JP5697294B2 - 糖脂質アシル基転移酵素変異体及びその製造方法 - Google Patents
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Description
アミノ酸セット1:
アミノ酸セット1(これらは1IVN中のアミノ酸であることに留意されたい−図57及び図58)。
Gly8、Asp9、Ser10、Leu11、Ser12、Tyr15、Gly44、Asp45、Thr46、Glu69、Leu70、Gly71、Gly72、Asn73、Asp74、Gly75、Leu76、Gln106、Ile107、Arg108、Leu109、Pro110、Tyr113、Phe121、Phe139、Phe140、Met141、Tyr145、Met151、Asp154、His157、Gly155、Ile156、Pro158
アミノ酸セット2(アミノ酸の番号付与は、P10480成熟配列中のアミノ酸を参照したものであることに留意されたい)。
Leu17、Lys22、Met23、Gly40、Asn80、Pro81、Lys82、Asn87、Asn88、Trp111、Val112、Ala114、Tyr117、Leu118、Pro156、Gly159、Gln160、Asn161、Pro162、Ser163、Ala164、Arg165、Ser166、Gln167、Lys168、Val169、Val170、Glu171、Ala172、Tyr179、His180、Asn181、Met209、Leu210、Arg211、Asn215、Lys284、Met285、Gln289及びVal290。
アミノ酸セット3はセット2と同一であるが、アエロモナス サルモニシダ(Aeromonas salmonicida)(配列番号28)コード配列を指す。すなわち、アミノ酸残基番号は、シグナル配列を含むタンパク質(配列番号28)と比較した成熟タンパク質(配列番号2)中のアミノ酸番号付与の差を反映して、セット3が18大きい。
アミノ酸セット4はS3、Q182、E309、S310及び−318である。
F13S、D15N、S18G、S18V、Y30F、D116N、D116E、D157 N、Y226F、D228N Y230F。
アミノ酸セット6は、Ser3、Leu17、Lys22、Met23、Gly40、Asn80、Pro81、Lys82、Asn 87、Asn88、Trp111、Val112、Ala114、Tyr117、Leu118、Pro156、Gly159、Gln160、Asn161、Pro162、Ser163、Ala164、Arg165、Ser166、Gln167、Lys168、Val169、Val170、Glu171、Ala172、Tyr179、His180、Asn181、Gln182、Met209、Leu210、Arg211、Asn215、Lys284、Met285、Gln289、Val290、Glu309、Ser310、−318である。
アミノ酸セット7は、Ser3、Leu17、Lys22、Met23、Gly40、Asn80、Pro81、Lys82、Asn 87、Asn88、Trp111、Val112、Ala114、Tyr117、Leu118、Pro156、Gly159、Gln160、Asn161、Pro162、Ser163、Ala164、Arg165、Ser166、Gln167、Lys168、Val169、Val170、Glu171、Ala172、Tyr179、His180、Asn181、Gln182、Met209、Leu210、Arg211、Asn215、Lys284、Met285、Gln289、Val290、Glu309、Ser310、−318、Y30X(ここで、Xは、A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V又はWから選択される)、Y226X(ここで、Xは、A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V又はWから選択される)、Y230X(ここで、Xは、A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V又はWから選択される)、S18X(ここで、Xは、A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、W又はYから選択される)、D157X(ここで、Xは、A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W又はYから選択される)である。
(i)ガラクト脂質基質からの転移酵素活性、及び
(ii)リン脂質基質からの転移酵素活性、
について脂質アシル基転移酵素変異体を試験するステップと、
親酵素と比較したときに、ガラクト脂質からの転移酵素活性とリン脂質からの転移酵素活性との比が大きい酵素変異体を選択するステップと
を含むことができる。1個又は複数
(a)ガラクト脂質基質からの転移酵素活性、及び
(b)ガラクト脂質基質に対する加水分解活性
について脂質アシル基転移酵素変異体を試験するステップと、
ガラクト脂質からの転移酵素活性と糖脂質に対するその加水分解活性との比が親酵素よりも大きい酵素変異体を選択するステップ
を含むことができる。
S3E、A、G、K、M、Y、R、P、N、T又はG
E309Q、R又はA、好ましくはQ又はR
−318Y、H、S又はY、好ましくはY
の1個又は複数を含む。
1)構造的相同性マッピング、又は
2)配列相同性アラインメント
の1個又は複数を含むことが好ましい。
i)親配列を図52の構造モデル(1IVN.PDB)とアラインメントさせるステップ、
ii)(セット1又はセット2に規定されるアミノ酸残基の1個又は複数などの)活性部位中のグリセリン分子の中心炭素原子上に中心を置く10Åの球内の1個又は複数のアミノ酸残基を選択するステップ(図53参照)、及び
iii)前記親配列においてステップ(ii)に従って選択された1個又は複数のアミノ酸を改変するステップ
の1つ又は複数を含むことができる。
i)親配列を図52の構造モデル(1IVN.PDB)とアラインメントさせるステップ、
ii)(セット1又はセット2に規定されるアミノ酸残基の1個又は複数などの)活性部位中のグリセリン分子の中心炭素原子上に中心を置く10Åの球内の1個又は複数のアミノ酸を選択するステップ(図53参照)、
iii)ステップ(ii)によって選択された1個又は複数のアミノ酸残基が高度に保存されている(特に、活性部位残基及び/又はGDSxモチーフの一部及び/又はGANDYモチーフの一部である)かどうかを求めるステップ、並びに
iv)前記親配列中のステップ(iii)によって特定された保存領域を除いて、ステップ(ii)によって選択された1個又は複数のアミノ酸を改変するステップ
の1つ又は複数を含むことができる。
i)親配列を図52の構造モデル(1IVN.PDB)とアラインメントさせるステップ、
ii)(セット1又はセット2に規定されるアミノ酸残基の1個又は複数などの)活性部位中のグリセリン分子の中心炭素原子上に中心を置く10Åの球内で1個又は複数のアミノ酸残基を選択するステップ(図53参照)及び/或いはIVR1〜6内で(好ましくはIVR3、5又は6内で、より好ましくはIVR5又はIVR6内で)1個又は複数のアミノ酸残基を選択するステップ)及び/或いはLR1〜5内で(好ましくはLR1、LR2又はLR5内で、より好ましくはLR5内で)1個又は複数のアミノ酸残基を選択するステップ、並びに
iii)前記親配列においてステップ(ii)に従って選択された1個又は複数のアミノ酸を改変するステップ
の1つ又は複数を含むことができる。
i)親配列を図52の構造モデル(1IVN.PDB)とアラインメントさせるステップ、
ii)(セット1又はセット2に規定されるアミノ酸残基の1個又は複数などの)活性部位中のグリセリン分子の中心炭素原子上に中心を置く10Åの球内で1個又は複数のアミノ酸を選択するステップ(図53参照)及び/或いはIVR1〜6内で(好ましくはIVR3、5又は6内で、より好ましくはIVR5又はIVR6内で)1個又は複数のアミノ酸残基を選択するステップ)及び/或いはLR1〜5内で(好ましくはLR1、LR2又はLR5内で、より好ましくはLR5内で)1個又は複数のアミノ酸残基を選択するステップ、
iii)ステップ(ii)によって選択された1個又は複数のアミノ酸残基が高度に保存されている(特に、活性部位残基及び/又はGDSxモチーフの一部及び/又はGANDYモチーフの一部である)かどうかを求めるステップ、並びに
前記親配列中のステップ(iii)によって特定された保存領域を除いて、ステップ(ii)によって選択された1個又は複数のアミノ酸を改変するステップ
の1つ又は複数を含むことができる。
i)第1の親脂質アシル基転移酵素を選択するステップ、
ii)望ましい活性を有する第2の関連脂質アシル基転移酵素を特定するステップ、
iii)前記第1の親脂質アシル基転移酵素と前記第2の関連脂質アシル基転移酵素とをアラインメントさせるステップ、
iv)前記2つの配列間で異なるアミノ酸残基を特定するステップ、及び
v)前記親脂質アシル基転移酵素中のステップ(iv)によって特定されたアミノ酸残基の1個又は複数を改変するステップ
の1つ又は複数を含むことができる。
i)第1の親脂質アシル基転移酵素を選択するステップ、
ii)望ましい活性を有する第2の関連脂質アシル基転移酵素を特定するステップ、
iii)前記第1の親脂質アシル基転移酵素と前記第2の関連脂質アシル基転移酵素とをアラインメントさせるステップ、
iv)前記2つの配列間で異なるアミノ酸残基を特定するステップ、
v)ステップ(iv)によって選択された1個又は複数のアミノ酸残基が高度に保存されている(特に、活性部位残基及び/又はGDSxモチーフの一部及び/又はGANDYモチーフの一部である)かどうかを求めるステップ、並びに
vi)前記親配列中のステップ(v)によって特定された保存領域を除いて、ステップ(iv)によって特定されたアミノ酸残基の1個又は複数を改変するステップ
の1つ又は複数を含むことができる。
S3A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W、又はY;及び/又はL17A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、又はY;及び/又は
S18A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、W、又はY;及び/又は
K22A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、又はY;及び/又は
M23A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W、又はY;及び/又は
Y30A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、又はW;及び/又は
G40A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、又はY;及び/又は
N80A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、又はY;及び/又は
P81A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、又はY;及び/又は
K82A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、又はY;及び/又は
N87A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、又はY;及び/又は
N88A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、又はY;及び/又は
W111A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W又はY;及び/又は
