EA020035B1

EA020035B1 - Способы

Info

Publication number: EA020035B1
Application number: EA201001003A
Authority: EA
Inventors: Йорн Борк Сёе; Анне Виктория Браун
Original assignee: ДюПон НЬЮТРИШН БАЙОСАЙЕНСИЗ АпС
Priority date: 2007-12-21
Filing date: 2008-12-11
Publication date: 2014-08-29
Also published as: PL2235151T3; JP5509094B2; EP2235151B1; CA2708292A1; WO2009081094A2; MX2010007014A; NZ585870A; CL2008003776A1; CN101978037A; KR20100086507A; MY151265A; WO2009081094A3; EP2235151A2; US9228211B2; ES2395551T3; EA201001003A1; BRPI0821253A2; JP2011505865A; AU2008339660A1; AU2008339660B2

Abstract

Способ рафинирования гидратацией пищевого масла (предпочтительно неочищенного пищевого масла), включающий стадии а) смешивания приблизительно 0,1-5% мас./мас. воды с пищевым маслом (предпочтительно неочищенным пищевым маслом) и липидацилтрансферазой; b) перемешивания этой смеси в течение от приблизительно 10 до приблизительно 180 мин при температуре от приблизительно 45 до приблизительно 90°С и с) разделения масляной фазы и смоляной фазы. Предпочтительно указанная липидацилтрансфераза представляет собой полипептид, обладающий липидацилтрансферазной активностью, где полипептид получают экспрессией нуклеотидной последовательности, показанной как SEQ ID No. 49, или нуклеотидной последовательности, которая имеет 70% или большую идентичность с ней; и/или получают экспрессией нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется при условиях средней жесткости с нуклеиновым зондом, содержащим нуклеотидную последовательность, показанную как SEQ ID No. 49; и/или представляет собой полипептид, имеющий липидацилтрансферазную активность, где полипептид включает аминокислотную последовательность, показанную как SEQ ID No. 68, или аминокислотную последовательность, которая имеет 70% или большую идентичность с ней. В одном варианте воплощения липидацилтрансферазу предпочтительно используют в комбинации с фосфолипазным С ферментом. Также описан способ модифицирования смоляной фазы рафинированного масла с использованием липидацилтрансферазы.

Description

Настоящее изобретение относится к способу рафинирования пищевого масла (предпочтительно растительного масла), используя липидацилтрансферазу. Далее настоящее изобретение относится к способу обработки пищевого масла (предпочтительно неочищенного пищевого масла) (например, растительного масла) и/или смоляной фазы пищевого масла (предпочтительно растительного масла), используя липидацилтрансферазу.

Предпосылки создания настоящего изобретения

Липидацилтрансферазы являются известными как такие, которые обладают преимуществами в пищевой промышленности. Липидацилтрансферазы, как было обнаружено, обладают значительной ацилтрансферазной активностью в пищевых продуктах. Эта активность обладает весьма преимущественным применением в способах получения продуктов питания.

Например, \О 2004/064537 раскрывает способ для ίη δίΐιι получения эмульгатора при использовании липидацилтрансферазы и преимущества, связанные с этим.

Международная патентная заявка под номером РСТ/1В 2001/000558 демонстрирует экспрессию липидацилтрансферазы в (гетерологичной) хозяйской клетке и является введенной в данное описание в качестве ссылки.

Цель рафинирования пищевого масла заключается в том, чтобы удалить нежелательные примеси, которые влияют на качество (например, вкус, запах и внешний вид) и стабильность при хранении.

Из-за большого разнообразия этих примесей - свободные жирные кислоты, ионы металлов, красящие соединения, ароматизирующие вещества, смолы и т.д. - для рафинирования применяют целый ряд способов химической и физической природы (см., например, Вайеу'к 1пФ151па1 ОН апй Ра! Ргойисй - 2006, Ιοίιη \йеу & 8оп5. δί.χΐΐι Εάίΐίοη).

Как правило, для рафинирования масла применяют два способа, которые представляют собой способы физического рафинирования и химического рафинирования.

В так называемом химическом рафинировании почти всё содержание свободных жирных кислот удаляют путём начальной обработки большим избытком №ОН. Также содержание фосфолипидов снижают до уровня фосфора, как правило, ниже 10 ррт. Далее масло осветляют и дезодорируют.

Так называемое физическое рафинирование в основном заключается в стадии рафинирования гидратацией, которую сопровождают рафинированием кислотой, нейтрализацией, осветлением, отгонкой с помощью водяного пара для удаления свободных жирных кислот и дезодорированием.

Вместо применения рафинирования кислотой при физических способах очищения было принято использовать ферментативное рафинирование.

Способ ферментативного рафинирования был разработан на основе применения фосфолипазы поджелудочной железы. Поскольку данный фермент некошерный, фосфолипазу со временем заменили микробной фосфолипазой А1 (Ьесйаке ИИга™ - Νονοζ\Ίΐκ5, Эептагк) (Ой Мй1 СахеНеег, νοί. 111, 1и1у 2005, р. 2-4).

Ферментативный способ имеет некоторые преимущества относительно химического или физического способов рафинирования гидратацией, включая снижение себестоимости, повышенный выход и процесс, более благоприятный для окружающей среды.

Способ ферментативного рафинирования масла основывается на добавлении фосфолипазы к маслу, которое уже прошло рафинирование гидратацией.

В \О 2006/008508 описано, что липидацилтрансферазы применяют в ферментативном рафинировании пищевых масел. В \О 2006/008508 раскрыто добавление липидацилтрансферазы к рафинированному гидратацией маслу или добавление липидацилтрансферазы к неочищенному маслу без необходимости подвергать это масло процессу рафинирования гидратацией.

Рафинированное гидратацией масло, как правило, может быть получено с помощью обычного способа рафинирования гидратацией, который включает смешивание 1-2% мас./мас. горячей мягкой воды с тёплым (70-90°С) сирым маслом (АОС8 1п!гойис!юп !о !йе Ргосекыпд о£ Ра18 апй ОЙ8 - ТаЫе 8 Оещппттд Ргосеккек - 1Шр://\у\у\у.аос5.ог§/тееОпд5/ейиса1юп/той35атр1е.рйГ). Практическое правило заключается в том, что количество воды, добавляемой к неочищенному маслу, как правило, приблизи

- 1 020035 тельно равно количеству фосфолипидов в неочищенном масле. Обычные периоды обработки составляют 30-60 мин. Стадия рафинирования гидратацией удаляет фосфатиды и клейкие смолы, которые становятся нерастворимыми в масле при гидрировании. Гидратированные фосфатиды и смолы могут быть отделены от масла путём осаждения, фильтрования или центрифугирования - на практике центрифугирование более распространено. Главная цель в указанном процессе рафинирования гидратацией заключается в отделении гидратированных фосфатидов от масла. Смешивание горячей воды с маслом, описанной выше, в данном описании должно пониматься в широком смысле как смешивание водного раствора с маслом в соответствии со стандартными процедурами рафинирования гидратацией в данной области техники.

В общепринятом способе рафинирования гидратацией основную часть фосфатидов удаляют в высококипящую смоляную фазу. В конце способа рафинирования гидратацией масляную фазу отделяют от смоляной фазы. Хотя смоляная фаза может быть дополнительно переработана в коммерческие продукты, по сути, она рассматривается как побочный продукт рафинирования масла. Именно масляная фаза является коммерчески важной. Однако, так как фосфатиды могут быть хорошими эмульгаторами, некоторое количество масла неизменно теряется в смоляной фазе в процессе рафинирования гидратацией. Это ведёт к сниженным выходам масла в масляной фазе после рафинирования гидратацией.

С повышением цены на масло и увеличением необходимости в растительном масле для биодизельного топлива важно оптимизировать переработку пищевых масел для получения более высоких выходов масла.

Краткое изложение аспектов настоящего изобретения

Аспекты настоящего изобретения представлены в пунктах формулы изобретения и в следующих комментариях.

Неожиданно было найдено, что добавлением одной или большего количества липидацилтрансфераз к неочищенному пищевому маслу в процессе или до проведения способа рафинирования гидратацией выход масла в масляной фазе может быть существенно увеличен. Другими словами, потери масла в смоляной фазе могут быть существенно снижены.

Кроме того, неожиданно было найдено, что при добавлении одной или большего количества липидацилтрансфераз к неочищенному пищевому маслу в процессе или до проведения способа рафинирования гидратацией полученная смоляная фаза является значительно менее вязкой. Это может обеспечить более удобные параметры для центрифугирования.

Также неожиданно было найдено, что при добавлении одной или большего количества липидацилтрансфераз к неочищенному пищевому маслу в процессе или до проведения способа рафинирования гидратацией смоляная фаза, полученная из этого способа, может инкубироваться или храниться и (благодаря остаточной активной липидацилтрансферазе) может наблюдаться дополнительный гидролиз фосфолипидов в смоляной фазе. Затем изобретатели обнаружили, что далее можно выделить масляную фазу, содержащую свободные жирные кислоты (кислое масло) и остаточные триглицериды в смоляной фазе. Это кислое масло может продаваться за большую цену, чем нормальная смоляная фаза, которую добавляют в еду. Кроме того, неожиданно было найдено, что оставшаяся твёрдая фаза (после отделения кислого масла) имеет более высокий уровень фосфора, чем нормальная смола и, таким образом, может быть использована как источник органического фосфора.

Также неожиданно было найдено, что комбинирование ферментов одной или большего количества липидацилтрансфераз и одной или большего количества фосфолипаз С (РЬС) приводит к синергетическим эффектам при применении в рафинировании пищевых масел (например, растительных масел).

Детальные аспекты настоящего изобретения

В соответствии с первым аспектом настоящего изобретения обеспечивается способ рафинирования гидратацией пищевого масла (предпочтительно неочищенного пищевого масла), который включает следующие стадии:

a) смешивание приблизительно 0,1-5% мас./мас. воды с пищевым маслом (предпочтительно неочищенным пищевым маслом) и липидацилтрансферазой;

b) энергичное перемешивание смеси в течение от приблизительно 10 до 180 мин при температуре от приблизительно 45 до приблизительно 90°С и

c) разделение масляной фазы и смоляной фазы.

В соответствии со вторым аспектом настоящего изобретения обеспечивается применение липидацилтрансферазы в процессе рафинирования гидратацией пищевого масла (предпочтительно в процессе рафинирования гидратацией неочищенного пищевого масла) для увеличения выхода масла в масляной фазе после завершения процесса рафинирования гидратацией.

В соответствии с третьим аспектом настоящего изобретения обеспечивается применение липидацилтрансферазы в процессе рафинирования гидратацией пищевого масла (предпочтительно в процессе рафинирования гидратацией неочищенного пищевого масла) для уменьшения вязкости смоляной фазы после завершения процесса рафинирования гидратацией.

Увеличение в выходе и/или уменьшение в вязкости происходит в сравнении с масляной фазой и/или смоляной фазой сравниваемого масла, рафинированного (или рафинированного гидратацией или ферментативно рафинированного гидратацией) баз применения липидацилтрансферазы.

- 2 020035

В соответствии с четвёртым аспектом настоящего изобретения обеспечивается способ рафинирования гидратацией пищевого масла (предпочтительно неочищенного пищевого масла), который включает следующие стадии:

b) энергичное перемешивание смеси в течение от приблизительно 10 до 180 мин при температуре от приблизительно 45 до приблизительно 90°С;

c) разделение масляной фазы и смоляной фазы;

б) инкубирование смоляной фазы, включающей активный липидацилтрансферазный фермент в течение от минимум приблизительно 2 ч до максимум 7 дней (предпочтительно до приблизительно 1-2 дней) и

е) отделение (например, путём центрифугирования) масла от смоляной фазы.

Настоящее изобретение дополнительно обеспечивает способ обработки смоляной фазы (предпочтительно получаемой или полученной после рафинирования, например рафинирования гидратацией или ферментативного рафинирования или их комбинации, пищевого масла), где смоляную фазу инкубируют с одним или большим количеством (активных) липидацилтрансферазных ферментов (отдельно или в комбинации с одним или большим количеством фосфолипазных С ферментов) в течение от минимум приблизительно 2 ч до максимум 7 дней (предпочтительно до приблизительно 1-2 дней) и отделяют (например, путём центрифугирования) масло от смоляной фазы.

Настоящее изобретение ещё дополнительно обеспечивает применение липидацилтрансферазы (отдельно или в комбинации с фосфолипазой С) в инкубировании смоляной фазы (получаемой или полученной после рафинирования, например рафинирования гидратацией или ферментативного рафинирования или их комбинации, пищевого масла) для увеличения выхода масла и/или производства твёрдой фазы (после отделения кислого масла) с более высоким уровнем фосфора, чем в нормальной смоле.

Применение фермента(ов) увеличивает ценность кислого масла в сравнении со смолой, так как кислое масло может быть использовано для получения жирных кислот. Жирная кислота имеет более высокую ценность, чем смола, которую в противном случае добавляют в еду.

Улучшения и/или увеличения наблюдаются в сравнении со смоляной фазой, которая не была обработана липидацилтрансферазой (отдельно или в комбинации с фосфолипазой С).

Подходяще один или большее количество липидацилтрансферазных ферментов в смоляной фазе могут иметь остаточный активный фермент, который может быть перенесён в смоляную фазу после ферментативного рафинирования пищевого масла. Альтернативно, к смоляной фазе может быть добавлен липидацилтрансферазный фермент, липидацилтрансфераза, где фермент может быть добавлен в начале или в процессе инкубации смоляной фазы.

В особенности масло в конце процесса в четвёртом аспекте (и других обработок смоляной фазы) представляет собой кислое масло. Это кислое масло может продаваться за большую цену, чем нормальная смоляная фаза, которую добавляют в еду. Оставшуюся смоляную фазу (после отделения кислого масла) иногда называют твёрдой фазой. Неожиданно было найдено, что оставшаяся твёрдая фаза (после отделения кислого масла) имеет более высокий уровень фосфора, чем нормальная смола и, таким образом, может быть использована как источник органического фосфора.

Предпочтительно смоляная фаза может быть инкубирована с липидацилтрансферазой (или отдельно, или с одним или большим количеством фосфолипазных С ферментов) при температуре от приблизительно 30 до приблизительно 10°С, предпочтительно от приблизительно 40 до приблизительно 60°С, предпочтительно от приблизительно 40 до приблизительно 50°С, предпочтительно от приблизительно 40 до приблизительно 45°С.

Предпочтительно смоляная фаза, полученная из ферментативного рафинирования гидратацией неочищенного масла с липидацилтрансферазой, может быть инкубирована при температуре от приблизительно 30 до приблизительно 70°С, предпочтительно от приблизительно 40 до приблизительно 60°С, предпочтительно от приблизительно 40 до приблизительно 50°С, предпочтительно от приблизительно 40 до приблизительно 45°С.

Преимущественно липидацилтрансфераза представляет собой такую, которая классифицирована Номенклатурной классификацией ферментов (Е.С. 2.3.1.43).

В одном варианте воплощения предпочтительно липидацилтрансферазу используют в комбинации с фосфолипазой С (Е.С. 3.1.4.3).

В одном предпочтительном варианте воплощения липидацилтрансферазу (Е.С. 2.3.1.43) используют в комбинации с фосфолипазой С (Е.С. 3.1.4.3).

Поэтому в соответствии с одним аспектом настоящего изобретения обеспечивается способ рафинирования гидратацией пищевого масла (предпочтительно неочищенного пищевого масла), который включает следующие стадии:

a) смешивание приблизительно 0,1-5% мас./мас. воды с пищевым маслом (предпочтительно неочищенным пищевым маслом) и комбинацией липидацилтрансферазы и фосфолипазы С;

b) энергичное перемешивание смеси в течение от приблизительно 10 до приблизительно 180 мин

- 3 020035 при температуре от приблизительно 45 до приблизительно 90°С и

с) разделение масляной фазы и смоляной фазы.

Не желая связываться теорией, неожиданно было найдено, что липидацилтрансфераза может использовать диглицерид (полученный с помощью реакции фосфолипазы С) как акцепторную молекулу для получения триглицерида. Таким образом, когда липидацилтрансферазу используют в комбинации с фосфолипазой С, взаимодействие между этими ферментами приводит к синергичному повышению количества триглицерида в масле, содержащем оба фермента, в сравнении с маслом, содержащим только один любой фермент, или в сравнении с маслом, не содержащим никакого фермента. Предпочтительно, когда липидацилтрансферазу используют в комбинации с фосфолипазой С, взаимодействие между этими ферментами приводит к синергичному уменьшению количества диглицерида в масле, содержащем оба фермента, в сравнении с маслом, содержащим только один любой фермент, или в сравнении с маслом, не содержащим никакого фермента. Когда липидацилтрансферазу используют в комбинации с фосфолипазой С, взаимодействие между этими ферментами приводит к синергичному увеличению выхода масла в масле, содержащем оба фермента, в сравнении с маслом, содержащим только один любой фермент, или в сравнении с маслом, не содержащим никакого фермента.

