BRPI0720801A2 - Produção de um lipídio aciltranfersase a partir de células transformadas de bacillus licheniformis. - Google Patents

Description

RELATORIO DESCRITIVO Pedido de Patente de Invenção para: "PRODUÇÃO DE UM LIPÍDIO ACILTRANSFERSASE A PARTIR DE CÉLULAS TRANSFORMADAS DE BACILLUS LICHENIFOBMIS" .

REFERÊNCIAS RELACIONADAS AO PEDIDO

É feita referência aos seguintes pedidos relacionados: US 2002-0009518, US 2004-0091574, WO 2004/064537, WO 2004/064987, WO 2005/066347, WO 2005/066351, Pedido americano No. de série US 60/764, 430, depositado em 2 de 10 fevereiro de 2006, e WO 2006/008508. Cada um desses pedidos e cada um dos documentos citados em cada um desses pedidos ("documentos citados nos pedidos"), e cada documento referenciado ou citado nos documentos citados nos pedidos, tanto no texto quanto durante o processamento desses 15 pedidos, bem como todos os argumentos no suporte da patenteabilidade avançada durante tal processamento, são por meio deste incorporados aqui por referência. Diversos documentos são também citados neste texto ("documentos citados aqui"). Cada um dos documentos citados aqui, e cada 20 documento citado ou referenciado nos aqui citados documentos, é por meio deste incorporado aqui por referência.

CAMPO DA PRESENTE INVENÇÃO

A presente invenção se refere à produção de lipidio aciltransferases. Em particular, métodos para a produção de um lipidio aciltransferase pela expressão de um lipidio aciltransferase em uma célula hospedeira de Bacillus, preferivelmente uma célula hospedeira de B. Iicheniformis. Adicionalmente, a presente invenção se refere ao uso de Bacillus (preferivelmente, B. Iicheniformis) para expressar 5 um lipidio aciltransferase e para uma célula hospedeira de Baeillus, preferivelmente uma célula hospedeira de B. Iicheniformis, compreendendo no seu genoma um gene codificando um lipidio aciltransferase.

ANTECEDENTES DA PRESENTE INVENÇÃO Lipidio aciltransferases são conhecidos por serem

vantajosos em aplicações alimentícias. Lipidio

aciltransferases têm sido verificados apresentar atividade aciltransferase significativa em gêneros alimentícios. Esta atividade possui surpreendentes aplicações benéficas em métodos de preparo de substâncias alimentícias.

Por exemplo, o documento WO 2004/064537 divulga um método para a produção in situ de um emulsificante pelo uso de um lipidio aciltransferase e as vantagens associadas com isso.

Consequentemente há uma necessidade por um método para

a produção comercial de lipidio aciltransferases.

Entretanto, genes podem ser geralmente difíceis de serem expressos em hospedeiros heterólogos e a expressão de lipidio aciltransferases em células hospedeiras pode ser problemática. O documento WO 2004/064537 divulga a expressão de dois lipidios aciltransferases de Aeromonas em Bacillus subtilis e Escherichia eoli. Contudo, a expressão em Baeillus subtilis é baixa enquanto E. eoli não é um organismo GRAS e é, dessa forma, inadequada como um hospedeiro para enzimas que devem ser usadas na indústria alimentícia.

0 documento US 6,255,076 divulga um método para a produção de um polipeptídio em uma célula hospedeira de Baeillus. Porém, tal método requer o uso de um promotor em tandem, no qual cada seqüência promotora é ligada de modo operável a uma cópia simples de uma seqüência de ácido nucléico que codifica a seqüência de polipeptídio. Assim, existe a necessidade na arte de um método melhorado para a produção de lipidio aciltransferases.

RESUMO DOS ASPECTOS DA PRESENTE INVENÇÃO

Os aspectos da presente invenção são apresentados nas reivindicações e no comentário a seguir.

Um aspecto da presente invenção se refere a um método para a produção de um lipidio aciltransferase compreendendo as etapas de:

(i) fornecer uma célula hospedeira,

preferivelmente uma célula hospedeira de Baeillus, em que a célula hospedeira de Bacillus é uma outra que de Baeillus subtilis, preferivelmente uma célula de Baeillus lieheniformis; (ii) transformar a célula hospedeira, preferivelmente a célula hospedeira de Bacillus, em que a célula hospedeira de Bacillus é uma outra que de Bacillus subtilis, preferivelmente a célula de Baeillus

lieheniformis, com uma seqüência de nucleotídios heteróloga que codifica um lipidio aciltransferase; e

(iii) expressar o lipidio aciltransferase na célula sob o controle de uma seqüência promotora.

Em outro aspecto, a presente invenção se refere a uma 10 célula hospedeira de Bacillus, em que a célula hospedeira de Baeillus é uma outra que de Baeillus subtilis, preferivelmente uma célula hospedeira de Bacillus lieheniformis, compreendendo um lipidio aciltransferase heterólogo.

Em um aspecto adicional, a presente invenção se refere

ao uso de uma célula hospedeira de Bacillus, em que a célula hospedeira de Bacillus é uma outra do que a Baeillus subtilis, preferivelmente uma célula hospedeira de Baeillus lieheniformis, na produção de um lipidio aciltransferase heterólogo.

A expressão adequada no hospedeiro de Bacillus, em que o hospedeiro de Baeillus é uma outra que de Baeillus subtilis, e preferivelmente em que o hospedeiro de Baeillus é B. lieheniformis, pode resultar na expressão aumentada quando comparada à expressão no B. subtilis. Ainda em outro aspecto, a presente invenção se refere a um vetor de expressão compreendendo uma seqüência de nucleotidios que codifica um lipidio aciltransferase ligado de forma operável a uma ou mais seqüência(s) regulatória(s) 5 tal que a(s) seqüência(s) regulatória(s) é(são) capaz(es) de expressar a seqüência de nucleotidios que codifica um lipidio aciltransferase em um hospedeiro ou célula hospedeira adequada, preferivelmente um hospedeiro (ou célula) de Bacillus, em que o hospedeiro (ou célula) de 10 Bacillus é um outro que Baeillus subtilis, preferivelmente em B. Iieheniformis ou uma célula de B. lieheniformis.

O lipidio aciltransferase pode, de forma adequada, ser um lipidio aciltransferase recombinante.

ASPECTOS DETALHADOS DA PRESENTE INVENÇÃO De acordo com um primeiro aspecto da presente

invenção, é provido um método para a produção de um lipidio aciltransferase compreendendo as etapas de:

(i) fornecer uma célula hospedeira, preferivelmente uma célula hospedeira de Bacillus, em que a célula

hospedeira de Bacillus é uma outra que de Baeillus subtilis, preferivelmente uma célula de Baeillus lieheniformis;

(ii) transformar a célula hospedeira, preferivelmente a célula hospedeira de Baeillus, em que a

célula hospedeira de Baeillus é uma outra que de Bacillus subtilis, preferivelmente uma célula de Baeillus lieheniformis, com uma seqüência de nucleotidios heteróloga que codifica um lipidio aciltransferase; e

(iii) expressar o lipidio aciltransferase na célula sob o controle de uma seqüência promotora.

Adicionalmente, uma seqüência de nucleotidios que

codifica um peptídio sinal pode ser ligada de forma operável à dita seqüência de nucleotidios heteróloga que codifica um lipidio aciltransferase.

Um método adequado, da presente invenção, pode ainda compreender a etapa adicional de isolamento/recuperação do lipidio aciltransferase.

Em outro aspecto, a presente invenção se refere a uma célula hospedeira de Bacillus lieheniformis compreendendo um lipidio aciltransferase heterólogo.

Um lipidio aciltransferase adequado pode ser um

lipidio aciltransferase recombinante.

De maneira adequada, a seqüência promotora usada de acordo com as células hospedeiras, vetores, métodos e/ou usos da presente invenção pode ser homologa à célula 20 hospedeira. "Homólogos à célula hospedeira" significa originada dentro do organismo hospedeiro; ou seja, uma seqüência promotora que é naturalmente encontrada no organismo hospedeiro. Adequadamente, a seqüência promotora pode ser selecionada a partir do grupo consistindo de uma 25 seqüência de nucleotidios que codifica: um promotor <x- amilase, um promotor de protease, um promotor de subtilisina, um promotor de protease específico de ácido glutâmico e um promotor de levanasacarase.

Convenientemente, a seqüência promotora pode ser uma seqüência de nucleotidios que codifica: o LAT (por exemplo, promotor alfa-amilase de B. lieheniformis, conhecido também como AmyL), AprL (por exemplo, promotor subtilisina Carlsberg), EndoGLUC (por exemplo, promotor específico de ácido glutâmico do B. lieheniformis), AmyQ (por exemplo, o promotor alfa-amilase do promotor da alfa-amilase de B. amyloliquefaciens) e SacB (por exemplo, o promotor da B. subtilis levanasacarase) .

Em uma modalidade da presente invenção, a seqüência promotora é a seqüência -35 a -10 de um promotor alfa- amilase, preferivelmente a seqüência -35 a -10 de um promotor α-amilase de B. lieheniformis. A "seqüência -35 a -10" descreve a posição relativa ao sítio de iniciação da transcrição. Ambos "-35" e "-10" são caixas, ou seja, um número de nucleotidios, compreendendo cada uma 6 nucleotidios e essas caixas são separadas por 17 nucleotidios. Esses 17 nucleotidios são frequentemente referidos como um "espaçador". Isso é ilustrado na Figura 55, onde as caixas "-35" e "-10" estão sublinhadas. Para evitar dúvidas, onde "a seqüência -35 a -10" é usada aqui, se refere a uma seqüência do início da caixa -35 para o final da caixa -10, ou seja, incluindo também a caixa -35, o espaçador com tamanho de 17 nucleotidios e a caixa -10. Em alguns aspectos, a seqüência de nucleotidios que codifica um lipidio aciltransferase para uso em qualquer uma das células hospedeiras, vetores, métodos e/ou usos da presente invenção pode compreender um Motif GDSx e/ou um Motif GANDY.

Preferivelmente, a enzima lipidio aciltransferase é caracterizada como uma enzima que possui atividade aciltransferase e que compreende a seqüência de aminoácidos do motif GDSX, onde X é um ou mais dos seguintes resíduos de aminoácido L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M ou S.

Apropriadamente, a seqüência de nucleotidios que codifica um lipidio aciltransferase para uso em qualquer um dos vetores, células hospedeiras, métodos e/ou usos da presente invenção pode ser obtenível, preferivelmente 15 obtida, a partir de um organismo de um ou mais dos seguintes gêneros: Aeromonas, Streptomyces, Saccharomyces, Lactoeoceus, Mycobaeteríum, Streptoeoecus, Laetobaeillus, Desulf itobaeterium, Bacillus, Campylobaeter, Vibrionaeeae, Xylella, Sulfolobus, Aspergillus, Schizosaceharomyees, 20 Listeria, Neisseria, Mesorhizobium, Ralstonia, Xanthomonas e Candida. Preferivelmente, o lipidio aciltransferase é obtenível, preferivelmente obtido, a partir de um organismo do gênero Aeromonas.

Em alguns aspectos da presente invenção, a seqüência de nucleotidios que codifica um lipidio aciltransferase para uso em qualquer um dos vetores, células hospedeiras, métodos e/ou usos da presente invenção codifica um lipidio aciltransferase que compreende um resíduo de ácido aspártico em uma posição correspondente ao N-80 na seqüência de aminoácido do lipidio aciltransferase de Aeromonas hydrophila mostrada como SEQ ID No. 35.

Adicionalmente ou alternativamente, a seqüência de nucleotidios que codifica um lipidio aciltransferase para uso em qualquer um dos vetores, células hospedeiras, métodos e/ou usos da presente invenção codifica um lipidio aciltransferase que pode compreender a seqüência de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 16, ou uma seqüência de aminoácidos que possui 75 % ou mais de homologia a isso. Adequadamente, a seqüência de nucleotidios que codifica um lipidio aciltransferase codifica um lipidio aciltransferase que pode compreender a seqüência de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 16.

0 termo "heterólogo" conforme usado aqui significa uma seqüência derivada de uma espécies ou fonte genética separada. A seqüência heteróloga é uma seqüência não hospedeira, uma seqüência modificada, uma seqüência de uma linhagem de célula hospedeira diferente, ou uma seqüência homóloga de uma diferente localização cromossomal da célula hospedeira.

Uma seqüência "homóloga" é uma seqüência que é encontrada na mesma fonte genética ou espécie, ou seja, é de ocorrência natural nas espécies relevantes da célula hospedeira.

0 termo "lipidio aciltransferase recombinante" conforme usado aqui quer dizer que o lipidio aciltransferase tem sido produzido por meio de recombinação genética. Por exemplo, a seqüência de nucleotidios que codifica o lipidio aciltransferase foi introduzida em um vetor de clonagem, resultando em uma célula de B. lieheniformis caracterizada pela presença do lipidio aciltransferase heterólogo.

CÉLULA HOSPEDEIRA

Em uma modalidade da presente invenção, a célula hospedeira para uso nos métodos e/ou usos da presente invenção é uma célula hospedeira de Bacillus lieheniformis.

Descobriu-se que o uso de uma célula hospedeira de Baeillus lieheniformis resulta na expressão aumentada de um lipidio aciltransferase quando comparada com outro organismo, tal como o Bacillus subtilis.

Um lipidio aciltransferase de Aeromonas salmonieida tem sido inserido em um número de vetores de expressão convencionais designados para serem os mais adequados para a expressão em Baeillus subtilis, Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe e Aspergillus tubigensis, respectivamente. Apenas níveis muito baixos foram, entretanto, detectados em Hansenula polymorpha, Schizosaceharomyees pombe e Aspergillus tubigensis. Os niveis de expressão foram abaixo de 1 μg/mL, e não foi possível selecionar as células que produziram proteína suficiente para iniciar uma produção comercial (resultados não apresentados). Em contraste, o Bacillus lieheniformis foi capaz de produzir níveis de proteína, que são atraentes para uma produção economicamente viável.

Em particular, tem sido verificado que a expressão no B. Iieheniformis é aproximadamente 100 vezes maior do que a expressão no B. subtilis sob o controle do promotor aprE ou é aproximadamente 100 vezes maior do que a expressão em S. Iividans sob o controle de um promotor A4 e unido à celulose (resultado não mostrado aqui).

Em outra modalidade, a célula hospedeira pode ser qualquer outra célula de Baeillus que não B. subtilis. Preferivelmente, a dita célula hospedeira de Baeillus sendo de uma das seguintes espécies: Bacillus lieheniformis; B. alkalophilus; B. amyloliquefaciens; B. eireulans; B. elausii; B. eoagulans; B. firmus; B. Iautus; B. Ientus; B. megaterium; B. pumilus ou B. stearothermophilus.

O termo "célula hospedeira" - em relação à presente invenção, inclui qualquer célula que compreenda também uma seqüência de nucleotidios que codifica um lipidio aciltransferase como aqui definido ou um vetor de expressão como descrito acima e que é usado na produção recombinante de um lipidio aciltransferase possuindo as propriedades específicas como definidas aqui. Assim, uma modalidade adicional da presente invenção provê uma célula hospedeira compreendendo (por exemplo, transformada ou transfectada com) uma seqüência de nucleotidios da presente invenção ou uma seqüência de nucleotidios que expressa um polipeptídio possuindo as propriedades específicas conforme definidas aqui.

Adequadamente, em algumas modalidades, a célula hospedeira pode ser uma linhagem deficiente de protease ou com menos protease e/ou uma linhagem deficiente em a- amilase ou com menos a-amilase.

SEQÜÊNCIAS REGULATÓRIAS

Em algumas aplicações, uma seqüência lipidio aciltransferase para uso em qualquer uma das células hospedeiras, vetores, métodos e/ou usos da presente invenção pode ser ligada de forma operável a uma seqüência reguladora que é capaz de prover a expressão da seqüência de nucleotidios, tal como pela célula hospedeira selecionada (tal como uma célula B. lieheniformis).

A título de exemplo, a presente invenção cobre um vetor que compreende a seqüência de nucleotidios da presente invenção ligada de forma operável a tal seqüência reguladora, ou seja, o vetor é um vetor de expressão.

0 termo "ligada de forma operável" se refere a uma justaposição onde os componentes descritos estão em uma relação que os permite funcionar na forma pretendida. Uma seqüência regulatória "ligada de forma operável" a uma seqüência codificante é ligada de tal forma que a expressão da seqüência codificante é alcançada sob condições compatíveis com as seqüências controle.

0 termo "seqüências regulatórias" inclui promotores e acentuadores e outros sinais de regulação da expressão.

0 termo "promotor" é usado no sentido normal da arte, por exemplo, um sítio de ligação de RNA polimerase.

A expressão acentuada da seqüência de nucleotidios que codifica a enzima que possui as propriedades específicas 10 conforme aqui definidas, pode ser também alcançada pela seleção das regiões reguladoras, por exemplo, promotor, líder de secreção e regiões terminais que não são regiões reguladoras para a seqüência de nucleotidios que codifica a enzima in natura.

Adequadamente, a seqüência de nucleotidios da presente

invenção pode ser ligada de forma operável a pelo menos um promotor.

Adequadamente, a seqüência de nucleotidios que codifica um lipidio aciltransferase pode ser ligada de 20 forma operável a uma seqüência de nucleotidios que codifica uma seqüência terminal. Exemplos de seqüência terminais adequadas para uso em qualquer um dos vetores, células hospedeiras, métodos e/ou usos da presente invenção incluem: uma seqüência terminal de α-amilase (por exemplo, 25 CGGGACTTACCGAAAGAAACCATCAATGATGGTTTCTTTTTTGTTCATAAA - SEQ ID No. 64), uma seqüência terminal de protease alcalina (por exemplo,

CAAGACTAAAGACCGTTCGCCCGTTTTTGCAATAAGCGGGCGAATCTTACATAAAAATA - SEQ ID No. 65), uma seqüência terminal de ácido glutâmico específico (por exemplo,

ACGGCCGTTAGATGTGACAGCCCGTTCCAAAAGGAAGCGGGCTGTCTTCGTGTATTATT GT - SEQ ID No. 66), uma seqüência terminal de levanase (por exemplo,

TCTTTTAAAGGAAAGGCTGGAATGCCCGGCATTCCAGCCACATGATCATCGTTT SEQ ID No. 67) e uma seqüência terminal de subtilisina E (por exemplo,

GCTGACAAATAAAAAGAAGCAGGTATGGAGGAACCTGCTTCTTTTTACTATTATTG) . Adequadamente, a seqüência de nucleotidios que codifica um lipidio aciltransferase pode ser ligada de forma operável a um terminal de α-amilase, tal como um terminal de oc- amilase de B. lieheniformis.

PROMOTOR

A seqüência promotora a ser usada de acordo com a presente invenção, pode ser heteróloga ou homóloga à seqüência que codifica um lipidio aciltransferase.

A seqüência promotora pode ser qualquer seqüência promotora capaz de direcionar a expressão de um lipidio aciltransferase na célula hospedeira de escolha.

Adequadamente, a seqüência promotora pode ser homóloga à uma espécie de BaciIlus, por exemplo B. lieheniformis. Preferivelmente, a seqüência promotora é homóloga à célula hospedeira de escolha. Seqüências promotoras adequadas para uso na presente invenção incluem: o promotor do gene alfa-amilase de Bacillus lieheniformis, o promotor do gene subtilisina de Baeillus lieheniformis, o promotor do gene subtilisina de Baeillus subtilis, o promotor do gene da protease alcalina de Baeillus lieheniformis (gene subtilisina Carlsberg), o promotor do gene da protease específica de ácido glutâmico de B. lieheniformis, o promotor do gene alfa-amilase de B. amyloliquefaeiens; o promotor de levanasacarase de B. subtilis e um promotor "consenso" que possui a seqüência TTGACA para a região "-35" e TATAAT para a região "-10" (ou seja, o promotor -35 a -10) do gene alfa-amilase.

Outros exemplos de promotores adequados para a direção da transcrição de uma seqüência de ácido nucléico nos métodos da presente invenção incluem: o promotor do gene da protease alcalina (aprH) de Baeillus lentus; o promotor do gene da alfa-amilase (amyE) de Baeillus subtilis; o promotor do gene da amilase maltogênica (AmyM) de Baeillus stearothermophilus; o promotor do gene da penicilinase (penP) de Baeillus lieheniformis; os promotores dos genes xylA e xylB de Baeillus subtilis e/ou o promotor do gene CryIIIA de Baeillus thuringiensis subesp. tenebrionis.

Em uma modalidade preferida, a seqüência promotora é um promotor de α-amilase (tal como promotor de a-amilase de Baeillus lieheniformis) . Preferivelmente, a seqüência promotora compreende a seqüência -35 a -10 do promotor de α-amilase de B. lieheniformis - veja Figuras 53 e 55. PEPTÍDIO SINAL

O lipidio aciltransferase produzido por uma célula hospedeira da seqüência de nucleotidios que codifica o lipidio aciltransferase pode ser secretado ou pode estar contido intracelularmente dependendo da seqüência e/ou vetor usado.

Uma seqüência de sinal pode ser usada para direcionar a secreção das seqüências codificadoras através de uma membrana celular particular. As seqüências de sinal podem ser naturais ou externas à seqüência que codifica lipidio aciltransferase. Por exemplo, a seqüência que codifica o peptídio sinal pode ser obtida a partir de um gene amilase ou protease de uma espécie de Bacillus, preferivelmente do Baeillus lieheniformis.

Seqüências adequadas que codificam o peptídio sinal podem ser obtidas a partir de um ou mais dos seguintes genes: gene de α-amilase maltogênica, gene de subtilisina, gene de betalactamase, gene de protease neutra, gene prsA, e/ou gene aciltransferase.

Preferivelmente, o peptídio sinal é um peptídio sinal de α-amilase de B. Lieheniformis, aciltransferase de Aeromonas (por exemplo, mkkwfvcllglialtvqa - SEQ ID No. 21), subtilisina de B. subtilis (por exemplo, mrskklwisllf altlif tmaf snmsaqa - SEQ ID No. 22) ou subtilisina de B. lieheniformis (por exemplo, mmrkksfwf gmltafmlvf tmef sdsasa - SEQ ID No. 23). Adequadamente, o peptídio sinal pode ser o peptídio sinal de α-amilase de B. Lieheniformis.