V112A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W、又はY;及び/又は
A114C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、又はY;及び/又は
Y117A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、又はW;及び/又は
L118A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、又はY;及び/又は
P156A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、又はY;及び/又は
D157A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、又はY;及び/又は
G159A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、又はY;及び/又は
Q160A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W、又はY;及び/又は
N161A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M P、Q、R、S、T、V、W、又はY;及び/又は
P162A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、又はY;及び/又は
S163A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W、又はY;及び/又は
A164C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、又はY;及び/又は
R165A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、W、又はY;及び/又は
S166A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W、又はY;及び/又は
Q167A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W、又はY;及び/又は
K168A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、又はY;及び/又は
V169A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W、又はY;及び/又は
V170A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W、又はY;及び/又は
E171A、C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、又はY;及び/又は
A172C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、又はY;及び/又は
Y179A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、又はW;及び/又は
H180A、C、D、E、F、G、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、又はY;及び/又は
N181A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、又はY;及び/又は
Q182A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W、又はY、好ましくはK;及び/又は
M209A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W、又はY;及び/又は
L210 A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、又はY;及び/又は
R211 A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、又はY;及び/又は
N215 A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、又はY;及び/又は
Y226A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、又はW;及び/又は
Y230A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V又はW;及び/又は
K284A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、又はY;及び/又は
M285A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W、又はY;及び/又は
Q289A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W、又はY;及び/又は
V290A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W、又はY;及び/又は
E309A、C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、又はY;及び/又は
S310A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W、又はY
の1個又は複数を含むことが好ましい。
1)(実施例8に示される)%TDG/TPCとして計算される、PCよりもガラクト脂質(DG)に対する高い相対転移酵素活性
2)(実施例8に示される)ガラクト脂質(DG)に対する高い絶対転移酵素活性
3)(実施例8に示される)ガラクト脂質(DG)に対する加水分解活性HDGに比べてガラクト脂質を供与体として用いた高い転移酵素活性(TDG)
4)(実施例8に示される)PCに対する高い絶対転移酵素活性
の1個又は複数を有することができる。
S3A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W又はY、好ましくはM、R、N、G、T、Q、P、Y、S、L、E、W、最も好ましくはQ
K22A、E、C、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W又はY、好ましくはA、C、E又はR
Y30A、C、D、H、K、M、N、P、Q、R、T、V、W、G、I、L、S、M、A、R又はE、好ましくはH、T、W、N、D、C、Q G、I、L、S、M、A、R又はE
G40 L、N、T、V又はA
N80N、R、D、A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、S、T、V、W又はY、好ましくはH、I、Y、C、Q、M、S、W、L、N、R、D又はF
P81A、C、D、E、F、G H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W又はY、好ましくはI、M、F、G、V、Y、D、C又はA
K82A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W又はY、好ましくはH、K、S又はR
N87A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W又はY、好ましくはI、Y、M、T、Q、S、W、F、V又はP
N88A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W又はY、好ましくはC、V、A又はF
V112C
Y117A、C、D、E、F、H、T、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、V又はW、好ましくはA、N、E、H、T、I、F、C、P又はS
L118A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、又はY、好ましくはF
V112A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W又はY、好ましくはI、M、F、Y、N、E、T、Q、H又はP
Y179A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V又はW、好ましくはF、C、H、I、L、M、P、V又はW
H180K、Q、A、C、D、E、F、G、I、L、M、P、R、S、T、V、W、又はY、好ましくはM、F、C、K又はQ
N181A又はV
Q182A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、又はY、好ましくはK
M209L、K、M、A、C、D、E、F、G、H、I、N、P、Q、R、S、T、V、W、又はY、好ましくはI、F、T、D、C、H、L、K、M又はP
L210 G、I、H、E、M、S、W、V、A、R、N、D、Q、T、C、F、K、P又はY、好ましくはG、I、H、E、M、S、W、V、A、R、N、D、Q、T、Y又はF
R211G、Q、K、D、A、C、E、F、H、I、L、M、N、P、R、S、T、V、W又はY、好ましくはG、Q、K、D、H、I、M、F、P、S、Y、N、C、L又はW
N215A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W又はY、好ましくはI、F、P、T、W、H又はA
Y230A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V又はW、好ましくはI、T、G、D、R、E、V、M又はS、最も好ましくはI、D、R又はE
Q289A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W又はY、好ましくはF、W、H、I、Y、L、D、C、K、V、E、G、R、N又はP、より好ましくはR、T、D、K、N又はP
V290A、C、D、E、H、F、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W又はY;
E309S、Q、R、A、C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、P、T、V、W又はY、好ましくはF、W、N、H、I、M、S、Q、R、A又はY
S310A、P、T、H、M、K、G、C、D、E、F、I、L、N、Q、R、V、W又はY、好ましくはF、Y、C、L、K、A、P、T、H、M、K又はG
−318 A、C、D、E、F、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W、Y、H又はS
の1個又は複数が好ましいことがある。
S3A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W又はY、好ましくはM、R、N、G、T、Q、P、Y、S、L、E、W、最も好ましくはQ
G40 L、N、T、V又はA
K82A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W又はY、好ましくはH、K、S又はR
N88A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W又はY、好ましくはC、V、A又はF
Y230A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V又はW、好ましくはI、T、G、D、R、E、V、M又はS、最も好ましくはD、R又はE
