydrolyse (% DH) durch eine Latroscan TLC/FID-Methode.
Flüssiges Modell-Waschmittel
Mikrobielle Quellen
Das lipolytische Enzym dieser Erfindung kann aus einem Ascomyceten der Ordnung der Hypocreales erhalten werden, welcher zu der Gattung Gliocladium, Verticillium oder Trichophaea gehört.
Die Gattung Gliocladium ist dadurch charakterisiert, dass sie einzellige Conidien hat, die von Phialiden in schleimigen Köpfen gebildet werden. Die Conidiophoren sind deutlich pinselförmig (engl. penicillate). Sie ist beschrieben in Domsch K. H. & Gams W. (1993) Compendium of Soil Fungi (Reprint of 1980 edition), vol. I, IHW-Verlag, S. 368.
Die Gattung Verticillium ist dadurch charakterisiert, dass sie vorwiegend Hyalinehyphen mit gut differenzierten, aufrechten Conidiophoren hat, die wirbelförmig (engl. verticillately) verzweigt sind. Die Zweige tragen Wirbel von schlanken Phialiden, von denen Hyaline oder grell gefärbte Conidien gebildet werden. Die Conidienmassen werden als schleimige Köpfe auf den Phialiden gesehen.
Die folgenden Arten und Stämme sind bevorzugt. Varianten und Mutanten davon, die in der Lage sind, lipolytisches Enzym zu produzieren, können ebenfalls in der Erfindung verwendet werden.
Die Hinterlegungsnummern in der obigen Liste beziehen sich auf die Hinterlegungen, die an den folgenden Hinterlegungsstellen gemacht wurden:
CBS: Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Oosterstraat 1, 3740 AG Baarn, Niederlande.
IFO: Institute for Fermentaion, 17–85 Juso-honmachi 2-chome, Yodogawa-ku, Osaka 532, Japan.
NRRL: Agricultural Research Service Culture Collection (NRRL), 1815 North University Street, Illinois 61604, USA.
Die folgenden Stämme wurden von den Erfindern isoliert: Gliocladium sp. CBS 173.96, G. roseum CBS 126.96, G. roseum CBS 127.96 und Verticillium sp. CBS 830.95. Diese Stämme wurden von den Erfindern mit den Hinterlegungsnummern und Hinterlegungsdaten, die in der obigen Tabelle angegeben sind, gemäß dem Budapester Vertrag über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren hinterlegt. Sie wurden nach normalen taxonomischen Methoden klassifiziert. Zwei Stämme sind als „sp." bezeichnet, was anzeigt, dass sie nicht bis zur Ebene der Spezies identifiziert werden konnten. Verticillium sp. CBS 830.95 wurde von Blattmaterial isoliert und gehört daher am wahrscheinlichsten zur Gruppe von saprophytischen Spezies auf Pflanzenmaterial.
Transformierte E. coli-Stämme
Expressionsplasmide, die die Full-length cDNA-Sequenz kodierend für die lipolytischen Enzyme der Erfindung von dreien der obigen Stämme enthalten, wurden in Stämme vor Escherichia coli transformiert, wie bereits in dieser Beschreibung angegeben. Die Transformanten wurden von den Erfindern gemäß dem Budapester Vertrag über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Bundesrepublik Deutschland, (DSM), hinterlegt. Die Hinterlegungsnummern und -daten der transformierten E. coli-Stämme waren wie folgt:

Hinterlegungsnummer Hinterlegungsdatum

DSM 10591 15. März 1996

DSM 10590 15. März 1996

DSM 11298 27. November 1996
DNA-Sequenz
Wann immer in dieser Beschreibung und den Ansprüchen auf den Teil der DNA-Sequenz Bezug genommen wird, die für das lipolytische Enzym kodiert, kloniert in ein Plasmid, vorliegend in einem transformierten E. coli-Stamm, ist es beabsichtigt, dass diese Bezugnahme auch den entsprechenden Teil der DNA-Sequenzauflistung, die für das lipolytische Enzym kodiert, wie bereits in dieser Beschreibung gekennzeichnet, einschließt. Entsprechend können diese Begriffe austauschbar verwendet werden.
Die DNA-Sequenz der Erfindung kann aus der hinterlegten Transformante von Escherichia coli durch Extraktion der Plasmid-DNA nach Methoden, die im Stand der Technik bekannt sind (Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY) isoliert werden.
Die DNA-Sequenz der Erfindung kann auch aus einem Stamm der Gattung Gliocladium, Verticillium oder Trichophaea, der das lipolytische Enzym der Erfindung produziert, oder einem anderen verwandten Organismus isoliert werden und so, z. B. eine allelische oder Spezies-Variante des Teils der DNA-Sequenz, die für das lipolytische Enzym kodiert, kloniert in ein Plasmid, vorliegend in einer Transformante von Escherichia coli, wie bereits in dieser Beschreibung gekennzeichnet, sein.
Alternativ kann die Sequenz auf der Basis der DNA-Sequenz konstruiert werden, die als der Teil der angegebenen Sequenzprotokolle dargestellt ist, der für das lipolytische Enzym kodiert, z. B. kann sie davon eine Sub-Sequenz sein, und/oder durch Einführen von Nukleotidaustauschen abgeleitet sein, die nicht zu einer anderen Aminosäuresequenz des durch die DNA-Sequenz kodierten lipolytischen Enzyms führen, sondern welche der Codon-Verwendung des für die Produktion des Enzyms vorgesehenen Wirtsorganismus entspricht, oder durch Einführen von Nukleotid-Austauschen, welche zu einer anderen Aminosäuresequenz führen.
Wenn Nukleotid-Austausche ausgeführt werden, sind die Aminosäureveränderungen vorzugsweise von weniger bedeutender Art, also konservative Aminosäureaustausche, die die Faltung oder Aktivität des Proteins nicht signifikant beeinträchtigen, kleine Deletionen, typischerweise von ein bis 30 Aminosäuren; kleine Amino- oder Carboxy-terminale Verlängerungen, wie ein Amino-terminaler Methioninrest, ein kleines Linker-Peptid von bis zu etwa 20–25 Resten, oder eine kleine Erweiterung, die die Reinigung erleichtert, wie ein Poly-Histidin-Strang, ein antigenisches Epitop oder eine Bindedomäne.
Beispiele für konservative Austausche sind innerhalb der Gruppe von basischen Aminosäuren (wie Arginin, Lysin, Histidin), sauren Aminosäuren (so wie Glutaminsäure und Asparaginsäure), polaren Aminosäuren (wie Glutamin und Asparagin), hydrophobe Aminosäuren (wie Leucin, Isoleucin, Valin), aromatischen Aminosäuren (wie Phenylalanin, Tryptophan, Tyrosin) und kleinen Aminosäuren (wie Glycin, Alanin, Serin, Threonin, Methionin). Für eine allgemeine Beschreibung von Austauschen von Nukleotiden, siehe z. B. Ford et al., (1991), Protein Expression and Purification 2, 95–107.
Es wird für Fachleute offensichtlich sein, dass solche Austausche außerhalb der Regionen, die für Funktion des Moleküls entscheidend sind, gemacht werden können und weiterhin ein aktives Polypeptid ergeben. Aminosäuren, die für die Aktivität des durch das DNA-Konstrukt der Erfindung kodierten Polypeptids essentiell sind, und daher vorzugsweise nicht Gegenstand eines Austausches, können gemäß Verfahren aus dem Stand der Technik identifiziert werden, wie Site-directed mutagenesis oder Alanine-scanning mutagenesis (cf. z. B. Cunningham and Wells, (1989), Science 244, 1081–1085). In der zuletzt genannten Technik werden Mutationen an jedem Rest in dem Molekül eingeführt und die resultierenden mutanten Moleküle werden auf ihre biologische (d. h. lipolytische Enzym)-Aktivität getestet, um Aminosäurereste zu identifizieren, die für die Aktivität des Moleküls entscheidend sind. Stellen der Substrat-Enzym-Interaktion können auch durch Analyse der Kristallstruktur bestimmt werden, genauso wie sie durch Techniken wie nuclear magnetic resonance-Analyse, Kristallographie oder Photoaffinitäts-Markierung bestimmt werden (cf. z. B. de Vos et al., (1992), Science 255, 306–312; Smith et al., (1992), J. Mol. Biol. 224, 899–904; Wlodaver et al., (1992), FEBS Lett. 309, 59–64).
Die DNA-Sequenz der Erfindung kann aus dem transformierten E. coli-Stamm durch Extraktion von DNA mit Methoden, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, isoliert werden, z. B. wie beschrieben durch Sambrook et al., (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Lab.; Cold Spring Harbor, NY.
Die DNA-Sequenz der Erfindung kann auch durch irgendeine allgemeine Methode isoliert werden, einbeziehend

– Klonieren, in geeignete Vektoren, einer cDNA-Bibliothek aus irgendeinem Organismus, von dem erwartet wird, dass er das interessierende lipolytische Enzym produziert,
– Tranformieren passender Hefewirtszellen mit besagten Vektoren,
– Kultivieren der Wirtszellen unter passenden Bedingungen, um das interessierende Enzym, das durch einen Klon in der cDNA-Bibliothek kodiert wird, zu exprimieren,
– Durchmustern (Screenen) nach positiven Klonen durch Bestimmen jeglicher lipolytischer Enzymaktivität des Enzyms, das von solchen Klonen produziert wird, und
– Isolieren der das Enzym kodierenden DNA von solchen Klonen.