Contudo, qualquer seqüência codificadora de peptídio sinal capaz de direcionar o lipidio aciltransferase expresso na via secretora de uma célula hospedeira de Baeillus (preferivelmente uma célula hospedeira de escolha de B. Lieheniformis) pode ser usada.

Em algumas modalidades da presente invenção, uma seqüência de nucleotidios que codifica um peptídio sinal pode ser ligada de forma operável a uma seqüência de nucleotidios que codifica um lipidio aciltransferase de escolha.

0 lipidio aciltransferase de escolha pode ser expresso em uma célula hospedeira conforme descrito aqui como uma proteína de fusão.

VETOR DE EXPRESSÃO

0 termo "vetor de expressão" significa uma construção capaz da expressão in vivo ou in vitro.

Preferivelmente, o vetor de expressão está incorporado no genoma do organismo, tal como um hospedeiro B. Lieheniformis. 0 termo "incorporado" cobre preferivelmente a incorporação estável no genoma. A seqüência de nucleotidios que codifica um lipidio aciltransferase conforme aqui definida pode estar presente em um vetor, no qual a seqüência de nucleotidios está ligada de forma operável às seqüências regulatórias, tal que as seqüências regulatórias são capazes de prover a expressão da seqüência de nucleotidios em um organismo hospedeiro adequado (tal como B. Lieheniformis), ou seja, o vetor é um vetor de expressão.

Os vetores da presente invenção podem ser transformados em uma célula hospedeira adequada como descrito acima para prover a expressão de um polipeptídio possuindo atividade lipidio aciltransferase conforme definida aqui.

A escolha do vetor, por exemplo, plasmídeo, cosmídeo, vírus ou vetor fago, inserto genômico, irá muitas vezes depender da célula hospedeira na qual que é para ser introduzido. A presente invenção pode cobrir outras formas de vetores de expressão que apresentam funções equivalentes e que são, ou se tornam, conhecidas na arte.

Uma vez transformado na célula hospedeira de escolha, o vetor pode se replicar e agir de forma independente do genoma da célula hospedeira, ou pode se integrar no próprio genoma.

Os vetores podem conter um ou mais genes marcadores selecionáveis - tais como um gene que confere resistência antibiótica, por exemplo, resistência à ampicilina, kanamicina, cloranfenicol ou tetraciclina.

Alternativamente, a seleção pode ser acompanhada pela cotransformação (como descrita no documento WO 91/17243).

Os vetores podem ser usados in vitro, por exemplo, para a produção de RNA ou usados para transfectar ou transformar uma célula hospedeira.

Assim, em uma modalidade adicional, a invenção provê um método de preparo das seqüências de nucleotidios da presente invenção ou seqüências de nucleotidios que codificam polipeptídios possuindo as propriedades especificas como aqui definidas para uso em qualquer um dos vetores, células hospedeiras, outros métodos e/ou usos da presente invenção, pela introdução da seqüência de nucleotidios em um vetor replicável, introdução do vetor em uma célula hospedeira compatível, e desenvolvimento da célula hospedeira sob condições que ocasionam a replicação do vetor.

0 vetor pode compreender ainda uma seqüência de nucleotidios que permite o vetor se replicar na célula hospedeira em questão. Exemplos de tais seqüências são as origens de replicação dos plasmídeos pUC19, pACYC177, pUBUO, pEl 94, pAMBl e pIJ702.

LIPÍDIO ACILTRANSFERASE

A seqüência de nucleotidios que codifica um lipidio aciltransferase para uso em qualquer um dos métodos, vetores e/ou usos da presente invenção pode codificar um lipidio aciltransferase natural ou um lipidio aciltransferase variante.

Por exemplo, a seqüência de nucleotidios que codifica um lipidio aciltransferase para uso na presente invenção pode ser um conforme descrito nos documentos W02004/064537, W02004/064987, W02005/066347, ou W02006/008508 . Esses documentos são aqui incorporados por referência.

0 termo "lipidio aciltransferase", como usado aqui, significa preferivelmente uma enzima que possui atividade aciltransferase (geralmente classificada como E.C. 2.3.1.x, por exemplo, 2.3.1.43), pela qual a enzima é capaz de transferir um grupo acila de um lipidio para um ou mais substratos aceptores, tal com um ou mais dos seguintes: um esterol, um estanol, uma carboidrato, uma proteína, uma subunidade de proteína, um álcool de açúcar, tal como ácido ascórbico e/ou glicerol - preferivelmente glicerol e/ou um esterol, tal como colesterol.

Preferivelmente, a seqüência de nucleotidios que codifica um lipidio aciltransferase para uso em qualquer um dos vetores, células hospedeiras, métodos e/ou usos da presente invenção codifica um lipidio aciltransferase que é capaz de transferir um grupo acila de um fosfolipídio (como definido aqui) a um álcool de açúcar, tal como ácido ascórbico e/ou glicerol, mais preferivelmente glicerol.

Em alguns aspectos o "aceptor de acila" de acordo com a presente invenção pode ser qualquer composto compreendendo um grupo hidroxila (-0H), tal como, por exemplo, álcoois polivalentes, incluindo glicerol, esteróis, estanóis, carboidratos, hidroxiácidos incluindo ácidos de frutos, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido lático e ácido ascórbico; proteínas ou subunidades destas, tais como aminoácidos, hidrolisatos de proteínas e peptídios (proteína parcialmente hidrolisada), por exemplo; e misturas e derivados destes. Preferivelmente, o "aceptor de acila" de acordo com a presente invenção não é água. Preferivelmente, o "aceptor de acila" de acordo com a presente invenção é um álcool de açúcar, tal como um poliol, mais preferivelmente glicerol. Para a finalidade desta invenção o ácido ascórbico é também considerado um álcool de açúcar.

0 aceptor de acila é preferivelmente não um monoglicerídio.

0 aceptor de acila é preferivelmente não um diglicerídio.

Em um aspecto, a seqüência de nucleotidios que codifica um lipidio aciltransferase para uso em qualquer uma das células hospedeiras, vetores, métodos e/ou usos da presente invenção codifica um lipidio aciltransferase que pode, bem como ser capaz de transferir um grupo acila de um lipidio a glicerol, adicionalmente ser capaz de transferir o grupo acila de um lipidio a um ou mais dos seguintes: um carboidrato, uma proteína, uma subunidade de proteína, esterol e/ou um estanol, preferivelmente é capaz da transferência a ambos um álcool de açúcar, tal como ácido ascórbico e/ou glicerol, mais preferivelmente um esterol tal como colesterol, e/ou estanóis/esterol de vegetal.

Preferivelmente, o substrato de lipidio no qual o

lipidio acil atua é um ou mais dos seguintes lipidios: um fosfolipidio, tal como uma lecitina, por exemplo, fosfatidilcolina.

Este substrato de lipidio pode ser referido aqui como "doador de lipidio acil". 0 termo lecitina como usado aqui engloba fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina,

fosfatidilinositol, fosfatidilserina e fosfatidilglicerol.

Para alguns aspectos, preferivelmente a seqüência de nucleotidios que codifica um lipidio aciltransferase para 15 uso em qualquer uma das células hospedeiras, vetores, métodos e/ou usos da presente invenção codifica um lipidio aciltransferase que é incapaz de, ou substancialmente incapaz de, atuar em um triglicerídio e/ou um 1- monogliceridio e/ou 2-monogliceridio.

Para alguns aspectos, preferivelmente a seqüência de

nucleotidios que codifica um lipidio aciltransferase para uso em qualquer uma das células hospedeiras, vetores, métodos e/ou usos da presente invenção codifica um lipidio aciltransferase que não exibe atividade triacilglicerol 25 lipase (E.C. 3.1.1.3) ou não exibe atividade significativa de triacilglicerol lipase (E.C. 3.1.1.3). A capacidade em hidrolisar trigliceridio (atividade

E.C. 3.1.1.3) pode ser determinada pela atividade da lipase que é determinada de acordo com o Código de Produtos Químicos Alimentícios (FCC) (3a Ed., 1998, págs. 492-493) modificado para óleo de girassol e pH 5,5 ao invés de óleo de oliva e pH 6,5. A atividade da lipase é medida como LUS (unidades de lipase no girassol) onde I LUS é definido como a quantidade de enzima que pode liberar l[mu]mol de ácidos graxos por minuto do óleo de girassol sob as condições de ensaio acima. Alternativamente, pode ser usada o ensaio LUT conforme definido no documento W09845453. Essa referência é aqui incorporada por referência.

A seqüência de nucleotidios que codifica um lipidio aciltransferase para uso em qualquer uma das células hospedeiras, vetores, métodos e/ou usos da presente invenção pode codificar um lipidio aciltransferase o qual é substancialmente incapaz de atuar em um trigliceridio que pode ter um LUS/mg de menos do que 1000, por exemplo, menor que 500, tal como menor que 300, preferivelmente menor que 200, mais preferivelmente menor que 100, mais preferivelmente menor que 50, mais preferivelmente menor que 20, mais preferivelmente menor que 10, tal como menor que 5, menor que 2, mais preferivelmente menor que 1 LUS/mg. Alternativamente, a atividade LUT/mg é menor do que 500, tal como menor que 300, preferivelmente menor que 200, mais preferivelmente menor que 100, mais preferivelmente menor que 50, mais preferivelmente menor que 20, mais preferivelmente menor que 10, tal como menor que 5, menor que 2, mais preferivelmente menor que 1 LUT/mg.

A seqüência de nucleotidios que codifica um lipidio aciltransferase para uso em qualquer uma das células hospedeiras, vetores, métodos e/ou usos da presente invenção pode codificar um lipidio aciltransferase o qual é substancialmente incapaz de atuar em um monoglicerídio, pode ser determinado pelo uso de monooleato (M77 65 1- Oleoil-rac-glicerol 99 %) no lugar do óleo de girassol no ensaio LUS. I MGHU é definido como a quantidade de enzima que pode liberar l[mu]mol de ácidos graxos por minuto de monoglicerídio sob condições de ensaio.

A seqüência de nucleotidios que codifica um lipidio aciltransferase para uso em qualquer uma das células hospedeiras, vetores, métodos e/ou usos da presente invenção codifica um lipidio aciltransferase, o qual é substancialmente incapaz de atuar em um trigliceridio que pode ter um MGHU/mg menor do que 5000, por exemplo, menor do que 1000, por exemplo, menor do que 500, tal como menor do que 300, preferivelmente menor do que 200, mais preferivelmente menor do que 100, mais preferivelmente menor do que 50, mais preferivelmente menor do que 20, mais preferivelmente menor do que 10, tal como menor do que 5, menor do que 2, mais preferivelmente menor do que 1 MGHU/mg. Adequadamente, a seqüência de nucleotidios que codifica um lipidio aciltransferase para uso em qualquer uma das células hospedeiras, vetores, métodos e/ou usos da presente invenção codifica um lipidio aciltransferase que pode apresentar uma ou mais das seguintes atividades de fosfolipase: atividade de fosfolipase A2 (E.C. 3.1.1.4) e/ou atividade de fosfolipase Al (E.C. 3.1.1.32). 0 lipidio aciltransferase pode também ter atividade de fosfolipase B (E.C. 3.1.1.5) .

Apropriadamente, para alguns aspectos, o lipidio aciltransferase pode ser capaz de transferir um grupo acila de um fosfolipídio a um álcool de açúcar, preferivelmente glicerol e/ou ácido ascórbico.

Para alguns aspectos, preferivelmente a seqüência de nucleotidios que codifica um lipidio aciltransferase para uso em qualquer uma das células hospedeiras, vetores, métodos e/ou usos da presente invenção codifica um lipidio aciltransferase que é capaz de transferir um grupo acila de um fosfolipídio a um esterol e/ou estanol para formar pelo menos um éster de esterol e/ou éster de estanol.

0 lipidio aciltransferase pode ser capaz de transferir um grupo acila de um lipidio a um poliol tal como glicerol, e/ou um esterol tal como colesterol ou estanóis/ esteróis de vegetais. Assim, em uma modalidade o "aceptor de acila" de acordo com a presente invenção pode ser glicerol e/ou colesterol ou estanóis/esteróis de vegetais. Preferivelmente, a enzima lipidio aciltransferase pode ser caracterizada usando os seguintes critérios:

A enzima possui atividade aciltransferase que pode ser definida como atividade de transferência de éster de acordo com o qual a parte acila de uma

ligação original de éster de um lipidio doador de acila é transferida a um aceptor de acila, preferivelmente glicerol ou colesterol, para formar um novo éster; e A enzima compreende uma seqüência de aminoácidos

de Motif GDSx, em que X é um ou mais dos seguintes resíduos de aminoácidos: L, A, V, I,

F, Y, H, Q, T, N, M ou S.

Preferivelmente, X do Motif GDSx é L ou Y. Mais preferivelmente, X do Motif GDSx é L. Assim, preferivelmente, a enzima de acordo com a presente invenção compreende a seqüência de aminoácidos de Motif GDSL.

O Motif GDSx é compreendido por quatro aminoácidos conservados. Preferivelmente, a serina dentro do motif é 20 uma serina catalítica da enzima lipidio aciltransferase. Adequadamente, a serina do Motif GDSx pode estar em uma posição correspondente a Ser-16 na enzima lipidio aciltransferase de Aeromonas hydrophíIa ensinado em Brumlik

& Buckley (Journal of Bacteriology, Apr. 1996, Vol. 178, No. 7, p 2060-2064). Para determinar se a proteína possui Motif GDSx de acordo com a presente invenção, a seqüência é preferivelmente comparada com perfis de modelos ocultos de Markov (perfis HMM) da base de dados pfms de acordo com os 5 procedimentos ensinados nos documentos W02004/064537 ou W02004/064987, incorporados aqui por referência.

Preferivelmente, a enzima lipidio aciltransferase pode ser ordenada usando a seqüência consenso Pfam00657 (para uma explicação completa veja W02004/064537 ou W02004/064987).

Preferivelmente, uma correspondência positiva com o perfil de modelo oculto de Markov (perfil HMM) da família de domínio pfam00657 indica a presença do domínio GDSL ou GDSX de acordo com a invenção.

Preferivelmente, quando alinhado com a seqüência

consenso Pfam00657 o lipidio aciltransferase para uso nos métodos ou usos da invenção pode ter pelo menos um, preferivelmente mais do que um, preferivelmente mais do que dois, dos seguintes, um bloco GDSx, um bloco GANDY, um 20 bloco HPT. Adequadamente, o lipidio aciltransferase pode ter um bloco GDSx e um bloco GANDY. Alternativamente, a enzima pode ter um bloco GDSx e um bloco HPT. Preferivelmente, a enzima compreende pelo menos um bloco GDSx. Veja o documento W02004/064537 ou W02004/064987 para 25 detalhes adicionais. Preferivelmente, resíduos do Motif GANDY são selecionados a partir GANDY, GGNDA, GGNDL, mais preferivelmente GANDY.

Preferivelmente, quando alinhado com a seqüência consenso Pfam00657, a enzima para uso nos métodos ou usos da invenção tem pelo menos um, preferivelmente mais do que um, preferivelmente mais do que dois, preferivelmente mais do que três, preferivelmente mais do que quatro, preferivelmente mais do que cinco, preferivelmente mais do que seis, preferivelmente mais do que sete, preferivelmente mais do que oito, preferivelmente mais do que nove, preferivelmente mais do que dez, preferivelmente mais do que onze, preferivelmente mais do que doze, preferivelmente mais do que treze, preferivelmente mais do que quatorze, dos seguintes resíduos de aminoácidos quando comparada à seqüência polipeptídica de referência de A. hydrophila, denominada SEQ ID No. 1: 28hid, 29hid, 30hid, 31hid, 32gly, 33Asp, 34Ser, 35hid, 130hid, 131Gly, 132Hid, 133Asn, 134Asp, 135Hid, 309His.

O domínio GDSX pfam00657 é um identificador único que distingue as proteínas que possuem este domínio de outras enzimas.

A seqüência consenso pfam00657 é apresentada na Figura 3 como SEQ ID No. 2. Essa é derivada da identificação da família 00657 pfam, base de dados versão 6, que pode ser também referida aqui como pfam00657.6. A seqüência consenso pode ser atualizada usando ainda lançamentos da base de dados pfam (por exemplo, veja o documento W02004/064537 ou W02004/064987).

Em uma modalidade, a seqüência de nucleotidios que codifica uma enzima lipidio aciltransferase para uso em qualquer uma das células hospedeiras, vetores, métodos e/ou usos da presente invenção codifica um lipidio aciltransferase que pode ser caracterizado usando os seguintes critérios:

(i) a enzima possui atividade aciltransferase que pode ser definida como atividade de transferência de éster através do qual a parte acila de uma ligação original de éster de um lipidio doador de acila é transferida ao aceptor de acila, preferivelmente glicerol ou colesterol, para formar um novo éster, preferivelmente monoglicerídio ou éster de colesterol, respectivamente;

(ii) a enzima compreende a seqüência de aminoácidos Motif GDSx, onde X é um ou mais dos seguintes resíduos de aminoácidos: L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M ou S;

(iii) a enzima compreende His-309 ou compreende um resíduo de histidina em uma posição correspondente à HIS-309 na enzima lipidio aciltransferase de Aeromonas hydrophila mostrada nas Figuras 2 e 4 (SEQ ID No. 1 ou SEQ ID No. 3).

Preferivelmente, o resíduo de aminoácidos do Motif GDSx é L.

Na SEQ ID No. 3 ou SEQ ID No. 1, os primeiros 18 resíduos de aminoácidos formam uma seqüência sinal. His-309 da seqüência de comprimento total, que é a proteína incluindo a seqüência sinal, se equipara à His-291 da parte madura da proteína, ou seja, a seqüência sem a seqüência sinal.

Em uma modalidade, a seqüência de nucleotidios que codifica uma enzima lipidio aciltransferase para uso em qualquer uma das células hospedeiras, vetores, métodos e/ou usos da presente invenção codifica um lipidio aciltransferase que compreende a seguinte tríade catalítica: Ser-34, Asp-306 e His-309 ou compreende um resíduo de serina, um resíduo de ácido aspártico e um resíduo de histidina, respectivamente, nas posições correspondentes à Ser-34, Asp-306 e His-309 na enzima lipidio aciltransferase de Aeromonas hydrophila mostrada na Figura 4 (SEQ ID No. 3) ou Figura 2 (SEQ ID No. 1) . Conforme especificado acima, na seqüência mostrada em SEQ ID No. 3 ou SEQ ID No. 1, os primeiros 18 resíduos de aminoácidos formam uma seqüência sinal. Ser-34, Asp-306 e His-309 da seqüência de comprimento total, que é a proteína que inclui a seqüência de sinal, se equipara a Ser-16, Asp- 288 e His-291 da parte madura da proteína, ou seja, a seqüência sem a seqüência sinal. Na seqüência consenso pfam00657, conforme dado na Figura 3 (SEQ ID No. 2), os resíduos de sítio ativo correspondem a Ser-7, Asp-345 e Hís-348 .

Em uma modalidade, a seqüência de nucleotidios que codifica uma enzima lipidio aciltransferase para uso em qualquer uma das células hospedeiras, vetores, métodos e usos da presente invenção codifica um lipidio aciltransferase que pode ser caracterizado usando os seguintes critérios:

a enzima possui atividade aciltransferase que pode ser definida como atividade de transferência de éster através da qual a parte acila de uma ligação original de éster de um primeiro lipidio doador de acila é transferida a um aceptor de acila, para formar um novo éster; e

a enzima compreende pelo menos Gly-32, Asp-33, Ser-34, Asp-134 e His-309 ou compreende resíduos de glicina, ácido aspártico, serina, ácido aspártico e histidina nas posições correspondentes à Gly-32, Asp-33, Ser-34, Asp-306 e His-309, respectivamente na enzima lipidio aciltransferase de Aeromonas hydrophila mostrada na SEQ ID No. 3 ou SEQ ID No. 1.

Adequadamente, a seqüência de nucleotidios que codifica uma enzima lipidio aciltransferase para uso em qualquer uma das células hospedeiras, vetores, métodos e usos da presente invenção pode ser uma das seguintes seqüências de nucleotidios:

(a) seqüência de nucleotidios mostrada como SEQ ID NO. 36 (Veja figura 29);

(b) seqüência de nucleotidios mostrada como SEQ ID NO. 38 (Veja figura 31);

(c) seqüência de nucleotidios mostrada como SEQ ID NO. 39 (Veja figura 32);

(d) seqüência de nucleotidios mostrada como SEQ

ID NO. 42 (Veja figura 35);

(e) seqüência de nucleotidios mostrada como SEQ ID NO. 44 (Veja figura 37);

(f) seqüência de nucleotidios mostrada como SEQ ID NO. 46 (Veja figura 39);

(g) seqüência de nucleotidios mostrada como SEQ ID NO. 48 (Veja figura 41);

(h) seqüência de nucleotidios mostrada como SEQ ID NO. 49 (Veja figura 57);

(i) seqüência de nucleotidios mostrada como SEQ

ID NO. 50 (Veja figura 58);

(j) seqüência de nucleotidios mostrada como SEQ

ID NO. 51 (Veja figura 59);

(k) seqüência de nucleotidios mostrada como SEQ

ID NO. 52 (Veja figura 60); (1) seqüência de nucleotidios mostrada como SEQ ID NO. 53 (Vej a figura 61) ; (m) seqüência de nucleotidios mostrada como SEQ ID NO. 54 (Veja figura 62); (n) seqüência de nucleotidios mostrada como SEQ ID NO. 5 5 (Veja figura 63); (o) seqüência de nucleotidios mostrada como SEQ ID NO. 56 (Veja figura 64); (P) seqüência de nucleotidios mostrada como SEQ ID NO. 57 (Veja figura 65); (q) seqüência de nucleotidios mostrada como SEQ ID NO. 58 (Veja figura 66); (r) seqüência de nucleotidios mostrada como SEQ ID NO. 59 (Veja figura 67); (S) seqüência de nucleotidios mostrada como SEQ ID NO. 60 (Veja figura 68); (t) seqüência de nucleotidios mostrada como SEQ ID NO. 61 (Veja figura 69); (U) seqüência de nucleotidios mostrada como SEQ ID NO. 62 (Veja figura 70); (v) seqüência de nucleotidios mostrada como SEQ ID NO. 63 (Veja figura 71); (w) OU uma seqüência de nucleotidios que possui 70 % ou mais, preferivelmente 75 % ou mais, de identidade com qualquer uma das seqüências mostradas como SEQ ID No. 36, SEQ ID No. 38, SEQ ID No. 39, SEQ ID No. 42, SEQ ID No. 44, SEQ ID No. 46, SEQ ID No. 48, SEQ ID No. 49, SEQ ID No. 50, SEQ ID No. 51, SEQ ID No. 52, SEQ ID No. 53, SEQ ID No. 54, SEQ ID No. 55, SEQ ID No. 56, SEQ ID No. 57, SEQ ID No. 58, SEQ ID No. 59, SEQ ID No. 60, SEQ ID No. 61, SEQ ID No. 62 ou SEQ ID No. 63.