Применение комбинации этих ферментов имеет значительные преимущества перед применением только фосфолипазы С, так как накопление диглицеридов в масле (которое может происходить, когда используют только фосфолипазу С) может быть вредным для масла, потому что это может иметь негативное влияние на температуру образования копоти масла и/или может иметь негативное влияние на кристаллизационные свойства источников более насыщенных жиров.

Следовательно, в настоящем изобретении другое преимущество применения липидацилтрансфераз (в частности, в комбинации с фосфолипазой С) заключается в том, что количество диглицерида в масле может быть уменьшено по сравнению с аналогичным маслом без липидацилтрансферазы и/или особенно по сравнению с аналогичным маслом, обработанным только фосфолипазой С.

В другом аспекте настоящего изобретения обеспечивается применение липидацилтрансферазы в комбинации с фосфолипазой С в процессе рафинирования гидратацией пищевого масла (предпочтительно в процессе рафинирования гидратацией неочищенного пищевого масла) для увеличения выхода масла и/или для увеличения уровней триглицеридов в масляной фазе после завершения процесса рафинирования гидратацией и/или для уменьшения уровня диглицеридов в масляной фазе после завершения процесса рафинирования гидратацией.

В соответствии с ещё одним другим аспектом настоящего изобретения обеспечивается применение липидацилтрансферазы в комбинации с фосфолипазой С в процессе рафинирования гидратацией пищевого масла (предпочтительно в процессе рафинирования гидратацией неочищенного пищевого масла) для уменьшения вязкости смоляной фазы после завершения процесса рафинирования гидратацией.

Эти увеличения и/или уменьшения наблюдаются при сравнении со сравниваемым рафинированным пищевым маслом, которое не было обработано липидацилтрансферазой в комбинации с фосфолипазой С.

В основном увеличения и/или уменьшения, обговоренные выше, наблюдаются при сравнении со сравниваемым способом или сравниваемым маслом, которое не было обработано липидацилтрансферазой (или только ею или в комбинации с фосфолипазой С).

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения обеспечивается способ рафинирования гидратацией пищевого масла (предпочтительно неочищенного пищевого масла), который включает следующие стадии:

a) смешивание приблизительно 0,1-5% мас./мас. воды с пищевым маслом (предпочтительно неочищенным пищевым маслом) и липидацилтрансферазы в комбинации с фосфолипазой С;

b) энергичное перемешивание этой смеси в течение от приблизительно 10 до приблизительно 180 мин при температуре от приблизительно 45 до приблизительно 90°С;

c) разделение масляной фазы и смоляной фазы;

б) инкубирование смоляной фазы, содержащей активную липидацилтрансферазу, в течение от минимум приблизительно 2 ч до максимум 7 дней (предпочтительно до приблизительно 1-2 дней) и

Когда фермент, разлагающий фосфолипиды (предпочтительно липидацилтрансферазу), используют в комбинации с фосфолипазой С, фосфолипаза С может быть добавлена до, в то же время или после добавления липидацилтрансферазного фермента.

В одном варианте воплощения предпочтительно фосфолипазу С добавляют к липидацилтрансферазе.

Неожиданно было найдено, что применение комбинации липидацилтрансферазы и фосфолипазы С значительно увеличивает выход масла в масляной фазе после завершения процесса рафинирования гидратацией.

Не желая связываться теорией, предполагают, что фосфолипаза С гидролизует фосфолипид (например, фосфатидилхолин) до диглицерида (например, 1,2-диацилглицерин) и фосфатного остатка (например, холинфосфат) и липидацилтрансфераза затем переносит жирную кислоту на диглицерид, образованный с помощью фосфолипазы С, таким образом образуя больше триглицеридов и увеличивая вы

- 4 020035 ход масла. Этот эффект приводит к синергетическому (т.е. предпочтительно больше, чем к аддитивному) увеличению выхода масла.

В одном варианте воплощения предпочтительно способ рафинирования пищевого масла и/или применение в соответствии с настоящим изобретением могут быть выполнены при температуре в интервале приблизительно 45-90°С, предпочтительно приблизительно 45-70°С.

В другом варианте воплощения предпочтительно способ рафинирования пищевого масла и/или применение в соответствии с настоящим изобретением могут быть выполнены при температуре выше приблизительно 44°С, более предпочтительно выше приблизительно 45°С, более предпочтительно выше приблизительно 50°С.

В другом варианте воплощения предпочтительно способ и/или применение в соответствии с настоящим изобретением могут быть выполнены при температуре ниже приблизительно 60°С, предпочтительно ниже приблизительно 65°С, предпочтительно ниже приблизительно 70°С.

В одном варианте воплощения предпочтительно способ и/или применение в соответствии с настоящим изобретением могут быть выполнены при температуре в интервале приблизительно 45-70°С, предпочтительно в интервале приблизительно 45-68°С, более предпочтительно в интервале приблизительно 50-65°С.

Соответственно, температура масла и/или воды может составлять желательную температуру реакции при смешивании с ферментом.

Масло и/или вода могут быть нагреты и/или охлаждены до желательной температуры до и/или в процессе добавления фермента. Поэтому в одном варианте воплощения предполагают, что дополнительная стадия способа в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой охлаждение и/или нагревание масла и/или воды.

Предпочтительно содержание воды для способа в соответствии с настоящим изобретением может составлять приблизительно 0,1-4% мас./мас., более предпочтительно приблизительно 0,1-3% мас./мас., более предпочтительно приблизительно 0,5-3% мас./мас.

В одном варианте воплощения содержание воды для способа в соответствии с настоящим изобретением может составлять приблизительно 1-3% мас./мас.

В одном варианте воплощения содержание воды для способа в соответствии с настоящим изобретением может составлять меньше чем приблизительно 3% мас./мас., предпочтительно меньше чем приблизительно 2%.

В одном варианте воплощения содержание воды для этого способа может составлять меньше чем 1%. Уменьшение количества воды меньше чем приблизительно до 1% может приводить к значительному финансовому преимуществу в способе рафинирования гидратацией. Поэтому возможность уменьшения количества воды меньше чем приблизительно до 1% может привести к значительным сокращениям затрат.

Соответственно, время реакции (т.е. период времени, в течение которого смесь перемешивают) может составлять от приблизительно 10 до приблизительно 180 мин, предпочтительно от приблизительно 15 до приблизительно 180 мин, более предпочтительно от приблизительно 15 до 60 мин, даже более предпочтительно от приблизительно 15 до приблизительно 35 мин.

В одном варианте воплощения предпочтительно время реакции может составлять от приблизительно 30 до приблизительно 180 мин, предпочтительно от приблизительно 30 до приблизительно 60 мин.

В одном варианте воплощения способ предпочтительно выполняют при выше приблизительно рН 4,5, при выше приблизительно рН 5 или при выше приблизительно рН 6.

Предпочтительно способ выполняют при рН от приблизительно 4,6 до приблизительно 10,0, более предпочтительно от приблизительно 5,0 до приблизительно 10,0, более предпочтительно от приблизительно 6,0 до приблизительно 10,0, более предпочтительно от приблизительно 5,0 до приблизительно 7,0, более предпочтительно от приблизительно 5,0 до приблизительно 6,5 и даже более предпочтительно от приблизительно 5,5 до 6,0.

В одном варианте воплощения способ может быть выполнен при рН от приблизительно 5,3 до 8,3.

В одном варианте воплощения способ может быть выполнен при рН от приблизительно 6 до 6,5, предпочтительно приблизительно при 6,3.

Предпочтительно рН может быть нейтральным (рН приблизительно 5,0-7,0) в способах и/или применениях настоящего изобретения.

Предпочтительно обработка ферментом происходит в процессе рафинирования без корректировки рН масла и/или воды. Поэтому, как правило, рН будет составлять приблизительно 5,5-7,5. Это приводит к значительному преимуществу по сравнению со способами предыдущего уровня техники, используя фосфолипазные А ферменты, которые, как правило, являются высокоактивными только в кислых рН условиях, т.е. рН 4-5. Поэтому, как правило, в способах предыдущего уровня техники (например, используя фосфолипазные А ферменты) рН масла должен быть доведен до более кислых условий.

Кроме того, применение липидацилтрансферазы с фосфолипазным С ферментом имеет значительное преимущество по сравнению с применением указанной фосфолипазы А с фосфолипазным С ферментом, так как оптимальный рН для липидацилтрансфераз, как правило, совпадает значительно лучше с

- 5 020035 оптимальным рН для фосфолипазных С ферментов. Поэтому в основном не происходит никакого рНконфликта, когда липидацилтрансферазы применяют в комбинации с фосфолипазными С ферментами. Это резко контрастирует с применением фосфолипазных А ферментов в комбинации с фосфолипазными С ферментами. Поэтому применение липидацилтрансфераз в комбинации с фосфолипазными С ферментами обеспечивает значительное улучшение, так как оба фермента могут работать в их оптимальном рН интервале или одновременно.

Разделение масляной фазы и смоляной фазы может быть выполнено с помощью любого общепринятого способа разделения. Предпочтительно разделение проводят с помощью центрифугирования.

Одно значительное преимущество применения липидацилтрансфераз (или отдельно, или предпочтительно в комбинации с фосфолипазным С ферментом) заключается в том, что ферментативная обработка дает возможность настроить центрифугу для контролирования количества фосфора в конечном масле. Не желая связываться теорией, это достижимо, потому что вязкость масла значительно снижена в сравнении с маслом, не обработанным липидацилтрансферазой (или отдельно, или предпочтительно в комбинации с фосфолипазным С ферментом). Это значительное преимущество по сравнению со способами предыдущего уровня техники. Как правило, в общепринятых способах рафинирования центрифугирование приводит к получению уровня фосфора в масле приблизительно 50 ррт. Фактически, технические характеристики для уровня фосфора в пищевом масле регламентируют, что он должен быть меньше чем 200 ррт. В действительности, оптимально иметь масла с уровнем фосфора как можно более близким к уровню 200 ррт. Применение липидацилтрансферазы (или отдельно, или предпочтительно в комбинации с фосфолипазным С ферментом) приводит к получению масла, которое может быть центрифугировано до уровня фосфора от приблизительно 100 до 200 ррт, предпочтительно приблизительно 170-190 ррт, более предпочтительно приблизительно 180 ррт. Установка центрифуги для получения этих уровней фосфора до настоящего изобретения была очень сложной и обеспечивает значительное улучшение настоящего изобретения.

Соответственно, вода может быть смешана с пищевым маслом, до или во время смешивания с ферментом. Альтернативно, пищевое масло и фермент могут быть смешаны до смешивания с водой.

В одном варианте воплощения масло, воду и фермент можно прокачивать в потоке одновременно или по сути одновременно через миксер и в бак выдержки.

Предпочтительно фермент может быть инактивирован в течение и/или в конце способа.

Фермент может быть инактивирован до или после разделения масляной фазы и смоляной фазы.

Предпочтительно фермент может быть инактивирован теплом путём нагревания в течение 10 мин при 75-85°С или при температуре выше 92°С.

В одном варианте воплощения предпочтительно фермент может быть не инактивирован в смоляной фазе. Таким образом, когда смоляную фазу собирают и инкубируют, фермент может дополнительно разлагать фосфолипиды в смоляной фазе. После продолжительной инкубации смоляной фазы может быть выполнено дополнительное разделение (например, с помощью центрифугирования) для того, чтобы получить ещё больше масла из смоляной фазы. Это ещё больше может увеличить выход масла.

Не желая связываться теорией, считают, что фермент разлагает фосфолипиды до свободных жирных кислот в смоляной фазе, таким образом высвобождая триацилглицерид, который до этого был эмульсирован с фосфолипидами. Это снижает вязкость смоляной фазы и позволяет разделить триацилглицериды и свободные жирные кислоты, например, с помощью центрифугирования.

В одном варианте воплощения предпочтительно способ настоящего изобретения может быть выполнен без добавления щёлочи, такой как, например, ΝαΟΗ.

В другом варианте воплощения предпочтительно способ настоящего изобретения может быть выполнен в присутствии щёлочи, такой как, например, ΝαΟΗ. Когда добавляют ΝαΟΗ, предпочтительно её не добавляют в количестве, которое превышает приблизительно 0,2 мл (4% раствор) ΝαΟΗ на 100 г масла.

Ферменты, подходящие для применения в способах и/или применениях данного изобретения, могут иметь липидацилтрансферазную активность, что определяют, используя Исследование трансферазы (холестерин:фосфолипид) (ТтИ), описанное ниже.

Определение трансферазной активности Исследование трансферазы (холестерин:фосфолипид) (ТгИ).

Субстрат: 50 мг холестерина (81дта С8503) и 450 мг соевого фосфатидилхолина (РС), ΛναηΙί # 441601, растворяют в хлороформе и хлороформ выпаривают при 40°С в вакууме.

300 мг РС:холестерин 9:1 диспергируют при 40°С в 10 мл 50 мМ НЕРЕ8 буфера рН 7.

Ферментация:

250 мкл субстрата добавляют в стакан с крышкой при 40°С.

мкл раствора фермента добавляют и инкубируют при энергичном перемешивании в течение 10 мин при 40°С.

Добавленный фермент должен эстерифицировать 2-5% холестерина в данном исследовании.

Также анализируют контрольную пробу с 25 мкл воды вместо раствора фермента.

Через 10 мин добавляют 5 мл гексан:изопропанол 3:2.

- 6 020035

Количество эстера холестерина анализируют с помощью ВЭТСХ, используя холестеринстеарат (81§ша С3549), стандарт для калибрования.

Трансферазную активность рассчитывают как количество образования эстера холестерина в минуту при условиях исследования.

Одна трансферазная единица (Тги) определяется как мкмоль эстера холестерина, получаемого в минуту при 40°С и рН 7 в соответствии с исследованием трансферазы, представленным выше.

Предпочтительно липидацилтрансфераза, используемая в способе и применениях настоящего изобретения, будет иметь специфическую трансферазную единицу (Тги) на 1 мг фермента по крайней мере 25 Тги/мг ферментного белка.

Преимущественно липидацилтрансфераза для применения в настоящем изобретении может дозироваться в количестве от 0,05 до 50 Тги на 1 г масла, предпочтительно в количестве от 0,5 до 5 Тги на 1 г масла.

Более предпочтительно ферменты, подходящие для применения в способах и/или применениях настоящего изобретения, обладают липидацилтрансферазной активностью, как определено с помощью протокола ниже.

Протокол для определения % ацилтрансферазной активности.

Пищевое масло, к которому добавляют липидацилтрансферазу в соответствии с настоящим изобретением, может быть экстрагировано после ферментативной реакции с СНС1₃:СН₃ОН 2:1 и органическую фазу, содержащую липидный материал, выделяют и анализируют с помощью ГЖХ и ВЭЖХ в соответствии с процедурой, детально описанной ниже. Из ГЖХ и ВЭЖХ анализов определяют количество свободных жирных кислот и одного или большего количества эстеров стерина/станола. Контрольное пищевое масло, к которому не добавляют никакого фермента в соответствии с настоящим изобретением, анализируют тем же способом.

Расчёты.

Из результатов ГЖХ и ВЭЖХ анализов может быть рассчитано увеличение в свободных жирных кислотах и эстерах стерина/станола:

Δ % жирной кислоты = % жирной кислоты (фермент) - % жирной кислоты (контроль);

Μν жирной кислоты = средняя молекулярная масса жирных кислот;

А = Δ % эстера стерина/Μν эстера стерина (где Δ % эстера стерина = % эстера стерина/станола (фермент) - % эстера стерина/станола (контроль) и Μν эстера стерина = средняя молекулярная масса эстеров стерина/станола).

Трансферазную активность рассчитывают как процент от общей ферментативной активности:

% трансферазной активности = А х 100_____________________________

А + Δ % жирной кислоты /(Μν жирной кислоты)

Если количество свободных жирных кислот в пищевом масле увеличивается, оно не увеличивается предпочтительно существенно, т.е. в значительной степени. Под этим авторы имеют в виду, что увеличение в количестве свободных жирных кислот не влияет негативно на качество пищевого масла.

Пищевое масло, используемое для исследования ацилтрансферазной активности, предпочтительно представляет собой соевое масло, дополненное растительным стерином (1%) и фосфатидилхолином (2%), используя способ.

Растительный стерин и фосфатидилхолин растворяют в соевом масле путём нагревания до 95°С при перемешивании. Затем это масло охлаждают до 40°С и добавляют ферменты. Воду добавляют до общей концентрации 5% масляной фазы. Этот образец поддерживают при 40°С с перемешиванием на магнитной мешалке и образцы отбирают через 4 и 20 ч и анализируют с помощью ТСХ.

Для этого исследования используемая доза фермента составляет предпочтительно 0,2 Т1Ри-К/г масла, более предпочтительно 0,08 Т1РИ-К/г масла, предпочтительно 0,01 Т1РИ-К/г масла. Уровень фосфолипидов, присутствующих в масле, и/или % превращения стерина предпочтительно определяют через 0,5, 1, 2, 4 и 20 ч, более предпочтительно через 20 ч.

