CN102656264A - 脂质酰基转移酶蛋白及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明一方面提供了制备脂质酰基转移酶变体的方法，所述方法包括在宿主生物中表达与编码亲本脂质酰基转移酶的核苷酸序列具有至少90%同一性并且包含至少一个修饰(合适地为至少两个修饰)的核苷酸序列，所述修饰的位置对应于在所编码的氨基酸序列中位于以下的氨基酸：a)所述酶的峡谷区(即优选氨基酸残基31、27、85、86、119和120)；和/或b)插入位点1(即氨基酸残基22-36)和/或c)插入位点2(即氨基酸残基74-88)，其中所述峡谷区、插入位点1和/或插入位点2被定义为在基于初级或三级结构比对时，对应于本发明SEQ ID No.16或6所示的酶的峡谷区、插入位点1或插入位点2(或以上教导的相应氨基酸残基)的区域。优选的修饰为以下一个或多个：L3IQ,H,N,T,F,Y或C(优选L31Q)；M27R,G，H,K,Y，D,N,V，C,Q,L,E,S或F(优选M27V)；V85H,R5D或E；I86R,Y，S,V，I,As,T,M,F,C或L(优选I86S或A)；A119T或I；Y120K或E；W122S,L或A(优选W122L)；E201R；Q245S；F235A或V；W232G或S；和/或A236G或E。

Description

脂质酰基转移酶蛋白及其制备方法
申请的引用
引用以下相关申请：US2002-0009518、US2004-0091574、WO2004/064537、WO2004/064987、WO2005/066347、WO2005/066351，2006年2月2日提交的美国申请No.60/764,430，WO2006/008508、国际专利申请号PCT/IB2007/000558和美国申请No.11/671,953。这些申请的每一个以及这些申请的每一个中所引用的每篇文献(“申请引用的文献”)，和申请引用的文献中(无论是出现在这些申请的正文中或是在审查过程中)所参考或引用的每篇文献以及在所述审查中用以支持先进专利性的论据，均通过引用并入本文。本文还引用了多份文献(“本文所引用文献”)。每篇本文所引用文献以及本文所引用文献中所引用或参考的每篇文献均通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及工程加工和产生变体酶的方法。本发明还涉及新型变体酶和这些新型变体酶的应用。
背景技术
脂质:胆固醇酰基转移酶已经为人所知一段时间(参见，例如Buckley-Biochemistry 1983,22,5490-5493)。特别地，已经发现，与植物和/或哺乳动物的卵磷脂:胆固醇酰基转移酶((LCAT)类似，甘油磷脂:胆固醇酰基转移酶(GCAT)可催化磷脂酰胆碱和胆固醇之间的脂肪酸转移。
Upton和Buckley(TIBS 20,May 1995,p178-179)以及Brumlik和Buckley(J.of Bacteriology Apr.1996,p2060-2064)教导了能够在含水媒介中进行至醇受体的酰基转移的来自嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)的脂肪酶/酰基转移酶。
对于这个酶，已经鉴定了嗜水气单胞菌酰基转移酶的推定底物结合域和活性位点(参见，例如Thornton et al1988 Biochem.et Biophys.Acta.959,153-159和Hilton & Buckley 1991 J.Biol.Chem.266,997-1000)。
Buckley等(J.Bacteriol 1996,178(7)2060-4)教导，Ser16、Asp 116和His291是保持酶活性所必须保留的重要氨基酸。
Robertson等(J.Biol.Chem.1994,269,2146-50)教导了嗜水气单胞菌的酰基转移酶的一些具体突变，即Y226F、Y230F、Y30F、F13S、S18G和S18V，均没有包含在本发明中。
WO 2005/066347涉及变体脂质酰基转移酶及其制备方法。这些变体酶均没有包含在本发明中。
具有改善(增强)活性的变体脂质酰基转移酶的开发一直存在困难，尤其对于在一些应用中具有高特异活性的变体脂质酰基转移酶的发现更是如此。
发明内容
本发明是基于发明人发现的用于修饰的感兴趣特定位点的预期。发明人首次建立了脂质酰基转移酶模型并且利用所述酶的三级结构鉴定了用于修饰的具体区域。此外，发明人还制备并测试了根据其以上发现而修饰的酶，并确定了用于多个应用中的有利的变体脂质酰基转移酶。
本发明的各方面体现在权利要求书和以下说明内容中。
本发明一个方面提供了用于制备变体脂质酰基转移酶的方法，所述方法包括在宿主生物中表达与编码亲本脂质酰基转移酶的核苷酸序列具有至少90%同一性并且包含至少一个修饰(合适地为至少两个修饰)的核苷酸序列，所述修饰的位置对应于在所编码的氨基酸序列中定位于以下的氨基酸：a)所述酶的峡谷区(即优选氨基酸残基31、27、85、86、119和120)；和/或b)插入位点1和/或c)插入位点2，其中所述峡谷区、插入位点1和/或插入位点2被定义为在基于初级或三级结构比对时，对应于本文SEQ ID No.6或16所示的酶的峡谷区、插入位点1或插入位点2的区域。
在一个实施方式中，优选位置位于峡谷和/或插入位点1和/或插入位点2中的修饰与位置对应于在所编码的氨基酸序列中位于峡谷和/或插入位点1和/或插入位点2之外的氨基酸的至少一个修饰组合。
本发明另一方面提供了用于制备变体脂质酰基转移酶的方法，所述方法包括在宿主生物中表达与编码亲本脂质酰基转移酶的核苷酸序列具有至少90%同一性并且包含至少一个修饰(合适地为至少两个修饰)的核苷酸序列，所述修饰的位置对应于在所编码的氨基酸序列中位于以下位置的氨基酸：27、31、85、86、122、119、120、201、245、232、235和/或236(优选第27、31、85、86、119和/或120位，更优选第27和/或31位)，其中所述位置编号被定义为在基于初级或三级结构比对时，对应于本文SEQ ID No.6所示酶的相同位置的位置。
本发明的另一方面提供了制备变体脂质酰基转移酶的方法，所述方法包括在宿主生物中表达与编码亲本脂质酰基转移酶的核苷酸序列具有至少90%同一性并且包含至少一个修饰的核苷酸序列，所述修饰的位置对应于在所编码的氨基酸序列中位于第27和/或31位的氨基酸并与至少一个进一步的修饰组合，其中所述位置编号被定义为在基于初级或三级结构比对时，对应于本文SEQ ID No.6所示酶的相同位置的位置。
合适地，所述至少一个进一步的修饰可位于一个或多个以下位置：85、86、122、119、120、201、245、23、81、82、289、227、229、233、33、207、130，其中所述位置编号被定义为在基于初级或三级结构比对时，对应于本文SEQ ID No.6所示酶的相同位置的位置
本发明另一个方面提供了产生变体脂质酰基转移酶的方法，所述方法包括修饰脂质酰基转移酶氨基酸序列骨架，从而在对应于所编码的氨基酸序列中以下氨基酸的位置形成至少一个修饰(合适地为两个修饰)：a)所述酶的峡谷区和/或b)插入位点1和/或c)插入位点2，其中所述酶的峡谷区、插入位点1和/或插入位点2被定义为在基于初级或三级结构比对时，分别对应于本文SEQ ID No.6或16所示的酶的峡谷区、插入位点1或插入位点2的区域。
在一个实施方式中，优选位置位于峡谷和/或插入位点1和/或插入位点2中的修饰与位置对应于在所编码的氨基酸序列中位于峡谷区和/或插入位点1和/或插入位点2之外的氨基酸的至少一个修饰组合。
本发明另一方面提供了产生变体脂质酰基转移酶的方法，所述方法包括修饰脂质酰基转移酶氨基酸序列骨架从而形成至少一个修饰(合适地为至少两个修饰)，所述修饰的位置对应于在所编码的氨基酸序列中位于第27、31、85、86、122、119、120、201、245、232、235和/或236位(优选第27、31、85、86、119和/或120位，更优选第27和/或31位)的氨基酸，其中所述位置编号被定义为在基于初级或三级结构比对时，对应于本文SEQ ID No.6所示酶的相同位置的位置。
本发明另一方面提供了产生变体脂质酰基转移酶的方法，所述方法包括修饰脂质酰基转移酶氨基酸序列骨架，从而形成至少一个修饰(合适地为至少两个修饰)，所述修饰的位置对应于在所编码的氨基酸序列中位于第27、31位的氨基酸并组合至少一个进一步的修饰，其中所述位置编号被定义为在基于初级或三级结构比对时，对应于本文SEQ ID No.6所示酶的相同位置的位置。
合适地，所述至少一个进一步的修饰可位于一个或多个以下位置：85、86、122、119、120、201、245、23、81、82、289、227、229、233、33、207、130位，其中所述位置编号被定义为在基于初级或三级结构比对时，对应于本文SEQ ID No.6所示酶的相同位置的位置。
本发明还涉及一种方法，其包括改变紧邻于亲本酶(例如亲本脂质酰基转移酶)的催化三联体(优选催化三联体的Asp残基)的N-末端的底物链长特异性决定片段的长度，从而产生相对于所述亲本酶具有改变的底物特异性的改变的脂质酰基转移酶，其中所述亲本酶具有与本文SEQ ID No.6或16所示来自杀鲑气单胞菌(A.salmonicida)的脂质酰基转移酶至少70%相同的氨基酸序列。
优选地，所述改变包括在所述底物链长特异性决定片段中进行氨基酸插入或缺失，例如由不同脂质酰基转移酶的底物链长特异性决定片段取代所述亲本酶的所述底物链长特异性决定片段，从而产生所述改变的脂质酰基转移酶。优选地，所述改变增加了可被所述脂质酰基转移酶转移的酰基链的长度。在一个实施方式中，优选所述方法包括测试所述改变的脂质酰基转移酶的改变的底物特异性。
合适地，所述测试可以包括评价所述改变的或变体脂质酰基转移酶在含水环境下将酰基从底物转移至受体分子的能力。在一个实施方式中，所述测试包括评价所述变体脂质酰基转移酶和所述亲本酶转移不同长度的酰基链的能力。
本发明还提供了改变的或变体脂质酰基转移酶，所述脂质酰基转移酶包含与本文SEQ ID No.6或16所示来自杀鲑气单胞菌的脂质酰基转移酶具有至少70%同一性的氨基酸序列，其中相对于本文SEQ ID No.6或16所示来自杀鲑气单胞菌的脂质酰基转移酶，紧邻于所述改变的脂质酰基转移酶的催化三联体的Asp残基的N-末端的底物链长特异性决定片段具有改变的长度。
优选地，所述改变的脂质酰基转移酶包含与本文SEQ ID No.6或16所示来自杀鲑气单胞菌的脂质酰基转移酶具有至少90%同一性的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供了通过本发明的方法获得的(变体)脂质酰基转移酶多肽。
在再一方面，本发明提供了包含编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列的核酸(优选分离的或重组的核酸)或载体，并且所述核苷酸序列在对应于所编码的氨基酸序列中一个或多个以下位置的位置包含至少一个修饰：27、31、85、86、122、119、120、201、245、232、235和/或236(优选第27、31、85、86、119和/或120位，更优选第27和/或31位)，其中所述位置编号被定义为在基于初级或三级结构比对时，对应于本文SEQ ID No.6所示酶的相同位置的位置。
本发明的再一方面提供了包含编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列的核酸(优选分离的或重组的核酸)或载体，并且所述核苷酸序列在对应于所编码的氨基酸序列中一个或多个以下位置的位置包含至少一个修饰：27和/或31，并组合至少一个进一步的修饰，其中所述位置编号被定义为在基于初级或三级结构比对时，对应于本文SEQ ID No.6所示酶的相同位置的位置。
合适地，所述至少一个进一步的修饰可位于一个或多个以下位置：85、86、122、119、120、201、245、23、81、82、289、227、229、233、33、207、130位，其中所述位置编号被定义为在基于初级或三级结构比对时，对应于本文SEQ ID No.6所示酶的相同位置的位置。
优选地，所述核苷酸序列编码本发明的脂质酰基转移酶并且在修饰前为本文SEQ ID No.25、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ IDNo.13、SEQ ID No.14或SEQ ID No.15所示的核苷酸序列；或者为与SEQ IDNo.25、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQID No.14或SEQ ID No.15所示的核苷酸序列具有至少70%同一性(优选至少80%，更优选至少90%，甚至更优选至少95%同一性)的核苷酸序列；或者通过遗传密码子的简并性而与SEQ ID No.25、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15相关联的核苷酸序列；或者在中等严谨条件下或高严谨条件下与本文SEQ ID No.25、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14或SEQ ID No.15所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
本发明在一个方面提供了分离或重组的核酸，其编码具有脂质酰基转移酶活性并且包含与SEQ ID No.6或16的成熟区具有至少94%(优选至少98%)氨基酸序列同一性的序列的多肽，并且其中所述多肽在位于以下位置的位置包含至少一个修饰(优选至少两个修饰)：第27、31、85、86、122、119、120、201、245、232、235和/或236位(优选第27、31、85、86、119和/或120位，更优选第27和/或31位)，其中所述位置编号定义为当基于初级或三级结构比对时，对应于本文SEQ ID No.6所示酶的相同位置的位置。
本发明在一个方面提供了分离或重组的核酸，其编码具有脂质酰基转移酶活性并包含与SEQ ID No.6或16的成熟区具有至少94%(优选至少98%)氨基酸序列同一性的序列的多肽，并且其中所述多肽在对应于所编码核酸序列中第27和/或31位氨基酸的位置包含至少一个修饰(优选至少两个修饰)，并且组合至少一个进一步的修饰，其中所述位置编号定义为当基于初级或三级结构比对时，对应于本文SEQ ID No.6所示酶的相同位置的位置。
合适地，所述至少一个进一步的修饰可位于一个或多个以下位置：85、86、122、119、120、201、245、23、81、82、289、227、229、233、33、207、130，其中所述位置编号被定义为在基于初级或三级结构比对时，对应于本文SEQ ID No.6所示酶的相同位置的位置。
一方面提供了包含编码具有脂质酰基转移酶活性的多肽的核苷酸序列的核酸(优选分离的或重组的核酸)或载体，其中所述核苷酸序列在中等或高严谨条件下与SEQ ID No.10或SEQ ID No.25或者SEQ ID No.10或SEQ IDNo.25的互补序列的基本全长上杂交，其中所编码的多肽包含选自以下的一个或多个氨基酸残基：第31位的Q、H、N、T、F、Y或C；第86位的R、Y、S、V、I、A、T、M、F、C或L；第27位的R、G、H、K、Y、D、N、V、C、Q、L、E、S或F；H、R、D、E 85；第119位的T或I；第120位的K或E；第122位的S、L、A、F、W、Y、R、H、M或C；第201位的R；第245位的S；第235位的A或V；第232位的G或S；第236位的G或E，其中所述位置是与SEQ ID No.6相当的氨基酸位置。
本发明在再一方面提供了由本发明的核酸或核苷酸序列编码的变体脂质酰基转移酶多肽。
本发明一方面提供了在芽孢杆菌表达宿主，尤其是在地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)表达宿主中表达时，由本发明的核酸或核苷酸序列编码的变体脂质酰基转移酶多肽。
本发明另一方面提供了产生多肽的方法，所述方法包括向宿主细胞(优选芽孢杆菌表达宿主，尤其是地衣芽孢杆菌表达宿主)中引入所述核酸或载体，其中所述核酸或载体包含编码所述多肽的所述核苷酸序列，所述核苷酸序列与能够引导由所述核酸编码的多肽表达的调控序列可操作地连接；在所述调控序列引导所述核酸或载体编码的多肽表达的条件下培养所述宿主细胞。
本发明一方面提供了一种前肽或多肽，其具有脂质酰基转移酶活性并且包含与SEQ ID No.6或16所示的氨基酸序列具有至少90%(优选至少95%，更优选至少98%，更优选至少99%)同一性的氨基酸序列并且在一个或多个以下位置包含一个或多个修饰：27、31、85、86、122、119、120、201、245、232、235和/或236(优选第27、31、85、86、119和/或120位，更优选第27和/或31位)。
本发明另一方面提供了一种前肽或多肽，其具有脂质酰基转移酶活性并且包含SEQ ID No.6或16所示的氨基酸序列，但在一个或多个以下位置具有一个或多个修饰：27、31、85、86、122、119、120、201、245、232、235和/或236(优选第27、31、85、86、119和/或120位，更优选第27和/或31位)。
本发明一方面提供了一种前肽或多肽，其具有脂质酰基转移酶活性并且包含与SEQ ID No.6或16所示的氨基酸序列具有至少90%(优选至少95%，更优选至少98%，更优选至少99%)同一性的氨基酸序列并且在第27和/或31位包含一个或多个修饰且与至少一个进一步的修饰组合，其中所述位置编号被定义为在基于初级或三级结构比对时，对应于本文SEQ ID No.6所示酶的相同位置的位置。
合适地，所述至少一个进一步的修饰可位于一个或多个以下位置：85、86、122、119、120、201、245、23、81、82、289、227、229、233、33、207、130，其中所述位置编号被定义为在基于初级或三级结构比对时，对应于本文SEQ ID No.6所示酶的相同位置的位置。
本发明另一方面提供了一种的前肽或多肽，其具有脂质酰基转移酶活性并且包含SEQ ID No.6或16所示的氨基酸序列，但在第27和/或31位的一个或多个位置具有一个或多个修饰且与至少一个进一步的修饰组合。
合适地，所述至少一个进一步的修饰可位于一个或多个以下位置：85、86、122、119、120、201、245、23、81、82、289、227、229、233、33、207和/或130，其中所述位置编号被定义为在基于初级或三级结构比对时，对应于本文SEQ ID No.6所示酶的相同位置的位置。
本发明的多肽可以是前肽(pro-peptide)，其经历进一步的翻译后修饰成为成熟肽，即具有脂质酰基转移酶活性的多肽。仅作为示例，SEQ ID No.16与SEQ ID No.6相同，但SEQ ID No.16经历翻译后和/或转录后修饰以除去一些氨基酸，更具体地为38个氨基酸。因此，本文SEQ ID No.6所示的多肽在一些情况下(即在一些宿主细胞中)可以被认为是前肽，其通过翻译后和/或转录后修饰而被进一步加工成成熟肽。对于翻译后和/或转录后修饰，精确的修饰，例如切割位点，可根据宿主种类而略有变化。在一些宿主物种中，可能没有翻译后和/或转录后修饰，这样，前肽可等同于成熟肽(即具有脂质酰基转移酶活性的多肽)。不期望受理论约束，与通过SEQ ID No.6与SEQ IDNo.16比较的参照所示的切割位点相比，所述切割位点可以在任一方向移动数个残基(例如1、2或3个残基)。换而言之，例如不是在第235位-ATR至第273位(RRSAS)切割，而可以在例如残基232、233、234、235、236、237或238处开始切割。此外或可选择地，可以在残基270、271、272、273、274、275或276处终止切割。此外或可选择地，切割可导致去除大约38个氨基酸，在一些实施方式中切割可导致去除30-45个之间的残基，例如34-42个残基，例如36-40个残基，优选38个残基。
本发明进一步提供了制备食品的方法，其包括向所述食品的一个或多个成分中添加本发明的多肽。
本发明另一方面提供了制备烘焙产品的方法，所述方法包括向生面团中添加本发明的多肽，并烘焙生面团以制备烘焙产品。
本发明另一方面提供了本发明的或可通过本发明的方法获得(优选已经获得)的变体脂质酰基转移酶在处理蛋或基于蛋的产品以产生溶血磷脂的方法中的应用。
本发明进一步提供了制备溶血磷脂的方法，所述方法包括用本发明的多肽处理磷脂以产生溶血磷脂。
在再一实施方式中，本发明提供了制备溶血糖脂的方法，所述方法包括用本发明的多肽处理糖脂以产生溶血糖脂。
本发明进一步提供了植物油或食用油的酶促脱胶方法，所述方法包括用本发明的多肽处理所述食用油或植物油，从而水解其中存在的大部分极性脂质。
本发明另一方面提供了本发明的的或可通过本发明的方法获得(优选已经获得)的变体脂质酰基转移酶在降低食用油中的磷脂含量的方法中的应用，所述方法包括用所述变体脂肪分解酶处理所述油，从而水解大部分的所述磷脂，并将含水解磷脂的水相与油相分开。
本发明另一方面提供了由本发明的方法获得的食品或烘焙产品。
本发明另一方面提供了包含本发明的变体脂质酰基转移酶的清洁组合物或去污组合物。
本发明再一方面提供了包含本发明的变体脂质酰基转移酶的面包和/或生面团改良组合物。
涉及可用于本发明的核苷酸序列的其他方面包括：包含本发明的序列的构建体；包含用于本发明的序列的载体；包含用于本发明的序列的质粒；包含用于本发明的序列的转化细胞；包含用于本发明的序列的转化组织；包含用于本发明的序列的转化器官；包含用于本发明的序列的转化宿主；包含本用于发明的序列的转化生物。本发明还涵盖利用以上来表达用于本发明的核苷酸序列的方法，例如在宿主细胞中表达；包括转移方法。本发明进一步涵盖分离所述核苷酸序列的方法，例如从宿主细胞分离苷酸序列的方法。
涉及可用于本发明的氨基酸序列的其它方面包括：编码用于本发明的氨基酸序列的构建体；编码用于本发明的氨基酸序列的载体；编码用于本发明的氨基酸序列的质粒；表达用于本发明的氨基酸序列的转化细胞；表达用于本发明的氨基酸序列的转化组织；表达用于本发明的氨基酸序列的转化器官；表达用于本发明的氨基酸序列的转化宿主；表达用于本发明的氨基酸序列的转化生物。本发明还涵盖利用以上来纯化用于本发明的氨基酸序列的方法，例如在宿主细胞中表达；包括转移，然后纯化所述序列的方法。
发明的详细内容
除非另有说明，否则所有氨基酸位置编号均涉及当基于初级和/或三级结构(优选初级结构)比对时，本文SEQ ID No.6所示的酶的相应位置。然而，在一些实施方式中，本文使用的氨基酸位置编号可以涉及当基于本文SEQ IDNo.16所示酶的三级结构比对时的相应位置。
在分析脂质酰基转移酶的3-D结构(三级结构)时，可确定酶中适合产生具有改良性质的工程化脂质酰基转移酶的修饰位点。
本发明提供了鉴定脂质酰基转移酶中适合修饰的区域的工具。在一些优选的实施方式中，所述修饰导致改良的性质，其可包括a)改变脂质酰基转移酶的底物特异性，例如并且仅作为示例：i)改变酶使用某些化合物作为受体的能力，例如提高酶利用碳水化合物(例如麦芽糖)作为受体分子的能力，由此改善酶产生碳水化合物酯的能力；或ii)改变酶利用饱和或不饱和的脂肪酸作为底物的能力；或iii)改变酶的特异性，从而使其优先利用来自脂质的Sn1或Sn2位的脂肪酸；或iv)改变酶的底物链长特异性；b)改变酶的动力学；和/或c)降低酶进行水解反应的能力同时保持或增强酶进行酰基转移反应的能力。
所述脂质酰基转移酶的三级结构揭示了不寻常且有趣的结构，该结构可使脂质酰基转移酶得到更有效的工程化加工。特别地，所述脂质酰基转移酶的三级结构已经揭示了穴(cave)和峡谷(canyon)结构。
穴区中的改变可以(例如)改变如酶的底物链长特异性。
现已发现峡谷中的改变(特别是一些优选的关键修饰)对于例如增强或改变酶的底物特异性具有重要性。
特别地，发明人已经发现，在峡谷中具有多个修饰，其等级高(rank highly)且产生具有改良性质的感兴趣变体，这些修饰可见于第31、27、85、86、119和120位。在一些实施方式中，高度优选第31和/或27位。
因此，在本发明的广义概念中，涉及在穴和/或峡谷区(优选峡谷区)内修饰脂质酰基转移酶，由此产生具有改变的活性/性质的经修饰的酶。
在一些实施方式中，优选具有在峡谷区内的至少一个修饰和峡谷区内或外的其他位置的至少一个修饰的组合。在一些实施方式中，优选所述改变不在穴区内。
在一个广义的方面，本发明可提供修饰脂质酰基转移酶(或者通过修饰核苷酸序列或者通过修饰氨基酸序列)，由此在以下残基产生一个或多个修饰的方法：27、31、85、86、122、119、120、201、245、232、235、236，以及具有所述修饰的核酸和脂质酰基转移酶。
在另一个广义的方面，本发明可提供用于修饰脂质酰基转移酶(或者通过修饰核苷酸序列或者通过修饰氨基酸序列)，由此在以下残基产生一个或多个修饰的方法：27、31、85、86、122、119、120、201、245，在一些情况下，所述一个或多个修饰可以与一个或多个以下残基中的一个或多个进一步的修饰组合：23、81、82、289、227、229、233、33、207或130。本发明还提供了具有这些修饰的核酸和脂质酰基转移酶。