Q289A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W又はY、好ましくはF、W、H、I、Y、L、D、C、K、V、E、G又はP、より好ましくはR、T、D、K又はP
の1個又は複数は、%TDG/TPCとして計算される、PCよりもDGに対して高い相対転移酵素活性を有する酵素変異体をもたらし得る。
−318 Y、H又はS
N215H
L210G、I、H、E、M、S、W、V、A、R、N、D、Q又はT
S310A、P、T、H、M、K又はG
E309S、Q、A又はR
H180K、T又はQ
N80N、R又はD
V112C
Y30G、I、L、S、M、A、R又はE、より好ましくはY30M、A又はR
V290R、E、H又はA
Q289R、T、D又はN
K22E
G40L
Y179V又はR
M209L、K又はM
L211G、Q、K又はD
Y230V
G40Q、L又はV
N88W
N87R又はD
の1個又は複数を改変すると、%TDG/TPCとして計算される、PCよりもDGに対して高い相対転移酵素活性を有する酵素変異体がもたらされる。
K22A又はC
P81G
N87 M
Y117A、N、E、H又はT
N181A又はV
Y230I
V290H
N87R、D、E又はM
Q182T
も適切であり得る。
−318 Y、H又はS、最も好ましくはY
N215H
L210D、Q又はT
E309Q又はR
H180K又はQ
N80N、R又はD
の1個又は複数が好ましい。
−318、N215、L210、S310、E309、H180、N80、V112、Y30X(ここで、Xは、A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V又はWから選択される)、V290、Q 289、K22、G40、Y179、M209、L211、K22、P81、N87、Y117、N181、Y230X(ここで、Xは、A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V又はWから選択される)、V290、N87、Q182、S3、S310、K82、A309の1個又は複数を改変すると、DGに対して高い絶対転移酵素活性を有する変異体がもたらされ得る。
−318Y、H、S、A、C、D、E、F、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V又はW、好ましくはY、H、S又はI
N215A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W又はY;好ましくはH、I、F、P、T、W又はA、最も好ましくはH、S、L、R、Y
L210G、I、H、E、M、S、W、V、A、R、N、D、Q、T、C、F、K、P又はY、好ましくはD、Q、T、Y又はF
S310A、P、T、H、M、K、G、C、D、E、F、I、L、N、Q、R、V、W又はY、好ましくはF、Y、C、L、K又はP、
E309S、Q、R、A、C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、P、S、T、V、W又はY;好ましくはS、Q、R、F、W、N、H、I、M又はY、最も好ましくはS、Q、R、N、P又はA
H180A、C、D、E、F、G、I、K、Q L、M、P、R、S、T、V、W又はY;好ましくはK、Q、M、F又はC、最も好ましくはT、K又はQ
N181A又はV
N80N、R、D、A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、S、T、V、W又はY、好ましくはH、I、Y、C、Q、M、S、W、L、N、R、D又はF、最も好ましくはN、R、D、P、V、A又はG
V112A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W又はY;好ましくはI、M、F、Y、N、E、T、Q、H又はP
Y30G、I、L、S、A、E、C、D、H、K、M、N、P、Q、R、T、V又はW、好ましくはH、T、W、N、D、C又はQ
V290A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W又はY;
Q289A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W又はY;好ましくはR、E、G、P、N又はR
K22A、C、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W又はY、好ましくはC
Y179A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V又はW;好ましくはF、C、H、I、L、M、P又はW、より好ましくはE、R、N、V、K、S
M209A、C、D、E、F、G、H、I、L、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W又はY;好ましくはR、N、Y、E又はV
R211A、C、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、K、D、R、S、T、V、W又はY、好ましくはH、I、M、F、P、S、Y、N、C、L又はW、最も好ましくはR
S310 C、D、E、F、I、L、N、Q、R、V、W又はY、好ましくはF、Y、C、L、K又はP
S3A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W又はY、好ましくはM、R、N、A、G、T、Q、P、Y又はS 最も好ましくはQ又はN
K82A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W又はY、好ましくはH、K、S、E又はR
P81A、C、D、E、F、G,H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W又はY;好ましくはI、M、F、V、Y、D、C又はA
N87A、C、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、D、E、S、T、V、W又はY;好ましくはL、G又はA
Y117A、N、E、H、T、C、D、F、G、I、K、L、M、P、Q、R、S、V又はW;好ましくはI、F、C、P又はS
N87A、C、F、G、H、I、K、L、P、Q、S、T、V、W又はY;好ましくはI、Y、T、Q、S、W、F、V又はP
Q182A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W又はY、好ましくはD又はK
Y230A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V又はW、好ましくはW、H、Q、L、P又はC、最も好ましくはT又はG
D157A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W又はY、好ましくはC
G40L
Y226I
の1個又は複数は、DGに対して高い絶対転移酵素活性を有する変異体をもたらし得る。
−318 Y、H又はS
N215H
L210G、I、H、E、M、S、W、V、A、R、N、D、Q又はT
S310A、P、T、H、M、K又はG
E309S、Q又はR
H180K又はQ
N80N、R又はD
V112C
Y30G、I、L、S、M、A、R又はE、より好ましくはY30M、A又はR
V290R、E、H又はA
Q289R又はN
K22E
G40L
Y179V
M209L、K又はM
L211G、Q、K又はD
の1個又は複数が好ましい。
K22A又はC
P81G
N87 M
Y117A、N、E、H又はT
N181A又はV
Y230 I
V290H
N87R、D、E又はM
Q182T
も適切であり得る。
−318 Y、H又はS、最も好ましくはY
N215H
L210D、Q又はT
E309Q又はR
H180K又はQ
N80N、R又はD
の1個又は複数が好ましい。
Y230、S310、H180、Q289、G40、N88、Y179、N215、L210、N80、Y30X(ここで、Xは、A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V又はWから選択される)、N87、M209、R211、S18X(ここで、Xは、A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、W又はYから特異的に選択される)
の1個又は複数における改変は、DGに対して加水分解活性HDGよりも高い転移酵素活性TDGを有する酵素変異体をもたらし得る。
Y230A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T又はW、好ましくはW、H、Q、L、P又はC
S310A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、T、V、W又はY、好ましくはF、Y、C、L、K又はP
Y179A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、又はW、好ましくはF、C、H、I、L、M、P又はW
H180A、C、D、E、F、G、I、K、L、M、P、Q、R、S、V、W又はY、好ましくはM、F又はC
Q289A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、V、W又はY;好ましくはF、W、H、I、Y、L、D、C、K、V、E、G又はP
G40A、C、D、E、F、H、I、K、M、N、P、R、S、T、W又はY;好ましくはI、P、W又はY
N88A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V又はY;好ましくはI又はH
N87A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、S、T、V、W又はY;好ましくはI、Y、T、Q、S、W、F、V又はP
の1個又は複数は、DGに対して加水分解活性HDGよりも高い転移酵素活性TDGを有する酵素変異体をもたらし得る。
Y179 E、R、N又はQ
N215G
L210D、H、R、E、A、Q、P、N、K、G、R、T、W、I、V又はS
N80G
Y30L
N87G
の1個又は複数が好ましい(かかる酵素変異体は、低い加水分解活性(ガラクト脂質及び/又はリン脂質)及び/又はガラクト脂質からの高い転移酵素活性を有することができる。
Y179 E、R、N、Q
N215 G
L210 D、H、R、E、A、Q、P、N、K、G、R、T、W、I、V及びS
N80 G
Y30 L
N87 G
H180 I、T
M209 Y
R211 D、T及びG
S18 G、M及びT
G40 R及びM
N88 W
N87 C、D、R、E及びG
の1個又は複数が好ましい(かかる酵素変異体は低い加水分解活性(ガラクト脂質及び/又はリン脂質)を有しつつ、ガラクト脂質からのかなりの転移酵素活性を保持することができる。
S3、D157、S310、E309、Y179、N215、K22、Q289、M23、H180、M209、L210、R211、P81、V112、N80、L82、N88;N87
の1個又は複数を改変すると、リン脂質に対して高い絶対転移酵素活性を有する酵素変異体がもたらされ得る。
S3A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W又はY;好ましくはN、E、K、R、A、P又はM、最も好ましくはS3A
D157A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W又はY ;好ましくはD157S、R、E、N、G、T、V、Q、K又はC
S310A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W又はY;好ましくはS310T
−318 E
E309A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W又はY;好ましくはE309 R、E、L、R又はA