Eine allgemeine Isolationsmethode ist in WO 93/11249 oder WO 94/14953, deren Inhalte hiermit durch Bezugnahme in die vorliegende Anmeldung aufgenommen sind, offenbart worden. Eine detailliertere Beschreibung der Durchmusterungsmethode wird in den Beispielen unten gegeben.
Alternativ kann die DNA, die für ein lipolytisches Enzym der Erfindung kodiert, gemäß wohlbekannten Verfahren auf bequeme Weise aus einer passenden Quelle isoliert werden, wie den oben beschriebenen Mikroorganismen, durch Verwendung von synthetischen Oligonukleotid-Sonden, die auf Basis der hier offenbarten DNA-Sequenz präpariert wurden. Zum Beispiel kann eine passende Oligonukleotid-Sonde auf der Basis des für das lipolytische Enzym kodierenden Teils der Nukleotidsequenzen, die als SEQ ID NO: 2 dargestellt sind oder einer beliebigen Untersequenz davon oder auf der Basis der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 3 präpariert werden.
Homologie der DNA-Sequenzen
Die DNA-Sequenz-Homologie auf die in dieser Beschreibung mit den Ansprüchen Bezug genommen wird, wird bestimmt als der Grad von Identität zwischen zwei Sequenzen, der eine Abweichung der ersten Sequenz von der zweiten anzeigt. Die Homologie kann passender Weise mit Hilfe von Computerprogrammen, die im Stand der Technik bekannt sind, bestimmt werden, wie GAP, das in der GCG-Programmsammlung bereitgestellt wird (Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711; Needleman, S. B. und Wunsch, C. D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443–453). Unter Verwendung von GAP mit den folgenden Einstellungen für den DNA-Sequenzvergleich: GAP creation penalty von 5.0 und GAP extension penalty von 0.3, zeigt die kodierende Region der oben in Bezug genommenen analogen DNA-Sequenzen einen Grad an Identität von vorzugsweise mindestens 70%, mehr bevorzugt von mindestens 80%, mehr bevorzugt von mindestens 90%, mehr bevorzugt von mindestens 95%, mehr bevorzugt von mindestens 97% mit dem bereits in der Beschreibung angegebenen Teil der DNA-Sequenz, die für das lipolytische Enzym kodiert.
Hybridisierung
Die Hybridisierung, auf die oben Bezug genommen wurde, soll anzeigen, dass die analoge DNA-Sequenz an die gleiche Probe wie die DNA-Sequenz hybridisiert, die für das lipolytische Enzym kodiert, unter bestimmten spezifizierten Bedingungen, welche im Detail unten beschrieben sind. Die Oligonukleotid-Sonde, die verwendet wird, ist die DNA-Sequenz, die dem Teil des DNA-Sequenzprotokolls, das früher in dieser Beschreibung angegeben wurde, der für das lipolytische Enzym kodiert, entspricht.
Passende Bedingungen zum Bestimmen der Hybridisierung zwischen einer Nukleotidprobe und einer homologen DNA- oder RNA-Sequenz umfasst das vorherige Tränken eines Filters, der die zu hybridisierenden DNA-Fragmente oder RNA enthält, in 5 × SSC (standard saline citrate) für 10 min., und Vorhybridisierung des Filters in einer Lösung von 5 × SSC (Sambrook et al. 1989), 5 × Denhardt's Lösung (Sambrook et al. 1989), 0,5% SDS und 100 μg/ml denaturierter, mit Ultraschall behandelter Lachssperm-DNA (Sambrook et al. 1989), gefolgt von Hybridisierung in der gleichen Lösung enthaltend eine Zufalls-geprimete (Feinberg, A. P. und Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem. 132: 6–13), ³²P-dCTP-markierte spezifische Aktivität > 1 × 10⁹ cpm/μg) Probe für 12 Stunden bei ca. 45°C. Das Filter wird dann zweimal für 30 Minuten gewaschen in 2 × SSC, 0,5% SDS bei Temperaturen von bis zu 55°C, vorzugsweise bis zu 60°C, mehr bevorzugt bis zu 65°C, noch mehr bevorzugt bis zu 70°C und speziell bis zu 75°C.
Moleküle, an welche die Oligonukleotid-Sonde unter diesen Bedingungen hybridisiert, werden unter Verwendung eines Röntgenfilms nachgewiesen.
Homologie der Aminosäuresequenzen
Die Polypeptid-Homologie, auf die in dieser Beschreibung mit den Ansprüchen Bezug genommen wird, wird bestimmt als der Grad von Identität zwischen zwei Sequenzen, die eine Abweichung der ersten Sequenz von der zweiten anzeigt. Die Homologie kann passender Weise mit Hilfe von Computerprogrammen, die im Stand der Technik bekannt sind, bestimmt werden wie GAP, das mit der GCG-Programmsammlung bereitgestellt wird (Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711; Needleman, S. B. und Wunsch, C. D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443–453). Unter Verwendung von GAP mit den folgenden Einstellungen für den Polypeptid-Sequenzvergleich: GAP creation penalty von 3.0 und GAP extension penalty von 0.1, zeigt der reife Teil eines Polypeptids, das durch eine analoge DNA-Sequenz kodiert wird, einen Grad an Identität von vorzugsweise mindestens 70%, mehr bevorzugt mindestens 80%, mehr bevorzugt mindestens 90%, mehr bevorzugt mindestens 95%, und speziell mindestens 97% mit dem reifen Teil der Aminosäuresequenz der lipolytischen Enzyme der bereits in dieser Beschreibung gekennzeichnet wurde.
Immunologische Kreuzreaktivität
Antikörper, die für die Bestimmung der immunologischen Kreuzreaktivität verwendet werden, können unter Verwendung eines gereinigten lipolytischen Enzyms hergestellt werden. Genauer kann ein Antiserum gegen das lipolytische Enzym der Erfindung durch Immunisierung von Kaninchen (oder anderen Nagetieren) gemäß dem Verfahren hergestellt werden, das durch N. Axelsen et al. in: A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific Publications, 1973, Chapter 23 oder A. Johnstone und R. Thorpe, Immunochemistry in Practice, Blackwell Scientific Publications, 1982 (genauer S. 27–31) beschrieben wurde. Gereinigte Immunoglobuline können aus den Antiseren erhalten werden, zum Beispiel durch Salzpräzipitation ((NH4)2 SO4), gefolgt von Dialyse und Ionenaustauschchromatographie, z. B. auf DEAE-Sephadex. Immunochemische Charakterisierung der Proteine kann entweder durch Ouchterlony Doppeldiffusionsanalyse (O. Ouchterlony in: Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir, Ed.), Blackwelll Scientific Publications, 1967, S. 655–706), durch zweidimensionale Immunoelektrophorese (engl. crossed immunoelectrophoresis) (N. Axelsen et al., supra, Kapitel 3 und 4), oder durch Rocket-Immunoelektrophorese (N. Axelsen et al., Kapitel 2) durchgeführt werden.
Expressionsvektoren
Der Expressionsvektor der Erfindung kann ein beliebiger Expressionsvektor sein, der auf bequeme Weise rekombinanten DNA-Verfahren unterworfen werden kann, und die Wahl des Vektors wird häufig von der Wirtszelle abhängen, in welche er eingeführt werden soll. So kann der Vektor ein autonom replizierender Vektor sein, d. h. ein Vektor, der als eine extrachromosomale Einheit existiert, deren Replikation unabhängig von der chromosomalen Replikation ist, z. B. ein Plasmid. Alternativ kann der Vektor ein Vektor sein, welcher, wenn er in eine Wirtszelle eingeführt wird, in das Wirtszellgenom integriert und zusammen mit dem/den Chromosomen) repliziert, in welche er integriert hat.
In dem Expressionsvektor sollte die DNA-Sequenz, die für das lipolytische Enzym kodiert, funktionsfähig mit einer passenden Promotor- und Terminatorsequenz verbunden sein. Der Promotor kann jegliche DNA-Sequenz sein, welche eine transkriptionelle Aktivität in der gewählten Wirtszelle zeigt und welcher von Genen abgeleitet werden kann, die für Proteine kodieren, die entweder homolog oder heterolog zu der Wirtszelle sind. Die Verfahren, die verwendet werden, um die DNA-Sequenzen, die für das lipolytische Enzym kodieren, den Promotor und den Terminator, jeweils zu ligieren und um sie in passende Vektoren zu inserieren, sind den Fachleuten wohlbekannt (cf., z. B., Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY).
Beispiele für passende Promotoren zur Verwendung in Wirszellen von filamentösen Pilzen sind, zum Beispiel, der ADH3-Promotor (McKnight et al., The EMBO J. 4 (1985), 2093–2099) oder der tpiA-Promotor. Beispiele für andere nützliche Promotoren sind solche, die von dem Gen, das für Aspergillus oryzae TAKA-Amylase kodiert, Rhizomucor miehei Aspartatproteinase, Aspergillus niger neutrale α-Amylase, Aspergillus niger säurestabile α-Amylase, Aspergillus niger oder Aspergillus awamori Glucoamylase (gluA), Rhizomucor miehei Lipase, Aspergillus oryzae alkaline Protease, Aspergillus oryzae Triosephosphat-Isomerase oder Aspergillus nidulans Acetamidase.
Wirtszellen