Adequadamente, a seqüência de nucleotidios pode possuir 80 % ou mais, preferivelmente 85 % ou mais, mais preferivelmente 90 % ou mais e ainda mais preferivelmente

95 % ou mais, de identidade com qualquer uma das seqüências mostradas como SEQ ID No. 36, SEQ ID No. 38, SEQ ID No. 39, SEQ ID No. 42, SEQ ID No. 44, SEQ ID No. 46, SEQ ID No. 48, SEQ ID No. 49, SEQ ID No. 50, SEQ ID No. 51, SEQ ID No. 52, SEQ ID No. 53, SEQ ID No. 54, SEQ ID No. 55, SEQ ID No. 56, SEQ ID No. 57, SEQ ID No. 58, SEQ ID No. 59, SEQ ID No. 60, SEQ ID No. 61, SEQ ID No. 62 ou SEQ ID No. 63.

Em uma modalidade, a seqüência de nucleotidios que codifica uma enzima lipidio aciltransferase para uso em qualquer uma das células hospedeiras, vetores, métodos e usos da presente invenção é uma seqüência de nucleotidios que possui 70 % ou mais, preferivelmente 75 % ou mais, de identidade com qualquer uma das seqüências mostradas como: SEQ ID No. 49, SEQ ID No. 50, SEQ ID No. 51, SEQ ID No. 62 e SEQ ID No. 63. Adequadamente, a seqüência de nucleotidios pode possuir 80 % ou mais, preferivelmente 85 % ou mais, mais preferivelmente 90 % ou mais e ainda mais preferivelmente 95 % ou mais de identidade com qualquer uma das seqüências mostradas como: SEQ ID No. 49, SEQ ID No. 50, SEQ ID No. 51, SEQ ID No. 62 e SEQ ID No. 63.

Em uma modalidade, a seqüência de nucleotidios que 5 codifica uma enzima lipidio aciltransferase para uso em qualquer uma das células hospedeiras, vetores, métodos e usos da presente invenção é uma seqüência de nucleotidios que possui 70 % ou mais, 75 % ou mais, 80 % ou mais, preferivelmente 85 % ou mais, mais preferivelmente 90 % ou 10 mais e ainda mais preferivelmente 95 % ou mais de identidade da seqüência apresentada como SEQ ID No. 49.

Adequadamente, a seqüência de nucleotidios que codifica uma enzima lipidio aciltransferase para uso em qualquer uma das células hospedeiras, vetores, métodos e 15 usos da presente invenção pode codificar um lipidio aciltransferase que compreende uma ou mais das seguintes seqüências de nucleotidios:

(i) seqüência de aminoácidos mostrada como SEQ ID

No. 3

(ü) seqüência de aminoácidos mostrada como SEQ ID

No. 4

(iii) seqüência de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 5

(iv) seqüência de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 6 (v) seqüência de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 7

(vi) seqüência de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 8

(vii) seqüência de aminoácidos mostrada como SEQ ID

No. 9

(viii) seqüência de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 10

(ix) seqüência de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 11

(x) seqüência de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 12

(xi) seqüência de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 13

(xü) seqüência de aminoácidos mostrada como SEQ ID

No. 14

(xiii) seqüência de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 1

(xiv) seqüência de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 15 ou

uma seqüência de aminoácidos que possui 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, ou mais de identidade com qualquer uma das seqüências apresentadas como SEQ ID No. I, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 14, ou SEQ ID No. 15.

Adequadamente, a seqüência de nucleotidios que codifica uma enzima lipidio aciltransferase para uso em qualquer uma das células hospedeiras, vetores, métodos e usos da presente invenção pode codificar um lipidio aciltransferase que compreende também a seqüência de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 3 ou como SEQ ID No. 4 ou como SEQ ID No. 1 ou como SEQ ID No. 15 ou compreende uma seqüência de aminoácidos que tem 75 % ou mais, preferivelmente 80 % ou mais, preferivelmente 85 % ou mais, preferivelmente 90 % ou mais, preferivelmente 95 % ou mais, de identidade com a seqüência de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 3 ou a seqüência de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 4 ou a seqüência de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 1 ou a seqüência de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 15.

Adequadamente, a seqüência de nucleotidios que codifica uma enzima lipidio aciltransferase para uso em 20 qualquer uma das células hospedeiras, vetores, métodos e usos da presente invenção pode codificar um lipidio aciltransferase que compreende uma seqüência de aminoácidos 80 % ou mais, preferivelmente 85 % ou mais, preferivelmente 90 % ou mais, e ainda mais preferivelmente 95 % ou mais de 25 identidade com a seqüência de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 14, SEQ ID No. I, ou SEQ ID No. 15.

Adequadamente, a seqüência de nucleotidios que 5 codifica uma enzima lipidio aciltransferase para uso em qualquer uma das células hospedeiras, vetores, métodos e usos da presente invenção pode codificar um lipidio aciltransferase que compreende uma ou mais das seguintes seqüências de aminoácidos:

(a) uma seqüência de aminoácidos mostrada como

resíduos de aminoácidos 1-100 da SEQ ID No. 3 ou SEQ ID No. 1;

(b) uma seqüência de aminoácidos mostrada como resíduos de aminoácidos 101-200 da SEQ ID No.

3 ou SEQ ID No. 1;

(c) uma seqüência de aminoácidos mostrada como resíduos de aminoácidos 201-300 da SEQ ID No. 3 ou SEQ ID No. 1; ou

(d) uma seqüência de aminoácidos que possui 75 % ou mais, preferivelmente 85 % ou mais,

preferivelmente 90 % ou mais, ainda mais preferivelmente 95 % ou mais, de identidade a qualquer uma das seqüências de aminoácidos definidas acima em (a)-(c). Adequadamente, a enzima lipidio aciltransferase para uso em métodos e usos da presente invenção pode compreender uma ou mais das seguintes seqüências de aminoácidos:

(a) uma seqüência de aminoácidos mostrada como resíduos de aminoácidos 28-39 da SEQ ID No. 3

ou SEQ ID No. 1;

(b) uma seqüência de aminoácidos mostrada como resíduos de aminoácidos 77-88 da SEQ ID No. 3 ou SEQ ID No. 1;

(c) uma seqüência de aminoácidos mostrada como

resíduos de aminoácidos 126-136 da SEQ ID No. 3 ou SEQ ID No. 1;

(d) uma seqüência de aminoácidos mostrada como resíduos de aminoácidos 163-175 da SEQ ID No.

3 ou SEQ ID No. 1;

(e) uma seqüência de aminoácidos mostrada como resíduos de aminoácidos 304-311 da SEQ ID No. 3 ou SEQ ID No. 1; ou

(f) uma seqüência de aminoácidos que possui 75 % ou mais, preferivelmente 85 % ou mais,

preferivelmente 90 % ou mais, ainda mais preferivelmente 95 % ou mais, de identidade a qualquer uma das seqüências de aminoácidos definidas acima em (a)-(e).

Em um aspecto, a seqüência de nucleotidios que

codifica uma enzima lipidio aciltransferase para uso em qualquer uma das células hospedeiras, vetores, métodos e usos da presente invenção codifica um lipidio aciltransferase que pode ser o lipidio aciltransferase de Candida parapsilosis conforme ensinado em EP 1 275 711.

Assim, em um aspecto o lipidio aciltransferase para uso no método e usos da presente invenção pode ser um lipidio aciltransferase compreendido em uma das seqüências de aminoácidos ensinadas em SEQ ID No. 17 ou SEQ ID No. 18.

Muito pela preferência, a seqüência de nucleotidios que codifica uma enzima lipidio aciltransferase para uso em qualquer uma das células hospedeiras, vetores, métodos e usos da presente invenção codifica um lipidio aciltransferase que pode ser um lipidio acil transferase (lipidio aciltransferase) compreendendo a seqüência de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 16, ou uma seqüência de aminoácidos que possui 75 % ou mais, preferivelmente 85 % ou mais, preferivelmente 90 % ou mais, ainda mais preferivelmente 95 % ou mais, ainda mais preferivelmente 98 % ou mais, ou ainda mais preferivelmente 99 % ou mais de identidade a SEQ ID No. 16. Essa enzima pode ser considerada uma enzima variante.

Em um aspecto, a seqüência de nucleotidios que codifica uma enzima lipidio aciltransferase para uso em qualquer uma das células hospedeiras, vetores, métodos e usos da presente invenção codifica um lipidio aciltransferase que pode ser uma lecitina: colesterol aciltransferase (LCAT) ou sua variante (por exemplo, uma variante feita pela evolução molecular).

LCATs adequados são conhecidos na arte e podem ser obtidos a partir de um ou mais dos seguintes organismos, por exemplo: mamíferos, ratos, camundongos, galinhas, Drosophila melanogaster, vegetais, incluindo Arabidopsis e Oryza sativa, nematóides, fungos e leveduras.

Em uma modalidade a seqüência de nucleotidios que codifica uma enzima lipidio aciltransferase para uso em qualquer uma das células hospedeiras, vetores, métodos e usos da presente invenção codifica um lipidio aciltransferase que pode ser o lipidio aciltransferase obtenível, preferivelmente obtido, de Linhagens de E.coli TOP 10 harbouring pPet12aAhydro e pPet12aASalmo depositadas pela Danisco A/S de Langebrogade I, DK-1001 Copenhagen K, Dinamarca sob o Tratado de Budapeste sobre o reconhecimento Internacional do Deposito de Microorganismos para as finalidades de Procedimento de Patente na National Colletion of Industrial, Marine and Food Bactéria (NCIMB) 23 St. Machar Street, Aberdeen Escócia, GB em 22 de dezembro de 2003 sob os números de acesso NCIMB 41204 e NCIMB 41205, respectivamente.

Uma seqüência de nucleotidios que codifica uma enzima lipidio aciltransferase para uso em qualquer uma das células hospedeiras, vetores, métodos e usos da presente invenção pode codificar um fosfolipídio glicerol aciltransferase. Fosfolipídios glicerol aciltransferase incluem aqueles isolados de Aeromonas spp., preferivelmente Aeromonas hydrophila ou A. salmonicida, mais preferivelmente A. salmonicida ou suas variantes. Lipidio aciltransferases mais preferidos para uso na presente invenção são codificados pela SEQ ID Nos. 1, 3, 4, 15 e 16. Será reconhecido pelo versado na técnica que é preferível que os peptídios sinais da aciltransferase tenham sido clivados durante a expressão da transferase. Os peptídios sinal das SEQ ID 1, 3, 4, 15 e 16 são aminoácidos 1-18. Assim, as regiões mais preferidas são aminoácidos 19-335 para SEQ ID No. I e SEQ ID No. 3 (A. hydrophila) e aminoácidos 19-336 para SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 15 e SEQ ID No. 16 (A. salmonicida) . Quando usado para determinar a homologia da identidade das seqüências de aminoácidos, é preferido que os alinhamentos, conforme descritos aqui, usem a seqüência madura.

Assim, as regiões mais preferidas para a determinação da homologia (identidade) são aminoácidos 19-335 para SEQ ID No. 1 e 3 (A. hydrophila) e aminoácidos 19-336 para SEQ ID Nos. 4, 15 e 16 (A. salmonicida) . SEQ ID 34 e 35 são seqüências de proteínas maduras de um lipidio aciltransferase de A. hydrophila e A. salmonicida, respectivamente.

Uma seqüência de nucleotidios que codifica uma enzima aciltransferase para uso em qualquer uma das células hospedeiras, vetores, métodos e usos da presente invenção codifica um lipidio aciltransferase que pode ser também isolado de Thermobi fida, preferivelmente T. fusca, mais preferivelmente aquela codificada pela SEQ ID No. 28.

Uma seqüência de nucleotidios que codifica uma enzima lipidio aciltransferase para uso em qualquer uma das células hospedeiras, vetores, métodos e usos da presente invenção codifica um lipidio aciltransferase que pode ser também isolado de Streptomyces, preferivelmente S. avermitis, mais preferivelmente aquela codificada pela SEQ ID No. 32. Outras enzimas possíveis para uso na presente invenção de Streptomyces incluem aquelas codificadas pela SEQ ID Nos. 5, 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 31 e 33.

Uma enzima para uso na invenção pode ser também isolada da Corynebacterium, preferivelmente C. efficiens, mais preferivelmente aquela codificada pela SEQ ID No. 29.

Adequadamente, a seqüência de nucleotidios que codifica uma enzima lipidio aciltransferase para uso em qualquer uma das células hospedeiras, vetores, métodos e usos da presente invenção pode codificar um lipidio aciltransferase que compreende qualquer uma das seqüências de aminoácidos mostradas como SEQ ID Nos. 37, 38, 40, 41, 43, 45 ou 47 ou uma seqüência de aminoácidos que possui pelo menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 % ou 98 % de identidade com isto, ou codificada por qualquer uma das seqüências de nucleotidios mostradas como SEQ ID Nos. 36, 39, 42, 44, 46, ou 48 ou uma seqüência de nucleotidios que possui pelo menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 % ou 98 % de identidade com isto.

Em uma modalidade, a seqüência nucléica que codifica uma enzima lipidio aciltransferase para uso em qualquer uma das células hospedeiras, vetores, métodos e usos da presente invenção é selecionada a partir do grupo consistindo de:

a) um ácido nucléico compreendendo uma seqüência de nucleotidios mostrada na SEQ ID No. 36;

b) um ácido nucléico que é relacionado à seqüência de nucleotidios de SEQ ID No. 36 pela degeneração do código genético; e

c) um ácido nucléico compreendendo uma seqüência de nucleotidios que possui pelo menos 7 0 % de identidade com a seqüência de nucleotidios mostrada na SEQ ID No. 36.

Em uma modalidade, uma seqüência de nucleotidios que codifica uma enzima lipidio aciltransferase para uso em qualquer uma das células hospedeiras, vetores, métodos e usos da presente invenção codifica um lipidio aciltransferase que compreende uma seqüência de aminoácidos como mostrada na SEQ ID No. 37 ou seqüência de aminoácidos que possui pelo menos 60 % de identidade com este. Em uma modalidade adicional, a seqüência de nucleotidios que codifica uma enzima lipidio aciltransferase para uso em qualquer uma das células hospedeiras, vetores, métodos e usos da presente invenção codifica um lipidio aciltransferase que compreende qualquer uma das seqüências de aminoácidos apresentadas como SEQ ID No. 37, 38, 40, 41, 43, 45 ou 47 ou uma seqüência de aminoácidos que possui pelos menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 % ou 98 % de identidade com este, ou codificada por qualquer uma das seqüências de nucleotidios apresentadas como SEQ OD No. 39, 42, 44, 46 ou 48 ou uma seqüência de nucleotidios que possui pelo menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 % ou 98 % de identidade com este.

Em uma modalidade adicional, a seqüência de nucleotidios que codifica uma enzima lipidio aciltransferase para uso em qualquer um das células hospedeiras, vetores, métodos e usos da presente invenção pode codificar um lipidio aciltransferase compreendendo qualquer uma das seqüências de aminoácidos apresentadas como SEQ ID No. 38, 40, 41, 45 ou 47 ou uma seqüência de nucleotidios que possui pelo menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 % ou 98 % de identidade com este para os usos aqui descritos.

Em uma modalidade adicional, a seqüência de nucleotidios que codifica uma enzima lipidio aciltransferase para uso em qualquer um das células hospedeiras, vetores, métodos e usos da presente invenção pode codificar um lipidio aciltransferase compreende qualquer uma das seqüências de aminoácidos apresentadas como SEQ ID No. 38, 40 ou 47 ou uma seqüência de aminoácidos que possui pelo menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 % ou 98 % de identidade com este para os usos aqui descritos.

Mais preferivelmente, em uma modalidade a seqüência de nucleotidios que codifica uma enzima lipidio aciltransferase para uso em qualquer um das células hospedeiras, vetores, métodos e usos da presente invenção pode codificar um lipidio aciltransferase compreendendo a seqüência de aminoácidos apresentada como SEQ ID No. 47 ou uma seqüência de aminoácidos que possui pelo menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 % ou 98 % de identidade com este.

Em outra modalidade, a seqüência de nucleotidios que codifica uma enzima lipidio aciltransferase para uso em qualquer um das células hospedeiras, vetores, métodos e usos da presente invenção pode codificar um lipidio aciltransferase compreendendo a seqüência de aminoácidos apresentada como SEQ ID No. 43 ou 44 ou uma seqüência de aminoácidos que possui pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %,

96 %, 97 % ou 98 % de identidade com este. Em outra modalidade, a seqüência de nucleotidios que codifica uma enzima lipidio aciltransferase para uso em qualquer um das células hospedeiras, vetores, métodos e usos da presente invenção pode codificar um lipidio aciltransferase compreendendo a seqüência de aminoácidos apresentada como SEQ ID No. 41 ou uma seqüência de aminoácidos que possui pelo menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 % ou 98 % de identidade com este.

Em uma modalidade, a seqüência de nucleotidios que codifica uma enzima lipidio aciltransferase para uso em qualquer um das células hospedeiras, vetores, métodos e usos da presente invenção é selecionada a partir do grupo consistindo de:

a) um ácido nucléico compreendendo uma seqüência de nucleotidios mostrada na SEQ ID No. 36;

b) um ácido nucléico que é relacionado à seqüência de nucleotidios de SEQ ID No. 36 pela degeneração do código genético; e

c) um ácido nucléico compreendendo uma seqüência de nucleotidios que possui pelo menos 70 % de identidade com a seqüência de nucleotidios mostrada na SEQ ID No. 36.

Em uma modalidade, o lipidio aciltransferase de acordo com a presente invenção pode ser um lipidio aciltransferase obtenível, preferivelmente obtido, de linhagens de Streptomyces L130 ou L131 depositadas pela Danisco A/S de Langebrogade I, DK-1001 Copenhagen K, Dinamarca sob ο Tratado de Budapeste sobre o reconhecimento Internacional do Deposito de Microorganismos para as finalidades de Procedimento de Patente na National Colletion of 5 Industrial, Marine and Food Bactéria (NCIMB) 23 St. Machar Street, Aberdeen, Escócia, GB em 25 de junho de 2004 sob os números de acesso NCIMB 41226 e NCIMB 41227, respectivamente.

As seqüências de nucleotidios adequadas que codificam 10 um lipidio aciltransferase para uso em qualquer um das células hospedeiras, vetores, métodos e usos da presente invenção pode codificar uma seqüência de aminoácidos que pode ser identificada pelo alinhamento à seqüência L131 (SEQ ID No. 37) usando Align X, o algoritmo ClustalW de 15 alinhamento pareado do VectorNTI usando definições padrão.

Um alinhamento da L131 e homólogos da S. avermitilis e T. fusca ilustra que a conservação do Motif GDSx (GDSY em L131 e S. avermitilis e T. fusca), a caixa GANDY, que é também GGNDA ou GGNDL, e o bloco HPT (considerado para ser 20 a histidina catalítica conservada). Esses três blocos são destacados na Figura 42.

Quando alinhado à seqüência consenso pfam Pfam00657 (como descrito no documento W004/064987) e/ou a seqüência L131 aqui divulgada (SEQ ID No. 37) é possível identificar três regiões conservadas, o bloco GDSx, o bloco GANDY e o bloco HPT (veja WO04/064987 para mais detalhes). Quando alinhado à seqüência consenso pfam Pfam00657 (como descrito no documento W004/064987) e/ou à seqüência L131 aqui divulgada (SEQ ID No. 37)

i) a seqüência de nucleotidios que codifica um lipidio aciltransferase para uso em qualquer

uma das células hospedeiras, vetores, métodos ou usos da presente invenção pode codificar um lipidio aciltransferase que, possui um motif GDSx, mais preferivelmente um motif GDSx selecionado a partir de um motif GDSL ou

GDSY.

e/ou

ii) a seqüência de nucleotidios que codifica um lipidio aciltransferase para uso em qualquer

uma das células hospedeiras, vetores, métodos

ou usos da presente invenção pode codificar um lipidio aciltransferase que, possui um bloco GANDY, mais preferivelmente um bloco GANDY compreendendo amino GGNDx, mais

preferivelmente GGNDA ou GGNDL.

e/ou

iii) a seqüência de nucleotidios que codifica um lipidio aciltransferase para uso em qualquer uma das células hospedeiras, vetores, métodos

ou usos da presente invenção codifica um lipidio aciltransferase

que

possui

preferivelmente o bloco HPT.

e preferivelmente,

iv) a seqüência de nucleotidios que codifica um

5

lipidio aciltransferase para uso em qualquer

uma das células hospedeiras, vetores, métodos

ou usos da presente invenção pode codificar um

lipidio

aciltransferase

que

possui

preferivelmente um motif GDSx ou GDSY, e um

10

bloco GANDY compreendendo amino GGNDx,

preferivelmente GGNDA ou GGNDL, e um bloco HPT

(histidina conservada).

Lipidio aciltransferase variante

Em uma modalidade preferida, a seqüência de 15 nucleotidios que codifica um lipidio aciltransferase para uso em qualquer uma das células hospedeiras, vetores, métodos ou usos da presente invenção pode codificar um lipidio aciltransferase que é um lipidio aciltransferase variante.