与亲本酶相比，所述变体酶必须包含至少一个氨基酸修饰。在一些实施方式中，与亲本酶相比，所述变体酶可包含至少2个，优选至少3个，优选至少4个氨基酸修饰。
在本发明的一些实施方式中，编码本文SEQ ID No.6或16所示的脂质酰基转移酶的DNA序列经过修饰。
合适地，本发明的方法可包括将变体酶配制成酶组合物和/或食品组合物，例如面包改良组合物的额外步骤。本发明进一步提供了包含本发明所述的变体脂质酰基转移酶的面包改良组合物。
优选地，产生变体脂质酰基转移酶的方法进一步包括一个或多个以下步骤：
1)结构同源性制图，或
2)序列同源性比对。
如果脂质酰基转移酶的氨基酸残基同源于(即在初级和/或三级结构中具有相应的位置)或者类似于SEQ ID No.6或16所示的脂质酰基转移酶中的特异残基或该残基部分(即具有组合、反应和/或化学相互作用的相同或类似功能性作用)，则脂质酰基转移酶的氨基酸残基可等同于(equivalent to)本文SEQID No.16或6所示的脂质酰基转移酶的残基。
在一些实施方式中，为了建立与初级结构的同源性，将脂质酰基转移酶的氨基酸序列与本文SEQ ID No.6或16所示的脂质酰基转移酶的初级序列，尤其是在序列已知的所有或多数脂质酰基转移酶中已知不变的残基组进行直接比较。在比对保守残基，允许必要的插入和删除以保持对齐(即避免通过任意删除和插入而消除保守残基)后，限定出了与SEQ ID No.6或16的初级序列中的特定氨基酸等同的残基。在优选的实施方式中，保守残基的比对保留100%的此类残基。然而，保守残基的大于75%或低至50%的比对也足以限定出等同的残基。在优选的实施方式中，保持催化性丝氨酸和组氨酸残基的保守性。使用保守残基来限定其他脂质酰基转移酶中，例如在来自其他气单胞菌(Aeromonas)种以及任意其他生物的脂质酰基转移酶中与SEQ ID No.6或16所示的脂质酰基转移酶相应的等同氨基酸残基。
为了将亲本脂质酰基转移酶与SEQ ID No.6或SEQ ID No.16(参照序列)比对，可以使用序列比对，例如逐对比对(http://www.ebi.ac.uk/emboss/a lign/index.html)。由此，可以确定并修饰在可选的亲本脂质酰基转移酶多肽中与参照SEQ ID No.16或SEQ ID No.6所限定的一个或多个氨基酸对应的等同氨基酸。本领域技术人员易于理解，当使用emboss逐对比对时，标准设置通常足矣。可以利用“针(needle)”鉴定相应残基，以进行覆盖两个序列的全长的比对。然而，也可利用“水(water)”发现两个序列间相似性最佳的区域。
可选择地，尤其例如，在亲本脂质酰基转移酶与SEQ ID No.6或SEQ IDNo.16的初级结构同源性低的情况下，可通过与SEQ ID No.16或SEQ ID No.6，优选与SEQ ID No.16的结构模型的结构比对，确定可选亲本脂质酰基转移酶中与参照SEQ ID No.6或SEQ ID No.16所限定的一个或多个氨基酸对应的相应氨基酸。
因此，可通过在三级结构水平上确定与已经通过x-射线结晶学确定三级结构的脂质酰基转移酶的同源性，来定义等同的残基。在这种情况下，“等同残基”被定义为在比对后，与本文SEQ ID No.6或16所示的脂质酰基转移酶的特定氨基酸残基的两个或更多个主链原子的原子坐标(N对N、CA对CA、C对C、和O对O)在0.13nm以内，且优选在0.1nm以内的那些残基。在定向并定位最佳模型后实现比对，从而产生所述脂质酰基转移酶的非氢蛋白原子的原子坐标与本文SEQ ID No.6或16所示的脂质酰基转移酶的最大重叠。如本领域已知的，最佳模型是在可得的最高分辨率下产生用于实验衍射数据的最低R因子的晶体学模型。将在功能和/或结构上类似于本文SEQ ID No.6或16所示脂质酰基转移酶的具体残基的等同残基定义为，脂质酰基转移酶的的那些氨基酸，其优先采用使得其改变、修饰或者调节蛋白结构的构象，从而以限于并归结于本文SEQ ID No.6或16所示的脂质酰基转移酶的具体残基的方式导致底物属性，例如底物结合和/或催化作用的变化。此外，它们是脂质酰基转移酶的那些残基(在已通过x-射线结晶学获得三级结构的情况下)：其占据类似位置的程度使得尽管给定残基的主链原子不满足基于占据同源位置的等同标准，但所述残基的至少两个侧链原子的原子坐标位于本文SEQ ID No.6或16所示的脂质酰基转移酶的相应侧链原子的0.13nm以内。
确定了本文SEQ ID No.16所示的脂质酰基转移酶(其是包含N80D突变的杀鲑气单胞菌脂质酰基转移酶)的三维结构的坐标，并将其示于下表中并应用于在三级结构水平上确定等同的残基。
结晶：利用悬滴扩散法获得酶的晶体，具体地，将液滴(5μl蛋白溶液(mg/ml in)与5μl储备溶液(reservoir solution):1.4M磷酸铵、0.10M磷酸钾、44mM氯化钠、94mM氯化铵、2mM硫酸镁、2mM氯化钙，混合)放置在塑料盖玻片上并翻转到6x4Linbro平板的含1ml储备溶液的孔上，并使其在持续数天至2周长的时间内达到平衡。通过将预先生长的晶体浸入含10mM(NH4)2PtCl4的储备溶液中，获得(NH4)2PtCl4的晶体。
X-射线数据收集：在斯坦福同步加速器辐射实验室(SSRL,Menlo Park,USA)，在Beamline 11.1上对应于铂MAD实验的拐点(λ1)、低能远端(lowenergy remote,λ2)和峰(λ3)的波长，收集(NH4)2PtCl4衍生物的多波长反常衍射数据。之后，以
Figure BDA00001770085400131
的分辨率收集数据集(λ0)。利用Quantum 315CCD在100K收集所述数据集。利用Mosflm(Leslie,A.G.W.(1999)Acta Crystallogr.,D55,1696-1702)整合数据，并利用来自CCP4套装(Collaborate computerproject,Number 4(1994)The CCP4 suite:programs for protein crystallography.Acta Chrystallogr.,D50,760-763)的SCALA程序绘图。数据统计概括在表A中。
X-射线数据收集：在斯坦福同步加速器辐射实验室(SSRL,Menlo Park,USA)，在Beamline 11.1上对应于铂SAD实验的峰(λ1)的波长，收集(NH4)2PtCl4衍生物的多波长反常衍射数据。之后，以的分辨率收集数据集(λ0)。利用Quantum 315CCD在100K收集所述数据集。利用Mosflm[如上文]整合数据，并利用来自CCP4套装[如上文]的SCALA程序绘图。数据统计概括在下表(模型部分-mod)中。
结构解析和修正：利用使用CCP4套装的
Figure BDA00001770085400141
铂SAD数据(λ3或λ1)和SOLVE/RESOLVE程序(Terwilliger,T.C.and Berendzen,J.(1999)ActaCrystallogr.,D55,849-861)确定初始结构。利用O10和COOT(Jones,T.A.,et al.(1991)Acta Crystallogr.,A47,110-119)进行模型构建。然后利用使用REFMAC(Collaborate computer project,Number 4(1994)The CCP4 suite:programs forprotein crystallography.Acta Chrystallogr.,D50,760-763)的
Figure BDA00001770085400142
数据集(λ0)对追踪模型(traced model)进行修正。修正的统计数据概括在下表中。最终的模型包括不对称单元中的蛋白二聚体和1198个水分子。在所有分子中均没有观察到第一蛋氨酸残基的电子密度。PROCHECK11(Laskowski,G.N.et al.(1993)J.Appl.Chrystallogr.,26,91-07)表明，所有单体中94%的残基都位于Ramachandran图(Ramachandran,G.N.et al.(1968)Advan.Protein Chem.,23,283-437)的核心区，在不允许区或勉强许可区中没有残基。
所有图像图均由PyMOL(Warren L.DeLano“The PyMOL MolecularGraphics System.”DeLano Scientific,Belmont,CA,USA.http://www.pymol.org)绘制。
表A：本文SEQ ID No.16所示的脂质酰基转移酶(在本文中也称为具有N80D突变且经翻译后修饰(切割)的来自杀鲑气单胞菌的脂质酰基转移酶)的晶体参数、数据收集和修正统计数据的概述：
Figure BDA00001770085400143
Figure BDA00001770085400151
+最高分辨率壳
ESU=估测的整体坐标误差(Tickle et al.,1998).
Rsym=∑|Ii-<Ii>|/∑|Ii|，其中Ii是第i次测量的标度强度，<Ii>为该反射的平均强度。
Rcryst=∑||Fobs|-|Fcalc||/∑|Fobs|，其中Fcalc和Fobs分别是所计算和所观察到的结构因子幅度。
Rfree=如Rcryst，但是用于随机选择并从修正删去的总反射的5.0%。
晶体结构显示所述酶为由Ser16、Asp 288和His 291构成的催化三联体。
利用程序DALI(Holm and Sander,Trends Biochem.Sci.,478-480[1995])进行结构-同源性检索，其基于距离标准并且不使用序列信息用于比较以获得紧密相关的蛋白。
在本发明中，利用程序PyMOL将大肠杆菌硫酯酶I(1IVN)与本文SEQ IDNo.16所示的脂质酰基转移酶进行结构上的比对，以鉴定可为用于脂质酰基转移酶的工程改造的目标区域。显然，硫酯酶I(1IVN)是与脂质酰基转移酶相比具有非常不同的活性和特异性的酶，并且从初级水平看具有完全不同的氨基酸序列。然而，硫酯酶I(1IVN)的三级结构可以与脂质酰基转移酶相比。在对脂质酰基转移酶进行工程加工并选择三级结构中的小差异(例如穴区、峡谷区和插入区必然促成脂质酰基转移酶与硫酯酶I(1IVN)相比的不同活性)作为修饰时，这些酶结构上相似但具有非常不同的活性这一事实是有用的。
这个比对揭示了一些感兴趣的点，其中，发现脂质酰基转移酶共有共同的结构基序，其具有在任一侧被α-螺旋夹在中间的五链平行β-折叠结构。经历翻译后修饰(即切割)并且包含N80D突变的杀鲑气单胞菌脂质酰基转移酶(SEQ ID No.16)的三维结构显示脂质酰基转移酶类，尤其是所述脂质酰基转移酶在二级结构的共有元件之间包含大的插入物。
例如，在杀鲑气单胞菌的酰基转移酶最后的β-链和ASP-X-X_HIS基序之间具有大的插入物。该插入物产生与酰基酶中间物的脂肪链结合的大腔(下文称为“穴”)。该区的序列和尺寸的调节形成用于酰基酶中间物的脂肪链(即由所述酶转移的酰基链)的较小或较大的“穴”或“腔(cavity)”。因此，该家族的酶可以经工程加工而优先转移不同长度的酰基链。
相对于大肠杆菌硫酯酶(PDB登记号:1IVN)，在脂质酰基转移酶中发现4个插入物，其与两个结构共有的共同二级结构元件相连。
本文SEQ ID No.16所示的脂质酰基转移酶中的这些插入物的氨基酸坐标列于下表：所述插入物还示于图32、33、34和35的结构中。
表：脂质酰基转移酶中的插入物
 插入物   残基
 插入物1   22-36
 插入物2   74-88
 插入物3   162-168
 插入物4   213-281
在脂质酰基转移酶中具有用于底物结合的大表面，其可以分成被Ser 16和His 291分隔的两个区域，其中Ser 16和His 291以及Asp288形成特有的催化三联体。这两个区域示于图30中，并且可以表征为深通道或“峡谷”(用箭头标记，且下文称为“峡谷”)，其通向贯穿所述分子的封闭腔或“穴”(用箭头标记)。
形成峡谷的残基示于下表：
表：峡谷残基
  插入1   M23,M27,Y30,L31
  片段1   F42,G67,G68
  插入2   D80,P81,K82,Q84,V85,I86
  片段2a   Y117,A119,Y120
  插入4   G229,Y230,V231
形成穴的残基示于下表。
表：穴残基
 片段1   D15,S16,L18
 片段2   W111,A114,L115,L118
 片段3   P156,D157,L158,Q160,N161
 片段4   F206,A207,E208,M209,L210
 片段5   M285,F286,V290,H291,P292,V295
片段3和4分别在插入物3和4之前，并且片段5紧邻在插入物4之后。插入物4和5还有助于形成所述穴的外罩(over enclsoure)，因此，所述穴与所述峡谷的区别在于插入物1和2形成所述峡谷的内衬，而插入物3和4形成覆盖结构。插入物3和4覆盖了所述穴。
在本发明的一个实施方式中，可以通过修饰所述峡谷、穴、插入物1、插入物2、插入物3或插入物4中一个或多个的氨基酸残基而改变脂质酰基转移酶。
在本发明的一个实施方式中，可以通过修饰所述峡谷、插入物1或插入物2中一个或多个的氨基酸残基而改变脂质酰基转移酶。
在一个实施方式中，可以通过改变形成较大穴的氨基酸残基而改变脂质酰基转移酶的酰基链结合腔的尺寸。这可以通过调节如上所讨论的连接共有的二级结构特征的区域的尺寸而完成。特别地，可以通过改变在所述酶最后的(第五个)β链和形成部分催化三联体的Asp-X-X-His基序之间的区域内的氨基酸而改变所述穴的尺寸。
脂质酰基转移酶的底物链长特异性决定片段是位于所述酶的β5β-链和该酶的催化三联体的Asp残基(Asp残基为Asp-Xaa-Xaa-His基序的一部分)之间的连续氨基酸区域。
杀鲑气单胞菌脂质酰基转移酶和大肠杆菌硫酯酶(在NCBI Genbank数据库中的保藏编号为1IVN_A;GID:33357066)的三级结构分别显示了特征性的三层α/β/α结构，其中所述β-折叠由五个平行链组成，这使得每种脂质酰基转移酶的底物链长特异性决定片段均可被确定。
杀鲑气单胞菌脂质酰基转移酶的底物链长特异性决定片段紧邻于所述酶的催化三联体的Asp残基的N-末端。然而，底物链长特异性决定片段的长度可随所述酶的Asp残基和β5β-链之间的距离而变化。例如，所述脂质酰基转移酶的底物链长特异性决定片段的长度分别为约13个氨基酸、19个氨基酸和约70个氨基酸。因此，根据脂质酰基转移酶，底物链长特异性决定片段的长度可以为10-70个氨基酸，长度为10-30个氨基酸，长度为30-50个氨基酸，或者50-70个氨基酸。
下表提供了所述脂质酰基转移酶的底物链长特异性决定片段的示例性序列。
Figure BDA00001770085400181
在某些实施方式中，底物链长特异性决定片段的氨基酸序列可以是或不是野生型酶的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述底物链长特异性决定片段可以具有与野生型脂质酰基转移酶的底物链长特异性决定片段具有至少70%同一性，例如至少80%同一性，至少90%同一性或者至少95%同一性的氨基酸序列。
合适地，可以利用定点诱变法制备所述变体酶。
可选择地，例如可以使用商业试剂盒，例如来自Stratagene的GeneMorphPCR诱变试剂盒，或者来自Clontech的Diversify PCR随机诱变试剂盒随机制备突变。EP 0583265涉及基于诱变的PCR优化方法，其也可以与诸如EP0866796中描述的诱变DNA类似物组合使用。易错PCR技术适合产生具有优选特征的脂质酰基转移酶的变体。WO0206457涉及脂肪酶的分子进化。
用以获得新序列的第三个方法是通过使用任何数量的限制性酶，或者诸如Dnase I的酶使不同的核苷酸序列片段化，并重新组装编码功能蛋白的完整核苷酸序列(下文称为“改组”)。可选择地，可以使用一个或多个不同的核苷酸序列并在重新组装完整核苷酸序列的过程中引入突变。DNA改组和家族改组技术适合用于产生具有优选特征的脂质酰基转移酶的变体。适合用于进行“改组”的方法可见于EP0752008、EP1138763、EP1103606。改组还可以与US 6,180,406和WO 01/34835中描述的其他形式的DNA诱变法组合。
因此，可在体内或体外在核苷酸序列中产生多个定点或随机突变，并随后通过各种方式筛选所编码的变体多肽的改进功能性。
此外，作为非限制性实例，多核苷酸序列的突变或天然变体可以与野生型或其他突变或天然变体重组以产生新的变体。还可以根据所编码多肽的改良的功能性来筛选此类新变体。
优选的修饰位于一个或多个以下位置：
L031、I086、M027、V085、A119、Y120、W122、E201、F235、W232、A236和/或Q245。
特别地，关键的修饰包括一个或多个以下修饰：L31Q、H、N、T、F、Y或C(优选L31Q)；M27R、G、H、K、Y、D、N、V、C、Q、L、E、S或F(优选M27V)；V85H、R、D或E；I86R、Y、S、V、I、A、T、M、F、C或L(优选I86S或A)；A119T或I；Y120K或E；W122S、L或A(优选W122L)；E201R；Q245S；F235A或V；W232G或S；和/或A236G或E。
在一个实施方式中，当在峡谷中形成所述至少一个修饰时，所述修饰在一个或多个以下位置：31、27、85、86、119、120。
特别地，所述峡谷内的关键修饰包括一个或多个以下修饰：L31Q、H、N、T、F、Y或C(优选L31Q)；M27R、G、H、K、Y、D、N、V、C、Q、L、E、S或F (优选M27V)；V85H、R、D或E；I86R、Y、S、V、I、A、T、M、F、C或L (优选I86S或A)；A119T或I；Y120K或E，其可以与另一个修饰组合和/或与进一步的修饰组合。
在一个实施方式中，优选地，当所述修饰在插入位点1内时，所述修饰位于第31和/或27位的一个或多个位置。合适地，所述修饰可以为L31Q、H、N、T、F、Y或C(优选L31Q)和/或M27R、G、H、K、Y、D、N、V、C、Q、L、E、S或F(优选M27V)。
在一个实施方式中，优选地，当所述修饰在插入位点2中时，所述修饰在第085、086位。合适地，所述修饰可以为V85H、R、D或E和/或I86R、Y、S、V、I、A、T、M、F、C或L。
在一个实施方式中，优选地，当所述修饰在插入位点4中时，所述修饰在第245位。合适地，所述修饰可以为Q245S。
在一个实施方式中，优选至少在插入位点1中进行所述修饰。
在一个实施方式中，优选地，至少在插入位点1中进行所述修饰，并组合在插入位点2和/或4中和/或在一个或多个以下位点的进一步的修饰：119、120、122、201、77、130、82、120、207、167、227、215、230、289。
在进一步的实施方式中，优选地，至少在峡谷区中进行所述修饰，并组合插入位点4中和/或在一个或多个以下位点的进一步的修饰：122、201、77、130、82、120、207、167、227、215、230、289。
以下给出了特定位点的优选修饰：
R130R、V、Q、H、A、D、L、I、K、N、C、Y、G、S、F、T或M；
K82R、N、H、S、L、E、T、M或G；
G121S、R、G、E、K、D、N、V、Q或A；
Y74Y或W；
Y83F或P；
I77T、M、H、Q、S、C、A、E、L、Y、F、R或V；
A207E；
Q167T、H、I、G、L或M；
D227L、C、S、E、F、V、I、T、Y、P、G、R、D、H或A；
N215G；
Y230A、G、V、R、I、T、S、N、H、E、D、Q、K；或
N289P。
与第31、27、85、86、119、120、122、201、245、235、232和/或236位的一个或多个修饰组合(例如所述修饰可以为以下的一个或多个：L31Q、H、N、T、F、Y或C(优选L31Q)；M27R、G、H、K、Y、D、N、V、C、Q、L、E、S或F(优选M27V)；V85H、R、D或E；I86R、Y、S、V、I、A、T、M、F、C或L(优选I86S或A)；A119T或I；Y120K或E；W122S、L或A(优选W122L)；E201R；Q245S；F235A或V；W232G或S；和/或A236G或E)，合适地，可以在变体脂质酰基转移酶的一个或多个以下位点对进行额外修饰：130、82、121、74、83、77、207、167、227、215、230、289(例如额外的修饰可以为以下一个或多个：R130R、V、Q、H、A、D、L、I、K、N、C、Y、G、S、F、T或M；K82R、N、H、S、L、E、T、M或G；G121S、R、G、E、K、D、N、V、Q或A；Y74Y或W；Y83F或P；I77T、M、H、Q、S、C、A、E、L、Y、F、R或V；A207E；Q167T、H、I、G、L或M；D227L、C、S、E、F、V、I、T、Y、P、G、R、D、H或A；N215G；Y230A、G、V、R、I、T、S、N、H、E、D、Q、K；和/或N289P)，优选地，可以在所述变体脂质酰基转移酶的至少一个或多个以下位点进行额外的修饰：130、82、77或227。
为了避免怀疑，在与本文SEQ ID No.6所示的脂质酰基转移酶进行(在初级或三级基础上)比对时，所述脂质酰基转移酶骨架优选在第80位具有D。因此，发明人在本文教导的多个组合中均显示作为修饰的N80D。如果没有提及N80D作为合适修饰，并且亲本骨架在第80位不包含D，则必须要将N80D的额外修饰引入至变体脂质酰基转移酶中，以确保变体在第80位包含D。
在骨架或亲本脂质酰基转移酶已经包含N80D修饰时，可以在表述其他修饰时不引用N80D修饰，即L31Q、N80D、W122L可以表述为例如L31Q、W122L。
然而，重要的是应该注意N80D修饰是优选的修饰，并且优选使用在第80位已经具有氨基酸D的骨架酶或亲本酶。然而，如果使用了在该位置不含氨基酸D的骨架(例如本文SEQ ID No.1、3、4、5、8或9所示的一个或多个脂质酰基转移酶)，则优选包括N80D的额外修饰。
在一个实施方式中，本发明涉及产生变体脂质酰基转移酶的方法，所述方法包括：
a)在亲本脂质酰基转移酶的至少第27或31位取代至少一个氨基酸残基，从而产生变体脂质酰基转移酶，其中通过将亲本酶与SEQ ID No.16或SEQ ID No.6比对而鉴定出所述位点；
b)与所述亲本脂质酰基转移酶相比，测定变体脂质酰基转移酶将酰基转移至麦芽糖的能力；和
c)选择与亲本脂质酰基转移酶相比，转移酰基至麦芽糖的活性提高的变体脂质酰基转移酶。
合适地，通过将亲本序列与SEQ ID No.16或SEQ ID No.6比对而鉴别第27或31位的取代。此外或可选择地，第31位的取代可以为取代成选自以下组成的组的氨基酸残基的取代：Q、H、Y、N、T、F、Y和C，优选Q。第27位的取代可以为取代成选自以下组成的组的氨基酸残基的取代：R、G、H、K、Y、D、N、V、C、Q和L，优选V。
本发明还涉及制备变体脂质酰基转移酶的方法，所述方法包括：
a)将亲本脂质酰基转移酶的至少第31位的至少一个氨基酸残基取代成谷氨酰胺，其中所述位点是通过将亲本酶与SEQ ID No.16或SEQ ID No.6比对而鉴定的；
b)其中，当使用方案1中提供的麦芽糖转移酶实验时，所述变体脂质酰基转移酶具有至少0.0282%的麦芽糖转移酶活性。
本发明还涉及可通过本发明的任一方法获得(或已获得)的变体脂质酰基转移酶。
合适地，通过比对亲本序列和SEQ ID No.16或SEQ ID No.6而鉴定的第31位的取代可以为取代成选自由以下组成的组的氨基酸残基的取代：Q、H、Y和F，优选Q。
合适地，所述变体多肽包含在第27、77、80、82、85、85、86、121、122、130、167、207、227、230或289氨基酸残基位中的任意一个或多个位置的一个或多个进一步的修饰，其中，所述位置是通过将亲本序列与SEQ IDNo.16比对而鉴定出的。合适地，所述一个或多个进一步的修饰中的至少一个可在第86、122或130位的氨基酸残基位点，其中，所述位置是通过将亲本序列和SEQ ID No.16比对而鉴定出的。
合适地，所述变体脂质酰基转移酶包含一个或多个以下进一步的取代：I86(A、C、F、L、M、S、T、V、R、I或Y)；W122(S、A、F、W、C、H、L、M、R或Y)；R130A、C、D、G、H、I、K、L、M、N、Q、T、V、R、F或Y)；或其任意组合。
合适地，所述变体脂质酰基转移酶可包含本文实施例的表1和/或表2中教导的至少一个突变，或者本文实施例的表3和/或表4教导的修饰组合。
所述变体脂质酰基转移酶可包含以下修饰组合之一(当亲本骨架已经包含在第80位的氨基酸D时，所述修饰的表述可以不引用N80D)：
L31Q,N80D,I86S,W122F
L31Q,N80D,W122L
L31Q,N80D,I86V， W122L
L31Q,N80D,I86I,W122L
L31Q,N80D,I86S,R130R
L31Q,N80D,K82R,I86A
L31Q,N80D,I86S,W122W
L31Q,N80D,I86S,W122Y
M27V，L31Q,N80D