Der Wirtsorganismus ist vorzugsweise eine eukaryotische Zelle, insbesondere eine Pilzzelle, wie eine Hefezelle oder eine Zelle eines filamentösen Pilzes. Bevorzugte filamentöse Pilze schließen ein Aspergillus, Fusarium oder Trichoderma, am meisten bevorzugt A. niger, A. oryzae, F. graminearum, F. sambuccinum, F. cerealis, T. harzianum oder T. reesei. Pilzzellen können durch ein Verfahren transformiert werden, das die Protoplastenbildung umfasst und Transformierung der Protoplasten gefolgt von Regeneration der Zellwand in einer Weise die als solche bekannt ist. Protoplasten können hergestellt werden wie beschrieben in WO 95/02043, S. 16, Z. 21–S. 17, Z. 12, welche hiermit durch Bezugnahme in den vorliegenden Anmeldetext aufgenommen ist. Die Verwendung von Aspergillus als ein Wirtsorganismus ist in EP 238 023 (Novo Nordisk A/S) beschrieben, deren Inhalte hiermit durch Bezugnahme in den Anmeldetext aufgenommen sind. Die Wirtszelle kann auch eine Hefezelle sein, z. B. ein Stamm von Saccharomyces, insbesondere Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces kluyveri oder Saccharomyces uvarum, ein Stamm von Schizosaccharomyces, wie Schizosaccharomyces pombe, ein Stamm von Hansenula, Pichi, Yarrowia (wie Yarrowia lipolytica) oder Kluyveromyces (wie Kluyveromyces lactis).
Herstellung des lipolytischen Enzyms
Das lipolytische Enzym der Erfindung kann hergestellt werden durch Kultivieren eines der oben beschriebenen Mikroorganismen in einem passend Nährmedium, das Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und inorganische Salze enthält, gefolgt von Gewinnung des lipolytischen Enzyms. Eine alternative Methode zum Herstellen des lipolytischen Enzyms der Erfindung umfasst das Transformieren einer passenden Wirtszelle mit einer DNA-Sequenz, die für das Enzym kodiert, Kultivieren des transformierten Organismus unter Bedingungen, die die Produktion des Enzyms erlauben, Gewinnen des Enzyms aus der Kultur.
Das Medium, das für die Kultur des Mikroorganismus oder der transformierten Wirtszellen verwendet wird, kann ein beliebiges herkömmliches Medium sein, das geeignet ist, um den fraglichen Organismus aufzuziehen. Das exprimierte lipolytische Enzym kann auf bequeme Weise in das Kulturmedium sekretiert werden und kann daraus durch wohlbekannte Verfahren einschließlich dem Abtrennen der Zellen aus dem Medium durch Zentrifugation oder Filtration, Präzipitieren der Proteinkomponenten des Mediums mit Hilfe eines Salzes wie Ammoniumsulfat, gefolgt von chromatographischen Verfahren wie Ionenaustauscherchromatographie, Affinitätschromatographie oder ähnlichem, gewonnen werden.
Anwendung des lipolytischen Enzyms
Das lipolytische Enzym der Erfindung kann in herkömmlichen Anwendungen von lipolytischem Enzym verwendet werden, insbesondere bei hohem pH, z. B. in Wäsche- und Geschirrspülmitteln, in instutionellen und industriellen Reinigern und in der Lederverarbeitung.
Die lipolytischen Enzyme der Erfindung können auch für Interesterifizierung verwendet werden, für die Gesamthydrolyse von Fetten und Ölen und in Verfahren zur Trennung optischer Isomere (engl. optical isomer resolution processes).
Waschmittelzusatz
Gemäß der Erfindung kann das lipolytische Enzym typischerweise als ein Zusatz in einer Waschmittelzusammensetzung verwendet werden. Dieser Zusatz wird auf bequeme Weise als ein nicht staubendes Granulat formuliert, als eine stabilisierte Lösung, eine Aufschlämmung oder ein geschütztes Enzym.
Ein passender Aktivitätsbereich für einen Waschmittelzusatz enthaltend das lipolytische Enzym dieser Erfindung ist 5000–100000 OPIDU/g (OPID gemessen bei pH 9) oder 0,01–100 mg reines Enzymprotein pro g des Zusatzes.
Waschmittel
Das lipolytische Enzym der Erfindung kann in Konzentrationen aufgenommen werden, die herkömmlicherweise in Waschmitteln eingesetzt werden. Die Waschmittelzusammensetzung der Erfindung kann das lipolytische Enzym in einer Menge entsprechend von 10–50 000 LU pro Gramm des Waschmittels, vorzugsweise 20–5000 LU/g, umfassen. Das Waschmittel kann in Wasser aufgelöst werden, um eine Waschlösung enthaltend das lipolytische Enzym in einer Menge entsprechend zu 25–15 000 LU pro Liter von Waschlösung herzustellen. Die Menge des lipolytischen Enzymproteins kann 0,001–10 mg pro Gramm des Waschmittels oder 0,001–100 mg pro Liter der Waschlösung betragen.
Waschmittelzusammensetzungen
Gemäß der Erfindung kann das lipolytische Enzym typischerweise eine Komponente einer Waschmittelzusammensetzung sein. Als solche kann es in der Waschmittelzusammensetzung in der Form eines nicht staubenden Granulates, einer stabilisierten Flüssigkeit, oder eines geschützten Enzyms eingeschlossen sein. Nicht staubende Granulate können so hergestellt werden, wie offenbart z. B. in US 4,106,991 und US 4,661,452 (beide zu Novo Industri A/S gehörend) und können optional durch Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, beschichtet werden. Beispiele für wachsartige Beschichtungsmaterialien sind Poly(ethylenoxid)produkte (Polyethylenglycol, PEG) mit mittleren molekularen Gewichten von 1000 bis 20 000; ethoxylierte Nonylphenole, die 16 bis 50 Ethylenoxideinheiten haben; ethoxilierte Fettalkohole, in welchen der Alkohol 12 bis 20 Kohlenstoffatome enthält und in welchen 15 bis 80 Ethylenoxideinheiten sind; Fettalkohole, Fettsäuren; und Mono- und Di- und Triglyceride von Fettsäuren. Beispiele für filmbildende Beschichtungsmaterialien, die für das Auftragen (engl. application) mit Flüssigbetttechniken (engl. fluid bed techniques) geeignet sind, sind in Patent GB 1483591 angegeben. Flüssige Enzymzubereitungen können, zum Beispiel, durch Zusatz eines Polyoles wie Propylenglykol, eines Zuckers oder eines Zuckeralkohols, Milchsäure oder Borsäure gemäß den etablierten Methoden stabilisiert werden. Andere Enzymstabilisatoren sind im Stand der Technik wohlbekannt. Geschützte Enzyme können gemäß der in EP 238,216 offenbarten Methode hergestellt werden.
Die Waschmittelzusammensetzung der Erfindung kann in jeder günstigen Form sein, z. B. als Pulver, als Körner, als Paste oder als Flüssigkeit. Ein flüssiges Waschmittel kann wässrig sein, typischerweise enthaltend bis zu 70% Wasser und 0–30% organischem Lösungsmittel, oder es kann nicht wässrig sein.
Die Waschmittelzusammensetzung umfasst ein oder mehrere oberflächenaktive Substanzen, von denen jede anionisch, nicht ionisch, kationisch oder zwitterionisch sein kann. Das Waschmittel wird üblicherweise 0–50% einer anionischen oberflächenaktiven Substanz enthalten, wie ein lineares Alkylbenzolsulfonat (linear alkylbenzene sulfonate, LAS), alpha-Olefinsulfonat (AOS), Alkylsulfat (Fettalkoholsulfat) (AS), Alkoholethoxysulfat (AEOS oder AES), sekundäre Alkansulfonate (SAS), alpha-Sulfofettsäuremethylester, Alkyl- oder Alkenylbernsteinsäure, oder Seife. Es kann auch 0–40% einer nichtionischen obeflächenaktiven Substanz wie Alkoholethoxilat (AEO oder AE), carboxylierte Alkoholethoxilate, Nonyl-Phenolethoxilate, Alkylpolyglycoside, Alkyldimethylaminoxide, ethoxilierte Fettsäuremonoethanolamide, Fettsäuremonoethanolamide, oder Polyhydroxyalkylfettsäureamide (z. B. wie beschrieben in WO 92/06154).
Die Waschmittelzusammensetzung kann zusätzlich ein oder mehr andere Enzyme umfassen wie Amylase, Cutinase, Protease, Cellulase, Peroxidase und Oxidase, z. B., Laccase.
Das Waschmittel kann 1–65% eines Aufbaustoffes (Gerüststoffes, engl. builder) oder eines Komplexierungsmittels enthalten, wie Zeolith, Diphosphat, Triphosphat, Phosphonat, Citrat, Nitrilotriessigsäure (NTA), Ethylendiamintetraessigsäureethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Diethylentri-aminpentaessigsäure (DTMPA), Alkyl- oder Alkenylbernsteinsäure, lösliche Silikate oder geschichtete Silikate (z. B. SKS-6 von Hoechst). Das Waschmittel kann auch ohne Aufbaustoff sein, d. h. im Wesentlichen frei von Aufbaustoffen.
Das Waschmittel kann ein oder mehr Polymere enthalten. Beispiele sind Carboxymethylcellulose (CMC), Polyvinylpyrrolidon (PVP), Polyethylenglykol (PEG), Polyvinylalkohol (PVA), Polycarboxylate wie Polyacrylate, Maleinsäure/Acrylsäure-Copolymere und Laurylmethacrylat/Acrylsäure-Copolymere.
Das Waschmittel kann ein Bleichsystem enthalten, welches eine H₂O₂-Quelle wie Perborat oder Percarbonat umfasst, welche mit einem Peracid-bildenden Bleichaktivator wie Tetraactylethylendiamin (TAED) oder Nonanoyloxybenzolsulfonat (MOBS) kombiniert werden kann. Alternativ kann das Bleichsystem Peroxysäuren enthalten von, z. B. dem Amid-, Imid- oder Sulfon-Typ.
Die Enzyme der Waschmittelzusammensetzung der Erfindung können unter Verwendung herkömmlicher Stabilisierungsmittel stabilisiert werden, z. B. eines Polyols wie Propylenglykol oder Glycerol, eines Zuckers oder Zuckeralkohols, Milchsäure, Borsäure, oder eines Börsäurederivates wie z. B. einem aromatischen Boratester, und die Zusammensetzung kann wie z. B. in WO 92/19709 und WO 92/19708 beschrieben formuliert werden.
Das Waschmittel kann auch andere herkömmliche Waschmittelinhaltsstoffe enthalten, wie z. B. Gewebeconditioner einschließlich Tone, Foam Booster, Schauminhibitoren (engl. suds suppressors), Korrosionsinhibitoren, Schmutz suspendierende Mittel, Mittel gegen die Wiederablagerung von Schmutz, Farbstoffe, Bakterizide, optische Aufheller, oder Parfüm.
Der pH (gemessen in wässriger Lösung bei der verwendeten Konzentration) wird üblicherweise im Neutralen oder Alkalischen sein, d. h. im Bereich von 7–11.
Spezielle Formen von Waschmittelzusammensetzungen im Rahmen der Erfindung schließen ein:

1) Eine Waschmittelzusammensetzung, formuliert als ein Granulat, das eine Schüttdichte (engl. bulk density) von mindestens 600 g/l hat, umfassend
2) Eine Waschmittelzusammensetzung formuliert als ein Granulat, das eine Schüttdichte von mindestens 600 g/l hat, umfassend
3) Eine Waschmittelzusammensetzung formuliert als ein Granulat, das eine Schüttdichte von mindestens 600 g/l hat, umfassend
4) Eine Waschmittelzusammensetzung formuliert als ein Granulat, das eine Schüttdichte von mindestens 600 g/l hat, umfassend
5) Eine wässrige flüssige Waschmittelzusammensetzung, umfassend
6) Eine wässrige, strukturierte flüssige Waschmittelzusammensetzung, umfassend
7) Eine Waschmittelzusammensetzung formuliert als ein Granulat, das eine Schüttdichte von mindestens 600 g/l hat, umfassend
8) Eine Waschmittelzusammensetzung formuliert als ein Granulat, umfassend
9) Eine Waschmittelzusammensetzung formuliert als ein Granulat, umfassend
10) Eine wässrige flüssige Waschmittelzusammensetzung umfassend
11) Eine wässrige flüssige Waschmittelzusammensetzung, umfassend
12) Eine Waschmittelzusammensetzung formuliert als ein Granulat, das eine Schüttdichte von mindestens 600 g/l hat, umfassend
13) Waschmittelformulierungen, wie in 1)–12) beschrieben, wobei das gesamte oder ein Teil des linearen Alkylbenzolsulfonates durch (C₁₂-C₁₈)-Alkylsulfat ersetzt ist.
14) Eine Waschmittelzusammensetzung formuliert als ein Granulat, das eine Schüttdichte von mindestens 600 g/l hat, umfassend
15) Eine Waschmittelzusammensetzung formuliert als ein Granulat, das eine Schüttdichte von mindestens 600 g/l hat, umfassend
16) Waschmittelformulierungen, wie in 1)–15) beschrieben, welche eine stabilisierte oder verkapselte Persäure enthalten, entweder als eine zusätzliche Komponente, oder als ein Ersatz für bereits spezifizierte Bleichsysteme.
17) Waschmittelzusammensetzungen, wie beschrieben in 1), 3), 7), 9) und 12), in welchen Perborat durch Percarbonat ersetzt ist.
18) Waschmittelzusammensetzungen, wie beschrieben in 1), 3), 7), 9), 12), 14) und 15), welche zusätzlich einen Mangankatalysator enthalten. Der Mangankatalysator kann z. B. eine von den Verbindungen sein, die in „Efficient manganese catalysts for low-temperature bleaching", Nature 369, 1994, S. 637–639 beschrieben sind.
19) Waschmittelzusammensetzung formuliert als ein nicht-wässriges flüssiges Waschmittel, umfassend eine flüssige nicht-ionische oberflächenaktive Substanz wie z. B. einen linearen alkoxylierten primären Alkohol, ein Aufbausystem (engl. builder system) (z. B. Phospat), Enzym und Alkali. Das Waschmittel kann auch eine anionische oberflächenaktive Substanz und/oder ein Bleichsystem umfassen.