Variantes que apresentam uma atividade aumentada em

fosfolipídios, tais como atividade hidrolítica aumentada e/ou atividade transferase aumentada, preferivelmente atividade transferase aumentada em fosfolipídios podem ser usadas. Preferivelmente, o lipidio aciltransferase variante é preparado por uma ou mais modificações de aminoácidos dos lipidio aciltransferases conforme previamente definidos.

Adequadamente, quando a seqüência de nucleotidios que codifica um lipidio aciltransferase para uso em qualquer uma das células hospedeiras, vetores, métodos ou usos da presente invenção pode codificar um lipidio aciltransferase que pode ser um lipidio aciltransferase variante, no qual caso a enzima possa ser caracterizada em que a enzima compreende uma seqüência de aminoácidos motif GDSx, onde X é um ou mais dos seguintes resíduos de aminoácidos L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M ou S, e onde a enzima variante compreende uma ou mais modificações de aminoácidos comparada com a seqüência mãe em qualquer um ou mais dos resíduos de aminoácidos definidos no grupo 2 ou grupo 4 ou grupo 6 ou grupo 7 (conforme definido em W02005/066347 e a seguir).

Por exemplo, o lipidio aciltransferase variante pode ser caracterizado em que a enzima compreende a seqüência de aminoácidos motif GDSX, em que X é um ou mais dos seguintes resíduos de aminoácidos L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M ou S, e em que a enzima variante compreende uma ou mais modificações de aminoácidos comparada com seqüência mãe em que um ou mais dos resíduos de aminoácidos detalhados no grupo 2 ou grupo 4 ou grupo 6 ou grupo 7 (conforme definido em W02005/066347 e a seguir) identificados pela dita seqüência mãe sendo alinhados estruturalmente com o modelo estrutural do P10480 definido aqui, que é preferivelmente obtido pelo alinhamento estrutural das coordenadas estruturais do cristal de P10480 com 1IVN.PDB e/ou 1DE0.PDB conforme definido em W02005/066347 e a seguir.

Em uma modalidade adicional, uma seqüência de nucleotidios que codifica um lipidio aciltransferase para uso em qualquer uma das células hospedeiras, vetores, métodos ou usos da presente invenção pode codificar um lipidio aciltransferase variante que pode ser caracterizado pelo fato de que a enzima compreende a seqüência de aminoácidos L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M ou S, e onde a enzima variante compreende uma ou mais modificações de aminoácidos comparada com seqüência mãe em que um ou mais dos resíduos de aminoácidos ensinados no grupo 2 identificado quando a dita seqüência mãe é alinhada a seqüência consenso pfam (SEQ ID No. 2 - Figura 3) e modificada de acordo com um modelo estrutural de P10480 para garantir o melhor ajuste de sobreposição como definido em W02005/066347 e a seguir.

Adequadamente, a seqüência de nucleotidios que codifica um lipidio aciltransferase para uso em qualquer uma das células hospedeiras, vetores, métodos ou usos da presente invenção pode codificar uma enzima lipidio aciltransferase variante que pode compreender uma seqüência de aminoácidos, cuja seqüência de aminoácidos é mostrada como SEQ ID No. 34, SEQ ID No.3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 14, SEQ ID No. I, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 25, 5 SEQ ID No. 26, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 28, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 30, SEQ ID No. 32, ou SEQ ID No. 33 exceto para uma ou mais modificações de aminoácidos em qualquer um ou mais dos resíduos de aminoácidos definidos no grupo 2 ou grupo 4 ou grupo 6 ou grupo 7 (conforme definido em 10 W02005/066347 e a seguir) identificados pelo alinhamento da seqüência com SEQ ID No. 34.

Alternativamente, a seqüência de nucleotidios que codifica um lipidio aciltransferase pode codificar uma enzima lipidio aciltransferase variante compreendendo uma seqüência de aminoácidos, cuja seqüência de aminoácidos é mostrada como SEQ ID No. 34, SEQ ID No.3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 14, SEQ ID No. I, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 26, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 28, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 30, SEQ ID No. 32, ou SEQ ID No. 33 exceto para uma ou mais modificações de aminoácidos em qualquer um ou mais dos resíduos de aminoácidos definidos no grupo 2 ou grupo 4 ou grupo 6 ou grupo 7 conforme definido em W02005/066347 e a seguir, identificada pela dita seqüência mãe sendo alinhada estruturalmente com o modelo estrutural de P10480 aqui definido, que é preferivelmente obtido pelo alinhamento estrutural das coordenadas do cristal de P10480 com 1IVN.PDB e/ou 1DE0.PDB conforme ensinado em W02005/066347 e a seguir.

Alternativamente, a seqüência de nucleotidios que

codifica um lipidio aciltransferase pode codificar uma enzima lipidio aciltransferase variante compreendendo uma seqüência de aminoácidos, cuja seqüência de aminoácidos é mostrada como SEQ ID No. 34, SEQ ID No.3, SEQ ID No. 4, SEQ 10 ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 14, SEQ ID No. I, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 26, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 28, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 30, SEQ ID No. 32, ou SEQ ID No. 33 15 exceto para uma ou mais modificações de aminoácidos em qualquer um ou mais dos resíduos de aminoácidos ensinados no grupo 2 quando a dita seqüência mãe é alinhada à seqüência consenso pfma (SEQ ID No. 2) e modificada de acordo com um modelo estrutura de P10480 para garantir o 20 melhor ajuste de sobreposição como ensinado em W02005/066347 e a seguir.

Preferivelmente, a enzima mãe é uma enzima que compreende, ou é homologa à seqüência de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 34 e/ou SEQ ID No. 15 e/ou SEQ ID No. 35. Preferivelmente, a seqüência de nucleotidios que codifica um lipidio aciltransferase pode codificar uma enzima variante que compreende uma seqüência de aminoácidos, cuja seqüência de aminoácidos é mostrada como 5 SEQ ID No. 34 ou SEQ ID No. 35 exceto para uma ou mais modificações de aminoácidos em qualquer um ou mais dos resíduos de aminoácidos definidos no grupo 2 ou grupo 4 ou grupo 6 ou grupo 7 conforme definidos em W02005/066347 e a seguir.

DEFINIÇÕES DOS GRUPOS

Grupo de aminoácidos 1:

Grupo de aminoácidos 1 (observe que esses são aminoácidos em IIVN - Figura 53 e Figura 54) Gly8, Asp9, SerlO, Leull, Serl2, Tyrl5, Gly44, Asp45, Thr46, Glu69, 15 Leu70, Gly71, Gly72, Asn73, Asp74, Gly75, Leu76, Glnl06, Ilel07, Argl08, Leul09, ProllO, Tyrll3, Phel21, Phel39, Phel40, Metl41, Tyrl45, Metl51, Aspl54, Hisl57, Glyl55, Ilel56, Prol58

Os motifs altamente conservados, tais como GDSx e 20 resíduos catalíticos, foram desmarcados do grupo 1 (resíduos sublinhados). Para evitar duvida, o grupo 1 define os resíduos de aminoácidos em 10 Á do átomo de carbono central de um glicerol no sítio ativo do modelo IIVN.

Grupo de aminoácidos 2: Grupo de aminoácidos 2 (observe que a numeração dos aminoácidos se refere aos aminoácidos na seqüência madura de PlO480) .

Leul7, Lys22, Met23, Gly40, Asn80, Pro81, Lys82, 5 Asn87, Asn88, Trplll, Valll2, Alall4, Tyrll7, Leull8, Prol5 6, Glyl59, Glnl60, Asnl61, Prol62, Serl63, Alal64, Argl65, Serl66, Glnl67, Lysl68, Vall69, Vall70, Glul71, Alal72, Tyrl79, Hisl80, Asnl81, Met209, Leu210, Arg211, Asn215, Lys284, Met285, Gln289 e Val290.

Tabela de resíduos selecionados no Grupo 1 comparados

com o Grupo 2:

Modelo IVN P10480 IVN A.hyd homólogo Número de resíduo de seqüência madura PFAM Estrutura Gly8 Gly32 Asp9 Asp33 SerlO Ser3 4 Leul 1 Leu35 Leul7 Serl2 Ser3 6 Serl8 Lys22 Met23 Tyrl5 Gly5 8 Gly4 0 Gly4 4 Asn98 Asn8 0 Asp4 5 Pro9 9 Pro81 Thr4 6 Glu69 Leu7 O Gly71 Gly72 Asn7 3 Asp7 4 Gly7 5 Leu7 6 Glnl06 Ilel07 Argl08 Leul09 ProllO Tyrll3

LyslOO

Trpl29 Val130 Glyl31 Alal32 Asnl33 Aspl34 Tyr135 Leul3 6

Prol7 4 Glyl77 Glnl7 8 Asnl7 9 180 a 190

57/124

Lys82 Asn8 7 Asn8 8 Trplll Valll2

Alal14

Tyrl17 Leull8 Prol56 Glyl59 Glnl60 Asnl61 Prol 62 Serl63 Alal64 Argl65 Serl66 Glnl67 Lysl68 Vall69 Vall7 0 Glul71 Alal7 2 Phel21 Hisl98 Tyrl97 Tyrl7 9 Hisl98 Hisl80 Asnl99 Asnl81 Phel39 Met227 Met2 0 9 Phel4 0 Leu228 Leu210 Met141 Arg22 9 Arg211 Tyrl45 Asn233 Asn215 Lys2 8 4 Metl51 Met303 Met2 8 5 Aspl54 Asp30 6 Glyl55 Gln307 Gln2 8 9 Ilel56 Val308 Val2 90 Hisl57 His309 Prol58 Pro310 Grupo de aminoácidos 3:

Grupo de aminoácidos 3 é idêntico ao grupo 2, mas se refere à seqüência de codificação de Aeromonas salmonicida (SEQ ID No. 4), ou seja, números de resíduos de aminoácidos 5 são superiores em 18 no grupo 3 na medida em que isto reflete a diferença entre a contagem de aminoácidos na proteína madura (SEQ ID No. 34) comparada com a proteína que inclui uma seqüência sinal (SEQ ID No. 25).

As proteínas maduras de Aeromonas salmonicida GDSX (SEQ ID No. 4) e Aeromonas hydrophila GDSX (SEQ ID No. 34) diferem em cinco aminoácidos. Esses são Thr3ser, Glnl82Lys, Glu309Ala, Ser310Asn, e Gly318-, onde o resíduo de salmonicida é listado primeiro e o resíduo de hydrophila é listado no final. A proteína de hydrophila possui tamanho de apenas 317 aminoácidos e falta um resíduo na posição 5 318. As Aeromonas salmonicida GDSX possuem atividade consideravelmente alta sobre os lipídios polares tais como substratos de galactolipídio do que a proteína de Aeromonas hydrophila. Foi realizado um mapeamento do sítio em todas as cinco posições do aminoácido.

Grupo de aminoácidos 4:

Grupo de aminoácidos 4 é S3, Q182, E309, S310, e -318. Grupo de aminoácidos 5:

F13S, D15N, S18G, S18V, Y30F, D116N, D116E, D157N, Y226F, D228N, Y230F.

Grupo de aminoácidos 6:

Grupo de aminoácidos 6 é Ser3, Leul7, Lys22, Met23, Gly40, Asn80, Pro81, Lys82, Asn87, Asn88, Trplll, Valll2, Alall4, Tyrll7, Leull8, Prol56, Glyl59, Glnl60, Asnl61, Prol62, Serl63, Alal64, Argl65, Serl66, Glnl67, Lysl68, 20 Vall69, Vall70, Glul71, Alal72, Tyrl79, Hisl80, Asnl81, Glnl82, Met209, Leu210, Arg211, Asn215, Lys284, Met2 8 5,Gln2 8 9, Val290, Glu309, Ser310, -318.

A numeração de aminoácidos no grupo 6 se refere aos resíduos de aminoácidos no P10480 (SEQ ID No. 25) - aminoácidos correspondentes em outras seqüências principais podem ser determinados pelo alinhamento da homologia e/ou alinhamento estrutural ao P10480 e/ou 1IVN.

Grupo de aminoácidos 7:

Grupo de aminoácidos 7 é Ser3, Leul7, Lys22, Met23, 5 Gly40, Asn80, Pro81, Lys82, Asn87, Asn88, Trplll, Valll2, Alall4, Tyrll7, Leull8, Prol56, Glyl59, Glnl60, Asnl61, Prol62, Serl63, Alal64, Argl65, Serl66, Glnl67, Lysl68, Vall69, Vall70, Glul71, Alal72, Tyrl79, Hisl80, Asnl81, Glnl82, Met209, Leu210, Arg211, Asn215, Lys284, Met285, 10 Gln2 8 9, Val290, Glu309, Ser310, -318, Y30X (onde X é selecionado a partir de A, C, D, E, G, Η, I, K, L, Μ, N, P, Q, R, S, T, V, ou W) , Y226X (onde X é selecionado a partir de A, C, D, E, G, Η, I, K, L, Μ, N, P, Q, R, S, T, V, ou W) , Y230X (onde X é selecionado a partir de A, C, D, E, G, 15 Η, I, K, L, Μ, N, P, Q, R, S, T, V, ou W) , S18X (onde X é selecionado a partir de A, C, D, E, F, Η, I, K, L, Μ, N, P, Q, R, T, W, ou Y) , D157X (onde X é selecionado a partir de A, C, D, E, F, G, Η, I, K, L, Μ, P, Q, R, S, T, V, W, ou Y) -

A numeração de aminoácidos no grupo 7 se refere aos

resíduos de aminoácidos no P10480 (SEQ ID No. 25) -os aminoácidos correspondentes em outras seqüências principais podem ser determinados pelo alinhamento da homologia e/ou alinhamento estrutural ao P10480 e/ou 1IVN. Adequadamente, a enzima variante compreende uma ou mais das seguintes modificações de aminoácidos com a enzima mâe:

S3E, A, G, K, Μ, Y, R, P, N, T ou G E309Q, R ou A, preferivelmente Q ou R

-318Y, H, S ou Y, preferivelmente Y.

Preferivelmente, X do motif GDSx é L. Assim, preferivelmente, a enzima mãe compreende o aminoácido de motif GDSL.

Adequadamente, o dito primeiro lipidio aciltransferase

mãe pode compreender qualquer uma das seguintes seqüências de aminoácidos: SEQ ID No. 34, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 12, SEQ 15 ID No. 13, SEQ ID No. 14, SEQ ID No. I, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 26, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 28, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 30, SEQ ID No. 32 ou SEQ ID No. 33.

Adequadamente, o dito segundo lipidio aciltransferase relacionado pode compreender qualquer uma das seguintes 20 seqüências de aminoácidos: SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 34, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 14, SEQ ID No. I, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 26, SEQ ID No. 27, SEQ ID 25 No. 28, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 30, SEQ ID No. 32 ou SEQ ID No. 33. A enzima variante deve compreender pelo menos uma modificação de aminoácidos comparada com a enzima mãe. Em algumas modalidades, a enzima variante pode compreende pelo menos 2, preferivelmente pelo menos 3, preferivelmente pelo 5 menos 4, preferivelmente pelo menos 5, preferivelmente pelo menos 6, preferivelmente pelo menos 7, preferivelmente pelo menos 8, preferivelmente pelo menos 9, preferivelmente pelo menos 10 modificações de aminoácidos comparada com a enzima mãe.

Quando se referir aos resíduos específicos de

aminoácidos deste, a numeração é aquela obtida do alinhamento da seqüência variante com a seqüência de referência mostrada como SEQ ID No. 34 ou SEQ ID No. 35.

Em um aspecto a enzima variante preferivelmente compreende uma ou mais das seguintes substituições de aminoácidos:

S3A, C, D, E, F, G, Η, I, K, L, Μ, N, P, Q, R, T, V, W, ou Y; e/ou

L17A, C, D, E, F, G, Η, I, K, Μ, N, P, Q, R, S, T, V, W, ou Y; e/ou

S18A, C, D, E, F, Η, I, K, L, Μ, N, P, Q, R, T, W, ou Y; e/ou

K22A, C, D, E, F, G, Η, I, L, Μ, N, P, Q, R, S, T, V, W, ou Y; e/ou

M23A, C, D, E, F, G, Η, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W, ou Y; e/ou Υ30Ά, Cf D, E, e/ou

G40A, Cf D, E,

Y; e/ou N8 0A, Cf D, Ef Y; e/ou P81A, Cf Df E,

Y; e/ou K82A, Cf D, Ef Y; e/ou

N87A, C, D, Ef Y; e/ou N88A, C, D, E,

Y; e/ou 15 Wll IA, Cf D, E, F, W, ou Y; e/ou Vl 12A, Cf Df Ef Ff ou Y; e/ou A114C, D, E, F, Gf 20 ou Y; e/ou

Y117A, C, D, Ef Ff W; e/ou

L118A, C, D, E, F, ou Y; e/ou P156A, Cf D, Ef Ff ou Y; e/ou

63/124

G, Η, I, K, L, Μ, Nf F, Η, I, K, L, Mf N,

Ff Gf Hf I, K, L, Mr Ff G1 Η, I, K, Lf Mf Ff G, Η, I, L, Μ, Nf Ff Gf Hf I, Kf Lf Mf Ff Gf Hf If Kf Lf Mf

Gf Hf If Kf Lf Mf Gf Hf If Kf Lf Mf Hf I, Kf Lf Mf Nf Gf Hf I, Kf Lf Mf Gf Hf I, Kf Mf Nf Gf Hf I, Kf Lf Mf

Pf Qf R, Sf Tf Vf ou W;

Pf Qf Rf Sf Tf Vf Wf ou

Pf Qf Rf Sf Tf Vf Wf ou

Nf Qf Rf Sf T, Vf Wf ou

Pf Qf Rf Sf Tf Vf Wf ou

Pf Qf Rf Sf Tf Vf Wf ou

Pf Qf Rf Sf Tf Vf Wf ou

Nf Pf Qf Rf Sf Tf Vf

Nf Pf Qf Rf Sf Tf Wf

Pf Qf Rf Sf Tf Vf Wf

Nf Pf Q, R, Sf Tf V ou

Pf Qf Rf Sf Tf Vf Wf

Nf Qf Rf Sf Tf Vf Wf D157A, C, Y; e/ou G159A, C, ou Y; e/ou 5 Q160A, C, D, ou Y; e/ou Nl 6 IA, C, Dr ou Y; e/ou P162A, C, D, 10 ou Y; e/ou S163A, C, D, ou Y; e/ou A164C, D, E, ou Y; e/ou 15 R165A, C, D, ou Y; e/ou S166A, C, D, ou Y; e/ou Q167A, C, D, 20 ou Y; e/ou K168A, C, ou Y; e/ou V169A, C, D, ou Y/ e/ou 25 Vl 7 OA, C, ou Y; e/ou

E, F, G, Η, I, K,

D, E, F, Η, I, K,

E, F, G, Η, I,

E, F, G, H1 I,

E, F, G, Η, I,

E, F, G, Η, I,

F, G, Η, I, K,

E, F, G, Η, I,

E, F, G, Η, I,

E, F, G, H,

D, E, F, G, H,

E, F, G, H,

D, E, F, G, H,

64/124

L, Μ, P, Q, R,

L, Μ, N, P, Q,

K, L, Μ, N, P,

K, L, Μ, P, Q,

K, L, Μ, N, Q,

K, L, Μ, N, P

L, Μ, N, P, Q,

K, L, Μ, N, P

K, L, Μ, N,

I, K, L, Μ, N,

I, L, Μ, N, P, Q,

I, K, L, Μ, N, P

I, K, L, Μ, N,

S, T, V, W, OU

R, S, T, V, W,

R, S, T, V, W,

R, S, T, V, W,

R, S, T, V, W,

, Q, R, T, V, W,

R, S, T, V, W,

, Q, S, T, V, W,

P, Q, R/ T, V, W,

P, R, S, T, V, W,

R, S, T, V, W,

, Q, R, S, T, W,

P, Q, R, S, T, W, Ε171Α, C, D, F, G, Η, I, K, L, Μ, N, Pf Qf Rf S, T, V, Wf ou Y; e/ou

A172C, D, E, F, G, Η, I, K, L, Μ, N, Pf Qf R, Sf Tf V, W, ou Y; e/ou

Y179A, C, D, E, Ff G, Hf I, Kf Lf M, Nf Pf Qf Rf Sf T, Vf ou W; e/ou

Hl 8 OAf Cf Df Ef Ff Gf I, Kf Lf Mf Pf Qf Rf Sf Tf Vf Wf ou Y; e/ou

N181A, Cf Df Ef Ff Gf Hf I, Kf Lf Mf Pf Qf Rf Sf Tf Vf Wf ou Y; e/ou

Q182A, Cf D, Ef Ff G, Hf If Kf Lf Mf Nf Pf Rf Sf Tf Vf Wf ou Yf preferivelmente K; e/ou

M209A, Cf Df Ef Ff Gf Hf I, Kf Lf Nf Pf Qf Rf Sf Tf Vf Wf ou Y; e/ou

L210A, Cf Df Ef Ff Gf Hf If Kf Mf Nf Pf Qf Rf Sf Tf Vf Wf ou Y; e/ou

R211A, Cf Df Ef Ff Gf Hf I, Kf Lf Mf Nf Pf Qf Rf Sf Tf Vf Wf ou Y; e/ou

N215Af Cf Df Ef Ff Gf Hf I, Kf Lf Mf Nf Pf Qf Rf Sf Tf Vf Wf ou Y; e/ou

Y226A, Cf Df Ef Gf Hf I, Kf Lf Mf Nf Pf Qf Rf Sf Tf Vf ou W; e/ou

Y230A, Cf Df Ef Gf Hf If Kf Lf Mf Nf Pf Qf Rf Sf Tf Vf ou W; e/ou

K2 8 4 Af Cf Df Ef Ff Gf Hf I, Lf Mf Nf Pf Qf Rf Sf Tf Vf Wf ou Y; e/ou Μ285Α, C, D, E, F, G, Η, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W, ou Y; e/ou

Q289A, C, D, E, F, G, Η, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W, ou Y; e/ou

V290A, C, D, E, F, G, Hf If Kf Lf Mf Nf Pf Qf Rf Sf Tf Wf ou Y; e/ou

E309A, C, D, Ff G, Η, If K, L, Μ, N, P, Q, R, Sf T, V, W, ou Y; e/ou

S310A, C, Df Ef F, G, Hf I, Kf Lf Mf Nf Pf Qf Rf Tf Vf Wf ou Y.