Когда используемый фермент представляет собой липидацилтрансферазный фермент, предпочтительно время инкубирования является эффективным для обеспечения по крайней мере 5% трансферазной активности, предпочтительно по крайней мере 10% трансферазной активности, предпочтительно по крайней мере 15, 20, 25, 26, 28, 30, 40, 50, 60 или 75% трансферазной активности.

% трансферазной активности (т.е. трансферазная активность как процент от общей ферментативной активности) может быть определён протоколом, заданным выше.

В некоторых аспектах настоящего изобретения термин без существенного увеличения количества свободных жирных кислот, как использовано в данном описании, означает, что количество свободной жирной кислоты в пищевом масле, обработанном с помощью липидацилтрансферазы в соответствии с настоящим изобретением, меньше, чем количество свободной жирной кислоты, полученное в пищевом масле, когда используют фермент, другой, чем липидацилтрансфераза, в соответствии с настоящим изобретением, например, в сравнении с количеством свободной жирной кислоты, полученным, когда ис

- 7 020035 пользуют обычный фосфолипазный фермент, например Ьесйазе ИИта® (Νονοζνιηοδ А/8, Эептагк).

Кроме того, или вместо, может быть использовано оценивание % трансферазной активности в масле (выше), для определения липидацилтрансферазных ферментов, наиболее предпочтительных для использования в способах данного изобретения следуя исследованию, озаглавленному как Протокол для определения липидацилтрансферазы для использования в настоящем изобретении.

Протокол для определения липидацилтрансферазы.

Липидацилтрансфераза в соответствии с настоящим изобретением представляет собой такую, которая приводит к:

ί) удалению фосфолипида, присутствующего в соевом масле, дополненном растительным стерином (1%) и фосфатидилхолином (2%) (используя способ: Растительный стерин и фосфатидилхолин растворяют в соевом масле путём нагревания до 95°С при перемешивании. Затем это масло охлаждают до 40°С и добавляют ферменты. Этот образец поддерживают при 40°С с перемешиванием на магнитной мешалке и образцы отбирают через 0,5, 1, 2, 4 и 20 ч и анализируют с помощью ТСХ); и/или ίί) превращению (% превращения) добавленного стерина в эстер стерина (используя способ, раскрытый в ί) выше). Может быть использован способ ГЖХ для определения уровня стерина и эстера стерина, как описано в примере 2.

Для этого исследования используемая доза фермента может составлять предпочтительно 0,2 ΤΙΡυ-Κ/г масла, более предпочтительно 0,08 Т1РИ-К/г масла, предпочтительно 0,01 ΤΙΡυ-Κ/г масла. Уровень фосфолипидов, присутствующих в масле, и/или превращение (% превращения) стерина предпочтительно определяют через 0,5, 1, 2, 4 и 20 ч, более предпочтительно через 20 ч.

В протоколе для определения липидацилтрансфераз, после ферментативной обработки, предпочтительно добавляют 5% воды и тщательно перемешивают с маслом. Затем это масло разделяют на масляную и водную фазу, используя центрифугирование (см. Еηζуте-саίа1уζеά йедитттд оГ уеде1аЬ1е ойз ВисйоИ, Н. и Ьаигд1 А.-О., Рей ^188еп8ейай Тес1то1още (1993), 95(8), 300-4, Ι88Ν: 0931-5985), и потом масляная фаза может быть проанализирована на содержание фосфора, используя следующий протокол (Исследование содержания фосфора).

Исследование содержания фосфора.

Уровень фосфолипидов, присутствующих в масле после рафинирования гидратацией, определяют первым получением образца масла в соответствии с получением образца, раскрытым в АО АС ΘΓΠααΙ Ме11юй 999.10 (>Ьеаф Сайтнни. 2тс, Соррег, апб 1гоп ш Роойз АЮпйс АЬзогрйоп 8рес1гор1юЮте1гу айег Мюготаауе П1де8Йоп, Ρίτδΐ Асйоп 1999 ΝΜΚΒ-АОАС Ме11юй). Количество фосфолипидов в масле затем измеряют путём анализирования содержания фосфора в образце масла после рафинирования в соответствии с АОАС ΘΓΓίααΙ Ме11юй Са 20-99: Апа1у818 Рйозрйогиз ΐη ой Ьу 1пйисйуе1у Соир1еб Р1азта Орйса1 Ет188юп ЗресИозсору.

Количество фосфора, присутствующего в масляной фазе после использования настоящего изобретения, как правило, не значительно отличается от содержания фосфора в масляной фазе после обычного рафинирования гидратацией (т.е. без фермента).

Выход масла, используя настоящее изобретение, в масляной фазе, используя настоящее изобретение, существенно повышается в сравнении с масляной фазой после использования обычного способа рафинирования гидратацией (т.е. без фермента). Предпочтительно способ и/или применение в соответствии с настоящим изобретением улучшают выход приблизительно на 0,25-7%, например приблизительно на 0,25-3%, или приблизительно 0,5-2%, или приблизительно 1-2% в сравнении с тем же маслом, которое подвергли тому же способу рафинирования гидратацией без добавления фермента.

Неожиданно было найдено, что добавление фермента в способ в соответствии с настоящим изобретением обеспечивает значительно более высокий выход масла в масляной фазе без обязательного значительного уменьшения содержания фосфора в масляной фазе в сравнении со сравниваемой масляной фазой, полученной с использованием сравнительного способа рафинирования гидратацией, но без добавления фермента.

Соответственно, количество фосфора в масляной фазе, когда масло обработано в соответствии со способом или применением настоящего изобретения, может составлять на 0-80%, предпочтительно 050%, предпочтительно 0-10%, предпочтительно 0-1% меньше, чем содержание фосфора в масляной фазе, полученной с использованием сравнительного способа рафинирования гидратацией, но без добавления фермента.

В частности, масляная фаза, полученная в способе в соответствии с настоящим изобретением, может быть дополнительно рафинирована для удаления фосфатидов и/или фосфолипидов. Например, масляная фаза может подвергаться или ферментативному рафинированию и/или кислотному рафинированию.

% превращения стерина, присутствующего в масле, составляет по крайней мере	1%,
предпочтительно	по	крайней	мере	5%,	предпочтительно	по	крайней	мере	10%,
предпочтительно	по	крайней	мере	20%,	предпочтительно	по	крайней	мере	30%,
предпочтительно	по	крайней	мере	40%,	предпочтительно	по	крайней	мере	50%,
предпочтительно	по	крайней	мере	60%,	предпочтительно	по	крайней	мере	70%,

предпочтительно по крайней мере 80%, предпочтительно по крайней мере 90%, предпочтительно по крайней мере 95%.

В одном варианте воплощения % превращения стерина, присутствующего в масле, составляет по крайней мере 5%, предпочтительно по крайней мере 20%.

В некоторых аспектах липидацилтрансфераза для использования в одном из способов и/или применений настоящего изобретения может включать ΟΌ8Χ мотив и/или ΟΆΝΏΥ мотив.

Предпочтительно фермент липидацилтрансфераза характеризуется как фермент, который обладает ацилтрансферазной активностью и который включает аминокислотный мотив ΟΌ8Χ, где X представляет собой один или более из следующих аминокислотных остатков: Ь, А, V, I, Р, Υ, Η, О. Т, Ν, М или 8.

Предпочтительно нуклеотидная последовательность, кодирующая липидацилтрансферазу или липидацилтрансферазу для использования в одном из способов и/или применений настоящего изобретения, может быть получаемой, предпочтительно полученной, из организмов, выбранных из одного или более следующих родов: Аеготопак, 81тер1отусек, 8ассНаготусек, Ьас1ососсик, МусоЬас1епит, 81тер1ососсик, Ьас1оЬасШик, Пеки1ГйоЬас1епит, ВасШик, Сатру1оЬас1ет, ^Ьпопасеае, Ху1е11а, 8и1Го1оЬик, АкретдШик, 8сЫ7окассЬатотусек, Ь1к1епа, №1ккепа, МекотЫ/оЬтт, К.а1к1ота, ХапШотопак и СапЛба. Предпочтительно липидацилтрансфераза является получаемой, предпочтительно полученной, из организма рода Аеготопак.

В некоторых аспектах настоящего изобретения нуклеотидная последовательность, кодирующая липидацилтрансферазу для использования в одном из способов и/или применений настоящего изобретения, кодирует липидацилтрансферазу, которая включает остаток аспарагиновой кислоты в положении, соответствующем N-80 в аминокислотной последовательности липидацилтрансферазы Аеготопак ка1тошс1ба, которая представлена как 8ЕО ГО Νο. 35.

В некоторых аспектах настоящего изобретения липидацилтрансфераза для использования в одном из способов и/или применений настоящего изобретения представляет собой липидацилтрансферазу, которая включает остаток аспарагиновой кислоты в положении, соответствующем Ν-80 в аминокислотной последовательности липидацилтрансферазы Аеготопак ка1топ1сИа, которая представлена как 8ЕО ГО Νο. 35.

В дополнение или в качестве альтернативы, нуклеотидная последовательность, кодирующая липидацилтрансферазу для использования в одном из способов и/или применений настоящего изобретения, кодирует липидацилтрансферазу, которая может включать аминокислотную последовательность, которая представлена как 8ЕО ГО Νο. 16, или аминокислотную последовательность, которая обладает 75% или более гомологией по отношению к ней. Предпочтительно нуклеотидная последовательность, кодирующая липидацилтрансферазу, кодирует липидацилтрансферазу, которая может включать аминокислотную последовательность, которая представлена как 8ЕО ГО Νο. 16.

В дополнение или в качестве альтернативы, нуклеотидная последовательность, кодирующая липидацилтрансферазу для использования в одном из способов и/или применений настоящего изобретения, кодирует липидацилтрансферазу, которая может включать аминокислотную последовательность, которая представлена как 8ЕО ГО Νο. 68, или аминокислотную последовательность, которая обладает 75% или более гомологией по отношению к ней. Предпочтительно нуклеотидная последовательность, кодирующая липидацилтрансферазу, кодирует липидацилтрансферазу, которая может включать аминокислотную последовательность, которая представлена как 8ЕО ГО Νο. 68.

В одном воплощении липидацилтрансфераза для использования в одном из способов и/или применений настоящего изобретения имеет аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕО ГО Νο. 16 или 8ЕО ГО Νο. 68, или имеет аминокислотную последовательность, которая обладает по крайней мере 75%-ной идентичностью с ней, предпочтительно по крайней мере 80%, предпочтительно по крайней мере 85%, предпочтительно по крайней мере 95%, предпочтительно по крайней мере 98% идентичностью с ней.

В одном варианте воплощения предпочтительно липидацилтрансфераза для применения в любом из способов и/или применений настоящего изобретения представляет собой липидацилтрансферазу, которая экспрессируется в ВасШик КсНешГогппк путём трансформирования указанного В.КсНешГогппк нуклеотидной последовательностью, показанной в 8ЕО ГО Νο. 1, или нуклеотидной последовательностью, имеющей по крайней мере 75% идентичность с ней (более предпочтительно по крайней мере 80%, более предпочтительно по крайней мере 85%, более предпочтительно по крайней мере 95%, более предпочтительно по крайней мере 98% идентичность с ней); культивирования указанного В.КсНешГогппк и выделения липидацилтрансферазы (липидацилтрансфераз), полученной в нём.

Термин пищевое масло, как использовано в данном описании, может включать растительные масла.

Предпочтительно пищевое масло до обработки в соответствии с настоящим изобретением представляет собой пищевое масло, которое включает негидратируемый фосфор с содержанием приблизительно 50-3000 ррт, более предпочтительно приблизительно 50-1400 ррт, более предпочтительно приблизительно 200-1400 ррт и даже более предпочтительно приблизительно 400-1200 ррт.

В одном аспекте неочищенное пищевое масло, до проведения способа настоящего изобретения,

- 9 020035 имеет содержание фосфора выше 350 ррт, более предпочтительно выше 400 ррт, ещё более предпочтительно выше 500 ррт и наиболее предпочтительно выше 600 ррт.

Предпочтительно пищевое масло представляет собой растительное масло.

Масла, охватываемые способом в соответствии с настоящим изобретением, могут включать, но не ограничиваются указанными, одно или большее количество из таких как соевое масло, масло канолы, кукурузное масло, хлопковое масло, пальмовое масло, кокосовое масло, рисовое масло, арахисовое масло, оливковое масло, сафлоровое масло, пальмоядровое масло, рапсовое масло и подсолнечное масло.

Предпочтительно масло представляет собой одно или большее количество из таких как соевое масло, кукурузное масло, подсолнечное масло и рапсовое масло (иногда называется маслом канолы).

Более предпочтительно масло представляет собой одно или большее количество из таких как соевое масло, подсолнечное масло или рапсовое масло.

Наиболее предпочтительно масло представляет собой соевое масло.

Как использовано в данном описании, неочищенное масло (также называется в данном описании нерафинированным маслом) может представлять собой выжатое или экстрагированное масло или их смесь.

Содержание фосфатидов в сиром масле может изменяться от 0,5 до 3% мас./мас., что соответствует содержанию фосфора в интервале 200-1200 ррт, более предпочтительно в интервале 250-1200 ррт.

Помимо фосфатидов, неочищенное масло также может содержать небольшие концентрации углеводородов, соединения сахаров и металл/фосфатидные кислотные комплексы Са, Мд и Бе.

Преимущественно способ и применения настоящего изобретения могут рафинировать пищевые масла в средах с низким уровнем воды (<5%, предпочтительно меньше чем 2%, более предпочтительно меньше чем 1%). Поэтому рафинирование гидратацией может быть проведено с добавлением меньшего количества воды, чем при использовании обычного способа рафинирования гидратацией.

Дополнительное преимущество настоящего изобретения заключается в выработке эстеров стерина в масляной фазе.

Предпочтительно фермент может быть дозирован в интервале приблизительно 0,01-10 ТГРИ-К/г масла, предпочтительно фермент может быть дозирован в интервале приблизительно 0,05-1,5 Т1РИ-К/Г масла, более предпочтительно 0,2-1 Т1РИ-К/г масла.

Когда фермент представляет собой липидацилтрансферазу, предпочтительно она может быть дозирована в интервале от приблизительно 0,01 до 5 Т1РИ-К единиц/г масла. В одном варианте воплощения липидацилтрансфераза может быть дозирована в интервале от приблизительно 0,1 до приблизительно 1 Т1РИ-К единиц/г масла, более предпочтительно липидацилтрансфераза может быть дозирована в интервале от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,5 Т1РИ-К единиц/г масла, более предпочтительно липидацилтрансфераза может быть дозирована в интервале от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,3 Т1РИ-К единиц/г масла.

Когда фермент представляет собой фосфолипазу, предпочтительно она может быть дозирована в интервале приблизительно 0,5-10 Т1РИ-К единиц/г масла. В одном варианте воплощения фосфолипаза может быть дозирована в интервале приблизительно 0,5-5 Т1РИ-К единиц/г масла, предпочтительно фосфолипаза может быть дозирована в интервале приблизительно 0,5-1,5 Т1РИ-К единиц/г масла. Предпочтительно фосфолипаза может быть дозирована в интервале приблизительно 1,0-3 Т1РИ-К единиц/г масла.

Фосфолипазная активность, Т1РИ-К.

Субстрат: 1,75% Ь-растительного фосфатидилхолина 95% (441601, ΛναηΙί Ро1аг Ырйк), 6,3% Тритона Х-100 ((# Т9284, §1дта) и 5 мМ СаС1₂ растворяют в 0,05 мМ НЕРЕ8 буфере рН 7,0.

Процедура исследования: Образцы, калибровочные растворы и контроль разводят в 10 мМ НЕРЕ8 рН 7,0, 0,1% Тритона Х-100 (# Т9284, 81дта). Анализ проводят, используя автоанализатор Конелаба (Коие1аЬ Лн1оапа1ухег) (Тйегто, Б1и1аиб). Исследование проводят при 30°С. 34 мкл субстрата термостатируют в течение 180 с перед добавлением 4 мкл образца. Ферментация длится 600 с. Количество свободной жирной кислоты, высвобожденной в процессе ферментации, измеряют, используя ИЕБЛ С набор (999-75406, \УЛКО. Оегшаиу). 56 мкл ИЕБЛ А добавляют и смесь инкубируют в течение 300 с. После этого 113 мкл ИЕБЛ В добавляют и смесь инкубируют в течение 300 с. Затем измеряют ОП (оптическая плотность) 520 нм. Ферментную активность (мкмоль ББА/мин-мл) расчитывают в пересчёте на стандартный ферментный препарат.

Ферментную активность Т1РИ-К рассчитывают как микромоли свободной жирной кислоты (ББА), полученные в минуту в условиях исследования.