L31Q,N80D,I86A,W122L
L31Q,N80D,W122L
L31Q,N80D,I86S,G121S
L31Q,N80D,I86S
L31Q,N80D,K82R,I86S
L31Q,N80D,I86S,W122L,R130Y
L31Q,N80D,I86S,W122L,R130V
L31Q,N80D,I86S
L31Q,N80D,I86T,W122L
L31Q,N80D,I86S,W122L
L31Q,N80D,W122L,R130Q
L31Q,N80D,I86S,W122L,R130R
L31Q,N80D,I86S
L31Q,N80D,G121R
L31Q,N80D,I86A
M27C,L31Q,N80D
M27Q,L31Q,N80D
L31Q,N80D,G121S
L31Q,N80D,I86S,W122R
L31Q,N80D,R130Q
L31Q,N80D,I86S,W122H
L31Q,N80D,I86M,W122L
L31Q,N80D,R130N
L31Q,N80D,I86S,W122L
L31Q,N80D,K82N
L31Q,N80D,I86S,W122M
L31Q,N80D,W122L
L31Q,N80D,K82H
L31Q,N80D,R130H
L31Q,N80D,R130A
L31Q,N80D,G121S
L31Q,N80D,I86S,W122L,R130D
L31Q,N80D,I86M
L31Q,Y74Y，N80D
L31Q,N80D,R130L
L31Q,N80D,Y83F
L31Q,N80D,K82S
L31Q,I77T,N80D
L31Q,N80D,I86S,W122L,R130I
L31Q,N80D,I86S,W122L
L31Q,N80D,I86F,W122L
M27N,L31Q,N80D
L31Q,N80D,Y83P
L31Q,N80D,R130K
L31Q,N80D,K82R,I86S,W122L
L31Q,N80D,K82L
L31Q,N80D,I86S,G121G
L31Q,N80D,I86A,R130Q
M27H,L31Q,N80D
L31Q,N80D,W122L,A207E
L31Q,N80D,W122L,R130L
L31Q,N80D,K82E
L31Q,N80D,G121E
L31Q,N80D,W122L,R130R
L31Q,I77M,N80D
L31Q,N80D,K82T
L31Q,N80D,W122L
L31Q,N80D,W122H
L31Q,N80D,Q167T
L31Q,I77H,N80D
L31Q,N80D,G121K
L31Q,I77Q,N80D
L31Q,N80D,W122L,R130N
L31Q,N80D,W122L
L31Q,N80D,G121D
L31Q,N80D,R130T
L31Q,N80D,R130T
L31Q,N80D,K82M
L31Q,N80D,Q167H
L31Q,N80D,I86T
L31Q,N80D,Q167I
L31Q,N80D,I86C
L31Q,N80D,Q167G
M27L,L31Q,N80D
L31Q,N80D,I86S,G121R
L31Q,I77S,N80D
L31Q,I77C,N80D
L31Q,N80D,G121N
L31Q,I77A,N80D
L31Q,N80D,R130M
L31Q,N80D,W122F
M27G， L31Q,N80D
L31Q,N80D,K82G
L31Q,N80D,I86S,W122L,R130K
L31Q,N80D,R130A
L31Q,N80D,I86I
L31Q,I77E,N80D
L31Q,N80D,D227L
L31Q,N80D,V85H,N215G
L31Q,N80D,I86A,W122L,R130N
L31Q,I77R,N80D
L31Q,N80D,I86F
L31Q,N80D,I86Y，W122L
M27K,L31Q,N80D
L31Q,N80D,D227C
L31Q,N80D,R130L
L31Q,N80D,I86C,W122L
L31Q,N80D,Q167L
L31Q,N80D,V85H
L31Q,N80D,Q167M
M27D,L31Q,N80D
L31Q,N80D,I86L
L31Q,N80D,Y230A
L31Q,N80D,W122R
L31Q,N80D,Y230G
L31Q,N80D,D227S
L31Q,N80D,W122L,A207E,N289P
L31Q,N80D,W122Y
L31Q,N80D,I86L,W122L
L31Q,N80D,K82R,I86S,G121S,R130Q
L31Q,Y74W，N80D
L31Q,N80D,R130F
L31Q,N80D,G121V
L31Q,N80D,W122L,R130M
L31Q,N80D,R130V
L31Q,N80D,Y230V
L31Q,N80D,N215G
L31Q,N80D,I86S,W122L,R130N
L31Q,N80D,Y230R
M27E,L31Q,N80D
L31Q,N80D,Y230I
L31Q,N80D,I86S,W122L,R130S
L31Q,N80D,K82R
L31Q,N80D,D227E
L31Q,N80D,K82R,I86A,G121S
L31Q,N80D,R130G
L31Q,I77V， N80D
L31Q,N80D,G121G
L31Q,N80D,Y230T
L31Q,N80D,K82R,I86S,R130N
L31Q,N80D,D227F
L31Q,N80D,I86A,G121R
L31Q,N80D,I86S,R130N
L31Q,N80D,W122C
L31Q,N80D,Y230S
L31Q,N80D,R130Y
L31Q,N80D,R130C
L31Q,I77L,N80D
A119T,N80D
A199A,N80D
G67A,N80D,V85H
其中，所述位置是通过将亲本序列与SEQ ID No.16或SEQ ID No.6比对而鉴定出的。
合适地，除了在第31位的修饰和任选在第27、77、80、82、85、85、86、121、122、130、167、207、227、230和289氨基酸残基位中的任意一个或多个位置的一个或多个进一步的修饰外，所述变体脂质酰基转移酶可以与亲本脂质酰基转移酶相同，其中，所述位置是通过将亲本酶与SEQ ID No.16或SEQ ID No.6比对而鉴定出的。
合适地，除了在第31位的修饰和任选在第86、122或130氨基酸残基位中的任意一个或多个位置的一个或多个进一步的修饰外，所述变体脂质酰基转移酶可以与亲本脂质酰基转移酶相同，其中，所述位置是通过将亲本酶与SEQ ID No.16或SEQ ID No.6比对而鉴定出的。
在一个实施方式中，当亲本序列为SEQ ID No.6或SEQ ID No.16时或者当亲本序列由SEQ ID No.10或SEQ ID No.25编码时，除了在第80位外的修饰外，所述变体多肽还可以具有以上详述的任意一个修饰。因此，当通过将亲本序列与SEQ ID No.6比对而鉴定出所述位置时，SEQ ID No.6、SEQID No.16或者由SEQ ID No.10或SEQ ID No.25编码的多肽在第80位已经具有天冬氨酸。
合适地，所述变体脂质酰基转移酶或者可由本发明的方法获得的变体脂质酰基转移酶可以与亲本脂质酰基转移酶具有至少75%同一性，合适地，所述变体脂质酰基转移酶可以与亲本脂质酰基转移酶具有至少75%或至少80%或至少85%或至少90%或至少95%或至少98%同一性。
本发明还涉及具有脂质酰基转移酶活性的变体多肽，其中所述变体与亲本脂质酰基转移酶相比至少在第31位包含修饰，其中所述第31位是通过与SEQ ID No.16或SEQ ID No.6比对而鉴定出的，并且其中，当使用方案1提供的麦芽糖转移酶实验时，所述变体脂质酰基转移酶具有至少0.0282%的麦芽糖转移酶活性。
在一个实施方式中，优选地，所述变体脂质酰基转移酶具有以下修饰和/或在本发明的方法中进行以下修饰：
·L31Q、N80D、W122L(在所述骨架酶在第80位已经具有D的情况下，其可以表示为L31Q、W122L)；
·M27V、L31Q、N80D(在所述骨架酶在第80位已经具有D的情况下，其可以表示为N27V、L31Q)；
·L31Q、N80D、K82R、I86A(在所述骨架酶在第80位已经具有D的情况下，其可以表示为L31Q、K82R、I86A)；和/或
·L31Q、N80D、I86S、W122F(在所述骨架酶在第80位已经具有D的情况下，其可以表示为L31Q、I86S、W122F)。
在另一个实施方式中(特别是所述变体将用于食用油脱胶时)，优选所述变体脂质酰基转移酶具有以下修饰和/或在本发明的方法中进行以下修饰：
·A119T、N80D(其可以表示为A119T，其中所述骨架酶在第80位已经具有D)；
·A119A、N80D(其可以表示为A119A，其中所述骨架酶在第80位已经具有D)；
·G67A、V85H、N80D (其可以表示为G67A、V85H，其中所述骨架酶在第80位已经具有D)。
另一方面，本发明提供了具有脂质酰基转移酶活性的变体多肽，其中所述变体与亲本脂质酰基转移酶相比在至少第31位包含修饰，其中第31位是通过与SEQ ID No.16比对而鉴定出的，并且其中当使用下文公开的方案1提供的碳水化合物转移酶实验时，所述变体脂质酰基转移酶具有至少0.0282%的碳水化合物(优选麦芽糖)转移酶活性。
优选地，当改良的性质涉及改良的碳水化合物转移酶活性(例如麦芽糖转移酶活性)时，使用下文定义的方案1提供的麦芽糖转移酶实验时，所述变体脂质酰基转移酶具有至少0.0282%的碳水化合物转移酶活性(例如麦芽糖转移酶活性)。
定义
除非另有说明，否则本发明使用的所有科技术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。例如，Singleton and Sainsbury，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology,2d Ed.,John Wiley and Sons,NY(1994)；和Hale and Marham,The Harper Collins Dictionary of Biology,Harper Perennial,NY(1991)为本领域技术人员提供了本发明使用的许多术语的通用字典。与本文所述的那些方法和材料相似或等同的任意方法和材料都可用于实施本发明，但本文描述了优选的方法和材料。因此，通过整体地参考本说明书更完整地描述下文定义的术语。另外，除非上下文清楚地说明，否则本文使用的单数“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包括复数称谓。除非另外指出，否则核酸以5'至3'的方向从左至右书写，氨基酸以氨基至羧基的方向从左至右书写。应该理解，本发明不限于所描述的具体方法、方案和试剂，因为这些可用根据本领域技术人员的使用所述方法、方案和试剂的背景而变化。
本文使用的术语“修饰”表示添加、取代和/或缺失。优选地，术语“修饰”表示“取代”。
本文使用的术语“脂质酰基转移酶”表示具有酰基转移酶活性(例如根据国际生物化学和分子生物学联盟命名委员会的酶命名法建议(1992)归类为2.3.1.x，特别是2.3.1.43的酶)，由此该酶能将酰基将酰基从脂质转移至一种或多种受体底物，例如以下一种或多种：甾醇；甾烷醇(stanol)；碳水化合物(例如麦芽糖和/或葡萄糖)；蛋白质；蛋白质亚基；胆固醇、醇、甘油。
本文使用的术语“半乳糖脂”表示DGDG或DGMG中的一个或多个。
本文使用的术语“磷脂”表示包括磷脂酰胆碱在内的卵磷脂。
本文使用的术语“卵磷脂”包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰甘油。
本文使用的术语“极性脂质”表示磷脂和/或半乳糖脂，优选磷脂和半乳糖脂。
本文使用的术语“转移酶”表示可用与术语“脂质酰基转移酶”互换。
本文使用的术语“半乳糖脂转移酶活性”表示所述酶催化酰基从半乳糖脂供体转移至受体分子(非水)的能力。
同样地，本文使用的术语“磷脂转移酶活性”表示所述酶催化酰基从磷脂供体转移至受体分子(非水)的能力。
合适地，本文定义的脂质酰基转移酶催化以下一种或多种反应：酯交换(interesterification)、酯转移(transesterification)、醇解、水解。优选地，本文定义的脂质酰基转移酶催化以下一种或多种反应：酯转移、醇解。
术语“酯交换”指酶促催化的酰基在脂质供体和脂质受体间的转移，其中脂质供体不是游离酰基。
本文中所用的术语“酯转移”指酶促催化的酰基从脂质供体(非游离脂肪酸)至酰基受体(非水)的转移。
本文中所用的术语“醇解”指通过与醇ROH反应，酶促切割酸衍生物的共价键，使得产物之一与醇的H结合而另一种产物与醇的OR基团结合。
本文中所用的术语“醇”指含羟基的烃基化合物。
本文中所用的术语“水解”指酶促催化的酰基从脂质至水分子OH基团的转移。水解造成的酰基转移需要解离水分子。
本文中所用的术语“改良的特性”或“改良的活性”表示当与亲本(或骨架)酶的性质或活性相比时，所述变体酶具有更理想(即其可能为较高或较低)的性质或活性。
本文使用的术语“转移酶活性/水解活性的比例提高”表示当与亲本酶相比时，所述变体酶能够以比脂质水解更高的速率催化脂质转移。这可以表示与亲本酶相比脂质转移酶活性和脂质水解活性均提高，或者与亲本酶相比脂质转移酶活性提高而脂质水解活性降低。重要的是，这是两个活性之间的最终关系。
脂质底物
优选地，亲本脂质酰基转移酶和/或本发明的变体脂质酰基转移酶作用的脂质底物是一种或多种以下脂质：磷脂，例如卵磷脂，如磷脂酰胆碱、三酰基甘油酯、心磷脂、甘油二酯或糖脂，如二半乳糖苷甘油二酯(DGDG)或单半乳糖苷甘油二酯(MGDG)。
在本文中，此类磷脂底物可以称作“脂质酰基供体”。
在一些方面，优选亲本脂质酰基转移酶和/或变体脂质酰基转移酶作用的脂质底物为磷脂，例如卵磷脂，如磷脂酰胆碱。
在一些实施方式中，所述脂质底物可以是食物脂质，也就是说是食品的脂质成分。
合适地，所述脂质底物或脂质酰基供体可以是存在于一种或多种以下底物中的一种或多种脂质：脂肪，包括猪油、牛脂和黄油脂肪；油，包括提取自或衍生自棕榈油、向日葵油、大豆油、红花油、棉籽油、落花生油、玉米油、橄榄油、花生油、椰子油和油菜籽油的油。来自大豆、油菜籽或蛋黄的卵磷脂也是合适的脂质底物。脂质底物可以是燕麦脂质或其它基于植物的含半乳糖脂的材料。
在一个方面，所述脂质酰基供体优选是蛋黄中的卵磷脂(诸如磷脂酰胆碱)。
对于本发明的有些方面，脂质可以选自具有8至22个碳的脂肪酸链长度的脂质。
对于本发明的有些方面，脂质可以选自具有16至22个碳的脂肪酸链长度的脂质，更优选16至20个碳。
对于本发明的有些方面，脂质可以选自具有不超过14个碳的脂肪酸链长度的脂质，合适地选自具有4至14个碳的脂肪酸链长度的脂质，合适地4至10个碳，合适地4至8个碳。
在一些方面，本发明的变体脂质酰基转移酶可以使用蛋白作为酰基受体。合适地，所述蛋白可以为见于食品，例如乳制品和/或肉制品中的一种或多种蛋白质。仅作为示例，合适的蛋白可以为见于凝乳或乳清中的蛋白，例如乳球蛋白。其他合适的蛋白包括来自蛋的卵白蛋白、醇溶蛋白、麦谷蛋白、Puroindoline、来自谷物的脂质转移蛋白和来自肉类的肌球蛋白(myosin)。
脂质酰基转移酶
合适地，所述亲本酶可以包括具有酯酶或脂肪酶活性的任何酶，因此，在一些情况下，酯酶或脂肪酶也可以用作本发明方法中的亲本酶。
然而，优选地，所述亲本酶为脂质酰基转移酶。
优选地，所述亲本酶pfam00657共有序列相比对。
术语“亲本脂质酰基转移酶”和“亲本序列”在本文中互换使用。
与本发明的方法权利要求有关，“亲本脂质酰基转移酶”可以指经修饰的序列(即进行过修饰的序列)。
在本发明的任一方法中使用的亲本脂质酰基转移酶可以为天然脂质酰基转移酶或变体脂质酰基转移酶。
例如，编码本发明中使用的亲本脂质酰基转移酶的核苷酸序列可以如WO2004/064537、WO2004/064987、WO2005/066347或WO2006/008508中描述的序列。这些文献通过引用并入本文。
本文使用的术语“脂质酰基转移酶”表示具有酰基转移酶活性(例如根据国际生物化学和分子生物学联盟命名委员会的酶命名法建议(1992)归类为2.3.1.x，特别是2.3.1.43的酶)，由此该酶能将酰基从脂质转移至一种或多种受体底物，例如以下一种或多种：甾醇；甾烷醇；碳水化合物(例如麦芽糖和/或葡萄糖)；蛋白质；蛋白质亚基；胆固醇、醇、甘油。
优选地，所述亲本和/或变体脂质酰基转移酶是在酶命名法分类下归类的酶(E.C.2.3.1.43)。
可以通过使用以下题为“脂质酰基转移酶试验”的试验鉴定用作本发明的亲本酶的合适的脂质酰基转移酶。此外，当使用“脂质酰基转移酶试验”和/或方案1中详述的试验和/或以下方案2中详述的试验分类时，本发明的变体酶同样优选为脂质酰基转移酶。
“脂质酰基转移酶试验”
底物：将50mg胆固醇(Sigma C8503)和450mg大豆磷脂酰胆碱(PC)，Avanti#441601溶于氯仿，并在40℃真空蒸发氯仿。
在40℃，将300mg PC:胆固醇(9:1)分散在10ml 50mM HEPES缓冲液(pH7)中。
酶解：
在40℃，将250μl底物添加到带盖玻璃器中。
添加25μl酶溶液，并在搅动下于40℃温育10分钟。
在试验中，所添加的酶应当将2-5%的胆固醇酯化。
此外，同样分析使用25μl水代替酶溶液的空白对照。
10分钟后，添加5ml己烷:异丙醇(3:2)。
使用胆甾醇硬脂酸酯(Sigma C3549)作为校准标准品，通过HPTLC分析胆固醇酯的量。
计算在测定条件下每分钟形成的胆固醇酯量，作为转移酶活性。
一个转移酶单位(TrU)被定义为根据上文所述的转移酶试验，在40℃，pH 7的条件下，每分钟产生胆固醇酯的μmol数。
如果酶显示每毫克酶至少25TrU/mg酶蛋白的比转移酶单位(TrU)，则可以将其认为是适合用作本发明方法中的亲本酶的脂质酰基转移酶。
此外，优选在使用上述脂质酰基转移酶试验测试时，本发明的和用于本发明中的变体脂质酰基转移酶具有每毫克酶至少25TrU/mg酶蛋白的比转移酶单位(TrU)。
合适地，用于本发明的脂质酰基转移酶的添加量可为每克油0.05-50TrU，合适地，所述量为每克油0.5-5TrU。
优选地，当与Pfam00657共有序列进行比对时，用于本发明方法和/或应用的脂质酰基转移酶可以具有至少一个，优选为多于一个，更优选为多于两个的下述区段(block)：GDSx区段、GANDY区段、HPT区段。合适地，所述脂质酰基转移酶可以具有GDSx区段和GANDY区段。或者，所述酶可以具有GDSx区段和HPT区段。优选地，所述酶至少包含GDSx区段。更多细节请参见WO2004/064537或WO2004/064987。
优选地，GANDY基序的残基选自GANDY、GGNDA、GGNDL，最优选为GANDY。
合适地，所述亲本和/或变体脂质酰基转移酶可以包含GDSx基序和/或GANDY基序。
在一些方面，所述亲本脂质酰基转移酶和/或所述变体脂质酰基转移酶可以表征为具有酰基转移酶活性并包含氨基酸序列基序GDSX的酶，其中X是以下氨基酸残基中的一种或多种：L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M或S。
优选地，所述亲本和/或所述变体脂质酰基转移酶包含GDSX基序。
所述GDSX基序由四个保守的氨基酸构成。优选地，所述基序中的丝氨酸为所述脂质酰基转移酶的催化丝氨酸。合适地，GDSX基序的丝氨酸的位置可对应于Brumlik和Buckley (Journal of Bacteriology Apr.1996,Vol.178,No.7,p 2060-2064)中教导的嗜水气单胞菌脂质酰基转移酶的Ser-16。
为了测定蛋白是否具有本发明的GDSX基序，优选将序列与pfam数据库的隐马尔可夫模型谱(hidden markov model profile)(HMM谱)进行比较。
Pfam是蛋白质域家族的数据库。Pfam包括为每个家族的辅助(curated)多重序列比对以及用于鉴定新序列中的这些域的隐马尔可夫模型(HMM图谱)。对Pfam的介绍见于Bateman A et al.(2002)Nucleic Acids Res.30;276-280。隐马尔可夫模型应用于许多旨在对蛋白质进行分类的数据库中，综述见Bateman A和Haft DH(2002)Brief Bioinform3;236-245。
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed &list uids=12230032&dopt=Abstract
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed &list uids=11752314&dopt=Abstract
对隐马尔可夫模型的详细解释和这些模型如何在Pfam数据库中应用参见Durbin R,Eddy S和Krogh A(1998)Biological sequence analysis;probabilistic models of proteins and nucleic acids.Cambridge University Press,ISBN 0-521-62041-4。Hammer软件包可以从华盛顿大学,St Louis,USA获得。
可选择地，GDSX基序可以通过应用Hammer软件包识别，其说明由Durbin R,Eddy S,和Krogh A(1998)Biological sequence analysis;probabilistic models of proteins and nucleic acids.Cambridge University Press,ISBN 0-521-62041-4及其中的参考文献提供，且在此说明书中提供了HMMER2图谱。
PFAM数据库可以通过，例如，目前位于如下网址的几个服务器进行访问：
http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/index.shtml
http://pfam.wustl.edu/
http://pfam.jouy.inra.fr/
http://pfam.c gb.ki.se/
数据库提供了检索工具，可在此输入蛋白质序列。应用数据库的默认参数，对蛋白质序列中Pfam结构域的存在进行分析。GDSX域是在数据库中已建立的域，因此，其在任何查询序列中的存在均可以得到识别。数据库将返回Pfam00657共有序列与查询序列的比对。
合适地，所述亲本脂质酰基转移酶可以获自于，优选已经获自于以下一个或多个属的生物：气单胞菌属(Aeromonas)、链霉菌属(Streptomyces)、酵母菌属(Saccharomyces)、乳球菌属(Lactococcus)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、链球菌属(Streptococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、脱亚硫酸菌属(Desulfitobacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、弧菌属(Vibrionaceae)、木杆菌属(Xylella)、硫叶菌属(Sulfolobus)、曲霉属(Aspergillus)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、李斯特菌属(Listeria)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)、雷尔氏菌属(Ralstonia)、黄杆菌属(Xanthomonas)和假丝酵母属(Candida)。优选地，所述脂质酰基转移酶可以获自于，优选已经获自于气单孢菌属的生物。
合适地，所述亲本脂质酰基转移酶可由以下核苷酸序列之一编码：
(a)SEQ ID No.25所示的核苷酸序列；
(b)SEQ ID No.10所示的核苷酸序列；
(c)SEQ ID No.11所示的核苷酸序列；
(d)SEQ ID No.12所示的核苷酸序列；
(e)SEQ ID No.13所示的核苷酸序列；
(f)SEQ ID No.14所示的核苷酸序列；
(g)SEQ ID No.15所示的核苷酸序列；
(h)与SEQ ID No.25、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14或SEQ ID No.15所示的任一序列具有70%或更高(优选75%或更高，85%或更高，95%或更高或者98%或更高)同一性的核苷酸序列；
(i)通过遗传密码的简并性而与SEQ ID No.25、SEQ ID No.10、SEQ IDNo.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15相关联的核苷酸序列；或者