Adicionalmente ou alternativamente a isso, pode haver uma ou mais extensões C-terminal. Preferivelmente, a extensão C-terminal adicional é compreendida por um ou mais aminoácidos alifáticos, preferivelmente um aminoácido 15 apoiar, mais preferivelmente de I, Lf V ou G. Assim, a presente invenção provê ainda para uma enzima variante compreendendo uma ou mais das seguintes extensões C- terminal: 3181, 318L, 318V, 318G.

As enzimas variantes preferidas podem ter uma atividade hidrolitica reduzida contra um fosfolipidio, tal como fosfatidilcolina (PC), pode ter também uma atividade de transferase aumentada a partir de um fosfolipidio.

As enzimas variantes preferidas podem ter uma atividade de transferase aumentada a partir de um fosfolipidio tal como f osfatidilcolina (PC), esses podem também ter um uma atividade hidroiitica aumentada contra um fosfolipidio.

A modificação de um ou mais dos seguintes resíduos pode resultar em uma enzima variante que possui uma atividade absoluta de transferase aumentada contra o fosfolipidio:

S3, Dl57, S310, E309, Y179, N215, K22, Q289, M23, H180, M209, L210, R211, P81, V112, N80, L82, N88, N87

Modificações específicas preferidas que podem prover uma enzima variante possuindo uma atividade de transferase melhorada a partir de um fosfolipídio podem ser selecionadas a partir de um ou mais dos seguintes:

S3A, C, D, E, F, G, Η, I, K, L, Μ, N, P, Q, R, Τ, V, W ou Y; preferivelmente, N, E, K, R, A, P ou M, mais preferivelmente S3A

D157A, C, E, F, G, Η, I, K, L, Μ, N, P, Q, R, S, Τ, V, W ou Y; preferivelmente D157S, R, E, N, G, Τ, V, Q, K ou C S310A, C, D, E, F, G, Η, I, K, L, Μ, N, P, Q, R, Τ, V, W ou Y; preferivelmente S310T -318E

E309A, C, D, E, F, G, Η, I, K, L, Μ, N, P, Q, R, Τ, V, W ou Y; preferivelmente E309 R, E, L, R ou A

Y179A, C, D, E, Ff G, Η, I, K, L, Μ, N, P, Q, R, S, Τ, V ou W; preferivelmente Y179 D, Τ, E, R, Ν, V, K, Q OU S, mais preferivelmente E, R, Ν, V, K ou Q Ν215Α, C, D, E, F, G, Η, I, K, L, Μ, P, Q, R, S, Τ, V, W ou Y; preferivelmente N215 S, L, R ou Y

K22A, C, D, E, F, G, Η, I, L, Μ, Ν, P, Q, R, S, Τ, V, W ou Y; preferivelmente K22 E, R, C ou A Q289A, C, D, E, F, Gf Hf If Kf Lf Mf Nf Pf Rf Sf Tf Vf W ou Y; preferivelmente Q289 R, E, G, P ou N

M23A, C, D, E, F, G, Η, I, K, L, Ν, P, Q, R, S, T, Vf W ou Y; preferivelmente M23 K, Q, L, Gf T ou S

Hl8OA, C, D, E, F, G, I, K, L, Μ, P, Q, R, S, Τ, V, W ou Y; preferivelmente H180 Q, R ou K

M209A, C, D, E, F, G, Η, I, K, L, Ν, P, Q, R, S, Τ, V, W ou Y; preferivelmente M209 Q, S, R, A, Ν, Y, E, V ou L L210A, C, D, E, F, G, Η, I, K, Μ, Ν, P, Q, R, S, Τ, V, W ou Y; preferivelmente L210 R, A, V, S, T, I, W ou M 15 R211A, C, D, E, F, G, Η, I, K, L, Μ, Ν, P, Q, S, Τ, V, W ou Y; preferivelmente R211T

P81A, C, D, E, F, G, Η, I, K, L, Μ, N, Q, R, S, Τ, V, W ou Y; preferivelmente P81G

Vl 12 A, C, D, E, F, G, Η, I, K, L, Μ, Ν, P, Q, R, S, T, W ou Y; preferivelmente V112C

N80A, C, D, E, F, G, Η, I, K, L, Μ, P, Q, R, S, Τ, V, W ou Y; preferivelmente N80 R, G, N, D, P, Τ, E, Vf A ou G L82A, C, D, E, F, G, Η, I, Μ, Ν, P, Q, R, S, Τ, V, W ou Y; preferivelmente L82N, S ou E 25 N88A, C, D, E, F, G, Η, I, K, L, Μ, P, Q, R, S, Τ, V, W ou Y; preferivelmente N88C Ν87Α, C, D, E, F, G, Η, I, K, L, Μ, P, Q, R, S, Τ, V, W ou Y; preferivelmente N87M ou G

A modificação preferida de um ou mais dos seguintes resíduos resulta em uma enzima variante que possui uma atividade absoluta de transferase aumentada contra o fosfolipidio:

S3N, R, A, G

M23 K, Q, L, G, T, S

H180 R

L82 G

Y179 E, R, Ν, V, K ou Q E309 R, S, L ou A

Uma modificação preferida é N80D. Esse é particularmente o caso quando se usa a seqüência de referência SEQ ID No. 35 como estrutura. Assim, a seqüência de referência pode ser SEQ ID No. 16. Essa modificação pode ser em combinação com uma ou mais modificações adicionais. Dessa forma, em uma modalidade preferida da presente invenção, a seqüência de nucleotidios que codifica um lipidio aciltransferase para uso em qualquer uma das células hospedeiras, vetores, métodos e usos da presente invenção pode codificar um lipidio aciltransferase que compreende a SEQ ID No. 35 ou uma seqüência de aminoácidos que possui 75 % ou mais, preferivelmente 85 % ou mais, mais preferivelmente 90 % ou mais, ainda mais preferivelmente 95 % ou mais, ainda mais preferivelmente 98 % ou mais, ou ainda mais preferivelmente 99 % ou mais de identidade à SEQ ID No. 35.

Como observado acima, quando em referência aos resíduos específicos de aminoácidos daqui, a numeração é obtida a partir do alinhamento da seqüência variante com a seqüência de referência mostrada como SEQ ID No. 34 ou SEQ ID No. 35.

Mais preferivelmente, a seqüência de nucleotidios que 10 codifica um lipidio aciltransferase para uso em qualquer uma das células hospedeiras, vetores, métodos e usos da presente invenção pode codificar um lipidio compreendendo a seqüência de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 16, ou uma seqüência de aminoácidos que possui 75 % ou mais, 15 preferivelmente 85 % ou mais, mais preferivelmente 90 % ou mais, ainda mais preferivelmente 95 % ou mais, ainda mais preferivelmente 98 % ou mais, ou ainda mais preferivelmente 99 % ou mais de identidade à SEQ ID No. 16. Essa enzima pode ser considerada uma enzima variante.

Para os efeitos da presente invenção, o grau de

identidade é baseado no número de elementos de seqüência que são os mesmos. 0 grau de identidade de acordo com a presente invenção para as seqüências de aminoácidos, pode ser determinado de forma adequada por meio de programas de 25 computador conhecidos na arte, tal como Vector NTI 10 (Invitrogen Corp). Para o alinhamento pareado, a pontuação usada é preferivelmente BLOSUM62 com penalidade por abertura de GAP de 10,0 e penalidade por extensão de Gap de 0,1.

Adequadamente, o grau de identidade em relação a uma seqüência de aminoácidos é determinado acima de pelo menos aminoácidos contíguos, preferivelmente acima de pelo menos 30 aminoácidos contíguos, preferivelmente acima de pelo menos 40 aminoácidos contíguos, preferivelmente acima de pelo menos 50 aminoácidos contíguos, preferivelmente acima de pelo menos 60 aminoácidos contíguos.

Adequadamente, o grau de identidade em relação a uma seqüência de aminoácidos pode ser determinado em toda a seqüência.

Adequadamente, a seqüência de nucleotidios que codifica um lipidio aciltransferase/ enzima lipidio aciltransferase de acordo com a presente invenção pode ser obtenível, preferivelmente obtido, a partir dos organismos de um ou mais dos seguintes gêneros: Aeromonas, Streptomyces, Saccharomyces, Lactocoeeus, Myeobaeteriumr Streptoeoecus, Lactobacillus, Desulfitobaeterium, Baeillus, Campylobaeter, Vibrionaeeae, Xylella, Sulfolobus,

Aspergillus, Sehizosaecharomyces, Listeria, Neisseria, Mesorhizobium, Ralstonia, Xanthomonas, Candida,

Thermobifida e Corynebaeterium.

Adequadamente, a seqüência de nucleotidios que codifica um lipidio aciltransferase/ enzima lipidio aciltransferase de acordo com a presente invenção pode ser obtenível, preferivelmente obtido, a partir de um ou mais dos seguintes organismos: Aeromonas hydrophila, Aeromonas salmonicida, Streptomyces coelicolor, Streptomyces rimosus, Mycobacterium, Streptoeoeeus pyogenes, Laetocoecus lactis, Streptoeoecus pyogenes, Streptoeoeeus thermophilus, Streptomyees thermosaechari, Stretomyees avermitilis, Lactobacillus helvetieus, Desulfitobacterium dehalogenans, Baeillus sp, Campylobaeter jejuni, Vibrionaeeae, Xylella fastidiosa, Sulfolobus solfataricus, Saccharomyees cerevisiae, Aspergillus terreus, Schizosaccharomyces pombe, Listeria innoeua, Listeria monoeytogenes, Neisseria meningitidis, Mesorhizobium loti, Ralstonia solanaeearum, Xanthomonas eampestris, Xanthomonas axonopodis, Candida parapsilosis, Thermobifida fusca e Corynebacterium efficiens.

Em um aspecto, preferivelmente a seqüência de nucleotidios que codifica uma seqüência de nucleotidios que codifica um lipidio aciltransferase para uso em uma das células hospedeiras, vetores, métodos e usos da presente invenção que codifica uma enzima lipidio aciltransferase de acordo com a presente invenção é obtenível, preferivelmente obtida ou derivada, de um ou mais de Aeromonas spp. , Aeromonas hydrophila ou Aeromonas salmonicida.

As enzimas que funcionam como lipidio aciltransferases de acordo com a presente invenção podem ser identificadas rotineiramente usando o ensaio ensinado no Exemplo 12 do documento ¥102004/064537. Usando esse ensaio, no qual há um teor muito alto de água - aproximadamente 95 %, os lipidio aciltransferases/lipidio acil transferase de acordo com a 5 presente invenção são aqueles que possuem pelo menos 2 % de atividade aciltransferase (atividade transferase relativa), preferivelmente pelo menos 5 % de atividade transferase relativa, preferivelmente pelo menos 10 % de atividade transferase relativa, preferivelmente pelo menos 15 %, 20 10 %, 25 %, 26 %, 28 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 % ou 75% de atividade transferase relativa.

Fosfolipases podem atuar como enzimas aciltransferase em meios de pouca água. Assim, é considerado que no lugar de ou em adição à enzima fosfolipídio aciltransferase, uma 15 enzima fosfolipase pode ser usada quando o processo para a modificação de óleo comestível de gordura ocorre em um meio de pouca água.

0 termo "elevada água" como usado aqui significa qualquer substrato ou gênero alimentício com mais do que 3 20 % de teor de água, preferivelmente mais do que 4 %, mais do que 5 %, mais do que 6 %, mais do que 7 %, mais do que 8 %, mais do que 9 %, mais do que 10 %, mais do que 20 %, mais do que 30 %, mais do que 40 %, mais do que 50 %, mais do que 60 %, mais do que 70 %, mais do que 80 % ou mais do que 25 90 %. O termo "pouca água" como usado aqui siqnifica qualquer substrato ou qênero alimentício com menos do que 3 % de teor de água, preferivelmente menos do que 2 %, menos do que 1 % ou menos do que 0,5 %, menos do que 0,3 %, menos do que 0,2 %, menos do que 0,1 %, menos do que 0,05, ou menos do que 0,01 %.

Para evitar qualquer dúvida, o leite é um meio de elevada água, enquanto a nata é um meio de pouca água.

Fosfolipases adequadas para uso na invenção podem incluir fosfolipase Al, fosfolipase Δ2, ou fosfolipase B. Fosfolipase Al, fosfolipase A2, ou fosfolipase B podem ser também usadas em coordenação com a atividade lipidio aciltransferase. Fosfolipase C e/ou D podem ser também usadas em coordenação com a atividade lipidio aciltransferase/ atividade fosfolipase Al, A2 e/ou B em analogia com o documento W02005/089562. Fosfolipases preferidas podem incluir fosfolipase A2, tais como Lecitase TM ou a Fusarium venenatum e Tuber albidum fosfolipase divulgadas no documento W02004/97012 (Novozymes/CHr. Hansen). Uma fosfolipase Fusarium venenatum é vendida pela Novozymes como MAX YIELD™.

ISOLADO

Em um aspecto, o método da presente invenção compreende a etapa adicional de recuperação / isolamento do lipidio aciltransferase. Assim, o lipidio aciltransferase produzido pode estar em uma forma isolada. Em outro aspecto, a seqüência de nucleotidios que codifica um lipidio aciltransferase para uso na presente invenção pode estar em uma forma isolada.

0 termo "isolado" significa que a seqüência ou proteína está pelo menos livre a partir de pelo menos um outro componente com o qual a seqüência ou a proteína está naturalmente associada e conforme encontrada na natureza. PURIFICADA

Em um aspecto, o método da presente invenção compreende a etapa adicional de purificação do lipidio aciltransferase.

Em outro aspecto, a seqüência de nucleotidios que codifica um lipidio aciltransferase para uso na presente invenção pode estar em uma forma purificada.

0 termo "purificada" significa que a seqüência está em um estado relativamente puro - por exemplo, pelo menos cerca de 51 % puro, ou pelo menos cerca de 75 %, ou pelo menos cerca de 80 %, ou pelo menos cerca de 90 % puro, ou pelo menos cerca de 95 % puro ou pelo menos cerca de 98 % puro.

CLONAGEM DE UMA SEQÜÊNCIA DE NUCLEOTIDIOS QUE CODIFICA UM POLIPEPTIDEO DE ACORDO COM A PRESENTE INVENÇÃO

Uma seqüência de nucleotidios que codifica um polipeptidio que possui propriedades especificas conforme aqui definidas ou um polipeptidio que é adequado para modificação pode ser isolada de qualquer célula ou organismo que produz o dito polipeptidio. Vários métodos são bem conhecidos na arte para o isolamento das seqüências de nucleotidios.

Por exemplo, uma biblioteca de DNA genômico e/ou cDNA pode ser construída usando DNA cromossomal ou RNA mensageiro a partir do organismo que produz o polipeptidio. Se a seqüência de aminoácidos de polipeptidio é conhecida, podem ser sintetizadas sondas de oligonucleotidios marcados e usadas para identificar os clones codificantes de polipeptidios a partir da biblioteca genômica preparada a partir dos organismos. Alternativamente, uma sonda de oligonucleotidio marcado contendo seqüências homólogas a outro gene de polipeptidio conhecido poderia ser usada para identificar clones codificantes de polipeptidios. No último caso, são usadas condições de hibridização e lavagem de menor estringência.

Alternativamente, clones codificantes de polipeptídios poderiam ser identificados pela inserção de fragmentos de DNA genômico em um vetor de expressão, tal como um plasmídeo, bactéria de enzima negativa transformada com a biblioteca de DNA genômico resultante, e então a colocação da bactéria transformada em ágar contendo uma enzima inibida pelo polipeptidio, permitindo através disso que sejam identificados os clones que expressam o polipeptidio.

Ainda em uma alternativa adicional, a seqüência de nucleotidios que codifica o polipeptidio pode ser preparada de forma sintética pelos métodos padrão estabelecidos, por exemplo, método de fosforamidita descrito por Beucage S.L., e colaboradores (1981) Tethraedron Letters 22, p. 1859- 1869, ou o método descrito por Matthes e colaboradores (1984) EMBO J. 3, p 801-805. No método de fosforamidita, os oligonucleotídios são sintetizados, por exemplo, em um sintetizador automático de DNA, purificado, hibridizado, ligado e clonado em vetores adequados.

A seqüência de nucleotidios pode ser de origem mista genômica e sintética, de origem mista sintética e cDNA, ou de origem mista genômica e cDNA, preparada pela ligação dos fragmentos de origem sintética, genômica ou cDNA (conforme adequado) de acordo com as técnicas padrão. A seqüência de DNA pode ser também preparada pela reação em cadeia de polimerase (PCR) usando iniciadores específicos, por exemplo, conforme descrito no documento US 4,683,202 ou em Saiki R. K. e colaboradores (Science (1988) 239, pp. 487- 491) .

SEQÜÊNCIAS DE NUCLEOTIDIOS

A presente invenção engloba também as seqüências de nucleotidios que codificam polipeptídios que possuem as propriedades específicas conforme definidas aqui. 0 termo "seqüência de nucleotidios" como aqui usado se refere a uma seqüência de oligonucleotídio ou seqüência de polinucleotídio, e variantes, homólogos, fragmentos e derivados desta (tais como suas porções). A seqüência de nucleotidios pode ser de origem genômica ou sintética ou recombinante, que pode ser de dupla fita ou fita simples se representar o filamento de senso ou anti-senso.

0 termo "seqüência de nucleotidios" em relação a presente invenção inclui DNA genômico, cDNA, DNA sintético, e RNA. Preferivelmente, significa DNA, mais preferivelmente cDNA para a seqüência codificante.

Em uma modalidade preferida, a seqüência de nucleotidios per se que codifica um polipeptidio possuindo as propriedades específicas conforme definidas aqui, não cobre a seqüência de nucleotidios nativa em seu ambiente natural quando é ligada à sua(s) seqüência(s) naturalmente associada(s) que está/estão também em seu meio natural. Para facilidade de referência, podemos chamar esta modalidade preferida de "seqüência de nucleotidios não nativa". A esse respeito, o termo "seqüência de nucleotidios nativa" significa uma seqüência de nucleotidios completa que está no seu meio nativo e quando ligada de forma operável a um promotor completo com o qual está naturalmente associada, cujo promotor está também no seu meio nativo. Assim, o polipeptidio da presente invenção pode ser expresso por uma seqüência de nucleotidios no seu organismo nativo, mas onde a seqüência de nucleotidios não está sob o controle do promotor com o qual está associada naturalmente dentro daquele organismo. Preferivelmente, o polipeptidio não é um polipeptidio nativo. A este respeito, o termo "polipeptidio nativo" significa um polipeptidio inteiro que está no seu meio nativo e quando tiver sido expresso por sua seqüência de nucleotidios nativa.

Tipicamente, a seqüência de nucleotidios que codifica polipeptídios possuindo as propriedades específicas conforme definidas aqui, é preparada usando técnicas de DNA recombinante (ou seja, DNA recombinante). Contudo, em uma modalidade alternativa da invenção, a seqüência de nucleotidios poderia ser sintetizada, por inteiro ou em parte, usando métodos químicos bem conhecidos na arte (veja Caruthers MH e colaboradores (1980) Nue Acids Res Symp Ser 215-23 e Horn T. e colaboradores (1980) Nue Aeids Res Symp Ser 225-232).

EVOLUÇÃO MOLECULAR

Uma vez que uma seqüência de nucleotidios codificante de enzima foi isolada, ou uma seqüência de nucleotidios codificante de enzima putativa foi identificada, pode ser desejável modificar a seqüência de nucleotidios selecionada, por exemplo, pode ser desejável causar uma mutação na seqüência para preparar uma enzima de acordo com a presente invenção.

Podem ser introduzidas mutações usando

oligonucleotídios sintéticos. Esses oligonucleotidios contêm seqüências de nucleotidios que flanqueiam os sítios de mutação desejados.

Um método adequado é divulgado em Morinaga e colaboradores (Biotecnology (1984) 2, p646-649). Outro método de introdução de mutações nas seqüências de nucleotidios codificantes de enzima é descrito em Nelson e Long (Analytícal Biochemistry (1989), 180, p. 147-151).

Ao invés de mutagênese sítio-direcionada, tal como descrito acima, podem ser introduzidas mutações de forma aleatória, por exemplo, usando um kit comercial tal como o kit de mutagênese GeneMorph PCR da Stratagene, ou o kit de mutagênese aleatória Diversify PCR da Clontech. O documento EP O 583 265 se refere aos métodos de otimização do PCR baseado na mutagênese, que pode ser também combinado com o uso de análogos de DNA mutagênicos tais como aqueles descritos no documento EP O 866 796. As tecnologias de reações aleatórias de PCR (do inglês, error prone PCR) são adequadas para a produção de variantes de lipidio aciltransferase com as características preferidas. O documento W00206457 se refere à evolução molecular das lipases.

O terceiro método para obtenção de novas seqüências é para seqüências de nucleotidios de fragmentos não idênticos, pelo uso de quaisquer números de enzimas de restrição ou uma enzima tal como Dnasel, e reunindo novamente as seqüências de nucleotidios completas que codificam proteínas funcionais. Alternativamente, pode ser usada uma ou múltiplas seqüências de nucleotidios não idênticas e introduzidas mutações durante a reunião da seqüência de nucleotidios completa. Tecnologias de DNA shuffling e de family shuffling são adequadas para a produção de variantes de lipidio aciltransferase com características preferidas. Os métodos adequados para a realização do "shuffling" podem ser encontrados nos documentos EP O 752 008, EP 1 138 763, EP 1 103 606. O embaralhamento (shuffling) pode ser também combinado com outras formas de mutagênese de DNA conforme descrito nos documentos US 6,180,406 e WOOl/34835.