Y179A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V又はW;好ましくはY179 D、T、E、R、N、V、K、Q又はS、より好ましくはE、R、N、V、K又はQ
N215A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W又はY;好ましくはN215 S、L、R又はY
K22A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W又はY;好ましくはK22 E、R、C又はA
Q289A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W又はY;好ましくはQ289 R、E、G、P又はN
M23A、C、D、E、F、G、H、I、K、L N、P、Q、R、S、T、V、W又はY;好ましくはM23 K、Q、L、G、T又はS
H180A、C、D、E、F、G、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W又はY;好ましくはH180 Q、R又はK
M209 A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W又はY;好ましくはM209 Q、S、R、A、N、Y、E、V又はL
L210A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W又はY;好ましくはL210 R、A、V、S、T、I、W又はM
R211A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、W又はY;好ましくはR211T
P81A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W又はY;好ましくはP81G
V112A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W又はY;好ましくはV112C
N80A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W又はY;好ましくはN80 R、G、N、D、P、T、E、V、A又はG
L82A、C、D、E、F、G、H、I、M、N、P、Q、R、S、T、V、W又はY;好ましくはL82N、S又はE
N88A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W又はY;好ましくはN88C
N87A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W又はY;好ましくはN87M又はG
の1個又は複数から選択することができる。
S3 N、R、A、G
M23 K、Q、L、G、T、S
H180 R
L82 G
Y179 E、R、N、V、K又はQ
E309 R、S、L又はA
の1個又は複数を改変すると、リン脂質に対して高い絶対転移酵素活性を有する酵素変異体がもたらされる。
−318 Y、H又はS
N215H
L210G、I、H、E、M、S、W、V、A、R、N、D、Q又はT
S310A、P、T、H、M、K又はG
E309S、A、Q又はR
H180K又はQ
N80N、R又はD
V112C
Y30G、I、L、S、M、A、R又はE、より好ましくはY30M、A又はR
V290R、E、H又はA
Q289R又はN
K22E
G40L
Y179V
M209L、K又はM
L211G、Q、K又はD
の1個又は複数が好ましい。
K22A又はC
P81G
N87 M
Y117A、N、E、H又はT
N181A又はV
Y230I
V290H
N87R、D、E又はM
Q182T
も適切であり得る。
−318 Y、H又はS、最も好ましくはY
N215H
L210D、Q又はT
E309Q又はR
H180K又はQ
N80N、R又はD
の1個又は複数が好ましい。
N215H & −318Y
N215H & L210D、Q、又はT
−318Y & L210、D、Q、又はT
N215H & −318Y & L210D、Q、又はT
E309A、Q又はR。
N215H & −318Y、H、又はS、好ましくはY。
L210D、Q又はT & −318Y、H、又はS、好ましくはY。
N215H & E309A、Q又はR
L210D、Q又はT & E309A、Q又はR
−318Y & E309A、Q又はR
の1個又は複数は、ガラクト脂質基質(DGDG)からの高い転移酵素活性を有することができ、且つ/又はガラクト脂質転移酵素活性とリン脂質転移酵素活性の比が増加し得る。
N215H & N80G
−318Y & N80G
L210D又はQ & N80G
N215H & N88N
−318Y & N88N
L210D又はQ & N88N
N215H & Y30L
−318Y & Y30L
L210D又はQ & Y30L
N215H & N87G
−318Y & N87G
L210D又はQ & N87G
N215H & Y179E、R、N又はQ
−318Y & Y179 E、R、N又はQ
L210D又はQ & Y179 E、R、N又はQ
i)3−ベータヒドロキシ基若しくは3−アルファヒドロキシ基、及び/又は
ii)シス位におけるA:B環若しくはトランス位におけるA:B環若しくはC5−C6が不飽和である
の1つ又は複数を含むことができる。
(i)本酵素は、脂質アシル供与体の本来のエステル結合のアシル部分がアシル受容体に転移して新しいエステルを形成するエステル転移活性として定義することができるアシル基転移酵素活性を有する。
(ii)本酵素は、アミノ酸配列モチーフGDSX(ここで、Xは以下のアミノ酸残基L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M又はSの1個又は複数である)を含む。
HYPERLINK "http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list#uids=12230032&dopt=Abstract" http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list#uids=12230032&dopt=Abstract
HYPERLINK "http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list#uids=11752314&dopt=Abstract" http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list#uids=11752314&dopt=Abstract
HYPERLINK "http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/index.shtml" http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/index.shtml
HYPERLINK "http://pfam.wustl.edu/" http://pfam.wustl.edu/
HYPERLINK "http://pfam.jouy.inra.fr/" http://pfam.jouy.inra.fr/
HYPERLINK "http://pfam.cgb.ki.se/" http://pfam.cgb.ki.se/
a)手引書
上記手順に従って、目的タンパク質とPfam00657コンセンサス配列とのアラインメント及びP10480とPfam00657コンセンサス配列とのアラインメントを得る;
又は
b)データベースによって
データベースは、Pfam00657コンセンサス配列の特定後に、検索配列のアラインメントをPfam00657コンセンサス配列のシードアラインメントに示す選択肢を提供する。P10480はこのシードアラインメントの一部であり、GCAT_AERHYで示される。検索配列とP10480の両方は同じ枠内に示される。
によって得ることができる。
アエロモナス ヒドロフィラGDSXリパーゼの残基は、NCBIファイルP10480中で番号付与されている。本文中の番号は、好ましい実施形態において本発明の脂質アシル基転移酵素中に存在する特定のアミノ酸残基を求めるために本発明において使用されるファイル中の番号である。
ブロック1 − GDSXブロック
hid hid hid hid Gly Asp Ser hid
28 29 30 31 32 33 34 35
ブロック2 − GANDYブロック
hid Gly hid Asn Asp hid
130 131 132 133 134 135
ブロック3 − HPTブロック
His
309
(i)本酵素は、脂質アシル供与体の最初のエステル結合のアシル部分がアシル受容体に転移して新しいエステルを形成するエステル転移活性として定義することができるアシル基転移酵素活性を有する。
(ii)本酵素は、アミノ酸配列モチーフGDSX(ここで、Xは以下のアミノ酸残基L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M又はSの1個又は複数である)を含む。
(iii)本酵素は、His−309を含み、又は図2(配列番号2又は配列番号26)に示されるアエロモナス ヒドロフィラ脂肪分解酵素中のHis−309に対応する位置にヒスチジン残基を含む。
(i)本酵素は、第1の脂質アシル供与体の最初のエステル結合のアシル部分がアシル受容体に転移して新しいエステルを形成するエステル転移活性として定義することができるアシル基転移酵素活性を有する。
(ii)本酵素は、図28(配列番号26)における位置Gly−32、Asp−33、Ser−34、Asp−134及びHis−309にそれぞれ等しい図2(配列番号2)のアエロモナス ヒドロフィラ酵素に対応する位置において、少なくともGly−14、Asp−15、Ser−16、Asp−116及びHis−191を含む。
本発明による脂質アシル基転移酵素が添加された食料品は、以下の詳細な手順に従って、酵素反応後にCHCl3:CH3OH 2:1で抽出し、脂質材料を含む有機相を単離し、GLCによって分析することができる。GLC(及び必要に応じてHPLC分析)から、遊離脂肪酸及びステロール/スタノールエステル;炭水化物エステル、タンパク質エステル;ジグリセリド又はモノグリセリドの1個又は複数の量が求められる。本発明による酵素が添加されていない対照食料品も同様に分析される。
計算:
GLC(及び場合によりHPLC分析)の結果から、遊離脂肪酸及びステロール/スタノールエステル及び/又は炭水化物エステル及び/又はタンパク質エステル及び/又はジグリセリド及び/又はモノグリセリドの増加量を計算することができる。
Δ%脂肪酸=%脂肪酸(酵素)−%脂肪酸(対照);Mv脂肪酸=脂肪酸の平均分子量;
A=Δ%ステロールエステル/Mvステロールエステル(ここで、Δ%ステロールエステル=%ステロール/スタノールエステル(酵素)−%ステロール/スタノールエステル(対照)及びMvステロールエステル=ステロール/スタノールエステルの平均分子量)−アシル受容体がステロール及び/又はスタノールである場合に適用可能;
B=Δ%炭水化物エステル/Mv炭水化物エステル(ここで、Δ%炭水化物エステル=%炭水化物エステル(酵素)−%炭水化物エステル(対照)及びMv炭水化物エステル=炭水化物エステルの平均分子量)−アシル受容体が炭水化物である場合に適用可能;
C=Δ%タンパク質エステル/Mvタンパク質エステル(ここで、Δ%タンパク質エステル=%タンパク質エステル(酵素)−%タンパク質エステル(対照)及びMvタンパク質エステル=タンパク質エステルの平均分子量)−アシル受容体がタンパク質である場合に適用可能;並びに
D=ジグリセリド及び/又はモノグリセリド/Mvジ/モノグリセリドの絶対値(ここで、Δ%ジグリセリド及び/又はモノグリセリド=%ジグリセリド及び/又はモノグリセリド(酵素)−%ジグリセリド及び/又はモノグリセリド(対照)並びにMvジ/モノグリセリド=ジグリセリド及び/又はモノグリセリドの平均分子量)−アシル受容体がグリセリンである場合に適用可能。