(j)在中等或高等严谨条件下与SEQ ID No.25、SEQ ID No.10、SEQ IDNo.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14或SEQ ID No.15所示的任一序列杂交的核苷酸序列。
在一个实施方式中，编码本发明的亲本脂质酰基转移酶的核苷酸序列可以为与SEQ ID No.10或SEQ ID No.25所示的序列具有70%或更高，75%或更高，80%或更高，优选85%或更高，更优选90%或更高，例如998%或99%或更高同一性的核苷酸序列。
合适地，所述亲本脂质酰基转移酶可以包含以下氨基酸序列之一或由以下氨基酸序列之一组成：
(i)SEQ ID No.16所示的氨基酸序列；
(ii)SEQ ID No.3所示的氨基酸序列；
(iii)SEQ ID No.4所示的氨基酸序列；
(iv)SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；
(v)SEQ ID No.5所示的氨基酸序列；
(vi)SEQ ID No.6所示的氨基酸序列；
(vii)SEQ ID No.8所示的氨基酸序列；
(viii)SEQ ID No.9所示的氨基酸序列；或者
与SEQ ID No.16、SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4或SEQ IDNo.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.8或SEQ ID No.9所示的任一序列具有75%、80%、85%、90%、95%、98%或更高同一性的氨基酸序列。
合适地，本发明的亲本脂质酰基转移酶可以为包含SEQ ID No.6或16所示的氨基酸序列或由SEQ ID No.6或16所示的氨基酸序列组成的脂质酰基转移酶，或者为包含与SEQ ID No.16所示的氨基酸序列或SEQ ID No.6所示的氨基酸序列具有75%或更高，优选80%或更高，优选85%或更高，优选90%或更高，优选95%更高同一性的氨基酸序列的脂质酰基转移酶，或者由与SEQ ID No.16所示的氨基酸序列或SEQ ID No.6所示的氨基酸序列具有75%或更高，优选80%或更高，优选85%或更高，优选90%或更高，优选95%更高同一性的氨基酸序列组成的脂质酰基转移酶。
合适的亲本脂质酰基转移酶是本领域已知的。例如，WO2009/081094(通过引用并入本文)中教导的脂质酰基转移酶适合作为本发明的亲本脂质酰基转移酶。
所述亲本脂质酰基转移酶可以是磷脂甘油酰基转移酶。磷脂甘油酰基转移酶包括分离自气单孢菌，优选为嗜水气单胞菌或杀鲑气单胞菌，最优选为杀鲑气单胞菌的磷脂甘油酰基转移酶或其变体。
本领域技术人员可以理解，优选酰基转移酶的信号肽在转移酶的表达过程中已被切割掉。SEQ ID No.1、3、4和5的信号肽为氨基酸1-18。因此，最优选的区域为SEQ ID No.1和SEQ ID No.3(嗜水气单胞菌)中的氨基酸19-335，和SEQ ID No.4和SEQ ID No.5(杀鲑气单胞菌)中的氨基酸19-336。当用于测定氨基酸序列同一性或同源性时，优选在本文所述的比对中使用成熟序列，即例如没有信号肽的序列。
在一个实施方式中，合适地，本发明使用的脂质酰基转移酶包含SEQ IDNo.16所示的氨基酸序列或由SEQ ID No.16所示的氨基酸序列组成，或者包含与SEQ ID No.16所示的氨基酸序列具有至少70%，至少75%，至少85%，至少90%，至少95%，至少98%同一性的氨基酸序列，或者由与SEQ ID No.16所示的氨基酸序列具有至少70%，至少75%，至少85%，至少90%，至少95%，至少98%同一性的氨基酸序列组成。
因此，确定同源性(同一性)的最优选区域为SEQ ID No.1和3(嗜水气单胞菌)中的氨基酸19-335，和SEQ ID No.4、15和16(杀鲑气单胞菌)中的氨基酸19-336。SEQ ID No.8和9是来分别来自嗜水气单胞菌和杀鲑气单胞菌的脂质酰基转移酶的成熟蛋白序列，其可以经历或可以未经历进一步的翻译后修饰。
用于本发明和/或本发明方法中的合适的亲本脂质酰基转移酶可以包含任一个以下氨基酸序列和/或由以下核苷酸序列编码：
a)编码如下多肽的核酸，其表现出脂质酰基转移酶活性且与SEQ ID No.6所示的多肽序列或与SEQ ID No.16所示的多肽具有至少70%同一性(优选至少80%同一性，更优选至少90%同一性，甚至更优选至少95%同一性，例如至少98%同一性)；
b)(分离的)多肽，其包含SEQ ID No.16或SEQ ID No.6所示的氨基酸序列或由SEQ ID No.16或SEQ ID No.6所示的氨基酸序列组成，或者包含与SEQ ID No.6或SEQ ID No.16具有至少70%同一性(优选至少80%同一性，更优选至少90%同一性，甚至更优选至少95%同一性，例如至少98%同一性)的氨基酸序列或由与SEQ ID No.6或SEQ ID No.16具有至少70%同一性(优选至少80%同一性，更优选至少90%同一性，甚至更优选至少95%同一性，例如至少98%同一性)的氨基酸序列组成；
c)编码脂质酰基转移酶的核酸，所述核酸包含SEQ ID No.10或SEQ IDNo.25所示的核苷酸序列或由SEQ ID No.10或SEQ ID No.25所示的核苷酸序列组成，或包含与SEQ ID No.10或SEQ ID No.25所示的核苷酸序列具有至少70%同一性(优选至少80%同一性，更优选至少90%同一性)的核苷酸序列或由与SEQ ID No.10或SEQ ID No.25所示的核苷酸序列具有至少70%同一性(优选至少80%同一性，更优选至少90%同一性)的核苷酸序列组成；
d)核酸，所述核酸在中等或高严谨条件下与包含SEQ ID No.10或SEQID No.25所示核苷酸序列的核酸探针杂交，且编码表现出脂质酰基转移酶活性的多肽；
e)核酸，其是a)、c)或d)所述核酸序列的片段；或
f)多肽，其是b)所述多肽的片段。
优选地，编码用于本发明的亲本脂质酰基转移酶的核苷酸序列可以为编码脂质酰基转移酶(如SEQ ID No.6或SEQ ID No.16)的多聚核苷酸。
在一个实施方式中，优选地，通过用SEQ ID No.10或SEQ ID No.25所示的核苷酸序列，或者用与SEQ ID No.10或SEQ ID No.25具有至少75%(更优选至少80%，更优选至少85%，更优选至少95%，更优选至少98%)同一性的核苷酸序列，或者用本发明的经修饰的核苷酸序列转化地衣芽孢杆菌，培养所述地衣芽孢杆菌并分离由此产生的脂质酰基转移酶，从而在所述地衣芽孢杆菌中表达所述核苷酸序列。
优选地，本发明的亲本脂质酰基转移酶包含以下催化三联体：Ser 16、Asp 288和His 291(这些残基编号是参照例如SEQ ID No.6或16所示的成熟序列)。Ser 16、Asp 288和His 291在对应于SEQ ID No.3或SEQ ID No.1(即包含由这些序列的起始18个氨基酸残基形成的信号序列的未成熟序列)所示的嗜水气单胞菌酰基转移酶的Ser-34、Asp-306和His-309的位置上分别包含丝氨酸残基、天冬氨酸残基和组氨酸残基。在图3(SEQ ID No.2)所示的pfam00657共有序列中，活性位点残基对应于Ser-7、Asp-345和His-348。
变体脂质酰基转移酶
合适地，所述变体脂质酰基转移酶是在酶命名法分类下归类的酶(E.C.2.3.1.43)。
合适地，本发明的变体脂质酰基转移酶可显示出一种或多种下列脂肪酶活性：糖脂酶活性(E.C.3.1.1.26)，三酰基甘油脂肪酶活性(E.C.3.1.1.3)，磷脂酶A2活性(E.C.3.1.1.4)或磷脂酶A1活性(E.C.3.1.1.32)。本文使用的术语“糖脂酶活性”包括“半乳糖脂酶活性”。
合适地，本发明的变体脂质酰基转移酶可具有至少一种或多种下列活性：糖脂酶活性(E.C.3.1.1.26)和/或磷脂酶A1活性(E.C.3.1.1.32)和/或磷脂酶A2活性(E.C.3.1.1.4)。
对于一些方面，本发明的所述变体脂质酰基转移酶可至少具有糖脂酶活性(E.C.3.1.1.26)。
合适地，对于一些方面，本发明的变体脂质酰基转移酶可能够将酰基从糖脂和/或磷脂转移到以下一种或多种受体底物：甾醇，甾烷醇，碳水化合物(例如麦芽糖和/或葡萄糖)，蛋白质，甘油。
一些方面，优选本发明的变体脂质酰基转移酶不显示三酰基甘油脂肪酶活性(E.C.3.1.1.3)。
所述变体脂质酰基转移酶可以具有以上详细讨论的一个或多个修饰和/或可由本发明的方法制备。
合适地，本发明的变体脂质酰基转移酶保留了与亲本酶至少70%，优选至少80%，优选至少90%，优选至少95%，优选至少97%，优选至少99%的同源性。
合适地，所述变体脂质酰基转移酶可以包含氨基酸基序GDSX，其中X为以下氨基酸残基的一个或多个：L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M或S。优选地，GDSX基序中的X为L。
为了避免争议，当亲本酶中的氨基酸被取代时，优选使用与最初见于亲本酶的该位置不同的氨基酸进行取代，从而产生变体酶。换句话说，术语“取代”不涵盖用氨基酸对相同氨基酸的代替。
然而，在本发明方法的一个实施方式中，在除31位外的位置的一个或多个氨基酸残基的取代可涵盖用氨基酸代替相同的氨基酸，前提是这在核苷酸序列水平上产生了密码子的变化。
WO 2005/066347公开了脂质酰基转移酶的特别位置，其可以经修饰而增强了与对磷脂相比，对半乳糖脂的转移酶活性的比例。因此，本申请的变体脂质酰基转移酶可以除了本文公开的修饰外，还包含一个或多个如WO2005/066347(其通过引用并入本文)中公开的进一步修饰。
在优选的实施方式中，变体脂质酰基转移酶保留或引入了见于GDSx、GANDY和HPT区的至少一个或多个pfam00657共有序列氨基酸残基。
利用分子进化工具可以使酶，例如在含水环境下没有或具有低的酰基转移酶活性的脂肪酶突变以引入或增强转移酶活性，由此产生适合用于本发明的组合物和方法中的具有显著转移酶活性的变体脂质酰基转移酶。
改良的性质
与亲本(即骨架)或未改良的脂质酰基转移酶相比，本发明的或由本发明的方法产生的变体脂质酰基转移酶具有至少一种改良的性质。
本文使用的术语“改良的性质”可以包括a)脂质酰基转移酶的改变的底物特异性，例如并且仅作为示例：i)改变酶使用某些化合物作为受体的能力，例如提高酶利用碳水化合物(例如麦芽糖)作为受体分子的能力，由此改善酶产生碳水化合物酯的能力或ii)改变酶利用饱和或不饱和的脂肪酸作为底物的能力或iii)改变酶的特异性，从而使变体脂质酰基转移酶优先利用来自脂质底物的Sn1或Sn2位的脂肪酸或iv)改变酶的底物链长特异性；b)改变酶的动力学；和/或c)降低变体脂质酰基转移酶进行水解反应的能力，同时保持或增强酶进行酰基转移反应的能力。
其他改良的性质可以涉及，例如pH和/或温度稳定性的改良，和/或去污剂和/或氧化剂稳定性的改良。确实，可以理解，根据本发明可以制备在这些性质(pH、温度、蛋白水解稳定性、去污剂稳定性和/或氧化剂稳定性)中的一个或多个具有不同程度的稳定性的酶。
通过任何合适的方法实现野生型(例如亲本脂质酰基转移酶)和突变(例如变体脂质酰基转移酶)蛋白的表征，并且优选在对感兴趣性质的评价的基础上进行表征。
合适地，当使用下文详细描述的方案1中提供的实验时，所述变体脂质酰基转移酶可以具有至少0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%、0.35%或0.4%的碳水化合物(例如麦芽糖)转移酶活性。
合适地，当使用下文详细描述的方案2中提供的实验时，所述变体脂质酰基转移酶可以具有至少0.0059%的碳水化合物(例如麦芽糖)转移酶活性。合适地，当使用下文详细描述的方案2中提供的实验时，所述变体脂质酰基转移酶可以具有至少0.009、0.01、0.02、0.03、0.035、0.04、0.045、0.05、0.055或0.06%的碳水化合物(例如麦芽糖)转移酶活性。
优选地，所述变体脂质酰基转移酶可以具有至少0.0282%+10-20%的碳水化合物(例如麦芽糖)转移酶活性。
合适地，本发明的方法可以包括检测变体脂质酰基转移酶的一种或多种改良的性质和/或选择变体酶的步骤，其中所述变体酶在与亲本酶相比时具有改良的性质。
仅通过示例，本发明方法可以包括以下步骤：测定与亲本脂质酰基转移酶相比时，变体脂质酰基转移酶转移酰基至碳水化合物(例如麦芽糖和/或葡萄糖)的能力；和选择与亲本脂质酰基转移酶相比，转移酰基至麦芽糖的能力提高的变体脂质酰基转移酶。
在一些实施方式中，在与亲本酶相比时，本发明的变体酶可以具有提高的转移酶活性和相同或降低的水解活性。换句话说，合适的是，与亲本酶相比，变体酶可以比水解活性更高的转移酶活性(例如，转移酶:水解酶活性)。合适地，变体酶可以优先将酰基从脂质(包括磷脂、半乳糖脂或三酰基甘油)转移至酰基受体而非简单地水解脂质。
合适地，本发明的或用于本发明的脂质酰基转移酶可以为与亲本酶相比，对极性脂质优选磷脂和/或糖脂具有增强的酶活性的变体。优选地，此类变体还对溶血极性脂质的活性低或者没有活性。对极性脂质优选磷脂和/或糖脂的增强的酶活性可以是水解和/或转移酶活性或两者组合的结果。优选地，对极性脂质的活性增强是转移酶活性的结果。
与亲本酶相比，本发明的或用于本发明的变体脂质酰基转移酶可以对甘油三酯和/或甘油单酯和/或甘油二酯具有降低的活性。
合适地，所述变体脂质酰基转移酶可以对甘油三酯和/或甘油单酯和/或甘油二酯没有活性。在用于烘焙应用，用于蛋或基于蛋的产品和/或油脱胶的变体酶中优选对甘油三酯的活性低。
组合
因此，本发明的变体脂质酰基转移酶或本发明的包含所述变体脂质酰基转移酶的组合物可以与其他组分组合使用。
其他组分的实例包括以下一种或多种：增稠剂、胶凝剂、乳化剂、粘合剂、结晶改性剂、增甜剂(包括人工增甜剂)、流变改进剂、稳定剂、抗氧化剂、染料、酶、运载体(carrier)、媒介物(vehicle)、赋形剂、稀释剂、润滑剂、调味剂、着色剂、悬浮剂、崩解剂、粒化粘合剂(granulation binder)等。这些其它的组分可以是天然的。这些其它的组分可以通过使用化学技术和/或酶技术来制备。
本文使用的术语“增稠剂或胶凝剂”指通过减缓或阻止粒子(particle)的运动来防止分离的产品，所述粒子为不混溶液体的小滴(droplet)、空气或不溶性固体。当单个的水合分子引起粘度的增加时，出现增稠作用，从而减缓分离。当所述水合分子连接形成俘获粒子从而将它们固定化的三维网络时，出现胶凝作用。
本文使用的术语“稳定剂”定义为防止产品(例如食物产品)随时间发生变化的成分或成分的组合。
本文使用的术语“乳化剂”指阻止乳剂分离的成分(例如食物产品成分)。乳剂是两种不混溶的物质，其中一种以小滴的形式存在，包含在另一种内。乳剂可以由水包油组成，其中小滴或分散相是油而连续相是水；或由油包水组成，其中水变为分散相而连续相是油。泡沫是液体包气体型(gas-in-liquid)，而悬液是液体包固体型(solid-in-liquid)，它们也可以通过使用乳化剂来稳定化。充气可以在三相系统中发生，其中，通过液体油来捕获空气，然后通过由脂肪结晶稳定的凝聚脂肪结晶使其稳定。乳化剂具有对水有亲和力的(亲水的)极性基团和对油有吸引力的(亲脂的)非极性基团。乳化剂被吸收在所述两种物质的交界面上，提供了发挥稳定乳剂的作用的界面膜。乳化剂的亲水/亲脂的性质受分子结构的影响。这些性质通过亲水/亲脂平衡(HLB)值来鉴定。低HLB值表示比较强的亲脂趋势，将其用于稳定油包水型乳剂。将高HLB值指定给亲水的乳化剂，通常在水包油型的乳剂中使用。这些值来源于简单的体系。因为食品通常包含影响乳化性质的其它成分，所以HLB值并不总是乳化剂选择的可靠指导原则。
本文使用的术语“粘合剂”指通过物理或化学反应把产品结合到一起的成分(例如食物成分)。例如在“胶凝作用”的过程中，水被吸收，提供了结合作用。但是，粘合剂可以吸收其它液体，例如油，并将其保持在产品内。在本发明中，粘合剂通常用于固体或低水份产品中，例如烘焙产品：糕点(pastry)、炸面圈(doughnut)、面包等。
本文使用的术语“结晶改性剂”指影响脂肪或水的结晶作用的成分(例如食物成分)。冰晶的稳定化之所以重要的原因有两个：首先，从分离观点来看，其直接涉及产品的稳定性。产品经历的冻融循环越多，冰晶就变得越大。这些大的结晶可能会损坏产品结构，所述结构或者是天然存在的，如细胞壁的情况，或者是通过“兴奋(elation)”产生的。因为水不再固定于原位，产品在融化之后可能会显示脱水收缩，或漏液(weeping)。第二，在产品以冷冻形式被消费的情况下，这些大的结晶导致不合需要的、砂粒质口感。
“运载体”或“媒介物”意指适用于化合物施用的材料，并包括在本技术领域已知的任何此类材料例如，任何液体、凝胶、溶剂、液态稀释剂或增溶剂等，其是无毒的并且不与组合物中的任何组分以有害的方式相互作用。
营养上可接受的运载体的实例包括，例如，水、盐溶液、醇、有机硅(silicone)、蜡类、石油膏(petroleum jelly)、植物油、聚乙二醇、丙二醇、脂质体、糖、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、表面活性剂、硅酸、粘稠的石蜡(viscous paraffin)、芳香油、脂肪酸甘油单酯和甘油二酯、petroethral脂肪酸酯、羟甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮等。
赋形剂的实例包括下述中的一种或多种：微晶纤维素和其它纤维素、乳糖、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸氢钙、甘氨酸、淀粉、乳糖(milk suger)和高分子量聚乙二醇。
崩解剂的实例包括下述中的一种或多种：淀粉(优选玉米淀粉、马铃薯淀粉或木薯淀粉)、淀粉乙醇酸钠、交联羧甲纤维素钠和某些复合硅酸盐。
粒化粘合剂的实例包括下述中的一种或多种：聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基纤维素(HPC)、蔗糖、麦芽糖、明胶和阿拉伯胶(acacia)。
润滑剂的实例包括下述中的一种或多种：硬脂酸镁、硬脂酸、甘油山嵛酸酯(glyceryl behenate)和滑石。
稀释剂的实例包括下述中的一种或多种：水、乙醇、丙二醇和甘油，和它们的组合。
所述其它组分可以同时地使用(例如当其混合在一起时，或者甚至当其通过不同的途径递送时)或顺次使用(例如其可通过不同的途径递送)。
本文使用的术语“适于动物或人消费的组分”意指作为补充剂添加至或能够添加至本发明的组合物的化合物，其可能具有营养价值，可能是纤维取代物或对消费者具有普遍的有益效果。所述成分可以用于各种各样的产品，该产品需要胶凝作用、组织化处理、稳定处理、悬浮处理、成膜处理和结构化处理(structuring)，保持多汁，而不增加不必要的粘性。优选地，所述成分将能够改进活培养物的保存期和稳定性。
作为示例，所述组分可以是益生元(prebiotics)，例如藻酸盐、黄原胶(xanthan)、果胶、槐豆胶(locust bean gum；LBG)、菊粉(inulin)、瓜尔豆胶、低聚半乳糖(galacto-oligosaccharide；GOS)、低聚果糖(fructo-oligosaccharide；FOS)、乳果糖(lactosucrose)、大豆寡糖、帕拉金糖(palatinose)、低聚异麦芽糖、低聚葡糖和低聚木糖。
在一个实施方式中，本发明的变体脂质酰基转移酶可以与WO2005/087918(其教导通过引用并入本文)中教导的真菌脂肪分解酶组合使用。这是用于烘焙的尤其有用的组合。
此外，在某些应用中，本发明的变体脂质酰基转移酶还可以与一种或多种其他酶组合、例如脂肪酶、磷脂酶、纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、淀粉分解酶(包括淀粉酶、特别是麦芽糖淀粉酶)、氧化还原酶和蛋白酶。
当本发明的脂质酰基转移酶用于脱胶应用时，其可以与磷脂酶A和/或磷脂酶C组合使用。
实验
合适地，所述酰基转移酶活性占总酶活性的至少5%、更优选至少10%、更优选至少20%、更优选至少30%、更优选至少40%、更优选50%、更优选至少60%、更优选至少70%、更优选至少80%、更优选至少90%和更优选至少98%。转移酶活性%(即以总酶活性的百分数表示的转移酶活性)可以通过以下方法而测定：
测定转移酶活性％的实验方案：
酶促反应后，可用CHC13：CH3OH(2：1)提取已添加本发明脂质酰基转移酶的食品，分离包含脂质物质的有机相，并可根据在下文详述的方法通过GLC分析。通过GLC分析(在必要情况下，和HPLC分析)，确定游离脂肪酸和一种或多种甾醇/甾烷醇酯类；碳水化合物酯；蛋白质酯；甘油二酯；或甘油单酯的量。用同种方法分析没有添加本发明的酶的对照食品。
计算：
从GLC(和任选的HPLC分析)的结果，可以计算出游离脂肪酸和甾醇/甾烷醇酯和/或碳水化合物酯和/或蛋白质酯和/或甘油二酯和/或甘油单酯的增加：
Δ脂肪酸%=脂肪酸%(酶)-脂肪酸%(对照)；Mv脂肪酸=脂肪酸的平均分子量
A=Δ甾醇酯%/Mv甾醇酯(其中Δ甾醇酯%=甾醇/甾烷醇酯%(酶)-甾醇/甾烷醇酯%(对照)，Mv甾醇酯=甾醇/甾烷醇酯的平均分子量)，这适用于酰基受体是甾醇/甾烷醇的情况；
B=Δ碳水化合物酯%/Mv碳水化合物酯(其中Δ碳水化合物酯%=碳水化合物酯%(酶)-碳水化合物酯%(对照)，Mv碳水化合物酯=碳水化合物酯的平均分子量)，这适用于酰基受体是碳水化合物的情况；
C=Δ蛋白酯%/Mv蛋白酯(其中Δ蛋白酯%=蛋白酯%(酶)-蛋白酯%(对照)，Mv蛋白酯=蛋白酯的平均分子量)，这适用于酰基受体是蛋白的情况；和
D=甘油二酯和/或甘油单酯/Mv甘油二/单酯的绝对值(其中Δ甘油二酯和/或甘油单酯%=甘油二酯和/或甘油单酯%(酶)-甘油二酯和/或甘油单酯%(对照)，Mv甘油二/单酯=甘油二酯和/或甘油单酯的平均分子量)，这适用于酰基受体是甘油的情况。
转移酶活性以占总酶活性的百分率计算：
Figure BDA00001770085400461
*指适当时删除。
GLC分析
Perkin Elmer Autosystem 9000 Capillary Gas Chromatograph,其配备有WCOT熔融石英柱12.5m×0.25mm ID ×0.1μ薄膜厚度5%苯基甲基硅酮(CP Sil 8CB来自Chrompack)。
载气：氦
注射器：PSSI冷裂注射(最初温度50℃，加热到385℃)，体积1.0μl
检测器FID：395℃
Figure BDA00001770085400462
样品制备：将30mg样品溶于9ml的庚烷：吡啶(2：1)中，其中所述庚烷：吡啶含有0.5mg/ml内标十七烷。将300μl的样品溶液移到曲形瓶(crimpvial)，添加300μl MSTFA(N-甲基N-三甲基甲硅烷基三氟乙酰胺)，60℃反应20分钟。
计算：甘油单-二-三酯(mono-di-triglycerides)和游离脂肪酸的反应因子(response factor)通过标准品2(甘油单-双-三酯)确定，胆固醇、胆固醇基棕榈酸酯(Cholesteryl palmitate)和胆固醇基硬脂酸酯的反应因子通过纯参考物质(称取10mg纯物质)来确定。
可以采用多种实验评估变体脂质酰基转移酶的底物特异性。在某些实施方式中，实验可以包含以下成分：具有特定长度的碳链的测试酰基底物(例如酰基酯)，受体分子例如碳水化合物、甾醇/甾烷醇或醇，以及脂质酰基转移酶，其中，所述实验检测在含水环境中酰基从酰基底物至受体分子的转移。
在某些情况下，可以制备变体脂质酰基转移酶文库，并且测试文库成员的变化的底物特异性。可以使用此类方法鉴定具有改变的底物特异性的改变的脂质酰基转移酶。
方案1：测定麦芽糖转移酶活性(20h的方案)
将14g蛋黄和7g碳水化合物单水合物(例如单水合麦芽糖、单水合葡萄糖、单水合乳糖和/或单水合半乳糖)99%搅拌30分钟。然后，将1g蛋黄/碳水化合物底物(例如麦芽糖底物、葡萄糖底物、乳糖底物和/或半乳糖底物)与100μl酶溶液(或对照溶液)在40℃搅拌20小时。加入7.5ml CHCl3:MeOH(2:1)并混合30分钟，然后在1500rpm(700g)离心10分钟。然后将有机相转移到TLC瓶中。通过在160℃温育10分钟活化TLC板。然后将8μl各样本上样至HPTLC Si-板上。使用0.1、0.3、0.5、0.8和1.5μl 0.1%碳水化合物-单油酸酯(例如麦芽糖-单油酸酯、葡萄糖-单油酸酯、乳糖-单油酸酯和/或半乳糖-单乳酸酯)作为标准。然后，将TLC-板在溶剂4-1(比例为64:26:4的CHCl3:甲醇:水)中洗脱20分钟，随后，在通风橱中干燥约10分钟并在160℃温育10分钟。然后通过浸入含6%醋酸铜的16%H3PO4中10秒钟而使板显色，随后干燥(利用干燥滤纸)并在160℃温育8分钟。
将碳水化合物转移酶活性(例如麦芽糖、葡萄糖、乳糖和/或半乳糖转移酶活性)的百分率定义为利用该方案测定的碳水化合物-酯(例如麦芽糖-酯、葡萄糖-酯、乳糖-酯和/或半乳糖-酯)的百分数。
方案2：麦芽糖转移酶活性的可选测定方法(1h的方案)