Assim, é possível produzir numerosas mutações sítio- direcionadas ou aleatórias em uma seqüência de nucleotidios, tanto in vivo quanto in vitro, e mapear subsequentemente a funcionalidade melhorada do polipeptídio codificado por vários meios. O uso de métodos de recombinação mediada por exo e in silico (veja WO 00/58517, US 6,344,328, US 6,361,974), por exemplo, evolução molecular pode ser realizada onde a variante produzida possui homologia muito baixa em relação a enzimas ou proteínas conhecidas. Tais variantes obtidas através disso podem ter analogia estrutural significativa para enzimas transferase conhecidas, mas apresentam homologia muito baixa de seqüência de aminoácidos. Como um exemplo não limitativo, adicionalmente, mutações ou variantes naturais de uma seqüência de polinucleotídios podem ser recombinadas com o tipo selvagem (wild type) ou outras mutações ou variantes naturais para produzir novas variantes. Tais variantes novas podem ser também mapeadas para funcionalidade melhorada do polipeptídio codificado.

A aplicação dos métodos de evolução molecular acima mencionados e similares permite a identificação e seleção de variantes das enzimas da presente invenção que apresentam características preferidas sem qualquer conhecimento anterior da estrutura ou função de proteína, e permitem a produção de mutações ou variantes não previsíveis, mas benéficas. Há numerosos exemplos de aplicações da evolução molecular na arte para a otimização ou alteração da atividade de enzima, tais exemplos incluem, mas não são limitados a, um ou mais dos seguintes: atividade e/ou expressão otimizada em uma célula hospedeira ou in vitro, atividade enzimática aumentada, especificidade de produto e/ou substrato alterada, estabilidade estrutural e/ou enzimática aumentada ou reduzida, especificidade/ atividade enzimática alterada em condições ambientais preferidas, por exemplo, temperatura, pH, substrato.

Como será aparente para o versado na técnica, usando ferramentas de evolução molecular, uma enzima pode ser alterada para melhor a funcionalidade da enzima. Adequadamente, a seqüência de nucleotidios que codifica um lipidio aciltransferase usada na invenção pode codificar uma variante de lipidio aciltransferase, ou seja, o lipidio aciltransferase pode conter pelo menos uma 5 substituição, deleção ou adição de aminoácido, quando comparado a uma enzima mãe. Enzimas variantes mantêm pelo menos 1 %, 2 %, 3 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 97 %, 99 % de homologia com a enzima mãe. Enzimas mãe adequadas podem incluir 10 qualquer enzima com atividade esterase ou lipase. Preferivelmente, a enzima mãe alinha com a seqüência consenso pfam00657.

Em uma modalidade preferida, uma enzima lipidio transferase variante mantém ou incorpora pelo menos um ou mais dos resíduos de aminoácidos da seqüência consenso pfam00657 encontrados nos blocos GDSx, GANDY e HPT.

Enzimas, tais como lipase com baixa ou nenhuma atividade lipidio aciltransferase em um meio aquoso pode ser mutada usando ferramentas de evolução molecular para 20 introduzir ou aumentar a atividade transferase, produzindo, desse modo, uma enzima aciltransferase com atividade transferase significativa adequada para uso nas composições e métodos da presente invenção.

Adequadamente, a seqüência de nucleotidios que codifica um lipidio aciltransferase para uso em qualquer um dos vetores, células hospedeiras, métodos e/ou usos da presente invenção pode ser codificar um lipidio aciltransferase que pode ser um variante com atividade enzimática aumentada em lipidios polares, preferivelmente fosfolipidios e/ou glicolipidios, quando comparada com a enzima mãe. Preferivelmente, tais variantes apresentam também baixa ou nenhuma atividade nos lipidios Iyso polares. A atividade aumentada nos lipidios polares, fosfolipidios e/ou glicolipidios pode ser o resultado da hidrólise e/ou atividade transferase ou uma combinação de ambos.

Lipidio aciltransferases variantes podem ter atividade diminuída sobre os triglicerídios, e/ou monoglicerídios e/ou diglicerídios comparada como a enzima mãe.

Adequadamente, a enzima variante pode possuir nenhuma atividade sobre os triglicerídios e/ou monoglicerídios e/ou diglicerídios.

Alternativamente, a enzima variante pode ter atividade aumentada sobre os triglicerídios e/ou pode ter também atividade aumentada em um ou mais dos seguintes, lipidios polares, fosfolipidios, lecitina, fosfatidilcolina, glicolipidios, digalactosil monoglicerídio, monogalactosil monoglicerídio.

Variantes de lipidio aciltransferase são conhecidas, e uma ou mais de tais variantes podem ser usadas adequadamente para uso nos métodos e usos de acordo com a presente invenção e/ou nas composições de enzimas de acordo com a presente invenção. Apenas a título de exemplo, podem ser usadas na presente invenção variantes de lipidio aciltransferase que são descritas nas seguintes referencias: Hilton & Buckley, J. Biol. Chem., 1991, Jan 15:266 (2): 977-1000; Robertson e colaboradores, J. Biol. Chem., 1994, Jan 21; 269(3):2146-50; Brumlik e colaboradores, J. Bacteriol, April 1996, 178 (7): 2060-4; Peelman e colaboradores, Protein Sci., Mar 1998, 7(3):587- 99.

SEQÜÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS

A presente invenção compreende também as seqüências de aminoácidos codificadas por uma seqüência de nucleotidios que codifica um lipidio aciltransferase para uso em qualquer um dos vetores, células hospedeiras, métodos e/ou usos da presente invenção.

Como aqui usado, o termo "seqüência de aminoácidos" é sinônimo de termo "polipeptidio" e/ou do termo "proteína". Em alguns exemplos, o termo "seqüência de aminoácidos" é sinônimo do termo "peptídio".

A seqüência de aminoácidos pode ser preparada/isolada de uma origem adequada, ou pode ser feita sinteticamente ou pode ser preparada pelo uso de técnicas de DNA recombinante.

Adequadamente, as seqüências de aminoácidos podem ser obtidas a partir de polipeptídios ensinados aqui isolados pelas técnicas padrão. Um método adequado para a determinação da seqüência de aminoácidos a partir de polipeptídios isolados é conforme a seguir:

0 polipeptídio purificado pode ser liofilizado e 100 μg de material liofilizado podem ser dissolvidas em 50 μ]^ de uma mistura de uréia 8 M e carbonato de hidrogênio e amônio 0,4 M, pH 8,4. A proteína dissolvida pode ser desnaturada e reduzida por 15 minutos a 50 °C seguido de superposição com nitrogênio e adição de 5 μΐ, de ditiotreitol 45 mM. Após o resfriamento a temperatura ambiente, 5 μί de iodoacetamida 100 mM podem ser adicionados para os resíduos de cisteína serem derivatizados por 15 minutos em temperatura ambiente no escuro sob nitrogênio.

135 μ]1 de água e 5 μg de endoproteinase Lys-C em 5 μL de água pode ser adicionado à mistura reacional acima e a digestão foi realizada a 37 0C sob nitrogênio por 24 horas.

Os peptídios resultantes puderam ser separados por CLAE em fase reversa em uma coluna VYDAC C18 (0,46 x 15 cm; μχη; The Separation Group, Califórnia, EUA) usando solvente A: 0,1 % de TFA em água e solvente B: 0,1 % de TFA em acetonitrila. Os peptídios selecionados puderam ser recromatografados em uma coluna Develosil C18 usando o mesmo sistema de solventes, antes do sequenciamento N- terminal. 0 sequenciamento pode ser feito usando um seqüenciador 476A da Applied Biosystems, usando ciclos líquidos de pulso rápido de acordo com as instruções do fabricante (Applied Biosystems, Califórnia, EUA).

IDENTIDADE DE SEQÜÊNCIA OU HOMOLOGIA DE SEQÜÊNCIA

Aqui, o termo "homólogo" significa uma entidade que possui certa homologia com as seqüências de aminoácidos requeridas e as seqüências de nucleotidios requeridas. Aqui, o termo "homologia" pode ser igualado a "identidade".

A seqüência de aminoácidos homologa e/ou seqüência de nucleotidios devem prover e/ou codificar um polipeptídio que mantenha a atividade funcional e/ou aumente a atividade da enzima.

No presente contexto, uma seqüência homologa é tomada para incluir uma seqüência de aminoácidos que pode ser pelo menos 75, 85 ou 90 % idêntica, preferivelmente pelo menos 95 ou 98 % idêntica à seqüência requerida. Tipicamente, os homólogos compreenderão os mesmos sítios ativos etc. que a seqüência de aminoácidos. Embora a homologia possa ser também considerada em termos de similaridade (ou seja, resíduos de aminoácidos possuindo funções/propriedades químicas similares), no contexto da presente invenção, é preferido expressar a homologia em termos de identidade de seqüência.

No presente contexto, uma seqüência homologa é tomada para incluir uma seqüência de nucleotidios que pode ser pelos menos 75, 85 ou 90 % idêntica, preferivelmente 95 ou 98 % idêntica a uma seqüência de nucleotidios que codifica um polipeptídio da presente invenção (a seqüência requerida). Tipicamente, os homólogos compreenderão as mesmas seqüências que codificam os sitios ativos etc. como as seqüências requeridas. Embora a homologia possa ser também considerada em termos de similaridade (ou seja, resíduos de aminoácidos possuindo funções/propriedades químicas similares), no contexto da presente invenção, é preferido expressar a homologia em termos de identidade de seqüência.

Comparações de homologia podem ser conduzidas a olho, ou mais geralmente, com auxilio de programas de comparação de seqüências prontamente disponíveis. Esses programas de computador disponíveis comercialmente podem calcular a % de homologia entre duas ou mais seqüências.

A % de homologia pode ser calculada sobre seqüências contíguas, isto é, uma seqüência é alinhada com a outra seqüência e cada aminoácido em uma seqüência é diretamente comparado com o aminoácido correspondente em outra seqüência, um resíduo de cada vez. Isso é chamado de alinhamento sem espaçamento ("ungapped" alignment). Tipicamente tais alinhamentos sem intervalo são realizados somente sobre um número reduzido de resíduos.

Embora esse seja um método muito simples e consistente, não leva em consideração que, por exemplo, em um outro par idêntico de seqüências, uma introdução ou deleção provocará que os resíduos de aminoácidos seguintes sejam postos fora de alinhamento, resultando, assim, em uma redução potencialmente maior em % de homologia quando um alinhamento global é realizado. Consequentemente, os principais métodos de comparação de seqüências são designados para produzir alinhamentos ótimos que levam em consideração as possíveis introduções e deleções sem a penalização desnecessária da pontuação de homologia global. Isso é alcançado pela introdução de espaçamentos (gaps) na seqüência de alinhamento para tentar maximizar a homologia local.

Contudo, esses métodos mais complexos determinam as "penalidades de espaçamento" (gap penalties) para cada gap que ocorre no alinhamento de modo que, para o mesmo número de aminoácidos idênticos, um alinhamento de seqüência com poucos gaps possíveis - refletindo a maior relação entre as duas seqüências comparadas - alcançará uma pontuação maior do que um com muitos gaps. "Custos de affine gap" são tipicamente usados por cobrarem um custo relativamente alto para a existência de um gap e uma penalidade menor para cada resíduo subsequente no gap. Esse é o método de pontuação de gap mais comumente usado. Penalidades altas de gap certamente produzirão alinhamentos otimizados com menos gaps. A maior parte dos programas de alinhamento permite que as penalidades de gap sejam modificadas. Porém, é preferido usar os valores padrão ao usar tal programa de computador para comparações de seqüências.

O calculo da % máxima de homologia, então, requer primeiramente a produção de um alinhamento ótimo, levando em consideração as penalidades de gap. Um programa de computador adequado para a realização de tal alinhamento é o Vector NTI (Invitrogen Corp.) . Exemplos de outros programas de computador que podem realizar as comparações de seqüência incluem, mas não são limitados a, ao pacote BLAST (veja Ausubel e colaboradores, 1999, Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed. - Chapter 18) , e FASTA (Altschul e colaboradores, 1990, J. Mol. Biol. 403-410) . Ambos BLAST e FASTA são disponíveis para pesquisa na online e offline (veja Ausubel e colaboradores, 1999, páginas 7-58 a 7-60). Entretanto, para algumas aplicações, é preferido o uso do programa Vector NTI. Uma nova ferramenta, chamada de BLAST 2 Sequences está também disponível para a comparação da proteína e seqüência de nucleotidios (veja FEMS Microbiol Lett., 1999, 174 (2): 247-50; FEMS Microbiol Lett., 1999, 177(1): 187-8 e tatiana0ncbi.nlm.nih.gov)

Embora a % final de homologia possa ser medida em termos de identidade, o próprio processo de alinhamento é tipicamente não baseado em uma comparação tudo ou nada de pares (do inglês, all-or-nothing pair comparison). Em vez 25 disso, uma matriz dimensionada de similaridade de pontuação é geralmente usada por determinar pontuações para comparação de cada pareamento com base na similaridade química ou distancia evolutiva. Um exemplo de tal matriz comumente usada é a matriz BLOSUM62 - a matriz padrão para os conjuntos de BLAST dos programas. Programas Vector NTI 5 usam geralmente tanto os valores públicos de padrão quanto uma tabela de comparação de símbolo personalizado se fornecido (veja o manual do usuário para maiores detalhes). Para algumas aplicações, é preferido usar os valores padrão para o pacote Vector NTI.

Alternativamente, as porcentagens de homologias podem

ser calculadas usando a característica de alinhamento múltiplo no Vector NTI (Invitrogen corp.), com base em um algoritmo, análogo ao CLUSTAL (Higgins DS & Sharp PM (1988), Gene 73(1), 237-244).

Uma vez que o programa de computador produziu um

alinhamento ótimo, é possível calcular a % de homologia, preferivelmente a % da identidade de seqüência. O programa de computador faz isso como parte da comparação de seqüência e gera um resultado numérico.

As penalidades de gap devem ser usadas quando se

determina a identidade de seqüência, então, preferivelmente os seguintes parâmetros são usados para o alinhamento do pareamento.

Para BLAST ABERTURA DE GAP 0 EXTENSÃO DE GAP

Para CLUSTAL DNA PROTEÍNA WORD SIZE 2 1 K triplo PENALIDADE DE GAP 15 10 EXTENSÃO DE GAP 6,66 0,1 Em uma modalidade, a identidade de seqüência para seqüência de nucleotidios é preferivelmente determinada usando CLUSTAL com o conjunto de penalidade de gap e extensão de gap conforme definido acima.

Adequadamente, o grau de identidade em relação a uma seqüência de nucleotidios é determinado em pelo menos 20 nucleotidios contíguos, preferivelmente em pelo menos 30 nucleotidios contiguos, preferivelmente em pelo menos 40 10 nucleotidios contiguos, preferivelmente em pelo menos 50 nucleotidios contiguos, preferivelmente em pelo menos 60 nucleotidios contíguos, preferivelmente em pelo menos 100 nucleotidios contíguos.

Adequadamente, o grau de identidade em relação a uma seqüência de nucleotidios pode ser determinado em toda seqüência.

Em uma modalidade, o grau de identidade da seqüência de aminoácidos de acordo com a presente invenção pode ser determinado de forma adequada através de programas de computador conhecidos na arte, tal como Vector NTI (Invitrogen Corp.). Para o alinhamento do pareamento, a matriz usada é preferivelmente BLOSUM62 com penalidade por abertura de Gap de 10,0 e penalidade por extensão de Gap de 0,1.

Adequadamente, o grau de identidade em relação a uma seqüência de aminoácido é determinado em pelo menos 20 aminoácidos contíguos , preferivelmente em pelo menos 30 aminoácidos contíguos , preferivelmente em pelo menos 40 aminoácidos contíguos , preferivelmente em pelo menos 50 aminoácidos contíguos , preferivelmente em pelo menos 60 aminoácidos contíguos. Adequadamente, o grau de identidade em relação a uma seqüência de aminoácidos pode ser determinado em toda a seqüência.

As seqüências podem ter também deleções, inserções ou 15 substituições de resíduos de aminoácidos que produzem uma alteração silenciosa e resultam em uma substância funcionalmente equivalente. As substituições deliberadas de aminoácidos podem ser feitas com base na similaridade em polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade,

hidrofilicidade, e/ou a natureza anfipática dos resíduos enquanto a atividade ligante secundária da substância for mantida. Por exemplo, aminoácidos negativamente carregados incluem ácido aspártico e ácido glutâmico; aminoácidos positivamente carregados incluem lisina e arginina; e 25 aminoácidos com grupos de cabeça polar descarregada possuindo valores similares de hidrofilicidade incluem leucina, isoleucina, valina, glicina, alanina, asparagina, glutamina, serina, treonina, fenilalanina, e tirosina.

Substituições conservativas podem ser feitas, por exemplo, de acordo com a Tabela abaixo. Aminoácidos no mesmo bloco na segunda coluna e preferivelmente na mesma linha na terceira coluna podem ser substituídos um por outro:

ALIFÁTICOS apoiar GAP ILV Polar - descarregado CSTM N Q Polar - carregado D E K R AROMÁTICO HFWY A presente invenção compreende também a substituição homóloga (substituição e troca são ambos usados aqui para significar a alternação de um resíduo de aminoácido existente, com um resíduo alternativo) que pode ocorrer, ou seja, substituição por similares (do inglês, like-for-like) tais como básico por básico, ácido por ácido, polar por polar, etc. Substituições não homólogas podem também ocorrer, isto é, a partir de uma classe de resíduos a outra ou alternativamente envolvendo a inclusão de aminoácidos não naturais, tais como ornitina (referido aqui como Z), ácido diaminobutírico ornitina (referido aqui como B) , norleucina ornitina (referido aqui como 0) , pirilalanina, tienilalanina, naftilalanina e fenilglicina.

As substituições podem ser feitas também por aminoácidos não naturais.

As seqüências de aminoácidos variantes podem incluir grupos espaçadores adequados que podem ser inseridos entre dois resíduos de aminoácidos quaisquer da seqüência que inclui grupos alquila, tais como grupos metila, etila ou propila em adição aos espaçadores de aminoácidos, tais como resíduos de β-alanina ou glicina. Uma forma adicional de variação que envolve a presença de um ou mais resíduos de aminoácidos em forma peptóide, será bem compreendida por aqueles versados na técnica. Para evitar qualquer dúvida, "a forma peptóide" é usada para se referir aos resíduos de aminoácidos variantes, onde o grupo α-carbono substituinte está no átomo de nitrogênio do resíduo ao invés do a- carbono. Processos para preparação de peptídios na forma peptóide são conhecidos na arte, por exemplo, Simon RJ et al., PNAS (1992) 89(2), 9367-9371 e Horwell DC, Trends Biotechnol. (1995), 13(4), 132.-134.

As seqüências de nucleotidios para uso na presente invenção ou que codificam um polipeptídio que possui as propriedades específicas aqui definidas podem incluí-los dentro dos nucleotidios sintéticos ou modificados. Um número de tipos diferentes de modificações para oligonucleotídios é conhecido na arte. Esses incluem estruturas de metilfosfonato e fosforotioato e/ou a adição de cadeias de acridina ou polilisina nas extremidades 3' e/ou 5' da molécula. Para as finalidades da presente invenção, deve-se compreender que as seqüências de nucleotidios descritas aqui podem ser modificadas por qualquer método disponível na arte. Tais modificações podem ser realizadas para aumentar a atividade in vivo ou o tempo de vida das seqüências de nucleotidios.

A presente invenção compreende também o uso das seqüências de nucleotidios que são complementares às seqüências discutidas aqui, ou qualquer derivação, fragmento ou derivativo deste. Se a seqüência for complementar a um fragmento deste, então, aquela seqüência pode ser usada como uma sonda para identificar as seqüências codificantes similares em outro organismo.

Polinucleotídios que são não 100 % homólogos às seqüências da presente invenção, mas que caem dentro do escopo da invenção podem ser obtidos de diversas formas. Outras variantes das seqüências descritas aqui podem ser obtidas, por exemplo, pelo uso de sondas de bibliotecas de DNA feitas de uma gama de indivíduos, indivíduos de populações diferentes. Além disso, outros homólogos virais / bacterianos, ou celulares, particularmente homólogos celulares encontrados nas células de mamíferos (por exemplo, células de ratos, de camundongos, bovinas e primatas), podem ser obtidas e tais homólogos e fragmentos destes, em geral, serão capazes de hibridizar de forma seletiva as seqüências mostradas nas seqüências aqui listadas. Tais seqüências podem ser obtidas pelo uso de sondas de bibliotecas de cDNA feitas a partir de bibliotecas de DNA genômico a partir de outras espécies animais, e o uso de sondas de tais bibliotecas com sondas compreendendo todo ou parte de qualquer uma das seqüências na listagem de seqüências aqui anexada sob condições de média a alta estringência. Considerações similares aplicadas à obtenção dos homólogos de espécies e variantes alélicas das seqüências de nucleotidios ou polipeptidios da invenção.

Variantes e homólogos de linhagens / espécie podem ser também obtidos usando PCR degenerada que usará iniciadores designados para alvejar as seqüências nas variantes e homólogos que codificam as seqüências de aminoácidos conservadas nas seqüências da presente invenção. As seqüências conservadas podem ser previstas, por exemplo, pelo alinhamento das seqüências de aminoácidos de varias variantes / homólogos. Os alinhamentos de seqüência podem ser preparados usando programas de computador conhecidos na arte. Por exemplo, o programa PileUp da GCG Wisconsin é amplamente usado.

Os iniciadores usados na PCR degenerada conterão uma ou mais posições degeneradas e serão usados em condições estringentes inferiores àquelas usadas para as seqüências de clonagem com iniciadores de seqüência simples contra as seqüências conhecidas.

Alternativamente, tais polinucleotídios podem ser obtidos pela mutagênese sitio-dirigida das seqüências características. Isso pode ser útil onde, por exemplo, alterações de seqüência de códon silenciador são requeridas para otimizar as preferências de códon para uma célula hospedeira particular, em que as seqüências de nucleotidios estão sendo expressas. Outras alterações de seqüências podem ser desejadas para introduzir sítios de reconhecimento de polipeptídio de restrição, ou alterar a propriedade ou função dos polipeptídios codificados pelos polinucleotídios.