%転移酵素活性=(A*+B*+C*+D*×100) / (A*+B*+C*+D*+Δ%脂肪酸/(Mv脂肪酸))
*−適宜削除
WCOT溶融シリカカラム12.5m×0.25mm ID×0.1μ膜厚5%フェニル−メチル−シリコーン(Chrompack社製CP Sil 8 CB)を備えたPerkin Elmer社製Autosystem 9000 Capillary Gas Chromatograph。
キャリアガス:ヘリウム。
インジェクター.PSSIコールドスプリット注入(初期温度50℃ 385℃に昇温)、体積1.0μl
検出器 FID:395℃
乾燥器プログラム: 1 2 3
乾燥器温度、℃ 90 280 350
等温、時間、min 1 0 10
昇温速度、℃/min 15 4
計算:モノ−ジ−トリグリセリド及び遊離脂肪酸の応答係数を標準2(モノ−ジ−トリグリセリド)から求めた。コレステロール、パルミチン酸コレステリル及びステアリン酸コレステリルの場合には、純粋な基準材料(純粋材料10mgを計量)から応答係数を求めた。
本発明は、卵製品、特にマヨネーズにおける以下の予想外の技術的効果、すなわち、低温殺菌中の熱安定性の改善、感覚器官が感知し得る諸特性の改善、粘稠性の改善の1つ又は複数を提供することができる。
本発明の転移酵素変異体は、親酵素と比較して、以下の有利な諸特性の1つ又は複数を有する。
i)極性脂質に対する高い活性及び/又はトリグリセリドよりも極性脂質に対する高い活性
ii)DGDG(digalactosyl diglyceride)及び/又はMGDG(monogalactosyl diglyceride)の1個又は複数などのガラクト脂質(糖脂質)に対する高い活性。
iii)ガラクト脂質(糖脂質)とリン脂質及び/又はトリグリセリドに対する高い活性比。
一態様においては、本発明に使用されるポリペプチド又はタンパク質は、単離された形であることが好ましい。「単離された」という用語は、配列が本来天然に付随し、天然に存在する少なくとも1個の他の成分から、その配列が少なくとも実質的に遊離されていることを意味する。
一態様においては、本発明に使用されるポリペプチド又はタンパク質は、精製された形であることが好ましい。「精製された」という用語は、配列が比較的純粋な状態、例えば少なくとも純度約51%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも純度約90%、少なくとも純度約95%又は少なくとも純度約98%であることを意味する。
本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチド又は改変に適切であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、前記ポリペプチドを産生するあらゆる細胞又は生物から単離することができる。ヌクレオチド配列を単離する様々な方法が当技術分野で周知である。
本発明は、本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も包含する。本明細書では「ヌクレオチド配列」という用語は、オリゴヌクレオチド配列又はポリヌクレオチド配列並びに(その部分などの)その変異体、相同体、断片及び誘導体を意味する。ヌクレオチド配列は、センス鎖であろうとアンチセンス鎖であろうと、2本鎖でも1本鎖でもよいゲノム、合成又は組換え起源とすることができる。
酵素をコードするヌクレオチド配列が単離された後に、又は酵素をコードする推定ヌクレオチド配列が特定された後に、選択されたヌクレオチド配列を改変することが望ましいことがあり、例えば、本発明による酵素を調製するためにその配列を変異させることが望ましいことがある。
本発明は、本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチドのアミノ酸配列も包含する。
本発明は、本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチドのアミノ酸配列とある程度の配列同一性又は配列相同性を有する配列、或いはかかるポリペプチドをコードする任意のヌクレオチド配列の使用も包含する(以下「相同配列」と記述する)。ここで、「相同体」という用語は、対象アミノ酸配列及び対象ヌクレオチド配列とある相同性を有する実体を意味する。ここで、「相同性」という用語は「同一性」と同等とみなすことができる。
本発明は、本発明の配列に相補的である配列、或いは本発明の配列又はそれに相補的である配列とハイブリッド形成可能である配列も包含する。
本発明に使用されるヌクレオチド配列又は本明細書に定義される具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、複製可能な組換えベクターに組み込むことができる。このベクターを使用して、適合した宿主細胞中で、且つ/又は適合した宿主細胞から、ヌクレオチド配列を複製し、ポリペプチドの形で発現させることができる。発現は、プロモーター/エンハンサー及び他の発現調節シグナルを含む調節配列を用いて制御することができる。原核生物プロモーター及び真核細胞中で機能するプロモーターを使用することができる。組織特異的又は刺激特異的プロモーターを使用することができる。上記2種類以上の異なるプロモーターに由来する配列要素を含むキメラプロモーターを使用することもできる。
「発現ベクター」という用語は、インビボ又はインビトロでの発現が可能な構築体を意味する。
一部の適用例においては、本発明に使用されるヌクレオチド配列又は本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、選択された宿主細胞などによって、ヌクレオチド配列の発現を可能にする制御配列に作動可能に結合することができる。例として、本発明は、かかる制御配列に作動可能に結合した本発明のヌクレオチド配列を含むベクターを包含する。すなわち、このベクターは発現ベクターである。
「構築体」という用語は、「抱合体」、「カセット」、「ハイブリッド」などの用語と同義であり、プロモーターに直接又は間接的に結合し、本発明によって使用される、本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。間接的な結合の例は、プロモーターと本発明のヌクレオチド配列の間に介在するSh1−イントロン、ADHイントロンなどのイントロン配列などの適切なスペーサー基の提供である。直接又は間接的結合を含む、本発明に関係する「融合」という用語でも同じことが当てはまる。これらの用語は、野生型遺伝子プロモーターを通常伴うタンパク質をコードするヌクレオチド配列の天然の組み合わせを、それらがどちらも天然環境にあるときに包含しない場合もある。
本発明に関係する「宿主細胞」という用語は、本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列又は本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチドの組換え産生に使用される上記発現ベクターのどちらかを含む任意の細胞を含む。
本発明に関係する「生物」という用語は、本発明によるヌクレオチド配列又は本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列及び/又はそれらから得られる生成物を含むことができるあらゆる生物を含む。
先に示したように、宿主生物は、原核生物又は真核生物とすることができる。適切な原核生物宿主の例としては、大腸菌及びバチルス サブチリスが挙げられる。
宿主生物は、ストレプトミセス、バチルス サブチリス、大腸菌などの細菌とすることができる。大腸菌中での異種発現の適切な方法は、国際公開第04/064537号に開示されている。バチルス中での異種発現の適切な方法は、国際公開第02/214490号に開示されている。適切な細菌宿主生物の例は、バチルス サブチリス、バチルス リケニホルミス(Bacillus licheniformis)、バチルス レンタス(Bacillus lentus)、バチルス ブレビス(Bacillus brevis)、バチルス ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilus)、バチルス アルカロフィラス(Bacillus alkalophilus)、バチルス アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)、バチルス コアグランス(Bacillus coagulans)、バチルス ロータス(Bacillus lautus)、バチルス メガテリウム(Bacillus megaterium)及びバチルス チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)を含めたバチルス科、ストレプトミセス ムリナス(Streptomyces murinus)などのストレプトミセス種、ラクトコッカス ラクチスなどのラクトコッカス種、ラクトバチルス ロイテリ(Lactobacillus reuteri)を含めたラクトバチルス種、ロイコノストック種、ペジオコッカス種及びストレプトコッカス種を含めた乳酸菌種などのグラム陽性菌種である。或いは、大腸菌を含めた腸内細菌科又はシュードモナス科に属するグラム陰性菌種の系統を宿主生物として選択することができる。
宿主生物は、糸状菌などの真菌とすることができる。適切なかかる宿主の例としては、サーモマイセス(Thermomyces)属、アクレモニウム(Acremonium)属、アスペルギルス属、ペニシリウム属、ムコール(Mucor)属、ニューロスポラ(Neurospora)属、トリコデルマ(Trichoderma)属などに属するあらゆるメンバーが挙げられる。
別の実施形態においては、トランスジェニック生物は酵母とすることができる。
本発明に適切な宿主生物は植物とすることができる。一般技術の総説は、Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42: 205-225)及びChristou (Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)による論文又は国際公開第01/16308号にある。トランスジェニック植物は、例えば、高レベルの植物ステロールエステル及び植物スタノールエステルを産生することができる。
ポリペプチドは、発現宿主から、酵素をより容易に回収することができる培地中に分泌されることが望ましいことが多い。本発明によれば、分泌リーダー配列は、所望の発現宿主に基づいて選択することができる。ハイブリッドシグナル配列は、本発明の状況でも使用することができる。
アミノ酸配列の発現を検出し、測定する様々なプロトコールが当分野で知られている。例としては、ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)、RIA(radioimmunoassay)及びFACS(fluorescent activated cell sorting)が挙げられる。
本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチドは、融合タンパク質として生成され、例えば、その抽出及び精製に役立てることができる。融合タンパク質パートナーの例としては、(GST(glutathione-S-transferase)、6xHis、GAL4(DNA結合及び/又は転写活性化ドメイン)、β−ガラクトシダーゼなどが挙げられる。融合タンパク質パートナーと目的タンパク質配列の間にタンパク質分解性切断部位を入れて、融合タンパク質配列の除去を可能にすることが好都合な場合もある。融合タンパク質は、タンパク質配列の活性を妨げないことが好ましい。