将14g蛋黄和7g碳水化合物单水合物(例如单水合麦芽糖、单水合葡萄糖、单水合乳糖和/或单水合半乳糖)99%搅拌30分钟。然后将1g蛋黄/碳水化合物底物(例如麦芽糖底物、葡萄糖底物、乳糖底物和/或半乳糖底物)与100μl酶溶液(或对照溶液)在40℃搅拌1小时。加入7.5ml CHCl3:MeOH(2:1)并混合30分钟，然后在1500rpm(700g)离心10分钟。然后将有机相转移到TLC瓶中。通过在160℃温育10分钟活化TLC板。然后将8μl各样本上样至HPTLC Si-板上。使用0.1、0.3、0.5、0.8和1.5μl 0.1%碳水化合物-单油酸酯(例如麦芽糖-单油酸酯、葡萄糖-单油酸酯、乳糖-单油酸酯和/或半乳糖-单乳酸酯)作为标准。然后，将TLC-板在溶剂4-1(比例为64:26:4的CHCl3:甲醇:水)中洗脱20分钟，随后在通风橱中干燥约10分钟，并在160℃温育10分钟。然后通过浸入含6%醋酸铜的16%H3PO4中10秒钟而使板显色，随后干燥(利用干燥滤纸)并在160℃温育8分钟。
将碳水化合物转移酶活性(例如麦芽糖、葡萄糖、乳糖和/或半乳糖转移酶活性)的百分率定义为利用该方案测定的碳水化合物-酯(例如麦芽糖-酯、葡萄糖-酯、乳糖-酯和/或半乳糖-酯)的百分数。
组合物和用途
本发明还提供了包含改变的或变体脂质酰基转移酶的组合物。
在某些实施方式中，所述改变的脂质酰基转移酶包含与野生型脂质酰基转移酶或骨架脂质酰基转移酶至少70%相同的氨基酸序列。
所述组合物可以为食物产品，例如用于人或动物消费的食用产品，或者可食用的食物产品的制造中的中间物(例如食物补充剂)，或者如清洁和/或去污组合物。
如上文所述，包含变体脂质酰基转移酶的清洁和/或去污组合物也包含在本发明中。在某些实施方式中，所述清洁组合物可以包含以下组分：a)如上文所述的本发明的变体脂质酰基转移酶，b)长链酯底物，其在某些实施方式中可以为式R1C(=O)OR2，其中R1包含至少5个碳原子的取代或未取代的碳链，R2为任意有机部分；和c)过氧化氢源。多种其他化合物也可以存在于本发明的清洁组合物中。
本发明的清洁组合物可用于，例如洗衣用途、硬质表面清洁、自动洗碟用途以及化妆品用途，如清洁假牙、牙齿、皮毛和皮肤。然而，由于其在低温溶液中的提高的有效性和高色彩-安全性谱的独特性质，所述本发明的酶完美地适合于洗衣应用，例如织物漂白。此外，本发明的酶还在颗粒和液体组合物中也有用途。
本发明的本发明的酶还可用于清洁助剂产品中。需要额外的漂白效果时，在洗涤过程中掺入所述本发明的清洁助剂产品是很理想的。上述例子包括但不限于低温溶液清洁应用。助剂产品的最简单形式可以是本发明的一种或多种酶。该助剂可以经剂型包装以加入到使用过氧源并需要提高漂白效果的清洁过程中。此类单一剂型可包括丸剂、片剂、胶囊锭或其它单一剂量单元，如预量的粉末或液体。可包括填充剂或运载体材料以增加此类组合物的体积。合适的填充剂或运载体材料包括但不限于多种硫酸盐、碳酸盐和硅酸盐，以及滑石、粘土等等。用于液体组合物的填充剂或运载体材料可以是水或低分子量的伯醇和仲醇(包括多元醇和二醇)。此类醇的实施例包括但不限于甲醇、乙醇、丙醇和异丙醇。所述组合物可包含约5％至约90％的上述材料。可使用酸性填充剂来降低pH值。可选择地，该清洁助剂可包括诸如醇酯、二元醇酯或多元醇酯或如下限定的活性过氧源，或如下限定的辅助成分。
本发明的清洁组合物和清洁助剂需要由本发明提供的有效量的酶。典型地，本发明的清洁组合物包含至少0.0001wt%，约0.0001wt%-约1wt%，约0.001wt%-约0.5wt%，或者甚至约0.01wt%-约0.1wt%的本发明的至少一种酶。
本文使用的“清洁组合物”和“清洁制剂”指的是应用于从待清洁物品，例如织物、盘子、隐形眼镜、其它固体基材、毛发(洗发剂)、皮肤(肥皂和乳膏)、牙齿(漱口液、牙膏)等中清除不想要的化合物的组合物。所述术语包括根据期望的清洁组合物的特定类型和产品形式(例如液体、凝胶、颗粒或喷雾组合物)而挑选的任何材料/化合物，只要该组合物与组合物中使用的过水解酶和其它酶相容。通过考虑要清洗的表面、物品或纺织品，和在使用中的清洗条件下所需要的组合物形式，可容易地进行清洁组合物材料的具体选择。
所述术语进一步指适于对任何物品和/或表面进行清洗、漂白、消毒和/或灭菌的任何组合物。上述术语旨在包括，但不限于清洁组合物(例如液体和/或固体洗衣洗涤剂和精细织物洗涤剂；硬表面清洗制剂，例如玻璃、木材、陶瓷和金属柜台面和窗户；地毯清洁剂；烤箱清洁剂；织物清香剂；织物柔软剂；和纺织品和衣物除污剂，以及餐具洗涤剂)。
事实上，本文使用的术语“清洁组合物”，除非另有说明，包括颗粒的或粉末形式的多用途或强力(heavy-duty)洗涤剂，尤其洗衣洗涤剂；液体，凝胶或糊剂形式的多用途洗涤剂，尤其所谓的强力液体(HDL)类型；液体精细织物洗涤剂；手用洗碗剂或轻型洗碗剂，尤其那些高发泡类型；机用洗碗剂，包括供家庭和机构使用的各种片剂、粒状的、液体的和冲洗辅助类型；液体洗涤和消毒剂，包括抗菌洗手类型，清洁条，漱口液，假牙清洁剂，汽车或地毯香波，浴室清洁剂；洗发水和染发液；沐浴露和泡沫沐浴露和金属清洁剂；以及清洗助剂，例如，漂白添加剂和“去污棒”或预处理类型。
本文使用的术语“洗涤组合物”和“洗涤制剂”是用于指混合物，其目的是用于洗涤带污渍物品的清洗基质中。在一些优选的实施方式中，该术语用于指洗涤织物和/或衣服(例如，“洗衣洗涤剂”)。在可选实施方式中，该术语指其它的洗涤剂，例如用于洗涤碟盘、刀叉等的洗涤剂(例如“洗碗剂”)。本发明希望限定于任何特定的清洗制剂或组合物。事实上，除了过水解酶之外，所述术语包括包含表面活性剂、转移酶、水解酶、氧化还原酶、增洁剂(builders)、漂白剂、漂白活化剂，染蓝剂和荧光染料、结块抑制剂、遮蔽剂、酶活化剂、抗氧化剂和增溶剂的洗涤剂。
本文使用的术语“硬表面清洁组合物”指的是用于洗涤硬表面，例如地板、墙壁、瓷砖、浴室和厨房固定装置等等的清洗组合物。这样的组合物以任意形式提供，包括但不限于固体、液体、乳剂等。
本文使用的“洗碗组合物”指的是所有形式的洗涤餐具的组合物，包括但不限于颗粒的和液体形式。
本文使用的“织物清洁组合物”指的是用于洗涤织物的所有形式的清洗组合物，包括但不限于颗粒、液体和条块形式。
本文使用的“纺织品”包括适合转化成或用作纱、机织布、针织物和无纺布的任何机织布料以及短纤维和细丝。该术语包括由天然以及合成(例如加工的)纤维制造的纱线。
本文使用的“纺织材料”是对纤维、纱纺半制品、纱、织物和由织物制成的产品(例如，衣服和其它物品)的统称。
本文使用的“织物”包括任何纺织材料。因此，该术语旨在包括衣服以及织物、纱、纤维、无纺布材料、天然材料、合成材料和任何纺织材料。
本文使用的术语“相容(兼容)”表示所述清洁组合物材料没有将过水解酶的酶促活性降低至在正常使用条件中不如期望中的有效的程度。具体的清洁组合物材料在下文详细说明。
上述组合物可以在多个方法或应用中使用。总的来说，所述方法或应用可以包括在适合脂质酰基转移酶将酰基由所述底物转移至受体分子上的条件下使本发明的改变的脂质酰基转移酶与底物相接触。所述接触可以在含水条件下完成。
所述方法可用在食物制造、清洁物品、生物催化(例如用以产生酯，其用作乳化剂和/或表面活性剂等)和多种其他应用中。当将变体酶用作生物催化剂时产生的酯可用在化妆品、食品(包括烘焙产品、肉制品、基于蛋的产品和乳制品)、药物、肥皂、蜡烛、油、润滑剂、清漆、油毡、墨水、印刷品、纺织品染料和表面活性剂中，或用作表面活性剂。
上述酶的进一步用途描述在，例如以下公开的专利申请中：US20070026106、20060078648、20050196766和WO2005066347，这些专利申请通过引用并入，用于这些用途的公开。
除了上述应用外，上述酶还可以用在多种食物应用中。例如，所述酶可以存在于，或者可以用于制造食品，其中所述食品是适合人和/或动物消费的任何物质。例如，术语食品包括由生面团制备的烘焙品，以及用于制备所述烘焙品的生面团。在某些情况下，食品可以为含水食品。示例性含水食品除固体成分外，还包括10-98%的水，例如14-98%、18-98%、20-98%、40-98%、50-98%、70-98%、75-98%的水。
在某些实施方式中，食品可选自以下的一种或多种：蛋类，基于蛋的产品(包括但不仅限于蛋黄酱、色拉调料、沙司、冰淇淋、蛋粉、改良蛋黄及由它们制备的产品)，烘焙食品(包括面包、蛋糕、甜面制品、层状面点、液体面糊(batter)、松饼、炸面圈、饼干(biscuit)、发面饼干(cracker)和曲奇饼干)；糖食(confectionary)(包括巧克力、糖果(candy)、焦糖(caramel)、halawa、口香糖，包括无糖口香糖和含糖甜口香糖、泡泡糖、软泡泡糖、香口胶和布丁)；冷冻食品(包括清凉果汁饮料(sorbet)、优选冰冻乳制品(包括冰淇淋、冰牛奶))；乳制品(包括干酪、奶油、黄油、奶、咖啡稀奶油(coffee cream)、搅打起泡的稀奶油(whipped cream)、蛋奶羹(custard cream)、奶饮品和酸奶)；木斯(mousse)、经搅打的蔬菜奶油泥(whipped vegetable cream)、肉制品(包括加工的肉制品)；食用油和脂肪、充气的和真空的经搅打食品、水包油乳剂、油包水乳剂、人造黄油、起酥油(shortening)和涂抹物(spread)包括低脂和极低脂涂抹物；调料(dressings)、蛋黄酱、蘸料(dip)、奶油质沙司(creambased sauce)、奶油质汤(cream based soup)、软饮料、调味乳和沙司。包括蛋糕、发面点心(pastry)、糖食、巧克力、法奇糖(fudge)等的所谓“精制食品(fine foods)”也是食品类型。
在一个实施方式中，本发明的食品可以是面团制品(dough product)或烘烤产品(baked product)，例如面包，油炸制品(fried product)，小吃(snack)，蛋糕(cake)，馅饼(pie)，胡桃巧克力饼(brownie)，曲奇(cookie)，面条(noodle)，休闲零食品(snack items)诸如发面饼干(cracker)，全麦饼干(graham cracker)，椒盐卷饼(pretzel)，薯片(potato chips)和面食制品(pasta)。在其他实施方式中，食品可以是面粉、预混合物(pre-mix)、油、脂肪、可可油、调咖啡用白油(coffeewhitener)、色拉调料、人造黄油、涂抹物、花生酱、起酥油、冰激淋或烹饪用油。
另一方面，本发明所述食品可以是乳制品，包括黄油、奶、奶油、干酪，如天然的、经加工的和人造干酪，它可以呈现多种形式(包括碎片状(shredded)、块状(blocked)、薄片状(sliced)、或搓碎状(grated))、奶油干酪、冰激淋、冷冻的甜点、酸奶、酸奶饮品、乳脂肪(butter fat)、脱水奶脂肪、其它乳制品。本发明的酶能够提高乳制品中脂肪的稳定性。
在特别的实施方式中提供了制备食品的方法。该方法整体包括将上文所述酶加入至所述食品或其成分中。
在其他实施方式中，可提供包含变体酶的食品。例如，可以在以下方法中使用酶：原位产生乳化剂而不增加游离脂肪酸；食品中游离脂肪酸蓄积量下降；食品中的游离胆固醇水平下降；甾醇酯和/或甾烷醇酯增加；血清胆固醇和/或低密度脂蛋白下降；碳水化合物酯增加；不良游离碳水化合物的减少。
在一个实施例中，所述食品中的酰基受体分子可以是包含羟基(-OH)的任何化合物，例如多价醇类，包括甘油；甾醇；甾烷醇；碳水化合物；羟基酸，包括果酸、柠檬酸、酒石酸、乳酸和抗坏血酸；蛋白质或其亚单位，如氨基酸、蛋白质水解物和肽类(部分水解的蛋白质)；及其混合物和衍生物。在某些情况下，所述酰基受体不是水。
甾醇和/或甾烷醇可一种或多种以下结构特征：i)3-β羟基或3-α羟基；和/或ii)顺式位置的A:B环或反式位置的A:B环或者C5-C6是不饱和的。适宜的甾醇酰基受体包括胆固醇和植物甾醇类(phytosterols)，例如α-谷甾醇(sitosterol)、β-谷甾醇、豆甾醇(stigmasterol)、麦角甾醇(ergosterol)、油菜甾醇(campesterol)、5,6-二氢甾醇、菜子甾醇(brassicasterol)、α-菠菜甾醇(spinasterol)、β-菠菜甾醇、γ-菠菜甾醇、δ-菠菜甾醇、岩藻甾醇(fucosterol)、dimosterol、子囊甾醇(ascosterol)、serebisterol,、表甾醇(episterol)、anasterol、hyposterol、chondrillasterol、链甾醇(desmosterol)、海绵甾醇(chalinosterol)、多孔甾醇(poriferasterol)、穿贝海绵甾醇(clionasterol)、甾醇糖苷(sterolglycoside)和其它天然或合成的同分异构体和衍生物。
在本发明的一方面，合适地，可以由一种以上的甾醇和/或甾烷醇作为酰基受体，合适地，可以由两种以上的甾醇和/或甾烷醇作为酰基受体。换言之，在本发明一个方面，合适地，可以产生一种以上的甾醇酯和/或甾烷醇脂。合适地，当胆固醇是酰基受体时，一种或多种其他甾醇和一种或多种甾烷醇也可作为酰基受体。因此，在一个方面，本发明提供了用于原位产生胆固醇酯与至少一种甾醇酯或甾烷醇酯二者组合的方法。换言之，在本发明的一些方面，脂质酰基转移酶可以将酰基从脂质上转移到胆固醇与至少一种其它甾醇和/或至少一种甾烷醇二者。
在一个实施方式中，所述甾醇酰基受体是胆固醇。在这些实施方式中，与接触所述酶前的食品中的游离胆固醇相比和/或与未经所述酶处理的相同食品中的游离胆固醇相比，所述食品中游离胆固醇的量减少。
在其他实施方式中，本发明的酶可以用在基于蛋的产品的生产中。因此，提供了包括使本发明的酶与蛋或基于蛋的产品接触的方法。还提供了包含本发明的酶的基于蛋的产品。
特别地，蛋类和蛋类食品中糖，特别是葡萄糖，的存在常被认为是不利的。蛋黄可以包含多至1%葡萄糖，可以用葡萄糖氧化酶处理蛋类或基于蛋类的食品以去除部分或全部葡萄糖。然而，根据本发明的某些方面，这些不良的糖可以很容易通过糖的“酯化”生成糖酯来去除。
在某些情况下，碳水化合物酯可以在食品中发挥乳化剂的功能。因此，在某些情况下，可以将所述酶用于将酰基转移至糖，本发明包括在食品中原位生产乳化剂。在这些情况下，本发明的酶使用甾醇和/或甾烷醇和碳水化合物作为酰基受体，该方法尤其可用于生产包含蛋类或蛋类产品的食品。在其他实施方式中，所产生的酯(例如甾烷醇酯或甾醇酯)可以为调味剂和/或调质剂。
在另一个实施方式中，可以将本发明的酶加入至生面团中，例如作为烘焙方法的一部分。所述方法还可以包括烘焙包含所述酶的生面团以由生面团制备烘焙产品。当用在生面团或烘焙产品的制备中时，本发明的酶可在生面团和/或烘焙产品中产生以下一个或多个技术效果：改善的面团或烘焙产品(例如面包和/或蛋糕)的比体积(specific volume)；改善的面团稳定性；改善的外皮评分(例如更薄和/或更脆的面包外皮)；改善的面团瓤评分(例如更为均匀的面团瓤分布和/或更精细的面团瓤结构和/或更为柔软的面团瓤)；改善的外观(例如表面光滑没有泡或者洞，或者基本上没有泡或者洞)；陈味(staling)减少；改善的柔软度；改善的气味；改善的口味。
用在生面团和烘焙产品中的面粉通常包含约2%麦芽糖。与其他糖不同，麦芽糖不被酵母所利用。因此，在本发明的一个实施方式中，可涉及提高酶的麦芽糖利用度，即提高酶将酰基从脂质转移至麦芽糖以形成麦芽糖酯的能力。这在烘焙产品中可能尤其重要并导致显著的益处，所述烘焙产品为例如面包，油炸食品，小吃，蛋糕，馅饼，胡桃巧克力饼，曲奇，面条，小吃诸如发面饼干，全麦饼干，脆饼干，薯片和面食制品。通过使用本发明的变体脂质酰基转移酶，可取代烘焙产品中通常使用的乳化剂“DATEMTM”。优选地，通过使用本发明的变体脂质酰基转移酶在烘焙产品(或其生面团)中产生至少0.1%碳水化合物酯，例如麦芽糖酯。
在其他实施方式中，可以将本发明的酶用于在植物油或食用油中极性脂质的脱胶(即减少极性脂质，例如磷脂和/或糖脂，如卵磷脂，即磷脂酰胆碱和脑磷脂的量)。在这些实施方式中，可以使本发明的变体脂质酰基转移酶与所述油接触从而水解油中的极性脂质。
在某些实施方式中，本发明的变体脂质酰基转移酶可以用于降低食用油中的磷脂，其包括用本发明的酶处理所述油从而水解大部分的磷脂，和从所述油分离含水解的磷脂的水相。
在其他实施方式中，可使用本发明的酶将极性脂质(例如糖脂和/或磷脂)转化成更高价值的产品，例如碳水化合物酯、蛋白酯(例如通过与丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸或半胱氨酸残基的反应)和羟酸酯。因此，可以使用本发明的酶将任意酰基链转移至例如甾醇、甾烷醇、碳水化合物、蛋白质或甘油上。
在某些实施方式中，在食品中原位产生乳化剂而不增加或基本不增加食品中游离脂肪酸的含量。在某些情况下，游离脂肪酸的产生对食品是有害的。具体地，游离脂肪酸与食品中的不良气味(off-odour)和/或不良味道(off-flavour)有关，另外还有其它有害影响，包括例如干酪中有肥皂味等等。在某些情况下，该方法使乳化剂(优选两种乳化剂)在原位制备，减少和/或消除其中游离脂肪酸的蓄积。在某些情况下，从脂质除去的脂肪酸被酶转移至酰基受体，例如甾醇和/或甾烷醇。因此，与可能使用其他脂肪酸(例如具有E.C.3.1.1.x定义的活性的脂肪酸，例如脂肪酶(E.C.3.1.1.3)或磷脂酶A[E.C.3.1.1.32或3.1.1.4])的类似方法不同，本发明的方法没有导致食品中游离脂肪酸水平的显著性的增加。此类方法尤其可用于包含蛋类的食品上。
在本发明的一些方面，本发明的变体脂质酰基转移酶可以使用蛋白质作为酰基受体。合适地，所述蛋白可以是见于食物产品中，例如乳制品和/或肉制品中的一种或多种蛋白质。仅作为例示，合适的蛋白可以是见于凝乳或乳清中的那些蛋白，例如乳球蛋白。其它适宜的蛋白质包括来自蛋类的卵清蛋白、醇溶蛋白(gliadin)、麦谷蛋白(glutenin)、puroindoline、来自谷物的脂质转移蛋白和肉类中的肌球蛋白。
除了在洗涤剂中的应用外，本发明还提供了方法和组合物，其用于过酸在纺织品漂白和多种其他应用中的应用。在一些实施方式中，本发明提供了用于纺织品加工应用的一步方法，其包括但不限于一步脱浆、冲刷和漂白过程(参见，例如EP WO 03002810、EP 1255888、WO 0164993和US20020007516，其均通过引用并入)。如本文详细描述的，在一些实施方式中，漂白包括在染色前和/或在引入至纺织品后，对纺织材料进行加工。然而，本发明并不希望局限于任何具体的应用方案或任何具体的纺织材料。
转录后和翻译后修饰
适合地，本发明的脂质酰基转移酶可以由本文教导的任一个核苷酸序列编码。
根据所使用的宿主细胞，可以进行转录后和/或翻译后修饰。可以理解，用于本发明方法和/或应用的脂质酰基转移酶包括已经经历转录后和/或翻译后修饰的脂质酰基转移酶。
仅作为例示，本文以SEQ ID No.10(参见图22)或SEQ ID No.25(参见图42)所示的核苷酸序列在宿主细胞(例如地衣芽孢杆菌)中的表达引起转录后和/或翻译后修饰，从而产生本文SEQ ID No.16所示的氨基酸序列。
除了SEQ ID No.16经历了翻译后和/或转录后修饰从而除去了一些氨基酸(更具体地为38个氨基酸)外，SEQ ID No.16与SEQ ID No.6相同。明显地，所述分子的N-末端和C-末端部分通过两个半胱氨酸之间的S-S桥而共价相连。在翻译后修饰后，SEQ ID No.16的氨基酸残基236和236不共价相连。所形成的两个肽通过一个或多个S-S桥而连在一起。
对于翻译后和/或转录后修饰，准确的切割位点可略有变化，从而，例如仅作为例示，所除去的38个氨基酸(如与SEQ ID No.6相比的SEQ ID No.16所示)可略有改变。不期望受理论束缚，与通过SEQ ID No.6与SEQ ID No.16比较的参照所示的切割位点相比，所述切割位点可朝任一方向移动数个残基(例如1、2或3个残基)。换言之，不是在例如第235-ATR位至第273(RRSAS)位切割，而可在例如残基232、233、234、235、236、237或238开始切割。此外或可选择地，切割可导致除去约38个氨基酸，在一些实施方式中，切割可导致除去30-45之间的残基，例如34-42个残基，例如36-40个残基，优选38个残基。
分离的
一方面，所述脂质酰基转移酶是回收的/分离的脂质酰基转移酶。因此，所产生的亲本或变体脂质酰基转移酶可以是分离的形式。
另一方面，编码用于本发明的脂质酰基转移酶的核苷酸序列可以是分离的形式。
术语“分离(的)”是指序列或蛋白至少基本不包含至少一种其它成分，这些成分原本与所述序列或蛋白天然结合，并且原本在一起发现。
纯化的
一方面，所述脂质酰基转移酶可以是纯化的形式。
另一方面，编码用于本发明的脂质酰基转移酶的核苷酸序列可以是纯化的形式。
术语“纯化的”是指序列处于相对纯的状态，如至少约51%纯，或至少约75%纯，或至少约80%纯，或至少约90%纯，或至少约95%纯，或至少约98%纯。
克隆编码本发明多肽的核苷酸序列
编码具有如本文所定义的特定性质的多肽或适合修饰的多肽的核苷酸序列可以从产生所述多肽的任何细胞或生物中分离得到。用于分离核苷酸序列的各种方法都是本领域熟知的。
例如，可以使用产生所述多肽的生物的染色体DNA或信使RNA来构建基因组DNA和/或cDNA文库。如果所述多肽的氨基酸序列是已知的，可以合成经标记的寡核苷酸探针，并将其用于从由该生物制备的基因组文库中鉴定出编码多肽的克隆。或者，也可以使用包含与另一已知多肽基因同源的序列的经标记寡核苷酸探针来鉴定编码多肽的克隆。在后一种情况下，使用严谨性较低的杂交和清洗条件。
或者，可以通过如下方式鉴定编码多肽的克隆：将基因组DNA的片段插入到表达载体(如质粒)中，使用所得的基因组DNA文库转化酶为阴性的细菌，并随后将转化的细菌涂布在包含被所述多肽抑制的酶的琼脂上，由此可以鉴定出表达所述多肽的克隆。
再者，也可以通过成熟的标准方法，通过合成来制备编码所述多肽的核苷酸序列，如Beucage S.L.et al(1981)Tetrahedron Letters 22,p 1859-1869描述的亚磷酰胺法，或Matthes et al(1984)EMBO J.3,p 801-805描述的方法。在亚磷酰胺法中，在如自动DNA合成仪上合成寡核苷酸，然后将其纯化、退火、连接并克隆到适当的载体中。
所述核苷酸序列可以是源自混合的基因组和合成来源、混合的合成和cDNA来源、或混合的基因组和cDNA来源，其根据标准技术通过连接源自合成的、基因组的或cDNA的片段(根据需要)而制得。每个连接的片段对应于整个核苷酸序列的不同部分。所述DNA序列也可以使用特异引物通过聚合酶链式反应(PCR)来制备，如US 4,683,202或Saiki R K et al(Science(1988)239,pp 487-491)中所述。
核苷酸序列
本发明还涵盖编码具有如本文所定义的特定性质的多肽的核苷酸序列。本文所用的术语“核苷酸序列”是指寡核苷酸序列或多核苷酸序列和其变体、同源物、片段和衍生物(如其部分)。所述核苷酸序列可以是源自基因组或合成物或重组物，其可以是双链的或单链的(无论其代表正义链还是反义链)。
本发明的术语“核苷酸序列”包括基因组DNA、cDNA、合成的DNA和RNA。优选地，其指DNA，更优选为用于编码序列的cDNA。
在优选的实施方式中，编码具有如本文所定义的特定性质的多肽的核苷酸序列本身不涵盖在其天然环境中存在的天然核苷酸序列，此时该序列与同处于其天然环境中其天然结合序列相连接。为了便于参考，我们将此优选实施方式称为“非天然核苷酸序列”。在此，术语“天然核苷酸序列”是指与处于其天然环境中并与其天然结合的完整启动子(同处于其天然环境中)可操作地连接的完整核苷酸序列。因此，可以利用核苷酸序列在其天然生物中表达本发明的多肽，但是其中所述核苷酸序列不受所述生物中与其天然结合的启动子的控制。
优选地，所述多肽不是天然多肽。在此，术语“天然多肽”是指处于其天然环境中并已经由其天然核苷酸序列表达的完整多肽。
通常，使用重组DNA技术(即重组的DNA)制备编码具有如本文所定义的特定性质的多肽的核苷酸序列。然而，在本发明的可选实施方式中，可以使用本领域已知的化学方法来合成全部或部分核苷酸序列(参见CaruthersMH et al(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 215-23和Horn T et al(1980)NucAcids Res Symp Ser 225-232)。
分子进化
分离出编码酶的核苷酸序列或鉴定出编码推定酶的核苷酸序列后，可能需要对所选择的核苷酸序列进行修饰，例如可能需要对所述序列进行突变以制备本发明的酶。
可以使用合成的寡核苷酸来引入突变。这些寡核苷酸包含目标突变位点侧翼的核苷酸序列。
Morinaga等人(Biotechnology(1984)2,p646-649)中公开了适合的方法。Nelson和Long(Analytical Biochemistry(1989),180,p 147-151)中描述了向编码酶的核苷酸序列中引入突变的另一种方法。