Polinucleotídios (seqüências de nucleotidios) da invenção podem ser usadas para produzir um iniciador, por exemplo, um iniciador de PCR, um iniciador para uma reação de amplificação alternativa, uma sonda, por exemplo, marcada com uma marcação de revelação por meios convencionais usando marcadores radioativos ou não radiativos, ou os polinucleotídios podem ser clonados em vetores. Tais iniciadores, sondas e outros fragmentos serão pelo menos 15, preferivelmente pelo menos 20, por exemplo, pelo menos 25, 30 ou 40 nucleotidios em comprimento, e são também compreendidos pelo termo polinucleotídios da invenção conforme aqui usados. Polinucleotídios, tais como polinucleotídios de DNS e sondas de acordo com a invenção, pode ser produzidos de forma recombinante, sintética, ou por quaisquer meios disponíveis por aqueles versados na técnica. Eles podem ser também clonados por técnicas padrão.

Em geral, os iniciadores serão produzidos por meios sintéticos, envolvendo uma fabricação em etapas de uma seqüência de ácido nucléico desejada um nucleotídio por vez. Técnicas para este acompanhamento usando técnicas automatizadas que já são prontamente disponíveis na arte.

Polinucleotídios mais longos serão geralmente produzidos usando meios recombinantes, por exemplo, usando técnicas de clonagem por PCR (reação em cadeia da polimerase) . Isso envolverá a preparação de um par de iniciadores (por exemplo, cerca de 15 a 30 nucleotidios) que flanqueiam uma região da seqüência alvo de lipidios que se deseja clonar, induzindo os iniciadores a entrarem em contato com o mRNA ou cDNA obtido a partir de uma célula humana ou animal, realizando uma reação em cadeia da polimerase sob condições que causam amplificação da região desejada, isolando o fragmento amplificado (por exemplo, purificando a mistura reacional em um gel de agarose) e recuperando o DNA amplificado. Os iniciadores podem ser designados para conter sítios de reconhecimento de enzima de restrição adequados de forma que o DNA amplificado possa ser clonado em um vetor de clonagem adequado. HIBRIDIZAÇÃO

A presente invenção também compreende seqüências que são complementares às seqüências da presente invenção ou seqüências que são capazes de hibridizar tanto as seqüências da presente invenção quanto as seqüências que são complementares a esta.

O termo "hibridização" como usado aqui deve incluir ''o processo pelo qual uma fita de ácido nucléico se junta com uma fita complementar através do pareamento de bases", bem como o processo de amplificação conforme realizado nas tecnologias de reação em cadeia da polimerase (PCR).

A presente invenção compreende também o uso das seqüências de nucleotidios que são capazes de hibridizar as seqüências que são complementares às seqüências requeridas aqui discutidas, ou qualquer derivado, fragmento ou derivado desta.

A presente invenção compreende também as seqüências que são complementares às seqüências que são capazes de hibridizar as seqüências de nucleotidios aqui discutidas.

As condições de hibridização são baseadas na temperatura de fusão (Tf) do complexo nucleotídio-ligante, conforme ensinado em Berger e Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego, CA), e conferem uma "estringência" definida com explicado abaixo. Tipicamente, a estringência máxima ocorre em cerca de Tf-5 0C (5 0C abaixo da Tf da sonda); alta estringência em cerca de 5 0C a 10 0C abaixo da Tf; estringência intermediária em cerca de 10 0C a 20 0C abaixo da Tf; e baixa estringência em cerca de 20 0C a 25 0C abaixo da Tf. Como será compreendido por aqueles versados na técnica, uma hibridização de estringência máxima pode ser usada para identificar ou detectar seqüências de nucleotidios idênticas, enquanto que uma hibridização de estringência intermediária (ou baixa) pode ser usada para identificar ou detectar seqüências de nucleotidios similares ou relacionadas.

Preferivelmente, a presente invenção compreende seqüências que são complementares às seqüências que são capazes de hibridização sob altas condições de estringência ou condições intermediárias de estringência às seqüências de nucleotidios que codificam polipeptidios que possuem as propriedades específicas como aqui definidas.

Mais preferivelmente, a presente invenção compreende as seqüências que são complementares às seqüências que são capazes de hibridização sob condições de alta estringência (por exemplo, 65 0C e 0,IxSSC {IxSSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M Na-citrato, pH 7,0}) às seqüências de nucleotidios que codificam polipeptídios que possuem as propriedades específicas conforme definidas aqui. A presente invenção se refere também às seqüências de nucleotidios que são complementares às seqüências que podem hibridizar as seqüências de nucleotidios discutidas aqui (incluindo as seqüências complementares daquelas aqui discutidas).

Estão também inclusas no escopo da presente invenção as seqüências de polinucleotídios que são capazes de hibridizar as seqüências de nucleotidios aqui discutidas sob condições de estringência de intermediária a máxima .

Em um aspecto preferido, a presente invenção cobre as seqüências de nucleotidios que podem hibridizar às seqüências de nucleotidios aqui discutidas, ou o complemento destas, sob condições de estringência (por exemplo, 50 0C e 0,2xSSC).

Em um aspecto mais preferido, a presente invenção cobre as seqüências de nucleotidios que podem hibridizar às seqüências de nucleotidios aqui discutidas, ou o complemento destas, sob condições de alta estringência (por exemplo, 65 °C e 0,lxSSC).

EXPRESSÃO DOS POLIPEPTÍDIOS

Uma seqüência de nucleotidios para uso na presente invenção ou para codificação de um polipeptídio possuindo as propriedades específicas conforme definidas aqui, pode ser incorporada em um vetor replicável recombinante. O vetor pode ser usado para replicar e expressar a seqüência de nucleotidios, na forma de polipeptídio, em e/ou de uma célula hospedeira compatível. A expressão pode ser controlada usando seqüências controle que incluem promotores / acentuadores e outros sinais de regulação da expressão. Promotores procarióticos e promotores funcionais de células eucarióticas podem ser usados. Promotores tecido-específicos ou estímulo-específicos podem ser usados. Promotores quiméricos podem ser também usados compreendendo elementos de seqüência de dois ou mais promotores diferentes descritos acima.

O polipeptídio produzido pela célula hospedeira recombinante pela expressão da seqüência de nucleotidios pode ser secretado ou pode estar contido intracelularmente dependendo da seqüência e/ou do vetor usado. As seqüências codificantes podem ser designadas com seqüências sinal, que direcionam a secreção da substância que codifica as seqüências através de uma membrana celular procariótica ou eucariótica particular.

CONSTRUÇÕES

O termo "construção" - que é sinônimo dos termos tais como "conjugado", "cassete", e "híbrido" - inclui uma seqüência de nucleotidios que codifica um polipeptídio possuindo as propriedades específicas definidas aqui para uso de acordo com a presente invenção ligado diretamente ou indiretamente a um promotor. Um exemplo de uma ligação indireta é o fornecimento de um grupo espaçador adequado, tal como uma seqüência de íntron, tal como Shl-íntron ou o ADH intron, que intermedia o promotor e a seqüência de nucleotidios da presente invenção. O mesmo é verdadeiro para o termo "fundido" em relação ã presente invenção, que inclui a ligação direta ou indireta. Em alguns casos, os termos não cobrem a combinação natural da seqüência de nucleotidios que codifica a proteína geralmente associada ao promotor do gene do tipo selvagem (wild) e quando ambos estão no seu ambiente natural.

A construção pode mesmo conter ou expressar um marcador que permite a seleção da construção genética.

Para algumas aplicações, preferivelmente a construção compreende pelo menos uma seqüência de nucleotidios da presente invenção ou uma seqüência de nucleotidios que codifica um polipeptídio possuindo as propriedades específicas definidas aqui ligada de forma operável a um promotor.

ORGANISMO

O termo "organismo" em relação à presente invenção inclui qualquer organismo que possa compreender uma seqüência de nucleotidios de acordo com a presente invenção ou uma seqüência de nucleotidios que codifica um polipeptídio que possui as propriedades específicas conforme descritas aqui e/ou produtos obtidos deste.

0 termo "organismo transgênico" em relação à presente invenção inclui qualquer organismo que compreenda uma seqüência de nucleotidios que codifica um polipeptídio que possui as propriedades específicas conforme aqui definidas e/ou produtos obtidos desta, e/ou onde um promotor possa permitir a expressão da seqüência de nucleotidios que codifica um polipeptídio que possui as propriedades específicas conforme aqui definidas no organismo. Preferivelmente a seqüência de nucleotidios é incorporada no genoma do organismo.

O termo "organismo transgênico" não cobre as seqüências de nucleotidios codificantes no ambiente natural quando estão sob o controle do seu promotor nativo que está também no seu ambiente natural.

Assim, o organismo transgênico da presente invenção inclui um organismo que compreende qualquer um de, ou combinações de, uma seqüência de nucleotidios que codifica um polipeptídio que possui as propriedades específicas conforme aqui definidas, construções como aqui definidas, vetores como aqui definidos, plasmídeos como aqui definidos, células como aqui definidas, ou produtos destes. Por exemplo, o organismo transgênico pode também compreender uma seqüência de nucleotidios que codifica um polipeptídio possuindo as propriedades especificas como definidas aqui sob o controle de um promotor não associado com uma seqüência que codifica um lipidio aciltransferase in natura.

TRANSFORMAÇÃO DAS CÉLULAS HOSPEDEIRAS / ORGANISMO Ensinamentos sobre a transformação de hospedeiros procarióticos são bem documentados na arte, por exemplo, veja Sambrook e colaboradores (Molecular Cloning: A Laboratory manual, 2nd edition, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Se um hospedeiro procariótico for usado, então, a seqüência de nucleotidios pode necessitar ser modificada de forma adequada antes da transformação - tal como por remoção de íntrons.

Vários métodos são conhecidos para a transformação das espécies de Bacillus.

SECREÇÃO

Frequentemente deseja-se que o polipeptídio seja secretado a partir do hospedeiro de expressão em um meio de cultivo de onde a enzima pode ser recuperada de forma mais fácil. De acordo com a presente invenção, a seqüência secretora líder pode ser selecionada nas bases de hospedeiro de expressão desejado. As seqüências híbridas de sinal podem ser também usadas com o contexto da presente invenção.

Exemplos típicos de seqüências líderes secretoras não associadas com uma seqüência de nucleotidios que codifica um lipidio aciltransferase in natura são aquelas originadas a partir do gene amiloglucosidade (AG) de fungos (glaA - ambas as versões de 18 e 24 aminoácidos, por exemplo, do Aspergillus), o gene a-fator (leveduras, por exemplo, Saccharomyees, Kluyveromyces e Hansenula) ou ο gene da α- amilase (Bacillus) .

DETECÇÃO

Uma variedade de protocolos para detecção e medição da expressão da seqüência de aminoácidos é conhecida na arte. Exemplos incluem o ensaio imunoabsorvente de ligação de enzimas (ELISA), radioimunoensaio (RIA) e a seleção de células ativadas pela fluorescência (FACS).

Uma ampla variedade de marcadores e técnicas de conjugação é conhecida por aqueles versados na técnica e pode ser usada em vários ensaios nucléicos e de aminoácidos.

Um número de companhias, tais como Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ), Promega (Madison, WI), e US Biochemical Corp (Cleveland, OH) , fornecem kits comerciais e protocolos para esses procedimentos.

Moléculas repórter adequadas ou marcadores incluem aqueles radionuclideos, enzimas, agentes fluorescentes, quimioluminescentes ou cromogênicos, bem como substratos, cofatores, inibidores, partículas magnéticas e similares. Patentes que ensinam o uso de tais marcadores incluem US3,817,837 A, US3,850,752 A, US3,939,350 A, US 3,996,345 A, US4,277,437 A, US4,275,149 A e US4,366,241 A.

Além disso, as imunoglobulinas recombinantes podem ser produzidas como mostrado no documento US4,816,567 A. PROTEÍNAS DE FUSÃO No método da presente invenção, o lipidio aciltransferase pode ser produzido como uma proteína de fusão, por exemplo, para auxiliar na extração ou purificação deste. Exemplos de associados de proteína de fusão incluem glutationa S-transferase (GST), 6xHis, GAL4 (domínios de ativação de transcrição e/ou ligação de DNA) e β-galactosidase. Pode ser também conveniente incluir um sítio de clivagem proteolítica entre o associado de proteína de fusão e a seqüência de proteína de interesse para permitir a remoção das seqüências de proteína de fusão. Preferivelmente a proteína de fusão não impedirá a atividade da seqüência de proteína.

Os sistemas de fusão de gene de expressão na E. coli foram revisados em Curr. Opin. Biotechnol. (1995) 6(5) :501- 6.

Em outra modalidade da invenção, a seqüência de aminoácidos de um polipeptídio possuindo as propriedades específicas conforme aqui descritas pode ser ligada a uma seqüência não nativa para codificar uma proteína de fusão. Por exemplo, para o mapeamento das bibliotecas de peptídios para agentes capazes de afetar a atividade da substância, pode ser útil codificar uma substância quimérica que expressa um epítopo não nativo que é reconhecido por um anticorpo comercialmente disponível.

A invenção será agora descrita, somente a título de exemplo, em referência às seguintes Figuras e Exemplos. Figura 1 mostra a seqüência de aminoácidos de um lipidio aciltransferase maduro de uma Aeromonas salmonicida mutante (GCAT) com uma mutação de Asn80Asp (particularmente, aminoácido 80 está na seqüência madura) (SEQ ID No. 16) ;

Figura 2 mostra uma seqüência de aminoácidos (SEQ ID No. 1) um lipidio aciltransferase de Aeromonas hydrophila (ATCC #7965);

Figura 3 mostra uma seqüência consenso de pfam00657 da base de dados, versão 6 (SEQ ID No. 2);

Figura 4 mostra uma seqüência de aminoácidos (SEQ ID No. 3) obtida a partir de organismo Aeromonas hydrophila (P10 4 8 0; GI:12051)

Figura 5 mostra uma seqüência de aminoácidos (SEQ ID No. 4) OBTIDA A PARTIR DO ORGANISMO Aeromonas salmonicida (AAG 0 98 84 04 ; GI:9964017);

Figura 6 mostra uma seqüência de aminoácidos (SEQ ID No. 5) obtida a partir do organismo Streptomyces coelicolor A3(2) (número de acesso do Genbank NP_631558);

Figura 7 mostra uma seqüência de aminoácidos (SEQ ID No. 6) obtida a partir do organismo Streptomyces coelicolor A3(2) (número de acesso do Genbank: CAC42140);

Figura 8 mostra uma seqüência de aminoácidos (SEQ ID No. 7) obtida a partir do organismo Saccharomyees cerevisiae (número de acesso do Genbank: P41734); Figura 9 mostra uma seqüência de aminoácidos (SEQ ID No. 8) obtida a partir do organismo Ralstonia (número de acesso do Genbank: AL646052);

Figura 10 mostra SEQ ID No. 9 Scoel código de acesso NCBI da proteína CAB39707.1 GI:4539178 proteína hipotética conservada [ Stzeptomyces coelicolor A3(2)];

Figura 11 mostra um aminoácido mostrado como SEQ ID No. 10 Scoe2 código de acesso NCBI de proteína CAC01477.1 GI:9716139 proteína hipotética conservada [Streptomyces coelicolor A3(2)];

Figura 12 mostra uma seqüência de aminoácidos (SEQ ID No. 11) Scoe3 código de acesso NCBI de proteína CAB88833.1 GI:7635996 proteína putativa secretada [Streptomyces coelicolor A3(2)];

Figura 13 mostra uma seqüência de aminoácidos (SEQ ID

No. 12) Scoe4 código de acesso NCBI de proteína CAB89450.1 GI:7672261 proteína putativa secretada [Streptomyces coelicolor A3(2)] ;

Figura 14 mostra uma seqüência de aminoácidos (SEQ ID No. 13) Scoe5 código de acesso NCBI da proteína CAB62724.1 GI: 6562793 lipoproteína putativa [Streptomyces coelicolor A3 (2) ] ;

Figura 15 mostra uma seqüência de aminoácidos (SEQ ID No. 14) Sriml código de acesso NCBI da proteína AAK84028.1 GI:15082088 lipase-GDSL [Streptomyces rimosus]; Figura 16 mostra uma seqüência de aminoácidos (SEQ ID No. 15) de um lipidio aciltransferase de Aeromonas salmonicida subesp. Salmonicida (ATCC#14174);

Figura 17 mostra SEQ ID No. 19. Scoel código de acesso NCBI da proteína CAB39707.1 GI:4539178 proteína hipotética conservada [Streptomyces coelicolor A3(2)];

Figura 18 mostra uma seqüência de aminoácidos (SEQ ID No. 25) da construção de fusão usada para mutagênese do gene lipidio aciltransferase de Aeromonas hydrophila. Os aminoácidos sublinhados compreendem um peptídio sinal de xilanase;

Figura 19 mostra uma seqüência de polipeptídios de uma enzima lipidio aciltransferase de Streptomyces (SEQ ID No. 26) ;

Figura 20 mostra uma seqüência de polipeptídios de uma enzima lipidio aciltransferase de Thermobi fida_{SEQ ID No.

27) ;

Figura 21 mostra uma seqüência de polipeptídios de uma enzima lipidio aciltransferase de Thermobifida_ (SEQ ID No.

28) ;

Figura 22 mostra um polipeptídio de uma enzima lipidio aciltransferase de Corynebacterium efficiens GDSx de 300 aminoácidos (SEQ ID No. 29);

Figura 23 mostra um polipeptídio de uma enzima lipidio aciltransferase de Novosphingobium aromaticivorans GDSx de 284 aminoácidos (SEQ ID No. 30); Figura 24 mostra um polipeptídio de uma enzima lipidio aciltransferase de Streptomyces coelicolor GDSx de 269 aminoácidos (SEQ ID No. 31);

Figura 25 mostra um polipeptídio de uma enzima lipidio aciltransferase de Streptomyces avermitilis \ GDSx de 269 aminoácidos (SEQ ID No. 32);

Figura 26 mostra um polipeptídio de uma enzima lipidio aciltransferase de Streptomyces (SEQ ID No. 33);

Figura 27 mostra uma seqüência de aminoácidos (SEQ ID No. 34) obtida de organismo Aeromonas hydrophila (P10480, GI:121051) (particularmente, essa é a seqüência madura);

Figura 28 mostra uma seqüência de aminoácidos (SEQ ID No. 35) de um lipidio aciltransferase maduro mutante de Aeromonas salmonicida (GCAT) (particularmente, essa é a seqüência madura);

Figura 29 mostra uma seqüência de nucleotidios (SEQ ID No. 36) a partir de Streptomyces thermosacchari;

Figura 30 mostra uma seqüência de aminoácidos (SEQ ID No. 37) a partir de Streptomyces thermosacchari;

Figura 31 mostra uma seqüência de aminoácidos (SEQ ID

No. 38) a partir de Thermobifida fusca/GDSx de 548 aminoácidos;

Figura 32 mostra uma seqüência de nucleotidios (SEQ ID No. 39) a partir de Thermobifida fusca;

Figura 33 mostra uma seqüência de aminoácidos (SEQ ID

No. 40) a partir de Thermobifida fusca/GDSx; Figura 34 mostra uma seqüência de aminoácidos (SEQ ID No. 41) a partir de Corynebacterium efficiens/ GDSx de 300 aminoácidos;

Figura 35 mostra uma seqüência de nucleotidios (SEQ ID

42) a partir de Corynebacterium efficiens;

Figura 36 mostra uma seqüência de aminoácidos (SEQ ID

43) a partir de S. coelicolor/GDSx de 268 aminoácidos; Figura 37 mostra uma seqüência de nucleotidios (SEQ ID

44) a partir de S. coelicolor;

Figura 38 mostra uma seqüência de nucleotidios (SEQ ID

45) a partir de S. avermitilis;

Figura 39 mostra uma seqüência de nucleotidios (SEQ ID

46) a partir de S. avermitilis;

Figura 40 mostra uma seqüência de aminoácidos (SEQ ID

47) a partir de Thermobifida fusca/GDSx;

Figura 41 mostra uma seqüência de nucleotidios (SEQ ID

48) a partir de Thermobifida fusca/GDSx;

Figura 42 mostra um alinhamento da L131 e homólogos de

S. avermitilis e T. fusca ilustrando que a conservação do motif GDSx (GDSY na L131 e S. avermitilis e T. fusca) , a caixa GANDY, que é tanto GGNDA ou GGNDL, e o bloco HPT (considerado para ser a histidina catalítica conservada). Esses três blocos conservados são destacados;

Figura 43 mostra SEQ ID No. 17 que é a seqüência de aminoácidos de um lipidio aciltransferase Candida parapsilosis; No. No. No.

10 No. No. No. No. Figura 44 mostra SEQ ID No. 18 que é a seqüência de aminoácidos de um lipidio aciltransferase de Candida parapsilosis;

Figura 45 mostra uma representação da fita de uma estrutura de cristal de 1IVN.PDB que tem glicerol no sitio ativo. A figura foi feita usando o Deep View Swiss-PDB viewer.

Figura 46 mostra a vista lateral da estrutura de cristal de 1IVN.PDB - usando Deep View Swiss-PDB viewer, com glicerol no sitio ativo - resíduos dentro de 10 A do glicerol de sítio ativo são coloridos de preto;

Figura 47 mostra a vista superior da estrutura de cristal de 1IVN.PDB - usando Deep View Swiss-PDB viewer, com glicerol no sítio ativo - resíduos dentro de 10 Â do glicerol de sítio ativo são coloridos de preto;

Figura 48 mostra o alinhamento 1;

Figura 49 mostra o alinhamento 2;

Figuras 50 e 51 mostram um alinhamento de IIVN a P10480 (P10480 é a seqüência da base de dados para a enzima A. hydrophila) , esse alinhamento foi obtido a partir da base de dados PFAM e usados no processo de construção do modelo; e

Figura 52 mostra um alinhamento onde P10480 é a seqüência da base de dados para as Aeromonas hydrophila. Essa seqüência é usada para a construção do modelo e a seleção do sítio. Observe que a proteína completa (SEQ ID No. 25) é retratada, a proteína madura (equivalente à SEQ ID No. 34) inicia no resíduo 19. sal é Aeromonas salmonicida (SEQ ID No. 4) GDSX lipase, A. hyd. é Aeromonas hydrophila (SEQ ID No. 34) GDSX lipase. A seqüência 5 consenso contém um * na posição de uma diferença entre as seqüências listadas.