アエロモナス ヒドロフィラGDSXリパーゼアミノ酸配列(P10480)とエシェリキア コリ(Escherichia coli)チオエステラーゼアミノ酸配列(1IVN)及びアスペルギルス アキュレアタス(Aspergillus aculeatus)ラムノガラクツロナンアセチルエステラーゼアミノ酸配列(1DEO)とのアラインメントは、PFAMデータベースからFASTA形式で得られた。P10480と1IVNのアラインメントは、1IVN.PDB結晶構造座標ファイル図52)と一緒に自動3D構造モデラー( HYPERLINK "http://www.expasy.org" www.expasy.orgのSWISS−MODELLERサーバー)に入力された。得られたP10480モデルは、(www.expasy.org/spdbv/から得られる)’Deep View Swiss-PDBビューア’を用いて1IVN.PDB及び1DEO.PDBの結晶構造座標に構造的にアラインメントさせた(図53)。PFAMデータベースから得られたアミノ酸アラインメント(アラインメント1−(図55))は、1DEO.PDB及び1IVN.PDBの構造アラインメントに基づいて改変された。この別のアミノ酸アラインメントはアラインメント2(図56)と呼ばれる。
アミノ酸セット1:
アミノ酸セット1(これらは1IVN中のアミノ酸であることに留意されたい−図57及び図58)。
Gly8、Asp9、Leu11、Ser12、Tyr15、Gly44、Asp45、Thr46、Glu69、Leu70、Gly71、Gly72、Asn73、Asp74、Gly75、Leu76、Gln106、Ile107、Arg108、Leu109、Pro110、Tyr113、Phe121、Phe139、Phe140、Met141、Tyr145、Met151、Asp154、His157、Gly155、Ile156、Pro158
アミノ酸セット2(アミノ酸の番号付与は、P10480成熟配列中のアミノ酸を参照したものであることに留意されたい)
Leu17、Lys22、Met23、Gly40、Asn80、Pro81、Lys82、Asn87、Asn88、Trp111、Val112、Ala114、Tyr117、Leu118、Pro156、Gly159、Gln160、Asn161、Pro162、Ser163、Ala164、Arg165、Ser166、Gln167、Lys168、Val169、Val170、Glu171、Ala172、Tyr179、His180、Asn181、Met209、Leu210、Arg211、Asn215、Lys284、Met285、Gln289及びVal290。
アミノ酸セット3はセット2と同一であるが、アエロモナス サルモニシダ(配列番号28)コード配列を指す。すなわち、アミノ酸残基番号は、シグナル配列を含むタンパク質(配列番号28)と比較した成熟タンパク質(配列番号2)中のアミノ酸番号付与の差を反映して、セット3が18大きい。
アミノ酸セット4はS3、Q182、E309、S310及び−318である。
F13S、D15N、S18G、S18V、Y30F、D116N、D116E、D157 N、Y226F、D228N Y230F。
アミノ酸セット6は、Ser3、Leu17、Lys22、Met23、Gly40、Asn80、Pro81、Lys82、Asn 87、Asn88、Trp111、Val112、Ala114、Tyr117、Leu118、Pro156、Gly159、Gln160、Asn161、Pro162、Ser163、Ala164、Arg165、Ser166、Gln167、Lys168、Val169、Val170、Glu171、Ala172、Tyr179、His180、Asn181、Gln182、Met209、Leu210、Arg211、Asn215、Lys284、Met285、Gln289、Val290、Glu309、Ser310、−318である。
アミノ酸セット7は、Ser3、Leu17、Lys22、Met23、Gly40、Asn80、Pro81、Lys82、Asn 87、Asn88、Trp111、Val112、Ala114、Tyr117、Leu118、Pro156、Gly159、Gln160、Asn161、Pro162、Ser163、Ala164、Arg165、Ser166、Gln167、Lys168、Val169、Val170、Glu171、Ala172、Tyr179、His180、Asn181、Gln182、Met209、Leu210、Arg211、Asn215、Lys284、Met285、Gln289、Val290、Glu309、Ser310、−318、Y30X(ここで、Xは、A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V又はWから選択される)、Y226X(ここで、Xは、A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V又はWから選択される)、Y230X(ここで、Xは、A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V又はWから選択される)、S18X(ここで、Xは、A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、W又はYから選択される)、D157X(ここで、Xは、A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W又はYから選択される)。
Stratagene社製Quick Change Multi Site-Directed Mutagenesis Kitを製造者の指示に従って使用した。各ライブラリに対して、1個のNNK又はNNS(ヌクレオチド略語)コドンを有する縮重プライマーが設計された。プライマー設計は、Stratagene社ウェブサイト上で利用可能なツールを用いて実施した。プライマーの品質管理は、プライマーがヘアピン又はプライマー2量体を形成する可能性があるかどうかを分析する標準分析ツールを用いてさらに確認された。
2つの代替手法、すなわち、ライブラリ配列決定とそれに続く一義的なアミノ酸の分析又はライブラリ分析とそれに続く勝者の配列決定が記述される。
大腸菌における部位走査ライブラリ/変異体の作製及びB.サブチリスにおける変異体発現に使用される形質転換/発現シャトルベクターは、選択カセットをカナマイシン選択カセットに置換することによってpDP66S、Penninaga et al., (Biochemistry (1995), 3368-3376)から誘導された。P32プロモーターの下流のcgt遺伝子の代わりにアシル基転移酵素変異体遺伝子を挿入するのに使用されたベクター。ベクターは、P32プロモーターを使用してB.サブチリス中でアシル基転移酵素変異体遺伝子を発現させる。
式1;n={log(1−c)}/{log(1−f)}
384個のクローンの配列決定を選択することもできるが、それらを分析し改良変異体を選択した後に配列決定することもできる。
出発材料
・EM培地
・形質転換体を含むプレート
・野生型を含むプレート
・384個のプレート
・コロニー採取器(colony picker)
・Waco社製NEFA-Cキット
・384プレート中のPC及びDGDG溶液
・EM培地が充填された384プレートにコロニーを採取する
・4個のウェルを抜かし、非変異骨格を含むコロニーでそれらを接種する
・30℃、振とう速度200rpmでo/nを増殖させる
・o/n増殖プレートを遠心分離する;2500rpm、20分間
・各ウェルから2個の空の384プレートに上清10μlを移す
・12.5mM DGDG 5μlをプレートの一方に添加し、12.5mM PC 5μlをもう一方のプレートに添加する
・両方のプレートを37℃で2時間インキュベートする。最初に振とうして混合し、次いで振とうを停止する
・NEFA C手順を続ける
・A溶液10μlを添加する
・37℃、300rpmで10分間インキュベートする
・B溶液20μlを添加する
・37℃、300rpmで10分間インキュベートする
・550nmでプレートを読み取る
25mM PC eller DGDG
10mM CaCl2
60mM Triton X 100
15mM NaN3
20mM Briton Robinson pH5.0
酵素活性の測定
さまざまな基質に対する酵素活性を測定するために、酵素溶液4μlを基質11μlと一緒に37℃で60分間インキュベートした。続いて、WACO社製NEFA-Cキットを用いて遊離脂肪酸量を測定した。酵素+基質混合物15μlにNEFA溶液A 75μlを添加し、37℃で15分間インキュベートした。続いて、NEFA溶液B 150μlを添加し、15分間インキュベートした。続いて、試料の光学濃度(OD)を550nmで測定した。
PCに対する活性が改善された変異体
PCに対してインキュベートされたときに野生型酵素よりもODが増加した変異体は、ホスホリパーゼ活性が改善された変異体として選択された。
DGDGに対してインキュベートされたときに野生型酵素よりもODが増加した変異体は、DGDGに対する活性が改善された変異体として選択された。
DGDGに対する特異性は、DGDGに対する活性とPC(phosphatidylcholine)に対する活性の比である。DGDGとPCの比が野生型よりも高い変異体は、DGDGに対する特異性が改善された変異体として選択された。
PCに対して及びPCとコレステロールに対して酵素をインキュベートするときに形成される遊離脂肪酸量の差は、加水分解活性量に対する転移酵素活性量の指標である。転移酵素活性は、遊離脂肪酸の形成を生じない。転移酵素優先度は、基質としてPCが使用されたときに形成される遊離脂肪酸と、基質としてPCとコレステロールが使用されたときに形成される遊離脂肪酸との比である。転移酵素優先度の増加を示す変異体及びPCに対して野生型活性よりも高い変異体は、改善された転移酵素活性を有するとして選択された。
DGDG及びDGDGとコレステロールに対して酵素をインキュベートするときに形成される遊離脂肪酸量の差は、加水分解活性量に対する転移酵素活性量の指標である。転移酵素活性は、遊離脂肪酸の形成を生じない。転移酵素優先度は、基質としてDGDGが使用されたときに形成される遊離脂肪酸と、基質としてDGDGとコレステロールが使用されたときに形成される遊離脂肪酸との比である。転移酵素優先度の増加を示す変異体及びDGDGに対して野生型活性よりも高い変異体は、改善された転移酵素活性を有するとして選択された。
上記4つの選択判定基準の各々に対していくつかの変異体が選択された。この実施例における「野生型」酵素はA.サルモニシダ(配列番号28)である。
PCに対する活性が改善された変異体:
リン脂質はDGDGで置換されて、ガラクト脂質からの転移酵素アッセイを提供することができる。他の受容体、例えば、グリセリン、グルコース、ヒドロキシ酸、タンパク質又はマルトースも同じアッセイに使用することができる。
基質0.5mlを4mlバイアルに移し、40℃の加熱ブロック中に置く。転移酵素溶液0.050mlを添加し、水0.050mlを含む対照も同様に分析する。反応混合物を40℃で4時間撹拌する。次いで、試料を凍結し、凍結乾燥させ、GLCによって分析する。
計算:
GLC分析から、遊離脂肪酸とコレステロールエステルの含量を計算する。
%転移酵素活性=(Δ%コレステロールエステル/(Mvステロールエステル)×100) / (Δ%コレステロールエステル/(Mvコレステロールエステル)+Δ%脂肪酸/(Mv脂肪酸))
%加水分解活性=(Δ%脂肪酸/(Mv脂肪酸)×100) / (Δ%コレステロールエステル/(Mvコレステロールエステル)+Δ%脂肪酸/(Mv脂肪酸))
転移酵素/加水分解(Hydrolyse)比=%転移酵素活性/%加水分解活性
ここで、
Δ%コレステロールエステル=%コレステロールエステル(試料)−%コレステロールエステル(対照)
Δ%脂肪酸=%脂肪酸(試料)−%脂肪酸(対照)