除了如上文所述的定点诱变，可以随机引入突变，如使用商品试剂盒，如来自Stratagene的GeneMorph PCR诱变试剂盒，或来自Clontech的DiversifyPCR随机诱变试剂盒。EP 0583265涉及基于PCR的诱变的优化方法，其也可以结合使用DNA突变类似物，如EP 0866796中所述的那些。易错PCR技术也适用于制备具有优选性质的脂质酰基转移酶变体。WO0206457涉及脂肪酶的分子进化。
获得新型序列的第三种方法是使用任何数量的限制性酶或如Dnase I的酶将不同的核苷酸序列片段化，并重新组装成编码功能性蛋白的全长核苷酸序列。或者，可以使用一个或多个不同的核苷酸序列，并在重新组装全长核苷酸序列时引入突变。DNA改组(shuffling)和家族改组技术适用于制备具有优选性质的脂质酰基转移酶变体。适合进行“改组”的方法可以参见EP0752008、EP1138763、EP1103606。改组也可以与如US 6,180,406和WO 01/34835中所述的其它形式的DNA诱变相结合。
因此，可在体内或体外在核苷酸序列中产生大量定点突变或随机突变，并随后通过多种手段筛选功能性得到改进的编码多肽。可以使用例如计算机分析(in silico)和外切酶介导(exo-mediated)的重组方法(参见WO 00/58517、US6,344,328、US 6,361,974)进行分子进化，其中所产生的变体保留了与已知酶或蛋白的很低的同源性。由此获得的所述变体可与已知的转移酶具有显著的结构类似性，但却具有很低的氨基酸序列同源性。
此外，如在非限定性实例中，多核苷酸序列的突变体或天然变体也可以与野生型或其它突变体或天然变体重组以生产新的变体。也可以筛选所述新的变体以获得功能性得到改进的编码多肽。
应用以上以及类似的分子进化方法能够在没有关于蛋白结构或功能的任何现有知识的情况下鉴定和选择具有优选特性的本发明的酶变体，并能够产生不可预测的但有益的突变体或变体。在本领域中应用分子进化来优化或改变酶活性的实例有很多，所述实例包括但不限于以下的一种或多种：优化在宿主细胞或体外的表达和/或活性、增加酶活性、改变底物和/或产物特异性、增加或降低酶稳定性或结构稳定性、改变在优选环境条件(如温度、pH、底物)中酶的活性/特异性。
本领域的技术人员可理解，使用分子进化工具可以改变酶以提高该酶的功能性。
适合地，编码用于本发明的脂质酰基转移酶的核苷酸序列可以编码脂质酰基转移酶变体，即当与亲本酶比较时，所述脂质酰基转移酶可以包含至少一个氨基酸的取代、缺失或添加。优选地，所述变体酶与亲本酶保持至少40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%、99%的同源性。适合的亲本酶可以包括具有酯酶或脂肪酶活性的任何酶。优选地，亲本酶与pfam00657共有序列相比对。
氨基酸序列
本发明还涵盖由用于本发明任一方法和/或应用中的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列所编码的氨基酸序列的应用。
本文所使用的术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白”同义。在一些实例中，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义。
所述氨基酸序列可以从适合的来源制备/分离，或其可以通过合成制备、或其可以使用重组DNA技术制备。
适合地，所述氨基酸序列可以通过标准技术从本文教导的分离多肽获得。
一种适合测定分离多肽的氨基酸序列的方法如下：
可以将纯化的多肽冻干，并将100μg的冻干原料溶解于8M尿素和0.4M碳酸氢铵(pH 8.4)的50μl混合物中。在覆盖氮气并加入5μl 45mM二硫苏糖醇后，可以将溶解的蛋白在50℃变性并还原15分钟。冷却至室温后，可以加入5μl 100mM碘乙酰胺，从而使半胱氨酸残基在室温、避光和氮气下衍生15分钟。
可以向以上反应混合物中加入135μl水和含5μg内切蛋白酶Lys-C的5μl水，并在37℃氮气保护下消化24小时。
可以使用溶剂A(0.1%TFA的水溶液)和溶剂B(0.1%TFA的乙腈溶液)在VYDAC C18柱(0.46x15cm;10μm;The Separation Group,California,USA)上通过反相HPLC分离所得到的肽。在N-末端测序前，可以使用相同的溶剂体系在Develosil C18柱上对所选择的肽进行重新层析。可以使用AppliedBiosystems 476A测序仪，根据生产商的说明书(Applied Biosystems,California,USA)使用脉冲液态快速循环来完成测序。
序列同一性或序列同源性
在此，术语“同源物”是指与目标氨基酸序列和目标核苷酸序列具有一定同源性的实体。在此，术语“同源性”可以等同于“同一性”。
所述同源氨基酸序列和/或核苷酸序列应提供和/或编码保留所述酶的功能活性和/或增强所述酶的活性的多肽。
在本文中，认为同源序列包括可以与目标序列有至少75%、85%或90%同一性，优选为至少95%或98%同一性的氨基酸序列。通常，同源物将包含与目标氨基酸序列相同的活性位点等。虽然同源性也可以被视为相似性(即具有相似化学性质/功能的氨基酸残基)，但是在本发明的内容中，优选以序列同一性表示同源性。
在本文中，认为同源序列包括可以与编码本发明多肽的核苷酸序列(目标序列)有至少75%、85%或90%同一性的核苷酸序列，优选为至少95%或98%同一性的核苷酸序列。通常，同源物将包括与目标序列相同的活性位点编码序列等。虽然同源性也可以被视为相似性(即具有相似化学性质/功能的氨基酸残基)，但是在本发明的内容中，优选以序列同一性表示同源性。
可以通过目测进行同源性比较，或者更通常是借助易于获得的序列比较程序进行同源性比较。这些商业性计算机程序可以计算两个或多个序列间的同源性%。
可以在连续的序列中计算同源性%，即一个序列与其它序列比对，且将一个序列中的每个氨基酸与其它序列中的相应氨基酸直接比较，每次比较一个残基。这被称为“无缺口”比对。通常所述无缺口比对仅在数量相对少的残基中进行。
虽然这是非常简单且稳定的方法，但是其未能考虑到如在其它方面相同的成对序列中，一个插入或缺失将引起随后的氨基酸残基无法比对，因此可能导致在进行整体比对时的同源性%大大降低。因此，大部分序列比对方法被设计成产生考虑了可能的插入和缺失而不过度地惩罚整体同源性得分的最佳比对。这可以通过在比对序列中插入“缺口”以试图使局部同源性最大化而实现。
然而，这些更加复杂的方法给比对中出现的每个缺口赋予“缺口罚分”，使得对于相同数目的相同氨基酸，具有尽量少缺口的序列比对(反映了两个比较的序列间更高的相关性)将比具有更多缺口的序列比对达到更高的得分。通常使用“仿射缺口罚分”(Affine gap cost)，即对缺口的存在处以较高罚分，而对缺口中的每个后续残基处以较低罚分。这是最常用的缺口评分系统。高缺口罚分将无疑产生具有更少缺口的优化比对。大多数比对程序允许修正缺口罚分。然而，当使用所述软件进行序列比较时，优选使用默认值。
因此，最大同源性%的计算首先需要在考虑缺口罚分下产生最佳的比对。适合用于进行所述比对的计算机程序为Vector NTI(Invitrogen Corp.)。可以进行序列比较的其它软件的实例包括但不限于BLAST软件包(参见Ausubel等1999 Short Protocols in Molecular Biology，4th Ed,Chapter 18)和FASTA(Altschul等1990J.Mol.Biol.403-410)。BLAST和FASTA均可进行离线和在线搜索(参见Ausubel等1999,7-58页至7-60页)。然而，对于一些应用，优选使用Vector NTI程序。也可以将称为BLAST 2Sequences的新型工具用于比较蛋白和核苷酸序列(参见FEMS Microbiol Lett 1999174(2):247-50;FEMSMicrobiol Lett 1999177(1):187-8和tatianancbi.nlm.nih.gov)。
虽然可以根据同一性来测定最终的同源性%，但是比对方法本身通常不是基于全是或全非的成对比较。作为代替，通常使用尺度相似性评分矩阵(scaled similarity score matrix)，基于化学相似性或进化距离对每对比较评分。通常所用的此矩阵的实例为BLOSUM62矩阵，即用于BLAST程序套的默认矩阵。Vector NTI程序通常使用公开的默认值，或者也可能使用所提供的自定义符号比较表(详见用户手册)。对于一些应用，优选使用Vector NTI软件包的默认值。
或者，也可以使用基于与CLUSTAL(Higgins DG & Sharp PM(1988),Gene 73(1),237-244)类似的算法的Vector NTI(Invitrogen Corp.)中的多重比对特征来计算同源性%。
一旦软件生成了最佳比对，就可以计算同源性%，优选为序列同一性%。软件通常将其作为序列比较的一部分来执行，并生成数值结果。
如果在测定序列同一性时使用缺口罚分，则优选使用以下参数进行成对比对：
  BLAST
  缺口开口  0
  缺口延伸  0
 CLUSTAL   DNA   蛋白
 字长(WORD SIZE)   2   1   K三联体
 缺口罚分   15   10
 缺口延伸   6.66   0.1
在一个实施方式中，优选使用具有以上定义的缺口罚分和缺口延伸设定的CLUSTAL来测定核苷酸序列的序列同一性。
适合地，在至少20个连续的核苷酸中，优选为在至少30个连续的核苷酸中，优选为在至少40个连续的核苷酸中，优选为在至少50个连续的核苷酸中，优选为在至少60个连续的核苷酸中，优选为在至少100连续的核苷酸中测定核苷酸序列的同一性程度。
适合地，在全序列中测定核苷酸序列中的同一性程度。
在一个实施方式中，本发明氨基酸序列的同一性程度可以通过本领域已知的计算机程序的方法，如Vector NTI 10(Invitrogen Corp.)来适当地测定。对于成对比对，所用的矩阵优选为缺口开口罚分为10.0且缺口延伸罚分为0.1的BLOSUM62。
适合地，在至少20个连续的氨基酸中，优选为在至少30个连续的氨基酸中，优选为在至少40个连续的氨基酸中，优选为在至少50个连续的氨基酸中，优选为在至少60个连续的氨基酸中测定氨基酸序列的同一性程度。
适合地，在全序列中测定氨基酸序列的同一性程度。
所述序列也可以具有产生沉默改变和产生功能等价物的氨基酸残基的缺失、插入或取代。可以根据残基在极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质上的相似性来进行谨慎的氨基酸取代，只要该物质的二级结合活性被保持即可。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；具有相似亲水性值的不带电荷的极性头基团的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。
例如可以根据下表进行保守取代。在第二列中相同栏中的氨基酸，优选为在第三列中相同行中的氨基酸可以相互取代：
Figure BDA00001770085400641
本发明还涵盖可以发生的同源取代(本文所用的取代和替换均指现存氨基酸残基与可选残基的互换)，即相似取代，如碱性氨基酸取代碱性氨基酸、酸性氨基酸取代酸性氨基酸、极性氨基酸取代极性氨基酸等。也可以发生非同源取代，即从一类残基变成另一类残基，或涉及非天然氨基酸，如鸟氨酸(下文称为Z)、二氨基丁酸鸟氨酸(下文称为B)、正亮氨酸鸟氨酸(下文称为O)、吡啶丙氨酸、噻吩丙氨酸、萘丙氨酸和苯甘氨酸。
也可以使用非天然氨基酸进行替换。
氨基酸变体序列可以包含可以在序列的任何两个氨基酸残基间插入的适合的间隔子基团，除氨基酸间隔子如甘氨酸或β-丙氨酸残基外，还包括烷基基团如甲基、乙基或丙基基团。本领域的技术人员可充分理解其它形式的变异，其涉及以类肽(peptoid)形式存在的一个或多个氨基酸残基。为了避免争议，“类肽形式”用来指α-碳取代基基团在残基的氮原子上而非在α-碳上的氨基酸残基变体。制备类肽形式的肽的方法是本领域内已知的，如Simon RJ等,PNAS(1992)89(20),9367-9371和Horwell DC,Trends Biotechnol.(1995)13(4),132-134。
本发明所使用的或编码具有本文定义的特定性质的多肽的核苷酸序列可以在其内部包含合成的或修饰的核苷酸。本领域中已知对寡核苷酸的许多不同类型的修饰。这些修饰包括甲基膦酸酯和硫代磷酸酯骨架和/或在分子的3’末端和/或5’末端添加吖啶或多赖氨酸链。出于本发明的目的，应该理解可以用本领域中可用的任何方法来修饰本文所述的核苷酸序列。可以进行所述修饰以增强核苷酸序列的体内活性或寿命。
本发明还涵盖与本文所讨论的序列或其任何衍生物、片段或衍生物互补的核苷酸序列的应用。如果序列与其片段互补，此序列可以被用作探针以鉴定其它生物等中类似的编码序列。
可以以多种方式获得与本发明的序列并非100%同源但却落入本发明范围中的多核苷酸。可以通过例如探测由一系列个体(如来自不同种群的个体)制备的DNA文库来获得本文所述序列的其它变体。此外，可以获得其它病毒/细菌或细胞同源物，特别是在见于哺乳动物细胞(如大鼠、小鼠、牛和灵长类细胞)中的细胞同源物，且所述同源物或其片段将通常能够选择性地与本文序列表中所示的序列杂交。可以通过探测从其它动物物种制备的cDNA文库或基因组DNA文库，并在中度至高度严谨条件下使用包含所附序列表中任一个序列的全部或部分的探针探测所述文库来获得所述序列。类似的考虑用于获得本发明多肽或核苷酸序列的物种同源物和等位基因变体。
也可以使用简并PCR来获得变体和株系/物种同源物，所述简并PCR可使用设计为靶向变体和同源物中编码本发明序列中的保守氨基酸序列的序列。可以通过例如，比对来自多个变体/同源物的氨基酸序列来预测保守序列。可以使用本领域已知的计算机软件进行序列比对。例如广泛使用GCGWisconsin PileUp程序。
简并PCR中所用的引物可包含一个或多个简并位点，且其使用条件的严谨性可低于使用针对已知序列的单一序列引物克隆序列所用的那些条件。
或者，也可以通过已表征序列的定点诱变来获得所述多核苷酸。例如当需要沉默密码序列的改变，从而为表达多核苷酸序列的特定宿主细胞优化密码子偏爱性时，这可能是有用的。可需要其它序列改变，以引入限制性多肽识别位点，或改变由多核苷酸编码的多肽的性质或功能。
可以使用本发明的多核苷酸(核苷酸序列)制备引物，如PCR引物，用于可选扩增反应的引物；探针，如使用放射性或非放射性标记物通过常规方法用显示性标记物标记的探针；或可以将多核苷酸克隆到载体中。所述引物、探针和其它片段的长度可以是至少15个，优选为至少20个、如至少25个、30个或40个核苷酸，且其也涵盖在如本文所用的术语多核苷酸之内。
可以重组、合成或通过本领域技术人员可利用的任何方法来制备根据本发明的多核苷酸(如DNA多核苷酸)和探针。它们也可以通过标准技术进行克隆。
通常，可通过合成方法来制备引物，该方法包括以每次一个核苷酸的方式逐步制备所需要的核酸序列。本领域中易于获得使用自动化技术来实现上述方法的技术。
通常使用重组方法，如使用PCR(聚合酶链式反应)克隆技术来制备较长的多核苷酸。这包括制备位于所需要克隆的脂质靶向序列区域侧翼的一对引物(如约15至30个核苷酸)，使引物接触从动物或人细胞获得的mRNA或cDNA，在可以使所需区域扩增的条件下进行聚合酶链式反应，分离扩增的片段(如通过在琼脂糖凝胶上纯化反应混合物)，并回收扩增的DNA。可以设计引入使其包含适合的限制性酶识别位点，以便可以将扩增的DNA克隆到适合的克隆载体中。
杂交
本发明还涵盖与本发明的序列互补的序列，或能够与本发明的序列杂交或与其互补序列杂交的序列的应用。
本文所用的术语“杂交”应包括“核酸链通过碱基配对与互补链结合的过程”，以及在聚合酶链式反应(PCR)技术中进行扩增的过程。
本发明还涵盖所述核苷酸序列的应用，所述核苷酸序列能够和与本文所讨论的目标序列、或其任何衍生物、片段或衍生物互补的序列杂交。
本发明还涵盖能够与本文所讨论的核苷酸序列杂交的序列的互补序列。
杂交条件基于核苷酸结合复合物的解链温度(Tm)，如Berger和Kimmel(1987,Guide to Molecular Cloning Techniques,Methods in Enzymology，Vol.152,Academic Press,San Diego CA)中所教导，且给出了如下文所解释的定义的“严谨性”。
最高严谨性通常出现在约(Tm-5)℃(比探针的Tm低5℃)；高严谨性在比Tm以下约5℃至10℃；中等严谨性在Tm以下约10℃至20℃；且低严谨性出现在Tm以下约20℃至25℃。如本领域技术人员的理解，最高严谨性杂交可以用于鉴定或检测相同的核苷酸序列，而中等(或低)严谨性杂交可以用于鉴定或检测相似或相关的多核苷酸序列。
优选地，本发明涵盖能够在高严谨性条件或中等严谨性条件下与编码具有如本文定义的特定性质的多肽的核苷酸序列杂交的序列的互补序列的应用。
更优选地，本发明涵盖能够在高严谨性条件(如65℃和0.1xSSC{1xSSC=0.15M NaCl、0.015M柠檬酸钠，pH 7.0})下与编码具有如本文定义的特定性质的多肽的核苷酸序列发生杂交的序列的互补序列的应用。
本发明还涉及能够与本文讨论的核苷酸序列(包括本文讨论的那些序列的互补序列)杂交的核苷酸序列的应用。
本发明还涉及能够与本文讨论的核苷酸序列(包括本文讨论的那些序列的互补序列)杂交的序列的互补核苷酸序列的应用。
本发明的范围还包括能够在中等至最高严谨性条件下与本文所讨论的核苷酸序列杂交的多核苷酸序列的应用。
在优选的方面，本发明涵盖能够在严谨性条件(如50℃和0.2xSSC)下与本文所讨论的核苷酸序列或其互补序列杂交的核苷酸序列的应用。
在更优选的方面，本发明涵盖能够在高严谨性条件(如65℃和0.1xSSC)下与本文所讨论的核苷酸序列或其互补序列杂交的核苷酸序列的应用。
多肽的表达
为了产生变体文库，可以使用原核或真核表达宿主。为了确保在变体文库内的均匀表达，可以优选低拷贝数，优选单事件染色体表达体系(singleevent chromosomal expression systems)。还优选具有高转化率的表达系统，尤其用于大变体文库(>1000个菌落)的表达，例如利用随机诱变法和/或改组技术制备的那些大变体文库。
适合在酶生产中使用真核表达宿主，即酵母的方法描述在EP1131416中。可优选微生物真核表达宿主，例如酵母，用于表达由真核酰基亲本基因产生的变体文库。
利用芽孢杆菌，即枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)作为酶生产中的表达宿主的合适方法描述在WO02/14490中。可以优选微生物原核表达宿主，例如芽孢杆菌，用于表达由原核酰基亲本基因产生的变体文库。
在一个优选的实施方式中，表达宿主为地衣芽孢杆菌。在地衣芽孢杆菌中表达脂质酰基转移酶在WO2008/090395中有教导(其教导通过引用并入)。
可以将用于本发明的核苷酸序列或用于编码具有如本文所定义的特定性质的多肽的核苷酸序列引入重组的复制型载体中。载体可以用于在相容的宿主细胞中和/或从相容的宿主细胞复制并以多肽形式表达所述核苷酸序列。可以使用控制序列来控制表达，所述控制序列包括含启动子/增强子和其它表达调控信号。可以使用原核生物的启动子和在真核细胞中有功能的启动子。可以使用组织特异的或刺激特异性启动子。也可以使用包含来自上述两个或更多不同启动子的序列元件的嵌合启动子。
根据所用的序列和/或载体，通过由宿主重组细胞表达核苷酸序列而产生的多肽可以被分泌，或被包含在细胞内。编码序列经设计可以具有信号序列，该信号序列指导编码序列物质分泌通过特定的原核生物或真核细胞膜。
构建体
术语“构建体”，与术语如“结合物(或连接物)”、“盒(cassette)”和“杂合体(hybrid)”同义，其包含编码用于本发明的具有本文所定义的特定性质的多肽的核苷酸序列，且其直接或间接地与启动子连接。间接连接的实例是在启动子和本发明的核苷酸序列之间提供适合的间隔子基团，如内含子序列，如Sh1内含子或ADH内含子。本发明中的相关术语“融合”也是如此，其包括直接或间接连接。在一些情况中，这些术语不涵盖编码所述蛋白的核苷酸序列与其通常连接的野生型基因启动子的天然组合(此时这两者均处于其天然环境中)。
所述构建体甚至可以包含或表达允许选择基因构建体的标记物。
对于一些应用，优选构建体至少包含本发明的核苷酸序列，或编码具有如本文定义的特定性质的多肽且可操作地与启动子连接的核苷酸序列。
生物
与本发明有关的术语“生物”包括可包含本发明的核苷酸序列或编码具有如本文定义的特定性质的多肽的核苷酸序列和/或由其获得的产物的任何生物。
与本发明有关的术语“转基因生物”包括：包含编码具有如本文定义的特定性质的多肽的核苷酸序列和/或由其获得的产物，和/或其中启动子能够允许编码具有如本文定义的特定性质的多肽的核苷酸序列在所述生物内表达的任何生物。优选核苷酸序列被引入到所述生物的基因组中。
术语“转基因生物”不涵盖在处于自身天然环境中并同时受到其同处于自身天然环境中的天然启动子控制的天然核苷酸编码序列。
因此，本发明的转基因生物包括：包含以下任何一种或组合的生物：编码具有如本文定义的特定性质的多肽的核苷酸序列、本文定义的构建体、本文定义的载体、本文定义的质粒、本文定的细胞或其产物。例如，所述转基因生物还可以包含在启动子的控制下编码具有如本文定义的特定性质的多肽的核苷酸序列，其中所述启动子原本并不与脂质酰基转移酶编码基因相连。
宿主细胞/生物的转化
所述宿主生物可以是原核或真核生物。
合适的原核宿主的实例包括细菌，例如大肠杆菌和地衣芽孢杆菌，优选地衣芽孢杆菌。
原核宿主的转化的教导在本领域中有详细的记载，例如参见Sambrook等(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd edition,1989,Cold SpringHarbor Laboratory Press)。如果使用原核宿主，则在转化前需要适当地修饰核苷酸序列，例如去除内含子。
在另一个实施方式中，所示转基因生物可以为酵母。
可以利用本领域已知的多种方法转化丝状真菌，例如包括原生质体形成和原生质体转化，然后以已知的方式重建细胞壁的方法。在EP 0238023中公开了曲霉作为宿主微生物的应用。
另一种宿主生物可以为植物。用于转化植物的常用技术的概述可见于Potrykus(Annu Rev Plant Physiol Plant MoI Biol[1991]42:205-225)和Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 199417-27)。关于植物转化的其它教导可见于EP-A-0449375。
以下部分为关于真菌、酵母和植物转化的一般教导。
分泌
通常，期望表达宿主将多肽分泌到培养基中，由此可以更容易地回收酶。根据本发明，可以基于所需的表达宿主来选择分泌前导序列。本发明中也可以使用杂合信号序列。
原本不与编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列连接的分泌前导序列的典型实例为那些源于真菌淀粉葡萄糖苷酶(AG)基因(glaA-18个氨基酸和24个氨基酸两种形式，如来自曲霉菌属)、a-因子基因(酵母，如酵母属、克鲁维酵母和汉逊酵母)或α-淀粉酶基因(芽孢杆菌)的序列。
融合蛋白
用于本发明的脂质酰基转移酶可以作为融合蛋白制备，例如以便有助于其提取和纯化。融合蛋白配偶体(partner)的实例包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、6xHis、GAL4(DNA结合和/或转录激活结构域)和β-半乳糖苷酶。也可以方便地在融合蛋白配偶体和目的蛋白序列之间包含蛋白水解切割位点以去除融合蛋白序列。优选地，融合蛋白将不会妨碍蛋白序列的活性。
Curr.Opin.Biotechnol.(1995)6(5):501-6已经对大肠杆菌中的基因融合表达系统进行了综述。
具有如本文定义的特定性质的多肽的氨基酸序列可以与非天然序列连接以编码融合蛋白。例如，为了从肽库筛选能够影响物质活性的试剂，其可用于编码表达可被商购抗体所识别的非天然表位的嵌合物。
下文将参照以下附图和实施例，仅以举例的方式描述本发明。
附图说明
图1显示了突变的杀鲑气单胞菌成熟脂质酰基转移酶(GCAT)的氨基酸序列，该突变体具有Asn80Asp突变(注意，第80位氨基酸位于成熟序列中)(SEQ ID No.6)；
图2显示了来自嗜水气单胞菌(ATCC#7965)的脂质酰基转移酶的氨基酸序列(SEQ ID No.1)；
图3显示了来自第6版数据库的pfam00657共有序列(SEQ ID No.2)；
图4显示了从生物嗜水气单胞菌获得的氨基酸序列(SEQ ID No.3)(P10480；GI:121051)；
图5显示了从生物杀鲑气单胞菌获得的氨基酸序列(SEQ ID No.4)(AAG098404；GI:9964017)；
图6显示了来自杀鲑气单胞菌杀鲑亚种(Aeromonas salmonicida subsp.Salmonicida)的脂质酰基转移酶的氨基酸序列(SEQ ID No.5)；
图7显示了用于嗜水气单胞菌脂质酰基转移酶基因的诱变的融合构建体的氨基酸序列(SEQ ID No.7)。下划线表示的氨基酸为木聚糖酶信号肽；