Das lipolytische Enzym der Erfindung kann in Konzentrationen, die üblicherweise in Waschmitteln eingesetzt werden, aufgenommen werden. Es wird gegenwärtig erwogen, dass in der Waschmittelzusammensetzung der Erfindung das lipolytische Enzym in einer Menge entsprechend 0,0001–1 mg (berechnet als reines Enyzmprotein) von lipolytischem Enzym pro Liter der Waschlösung hinzugefügt wird.
BEISPIELE
Materialien und Methoden
Die folgenden Materialien und Methoden wurden in den folgenden Beispielen verwendet:
Mikroorganismen

Hefestamm: Der verwendete Saccharomyces cerevisiae-Stamm war W3124 (MATα; ura 3-52; leu 2-3, 112; his 3-D200; pep 4-1137; prc1::HIS3; prb1::LEU2; cir⁺).
E. coli-Stamm: DH10B (erhältlich, z. B., von Life Technologies)

Plasmide

Der Aspergillus-Expressionsvektor pHD414 ist ein Derivat des Plasmids p775 (beschrieben in EP 238 023 ). Die Konstruktion von pHD414 ist weiterhin beschrieben in WO 93/11249.
pYES 2.0 (erhältlich z. B. von Invitrogen)

Allgemeine molekularbiologische Methoden
Sofern nicht anders erwähnt, wurden die DNA-Manipulationen und Transformationen nach Standardmethoden der Molekularbiologie durchgeführt (Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, F. M. et al. (eds.) "Current protocols in Molecular Biology". John Wiley and Sons, 1995; Harwood, C. R. und Cutting, S. M (eds.) "Molecular Biological Methods for Bacillus". John Wiley and Sons, 1990).
Expressionsklonierung in Hefe
Expressionsklonierung in Hefe wurde durchgeführt wie ausführlich beschrieben durch H. Dalboege et al. (H. Dalboege et al. Mol. Gen. Genet (1994) 243: 253–260; WO 93/11249; WO 94/14953), welches hiermit durch Bezugnahme in die vorliegende Anmeldung aufgenommen ist.
Extraktion von Gesamt-RNA, Synthese von cDNA, Behandlung mit Mung bean nuclease, Blunt-ending mit T4 DNA-Polymerase und Konstruktion der Bibliotheken wurden gemäß den oben angegebenen Referenzen durchgeführt.
Identifizierung von positiven Klonen
Die Transformanten werden auf SC Agar, der 2% Glukose enthält, ausplattiert und für 3 Tage bei 30°C inkubiert. Ein Cellulose-Acetat-Filter (OE 67, Schleicher & Schuell) wird auf den Zellen platziert und dann auf Platten, die SC-Agar enthalten und 2% Galactose mit den Zellen auf dem Filter übertragen. Nach 3 Tagen der Inkubation bei 30°C wird das Filter mit den Zellen auf Substratplatten übertragen. Positive Klone werden als Kolonien, die von einer grünen Zone umgeben sind, identifiziert.
Charakterisierung positiver Klone
Die positiven Klone werden als einzelne Kolonien erhalten, die cDNA-Inserts werden direkt von der Hefekolonie mit biotinylierten Polylinkerprimern amplifiziert, mit einem magnetischen Kügelchensystem (Dynabead M-280, Dynal) gereinigt, und einzeln charakterisiert durch Sequenzieren des 5'-Endes von jedem cDNA-Klon unter Verwendung der Kettenabbruch-Methode (Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74: 5463–5467) und das Sequenase-System (United States Biochemical).
Isolierung eines cDNA-Gens zur Expression in Aspergillus
Eine ein lipolytisches Enzym produzierende Hefekolonie wird in 20 ml YPD-Medium in einem 50 ml-Glasteströhrchen inokuliert. Das Röhrchen wird für zwei Tage bei 30°C geschüttelt. Die Zellen werden durch Zentrifugation für 10 min. bei 3000 rpm geerntet.
Die DNA wird gemäß WO 94/14953 isoliert und in 50 μl Wasser gelöst. Die DNA wird in E. coli mit Standardverfahren transformiert. Plasmid-DNA wird von E. coli gemäß Standardverfahren isoliert und durch Restriktionsenzymanalyse analysiert. Das cDNA-Insert wird mit Hilfe geeigneter Restriktionsenzyme ausgeschnitten und in einen Aspergillus-Expressionsvektor ligiert.
Transformierung von Aspergillus oryzae oder Aspergillus niger
100 μl einer Protoplastensuspension wird mit 5–25 μg der geeigneten DNA in 10 μl von STC (1.2 M Sorbitol, 10 mM Tris-HCl, pH = 7.5, 10 mM CaCl₂) gemischt. Protoplasten werden mit p3SR2 (ein A. nidulans amdS-Gen-tragendes Plasmid) gemischt. Die Mischung wird für 25 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. 0,2 ml von 60% PEG 4000 (BDH 29576), 10 mM CaCl₂ und 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 wird hinzugefügt und vorsichtig gemischt (zweimal) und schließlich werden 0,85 ml derselben Lösung hinzugefügt und vorsichtig gemischt. Die Mischung wird für 25 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen, bei 2500 g für 15 Minuten zentrifugiert und das Pellet wird in 2 ml von 1,2 M Sorbitol resuspendiert. Nach einer weiteren Sedimentation werden die Protoplasten auf Minimal-Platten ausgestrichen (Cove, Biochem. Biophys. Acta 113 (1966) 51–56) enthaltend 1,0 M Saccharose, pH 7,0, 10 mM Acetamid als Stickstoffquelle und 20 mM CsCl, um das Hintergrundwachstum zu inhibieren. Nach Inkubation für 4–7 Tage bei 37°C werden die Sporen gepickt und für Einzelkolonien ausgestrichen. Dieses Verfahren wird wiederholt und die Sporen einer einzelnen Kolonie werden nach der zweiten Reisolierung als eine definierte Transformante aufbewahrt.
Test von A. oryzae-Transformanten
Jede der Transformanten wird in 10 ml von YPM (cf. unten) inokuliert und vermehrt. Nach 2–5 Tagen der Inkubation bei 30°C wird der Überstand entfernt. Die lipolytische Aktivität wird dadurch identifiziert, dass 10 μl Überstand auf Löcher von 4 mm Durchmesser appliziert werden, die in Agarplatten ausgestanzt sind, enthaltend 0,1 M Glycin pH 9, 0,1 M CaCl₂, 1% Trition X-100, 0,5% Olivenöl. Die lipolytische Aktivität wird durch die Bildung eines trüben Hofes angezeigt.
Fed-batch-Fermentation
Fed-batch-Fermentation wurde in einem Medium durchgeführt, das Maltodextrin als Kohlenstoffquelle enthielt, Harnstoff als Stickstoffquelle und Hefeextrakt. Die Fed-batch-Fermentation wurde durchgeführt durch Inokulieren einer Schüttelflaschenkultur von in Frage kommenden A. oryzae-Wirtszellen in ein Medium umfassend 3,5% der Kohlenstoffquelle und 0,5% der Stickstoffquelle. Nach 24 Stunden Kultivierung bei pH 7,0 und 34°C wurde die kontinuierliche Zufuhr von zusätzlichen Kohlenstoff- und Stickstoffquellen begonnen. Die Kohlenstoffquelle wurde als limitierender Faktor gehalten und es wurde sichergestellt, dass Sauerstoff im Überschuss vorhanden war. Die Fed-batch-Kultivierung wurde für 4 Tage fortgesetzt.
Medien