Figura 53 mostra uma construção de gene usada no Exemplo 1;

Figura 54 mostra uma construção de gene códon- otimizado (n° 052907) usada no exemplo 1; e

Figura 55 mostra a seqüência da inserção de Xhol contendo o iniciador de gene LAT-KLM3', as caixas -35 e -10 são sublinhadas;

Figura 56 mostra BML780-KLM3'CAP50 (compreendendo SEQ ID No. 16 - colônia superior) e BML780 (a linhagem hospedeira vazia - colônia inferior) após 48 h de crescimento a 37 0C em ágar tributirina 1 %;

Figura 57 mostra uma seqüência de nucleotidios de Aeromonas salmonicida (SEQ ID No. 49) incluindo a seqüência sinal (preLAT - posições 1 a 87);

Figura 58 mostra uma seqüência de nucleotidios (SEQ ID No. 50) que codifica um lipidio aciltransferase de acordo com a presente invenção obtido do organismo Aeromonas hydrophila;

Figura 59 mostra uma seqüência de nucleotidios (SEQ ID

No. 51) que codifica um lipidio aciltransferase de acordo cora a presente invenção obtida do organismo Aeromonas salmonicida;

Figura 60 mostra uma seqüência de nucleotidios (SEQ ID No. 52) que codifica um lipidio aciltransferase de acordo com a presente invenção obtido do organismo Streptomyces coelicolor A3(2) (número de acesso do Genbank NC_003888.1:83274 80. .8328367) ;

Figura 61 mostra uma seqüência de nucleotidios (SEQ ID No. 53) que codifica um lipidio aciltransferase de acordo com a presente invenção obtido do organismo Streptomyces coelicolor A3(2) (número de acesso do Genbank AL939131.1:265480..266367);

Figura 62 mostra uma seqüência de nucleotidios (SEQ ID No. 54) que codifica um lipidio aciltransferase de acordo com a presente invenção obtido do organismo Saccharomyces cerevisiae (número de acesso do Genbank Z75034);

Figura 63 mostra uma seqüência de nucleotidios (SEQ ID No. 55) que codifica um lipidio aciltransferase de acordo com a presente invenção obtido do organismo Ralstonia;

Figura 64 mostra uma seqüência de nucleotidios mostrada como SEQ ID No. 56 codificando a proteína com código de acesso NCBI CAB39707.1 GI:4539178 proteína hipotética conservada [ Streptomyces coelicolor A3(2)] ;

Figura 65 mostra uma seqüência de nucleotidios mostrada como SEQ ID No. 57 codificando Scoe2 código de acesso NCBI da proteína CAC01477.1 GI:9716139 proteína hipotética conservada [Streptomyces coelicolor A3(2)];

Figura 66 mostra uma seqüência de nucleotidios mostrada como SEQ ID No. 58 codificando Scoe3 código de acesso NCBI da proteína CAB88833.1 GI:7635996 proteína putativa secretada [Streptomyces coelicolor A3(2)];

Figura 67 mostra uma seqüência de nucleotidios mostrada como SEQ ID No. 59 codificando Scoe4 código de acesso NCBI da proteína CAB89450.1 GI:7672261 proteína putativa secretada [Streptomyces coelicolor A3(2)] ;

Figura 68 mostra uma seqüência de nucleotidios mostrada como SEQ ID No. 60 codificando Scoe5 código de acesso NCBI da proteína CAB62724.1 GI:6562793 lipoproteína putativa [Streptomyces coelicolor A3(2)];

Figura 69 mostra uma seqüência de nucleotidios

mostrada como SEQ ID No. 61 codificando Sriml código de acesso NCBI da proteína AAK84028.1 GI:15082088 GDSL-Iipase [Streptomyces rimosus] ;

Figura 70 mostra uma seqüência de nucleotidios (SEQ ID No. 62) que codifica um lipidio aciltransferase de Aeromonas hydrophila (ATCC#7965);

Figura 71 mostra uma seqüência de nucleotidios (SEQ ID No. 63) que codifica um lipidio aciltransferase de Aeromonas salmonicida subesp. Salmonicida (ATCC#14174); e Figura 72 mostra uma seqüência de nucleotidios (SEQ ID No. 24) que codifica uma enzima a partir de Aeromonas hydrophila incluindo um peptídio sinal de xilanase.

EXEMPLO 1

Expressão de KLM3' em Bacillus licheniformis

Uma seqüência de nucleotidios (SEQ ID No. 49) que codifica um lipidio aciltransferase (SEQ ID No. 16, daqui em diante KLM3') foi expressa no Bacillus licheniformis como uma proteina de fusão com o peptídio sinal de Bacillus 10 licheniformis [alfa]-amilase (LAT) (veja figuras 53 e 54) . Para a expressão ótima no Bacillus, uma construção de gene códon-otimizado (no. 052907) foi requerida no Geneart (Geneart AG, Regensburg, Alemanha).

A construção no. 052907 contém um promotor incompleto 15 LAT (apenas a seqüência -10) na frente do gene precursor LAT-KML3' e transcrição LAT a jusante (Tlat) do gene precursor LAT-KLM3' (veja Figs. 53 e 55) . Para criar um fragmento Xhol que contém o gene precursor LAT-KLM3' flanqueado pelo promotor LAT completo na extremidade 5' e o 20 terminador LAT na extremidade 3', foi realizada uma amplificação da reação em cadeia da polimerase (PCR) com os iniciadores Plat5Xhol_FW e EBS2Xhol_RV e a construção de gene 052907 como modelo.

Plat5Xhol_FW:

ccccgctcgaggcttttcttttgqaagaaaatatagqgaaaatggtacttgttaaaaat tc ggaatatttatacaatatcatatgtttcacattgaaagggg EBS2Xhol_RV: tggaatctcqaggttttatcctttaccttgtctcc

PCR foi realizado em um termociclador com Phusion High Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes OY, Espoo, Finlândia) de acordo com as instruções do fabricante (temperatura de anelamento de 55 °C).

O fragmento de PCR resultante foi digerido com a enzima de restrição Xhol e ligado com T4 DNA ligase no plCatH digerido com Xhol de acordo com as instruções do fornecedor (Invitrogen, Carlsbad, calif. EUA).

A mistura de ligação foi transformada em linhagem SC6.1 de B. subtilís conforme o pedido de patente americano US20020182734 (Publicação Internacional WO02/14490). A seqüência do inserto de Xhol contendo o gene precursor LAT- KLM3' foi confirmada pelo sequenciamento de DNA (BaseClear, Leiden, Holanda) e um dos clones de plasmideo correto foi designado plCatH-KLM3' (oril) (Figura 53). plCatH-KLM3' (oril) foi transformado na linhagem BML780 de B. licheniformis (um derivado de BRA7 e BML612, veja o documento W02005111203) na temperatura permissiva (37 °C).

Um transformante de resistência à neomicina (neoR) e resistência à cloranfenicol (CmR) foi selecionado e designado BML780(plCatH-KLM3'(oril)). O plasmideo em BML780(plCatH-KLM3'(oril)) foi integrado na região catH no genoma de B. licheniformis através do crescimento da linhagem em uma temperatura não permissiva (50 °C) em meio com 5 [mu]g/mL de cloranfenicol. Um clone resistente a CmR selecionado e designado BML780-plCatH-KLM3' (oril). BML780- plCatH-KLM3' (oril) foi crescido novamente a uma temperatura permissiva por várias gerações sem antibióticos para seqüências de vetor de saída de Ioop (do inglês, loop-out) e, então, um clone CmR sensível à neomicina (neoS) foi selecionado. Neste clone, as seqüência de vetor de plCatH no cromossomo foram excisadas (incluindo o gene de resistência à neomicina) e apenas o cassete catH-LATKLM3' foi deixado. A seguir, o cassete catH-LATKLM3' no cromossomo foi amplificado pelo crescimento da linhagem no/em meio com concentrações crescentes de cloranfenicol. Após vários ciclos de amplificação, um clone (resistente a 50 [mu]g/mL de cloranfenicol) foi selecionado e designado de BML780-KLM3'CAP50. Para verificar a expressão do KLM3', BML780-KLM3'CAP50 e BML780 (a linhagem hospedeira vazia) foram crescidos por 48 h a 37 0C em uma placa de ágar Heart Infusion (Bacto) com 1 % de tributirina. Uma zona de clareira, indicativa da atividade lipidio aciltransferase, foi claramente visível ao redor da colônia de BML780- KLM3' CAP50, mas não ao redor da linhagem hospedeira de BML780 (veja Figura 56) . Esse resultado mostra que uma quantidade substancial de KLM3' é expressa na linhagem BML780-KLM3'CAP5 0 de B. licheniformis e que essas moléculas de KLM3' são funcionais.

EXEMPLO COMPARATIVO 1 Construção de vetor

A construção de plasmideo é pCS32new N80D, que é um pCCmini derivado que conduz a seqüência que codifica a forma madura da Glicerofosfolipidio-colesterol

aciltransferase de Aeromonas salmonicidas nativas com uma substituição de Asn para Asp na posição 80 (KLM3'), sob controle do promotor p32 e com uma seqüência sinal de CGTase.

A linhagem hospedeira usada para a expressão, está na linhagem 0S21AAprE de Bacillus subtilis.

0 nível de expressão é medido em relação à atividade transferase, expressa como % de colesterol esterificado, calculado a partir da diferença no colesterol livre na amostra de referência e colesterol livre na amostra de enzima nas reações com PC(Tpc) como doador e colesterol como molécula aceptora.

Condições de cultura

5 mL de caldo LB (digestão enzimática de Caseína, 10 g/L; extrato de levedura de baixo-sódio, 5 g/L; Cloreto de Sódio, 5 g/L; comprimidos inertes, 2 g/L) suplementado com 50 mg/L de kanamicina, foi inoculado com uma única colônia e incubado a 30 0C por 6 horas a 205 rpm. 0,7 mL desta cultura foram usados para inocular 50 mL de meio SAS (K2HPO4, 10 g/L; MOPS (ácido 3-morfolinopropano sulfônico), 40 g/l; Cloreto de Sódio, 5 g/L; Antifoam (Sin260), 5 gotas/L; farinha de soja sem gordura, 20 g/L; Biospringer 106 (100 % dw YE) , 20 g/L) suplementado com 50 mg/L de kanamicina e uma solução de hidrolisatos de amido de alta maltose (60 g/L). A incubação foi continuada por 40 horas a 0C e 180 rpm antes do sobrenadante da cultura ser separado por centrifugação a 19000 rpm por 30 min. 0 sobrenadante foi transferido para um tubo limpo e usado diretamente para a medição da atividade transferase. Preparação dos substratos e reação enzimática

PC (Lipidios Polares Avanti #441601) e colesterol (Sigma, C8503) foram pesados na razão de 9:1, dissolvido em clorofórmio, e evaporado até a secura.

O substrato foi preparado através da dispersão de 3 % de PC:Colesterol 9:1 em tampão Hepes 50 mM, pH 7.

0,250 mL da solução de substrato foram transferidos para um tubo de vidro de 3 mL com tampa de rosca. 0,025 mL do sobrenadante da cultura foram adicionados e a mistura foi incubada a 40 0C por 2 horas. Uma amostra de referência com água ao invés de enzima foi também preparada. O aquecimento da mistura reacional em um banho-maria por 10 minutos interrompeu a reação enzimática. 2 mL de etanol 99 % foram adicionados à mistura reacional antes de submetê-la à análise do ensaio do colesterol.

Ensaio do colesterol

100 μΕ de substrato contendo 1,4 U/mL de colesterol oxidase (SERVA Electrophoresis GmbH cat. No. 17109), 0,4 mg/mL ABTS (Sigma A-1888) , 6 U/mL de Peroxidase (sigma 6782) em Tris-HCl 0,1 Μ, pH 6,6 e Triton X-100 (Sigma X- 100) 0,5 % foram incubados a 37 0C por 5 minutos antes de serem adicionados 5 μΕ da amostra da reação enzimática e misturados. A mistura reacional foi incubada por mais 5 minutos e o OD405 foi medido. 0 teor de colesterol foi calculado a partir das análises das soluções padrão de colesterol contendo 0,4 mg/mL, 0,3 mg/mL, 0,30 mg/mL, 0,1 mg/mL, 0,05 mg/mL e 0 mg/mL de colesterol em EtOH 99 %. Resultados

A tabela mostra a media das 8 culturas de expressão separadas.

Linhagem m β -L pc OS21AAprE[pCS32new] 74,2 ± 10, Ib a Tpc é a atividade transferase, expressa como % de colesterol esterificado, calculado a partir da diferença de colesterol livre na amostra de referência e colesterol livre na amostra da enzima nas reações com PC como molécula doadora e colesterol como molécula aceptora. b Média das 8 culturas de expressão separada.

Todas as publicações mencionadas na especificação acima são aqui incorporadas por referência. Várias modificações e variações dos métodos descritos e sistema da presente invenção serão aparentes para aquele versado na técnica sem sair do escopo e espírito da invenção. Embora a invenção tenha sido descrita em conexão com as modalidades específicas preferidas, deve-se compreender que a invenção conforme reivindicada não deve ser indevidamente limitada a tais modalidades específicas. De fato, várias modificações dos modos descritos para a realização da invenção que são evidentes para aqueles versados na técnica em bioquímica e biotecnologia ou áreas afins se destinam a estar no âmbito do escopo das reivindicações a seguir.

Claims (35)

1. Método para a produção de um lipidio aciltransferase caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: (i) fornecer uma célula de Bacillus licheniformis ; (ii) transformar a célula de Bacillus licheniformis com uma seqüência de nucleotidios heteróloga que codifica um lipidio aciltransferase; e (iii) expressar o lipidio aciltransferase na célula sob o controle de uma seqüência promotora.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de a seqüência promotora não estar associada de forma nativa com a seqüência de nucleotidios que codifica um lipidio aciltransferase.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de a seqüência de nucleotidios que codifica um peptídeo sinal ser ligada de forma operável à dita seqüência de nucleotidios heteróloga que codifica um lipidio aciltransferase.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo fato de o dito método compreender a etapa adicional de isolamento / recuperação do lipidio aciltransferase.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo fato de a seqüência promotora ser homóloga à célula hospedeira.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizado pelo fato de a dita seqüência promotora ser selecionada a partir do grupo consistindo de uma seqüência promotora de α-amilase, uma seqüência promotora de protease, uma seqüência promotora de subtilisina, uma seqüência promotora específica de ácido glutâmico e uma seqüência promotora de levanasacarase.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, caracterizado pelo fato de a dita seqüência promotora ser a seqüência promotora de a-amilase.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, caracterizado pelo fato de a seqüência de nucleotidios que codifica um lipidio aciltransferase codificar um lipidio aciltransferase que compreende um motif GDSx e/ou um motif GANDY.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, caracterizado pelo fato de a seqüência de nucleotidios que codifica um lipidio aciltransferase codificar um lipidio aciltransferase que é caracterizado como uma enzima que possui atividade aciltransferase e que compreende a seqüência de aminoácidos motif GDSX, onde X é um ou mais dos seguintes resíduos de aminoácidos: L, A, V, I,F, Y, H, Q, T, N, M ou S.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, caracterizado pelo fato de a seqüência de nucleotidios que codifica um lipidio aciltransferase codificar um lipidio aciltransferase que é obtido a partir de um organismo de um ou mais dos seguintes gêneros: Aeromonas, Streptomyces, Saccharomyces, Lactococcus, Myeobaeterium, Streptoeoceus, Lactobacillus, Desulfitobaeterium, Baeillus, Campylobaeter, Vibrionaeeae, Xylella, Sulfolobus, Aspergillus, Schizosaceharomyees, Listeria, Neisseria, Mesorhizobium, Ralstonia, Xanthomonas e Candida.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 10, caracterizado pelo fato de a seqüência de nucleotidios que codifica um lipidio aciltransferase codificar um lipidio aciltransferase que é obtido a partir de um organismo do gênero Aeromonas.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 11, caracterizado pelo fato de a seqüência de nucleotidios que codifica um lipidio aciltransferase codificar um lipidio aciltransferase que compreende um residuo de ácido aspártico em uma posição correspondente à N-80 na seqüência de aminoácidos do lipidio aciltransferase de Aeromonas hydrophila mostrada como SEQ ID No. 35.

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 12, caracterizado pelo fato de a seqüência de nucleotidios que codifica um lipidio aciltransferase codificar um lipidio aciltransferase que compreende a seqüência de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 16, ou seqüência de aminoácidos que tem pelo menos 75 % de homologia a esta.

14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 13, caracterizado pelo fato de a seqüência de nucleotidios que codifica um lipidio aciltransferase codificar um lipidio aciltransferase que compreende a seqüência de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 16.

15. Célula hospedeira do Bacillus licheniformis caracterizada pelo fato de compreender uma seqüência de nucleotidios que codifica um lipidio aciltransferase heterólogo.

16. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de a seqüência de nucleotidios que codifica um lipidio aciltransferase codificar um lipidio aciltransferase que compreende um motif GDSx e/ou um motif GANDY.

17. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 15 ou reivindicação 16, caracterizada pelo fato de a seqüência de nucleotidios que codifica um lipidio aciltransferase codificar um lipidio aciltransferase que é caracterizado como uma enzima que possui atividade aciltransferase e que compreende a seqüência de aminoácidos de motif GDSX, onde X é um ou mais dos seguintes resíduos de aminoácidos: L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M ou S.

18. Célula hospedeira de acordo com qualquer uma das reivindicações de 15 a 17, caracterizada pelo fato de o lipidio aciltransferase ser obtido a partir de um organismo de um ou mais dos seguintes gêneros: Aeromonas, Streptomyces, Saccharomyees, Lactoeoceus, Myeobaeterium, Streptoeoecus, Laetobaeillus, Desulfitobaeterium, Baeillus, Campylobaeter, Vibrionaeeae, Xylella, Sulfolobusf Aspergillus, Sehizosaceharomyees, Listeria, Neisseria, Mesorhizobium, Ralstonia, Xanthomonas e Candida.

19. Célula hospedeira de acordo com qualquer uma das reivindicações de 15 a 17, caracterizada pelo fato de a seqüência de nucleotidios que codifica um lipidio aciltransferase codificar um lipidio aciltransferase que é obtido a partir de um organismo do gênero Aeromonas.

20. Célula hospedeira de acordo com qualquer uma das reivindicações de 15 a 19, caracterizada pelo fato de a seqüência de nucleotidios que codifica um lipidio aciltransferase codificar um lipidio aciltransferase que compreende um resíduo de ácido aspártico em uma posição correspondente à N-80 na seqüência de aminoácidos do lipidio aciltransferase de Aeromonas hydrophila mostrada como SEQ ID No. 35.

21. Célula hospedeira de acordo com qualquer uma das reivindicações de 15 a 20, caracterizada pelo fato de a seqüência de nucleotidios que codifica um lipidio aciltransferase codificar um lipidio aciltransferase que compreende a seqüência de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 16, ou seqüência de aminoácidos que tem pelo menos 75 % ou mais de homologia a esta.

22. Cél ula hospedeira de acordo com qualquer uma das reivindicações de 15 a 21, caracterizada pelo fato de a seqüência de nucleotidios que codifica um lipidio aciltransferase codificar um lipidio aciltransferase que compreende a seqüência de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 16.

23. Uso de uma célula hospedeira de Bacillus licheniformis caracterizado pelo fato de ser na produção de um lipidio aciltransferase heterólogo.

24. Uso de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de existir uma expressão aumentada quando comparada com a expressão em uma célula hospedeira de B. subtilis.

25. Vetor de expressão caracterizado pelo fato de compreender uma seqüência de nucleotidios que codifica um lipidio aciltransferase ligado de forma operável a uma seqüência promotora homologa à B. licheniformis.

26. Vetor de expressão de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de o promotor não estar associado de forma nativa com a seqüência de nucleotidios que codifica um lipidio aciltransferase.

27. Vetor de expressão de acordo com a reivindicação 25 ou a reivindicação 2 6, caracterizado pelo fato de uma seqüência de nucleotidios que codifica um peptídeo sinal ser ligada de forma operável à dita seqüência de nucleotidios heteróloga que codifica um lipidio aciltransferase.

28. Vetor de expressão de acordo com qualquer uma das reivindicações de 2 5 a 27, caracterizado pelo fato de a dita seqüência promotora ser selecionada a partir do grupo consistindo de uma seqüência promotora de α-amilase, uma seqüência promotora de protease, uma seqüência promotora de subtilisina, uma seqüência promotora especifica de ácido glutâmico e uma seqüência promotora de levanasacarase.

29. Vetor de expressão de acordo com qualquer uma das reivindicações de 2 5 a 28, caracterizado pelo fato de a dita seqüência promotora ser a seqüência promotora de a- amilase.

30. Método para a produção de um lipidio aciltransferase caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: (i) fornecer uma célula de Bacillus, onde a célula de Bacillus é uma outra que não a B. subtilis; (ii) transformar a célula de Bacillus, onde a célula de Bacillus é um outra que não a B. subtilis com uma seqüência de nucleotidios heteróloga que codifica um lipidio aciltransferase; e (iii) expressar o lipidio aciltransferase na célula sob o controle de uma seqüência promotora.

31. Célula hospedeira de Bacillus caracterizada pelo fato de a célula de Bacillus ser uma outra que não de B. subtilis compreendendo uma seqüência de nucleotidios que codifica um lipidio aciltransferase heterólogo.

32. Uso de uma célula hospedeira de Bacillus caracterizado pelo fato de a célula hospedeira de Bacillus é uma outra que não de B. subtilis na produção de um lipidio aciltransferase heterólogo.

33. Uso caracterizado pelo fato de ser conforme substancialmente descrito antes em referência aos Exemplos e Figuras.

34. Vetor de expressão caracterizado pelo fato de ser conforme substancialmente descrito antes em referência aos Exemplos e Figuras.

35. Célula hospedeira do Bacillus licheniformis caracterizada pelo fato de ser conforme substancialmente descrito antes em referência aos Exemplos e Figuras.