图8显示了从生物嗜水气单胞菌获得的氨基酸序列(SEQ ID No.8)(P10480;GI:121051)；
图9显示了突变的杀鲑气单胞菌成熟脂质酰基转移酶(GCAT)的氨基酸序列(SEQ ID No.9)；
图10显示了活性位点中具有甘油的1IVN.PDB晶体结构的带状显示图。此图使用Deep View Swiss-PDB Viewer制作；
图11显示了活性位点中具有甘油的1IVN.PDB晶体结构的侧视图(使用Deep View Swiss-PDB Viewer制作)，黑色部分为活性位点甘油
Figure BDA00001770085400711
以内的残基；
图12显示了活性位点中具有甘油的1IVN.PDB晶体结构的俯视图(使用Deep View Swiss-PDB Viewer制作)，黑色部分为活性位点甘油
Figure BDA00001770085400712
以内的残基；
图13显示了比对1；
图14显示了比对2；
图15和16显示了1IVN与P10480的比对(P10480为嗜水气单胞菌酶的数据库序列)，此比对从PFAM数据库获得，并用在模型构建过程中；
图17显示了其中P10480为嗜水气单胞菌的数据库序列的比对。此序列用于模型构建和位点选择。注意：绘制出了完整的蛋白(SEQ ID No.3)，成熟蛋白(等价于SEQ ID No.8)起始于第19位残基。杀鲑气单胞菌(A.sal)为杀鲑气单胞菌的GDSX脂肪酶(SEQ ID No.9)，嗜水气单胞菌(A.hyd)为嗜水气单胞菌的GDSX脂肪酶(SEQ ID No.8)。所列序列间的差异位置在共有序列中用*表示；
图18显示了基因构建体；
图19显示了密码子优化的基因构建体(no.052907)；和
图20显示了包含脂质酰基转移酶前体基因的XhoI插入物的序列，下划线处为-35框和-10框；
图21显示了在三丁酸甘油酯琼脂上，于37℃生长48小时后的BML780-KLM3’CAP50(包含SEQ ID No.16-上面的菌落)和BML780(空宿主菌株-下面的菌落)；
图22显示了来自杀鲑气单胞菌的包含信号序列(preLAT-从第1位至第87位)的核苷酸序列(SEQ ID No.10)；
图23显示了从生物嗜水气单胞菌获得的编码本发明的脂质酰基转移酶的核苷酸序列(SEQ ID No.11)；
图24显示了从生物杀鲑气单胞菌获得的编码本发明的脂质酰基转移酶的核苷酸序列(SEQ ID No.12)；
图25显示了编码来自嗜水气单胞菌(ATCC#7965)的脂质酰基转移酶的核苷酸序列(SEQ ID No.13)；
图26显示了编码来自杀鲑气单胞菌杀鲑亚种(ATCC#14174)的脂质酰基转移酶的核苷酸序列(SEQ ID No.14)；
图27显示了核苷酸序列(SEQ ID No.15)，其编码来自嗜水气单胞菌的包含木聚糖酶信号肽的酶；
图28显示了具有Asn80Asp突变(注意，第80位氨基酸位于成熟序列中)的杀鲑气单胞菌成熟脂质酰基转移酶(GCAT)突变体的氨基酸序列(本文显示为SEQ ID No.6)，和经过翻译后修饰的氨基酸序列(SEQ ID No.16)-SEQ IDNo.16的第235位和236位氨基酸残基在翻译后修饰后并没有共价连接。所形成的两个肽通过一个或多个S-S桥连接在一起。SEQ ID No.16中的第236位氨基酸对应于本文所示的SEQ ID No.6中的第274位氨基酸残基[SEQ IDNo.16与SEQ ID No.6相同，但SEQ ID No.15显示了翻译后剪切或切割而除去38个氨基酸的序列]；
图29显示了质粒pLA52，其包含编码用于产生位点评价文库的脂质酰基转移酶的核苷酸序列(SEQ ID No.25)；
图30显示了脂质酰基转移酶尤其是本文以SEQ ID No.16所示的杀鲑气单胞菌脂质酰基转移酶的“峡谷”和“穴”结构；
图31显示了包含N80D突变且为经历翻译后剪切的成熟序列的杀鲑气单胞菌脂质酰基转移酶的脂质酰基转移酶(本文以SEQ ID No.16表示，白色)和大肠杆菌硫酯酶(黑色)(PDB登记1IVN)的结构比对；
图32显示了包含N80D突变且为经历翻译后剪切的成熟序列的杀鲑气单胞菌脂质酰基转移酶的脂质酰基转移酶(本文以SEQ ID No.16表示，白色)和大肠杆菌硫酯酶(黑色)(PDB登记1IVN)的结构比对，并鉴定出以棍表示的“插入物1”的残基(残基22-36)；
图33显示了包含N80D突变且为经历翻译后剪切的成熟序列的杀鲑气单胞菌脂质酰基转移酶的脂质酰基转移酶(本文以SEQ ID No.16表示，白色)和大肠杆菌硫酯酶(黑色)(PDB登记1IVN)的结构比对，并鉴定出以棍表示的“插入物2”的残基(残基74-88)；
图34显示了包含N80D突变且为经历翻译后剪切的成熟序列的杀鲑气单胞菌脂质酰基转移酶的脂质酰基转移酶(本文以SEQ ID No.16表示，白色)和大肠杆菌硫酯酶(黑色)(PDB登记1IVN)的结构比对，并鉴定出以棍表示的“插入物3”的残基(残基162-168)；
图35显示了包含N80D突变且为经历翻译后剪切的成熟序列的杀鲑气单胞菌脂质酰基转移酶的脂质酰基转移酶(本文以SEQ ID No.16表示，白色)和大肠杆菌硫酯酶(黑色)(PDB登记1IVN)的结构比对，并鉴定出以棍表示的“插入物4”的残基(残基213-281)；
图36显示了包含N80D突变且为经历翻译后剪切的成熟序列的杀鲑气单胞菌脂质酰基转移酶的脂质酰基转移酶(本文以SEQ ID No.16表示，白色)和大肠杆菌硫酯酶(黑色)(PDB登记1IVN)的结构比对，并在图中显示了“插入4物”的残基(残基213-281)，并且以空间填充的方式显示了脂质酰基转移酶的催化三联体(S16,D288,H291)；
图37显示了包含N80D突变且为经历翻译后剪切的成熟序列的杀鲑气单胞菌脂质酰基转移酶的脂质酰基转移酶(本文以SEQ ID No.16表示，白色)和大肠杆菌硫酯酶(黑色)(PDB登记1IVN)的结构比对，并且催化三联体(S16,D288,H291)以黑灰空间填充表示，形成峡谷的残基(包括Y117、A119和Y120)以白色空间填充表示；
图38显示了体外筛选结果的图，其评价了用来自杀鲑气单胞菌(包含N80D突变)的骨架脂质酰基转移酶；和4个变体酶的麦芽糖-酯的产生=f(100μl/g蛋黄,20h)；
图39显示了体外筛选结果的图，其评价了用来自杀鲑气单胞菌(包含N80D突变)的骨架脂质酰基转移酶；和4个变体酶的麦芽糖-酯的产生(g甲基酯(ME)/mg酶蛋白)；
图40显示了来自体外第3轮筛选的图，其评价了用来自杀鲑气单胞菌(包含N80D突变)的骨架脂质酰基转移酶；和4个变体酶的酶水解活性(LATU/mg酶蛋白)；
图41显示了当以10mg/kg面粉使用时，利用来自杀鲑气单胞菌(包含N80D突变)的骨架脂质酰基转移酶和两个变体M27K和L31Q,W122L在面浆中产生麦芽糖酯%的图；
图42显示了编码来自杀鲑气单胞菌的骨架脂质酰基转移酶的核苷酸序列SEQ ID No.25，其在以下实施例中用于制备变体脂质酰基转移酶；
图43显示了作为在TLC平板上测定的甘油三酯面积的函数的，基于0.5%精炼油菜籽油(标准物)的上样量(attachment)(0.1、0.3、0.5、0.8和1.5μl)的标准曲线；
图44显示了从胶量(对照)减去胶量(酶促样本)计算的产率(%)。由于分析错误，没有显示样本5。样本2：EDS 226(0.1 LATU-K/g)，3:K710(0.2LATU-K/g)，4:K710(0.4LATU-K/g)，6:K916(0.04LATU-K/g)，7:K916(0.1LATU-K/g)和8:K916(0.2LATU-K/g)；
图45显示了GC-结果：用脂质酰基转移酶突变体脱胶的油中的FFA、植物甾醇类和植物甾醇酯类的含量(％)。样本1：对照，2:EDS 226(0.1LATU-K/g)，3:K710(0.2LATU-K/g)，4:K710(0.4LATU-K/g)，6:K916(0.04LATU-K/g)，7:K916(0.1LATU-K/g)和8:K916(0.2LATU-K/g)；
图46显示了2-溶血-磷脂酰胆碱(2-LPC)降解成游离酸(FFA)和甘油磷脂酰胆碱(GPC)的溶血活性；
图47显示了胶相的TLC分析的结果；胶中磷脂(PE和PA)的相对降解。结果基于用不同脂质酰基转移酶突变体脱胶的油。样本1:对照,2:EDS 226(0.1LATU-K/g)，3:K710(0.2LATU-K/g)，4:K710(0.4LATU-K/g)，5:K710(0.9LATU-K/g)，6:K916(0.04LATU-K/g)，7:K916(0.1LATU-K/g)和8:K916(0.2LATU-K/g)；
图48显示了胶相的TLC分析的结果；用不同脂质酰基转移酶突变体脱胶而获得的油中的甘油三酯的含量(%)。样本1:对照,2:EDS 226(0.1LATU-K/g),3:K710(0.2LATU-K/g),4:K710(0.4LATU-K/g),5:K710(0.9LATU-K/g)，6:K916(0.04LATU-K/g),7:K916(0.1LATU-K/g)和8:K916(0.2LATU-K/g)。
实施例
实施例1-变体脂质酰基转移酶的产生
选择包含SEQ ID No.6(杀鲑气单胞菌磷脂酰胆碱胆固醇酰基转移酶(＝脂质酰基转移酶))所示序列的脂质酰基转移酶的某些位置用于位点评价，并筛选改良的性质，例如改变的底物特异性，如改良的产生某些酯的能力(例如碳水化合物酯，如麦芽糖酯)或者改变的链长特异性，或者改良的转移酶活性和/或减低的水解活性。
本文所示结果证明，SEQ ID No.16的一个或多个位置31、27、85、86、122、119、120、201、245、232、235和236的修饰位置产生了与骨架酶(即由核苷酸序列SEQ ID No.25表达的酶)相比，性质改良的脂质酰基转移酶，例如所述脂质酰基转移酶可以具有改变的底物特异性，例如改良的产生碳水化合物酯(例如麦芽糖酯)的能力和/或可以具有减低的水解活性。
选择在杀鲑气单胞菌脂质酰基转移酶分子(杀鲑气单胞菌磷脂酰胆碱胆固醇酰基转移酶)的“穴和峡谷”内和“穴和峡谷”周围位置的66个氨基酸用于位点评价，并筛选改良的转移酶活性以及麦芽糖酯的产生。所产生的66个位点评价文库产生了1223个密码子变体，每个文库平均具有19个不同的密码子变体和14个不同的氨基酸变体。进一步结合文库来评估通过根据麦芽糖酯的形成，从位点评价文库筛选变体而鉴定的赢家突变体(winner mutation)。总共分离具有达6个突变的大于70个不同的组合变体克隆，并根据组合文库进行表征。
试验
载体构建
用于位点评价文库的载体为pCS32new N80D，也称为pLA52，其具有在第80位用Asp取代Asn的杀鲑气单胞菌GCAT基因(该基因的核苷酸序列在本文中表示为SEQ ID No.25)。N80D突变增强了所述酶在枯草芽孢杆菌中的表达。该基因在在p32启动子的控制下，并且与芽孢杆菌环糊精葡聚糖转移酶(CGTase)信号序列一起表达。在枯草芽孢杆菌表达宿主OS21DAprE中筛选所有变体。
图29显示质粒pLA52，其包含在第80位用Asp取代Asn的脂质酰基转移酶的杀鲑气单胞菌GCAT基因(该基因的核苷酸序列在本文中表示为SEQ ID No.25)，用于产生位点评价文库。
位点评价文库的构建
根据厂商的方案，通过使用QuikChange Multi Site Directed Mutagenesis(MSDM)试剂盒(Stratagene)产生在特定位点包含“所有可能的氨基酸”的位点评价文库。使用具有用于氨基酸的随机取代的简并密码子(NNK或NNS)的磷酸化引物。将文库转化至大肠杆菌XL10-Gold Ultracompetent细胞(Stratagene)中。从大肠杆菌培养物中分离全部文库质粒DNA并转化至枯草芽孢杆菌OS21DAprE表达宿主中。
组合文库的构建
除了在相同的MSDM反应中使用含特定突变的达4个不同引物，并且通过对大肠杆菌克隆测序而鉴定组合变体，且随后转化至枯草芽孢杆菌OS21DAprE中外，以与位点评价相同的方式产生组合文库。
位点的增补
在包含非常少氨基酸突变的一些位点评价文库增补丢失的氨基酸。除了在MSDM反应中使用用于一个或几个突变的特异引物，并且通过对大肠杆菌克隆测序而鉴定变体，且随后转化至枯草芽孢杆菌OS21DAprE中外，以与位点评价相同的方式产生这些突变。
枯草芽孢杆菌OS21DAprE的转化
将文库质粒DNA、单突变质粒DNA或组合变体DNA转化至枯草芽孢杆菌OS21DAprE comK菌株中，该菌株已经通过使用木糖而成为感受态。简而言之，在LB中于37℃培养所述菌株的新菌落直至OD600为约1.0。添加木糖至0.3%并持续培养2小时。将5μl DNA(1ug/ml)加入至150μl感受态细胞中，在圆底falcon试管中于37℃、200rpm培养1小时，并平铺在带有推荐的抗生素(卡那霉素25μg/ml)的LB琼脂平板上。
变体的选择
为了鉴定位点评价文库中的不同氨基酸变体，将芽孢杆菌文库平铺在LB平板上，并从每个文库随机挑取96个菌落至96-孔板中。将每个96-孔板的复本送至德国柏林的AGOWA Gmbh，用于核酸测序。分析96个菌落在突变位点的序列，并选择代表各密码子的所有可得的单独突变用于筛选。
组合变体的选择
为了鉴定不同的组合变体，根据所使用的引物数量，随机挑取10-40个大肠杆菌菌落，并且为了测序，使用菌落PCR用以扩增所述基因。将各PCR反应物送至丹麦奥尔胡斯的DNA Technology A/S测序。分析在突变位点的序列，并且选择代表可能组合的所有可得的变体。将各个变体转化至枯草芽孢杆菌表达宿主OS21DAprE中用于筛选。
用于麦芽糖-酯测定的分析方案
Figure BDA00001770085400771
Figure BDA00001770085400781
结果和讨论
用pLA52(包含N80D并且由核苷酸序列SEQ ID No.25编码的杀鲑气单胞菌脂质酰基转移酶)作为骨架产生多数文库，然而利用L31Q(组合克隆L31Q和N80D)作为骨架产生12个文库。利用组合克隆M957(L31Q、N80D、W122L)产生三个文库。利用组合克隆M970(L31Q、N80D、86S)产生三个文库，利用组合克隆pLA487(L31Q、N80D、I86S、W122L)产生一个文库。
表1显示对于每个突变的变体脂质酰基转移酶(具有本文教导的单点突变)，在20小时后以麦芽糖-酯%表示的麦芽糖转移酶活性。骨架为在地衣芽孢杆菌生产菌种中产生的，包含N80D改变并且由核苷酸序列SEQ ID No.25(有时在本文中指N80D骨架)编码的杀鲑气单胞菌脂质酰基转移酶。
(N80D)–骨架
Figure BDA00001770085400791
Figure BDA00001770085400801
因此，当在20小时后以等级次序测定第1轮的赢家时，以下位点被鉴定为在对脂质酰基转移酶进行工程加工时的所用的重要位点：I086、M027、L031、V085、A119、Y120、W122、E201和/或Q245。
特别地，关键修饰包括I86R、Y；M27R、G、H、K、Y、D、N；L31Q、H、N、T；V85R；A119T；Y120K；W122S、L、E201R、Q245S。
表2显示对于每个突变的变体脂质酰基转移酶(具有本文教导的单点突变)，在1小时后以麦芽糖-酯%表示的麦芽糖转移酶活性。骨架为在地衣芽孢杆菌生产菌种中产生的，包含N80D改变并且由核苷酸序列SEQ ID No.25编码的杀鲑气单胞菌脂质酰基转移酶。
(N80D)–骨架
Figure BDA00001770085400802
Figure BDA00001770085400811
因此，当在1小时后以等级次序测定第1轮的赢家时，以下位点被鉴定为在对脂质酰基转移酶进行工程加工时的所用的重要位点：L031、W122、V085、I086、M027、F235、W232、A236、E201、A119、Y120。
特别地，关键修饰包括L031Q、F、H、T、Y、C；W122A、L、S；V85R、D、E；I86R、Y；M27N、H、Y、K、R；F235A、V；W232G、S；A236G、E；E201R、A119T、Y120E。
表3和4分别显示对于每个变体脂质酰基转移酶突变体，分别在20小时和1小时后分析以麦芽糖-酯%表示的麦芽糖转移酶活性时的组合赢家。
表3：
(N80D)–骨架
Figure BDA00001770085400831
Figure BDA00001770085400841
Figure BDA00001770085400851
表4：
(N80D)–骨架
Figure BDA00001770085400852
Figure BDA00001770085400861
Figure BDA00001770085400871
Figure BDA00001770085400891
为了避免争议，当与本文SEQ ID No.16或6所示的脂质酰基转移酶比对(在初级或三级基础上)时，所述脂质酰基转移酶骨架优选在第80位具有D。因此，本发明人在上表中显示N80D修饰。然而，实际上，以上实验中使用的骨架已经包含N80D修饰，并因此可以表述其它修饰而不引用N80D修饰，即L31Q、N80D、W122L可表示为L31Q、W122L。
然而，重要的是注意到N80D修饰是优选修饰，并且优选使用在第80位已经具有氨基酸D的骨架酶。然而，如果使用了在位置不含氨基酸D的骨架(例如本文以如SEQ ID No.1、3、4、5、8或9所示的一个或多个脂质酰基转移酶)，则优选包含N80D的额外修饰。
实施例2：烘焙中的脂质酰基转移酶变体
在烘焙中测试最有希望的酶。
水解活性方案：
底物：
溶解于50mm Hepes pH 7.0中的1.75%L-α植物磷脂酰胆碱95%(AvantiPolar Lipids,USA)、6.3%Triton X-100和5mM CaCl2。
实验方法：
将样本、校准物和对照稀释在含0.1%Triton X-100的10mM HEPES(pH7.0)中。利用Konelab自动分析仪(Thermo,Finland)进行分析。实验在30℃下进行。将34μL底物恒温180秒，然后加入4μL样本。酶解持续600秒。利用NEFA C试剂盒(WAKO,Germany)测定在酶解过程中释放的游离脂肪酸量。加入56μLNEFAA并将混合物温育300秒。之后，加入113μLNEFAB并将混合物温育300秒。然后测定OD 520nm。根据标准酶制备物计算酶活性(μmol FFA/min·mL)。
面浆实验：
酶促温育：
称取4.0g面粉(Reform flour DK 200700021)置于whenton玻璃试管中。加入剂量为10mg/kg面粉的酶。对于掺入面浆的底物，加入PC(L-α植物磷脂酰胆碱95%(Avanti Polar Lipids)溶液和麦芽糖(D-(+)-麦芽糖单水合物,Sigma)溶液至适当浓度。用0.1%NaCl将总体积调整至1.5mL。每个PC-麦芽糖浓度方案均包括一个盲样本(0.1%NaCl)。在搅拌(400rpm)、40℃下，在加热模块(Block:Variomag Multitherm，温度控制单元：Variomag Thermomodul40ST)中进行酶反应。在t等于30、60和180分钟的时间取出2.3g样本，对于盲样本，在t等于0分钟的时间也取出样本。
脂质提取
将6.0mL丁醇:乙醇(85:15(v/v))立即加入至所取出的2.3g样本中，然后在涡旋仪上混合15秒，之后在35rpm的转子混合仪(rotormixer)上放置5分钟。然后，将样本置于97℃的水浴中10分钟，接着在35rpm的转子混合仪上混合1小时。然后，将样本以1370g离心10分钟。然后，将含所提取的脂质的有机相上清液转移至新的玻璃管中。对于HPTLC，将1.5mL所提取的脂质在氮气罩(nitrogen cover)下于70℃蒸发，然后，重新分散在400μL己烷:异丙醇(3:2(v/v))中。将3μL重新分散的提取脂质上样至TLC板，参见下文。
HPTLC：
使用高效薄层色谱仪用于面浆实验中麦芽糖酯(ME)的分析。
方法：
通过干燥(160℃，20-30分钟)活化HPTLC板(20x10cm，Merck no.1.05641)，利用自动HPTLC上样器(ATS4，CAMAG)上样。利用自动显色室(ADC2，CAMAG)(7cm)进行板洗脱。洗脱后，干燥板(160℃，10分钟)、冷却并浸入(10秒)显色液体(含6%乙酸铜的16%H3PO4)中。干燥(160℃，6分钟)后，利用TLC扫描仪(TLC Scanner 3，CAMAG)在视觉上对板进行评价。
将四个尤其感兴趣的组合鉴定为：
·L31Q、N80D、W122L(在骨架酶在第80位已经具有D的情况下，其可以表示为L31Q、W122L)；
·M27V、L31Q、N80D(在骨架酶在第80位已经具有D的情况下，其可以表示为N27V、L31Q)；
·L31Q、N80D、K82R、I86A(在骨架酶在第80位已经具有D的情况下，其可以表示为L31Q、K82R、I86A)；和/或
·L31Q、N80D、I86S、W122F(在骨架酶在第80位已经具有D的情况下，其可以表示为L31Q、I86S、W122F)。
发现这些具体的组合(以及其他组合)与骨架脂质酰基转移酶相比具有改良的活性，原因有以下：
a)这些具体的组合能够显著地改变酶的受体偏好。通过示例，所述变体酶能够以比骨架脂质酰基转移酶(N80D)更高效地使用碳水化合物(尤其是麦芽糖)作为酰基受体，对于此方面，可见图38和图39所示的数据；和/或
b)这些具体的组合能够显著地改变脂质酰基转移酶的特异性。通过示例，所述变体酶具有显著降低的水解活性(参见图40所示数据)。实际上，所述变体酶几乎没有留下水解活性。
在面浆实验中，显示以下变体可改进麦芽糖酯的产生：M27K、N80D(也可以表示为单点突变M27K-在骨架酶在第80位已经具有D的情况下)和L31Q、N80D、W122L(也可以表示为L31Q、W122L-在骨架酶在第80位已经具有D的情况下)。所述结果示于图41中。所述变体显示了明显改变的受体偏好。通过示例，所述变体酶能够比骨架脂质酰基转移酶(N80D)(在本文中称为KLM3’)更高效地使用碳水化合物(尤其是麦芽糖)作为酰基受体。
实施例3：脱胶中的脂质酰基转移酶变体
本发明的目的是分析本发明的三个脂质酰基转移酶变体(称为EDS 226[具有N80D、A119I突变]，K710[具有N80D、A119T突变]和K916[具有N80D、G67A、V85H突变])在粗大豆油的水脱胶中的性能。结果与之前用骨架脂质酰基转移酶(在本文中有时称为KLM3’，即来自杀鲑气单胞菌，具有N80D突变并且当在地衣芽孢杆菌中表达时被翻译后剪切的脂质酰基转移酶，其序列在本文中以SEQ ID No.16表示)的脱胶实验进行比较。所评价的突变为在地衣芽孢杆菌(Bacillus lichiniformis)中表达的杀鲑气单胞菌甘油磷脂胆固醇酰基转移酶(脂质酰基转移酶)的变体。
如从油中降低至约32ppm(与用EDS 226和K916脱胶的油中的42ppm和56ppm相比)的总磷含量所观察到的，K710被证明产生高的水解作用。此外，K710导致油中比EDS 226和K916高的植物甾醇酯类和游离脂肪酸(FFA)含量。
用最高浓度的脂质酰基转移酶突变体的水脱胶导致高于用骨架脂质酰基转移酶通常观察的油产率提高量。整体而言，证明K710比骨架脂质酰基转移酶更高的水解活性，而EDS 226和K916与骨架脂质酰基转移酶相当。
介绍
分析三个突变体(EDS 226、K710和K916)在粗大豆油的水脱胶中的性能。所述突变体都具有与骨架脂质酰基转移酶共有的骨架(即所有都具有突变N80D)，但还具有一个或多个额外的突变位点。目标在于，对所述突变体与骨架脂质酰基转移酶的水解活性进行了比较，从而评价在水脱胶过程中使用其他酶的可能性。
材料和方法
材料
酶
对源自杀鲑气单胞菌的三种脂质酰基转移酶突变体(EDS 226、K710和K916)进行测试。如下表所示，所述酶为具有除N80D外的突变的甘油磷脂胆固醇酰基转移酶(GCAT)：
表：脂质酰基转移酶突变体的说明：突变位点、活性、制剂媒介和酶溶液。
Figure BDA00001770085400931
酶活性的定义
以脂质酰基转移酶单位(LATU)定义骨架脂质酰基转移酶的活性。根据标准酶定义1LATU。所述实验基于酶水解卵磷脂并释放游离脂肪酸(μmolFFA/min*ml)的能力。实验条件：(底物：磷脂酰胆碱，温度30℃，pH 7.0)。LATU-K实验指将酶稀释在3%NaCl中并实施以避免酶的沉淀。
油
在脱胶实验中使用来自Solae公司(January 2008)的粗大豆油，
用于脱胶的样本
用于水脱胶实验的样本(对照和酶促脱胶)示于下表：
表：用于水脱胶实验的样本：样本1：对照，2:EDS 226(0.1LATU-K/g)，3:K710(0.2LATU-K/g)，4:K710(0.4LATU-K/g)，5:K710(0.9LATU-K/g)，6:K916(0.04LATU-K/g)，7:K916(0.1LATU-K/g)和8:K916(0.2LATU-K/g)
Figure BDA00001770085400941
方法
水脱胶的实验室方法