YPD: 10 g Hefeextrakt, 20 g Pepton, H₂O auf 900 ml. Autoklaviert, 100 ml 20% Glucose (sterilfiltriert) hinzugefügt.
YPM: 10 g Hefeextrakt, 20 g Pepton, H₂O auf 900 ml. Autoklaviert, 100 ml 20% Maltodextrin (sterilfiltriert) hinzugefügt.
10 × Basissalz: 75 g Hefestickstoffbase, 113 g Bernsteinsäure, 68 g NaOH, H₂O ad 1000 ml, sterilfiltriert.
SC-URA: 100 ml 10 × Basissalz, 28 ml 20% Casaminosäuren ohne Vitamine, 10 ml 1% Tryptophan, H₂O ad 900 ml, autoklaviert, 3,6 ml 5% Threonin und 100 ml 20% Glucose oder 20% Galactose hinzugefügt.
SC-Agar: SC-URA, 20 g/l Agar hinzugefügt.
SC-Agar-Variante: 20 g Agar, 20 ml 10 × Basissalz, H₂O ad 900 ml, autoklaviert
Substratplatten: Petri-Schalen enthaltend 100 mM Glycin, pH 9,0, 1% Brilliantgrün-Lösung, 2,5 mM CaCl₂, 0,6% Olivenöl, 0,036% Polyvinylalkohol (MW 70,000–100,000, Sigma P-1763).
PEG 4000 (Polyethylenglykol, Molekulargewicht = 4000) (BDH, England)

Beispiel 1
Lipase-Herstellung aus Stämmen von Gliocladium und Trichophaea
Jeder der Gliocladium-Stämme, die in der Tabelle unten gezeigt sind, wurde für die Produktion lipolytischen Enzyms mit einer Vorkultur gefolgt von einer Hauptkultur verwendet. Die Vorkultur wurde durch Kultivierung mit YS-2-Medium für 2 Tage bei 27°C hergestellt und die Hauptkultur wurde bei 27°C unter Verwendung des Mediums und der Kulturzeiten, die unten gezeigt sind, hergestellt. Nach dem Ende der Hauptkultur wurden die Zellen entfernt und die Ausbeute an lipolytischer Aktivität wurde unter Verwendung der LU und SLU-Testverfahren gemessen.
Es wurde gesehen, dass alle der obigen Stämme lipolytisches Enzym produzieren. Eine besonders hohe Ausbeute wurde bei Kultivierung von G. solani gefunden.
Beispiel 2
Aktivität der lipolytischen Enzyme von Gliocladium und Trichophaea bei verschiedenen pH
Die zellfreien Kulturbrühen aus Beispiel 1 wurden auf ihre lipolytische Enzymaktivität bei pH 6,0, 8,5 und 10,00 ohne den Zusatz von Ca⁺⁺ und bei pH 10 mit Zugabe von Ca⁺⁺ getestet. Es wurden der Plattentest verwendet, der in Beispiel 11 von WO 88/02775 (entsprechend JP-W 1-501120) beschrieben wurde.
Es wird gesehen, dass in diesem semi-quantitativen Test alle der obigen Lipasepräparationen nahezu die gleiche Aktivität im pH-Bereich von 6–10 haben, mit und ohne Zusatz von Calcium.
Beispiel 3
Herstellung des lipolytischen Enzyms aus Gliocladium sp.
Eine Vorkultur wurde hergestellt durch Inokulieren von Gliocladium sp. CBS 173.96 aus einem Schrägagarröhrchen von PDA (ein Produkt von Difco) in eine Schüttelflasche unter Schütteln für 2 Tage bei 27°C. Eine Hauptkultur wurde hergestellt durch Verwenden der Vorkultur zum Inokulieren von 50 Schüttelflaschen mit 100 ml von NOMO 16 für 5 Tage bei 27°C unter Schütteln.
Nach Entfernung der Zellmasse wurden 3000 ml einer zellfreien Brühe mit einer Lipase-Aktivität von 11 LU/ml gewonnen, welche direkt für die Reinigung eingesetzt wurden.
Beispiel 4
Reinigung des lipolytischen Enzyms aus Gliocladium sp.
0,5% CHAPS wurde zur Kulturbrühe aus Beispiel 3 hinzugefügt. Dies wurde bei 45000 UPM für 1 Stunde zentrifugiert und auf ein 0,8 μm-Filter gefiltert. Das Filtrat wurde auf eine Gelfiltrationssäule (Superdex, ein Produkt von Pharmacia) aufgetragen unter Verwendung von 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,5 mit 0,2 M NaCl).
Beispiel 5
Herstellung des lipolytischen Enzyms von G. solani
Eine Vorkultur wurde hergestellt durch Inokulieren von G. solani CBS 707.86 aus einem Schrägagarröhrchen von PDA (ein Produkt von Difco) auf zwei Schüttelflaschen unter Schütteln für 2 Tage bei 27°C. Eine Hauptkultur wurde hergestellt unter Verwendung der Vorkultur, um 50 Schüttelflaschen zu inokulieren mit 100 ml von Agar 30 für 5 Tage bei 27°C unter Schütteln. 4900 ml einer zellfreien Brühe mit einer Lipase-Aktivität von 49 LU/ml wurden nach Entfernung der Zellmasse gewonnen. Diese wurde deionisiert und frei getrocknet (engl. free dried), um 10,2 g einer Pulverprobe mit einer Lipase-Aktivität von 15700 LU/g zu erhalten.
Beispiel 6
Reinigung des lipolytischen Enzyms von G. solani
Das lipolytische Enzym wurde mit 2 Schritten gereinigt, hydrophobe Interaktion und Gelfiltration. Genauer gesagt, wurde die Reinigung wie folgt ausgeführt.
Die Pulverprobe aus Beispiel 5 wurde in 3 M Ammoniumacetat gelöst, einschließlich 0,5% 3[3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonat (CHAPS) und bei 18000 UPM für 20 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde mit einem 0,2 μm-Filter gefiltert und auf eine Butyltoyopearl-Säulenchromatographie (62 × 200 mm) aufgetragen. Nachdem ungebundene Materialien mit 3 M Ammoniumacetat ausgewaschen waren, und dann wurde die Säule mit 50 mM Natriumcarbonat-Puffer (pH 10,0) einschließlich 0,5% CHAPS gewaschen. Die lipolytische Aktivität wurde mit H₂O eluiert. Das eluierte lipolytische Enzym wurde auf eine Gelfiltrationssäule (26 × 600 mm) aufgetragen. Das aufgetragene Volumen betrug 3 ml und das Eluiermittel war 35 mM Natriumcarbonat-Puffer (pH 10,0) einschließlich 0,3% CHAPS. Die Flussrate betrug 3 ml/min. Das lipolytische Enzym wurde bei etwa 225 ml eluiert.
Ein Molekulargewicht von 36 kDa wurde aus der Gelfiltration berechnet. Fraktionen, die die lipolytische Aktivität enthielten, wurden zusammengefasst und durch Ultrafiltration dialysiert/konzentriert. Ein Molekulargewicht des lipolytischen Enzyms von 22 kD wurde aus SDS-PAGE berechnet. Mit IEF-PAGE wurde ein isoelektrischer Punkt zwischen 8,15 und 8,45 gefunden.
Beispiel 7
Herstellung des lipolytischen Enzyms von Verticillium sp.
Vorkulturen von Verticillium sp. CBS 830.95 wurden in 500 ml Schüttelflaschen hergestellt, die 150 ml Medium der folgenden Zusammensetzung enthielten:
Corn steep-Flüssigkeit: 12 g/l
Glucose: 24 g/l
Zu jeder Flasche werden 0,5 ml Öl und 0,5 g CaCO₃ hinzugefügt.
Der pH wird vor dem Autoklavieren auf 5,5 eingestellt.
Die Flaschen wurden mit Sporensuspensionen aus Schrägagar-Röhrchen inokuliert, wobei 10 ml pro Schüttelflasche verwendet wurden.
Nach 2 Tagen bei 26°C bei 200 UPM wurde die Vorkultur für die Inokulierung von Schüttelflaschen verwendet, die 150 ml des folgenden Mediums enthielten:

Pepton 6 g/l

Pepticase 4 g/l

Hefeextrakt 3 g/l

Rindfleischextrakt 1,5 g/l

Dextrose 1 g/l

Olivenöl 10 g/l
Der pH wird auf 7,3–7,4 vor dem Autoklavieren eingestellt.
Jede Flasche wurde mit 4 ml Vorkultur inokuliert. Die Flaschen wurden bei 26°C bei 200 UPM für 4 Tage inkubiert.
Zwei Flaschen ergaben 6,3 LU/ml beziehungsweise 7,6 LU/ml.
50 Flaschen resultierten in 4,71 an Brühe, welche gereinigt wurde.
Beispiel 8
Reinigung des lipolytischen Enzyms aus Verticillium sp.
4 l an Kulturmedium, das in Beispiel 1 erhalten wurde, mit einer Aktivität von 4,4 LU/ml wurde mit dem folgenden Verfahren gereinigt.
Decyl Agarose (50 ml): Die Kulturbrühe wurde gefiltert und auf eine Decyl-Agarose-Säule aufgetragen, die vorher in 10 mM Tris/0,25 M NaCl, pH 7, equilibriert worden war. Gebundene Proteine wurden mit 50% Ethanol eluiert. Ausbeute: 75%.
Q-Sepharose (25 ml): Die Decyl-Agarose-Fraktion wurde auf eine Q-Sepharose-Säule aufgetragen, die vorher in 10 mM H₃BO₃/KCl, pH 10, nach Einstellen des pHs auf 10, equilibiert worden war. Die Aktivität wurde unter Verwendung eines linearen Gradienten von 0–0,25 M NaCl eluiert. Ausbeute: 50%.
Konzentrierung: Entsalzung wurde auf G-25 ausgeführt, gefolgt von Speed Vacuum Freeze Drying. Ausbeute: 60%.
Beispiel 9
Waschleistung des lipolytischen Enzyms
Das lipolytische Enzym der Erfindung wurde mit Enzymen des Standes der Technik im folgenden Waschtest verglichen.
Ein lipolytisches Enzym gemäß dieser Erfindung (von G. solani NN102998) wurde mit dem obigen AiD-Test getestet und verglichen zu einem Enzym des Standes der Technik: Lipolase^® (eine Lipase, die von Humicola lanuginosa abstammt).
Es wird beobachtet, dass der Wascheffekt der Lipase dieser Erfindung dem Stand der Technik weit überlegen ist.
Beispiel 10
Stabilität des lipolytischen Enzyms in Waschmittellösung
Das gereinigte lipolytische Enzym aus Beispiel 2 wurde für 30 Minuten in jeder der Lösungen, die unten gezeigt sind, inkubiert. Die Lipase-Aktivität wurde vor und nach der Inkubation gemessen und die Stabilität wurde als %-Restaktivität ausgedrückt. Ergebnisse:

100 mM Glycin, pH 10, 45°C 97%

Testwaschmittel (siehe unten), pH 10,2, 40°C 99%
Die obigen Ergebnisse demonstrieren eine exzellente Stabilität bei alkalischem pH, sogar in der Anwesenheit von Waschmittel.
Die Testwaschmittellösung hat die folgende Zusammensetzung (in g/l):