DGDG(digalactosyldiglyceride)(純度>95ガラクト脂質、使用されるDGDGはコムギ脂質から精製される。Sigma社製DGDG D4651も適切に使用することができる):コレステロール(Sigma社製)9:1 300mgをWheatonガラスに計量する。50mM HEPES緩衝剤pH7.0 10mlを添加し、40℃で撹拌して基質を分散させる。
基質0.5mlを4mlバイアルに移し、40℃の加熱ブロック中に置く。転移酵素溶液0.050mlを添加し、水0.050mlを含む対照も同様に分析する。反応混合物を40℃で4時間撹拌する。次いで、試料を凍結し、凍結乾燥させ、GLCによって分析する。
計算:
GLC分析から、遊離脂肪酸とコレステロールエステルの含量を計算する。
酵素活性は以下のとおり計算される。
%転移酵素活性=(Δ%コレステロールエステル/(Mvステロールエステル)×100) / (Δ%コレステロールエステル/(Mvコレステロールエステル)+Δ%脂肪酸/(Mv脂肪酸))
%加水分解活性=(Δ%脂肪酸/(Mv脂肪酸)×100) / (Δ%コレステロールエステル/(Mvコレステロールエステル)+Δ%脂肪酸/(Mv脂肪酸))
転移酵素/加水分解比=%転移酵素活性/%加水分解活性
ここで、
Δ%コレステロールエステル=%コレステロールエステル(試料)−%コレステロールエステル(対照)
Δ%脂肪酸=%脂肪酸(試料)−%脂肪酸(対照)
変異は、Stratagene, La Jolla, CA92037, USA社製QuikChange(登録商標)Multi-Site Directed Mutagenesisキットを用いて、Stratagene社の指示に従って導入された。
ホスファチジルコリンよりもジガラクトシルジグリセリドに対して良好な活性を有する変異体を選択する目的で、アエロモナス サルモニシダ由来のGCAT(glycerophospholipid:cholesterol acyltransferase)の点変異から得られる変異体を、供与体としてホスファチジルコリン又はジガラクトシルジグリセリド及び受容体としてコレステロールを用いて転移酵素活性についてスクリーニングした。
コレステロールオキシダーゼ(SERVA Electrophoresis GmbH cat. No 17109)1.4U/ml、ABTS(Sigma社製A-1888)0.4mg/ml、ペルオキシダーゼ(Sigma社製6782)6U/mlを含む基質100μlの0.1M TRIS、HCl緩衝剤pH6.6+0.5%Triton X 100(Sigma社製X-100)溶液を37℃で5分間インキュベートした。コレステロール試料5μlを添加し混合した。反応混合物をさらに5分間インキュベートし、OD 405nmを測定した。コレステロール含量を、0.4mg/ml、0.3mg/ml、0.20mg/ml、0.1mg/ml、0.05mg/ml及び0mg/mlを含むコレステロール標準液の分析から計算した。
試料中の遊離脂肪酸は、NEFA Cキット(WAKO Chemicals GmbH)を用いて測定された。
NEFA試薬A 75μlを37℃で10分間インキュベートした。酵素試料15μlを添加し、混合した。反応混合物を10分間インキュベートした。NEFA試薬B 150μlを添加し、混合し、さらに10分間インキュベートし、OD 540nmを測定した。遊離脂肪酸は、0.4、0.3、0.2、0.1、0.05及び0mM脂肪酸標準液から計算された。
(0.1×%TDG/386) / (% HDG/280) = (0.1×%TDG×280) / (% HDG×386)
ここで、386=コレステロールのMW及び280=脂肪酸のMW。
TDG>50%及びTDG/TPC>3及び(0.1×%TDG/386) / (% HDG/280) > 2.5
の変異体が、改良変異体として選択された。
この実施例における「親」酵素はA.サルモニシダ(配列番号28)である。
pfamアラインメント(アラインメント2;図56)及びP10480モデルと1IVNとの重なりから、1IVNの活性部位中のグリセリン分子を包囲する領域中の全アミノ酸が選択され、特定の目的領域(ループ)を限定するために使用された。(番号は、P10480成熟配列(配列番号2)中のアミノ酸を指す):
Thr 20- Arg 41 (ループ1、L1)
Ile 77- Leu 89 (ループ2、L2)
Leu 118 - Asp 127 (ループ3、L3)
Gly 146- Val 176 (ループ4、L4)
Glu 208 - Trp 287 (ループ5、L5)
Ala 1 - Asp 19 (IVR1)
Phe 42 - Lys 76 (IVR2)
Asp 90 - Tyr 117 (IVR3)
Ala 128 - Asn 145 (IVR4)
Ser 177 - Ala 207 (IVR5)
Asp 288 - His 317 (IVR6)
Claims (20)
- 糖脂質アシル基転移酵素変異体を製造する方法であって、(a)アミノ酸配列モチーフGDSX(式中、Xは以下のアミノ酸残基L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M又はSの1個又は複数である)を含むことを特徴とする脂質アシル基転移酵素である親酵素を選択するステップと、(b)1個又は複数のアミノ酸を改変して脂質アシル基転移酵素変異体を製造するステップと、(c)前記脂質アシル基転移酵素変異体を、ガラクト脂質基質並びに場合によりリン脂質基質及び/又は場合によりトリグリセリド基質に対する転移酵素活性及び場合により加水分解活性について試験するステップと、(d)ガラクト脂質に対して前記親酵素よりも活性が高い酵素変異体を選択するステップと、(e)多量の前記酵素変異体を調製するステップを含み、さらに、以下のステップ、すなわち構造的相同性マッピング又は配列相同性アラインメントの1又は複数を含み、
前記構造的相同性マッピングが、以下のステップ、すなわち、
(1)親配列を配列番号2に示されるP10480の結晶構造座標と1IVN.PDBとの構造アラインメントによって得られるP10480の構造モデルとアラインメントさせるステップであって、前記親配列が、配列番号26又は28に示されるアミノ酸配列、或いは、それらと85%以上同一であり、且つ、アミノ酸配列モチーフGDSX(式中、Xは以下のアミノ酸残基L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M又はSの1個又は複数である)を含み、配列番号26又は28のSer−34及びHis−309に対応する位置において、それぞれ、セリン残基及びヒスチジン残基を含むアミノ酸配列からなる、ステップ、
(2)活性部位中のグリセロール分子の中心炭素原子上に中心を置く10Åの球内の1個又は複数のアミノ酸を選択するステップ、
(3)ステップ(2)によって選択された1個又は複数のアミノ酸残基が、高度に保存されているかどうかを判断するステップ、及び
(4)前記親配列中のステップ(3)によって特定された保存領域を除いて、ステップ(2)によって選択された1個又は複数のアミノ酸を改変するステップ
の1つ又は複数を含み、
前記配列相同性アラインメントが、以下のステップ、すなわち、
(i)第1の親脂質アシル基転移酵素を選択するステップであって、前記親脂質アシル基転移酵素が、配列番号26又は28に示されるアミノ酸配列、或いは、それらと85%以上同一であり、且つ、アミノ酸配列モチーフGDSX(式中、Xは以下のアミノ酸残基L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M又はSの1個又は複数である)を含み、配列番号26又は28のSer−34及びHis−309に対応する位置において、それぞれ、セリン残基及びヒスチジン残基を含むアミノ酸配列からなる、ステップ、
(ii)望ましい活性を有する第2の関連脂質アシル基転移酵素を特定するステップ、
(iii)前記第1の親脂質アシル基転移酵素と前記第2の関連脂質アシル基転移酵素とを
アラインメントさせるステップ、
(iv)前記2つの配列間で異なるアミノ酸残基を特定するステップ、
(v)ステップ(iv)によって選択された1個又は複数のアミノ酸残基が、高度に保存されているかどうかを判断するステップ、及び
(vi)前記親配列中のステップ(v)によって特定された保存領域を除いて、ステップ(iv)によって特定されたアミノ酸残基の1個又は複数を改変するステップ
の1つ又は複数を含み、
配列番号2とのアラインメントにより特定された1個又は複数の以下のアミノ酸残基:N88W;S18M又はT;Y30G、I、L、S、E、M、A又はR;G40L、M、R、Q又はV;N80R、D又はG;N87R、D、E、M、C又はG;Y179V、E、R、N又はQ;H180T、K、Q又はI;M209Y、L又はK;L210N、D、R、E、A、Q、P、K、G、T、W、I、V、S又はM;R211G、Q、K、D又はT;N215L、G、V、R又はY
を親配列と比較して改変する、
方法。 - ガラクト脂質基質からの転移酵素活性、及びリン脂質基質からの転移酵素活性
について脂質アシル基転移酵素変異体を試験するステップと、
親酵素と比較したときに、ガラクト脂質からの転移酵素活性とリン脂質からの転移酵素活性との比が大きい酵素変異体を選択するステップと
を含む、請求項1に記載の方法。 - ガラクト脂質からの転移酵素活性とリン脂質からの転移酵素活性との比が少なくとも3である、請求項2に記載の方法。
- ガラクト脂質基質からの転移酵素活性、及びガラクト脂質基質に対する加水分解活性について脂質アシル基転移酵素変異体を試験するステップと、
ガラクト脂質からの転移酵素活性と糖脂質に対するその加水分解活性との比が親酵素よりも大きい酵素変異体を選択するステップと
を含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。 - ガラクト脂質に対する転移酵素活性とガラクト脂質に対する加水分解活性との比が少なくとも1.5である、請求項4に記載の方法。
- 親酵素が、配列番号28で示されるアミノ酸配列からなる酵素である、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- GDSXモチーフのXがLである、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- アミノ酸配列モチーフGDSXを含むことを特徴とする糖脂質アシル基転移酵素変異体であって、前記Xが以下のアミノ酸残基L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M又はSの1個又は複数であり、前記酵素変異体が親配列と比較して以下のアミノ酸残基、すなわち、S18M又はT;Y30G、I、L、S、E、M、A又はR;G40L、R、M、Q又はV;N80R、D又はG;N87R、D、E、M、C又はG;N88W;Y179V、E、R、N又はQ;H180T、K、Q又はI;M209Y、L又はK;L210N、D、H、R、E、A、Q、P、K、G、T、W、I、V、S又はM;R211G、Q、K、D又はT;N215H、L、G、V、R又はYのいずれかのアミノ酸改変を含み、前記親配列が、XがL、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M又はSの1個又は複数のアミノ酸残基であるアミノ酸モチーフGDSXを含む脂質アシル基転移酵素であって、配列番号26又は28に示されるアミノ酸配列、或いは、それらと85%以上同一であり、且つ、アミノ酸配列モチーフGDSX(式中、Xは以下のアミノ酸残基L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M又はSの1個又は複数である)を含み、配列番号26又は28のSer−34及びHis−309に対応する位置において、それぞれ、セリン残基及びヒスチジン残基を含むアミノ酸配列からなる脂質アシル基転移酵素であり、アミノ酸残基の番号付与が前記変異体配列と配列番号2の基準配列とのアラインメントから得られる、変異体。