称取100g粗大豆油置于250ml带盖的蓝色盖瓶中，并置于加热板(55℃)上。立即向所述油中加水，然后加入酶，并利用Ultra Turrax混合仪使溶液匀质30秒。在磁力搅拌(450rpm)下，将油放置在加热板上30分钟。在作用30分钟后，将约10ml油转移至12ml离心管(预先定标)中。将油在水浴中加热至97℃持续10分钟，以使所述酶失活。
用于HPTLC分析的胶样本的制备
加热后，将油在3000rcf下离心3分钟。倒出油并使试管排干15分钟(将试管倒置15分钟)。计算胶和油相的重量。
高效薄层色谱(HPTLC)
通过HPTLC对胶相中甘油三酯的含量与油和胶中磷脂的含量进行半定量。
仪器
·上样仪：自动TLC采样器4,CAMAGADC2自动显色室，其程序化至迁移7cm的洗脱长度。
·HPTLC板:20x10cm，Merck no.1.05641。使用前在CAMAG TLC平板加热器III上于160℃活化10分钟。
·显色：将HPTLC平板在CAMAG TLC平板加热器III上于160℃干燥10分钟，冷却，并浸入含6%乙酸铜的16%H3PO4中。在160℃额外干燥10分钟并直接评价。
方法
胶中甘油三酯含量的分析
·将从约10ml油获得的胶相稀释在7.5ml己烷:异丙醇(3:2)(溶液A)中。将200μl溶液A稀释在600μl己烷:异丙醇(3:2)(溶液B)中。
·通过自动TLC上样器将溶液B(0.3μl)上样至HPTLC板。
·标准物：通过自动TLC上样器将0.5%精炼菜籽油(0.1、0.3、0.5、0.8和1.5μl)上样至HPTLC板。
·运行缓冲液5：P-醚：甲基叔丁基酮：乙酸(70:30:1)
胶中磷脂含量的分析
·将来自约10g油的胶相溶解在7.5ml己烷:异丙醇(3:2)中。将1μl样本上样至HPTLC板。
·胶标准物：通过自动TLC上样器将来自对照的胶(0.1、0.3、0.5、0.8和1.0μl)上样至HPTLC板。
·运行缓冲液6：水中的乙酸甲酯：氯仿：1-丙醇：甲醇：25%KCl(25:25:25:10:9)。
油中磷脂的分析
·将约80-100mg油稀释在1ml己烷：异丙烷(3:2)中，并通过自动TLC上样器上样(5μl)至HPTLC板。
·磷脂标准物：通过自动TLC上样器将第16号(稀释于CHCl3中的0.5%磷脂(Spectra Lipid,Germany))(0.1、0.3、0.5、0.8和1.5μl)上样至HPTLC板。
胶中甘油三酯的计算
图43显示了基于作为甘油三酯的面积的函数(在TLC板上测定)的0.5%精炼菜籽油的上样量(0.1、0.3、0.5、0.8和1.5μl)而计算的标准曲线。
由标准曲线的公式和酶促样本中甘油三酯的面积(在TLC板上测定)而估算酶促胶样本中甘油三酯的含量。
实施例，样本3：
在样本3中，在TLC板上测量的甘油三酯面积为9647(图43)，对应于在TLC板上添加0.231μl标准物。
甘油三酯百分数的计算：在样本3中，将0.438g胶溶解在7.5mlCHCl3/MeOH中，4倍稀释并上样(0.3μl)至TLC板。标准物包含0.5g/ml甘油三酯，因此样本3中的甘油三酯量为(0.231μl*0.5g/ml*7.5ml*4)/(0.3μl*0.438g)=26.4%甘油三酯
胶中磷脂的计算
为了计算酶促样本中的磷脂含量，根据来自对照(无酶)的胶作出标准曲线。将0.1、0.3、0.5、0.8和1.0μl对照胶上样至TLC板。通过假设在对照胶中没有发生磷脂降解(分别=100% PA、PE、PC)，计算相对于对照的酶促样本中的磷脂降解(%)。
油中磷脂含量的计算
通过与计算胶中甘油三酯含量相同的原则，计算油相中PA、PE和PC的含量(ppm)。根据包含0.5%磷脂的标准物作出标准曲线。根据标准物中各磷脂的含量(%)和磷脂的分子量(参见下表)计算酶促样本中各磷脂的含量。
表：标准物中PA、PE和PC的含量和分子量
Figure BDA00001770085400961
实施例，样本3：
将0.088g油溶解在1ml CHCl3/MeOH中并将5μl上样到TLC平板上。
%PA：样本3中PA的检测面积(1779)对应于0.983μl的标准物(上样到TLC板上，未图示)。标准物包含0.5%磷脂，其中PA占到5.13%。因此，样本3中的PA含量为(0.983μl*0.5g/ml*0.0513)/(5μl*0.088g)=0.0573%。
基于磷和PA的分子量计算来自PA的磷(ppm)：0.0573%*10000*(32g/mol /685g/mol)=26.8ppm
气相色谱分析(GC)
通过气相色谱对油样本进行植物甾醇类、植物甾醇酯类和游离脂肪酸(FFA)分析(乳化剂分析)。
仪器
·Perkin Elmer Autosystem 9000Capillary Gas Chromatograph,其配备有WCOT熔融石英柱12.5m×0.25mm ID×0.1μ薄膜厚度5%苯基甲基硅酮(phenyl-methyl-silicone)(CP Sil 8CB，来自Chrompack)
·载气：氦
·注射器：PSSI冷裂注射(最初温度50℃加热到385℃)，体积1.0μl
·检测器FID：395℃
Figure BDA00001770085400971
样品制备
将所述样本溶于含有0.5mg/ml十七烷内标的12ml庚烷：吡啶(2：1)。将500μl样本溶液转移到曲管形瓶(crimp vial)，添加100μl MSTFA(N-甲基N-三甲基甲硅烷基三氟乙酰胺(N-Methyl-N-trimethylsilyl-trifluoraceamid))，并在60℃反应15分钟。
计算
基于纯的参照物质(称量纯物质10mg)计算植物甾醇类、植物甾醇棕榈酸酯和植物甾醇硬脂酸酯的反应因子。
结果和讨论
脂质酰基转移酶突变体的评价
在以下部分显示了来自油和胶相的TLC-分析(磷脂和甘油三酯)和GC-分析(FFA、植物甾醇类和植物甾醇酯类)的结果。
将脂质酰基转移酶在水脱胶中的性质与之前用骨架脂质酰基转移酶的结果进行比较。
油分析
油产率分析
图44显示了由酶促脱胶获得的提高的油产率。基于从对照中的胶量减去酶促样品中的胶量进行计算。
利用EDS 226(0.1LATU-K/g)和K710(0.2和0.4LATU-K/g)获得最高产率增加(2.3-2.5%)，而利用K916(0.1-0.2LATU-K/g)获得的产率增加略小(1.7-2%)。相比之下，浓度范围在0.1至0.2LATU-K/g的脂质酰基转移酶骨架得到了1.3-1.6%的油产率提高。因此，与脂质酰基转移酶骨架相比，EDS226、K710和K916使油产率提高。
磷脂和磷含量的分析
下表显示了水脱胶油(对照和酶促样本)中磷脂(磷脂酰胆碱、磷脂酰-乙醇胺和磷脂酸)的含量(ppm)：
表：用不同浓度的KLM3’突变体脱胶的油中来自PA、PE、PC的磷和总磷的含量(ppm)。样本1：对照，2:EDS 226(0.1LATU-K/g)，3:K710(0.2LATU-K/g)，4:K710(0.4LATU-K/g)，5:K710(0.9LATU-K/g)，6:K916(0.04LATU-K/g)，7:K916(0.1LATU-K/g)和8:K916(0.2LATU-K/g)。磷脂的最高降解用粗体标出。
Figure BDA00001770085400991
K710(0.2LATU-K/g)经证明具有最高的水解活性，产生了约32ppm的总磷含量，然而EDS 226和K916(0.2LATU-K/g)将总磷含量分别降低至42和56ppm。相比之下，KLM3’(0.1-0.2LATU-K/g)显示将总磷降低至约47-42ppm。
检验油中的特定PL，其含量随K916的浓度提高而提高，在一定程度上K710也是如此。这可以由以下事实解释：一些不可水解的磷脂在洗出时与可水解的磷脂一起被去除。当增加酶浓度时，可水解的PL的去除也提高。因此，不可水解的PL的去除自然减缓。
总之，该观察结果清楚地说明，所述脂质酰基转移酶突变体，尤其是K710可用于水脱胶。
脂肪酸、植物甾醇类和植物甾醇酯的分析
在用K916(0.04、0.1和0.2LATU-K/g)脱胶的对照和油中观察到了类似含量(0.53-0.62%)的游离脂肪酸(FFA)(图45)。此外，在用K916的样本中甾醇酯的形成没有显著提高。因此，可以看出K916的水解活性在低浓度下并不高。
相反，用浓度提高(0.2和0.4LATU-K/g)的K710观察到了FFA含量的提高(0.77-1.08%)。这最可能由K710的高水解活性解释。在植物甾醇类被用尽时，不可能进行FFA至植物甾醇类的转移，并且所述酶将把2-溶血-磷脂酰胆碱水解成FFA和甘油-磷脂酰胆碱，而FFA将保持在油中(图46)。很可能是K710具有比EDS 226和K916高的溶血活性。
已经报道，用骨架脂质酰基转移酶脱胶的油中FFA的含量范围从使用最低酶浓度(0.1LATU-K/g)的样本中的0.48%至使用最高浓度(0.4LATU-K/g)的样本中的0.73%。在精炼工业中，期望在油中实现最小量的FFA，原因是这些FFA将在除臭过程中除去。因此，FFA的量可被认为是油的损耗并且应在油产率的计算中进行考虑。
胶分析
磷脂含量的分析
图47显示了与对照相比，酶促胶样本中磷脂酰-乙醇胺(PE)和磷脂酸(PA)的相对降解。将对照中磷脂的降解设定为100%，并相对于对照计算酶促样本中的含量。
与对照和用EDS 226(0.1LATU-K/g)和K916(0.2LATU-K/g)的样本相比，用K710(0.2和0.4LATU-K/g)的样本中不可水解的磷脂，特别是PE和PA的催化降解尤其显著。通过用最高浓度的K710(0.4LATU-K/g)脱胶实现了PA(≈92%)和PE(≈68%)的显著降解。已经观察到，用骨架脂质酰基转移酶(0.4LATU-K/g)对PA(63%)和PE(81%)的降解在一定程度上相反。
甘油三酯含量的分析
图48显示了胶中的甘油三酯含量。比较胶相中的甘油三酯含量，用EDS226(0.1LATU-K/g)和K710(0.2和0.4LATU-K/g)的样本含有约26%，而相比之下，其他酶促样本中为33-43%，对照中为约57%。
用骨架脂质酰基转移酶(0.1、0.2、0.3和0.4LATU-K/g)观察到相当的甘油三酯含量(26-30%)。
结论
证实了，与EDS 226和K916以及骨架脂质酰基转移酶相比，K710对PA、PE和PC具有较高的水解活性。已经显示骨架脂质酰基转移酶将油中的总磷降低至约47-42ppm，而K710则产生了33-32ppm的含量。
K710和EDS 226产生了2.3-2.5%的油产率提高，而K916略少(2%)。相比之下，骨架脂质酰基转移酶显示油产率提高了1.3-1.6%。
用K710酶促脱胶导致油中具有0.77-1.08%的FFA，其略高于用骨架脂质酰基转移酶的水解。K710对溶血成分的活性可能大于骨架脂质酰基转移酶。用EDS 226和K916脱胶的油中FFA的含量与对照类似。
总之，本发明证明了所述突变的脂质酰基转移酶，尤其是K710用于油脱胶的巨大前景。
实施例4：将大肠杆菌硫酯酶转化成具有杀鲑气单胞菌的性质的酰基转移酶
在该实施例中，对大肠杆菌硫酯酶进行修饰以提供可以通过在含水环境中的过水解或醇解而有效催化酰基转移的经改变的酶：
A)用编码对应于以下氨基酸序列L S D T G K M Y S K M R G Y L P S SP P Y Y E G R F S N G P V W (SEQ ID No.19)的杀鲑气单胞菌脂质酰基转移酶中的氨基酸残基69-92的核酸，代替编码对应于氨基酸序列L S A G Y R MS A S A A W(SEQ ID No.18)的氨基酸残基11-23的核酸；
B)用编码对应于以下氨基酸序列A T A V A Y N K I S W D P K Y Q V IN N L D Y E(SEQ ID No.21)的杀鲑气单胞菌脂质酰基转移酶中的氨基酸残基69-92的DNA，代替编码对应于氨基酸序列D T S Q Q G L A R L(SEQ IDNo.20)的氨基酸残基45-54的核酸；
C)用编码对应于以下氨基酸序列L P D L G Q N P S A R S Q K V V E AV S H V S(SEQ ID No.23)的杀鲑气单胞菌脂质酰基转移酶中的氨基酸残基155-177的核酸，代替编码对应于氨基酸序列I R L P A N Y G R R Y N E A F S(SEQ ID No.22)的氨基酸残基107-122的核酸；
D)用编码对应于以下氨基酸序列A E M L R D P Q N F G L S D V E N PC Y D G G Y V W K P F A T R S V S T D R Q L S A S P Q E R L A I A G N P LL A Q A V A S P M A R R S A S P L N C E G K M F(SEQ ID No.17)的杀鲑气单胞菌脂质酰基转移酶中的氨基酸残基207-286的核酸，代替编码对应于氨基酸序列E E V Y L K P Q W M Q(SEQ ID No.24)的氨基酸残基142-152的核酸。
以上说明书提到的全部出版物均通过引用并入本文。本发明所述方法和体系的各种修饰和改变对本领域的技术人员来说都是显而易见的，并不脱离本发明的范围和精神。尽管已参照具体优选实施方式描述了本发明，但是应该理解所主张的发明不仅限于所述具体实施方式。实际上，用于实施本发明的所述模式的各种修改对于生物化学和生物工程或相关领域的技术人员来说都是显而易见的，均应落入本发明权利要求书的范围。
Figure IDA00001770086200011
Figure IDA00001770086200021
Figure IDA00001770086200041
Figure IDA00001770086200051
Figure IDA00001770086200061
Figure IDA00001770086200071
Figure IDA00001770086200081
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Figure IDA00001770086200101
Figure IDA00001770086200111
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Figure IDA00001770086200131
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Claims (35)

1.制备变体脂质酰基转移酶的方法，所述方法包括在宿主生物中表达与编码亲本脂质酰基转移酶的核苷酸序列具有至少90%同一性且包含至少一个修饰的核苷酸序列，所述修饰的位置对应于在所编码的氨基酸序列中位于第27、31、85、86、122、119、120、122、201、235、232、236、245、232、235和/或236位的氨基酸，其中所述位置编号定义为当基于初级或三级结构比对时，对应于本文SEQ ID No.6所示的酶相同位置的位置。
2.如权利要求1所述的方法，其中，至少一个修饰在位于所述峡谷区中的氨基酸残基中，并且选自一个或多个以下位置：27、31、85、86、119和/或120。
3.如权利要求2所述的方法，其中，所述峡谷区中的至少一个修饰与所述峡谷区之外的进一步的修饰组合。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述脂质酰基转移酶可进一步包括位于一个或多个以下位置的至少一个进一步的修饰：23、81、82、289、229、227、233、33、207和/或130，其中所述位置编号定义为当基于初级或三级结构比对时，对应于本文SEQ ID No.6所示的酶相同位置的位置。
5.如前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述至少一个修饰选自以下组成的组：L31Q、H、N、T、F、Y或C(优选L31Q)；M27R、G、H、K、Y、D、N、V、C、Q、L、E、S或F(优选M27V)；V85H、R、D或E；I86R、Y、S、V、I、A、T、M、F、C或L(优选I86S或A)；A119T或I；Y120K或E；W122S、L或A(优选W122L)；E201R；Q245S；F235A或V；W232G或S；和/或A236G或E。
6.一种方法，其包括改变底物链长特异性决定片段的长度，从而产生相对于亲本酶具有改变的底物特异性的变体脂质酰基转移酶，其中，所述底物链长特异性决定片段紧邻于所述亲本酶的催化三联体(优选所述催化三联体的Asp残基)的N-末端，所述亲本酶与本文SEQ ID No.6或16所示的来自杀鲑气单胞菌的脂质酰基转移酶具有至少70%的同一性。
7.一种(变体)脂质酰基转移酶多肽，其由前述任一项权利要求的方法获得。
8.编码脂质酰基转移酶的核酸，其核苷酸序列包含位置对应于所编码的氨基酸序列中一个或多个以下位置的至少一个修饰：第27、31、85、86、122、119、120、122、201、235、232、236、245、232、235、236位，其中所述位置编号定义为当基于初级或三级结构比对时，对应于本文SEQ ID No.6所示的酶相同位置的位置。
9.如权利要求8所述的核酸，其中，所述核酸编码具有脂质酰基转移酶活性并且包含与SEQ ID No.6或16的成熟区具有至少94%氨基酸序列同一性的序列的多肽，并且其中所述多肽在位于以下位置的位置包含至少一个修饰：第27、31、85、86、122、119、120、201、245、232、235和/或236位，其中所述位置编号定义为当基于初级或三级结构比对时，对应于本文SEQ IDNo.6所示的酶相同位置的位置。
10.编码具有脂质酰基转移酶活性的多肽的核酸，其中，所述核苷酸序列在中等或高严谨条件下与SEQ ID No.10或SEQ ID No.25，或者SEQ ID No.10或SEQ ID No.25的互补序列在基本全长上杂交，其中所编码的多肽包含选自以下的一个或多个氨基酸残基：第31位的Q、H、N、T、F、Y或C；第86位的R、Y、S、V、I、A、T、M、F、C或L；第27位的R、G、H、K、Y、D、N、V、C、Q、L、E、S或F；H、R、D、E 85；第119位的T或I；第120位的K或E；第122位的S、L、A、F、W、Y、R、H、M或C；第201位的R；第245位的S；第235位的A或V；第232位的G或S；第236位的G或E，其中所述位置是与SEQ ID No.6相当的氨基酸位置。
11.如权利要求8或9所述的核酸，其中，所述至少一个修饰在位于所述峡谷区中的氨基酸残基中，并且选自一个或多个以下位置：27、31、85、86、119和120。
12.如权利要求11所述的核酸，其中，所述峡谷区中的至少一个修饰与所述峡谷区之外的进一步的修饰组合。
13.如权利要求8-12中任一项所述的核酸，其中，所述核酸在对应于所编码的氨基酸序列中一个或多个以下位置的位置包括至少一个进一步的修饰：23、81、82、289、229、227、233、33、207和/或130，其中所述位置编号定义为当基于初级或三级结构比对时，对应于本文SEQ ID No.6所示的酶相同位置的位置。
14.如权利要求8-13中任一项所述的核酸，其中，所述至少一个修饰选自以下组成的组：L31Q、H、N、T、F、Y或C(优选L31Q)；M27R、G、H、K、Y、D、N、V、C、Q、L、E、S或F(优选M27V)；V85H、R、D或E；I86R、Y、S、V、I、A、T、M、F、C或L(优选I86S或A)；A119T或I；Y120K或E；W122S、L或A(优选W122L)；E201R；Q245S；F235A或V；W232G或S；和/或A236G或E。
15.如权利要求8-14中任一项所述的核酸，其中，所述核苷酸序列编码所述脂质酰基转移酶并且在修饰之前为本文SEQ ID No.25、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14或SEQ ID No.15所示的核苷酸序列；或者为与本文SEQ ID No.25、SEQ ID No.10、SEQ IDNo.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14或SEQ ID No.15所示的核苷酸序列具有至少70%同一性(优选至少80%、更优选至少90%、甚至更优选至少95%同一性)的核苷酸序列；或者通过遗传密码子的简并性而与SEQ ID No.25、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15相关联的核苷酸序列；或者在中等严谨条件下或高严谨条件下与本文SEQ ID No.25、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14或SEQ ID No.15所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
16.变体脂质酰基转移酶多肽，其由权利要求8-15中任一项所述的核酸或核苷酸序列编码。
17.当在芽孢杆菌(Bacillus)表达宿主中，尤其在地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)表达宿主中表达时，由权利要求8-15中任一项所述的核酸或核苷酸序列编码的变体脂质酰基转移酶多肽。
18.产生多肽的方法，所述方法包括向宿主细胞(优选芽孢杆菌表达宿主，尤其优选地衣芽孢杆菌表达宿主)中引入权利要求8-15中任一项所述的核酸，其中编码所述多肽的所述核酸与能够引导由所述核酸编码的多肽的表达的调控序列可操作地连接；在所述调控序列引导所述核酸或载体编码的多肽的表达的条件下培养所述宿主细胞。
19.多肽，其具有脂质酰基转移酶活性并且包含与SEQ ID No.6或16所示的氨基酸序列具有至少90%(优选至少95%，更优选至少98%)同一性的氨基酸序列，并且在一个或多个以下位置包含一个或多个修饰：27、31、85、86、122、119、120、122、201、235、232、236、245、232、235和/或236。
20.如权利要求19所述的多肽，其中，所述至少一个修饰在位于所述峡谷区中的氨基酸残基中，并且选自以下组成的组：27、31、85、86、119和120。
21.如权利要求19或权利要求20所述的多肽，其中，所述峡谷区的至少一个修饰与所述峡谷区之外的进一步的修饰组合。
22.如权利要求19-21中任一项所述的多肽，其中，所述脂质酰基转移酶可进一步包括至少一个进一步的修饰，所述修饰位于一个或多个以下位置：23、81、82、289、229、227、233、33、207和/或130，其中所述位置编号定义为当基于初级或三级结构比对时，对应于本文SEQ ID No.6所示的酶相同位置的位置。
23.如权利要求19-22中任一项所述的多肽，其中，所述至少一个修饰选自以下组成的组：L31Q、H、N、T、F、Y或C(优选L31Q)；M27R、G、H、K、Y、D、N、V、C、Q、L、E、S或F(优选M27V)；V85H、R、D或E；I86R、Y、S、V、I、A、T、M、F、C或L(优选I86S或A)；A119T或I；Y120K或E；W122S、L或A (优选W122L)；E201R；Q245S；F235A或V；W232G或S；和/或A236G或E。
24.如权利要求19-23中任一项所述的多肽，其具有脂质酰基转移酶活性，并且除所述一个或多个修饰之外，包含SEQ ID No.6或16所示的氨基酸序列。
25.变体脂质酰基转移酶多肽，其包含与本文SEQ ID No.6或16所示来自杀鲑气单胞菌的脂质酰基转移酶至少70%相同的氨基酸序列，其中相对于本文SEQ ID No.6或16所示来自杀鲑气单胞菌的所述脂质酰基转移酶，紧邻于所述改变的脂质酰基转移酶的催化三联体的Asp残基的N-末端的底物链长特异性决定片段具有改变的长度。
26.如权利要求25所述的变体脂质酰基转移酶，其中，所述改变的脂质酰基转移酶包含与本文SEQ ID No.6或16所示来自杀鲑气单胞菌的脂质酰基转移酶具有至少90%同一性的氨基酸序列。
27.制备食品的方法，所述方法包括向所述食品的一个或多个成分中添加权利要求7、16-17或19-26中任一项所述的多肽。
28.制备烘焙产品的方法，所述方法包括向生面团中添加权利要求7、16-17或19-26中任一项所述的多肽，和烘焙所述生面团以制备所述烘焙产品。
29.权利要求7、16-17或19-26中任一项所述的变体脂质酰基转移酶在处理蛋或基于蛋的产品以产生溶血磷脂的方法中的应用。
30.植物油或食用油的酶促脱胶方法，其包括用权利要求7、16-17或19-26中任一项所述的多肽处理所述植物油或食用油，从而水解其中存在的大部分极性脂质。
31.由权利要求27或权利要求28所述的方法获得的食品或烘焙产品。
32.参考附图和实施例的如本文整体描述的方法。
33.参考附图和实施例的如本文整体描述的核酸。
34.参考附图和实施例的如本文整体描述的变体脂质酰基转移酶多肽。
35.参考附图和实施例的如本文整体描述的变体脂质酰基转移酶多肽的应用。
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