В настоящем изобретении способ предпочтительно не представляет собой способ щелочной нейтрализации (т.е. не способ кислотного рафинирования гидратацией и/или не способ кислотно-щелочного рафинирования). Другими словами, способ предпочтительно не включает добавление кислот (таких как фосфорная, лимонная, аскорбиновая, серная, фумаровая, малеиновая, соляная и/или уксусная кислоты) или щелочей (таких как КОН и ЫаОН) или не включает добавление существенных количеств кислот или щелочей. Другими словами, если в способе настоящего изобретения добавляют кислоты и/или щёлочи, их добавляют менее чем при 0,004%.

- 10 020035

Для удобства поиска, эти и дополнительные аспекты настоящего изобретения далее раскрыты под соответствующими заголовками разделов. Однако информация в каждом разделе не обязательно ограничивается каждым определённым разделом.

Фосфолипаза С.

Как описано выше, фермент, разлагающий фосфолипиды (предпочтительно липидацилтрансфераза), может быть использован в комбинации с фосфолипазой С (Е.С. 3.1.4.3).

Фосфолипаза С может представлять собой любой доступный фосфолипазный С фермент и может быть выбрана из одного или больше из следующих фосфолипазных С ферментов: Рипйие® (имеется в наличии у Уетешит, И8); фосфолипаза С из С1о81пбшт регГппдещ (такая как фосфолипаза С, имеющаяся в наличии у 8щта. КеГ Р7633); фосфолипаза С из ВасШик сегеик (такая как фосфолипаза С, имеющаяся в наличии у 81дта, КеГ Р6621); фосфолипазный С фермент, описанный в \УО 2008/036863 (включённом в данное описание путём ссылки).

Преимущества.

Одно преимущество настоящего изобретения заключается в том, что в конце способа рафинирования гидратацией получают повышенный выход масла. Повышение в выходе масла сравнивают с аналогичным способом рафинирования гидратацией, но без добавления фермента в соответствии с настоящим изобретением.

Не желая связываться теорией, повышенный выход может быть благодаря уменьшенному эмульгирующему эффекту, что вызывается удалением фосфолипидов в смоляную фазу. Фосфолипиды являются хорошими эмульгаторами и могут быть эмульгированы с триацилглицеридами, таким образом, когда фосфолипиды удаляют в смоляную фазу, некоторое количество масла в форме триацилглицерида (масло) также удаляют. Уменьшение в вязкости смоляной фазы благодаря деградации фосфолипидов помогает предотвратить потерю масла в смоляной фазе (так как разделение смоляной фазы и масла значительно проще).

Кроме того или альтернативно (не желая связываться теорией), когда липидацилтрансферазу используют в соответствии с настоящим изобретением, эстеры стерина образуют путём переноса остатка жирной кислоты от фосфолипидов к стерину. Этот остаток жирной кислоты, эстерифицированный до стерина с помощью липидацилтрансферазной ферментной реакции, найден в масляной фазе и не выявляется в смоляной фазе. В обычных способах рафинирования гидратацией (без добавления липидацилтрансферазы) эти остатки жирной кислоты теряются, переходя в смоляную фазу.

Дополнительное преимущество настоящего изобретения заключается в том, что, когда используют липидацилтрансферазу, нет необходимости корректировать рН в способе рафинирования гидратацией (от приблизительно рН 5,0 или 5,5 до приблизительно рН 6,5 или 7). Этот рН приводит к получению высокой реакционной способности липидацилтрансферазы.

Другое преимущество настоящего изобретения при применении липидацилтрансферазы заключается в том, что жирная кислота от фосфолипидов переносится на стерин с образованием эстеров стерина. Это само по себе может способствовать получению от 0,1 до 0,15% увеличения в выходе в масляной фазе.

Дополнительное преимущество настоящего изобретения (в частности, при применении липидацилтрансферазы) заключается в том, что смоляная фаза является менее вязкой в сравнении со смоляной фазой из аналогичного способа рафинирования гидратацией, но без добавления фермента в соответствии с настоящим изобретением. Более низкая вязкость в смоляной фазе приводит к тому, что она легче отделяется от масляной фазы, т.е. путём центрифугирования.

Кроме того, смоляная фаза может иметь более низкое содержание воды, следовательно, она может быть легче высушена.

Ещё одно дополнительное преимущество настоящего изобретения заключается в том, что получается сниженная концентрация триглицеридов в смоляной фазе.

Способ настоящего изобретения может приводить к уменьшенному засорению отложениями на оборудовании для переработки. Это означает, что очищение оборудования может быть легче.

Не желая связываться теорией, неожиданно было найдено, что липидацилтрансфераза может использовать диглицерид (полученный реакцией фосфолипазы С) как акцепторную молекулу для получения триглицерида. Таким образом, когда липидацилтрансферазу используют в комбинации с фосфолипазой С, взаимодействие между этими ферментами приводит к синергетичному увеличению количества триглицерида в масле, содержащем оба фермента, в сравнении с аналогичным маслом, содержащим только любой фермент, или с аналогичным маслом, не содержащим никакого фермента. Когда липидацилтрансферазу используют в комбинации с фосфолипазой С, взаимодействие между этими ферментами приводит к синергетичному увеличению выхода масла в масле, содержащем оба фермента, в сравнении с аналогичным маслом, содержащим только любой фермент, или с аналогичным маслом, не содержащим никакого фермента.

Применение комбинации этих ферментов имеет значительные преимущества по сравнению с применением только фосфолипазы С, так как накопление диглицеридов в масле (которое может происходить, когда используют только фосфолипазу С) может быть вредным для масла, потому что это может

- 11 020035 иметь негативный эффект на температуру образования копоти масла и/или может иметь негативный эффект на кристаллизационные свойства источников более насыщенных жиров.

Применение фермента(ов) в соответствии с настоящим изобретением может уменьшить количество воды, необходимой в способе, меньше чем приблизительно до 1%. Это может привести к значительному финансовому преимуществу в способе рафинирования гидратацией. Поэтому возможность уменьшения количества воды меньше чем приблизительно до 1% может привести к значительным сокращениям затрат.

Предпочтительно обработка ферментом происходит в процессе рафинирования без корректировки рН масла и/или воды. Это приводит к значительному преимуществу по сравнению со способами предыдущего уровня техники, используя фосфолипазные А ферменты, которые, как правило, являются высокоактивными только в кислых рН условиях. Поэтому, как правило, в способах предыдущего уровня техники (например, используя фосфолипазные А ферменты) рН масла должен быть доведен до и/или при проведении процесса рафинирования. В настоящем изобретении в этом нет необходимости.

Кроме того, применение липидацилтрансферазы в комбинации с фосфолипазным С ферментом имеет значительное преимущество по сравнению с применением указанной фосфолипазы А с фосфолипазным С ферментом, так как оптимальный рН для липидацилтрансфераз, как правило, совпадает значительно лучше с оптимальным рН для фосфолипазных С ферментов. Поэтому в основном не происходит никакого рН-конфликта, когда липидацилтрансферазы применяют в комбинации с фосфолипазными С ферментами. Это резко контрастирует с применением фосфолипазных А ферментов в комбинации с фосфолипазными С ферментами. Поэтому применение липидацилтрансфераз в комбинации с фосфолипазными С ферментами обеспечивает значительное улучшение, так как оба фермента могут работать в их оптимальном рН интервале или одновременно.

В особенности в способе, который включает обработку смоляной фазы с помощью липидацилтрансферазы (или отдельно, или в комбинации с фосфолипазой С), кислое масло, полученное в конце этого способа, может продаваться за более высокую цену, чем нормальная смоляная фаза, которую добавляют в еду. Кроме того, неожиданно было найдено, что оставшаяся смоляная фаза (после отделения кислого масла) имеет более высокий уровень фосфора, чем нормальная смоляная фаза и, таким образом, может быть использована как источник органического фосфора.

Хозяйская клетка.

Хозяйский организм может представлять собой прокариотический или эукариотический организм.

В одном воплощении настоящего изобретения липидацилтрансфераза в соответствии с настоящим изобретением экспрессируется в хозяйской клетке, например бактериальных клетках, таких как ВасШик крр., например в хозяйской клетке ВаеШик КсНешГогпик.

Альтернативные хозяйские клетки могут представлять собой, например, грибы, дрожжи или растения.

Было обнаружено, что применение хозяйской клетки ВаеШик КсНешГогпик приводит к повышенной экспрессии липидацилтрансферазы по сравнению с другими организмами, такими как ВасШик киЫШк.

Липидацилтрансфераза из Аеготопак ка1тошсШа была встроена в ряд традиционных экспрессионных векторов, предназначенных для оптимальной экспрессии в ВасШик киЫШк, Напкепи1а ро1утогрйа, 8с1пхокасс11аготусек ротЬе и АкрегдШик ЫЫдеикщ соответственно. Однако очень низкие уровни определялись также в Напкепи1а ро1утогрНа. 8сЫхокассНаготусек ротЬе и АкрегдШик ЫЫдепык. Уровни экспрессии были ниже 1 мкг/мл, и не было возможности отобрать клетки, которые вырабатывают достаточное количество белка для начала коммерческого получения (результаты не представлены). В отличие от этого, ВасШик ПсНешГогпйк является способным продуцировать уровни белка, которые являются привлекательными для экономически рентабельного производства.

В частности, было обнаружено, что экспрессия в В.йсйешГогтщ является приблизительно в 10 раз большей, чем экспрессия в В.киЫШк под контролем аргЕ промотора, или является приблизительно в 100 раз большей, чем экспрессия в Б.йуШапк под контролем промотора А4 и слитого с целлюлозой (результаты не представлены в данном описании).

Хозяйская клетка может представлять собой клетку ВасШик, отличную от В.киЫШк. Предпочтительно, когда указанная хозяйская клетка ВасШик принадлежит к одному из следующих видов: ВасШик ПсНешГогпйк: В.а1ка1орЫ1ик; В.ату1о1к|иеГас1епк: В.спсШапк; В.с1аики; В.соади1апк; В.йгтик; В.1аи1ик; В.1еиЫк; В.тедаЮгшт; В.ритйик или В.кЮагоШегторНПик.

Термин хозяйская клетка в отношении настоящего изобретения включает любую клетку, которая включает либо нуклеотидную последовательность, кодирующую липидацилтрансферазу, как определено в данном описании, либо экспрессионный вектор, как определено в данном описании и который используется в рекомбинантном получении липидацилтрансферазы, обладающей специфическими свойствами, как определено в данном описании.

- 12 020035

Предпочтительно хозяйская клетка может быть дефектной по протеазе или представлять собой штамм протеаза минус и/или быть дефектной по α-амилазе или представлять собой штамм α-амилаза минус.

Термин гетерологичный, как используется в данном описании, означает последовательность, которая имеет происхождение от отличного генетического источника или видов. Гетерологичная последовательность представляет собой нехозяйскую последовательность, модифицированную последовательность, последовательность из отличного штамма хозяйской клетки или гомологичную последовательность из другого участка хромосомы хозяйской клетки.

Гомологичная последовательность представляет собой последовательность, которая обнаружена в том же генетическом источнике или видах, т.е. является существующей в природе в релевантных видах хозяйской клетки.

Термин рекомбинантная липидацилтрансфераза, как используется в данном описании, означает, что липидацилтрансфераза была получена с помощью генетической рекомбинации. Например, нуклеотидная последовательность, кодирующая липидацилтрансферазу, встраивали в клонирующий вектор, что приводило к получению клетки В.йсйешГогпщ. характеризующейся присутствием гетерологичной липидацилтрансферазы.

Регуляторные последовательности.

В некоторых применениях последовательность липидацилтрансферазы для использования в способах и применениях настоящего изобретения может быть получена путем оперативного связывания нуклеотидной последовательности, кодирующей ту же регуляторную последовательность, которая является способной обеспечить экспрессию нуклеотидной последовательности, что и выбранной хозяйской клеткой (такой клетки, как В.йсйеи1£огт18).

В качестве примера, может использоваться вектор, включающий нуклеотидную последовательность настоящего изобретения, оперативно связанную с такой регуляторной последовательностью, т.е. вектор, который представляет собой экспрессионный вектор.

Термин оперативно связанный относится к размещенным рядом компонентам, где описанные компоненты находятся во взаимосвязи, позволяющей им функционировать в соответствии с предназначенным способом. Регуляторная последовательность, оперативно связанная с кодирующей последовательностью, лигируется таким образом, что экспрессия кодирующей последовательности достигается при условиях, совместимых с контрольными последовательностями.

Термин регуляторные последовательности включает промоторы и энхансеры, а также другие сигналы регуляции экспрессии.

Термин промотор используется в обычном смысле, как принято в данной области техники, например, сайт связывания РНК-полимеразы.

Улучшенная экспрессия нуклеотидной последовательности, кодирующей фермент, обладающий специфическими свойствами, как определено в данном описании, может также быть достигнута с помощью селекции регуляторных участков, например промотора, лидерных и терминаторных участков секреции, которые не являются регуляторными участками для нуклеотидной последовательности, кодирующей фермент в природе.

Предпочтительно нуклеотидная последовательность настоящего изобретения может быть оперативно связана, по крайней мере, с промотором.

Предпочтительно нуклеотидная последовательность, кодирующая липидацилтрансферазу, может быть оперативно связанной с нуклеотидной последовательностью, кодирующей последовательность терминатора. Примеры приемлемых последовательностей терминатора для использования в каком-либо из векторов, хозяйских клеток, способов и/или применений настоящего изобретения включают:

последовательность терминатора α-амилазы (например, С666АСТТАСС6ААА6АААССАТСААТ6АТ66ТТТСТТТТТТ6ТТСАТААА - 5ЕС) ГО Νο. 64), последовательность терминатора щелочной протеазы (например, СААСАСТААА6АСС6ТТС6ССС6ТТТТТ6СААТАА6С666С6ААТСТТАСАТАААААТА - 5ЕО ГО Νο. 65), последовательность терминатора, специфического для глутаминовой кислоты (например, АС66СС6ТТА6АТ6Т6АСА6ССС6ТТССАААА66АА6С666СТ6ТСТТС6Т6ТАТТАТТ6Т 5ЕЕ) ΙΌ Νο. 66), последовательность терминатора леваназы (например, ТСТТТТАААС6ААА66СТ66ААТ6ССС66САТТССА6ССАСАТ6АТСАТС6ТТТ - 5ЕО ГО Νο. 67) и последовательность терминатора субтилина Е (например, 6СТ6АСАААТААААА6АА6СА66ТАТ66А66ААССТ6СТТСТТТТТАСТАТТАТТ6).

Предпочтительно нуклеотидная последовательность, кодирующая липидацилтрансферазу, может быть оперативно связана с терминатором α-амилазы, таким как терминатор α-амилазы ВЛсйепИогтщ.

Промотор.

Последовательность промотора, которая используется в соответствии с настоящим изобретением, может быть гетерологичной или гомологичной последовательности, кодирующей липидацилтрансфера

- 13 020035 зу.

Последовательность промотора может представлять собой последовательность промотора, способную направлять экспрессию липидацилтрансферазы в выбранной хозяйской клетке.

Предпочтительно последовательность промотора может быть гомологичной для видов ВасШик, например В.ПсйешГогпик. Предпочтительно последовательность промотора является гомологичной выбранной хозяйской клетке.

Предпочтительно последовательность промотора может быть гомологичной хозяйской клетке. Гомологичная хозяйской клетке означает такую, которая имеет происхождение от хозяйского организма; т.е. последовательность промотора, которая обнаружена в природе в хозяйском организме.

Предпочтительно последовательность промотора может быть выбрана из группы, состоящей из нуклеотидной последовательности, кодирующей промотор α-амилазы, промотор протеазы, промотор субтилизина, промотор протеазы, специфической для глутаминовой кислоты, и промотор левансахаразы.

Предпочтительно последовательность промотора может представлять собой нуклеотидную последовательность, кодирующую ЬЛТ (например, промотор α-амилазы из В.11сйешГогт18, также известный как ЛтуЬ), ЛргЬ (например, промотор субтилизина Карлсберга), ЕпбоС1иС (например, промотор, специфический для глутаминовой кислоты из ВЛсйешГогтщ), ЛтуО (например, промотор α-амилазы из В.ату1о1к|иеГас1еп5) и 8асВ (например, промотор левансахаразы В.киЫШк).

Другие примеры промоторов, приемлемых для направления транскрипции последовательности нуклеиновой кислоты в способах настоящего изобретения, включают промотор гена щелочной протеазы ВасШик 1еи1ик (аргН); промотор гена α-амилазы ВасШик киЫШк (атуЕ); промотор гена мальтогенной амилазы ВасШик к1еагоШегторЫ1ик (атуМ); промотор гена пенициллиназы ВасШик ПсйешГогиик (репР); промоторы генов ху1А и ху1В ВасШик киЫШк и/или промотор гена СгуШЛ ВасШик Шиппщепк1к киЬкр. (епеЬпошк.

В предпочтительном воплощении последовательность промотора представляет собой промотор αамилазы (такой как промотор α-амилазы ВасШик ПсНешГогпик). Предпочтительно, когда последовательность промотора включает от -35 до -10 последовательность промотора α-амилазы В.ПсНешГогпик - см. фиг. 53 и 55.