Alkylsulfat (C₁₄-C₁₆) 0,300

Alkoholethoxylat (C₁₂-C₁₄, 6 EO) 0,650

Zeolith P 1,750

Na₂CO₃ 0,145

Acrylat/Maleat-Copolymer 0,020

Carboxymethylcellulose 0,050
Beispiel 11
Klonierung und Expression der lipolytischen Enzyme
In diesem Beispiel wurden Enzyme von Gliocladium sp. CBS 173, Verticillium sp. CBS 830.95 und T. saccata CBS 804.70 als Spenderorganismen kloniert und exprimiert, unter Verwendung des Verfahrens zum „Expression cloning in yeast", das bereits in dieser Beschreibung beschrieben wurde.
mRNA wurde aus dem Spenderorganismus isoliert, im Wesentlichen wie in der Hauptkultur nach einem vorstehenden Beispiel kultiviert unter Rühren (engl. agitation), um eine ausreichende Belüftung sicherzustellen.
Die Mycelien wurden nach 3–5 Tagen Wachstum geerntet, sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei –80°C gelagert. Eine davon abstammende Bibliothek, bestehend aus etwa 9 × 10⁵ individuellen Klonen wurde in E. coli konstruiert, wie beschrieben, mit einem Vektorhintergrund von 1%. Die Plasmid-DNA von einigen der Poole wurde in Hefe transformiert und 50–100 Platten enthaltend 250–400 Hefekolonien wurden aus jedem Pool erhalten.
Kolonien positiv für das lipolytische Enzym wurden identifiziert und isoliert wie oben beschrieben. cDNA-Inserts wurden direkt von den Hefekolonien amplifiziert und charakterisiert wie in dem Materialien und Methoden-Abschnitt oben beschrieben. Die DNA-Sequenz der cDNA, die für das lipolytische Enzym kodiert, wurde bestimmt. Die DNA-Sequenz, die entsprechende Aminosäuresequenz und die für das lipolytische Enzym kodierende Region sind in den Sequenzprotokollen, die bereits in dieser Beschreibung gekennzeichnet sind, gezeigt.
Gesamt-DNA wurde aus einer Hefekolonie isoliert und die Plasmid-DNA wurde durch Transformieren von E. coli gewonnen (engl. rescued), wie oben beschrieben. Um das lipolytische Enzym in Aspergillus zu exprimieren, wurde die DNA mit geeigneten Restriktionsenzymen verdaut, nach Größe auf einem Gel fraktioniert und ein Fragment entsprechend dem Gen für das lipolytische Enzym wurde gereinigt. Das Gen wurde im Folgenden in pHD414 ligiert und mit geeigneten Restriktionsenzymen verdaut. Das resultierende Plasmid aus jedem der drei Spenderorganismen ist bezeichnet als pA2L123, pA2L114 bzw. pC1L160.
Nach Amplifikation der DNA in E. coli wurde das Plasmid in Aspergillus oryzae wie oben beschrieben transformiert.
Jede der Transformanten wurde auf lipolytische Enzymaktivität wie oben beschrieben getestet. Einige der Transformanten hatten lipolytische Enzymaktivität, welche deutlich größer war als der Hintergrund von Aspergillus oryzae. Dies demonstriert die effiziente Expression des lipolytischen Enzyms in Aspergillus oryzae.
Bis zur Publikation des Hinweises auf die Erteilung eines europäischen Patents, oder, wo zutreffend, für zwanzig Jahre ab dem Anmeldedatum, sofern die Anmeldung zurückgewiesen worden ist, zurückgezogen wurde, oder als zurückgezogen gilt, darf eine Probe des hinterlegten Mikroorganismus nur einem unabhängigen Experten zur Verfügung gestellt werden, der von der Person, die die Probe angefordert hat, benannt worden ist (cf. Regel 28(4) EPÜ). Und insoweit als Australien betroffen ist, wird in entsprechender Weise die Experten-Option beantragt, unter Bezug auf Regel. 3.25 der Australia Statutory Rules 1991 No. 71.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Ein alkalisches lipolytisches Enzym, welches ist: a) ein Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz hat, wie gezeigt in den Positionen 1–200 von SEQ ID NO: 3, Positionen 1–202 von SEQ ID NO: 6, oder Positionen 1–201 von SEQ ID NO: 8, oder b) ein Analog des Polypeptids definiert in (a), welches: i) wenigstens 60% homolog mit besagtem Polypeptid ist, oder ii) immunologisch reaktiv mit einem Antikörper ist, der gegen das besagte Polypeptid in gereinigter Form hergestellt wurde.
Das lipolytische Enzym des vorherigen Anspruchs, welches aus einem Mikroorganismus, bevorzugt einem filamentösen Pilz, mehr bevorzugt einem Stamm von Gliocladium, Verticillium oder Trichophaea (vorzugsweise T. saccata) erhalten werden kann.
Das lipolytische Enzym von Anspruch 2, welches aus einem Stamm von Gliocladium erhalten werden kann und eine lipolytische Aktivität bei pH 10 in der Abwesenheit von Ca⁺⁺ von über 20% der lipolytischen Aktivität bei pH 10 in der Gegenwart von 50 mM Ca⁺⁺ hat.
Das lipolytische Enzym von Anspruch 2 oder 3, welches aus einem Stamm von Gliocladium erhalten werden kann und das einen Grad an Hydrolyse von über 15% auf Baumwoll/Olivenöl-Stoffproben im Activity-in-Detergent (AiD)-Test hat.
Das lipolytische Enzym von einem der vorherigen Ansprüche, wobei der Stamm Gliocladium sp. CBS 173.96 ist oder zu G. ammoniophilum, G. aureum, G. catenulatum, G. flavum, G. nigrovirens, G. roseum, G. sagariensis oder G. solani, vorzugsweise Gliocladium sp. CBS 173.96, G. ammoniophilum CBS 156.70, G. aureum IFO 9055, G. catenulatum NRRL 1091, G. flavum CBS 155.27, G. nigrovirens CBS 183.30, G. roseum CBS 126.96, G. roseum CBS 127.96, G. sagariensis IFO 9080 oder G. solani CBS 707.86 gehört.
Das lipolytische Enzym von Anspruch 2, welches aus einem Stamm der Gattung Verticillium erhalten werden kann und das mehr als 90% seiner Aktivität behält nach einer Inkubation für 30 Minuten bei pH 10,2, 40°C in einer Lösung von 0,300 g/l C14-C16 Alkylsulfat, 0,650 g/l Alkoholethoxylat (C12-C14, 6 EO), 1,750 Zeolith P, 0,145 g/l Na2CO3, 0,020 g/l Acrylat/Maleat-Copolymer und 0,050 g/l Carboxymethylcellulose.
Das lipolytische Enzym des vorherigen Anspruchs, wobei der Stamm Verticillium sp. CBS 830.95 ist.
Das lipolytische Enzym von einem der vorherigen Ansprüche, welches Lipase und/oder Cutinase-Aktivität hat.
Das lipolytische Enzym von einem der vorherigen Ansprüche in der Gestalt eines enzymatischen Waschmittelzusatzes, welches ein nicht staubendes Granulat ist, eine stabilisierte Flüssigkeit, eine Aufschlämmung, oder ein geschütztes Enzym.
Eine enzymatische Waschmittelzusammensetzung umfassend eine oberflächenaktive Substanz und das lipolytische Enzym von einem der vorherigen Ansprüche.
Ein Verfahren zum Herstellen eines alkalischen lipolytischen Enzyms, umfassend die Kultivierung eines ein lipolytisches Enzym produzierenden Stammes von Gliocladium, Verticillium oder Trichophaea in einem passendem Nährmedium, gefolgt von Gewinnung des alkalischen lipolytischen Enzyms.
Das Verfahren des vorherigen Anspruchs, wobei der Stamm Gliocladium sp. CBS 173.96 ist oder zu G. ammoniophilum, G. aureum, G. catenulatum, G. flavum, G. nigrovirens, G. roseum, G. sagariensis oder G. solani, vorzugsweise Gliocladium sp. CBS 173.96, G. ammoniophilum CBS 156.70, G. aureum IFO 9055, G. catenulatum NRRL 1091, G. flavum CBS 155.27, G. nigrovirens CBS 183.30, G. roseum CBS 126.96, G. roseum CBS 127.96, G. sagariensis IFO 9080 oder G. solani CBS 707.86 gehört.
Das Verfahren von Anspruch 11, wobei der Stamm ein Stamm von Verticillium ist, und vorzugsweise Verticillium sp. CBS 830.95 ist.
Das Verfahren von Anspruch 11, wobei der Stamm ein Stamm von Trichophaea ist, vorzugsweise T. saccata, am meisten bevorzugt T. saccata CBS 804.70.
Ein Verfahren zum Herstellen eines alkalischen lipolytischen Enzyms umfassend: a) Isolieren einer DNA-Sequenz kodierend für das lipolytische Enzym eines ein lipolytisches Enzym produzierenden Stammes von Gliocladium, Verticillium oder Trichophaea, b) Kombinieren des DNA-Fragmentes mit geeignetem geeigneten Expressionssignal(en) in einem geeigneten Vektor, c) Transformieren eines geeigneten heterologen Wirtsorganismus mit dem Vektor, d) Kultivieren des transformierten Wirtsorganismus unter Bedingungen, die zur Expression des lipolytischen Enzyms führen, und e) Gewinnen des lipolytischen Enzyms aus dem Kulturmedium.
Das Verfahren des vorherigen Anspruchs, wobei der Wirtsorganismus eine eukaryotische Zelle ist, insbesondere eine Pilzzelle, wie zum Beispiel eine Hefezelle oder eine filamentöse Pilzzelle, vorzugsweise ein Stamm von Aspergillus, mehr bevorzugt A. oryzae.
Das Verfahren von Anspruch 15 oder 16, wobei die DNA-Sequenz mit einem Verfahren isoliert wird, umfassend: a) Klonieren, in geeignete Vektoren, einer cDNA-Bibliothek aus einem ein lipolytisches Enzym produzierenden Stamm von Gliocladium, Verticillum oder Trichophaea, b) Transformieren passender Hefewirtszellen mit besagten Vektoren, c) Kultivieren der transformierten Hefewirtszellen unter geeigneten Bedingungen, um das alkalische lipolytische Enzym zu exprimieren, d) Screening nach positiven Klonen durch Bestimmen der lipolytischen Enzymaktivität, die in Schritt (c) exprimiert wird.
Das Verfahren von einem der Ansprüche 15–17, wobei der das lipolytische Enzym produzierende Stamm Gliocladium sp. CBS 173.96 ist, oder zu G. ammoniophilum, G. aureum, G. catenulatum, G. flavum, G. nigrovirens, G. roseum, G. sagariensis oder G. solani, vorzugsweise Gliocladium sp. CBS 173.96, G. ammoniophilum CBS 156.70, G. aureum IFO 9055, G. catenulatum NRRL 1091, G. flavum CBS 155.27, G. nigrovirens CBS 183.30, G. roseum CBS 126.96, G. roseum CBS 127.96, G. sagariensis IFO 9080 oder G. solani CBS 707.86 gehört.
Das Verfahren von einem der Ansprüche 15–17, wobei der das lipolytische Enzym produzierende Stamm zu Verticillium gehört, und vorzugsweise Verticillium sp. CBS 830.95 ist.
Das Verfahren von einem der Ansprüche 15–17, wobei der das lipolytische Enzym produzierende Stamm zu Trichophaea gehört, vorzugsweise T. saccata, am meisten bevorzugt CBS 804.70.
Eine isolierte DNA-Sequenz, welche für das lipolytische Enzym von einem der Ansprüche 1–9 kodiert.
Eine isolierte DNA-Sequenz, welche für ein lipolytisches Enzym kodiert, welches umfasst: a) die DNA-Sequenz gezeigt in Positionen 114–713 von SEQ ID NO: 2, Positionen 133–738 von SEQ ID NO: 5 oder Positionen 161–763 von SEQ ID NO: 7, oder b) ein Analog der DNA-Sequenz definiert in a) welche i) mindestens 60% homolog ist mit besagter DNA-Sequenz, oder ii) mit besagter Sequenz bei 55°C hybridisiert.
Die DNA-Sequenz von Anspruch 21 oder 22, wobei die für das lipolytische Enzym kodierende Sequenz aus einem Mikroorganismus erhalten werden kann, vorzugsweise einem filamentösen Pilz.
Die DNA-Sequenz des vorherigen Anspruchs, wobei der filamentöse Pilz ein Stamm von Gliocladium, Verticillium oder Trichophaea ist, vorzugsweise der Stamm Gliocladium sp. CBS 173.96, Verticillium sp. CBS 173.96, oder T. saccata CBS 804.70.
Ein rekombinanter Expressionsvektor umfassend die DNA-Sequenz von einem der Ansprüche 21–24.
Eine Zelle umfassend die DNA-Sequenz von einem der Ansprüche 21–24 oder den rekombinanten Expressionsvektor von Anspruch 25.
Die Zelle des vorherigen Anspruchs, welche eine eukaryotische Zelle ist, insbesondere eine Pilzzelle, wie z. B. eine Hefezelle oder eine filamentöse Pilzzelle, vorzugsweise ein Stamm von Aspergillus, vorzugsweise A. oryzae.
Ein Verfahren zum Herstellen eines lipolytischen Enzyms, umfassend das Kultivieren der Zelle von einem der Ansprüche 26–27 unter Bedingungen, die die Produktion des Enzyms erlauben und Gewinnen des Enzyms aus der Kultur.
Eine biologisch reine Kultur eines mikrobiellen Stammes, welcher Gliocladium sp. CBS 173.96, Gliocladium roseum CBS 126.96 oder 127.96 oder Verticillium sp. CBS 830.95 ist.
Escherichia coli-Stamm DSM 10591, DSM 10590 oder DSM 11298.