- 配列番号26又は配列番号28で示されるアミノ酸配列において、S18M又はT;Y30G、I、L、S、E、M、A又はR;G40L、R、M、Q又はV;N80R、D、又はG;N87R、D、E、M、C又はG;N88W;Y179V、E、R、N又はQ;H180T、K、Q又はI;M209Y、L又はK;L210N、D、H、R、E、A、Q、P、K、G、T、W、I、V、S又はM;R211G、Q、K、D又はT;N215H、L、G、V、R又はYに規定されるアミノ酸残基の任意のいずれかにおけるアミノ酸改変を含むアミノ酸配列からなり、アミノ酸残基の番号付与が前記変異体配列と配列番号2の基準配列とのアラインメントから得られる、請求項8に記載の糖脂質アシル基転移酵素変異体。
- ガラクト脂質に対する活性とリン脂質及び/又はトリグリセリドに対する活性との比が親酵素よりも大きい、請求項8又は9に記載の糖脂質アシル基転移酵素変異体。
- ガラクト脂質加水分解活性と比較したガラクト脂質転移酵素活性が親酵素よりも高い、請求項8〜10のいずれかに記載の糖脂質アシル基転移酵素変異体。
- 糖脂質を処理してリゾ糖脂質を調製するための基質の製造における、請求項8から11のいずれか一項に記載の糖脂質アシル基転移酵素変異体又は請求項1から7のいずれか一項に記載の方法によって得られる糖脂質アシル基転移酵素変異体の使用。
- 基質が食料品である、請求項12に記載の使用。
- 食料品を調製する方法であって、請求項8から11のいずれか一項に記載の糖脂質アシル基転移酵素変異体又は請求項1から7のいずれか一項に記載の方法によって得られる糖脂質アシル基転移酵素変異体を前記食料品の1個又は複数の成分に添加するステップを含む方法。
- 焼いた生成物を生地から調製する方法であって、請求項8から11のいずれか一項に記載の糖脂質アシル基転移酵素変異体又は請求項1から7のいずれか一項に記載の方法によって得られる糖脂質アシル基転移酵素変異体を前記生地に添加するステップを含む方法。
- 卵又は卵を主成分とする生成物を処理してリゾリン脂質を製造する方法における、請求項8から11のいずれか一項に記載の糖脂質アシル基転移酵素変異体又は請求項1から7のいずれか一項に記載の方法によって得られる糖脂質アシル基転移酵素変異体の使用。
- 植物油又は食用油の酵素精練方法であって、極性脂質の主要な部分を加水分解するために、請求項8から11のいずれか一項に記載の糖脂質アシル基転移酵素変異体又は請求項1から7のいずれか一項に記載の方法によって得られる糖脂質アシル基転移酵素変異体で前記食用油又は植物油を処理するステップを含む方法。
- 食用油のリン脂質含有量を削減する方法における、請求項8から11のいずれか一項に記載の糖脂質アシル基転移酵素変異体又は請求項1から7のいずれか一項に記載の方法によって得られる糖脂質アシル基転移酵素変異体の使用であって、前記リン脂質の主要な部分を加水分解するために脂肪分解酵素変異体で前記油を処理するステップと、加水分解されたリン脂質を含む水相を前記油から分離するステップとを含む使用。
- 炭水化物エステル及び/又はタンパク質エステル及び/又はタンパク質サブユニットエステル及び/又はヒドロキシ酸エステルなどの高価な生成物を製造するための極性脂質(好ましくは糖脂質)の生物変換における、請求項8から11のいずれか一項に記載の糖脂質アシル基転移酵素変異体又は請求項1から7のいずれか一項に記載の方法によって得られる糖脂質アシル基転移酵素変異体の使用。
- 請求項8から11のいずれか一項に記載の固定化糖脂質アシル基転移酵素変異体又は請求項1から7のいずれか一項に記載の方法によって得られる固定化糖脂質アシル基転移酵素変異体。
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MX349923B (es) | 2009-04-03 | 2017-08-21 | Hoffmann La Roche | Composiciones del ácido propano-1-sulfónico {3-[5-(4-cloro-fenil)- 1h-pirrolo [2,3-b]-piridina-3-carbonil]-2,4-difluoro-fenil]-amida y el uso de las mismas. |
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CN103429747A (zh) | 2011-01-21 | 2013-12-04 | 诺维信公司 | 产生脂肪酸烃基酯 |
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CA92037A (en) | 1904-11-25 | 1905-03-07 | The Hooven, Owens, Rentchler Company | Turbine bearings |
GB330016A (en) | 1929-03-03 | 1930-06-05 | Thomas Reeder Ltd | Improvements in and relating to flanges for warp beams or rollers for use in textile and other machines |
NL154598B (nl) | 1970-11-10 | 1977-09-15 | Organon Nv | Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking. |
US3817837A (en) | 1971-05-14 | 1974-06-18 | Syva Corp | Enzyme amplification assay |
US3939350A (en) | 1974-04-29 | 1976-02-17 | Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Fluorescent immunoassay employing total reflection for activation |
US3996345A (en) | 1974-08-12 | 1976-12-07 | Syva Company | Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays |
US4277437A (en) | 1978-04-05 | 1981-07-07 | Syva Company | Kit for carrying out chemically induced fluorescence immunoassay |
US4275149A (en) | 1978-11-24 | 1981-06-23 | Syva Company | Macromolecular environment control in specific receptor assays |
US4366241A (en) | 1980-08-07 | 1982-12-28 | Syva Company | Concentrating zone method in heterogeneous immunoassays |
US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
US4683202A (en) | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
DK122686D0 (da) | 1986-03-17 | 1986-03-17 | Novo Industri As | Fremstilling af proteiner |
KR100225087B1 (ko) | 1990-03-23 | 1999-10-15 | 한스 발터라벤 | 피타아제의 식물내 발현 |
KR100237148B1 (ko) | 1990-05-09 | 2000-01-15 | 한센 핀 베네드 | 엔도글루칸아제 효소를 함유하는 셀룰라제 제조물 |
DE4112440C1 (ja) | 1991-04-16 | 1992-10-22 | Diagen Institut Fuer Molekularbiologische Diagnostik Gmbh, 4000 Duesseldorf, De | |
AU664827B2 (en) | 1991-05-03 | 1995-12-07 | Raisio Benecol Ltd. | A substance for lowering high cholesterol level in serum and a method for preparing the same |
DE69332030T2 (de) | 1992-12-10 | 2002-10-02 | Dsm Nv | Herstellung von heterologen proteinen in filamentösen fungi |
US5605793A (en) | 1994-02-17 | 1997-02-25 | Affymax Technologies N.V. | Methods for in vitro recombination |
US6117679A (en) | 1994-02-17 | 2000-09-12 | Maxygen, Inc. | Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination |
US5741665A (en) | 1994-05-10 | 1998-04-21 | University Of Hawaii | Light-regulated promoters for production of heterologous proteins in filamentous fungi |
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US6361974B1 (en) | 1995-12-07 | 2002-03-26 | Diversa Corporation | Exonuclease-mediated nucleic acid reassembly in directed evolution |
US6344328B1 (en) | 1995-12-07 | 2002-02-05 | Diversa Corporation | Method for screening for enzyme activity |
EP1193314B1 (en) * | 1997-04-09 | 2004-10-20 | Danisco A/S | Use of lipase for improving doughs and baked products |
WO2000005396A1 (en) * | 1998-07-21 | 2000-02-03 | Danisco A/S | Foodstuff |
DK1131416T3 (da) | 1998-11-27 | 2009-10-26 | Novozymes As | Lipolytiske enzymvarianter |
AU4039400A (en) | 1999-03-26 | 2000-10-16 | Diversa Corporation | Exonuclease-mediated nucleic acid reassembly in directed evolution |
AU7092900A (en) | 1999-08-30 | 2001-03-26 | Monsanto Technology Llc | Plant sterol acyltransferases |
DE19953854C2 (de) | 1999-11-09 | 2002-01-17 | Max Planck Gesellschaft | Verfahren zur Herstellung von Biopolymeren mit veränderten Eigenschaften |
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