Последовательность от -35 до -10 описывает положение относительно сайта начала транскрипции. Как -35, так и -10 представляют собой блоки, т.е. некое количество нуклеотидов, каждый из которых включает 6 нуклеотидов, и эти блоки разделены 17 нуклеотидами. Эти 17 нуклеотидов часто называют спейсером. Это иллюстрируется на фиг. 55, где блоки -35 и -10 подчеркнуты. Во избежание неоднозначного трактования, там где последовательность от -35 до -10 используется в данном описании, это относится к последовательности от начала -35 блока до конца -10 блока, т.е. включая как -35 блок, так и спейсер длиной 17 нуклеотидов и -10 блок.

Сигнальный пептид.

Липидацилтрансфераза, которая вырабатывается хозяйской клеткой путем экспрессии нуклеотидной последовательности, кодирующей липидацилтрансферазу, может секретироваться или может содержаться внутри клетки в зависимости от используемой последовательности и/или вектора.

Сигнальная последовательность может использоваться для непосредственной секреции кодирующих последовательностей через определенную клеточную мембрану. Сигнальные последовательности могут быть природными или чужеродными по отношению к последовательности, кодирующей липидацилтрансферазу. Например, последовательность, кодирующая сигнальный пептид, может быть получена из гена амилазы или протеазы из видов ВасШик, предпочтительно из ВасШик НсйешГогпик.

Приемлемые последовательности, кодирующие сигнальный пептид, могут быть получены из одного или более из следующих генов: гена мальтогенной α-амилазы, гена субтилизина, гена бетα-лактамазы, гена нейтральной протеазы, ргкА гена и/или гена ацилтрансферазы.

Предпочтительно, когда сигнальный пептид представляет собой сигнальный пептид α-амилазы ВЛсйешГогпик. ацилтрансферазу Аеготопак (например, ткк\\Тус11Д|а11ус.|а - 8ЕО ΙΌ Νο. 21), субтилизин В.киЫШк (например, ипккк1\у|к11Га111ШтаГкпткас.|а - 8ЕО ΙΌ Νο. 22) или субтилизин В.НсйешГогпик (например, иипгкккГ\уГщп11аГт1уПтеГкбкака -8ЕО ΙΌ Νο. 23). Предпочтительно сигнальный пептид может представлять собой сигнальный пептид α-амилазы В.НсйешГогпик.

Однако может использоваться любая последовательность, кодирующая сигнальный пептид, способная направлять экспрессированную липидацилтрансферазу по секреторному пути выбранной хозяйской клетки ВасШик (предпочтительно хозяйской клетки В.11сйепИогт1к).

В некоторых воплощениях настоящего изобретения нуклеотидная последовательность, кодирующая сигнальный пептид, может быть оперативно связана с нуклеотидной последовательностью, кодирующей выбранную липидацилтрансферазу.

Выбранная липидацилтрансфераза может экспрессироваться в хозяйской клетке, как определено в данном описании, в виде слитого белка.

- 14 020035

Экспрессионный вектор.

Термин экспрессионный вектор означает конструкцию, способную к ίη νίνο или ίη νίίΓΟ экспрессии.

Предпочтительно, когда экспрессионный вектор встраивается в геном организма, такого как хозяйская клетка В.НсйешГогшэк. Термин встроенный предпочтительно охватывает стабильное встраивание в геном.

Нуклеотидная последовательность, кодирующая липидацилтрансферазу, как определено в данном описании, может быть представлена в векторе, в котором нуклеотидная последовательность является оперативно связанной с регуляторными последовательностями, так, что регуляторные последовательности являются способными обеспечивать экспрессию нуклеотидной последовательности приемлемым хозяйским организмом (таким как В.НсйешГогпйД. т.е. вектор представляет собой экспрессионный вектор.

Векторы в соответствии с настоящим изобретением могут быть трансформированы в хозяйскую клетку так, как описано выше, для обеспечения экспрессии полипептида, обладающего липидацилтрансферазной активностью, как определено в данном описании.

Выбор вектора, например плазмиды, космиды, вирусного или фагового вектора, геномной вставки, часто зависит от хозяйской клетки, в которую он встраивается. Настоящее изобретение может охватывать разные формы экспрессионных векторов, которые служат для осуществления эквивалентных функций, которые являются известными в области техники.

Трансформированный в выбранную хозяйскую клетку вектор может реплицироваться и функционировать независимо от генома хозяйской клетки или может быть интегрированным в геном сам по себе.

Векторы могут содержать один или более генов селектируемых маркеров, таких как ген, который придает устойчивость к антибиотикам, например устойчивость к ампициллину, канамицину, хлорафениколу или тетрациклину. Альтернативно, селекция может осуществляться путем совместной трансформации (как описано в \УО 91/17243).

Векторы могут использоваться ίη νίίΓΟ, например, для получения РНК или использоваться для трансфекции или трансформации хозяйской клетки.

Вектор может дополнительно включать нуклеотидную последовательность, позволяющую вектору реплицироваться в рассматриваемой хозяйской клетке. Примеры таких последовательностей представляют собой точки начала репликации плазмид рИС19, рЛСУС177, рИВ110, рЕ194, рАМВ1 и рИ702.

Липидацилтрансфераза.

Нуклеотидная последовательность, кодирующая липидацилтрансферазу для использования в одном из способов и/или применений настоящего изобретения, может кодировать природную липидацилтрансферазу или вариант липидацилтрансферазы.

Липидацилтрансфераза для использования в одном из способов и/или применений настоящего изобретения может быть природной липидацилтрансферазой или вариантом липидацилтрансферазы.

Например, нуклеотидная последовательность, кодирующая липидацилтрансферазу для использования в настоящем изобретении, может быть одной из тех, что описаны в \УО 2004/064537, \УО 2004/064987, \УО 2005/066347 или \УО 2006/008508. Эти документы введены в данное описание в качестве ссылки.

Термин липидацилтрансфераза, как используется в данном описании, предпочтительно означает фермент, который обладает ацилтрансферазной активностью (который обычно классифицируется как Е.С. 2.3.1.x, например 2,3,1,43), где фермент является способным к переносу ацильной группы из липида на один или более акцепторных субстратов, таких как один или более из приведенных далее: стерин, станол; углевод; белок; белковая субъединица; сахарный спирт, такой как аскорбиновая кислота, и/или глицерин, предпочтительно глицерин и/или стерин, такой как холестерин.

Предпочтительно, когда липидацилтрансфераза для использования в одном из способов и/или применений настоящего изобретения представляет собой липидацилтрансферазу, которая является способной к переносу ацильной группы из фосфолипида (как определено в данном описании) на сахарный спирт, такой как аскорбиновая кислота, и/или глицерин, и/или стерин, предпочтительно глицерин или стерин, наиболее предпочтительно стерин (например, холестерин).

В некоторых аспектах акцептор ацила в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой соединение, включающее гидроксигруппу (-ОН), такое как, например, поливалентные спирты, включая глицерин; стерины; станолы; углеводы; гидроксикислоты, включая фруктовые кислоты, лимонную кислоту, винную кислоту, молочную кислоту и аскорбиновую кислоту; белки или их субъединицы, такие как аминокислоты, белковые гидролизаты и пептиды (частично гидролизованный белок), например; и их смеси, а также их производные. Предпочтительно, когда акцептор ацила в соответствии с настоящим изобретением не является водой.

Акцептор ацила предпочтительно не является моноглицеридом.

В одном варианте выполнения акцептор ацила может представлять собой диглицерид.

В одном аспекте липидацилтрансфераза для использования в способах и/или применениях настоящего изобретения является способной переносить группу ацила из липида на стерин и/или станол.

- 15 020035

В другом аспекте липидацилтрансфераза для использования в способах и/или применениях настоящего изобретения является способной переносить группу ацила из липида на стерин и/или станол, дополнительно может переносить группу ацила из липида на одно или более из следующих соединений: углевод, белок, белковая субъединица, глицерин, жирный спирт.

Предпочтительно акцептор ацила естественно может быть найден в масле. Альтернативно, акцептор ацила может быть добавлен к маслу (например, акцептор ацила может быть инородным для масла). Например, в некоторых вариантах воплощения стерин и/или станол могут быть добавлены к маслу до или в процессе рафинирования. Это особенно важно, если количество акцептора ацила является ограничивающим скорость ацилтрансферазной реакции. Добавление акцептора ацила может приводить к уменьшениям в количествах свободных жирных кислот и/или большему образованию эстера акцептора ацила в сравнении с маслом, к которому не добавляли дополнительного акцептора ацила.

Предпочтительно, когда липидный субстрат, на основе которого действует липидный ацил, представляет собой один или более из следующих липидов: фосфолипид, такой как лецитин, например фосфатидилхолин и/или фосфатидилэтаноламин.

Этот липидный субстрат может называться в данном описании донор липидного ацила. Термин лецитин, как используется в данном описании, охватывает фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилинозитол, фосфатидилсерин и фосфатидилглицерин.

Предпочтительные липидацилтрансферазы для применения в настоящем изобретении определяются как такие, которые имеют высокую активность, например высокую фосфолипидгидролитическую активность или высокую фосфолипид-трансферазную активность на фосфолипиды в масляной среде, наиболее предпочтительно липидацилтрансферазы для применения в настоящем изобретении имеют высокую трансферазную активность от фосфолипида до стерина.

Как детально описано выше, другие ацилтрансферазы, подходящие для применения в способах данного изобретения, могут быть определены путём идентифицирования присутствия СЭ8Х, ΟΆΝΏΥ и НРТ блоков или путём выравнивания рЕат00657 консенсусной последовательности (8Е0 Ш Νο. 1) и/или выравнивания к СЭ8Х ацилтрансферазе, например 8Е0 Ш Νο. 28. Для того чтобы оценить их пригодность для рафинирования, т.е. определить те ферменты, которые имеют трансферазную активность по крайней мере 5%, более предпочтительно по крайней мере 10%, более предпочтительно по крайней мере 20%, более предпочтительно по крайней мере 30%, более предпочтительно по крайней мере 40%, более предпочтительно 50%, более предпочтительно по крайней мере 60%, более предпочтительно по крайней мере 70%, более предпочтительно по крайней мере 80%, более предпочтительно по крайней мере 90% и более предпочтительно по крайней мере 98% от общей ферментной активности, такие ацилтрансферазы тестируют, используя исследование Протокол для определения % ацилтрансферазной активности, детально раскрытый в данном описании выше.

Для некоторых аспектов является предпочтительным, когда липидацилтрансфераза для способов и применений в соответствии с настоящим изобретением представляет собой липидацилтрансферазу, которая является не способной или существенно не способной воздействовать на триглицерид, и/или 1-моноглицерид, и/или 2-моноглицерид.

Для некоторых аспектов является предпочтительным, когда липидацилтрансфераза для использования в одном из способов и/или применений настоящего изобретения представляет собой липидацилтрансферазу, которая не демонстрирует активности триацилглицеринлипазы (Е.С. 3.1.1.3) или не демонстрирует значительной активности триацилглицеринлипазы (Е.С. 3.1.1.3).

Способность к гидролизу триглицерида (Е.С. 3.1.1.3 активность) может быть определена с помощью липазной активности, определяемой в соответствии с Кодексом пищевых химикатов (3-е изд., 1981, стр. 492-493), модифицированной для подсолнечного масла и рН 5,5 вместо оливкового масла и рН 6,5. Липазная активность измеряется как ЬИ8 (липазные единицы подсолнечника), где 1 ЬИ8 определяется как количество фермента, который может высвобождать 1 мкмоль жирных кислот в минуту из подсолнечного масла при указанных выше условиях анализа. Альтернативно, может использоваться ЬИТ анализ, как определено в \УО 9845453. Это упоминание введено в данное описание в качестве ссылки.

Липидацилтрансфераза для использования в одном из способов и/или применений настоящего изобретения может быть липидацилтрансферазой, которая является существенно не способной воздействовать на триглицерид, и может иметь значение ЬИ8/мг менее чем 1000, например менее чем 500, такое как менее чем 300, предпочтительно менее чем 200, более предпочтительно менее чем 100, более предпочтительно менее чем 50, более предпочтительно менее чем 20, более предпочтительно менее чем 10, такое как менее чем 5, менее чем 2, более предпочтительно менее чем 1 ЬИ8/мг. Альтернативно, активность ЬИТ/мг является меньшей чем 500, такой как менее чем 300, предпочтительно менее чем 200, более предпочтительно менее чем 100, более предпочтительно менее чем 50, более предпочтительно менее чем 20, более предпочтительно менее чем 10, такой как менее чем 5, менее чем 2, более предпочтительно менее чем 1 ЬИТ/мг.

Липидацилтрансфераза для использования в одном из способов и/или применений настоящего изобретения может представлять собой липидацилтрансферазу, которая является существенно не способной воздействовать на моноглицерид. Это может быть определено при использовании моноолеата (М7765 1

- 16 020035 олеил-гас-глицерина 99%) вместо подсолнечного масла в ЬИ8 анализе. 1 МОНИ определяется как количество, которое может высвобождать 1 мкмоль жирной кислот в минуту из моноглицерида при указанных выше условиях анализа.

Липидацилтрансфераза для использования в одном из способов и/или применений настоящего изобретения может представлять собой липидацилтрансферазу, которая предпочтительно является существенно не способной воздействовать на триглицерид и может иметь значение менее чем 5000, например менее чем 1000, например менее чем 500, такое как менее чем 300, предпочтительно менее чем 200, более предпочтительно менее чем 100, более предпочтительно менее чем 50, более предпочтительно менее чем 20, более предпочтительно менее чем 10, такое как менее чем 5, менее чем 2, более предпочтительно менее чем 1 МСНИ/мг.

Предпочтительно, когда липидацилтрансфераза для использования в одном из способов и/или применений настоящего изобретения представляет собой липидацилтрансферазу, которая дополнительно к своей липидацилтрансферазной активности также может демонстрировать одну или более из следующих активностей фосфолипазы: активность фосфолипазы А2 (Е.С. 3.1.1.4) и/или активность фосфолипазы А1 (Е.С. 3.1.1.32). Липидацилтрансфераза может также обладать активностью фосфолипазы В (Е.С 3.1.1.5).

Предпочтительно для некоторых аспектов липидацилтрансфераза может быть способной к переносу группы ацила из фосфолипида на станол и/или стерин, предпочтительно холестерин.

Для некоторых аспектов является предпочтительным, когда липидацилтрансфераза для использования в одном из способов и/или применений настоящего изобретения кодирует липидацилтрансферазу, которая является способной к переносу группы ацила из фосфолипида на стерин и/или станол с образованием, по крайней мере, эстера стерина и/или эстера станола.

Таким образом, в одном воплощении акцептор ацила в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой растительный стерин/станол.

Предпочтительно, когда фермент липидацилтрансфераза может быть охарактеризован при использовании следующих критериев:

фермент обладает ацилтрансферазной активностью, которая может быть определена как активность переноса эстера, посредством чего ацильная часть исходной связи эстера донора липидного ацила переносится на акцептор ацила, с образованием нового эстера; и фермент включает аминокислотный мотив СЭ8Х, где X представляет собой один или более из следующих аминокислотных остатков: Ь, А, V, I, Б, Υ, Н, О, Т, Ν, М или 8.

Предпочтительно, когда X мотив СЭ8Х представляет собой Ь или Υ. Более предпочтительно, когда X мотив СЭ8Х представляет собой Ь. Таким образом, предпочтительно фермент в соответствии с настоящим изобретением включает аминокислотный мотив СО8Б.

СЭ8Х мотив состоит из четырех консервативных аминокислот. Предпочтительно, когда серин в мотиве представляет собой серин фермента липидацилтрансферазы. Предпочтительно, когда серин СЭ8Х мотива может находиться в положении, соответствующем 8ег-16 в ферменте липидацилтрансферазы Аетотоиак НубгорНба, как описывается у Вгитйк & Виск1еу (1оитиа1 о£ Вас1етю1о§у. Арг. 1996, νοί. 178, Νο. 7, р. 2060-2064).

Для определения того, что белок имеет СЭ8Х мотив в соответствии с настоящим изобретением, последовательность предпочтительно сравнивают с профилями скрытой марковской модели (НММ профили) базы данных р£ат в соответствии с процедурами, описанными в νϋ 2004/064537 или νϋ 2004/064987, которые введены в данное описание в качестве ссылки

Предпочтительно фермент липидацилтрансфераза может подвергаться выравниванию при использовании р£ат00657 консенсусной последовательности (для полного объяснения см. νϋ 2004/064537 или νϋ 2004/064987).

Предпочтительно, когда позитивное соответствие профилю скрытой марковской модели (НММ профиль) семейства домена р£ат00657 свидетельствует о присутствии СО8Б или СЭ8Х домена в соответствии с настоящим изобретением.

Предпочтительно, когда соответствующая р£ат00657 консенсусная последовательность липидацилтрансферазы для использования в способах или применениях в соответствии с изобретением будет иметь по крайней мере один, предпочтительно более чем один, предпочтительно более двух из следующих: СЭ8Х блок, ΘΑΝΌΥ блок, НРТ блок. Предпочтительно липидацилтрансфераза может иметь СЭ8Х блок и 6ΑΝΏΥ блок. Альтернативно, фермент может иметь СЭ8Х блок и НРТ блок. Предпочтительно, когда фермент включает, по крайней мере, СЭ8Х блок. См. νϋ 2004/064537 или νϋ 2004/064987 для дополнительной информации.

Предпочтительно, когда остатки 6ΑΝΏΥ мотива выбирают из 6ΑΝΏΥ, 66ΝΏΑ, 66ΝΏΕ, более предпочтительно ΘΑΝΏΥ.

Предпочтительно, когда соответствующая р£ат00657 консенсусная последовательность фермента для использования в способах или применениях в соответствии с настоящим изобретением имеет по крайней мере 1, предпочтительно более 1, предпочтительно более 2, предпочтительно более 3, предпочтительно более 4, предпочтительно более 5, предпочтительно более 6, предпочтительно более 7, предпочтительно более 8, предпочтительно более девяти, предпочтительно более 10, предпочтительно более

- 17 020035

11, предпочтительно более 12, предпочтительно более 13, предпочтительно более 14 следующих аминокислотных остатков при сравнении со стандартной полипептидной последовательностью А.НубгорНШа. в частности 8ЕО Ш Νο. 1: 281ιίά, 291ιίά, 301ίά, 311ιίά, 32д1у, 33Акр, 348ег, 351ίά, 1301ίά, 131С1у, 132Ηίά, 133Акп, 134Акр, 1351ίά, 309Η18.

Домен р£ат00657 ΟΌ8Χ представляет собой уникальный идентификатор, который отличает белки, обладающие этим доменом от других ферментов.

р£ат00657 консенсусная последовательность представлена на фиг. 3 как 8Е0 Ш Νο. 2. Она получена путем идентификации р£ат семейства 00657, версии базы данных 6, которая также называется как р£ат00657,6 в данном описании.

Консенсусная последовательность может быть обновлена при использовании последующих выпусков р£ат базы данных (например, см. \УО 2004/064537 или \УО 2004/064987).

В одном воплощении фермент липидацилтрансфераза для использования в одном из способов и/или применений настоящего изобретения представляет собой липидацилтрансферазу, которая может быть охарактеризована при использовании следующих критериев:

(ί) фермент обладает ацилтрансферазной активностью, которая может быть определена как активность переноса эстера, посредством чего ацильная часть связи исходного эстера донора липидного ацила переносится на акцептор ацила с образованием нового эстера;

(ίί) фермент включает аминокислотный мотив ΟΌ8Χ, где X представляет собой один или более из следующих аминокислотных остатков: Ь, А, V, I, Р, Υ, Η, О, Т, Ν, М или 8;

(ш) фермент включает Шк-309 или включает остаток гистидина в положении, соответствующем Ηίδ-309 в ферменте липидацилтрансферазе Аеготопак йуйгорййа, показанном на фиг. 2 и 4 (8ЕО Ш Νο. 1 или 8ЕО Ш №. 3).

Предпочтительно аминокислотный остаток ΟΌ8Χ мотива представляет собой Ь.

В 8ЕО Ш №. 3 или 8ЕО Ш №. 1 первые 18 аминокислотных остатков образуют сигнальную последовательность. Ηίδ-309 последовательности полной длины, т.е. белка, включающего сигнальную последовательность, приравнивается к Ηίδ-291 зрелой части белка, т.е. последовательности, не содержащей сигнальной последовательности.

В одном воплощении фермент липидацилтрансфераза для использования в любом из способов и применений настоящего изобретения представляет собой липидацилтрансферазу, которая включает следующую каталитическую триаду: 8ег-34, Акр-306 и Ηίκ-309 или включает остаток серина, остаток аспарагиновой кислоты и остаток гистидина соответственно в положениях, соответствующих 8ег-34, Акр-306 и Ηίκ-309 в ферменте липидацилтрансферазы Аеготопак йубгорШа, показанном на фиг. 4 (8ЕО Ш №. 3) или фиг. 2 (8ЕО Ш №. 1). Как указано выше, в последовательности, показанной в 8ЕО Ш №. 3 или 8ЕО Ш №. 1, первые 18 аминокислотных остатков образуют сигнальную последовательность. 8ег-34, Акр-306 и Ηίκ-309 последовательности полной длины, т.е. белка, включающего сигнальную последовательность, приравнивается к 8ег-16, Акр-288 и И1к-291 зрелой части белка, т.е. последовательности, не содержащей сигнальной последовательности. В р£ат00657 консенсусной последовательности, как представлено на фиг. 3 (8ЕО Ш №. 2), остатки активного сайта соответствуют 8ег-7, Акр-345 и И1к-348.

фермент обладает ацилтрансферазной активностью, которая может быть определена как активность переноса эстера, посредством чего ацильная часть исходной связи эстера первого донора липидного ацила переносится на акцептор ацила с образованием нового эстера; и фермент включает, по крайней мере, О1у-32, Акр-33, 8ег-34, Акр-134 и И1к-309 или включает остатки глицина, аспарагиновой кислоты, серина, аспарагиновой кислоты и гистидина в положениях, соответствующих О1у-32, Акр-33, 8ег-34, Акр-306 и И1к-309 соответственно, в ферменте липидацилтрансферазе Аеготопак йуйгорййа, представленном в 8ЕО Ш №. 3 или 8ЕО Ш №. 1.

Предпочтительно, когда фермент липидацилтрансфераза для использования в одном из способов и/или применений настоящего изобретения может кодироваться одной из следующих нуклеотидных последовательностей:

(a) нуклеотидной последовательностью, которая представлена как 8ЕО Ш №. 36 (см. фиг. 29);

(b) нуклеотидной последовательностью, которая представлена как 8ЕО Ш №. 38 (см. фиг. 31);

(c) нуклеотидной последовательностью, которая представлена как 8ЕО Ш №. 39 (см. фиг. 32); (ά) нуклеотидной последовательностью, которая представлена как 8ЕО Ш №. 42 (см. фиг. 35); (е) нуклеотидной последовательностью, которая представлена как 8ЕО Ш №. 44 (см. фиг. 37); (ί) нуклеотидная последовательность, которая представлена как 8ЕО Ш №. 46 (см. фиг. 39);

(д) нуклеотидной последовательностью, которая представлена как 8ЕО Ш №. 48 (см. фиг. 41); (11) нуклеотидной последовательностью, которая представлена как 8ЕО Ш №. 49 (см. фиг. 57); (ί) нуклеотидной последовательностью, которая представлена как 8ЕО Ш №. 50 (см. фиг. 58); (ί) нуклеотидной последовательностью, которая представлена как 8ЕО Ш №. 51 (см. фиг. 59);

(к) нуклеотидной последовательность, которая представлена как 8ЕО Ш №. 52 (см. фиг. 60);

- 18 020035 (1) нуклеотидной последовательностью, которая представлена как 8Е0 ΙΌ Νο. 53 (см. фиг. 61);

(т) нуклеотидной последовательностью, которая представлена как 8Е0 ΙΌ Νο. 54 (см. фиг. 62);

(п) нуклеотидной последовательностью, которая представлена как 8Е0 ΙΌ Νο. 55 (см. фиг. 63);

(о) нуклеотидной последовательностью, которая представлена как 8Е0 ΙΌ Νο. 56 (см. фиг. 64);

(р) нуклеотидной последовательностью, которая представлена как 8Е0 ΙΌ Νο. 57 (см. фиг. 65); (с.|) нуклеотидной последовательностью, которая представлена как 8Е0 ΙΌ Νο. 58 (см. фиг. 66);

(г) нуклеотидной последовательностью, которая представлена как 8Е0 ΙΌ Νο. 59 (см. фиг. 67);

(к) нуклеотидной последовательностью, которая представлена как 8Е0 ΙΌ Νο. 60 (см. фиг. 68); (ΐ) нуклеотидной последовательностью, которая представлена как 8ЕО ΙΌ Νο. 61 (см. фиг. 69);

(и) нуклеотидной последовательностью, которая представлена как 8ЕО ΙΌ Νο. 62 (см. фиг. 70);

(ν) нуклеотидной последовательностью, которая представлена как 8ЕО ΙΌ Νο. 63 (см. фиг. 71); или (те) нуклеотидной последовательностью, которая обладает 70% или более, предпочтительно 75% или более идентичностью с одной или более последовательностей, которые представлены как 8ЕО ГО Νο. 36, 8ЕО ΙΌ Νο. 38, 8Ер ΙΌ Νο. 39, 8Ер ΙΌ Νο. 42, 8ЕЕ) ΙΌ Νο. 44, 8ЕЕ) ΙΌ Νο. 46,

8ЕЕ) ΙΌ Νο. 48, 8ЕЕ) ΙΌ Νο. 49, 8ЕЕ) ΙΌ Νο. 50, 8ЕЕ) ΙΌ Νο. 51, 8ЕЕ) ΙΌ Νο. 52, 8ЕЕ) ΙΌ Νο.53,

8ЕЕ) ΙΌ Νο. 54, 8ЕЕ) ΙΌ Νο. 55, 8ЕЕ) ΙΌ Νο. 56, 8ЕЕ) ΙΌ Νο. 57, 8ЕЕ) ΙΌ Νο. 58, 8ЕЕ) ΙΌ Νο.59,

8ЕЕ) ΙΌ Νο. 60, 8ЕЕ) ΙΌ Νο. 61, 8ЕЕ) ΙΌ Νο. 62 или 8ЕЕ) ΙΌ Νο.63.

Предпочтительно нуклеотидная последовательность может обладать 80% или более, предпочтительно 85% или более, более предпочтительно 90% или более и даже более предпочтительно 95% или более идентичностью с одной или более последовательностями, которые представлены как 8ЕЕ) ΙΌ Νο. 36, 8ЕЕ) ΙΌ Νο. 38, 8ЕЕ) ΙΌ Νο. 39, 8ЕЕ) ΙΌ Νο. 42, 8ЕЕ) ΙΌ Νο. 44, 8ЕЕ) ΙΌ Νο. 46,

В одном воплощении нуклеотидная последовательность, кодирующая фермент липидацилтрансферазу для использования в любом из способов или применений настоящего изобретения, представляет собой нуклеотидную последовательность, которая обладает 70% или более, предпочтительно 75% или более идентичностью с одной или более последовательностями, представленными как 8ЕО ΙΌ Νο. 49, 8ЕО ΙΌ Νο. 50, 8ЕО ΙΌ Νο. 51, 8ЕО ΙΌ Νο. 62 и 8ЕО ΙΌ Νο. 63. Предпочтительно нуклеотидная последовательность может иметь 80% или более, предпочтительно 85% или более, более предпочтительно 90% или более и даже более предпочтительно 95% или более идентичность с одной или более последовательностями, представленными как 8ЕО ΙΌ Νο. 49, 8ЕО ΙΌ Νο. 50, 8ЕО ΙΌ Νο. 51, 8ЕО ΙΌ Νο. 62 и 8ЕЕ) ΙΌ Νο. 63.

В одном воплощении нуклеотидная последовательность, кодирующая фермент липидацилтрансферазу для использования в любом из способов или применений настоящего изобретения, представляет собой нуклеотидную последовательность, которая обладает 70% или более, 75% или более, 80% или более, предпочтительно 85% или более, более предпочтительно 90% или более и даже более предпочтительно 95% или более идентичностью с последовательностью, которая представлена как 8ЕО ΙΌ Νο. 49.

Предпочтительно фермент липидацилтрансфераза для использования в одном из способов и/или применений настоящего изобретения может представлять собой липидацилтрансферазу, которая включает одну или более из следующих аминокислотных последовательностей:

(ί) аминокислотную последовательность, которая представлена как 8ЕО ΙΌ Νο. 68;

(ίί) аминокислотную последовательность, которая представлена как 8ЕО ΙΌ Νο. 3;

(ш) аминокислотную последовательность, которая представлена как 8ЕО ΙΌ Νο. 4;

(ίν) аминокислотную последовательность, которая представлена как 8ЕО ΙΌ Νο. 5;

(ν) аминокислотную последовательность, которая представлена как 8ЕО ΙΌ Νο. 6;

(νί) аминокислотную последовательность, которая представлена как 8ЕО ΙΌ Νο. 7;

(νίί) аминокислотную последовательность, которая представлена как 8ЕО ΙΌ Νο. 8;

(νίίί) аминокислотную последовательность, которая представлена как 8ЕО ΙΌ Νο. 9;

(ίχ) аминокислотную последовательность, которая представлена как 8ЕО ΙΌ Νο. 10;

(х) аминокислотную последовательность, которая представлена как 8ЕО ΙΌ Νο. 11;

(χί) аминокислотную последовательность, которая представлена как 8ЕО ΙΌ Νο. 12;

(χίί) аминокислотную последовательность, которая представлена как 8ЕО ΙΌ Νο. 13;

(χίίί) аминокислотную последовательность, которая представлена как 8ЕО ΙΌ Νο. 14; (χίν) аминокислотную последовательность, которая представлена как 8ЕО ΙΌ Νο. 1; (χν) аминокислотную последовательность, которая представлена как 8ЕО ΙΌ Νο. 15; (χνί) аминокислотную последовательность, которая представлена как 8ЕО ΙΌ Νο. 16: (χνίί) аминокислотную последовательность, которая представлена как 8ЕО ΙΌ Νο. 17; (χνίίί) аминокислотную последовательность, которая представлена как 8ЕО ΙΌ Νο. 18; (χίχ) аминокислотную последовательность, которая представлена как 8ЕО ΙΌ Νο. 34;

(хх) аминокислотную последовательность, которая представлена как 8ЕО ΙΌ Νο. 35 или аминокислотную последовательность, которая обладает 75, 80, 85, 90, 95, 98% или более идентич

- 19 020035 ностью с одной или более последовательностями, которые представлены как 8ΕΟ ΙΌ Νο. 68, 5ΕΟ ΙΌ Νο. 1, 5ΕΟ ΙΌ Νο. 3, 5ΕΤ) ΙΌ Νο. 4, 5ΕΤ) ΙΌ Νο. 5, 5ΕΤ) ΙΌ Νο. 6, 5ΕΤ) ΙΌ Νο. 7, 5ΕΤ) ΙΌ Νο. 8, 5ΕΤ) ΙΌ Νο. 9, 5ΕΤ) ΙΌ Νο. 10, 5ΕΤ) ΙΌ Νο. 11, 5ΕΤ) ΙΌ Νο. 12, 5ΕΤ) ΙΌ Νο. 13, 5ΕΤ) ΙΌ Νο. 14 или 5ΕΤ) ΙΌ Νο. 15, 5ΕΤ) ΙΌ Νο. 16, 5ΕΤ) ΙΌ Νο. 17, 5ΕΤ) ΙΌ Νο. 18, 5ΕΤ) ΙΌ Νο. 34 или 5ΕΤ) ΙΌ Νο. 35.

Предпочтительно фермент липидацилтрансфераза для использования в любом из способов или применений настоящего изобретения может представлять собой липидацилтрансферазу, которая включает либо аминокислотную последовательность, которая представлена как 8ΕΟ ΙΌ Νο. 68, или как 8ΕΟ ΙΌ Νο. 3, или как 8ΕΟ ΙΌ Νο. 4, или 8ΕΟ ΙΌ Νο. 1, или 8ΕΟ ΙΌ Νο. 15, или 8ΕΟ ΙΌ Νο. 16, или 8ΕΟ ΙΌ Νο. 34, или 8ΕΟ ΙΌ Νο. 35, или включает аминокислотную последовательность, которая обладает 75% или более, предпочтительно 80% или более, предпочтительно 85% или более, предпочтительно 90% или более, предпочтительно 95% или более идентичностью с аминокислотной последовательностью, которая представлена как 8ΕΟ ΙΌ Νο. 68, или аминокислотной последовательностью, которая представлена как 8ΕΟ ΙΌ Νο. 3, или аминокислотной последовательностью, которая представлена как 8ΕΟ ΙΌ Νο. 4, или аминокислотной последовательностью, которая представлена как 8ΕΟ ΙΌ Νο. 1, или аминокислотной последовательностью, которая представлена как 8ΕΟ ΙΌ Νο. 15, или аминокислотной последовательностью, которая представлена как 8ΕΟ ΙΌ Νο. 16, или аминокислотной последовательностью, которая представлена как 8ΕΟ ΙΌ Νο. 34, или аминокислотной последовательностью, которая представлена как 8ΕΟ ΙΌ Νο. 35.

Предпочтительно фермент липидацилтрансфераза для использования в одном из способов и/или применений настоящего изобретения может представлять собой липидацилтрансферазу, которая включает аминокислотную последовательность, которая обладает 80% или более, предпочтительно 85% или более, более предпочтительно 90% или более и даже более предпочтительно 95% или более идентичностью с одной или более последовательностями, которые представлены как 8ΕΟ ΙΌ Νο. 68, 8ΕΟ ΙΌ Νο. 3, 5ΕΤ) ΙΌ Νο. 4, 5ΕΤ) ΙΌ Νο. 5, 5ΕΤ) ΙΌ Νο. 6, 5ΕΤ) ΙΌ Νο. 7, 5ΕΤ) ΙΌ Νο. 8, 5ΕΤ) ΙΌ Νο. 9, 5ΕΤ) ΙΌ Νο. 10, 5ΕΤ) ΙΌ Νο. 11, 5ΕΤ) ΙΌ Νο. 12, 5ΕΤ) ΙΌ Νο. 13, 5ΕΤ) ΙΌ Νο. 14, 5ΕΤ) ΙΌ Νο. 1, 5ΕΤ) ΙΌ Νο. 15, 5ΕΤ) ΙΌ Νο. 16, 5ΕΤ) ΙΌ Νο. 17, 5ΕΤ) ΙΌ Νο. 18, 5ΕΤ) ΙΌ Νο. 34 или 5ΕΤ) ΙΌ Νο. 35.

(a) аминокислотную последовательность, которая представлена как аминокислотные остатки 1-100 5ΕΤ) ΙΌ Νο. 3 или 5ΕΤ) ΙΌ Νο. 1;

(b) аминокислотную последовательность, которая представлена как аминокислотные остатки 101-200 5ΕΤ) ΙΌ Νο. 3 или 5ΕΤ) ΙΌ Νο. 1;

(c) аминокислотную последовательность, которая представлена как аминокислотные остатки 201-300 5ΕΤ) ΙΌ Νο. 3 или 5ΕΤ) ΙΌ Νο. 1; или (б) аминокислотную последовательность, которая обладает 75% или более, предпочтительно 85% или более, более предпочтительно 90% или более, даже более предпочтительно 95% или более идентичностью с любой одной из аминокислотных последовательностей, определенных в (а)-(с), как указано выше.

Предпочтительно фермент липидацилтрансфераза для использования в способах и применениях настоящего изобретения может включать одну или более из следующих аминокислотных последовательностей:

(а) аминокислотную последовательность,	которая	представлена	как	аминокислотные	остатки
28-39 5ΕΤ) ΙΌ Νο. 3 или 5ΕΤ) ΙΌ Νο. 1; (Ь) аминокислотную последовательность,	которая	представлена	как	аминокислотные	остатки
77-88 5ΕΤ) ΙΌ Νο. 3 или 5ΕΤ) ΙΌ Νο. 1; (с) аминокислотную последовательность,	которая	представлена	как	аминокислотные	остатки
126-136 5ΕΤ) ΙΌ Νο. 3 или 5ΕΤ) ΙΌ Νο. 1; (б) аминокислотную последовательность,	которая	представлена	как	аминокислотные	остатки
163-175 5ΕΤ) ΙΌ Νο. 3 или 5ΕΤ) ΙΌ Νο. 1; (е) аминокислотную последовательность,	которая	представлена	как	аминокислотные	остатки

304-311 5ΕΤ) ΙΌ Νο. 3 или 5ΕΤ) ΙΌ Νο. 1; или (ί) аминокислотную последовательность, которая обладает 75% или более, предпочтительно 85% или более, более предпочтительно 90% или более, даже более предпочтительно 95% или более идентичностью с любой одной из аминокислотных последовательностей, определенных в (а)-(е), как указано выше.

В одном аспекте фермент липидацилтрансфераза для использования в одном из способов и/или применений настоящего изобретения представляет собой липидацилтрансферазу, которая может представлять собой липидацилтрансферазу из Сапб|ба ραΓαρκίΙοκίκ. описанную в ЕР 1275711. Таким образом, в одном аспекте липидацилтрансфераза для использования в способе и применениях настоящего изобретения может представлять собой липидацилтрансферазу, включающую одну из аминокислотных последовательностей, показанных в 8ΕΟ ΙΌ Νο. 17 или 8ΕΟ ΙΌ Νο. 18.

- 20 020035

Еще более предпочтительно когда фермент липидацилтрансфераза для использования в любом из способов или применений настоящего изобретения представляет собой липидацилтрансферазу, которая может являться липидацилтрансферазой, включающей аминокислотную последовательность, которая представлена как 8ЕО ΙΌ Νο. 16, или аминокислотную последовательность, которая обладает 75% или более, предпочтительно 85% или более, более предпочтительно 90% или более, даже более предпочтительно 95% или более, даже более предпочтительно 98% или более или даже более предпочтительно 99% или более идентичностью с 8Е0 ΙΌ Νο. 16. Такой фермент может рассматриваться в качестве варианта фермента.

В одном аспекте фермент липидацилтрансфераза для использования в одном из способов и/или применений настоящего изобретения представляет собой липидацилтрансферазу, которая может являться лецитин:холестерин ацилтрансферазой (ЬСЛТ) или ее вариантом (например, вариантом, полученным с помощью молекулярной эволюции).

Приемлемые ЬСЛТ являются известными в области техники и могут быть получены из одного или более следующих организмов, например: млекопитающих, крыс, мышей, кур, ОгоюрНПа те1апода81ет, растений, включая ЛтаЫйор818 и Ογυζ;·! зайуа, нематод, грибов и дрожжей.

В одном воплощении фермент липидацилтрансфераза для использования в одном из способов и/или применений настоящего изобретения представляет собой липидацилтрансферазу, которая может являться липидацилтрансферазой, получаемой, предпочтительно полученной, из штаммов Е.со11 ТΟР 10, которые несут рРсШаЛНубго и рРе112аЛ8а1то, депонированных Оатзсо А/8,ЕапдеЬгодайе 1, ΌΚ-1001 СорепНадеп Κ, Эептагк в соответствии с Будапештским договором о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры при Национальной коллекции промышленных, морских и пищевых бактерий (ΝΟΜΒ) 23 81. МасНаг 81гее(, АЬегбееп 8со11апй, СВ 22 декабря 2003 г. под депозитными номерами Νί’ΙΜΒ 41204 и Νί’ΙΜΒ 41205 соответственно.

Фермент липидацилтрансфераза для использования в одном из способов и/или применений настоящего изобретения может представлять собой фосфолипид глицеринацилтрансферазу. Фосфолипид глицеринацилтрансферазы включают те, что изолированы из Аетотопаз зрр., предпочтительно из Аетотопаз НуйгорНПа или А.8а1тошс1ба, наиболее предпочтительно из А.8а1тошсИа или их варианты.

Наиболее предпочтительно липидацилтрансферазы для использования в настоящем изобретении кодируются 8ЕО ΙΌ №. 1, 3, 4, 15, 16, 34 и 35. При этом специалисту в данной области техники будет понятно, что является предпочтительным, когда сигнальные пептиды ацилтрансферазы были вырезаны во время экспрессии трансферазы. Сигнальный пептид последовательностей 8ЕО ΙΌ Но. 1, 3, 4, 15 и 16 представляет собой аминокислоты 1-18. Таким образом, наиболее предпочтительные участки представляют собой аминокислоты 19-335 для 8ЕО ΙΌ Ко. 1 и 8ЕО ΙΌ Ко. 3 (А.йуйторйШа) и аминокислоты 19336 для 8ЕО ΙΌ №. 4, 8ЕО ΙΌ №. 15 и 8ЕО ΙΌ №. 16. (А.8а1тошсИа). При использовании для определения гомологии или идентичности аминокислотных последовательностей является предпочтительным, чтобы при выравниваниях, как описано в данном изобретении, использовалась зрелая последовательность.

В одном воплощении липидацилтрансфераза для использования в настоящем изобретении предпочтительно включает (или состоит из) аминокислотную последовательность, показанную в 8ЕО ΙΌ №. 16, или включает (или состоит из) аминокислотную последовательность, которая обладает по крайней мере 70%, по крайней мере 75%, по крайней мере 85%, по крайней мере 90%, по крайней мере 95%, по крайней мере 98% идентичностью с 8ЕО ΙΌ №. 16.

В одном воплощении липидацилтрансфераза для использования в настоящем изобретении предпочтительно кодируется нуклеотидной последовательностью, кодирующей аминокислотную последовательность, включающую (или состоящую из) аминокислотную последовательность, показанную в 8ЕО ΙΌ №. 68, или включающей (или состоящей из) аминокислотную последовательность, которая обладает по крайней мере 70%, по крайней мере 75%, по крайней мере 85%, по крайней мере 90%, по крайней мере 95%, по крайней мере 98% идентичностью с 8ЕО ΙΌ №. 68.

Таким образом, наиболее предпочтительные участки для определения (идентичности) представляют собой аминокислоты 19-335 для 8ЕО ΙΌ №. 1 и 3 (А.йуйторйШа) и аминокислоты 19-336 для 8ЕО ΙΌ №. 4, 15 и 16 (А.8а1тошс1ба). Последовательности 8ЕО ΙΌ №. 34 и 35 представляют собой последовательности зрелого белка липидацилтрансферазы из А.йуйгорЫйа и А.8а1тошс1ба соответственно, которые могут подвергаться или могут не подвергаться дальнейшей посттрансляционной модификации.

Фермент липидацилтрансфераза для использования в любом из способов или применений настоящего изобретения может представлять собой липидацилтрансферазу, которая также может быть изолирована из ТНегтоЫПйа, предпочтительно Т.Гнхса, наиболее предпочтительно ту, которая кодируется 8ЕО ΙΌ №. 28.

Приемлемые липидацилтрансферазы для использования в соответствии с настоящим изобретением и/или в способах настоящего изобретения могут включать любую из следующих аминокислотных последовательностей и/или кодируются следующими нуклеотидными последовательностями:

а) нуклеиновой кислотой, которая кодирует полипептид, демонстрирующий липидцилтрансферазную активность и является по крайней мере на 70% идентичным (предпочтительно по крайней мере на

- 21 020035

80%, более предпочтительно по крайней мере на 90% идентичным) полипептидной последовательности, показанной в 8ЕО ГО Νο. 16, или полипептиду, показанному в 8Е0 ГО Νο. 68;

b) (изолированный) полипептид, включающий (или состоящий из) аминокислотную последовательность, как показано в 8Е0 ГО Νο. 16 или 8Е0 ГО Νο. 68, или аминокислотную последовательность, которая явяется по крайней мере на 70% идентичной (предпочтительно по крайней мере на 80% идентичной, более предпочтительно по крайней мере на 90% идентичной) последовательности 8ЕО ГО Νο. 16 или 8ЕО ГО Νο. 68;

c) нуклеиновой кислотой, кодирующей липидацилтрансферазу, где нуклеиновая кислота включает (или состоит из) нуклеотидную последовательность, которая представлена как 8ЕО ГО Νο. 49, или нуклеотидную последовательность, которая является по крайней мере на 70% идентичной (предпочтительно по крайней мере на 80%, более предпочтительно по крайней мере на 90% идентичной) нуклеотидной последовательности, которая представлена как 8ЕО ГО Νο. 49;

ά) нуклеиновой кислотой, которая гибридизуется при условиях средней и высокой жесткости с образцом нуклеиновой кислоты, включающим нуклеотидную последовательность, которая представлена как 8ЕО ГО Νο. 49 и кодирует полипептид, демонстрирующий липидацилтрансферазную активность;

е) нуклеиновой кислотой, которая представляет собой фрагмент последовательностей нуклеиновой кислоты, указанных в а), с) или ά); или

ί) полипептид, который представляет собой фрагмент полипептида, указанного в Ь).

Фермент липидацилтрансфераза для использования в любом из способов или применений настоящего изобретения может представлять собой липидацилтрансферазу, которая также может быть изолированной из ЗЕерЮтусех, предпочтительно 8.ауегшй18, наиболее предпочтительно такую, которая кодируется 8ЕО ГО Νο. 32. Другие возможные ферменты из Зй’ерФшусек для использования в настоящем изобретении включают такие, которые кодируются последовательностями 8ЕО ГО Νο. 5, 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 31 и 33.

Фермент для использования в данном изобретении может также быть изолированным из ί'οΐΎΐκ^κ^πιιιη. предпочтительно С.еЕйаеик, наиболее предпочтительно таким, который кодируется 8ЕО ГО Νο. 29.

Предпочтительно фермент липидацилтрансфераза для использования в одном из способов и/или применений настоящего изобретения может представлять собой липидацилтрансферазу, которая включает какую-либо из аминокислотных последовательностей, которые представлены как 8ЕО ГО Νο. 37, 38, 40, 41, 43, 45 или 47, или аминокислотную последовательность, которая обладает с ней по крайней мере 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97 или 98% идентичностью, или может кодироваться какой-либо из нуклеотидных последовательностей, которые представлены как 8ЕО ГО Νο. 36, 39, 42, 44, 46, или 48, или нуклеотидной последовательностью, которая обладает с ней по крайней мере 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97 или 98% идентичностью.

В одном воплощении нуклеотидная последовательность, кодирующая фермент липидацилтрансферазу для использования в одном из способов и/или применений настоящего изобретения, выбирается из группы, которая состоит из:

a) нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность, показанную в 8ЕЕ) ГО Νο. 36;

b) нуклеиновой кислоты, которая является родственной с нуклеотидной последовательностью 8ЕО ГО Νο. 36 с учетом вырожденности генетического кода;

c) нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность, которая обладает по крайней мере 70% идентичностью с нуклеотидной последовательностью, показанной в 8ЕО ГО Νο. 36.

В одном воплощении фермент липидацилтрансфераза для использования в одном из способов и/или применений настоящего изобретения представляет собой липидацилтрансферазу, которая включает аминокислотную последовательность, как показано в 8ЕО ГО Νο. 37, или аминокислотную последовательность, которая обладает с ней по крайней мере 60% идентичностью.

В дополнительном воплощении фермент липидацилтрансфераза для использования в одном из способов и/или применений настоящего изобретения может представлять собой липидацилтрансферазу, которая включает одну или более аминокислотных последовательностей, которые представлены как 8ЕО ГО Νο. 37, 38, 40, 41, 43, 45 или 47, или аминокислотную последовательность, которая обладает с ней по крайней мере 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97 или 98% идентичностью, или может кодироваться одной или более из нуклеотидных последовательностей, которые представлены как 8ЕО ГО Νο. 39, 42, 44, 46 или 48, или нуклеотидной последовательностью, которая обладает с ней по крайней мере 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97 или 98% идентичностью.

В дополнительном воплощении фермент липидацилтрансфераза для использования в одном из способов и/или применений настоящего изобретения может представлять собой липидацилтрансферазу, которая включает одну из аминокислотных последовательностей, которые представлены как 8ЕО ГО Νο. 38, 40, 41, 45 или 47, или аминокислотную последовательность, которая обладает с ней по крайней мере 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97 или 98% идентичностью, для применений, описанных в данном изобретении.

- 22 020035

В дополнительном воплощении липидацилтрансфераза для использования в одном из способов и/или применений настоящего изобретения может представлять собой липидацилтрансферазу, которая включает одну из аминокислотных последовательностей, которые представлены как 8Е0 ГО Ыо. 38, 40 или 47, или аминокислотную последовательность, которая обладает с ней по крайней мере 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97 или 98% идентичностью, для применений, описанных в данном изобретении.

Более предпочтительно в одном воплощении липидацилтрансфераза для использования в одном из способов и/или применений настоящего изобретения может представлять собой липидацилтрансферазу, которая включает аминокислотную последовательность, которая представлена как 8ЕО ГО Ыо. 47, или аминокислотную последовательность, которая обладает с ней по крайней мере 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97 или 98% идентичностью.

В другом воплощении липидацилтрансфераза для использования в любом из способов или применений настоящего изобретения может представлять собой липидацилтрансферазу, включающую аминокислотную последовательность, которая представлена как 8ЕО ГО Ыо. 43 или 44, или аминокислотную последовательность, которая обладает с ней по крайней мере 80, 85, 90, 95, 96, 97 или 98% идентичностью.

В другом воплощении липидацилтрансфераза для использования в любом из способов или применений настоящего изобретения может представлять собой липидацилтрансферазу, которая включает аминокислотную последовательность, которая представлена как 8ЕО ГО Ыо. 41, или аминокислотную последовательность, которая обладает по крайней мере 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97 или 98% идентичностью с ней.

В одном воплощении липидацилтрансфераза для использования в любом из способов или применений настоящего изобретения может кодироваться нуклеиновой кислотой, выбранной из группы, состоящей из:

a) нуклеиновой кислоты, которая включает нуклеотидную последовательность, показанную в БЕС) ГО Ыо. 36;

b) нуклеиновой кислоты, которая является родственной с нуклеотидной последовательностью 8ЕО ГО Ыо. 36 с учетом вырожденности генетического кода; и

c) нуклеиновой кислоты, которая включает нуклеотидную последовательность, которая обладает по крайней мере 70% идентичностью с нуклеотидной последовательностью, показанной в 8ЕО ГО Ыо. 36.

В одном воплощении липидацилтрансфераза в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой липидацилтрансферазу, получаемую, предпочтительно полученную, из штаммов БИерЮтусех Ь130 или Ь131, депонированных Эап15со А/8 оГ ЬаидеЬтодайе 1, ЭК-1001 Сореийадеи К, Эеитагк в соответствии с Будапештским договором о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры при Национальной коллекции промышленных, морских и пищевых бактерий (ЫС1МВ) 23 81. Масйаг 81гееС АЬетбееи БсоОапй, СВ 25 июня 2004 г., под депозитными номерами ЫС1МВ 41226 и ЫС1МВ 41227 соответственно.

Приемлемые нуклеотидные последовательности, кодирующие липидацилтрансферазу для использования в одном из способов и/или применений настоящего изобретения, могут представлять собой полинуклеотид, кодирующий липидацилтрансферазу (8ЕО ГО Ыо. 16 или 8ЕО ГО Ыо. 68); или могут кодировать аминокислотную последовательность липидацилтрансферазы (8ЕО ГО Ыо. 16 или 8ЕО ГО Ыо. 68).

Приемлемые липидацилтрансферазы для использования в одном из способов и/или применений настоящего изобретения могут представлять собой аминокислотную последовательность, которая может быть идентифицирована путем выравнивания с Ь131 (8ЕО ГО Ыо. 37) последовательностью при использовании АНдп X, С1и81а1 алгоритма попарного выравнивания Уес1ог ЫТ1 при использовании параметров по умолчанию.

Выравнивание Ь131 и гомологов из Б.ауеттйШк и Т.Гикса иллюстрирует, что сохранение 6Ό8Χ мотива (СЭ8У в Ь131 и Б.ауеттйШк и Т.Гикса), САЫЭУ блока, который представляет собой либо 66Ы0А, либо ССЫОЬ, и НРТ блока (считается консервативным каталитическим гистидином). Эти три консервативных блока являются выделенными на фиг. 42.

При выравнивании или с рГат рГат00657 консенсусной последовательностью (как описано в \УО 04/064987) и/или с Ь131 последовательностью, раскрытой в данном описании (8ЕО ГО Ыо. 37), является возможным идентифицировать три консервативных участка, СЭ8Х блок, САЫЭУ блок и НТР блок (см. \УО 04/064987 для дополнительной информации).

При выравнивании или с рГат рГат00657 консенсусной последовательностью (как описано в \УО 04/064987) и/или с Ь131 последовательностью, раскрытой в данном описании (8ЕО ГО Ыо. 37):

ί) липидацилтрансфераза для использования в любом из способов или применений настоящего изобретения может представлять собой липидацилтрансферазу, которая содержит ΟΌ8Χ мотив, более предпочтительно ΟΌ8Χ мотив, выбранный из СЭББ или СЭ8У мотива; и/или ίί) липидацилтрансфераза для использования в любом из способов или применений настоящего изобретения может представлять собой липидацилтрансферазу, которая содержит САЫЭУ блок, более предпочтительно САЫЭУ блок, включающий амино ССЫЭх, более предпочтительно ССЫЭА или 66ЫЭЬ; и/или

- 23 020035 ίίί) липидацилтрансфераза для использования в любом из способов или применений настоящего изобретения может представлять собой липидацилтрансферазу, которая содержит предпочтительно НТР блок; предпочтительно ίν) липидацилтрансфераза для использования в любом из способов или применений настоящего изобретения может представлять собой липидацилтрансферазу, которая содержит предпочтительно ΟΌ8Χ или ΟΌ8Υ мотив, и ΟΑΝΏΥ блок, включающий амино ΟΟΝΏχ, предпочтительно ΟΟΝΏΑ или ΟΟΝΏΕ, и НТР блок (консервативный гистидин).

В одном варианте выполнения фермент в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно не является ферментом фосфолипазой, таким как фосфолипаза А1, классифицированная как Е.С. 3.1.1.32, или фосфолипаза А2, классифицированная как Е.С. 3.1.1.4.

Вариант липидацилтрансферазы.

В предпочтительном воплощении нуклеотидная последовательность, кодирующая липидацилтрансферазу для использования в одном из способов и/или применений настоящего изобретения, может кодировать липидацилтрансферазу, которая представляет собой вариант липидацилтрансферазы.

Могут использоваться варианты, которые обладают повышенной активностью по отношению к фосфолипидам, такой как повышенная гидролитическая активность и/или повышенная трансферазная активность, предпочтительно повышенная трансферазная активность по отношению к фосфолипидам.

Предпочтительно вариант липидацилтрансферазы получают с помощью одной или более модификаций аминокислот липидацилтрансфераз, как определено в данном описании выше.

Предпочтительно липидацилтрансфераза для использования в любом из способов или применений настоящего изобретения может представлять собой липидацилтрансферазу, которая может быть вариантом липидацилтрансферазы, в случае чего фермент может быть охарактеризован тем, что фермент включает аминокислотный мотив ΟΌ8Χ, в данном описании X представляет собой один или более из следующих аминокислотных остатков: Ь, А, V, I, Р, Υ, Н, О, Т, Ν, М или 8, и в данном описании вариант фермента включает одну или более модификаций аминокислот по сравнению с исходной последовательностью в каком-либо одном или более аминокислотных остатков, определенных в наборе 2, или наборе 4, или наборе 6, или наборе 7 (как определено в \О 2005/066347 и в данном описании ниже).

Например, вариант липидацилтрансферазы может быть охарактеризован тем, что фермент включает аминокислотный мотив ΟΌ8Χ, в данном описании X, который представляет собой один или более из следующих аминокислотных остатков: Ь, А, V, I, Р, Υ, Н, О, Т, Ν, М или 8, и в данном описании вариант фермента включает одну или более модификаций аминокислот по сравнению с исходной последовательностью в каком-либо одном или более аминокислотных остатках, определенных в наборе 2, или наборе 4, или наборе 6, или наборе 7 (как определено в \О 2005/066347 и в данном описании ниже), идентифицированном с помощью указанной исходной аминокислотной последовательности, являющейся структурно выровненной со структурной моделью Р10480, определенной в данном описании, которая является предпочтительно полученной с помощью структурного выравнивания Р10480 координат кристаллической структуры с ПУКРЭВ и/или 1ОЕО.РЭВ, как определено в \О 2005/066347 и в данном описании ниже.

В дополнительном воплощении липидацилтрансфераза для использования в одном из способов и/или применений настоящего изобретения может представлять собой вариант липидацилтрансферазы, который может быть охарактеризован тем, что фермент включает аминокислотный мотив ΟΌ8Χ, в данном описании X представляет собой один или более из следующих аминокислотных остатков: Ь, А, V, I, Р, Υ, Н, О, Т, Ν, М или 8, и в данном описании вариант фермента включает одну или более модификаций аминокислот по сравнению с исходной последовательностью в каком-либо одном или более аминокислотных остатков, определенных в наборе 2, идентифицированном тогда, когда указанная исходная последовательность является выровненной с р£ат консенсусной последовательностью (8ΕΟ ΙΌ №. 2, фиг. 3) и модифицированной в соответствии со структурной моделью Р10480 для обеспечения наибольшего соответствия перекрывания, как определено в \О 2005/066347 и в данном описании ниже.

Предпочтительно липидацилтрансфераза для использования в любом из способов или применений настоящего изобретения может представлять собой вариант фермента липидацилтрансферазы, который может включать аминокислотную последовательность, где аминокислотная последовательность представляет собой такую, которая представлена как 8ΕΟ ΙΌ №. 68, 8ΕΟ ΙΌ №. 16, 8ΕΟ ΙΌ №. 34, 8ΕΟ ΙΌ №. 3, 8ΕΟ ΙΌ №. 4, 8ΕΟ ΙΌ №. 5, 8ΕΟ ΙΌ №. 6, 8ΕΟ ΙΌ №. 7, 8ΕΟ ΙΌ №. 8, 8ΕΟ ΙΌ №. 9, 8ΕΟ ΙΌ №. 10, 8ΕΟ ΙΌ №. 11, 8ΕΟ ΙΌ №. 12, 8ΕΟ ΙΌ №. 13, 8ΕΟ ΙΌ №. 14, 8ΕΟ ΙΌ №. 1, 8ΕΟ ΙΌ №. 15, 8ΕΟ ΙΌ №. 25, 8ΕΟ ΙΌ №. 26, 8ΕΟ ΙΌ №. 27, 8ΕΟ ΙΌ №. 28, 8ΕΟ ΙΌ №. 29, 8ΕΟ ΙΌ №. 30, 8ΕΟ ΙΌ №. 32, 8ΕΟ ΙΌ №. 33 или 8ΕΟ ΙΌ №. 35, за исключением одной или более модификаций аминокислот в одном или более аминокислотных остатков, определенных в наборе 2, или наборе 4, или наборе 6, или наборе 7 (как определено в \О 2005/066347 и в данном описании ниже), идентифицированном с помощью выравнивания последовательности с 8ΕΟ ΙΌ №. 34.

Альтернативно, липидацилтрансфераза может представлять собой вариант фермента липидацилтрансферазы, включающий аминокислотную последовательность, где аминокислотная после

- 24 020035 довательность представляет собой такую, которая представлена как 8Ер ΙΙ) Νο. 34, 8Ер ΙΙ) Νο. 3, 8Ш ΙΌ Νο. 4, 8Ш ΙΌ Νο. 5, 8ЕР ΙΌ Νο. 6, 8Ш ΙΌ Νο. 7, 8Ш ΙΌ Νο. 8, 8Ш ΙΌ Νο. 9, 8Ш ΙΌ Νο. 10, 8Ш ΙΌ Νο. 11, 8Ш ΙΌ Νο. 12, 8Ш ΙΌ Νο. 13, 8Ш ΙΌ Νο. 14, 8Ш ΙΌ Νο. 1, 8Ш ΙΌ Νο. 15, 8Ш ΙΌ Νο. 25, 8Ш ΙΌ Νο. 26, 8Ш ΙΌ Νο. 27, 8Ш ΙΌ Νο. 28, 8Ш ΙΌ Νο. 29, 8Ш ΙΌ Νο. 30, 8ЕР ΙΌ Νο. 16, 8ЕР ΙΌ Νο. 68, 8ЕР ΙΌ Νο. 32, 8ЕР ΙΌ Νο. 33 или 8ЕР ΙΌ Νο. 35, за исключением одной или более модификаций аминокислот в одном или более аминокислотных остатков, определенных в наборе 2, или наборе 4, или наборе 6, или наборе 7, как определено в ШО 2005/066347 и в данном описании ниже, идентифицированном с помощью структурного выравнивания указанной исходной последовательности со структурной моделью Р10480, определенной в данном описании, которая является предпочтительно полученной с помощью структурного выравнивания координат кристаллической структуры Р10480 с 1ΙΥΝ.ΡΏΒ и/или ЮЕО.РЭВ, как описывается в ШО 2005/066347 и в данном описании ниже.

Альтернативно, липидацилтрансфераза может представлять собой вариант фермента липидацилтрансферазы, включающий аминокислотную последовательность, где аминокислотная последовательность представляет собой такую, которая представлена как 8Ер ΙΙ) Νο. 34, 8Ер ΙΙ) Νο. 3, 8Ш ΙΌ Νο. 4, 8Ш ΙΌ Νο. 5, 8ЕР ΙΌ Νο. 6, 8Ш ΙΌ Νο. 7, 8Ш ΙΌ Νο. 8, 8Ш ΙΌ Νο. 9, 8Ш ΙΌ Νο. 10, 8Ш ΙΌ Νο. 11, 8Ш ΙΌ Νο. 12, 8Ш ΙΌ Νο. 13, 8Ш ΙΌ Νο. 14, 8Ш ΙΌ Νο. 1, 8Ш ΙΌ Νο. 15, 8Ш ΙΌ Νο. 25, 8Ш ΙΌ Νο. 26, 8Ш ΙΌ Νο. 27, 8Ш ΙΌ Νο. 28, 8Ш ΙΌ Νο. 29, 8Ш ΙΌ Νο. 30, 8Ш ΙΌ Νο. 32, 8Ш ΙΌ Νο. 33, 8Ш ΙΌ Νο. 16, 8Ш ΙΌ Νο. 68 или 8ЕР ΙΌ Νο. 35, за исключением одной или более модификаций аминокислот в одном или более аминокислотных остатков, определенных в наборе 2, идентифицированном тогда, когда указанная исходная последовательность выравнивается с р1ат консенсусной последовательностью (8Ер ΙΙ) Νο. 2) и модифицируется в соответствии со структурной моделью Р10480 для обеспечения наибольшего соответствия перекрывания, как определено в ШО 2005/066347 и в данном описании ниже.

Предпочтительно исходный фермент представляет собой фермент, который включает или является гомологичным, аминокислотную последовательность, которая представлена как 8Ер ΙΙ) Νο. 34 и/или 8Ш И) Νο. 15 и/или 8Ер И) Νο. 35.

Предпочтительно липидацилтрансфераза может представлять собой вариант фермента, который включает аминокислотную последовательность, где аминокислотная последовательность представляет собой такую, которая представлена как 8Ер ΙΙ) Νο. 34 или 8Ер ΙΙ) Νο. 35, за исключением одной или более модификаций аминокислот в любом одном или более аминокислотных остатков, определенных в наборе 2, или наборе 4, или наборе 6, или наборе 7, как определено в ШО 2005/066347 и в данном описании ниже.

Определение наборов.

Аминокислотный набор 1.

Аминокислотный набор 1 (примечание: эти аминокислоты представляют собой таковые в 1ΙνΝ фиг. 53 и 54):

О1у8, Аар9, 8ег10, Ьеи11, 8ег12, Туг15, О1у44, Азр45, ТЬг46, С1и69, Ьеи70, С1у71, О1у72, А8п73, Аар74, С1у75, Ьеи76, О1пЮ6, Не 107, Аг§108, Ьеи109, Рго110, Туг113, РЬе121, РИе139, РЬе140, Ме1141, Туг145, МеП51, А§р154, ΗΪ8157, О1у155,11е156. Рго158

Высококонсервативные мотивы, такие как ΟΏ8Χ и каталитические остатки, отсеивали из набора 1 (остатки подчеркнуты). Во избежание сомнений, набор 1 определяет аминокислотные остатки в пределах 10 А центрального атома углерода глицерина в активном сайте 1ΙνΝ модели.

Аминокислотный набор 2.

Аминокислотный набор 2 (примечание: нумерация аминокислот относится к аминокислотам в зрелой последовательности Р10480):

Ьеи17, Ьуз22, Ме123, С1у40, Азп80, Рго81, Ьуз82, Азп87, Азп88, Тгр111, Уа1112, А1а114,

Туг117, Ьеи118, Рго156, О1у159, С1п160, Азп161, Рго162, 8ег163, А1а164, Аг§165, 8ег166, О1П167, Ьу5168, Уа1169, Уа1170, С1и171, А1а172, Туг179, ΗΪ3180, Азп181, Ме1209, Ьеи210, Аг§211, Азп215, Ьуз284, Ме1285, О1п289 и Уа1290.

- 25 020035

Таблица выбранных из набора 1 остатков по сравнению с набором 2.

ΙΥΝ модель	Номер остатка зрелой последовательности Р10480
ΐνΝ	А.ЬуН гомолог
	РРАМ	Структура
О1у8	С1у32
Азр9	АзрЗЗ
8ег10	8ег34
Ьеи11	Реи35		Ьеи17
8ег12	8ег36		8ег18
			Ьуз22 Ме123
Туг 15	О1у58		С1у40
С1у44	Азп98		Азп80
\| Азр45	Рго99		Рго81
ТЪг46	ЬузЮО		Ьуз82 Азп87
			Азп88
61и69	Тгр129		Тгр111
Ьеи70	Уа1130		Уа1112
О1у71	О1у131
О1у72	А1а132		А1а114
Азп73	Азп133
Азр74	Азр134
О1у75	Туг135		Туг117
Ьеи76	Ьеи136		Ьеи118
О1П106		Рго174	Рго156
Не 107		О1у177	О1у159
Аг§108		61п178	С1п160
Ьеи109		Азп179	Азп161
Рго110		180-190	Рго162
ТугИЗ			8ег163 А1а164
			Аг§165 8ег166
			С1П167 Ьуз168 Уа1169 Уа1170 О1и171 А1а172
РНе121	НЕ 198	Туг197	Туг179
		ΗΪ3198	ΗΪ3180
		Азп199	Азп181
Рке139	Ме1227		Ме1209
Рке140	Ьеи228		Ьеи210
МеН41	Аг§229		Аг§211
Туг145	Азп233		Азп215 Ьуз284
Ме1151	Ме1303		Ме1285
Азр154	АзрЗОб
С31у155	61пЗО7		С1п289
11е156	Уа13О8		Уа1290
ΗΪ3157	ΗΪ8309
Рго158	РгоЗЮ		__

Аминокислотный набор 3.

Аминокислотный набор 3 является идентичным набору 2, но относится к кодирующей последовательности Аеготопаз за1тотс1да (8Ер П) 4), т.е. номера аминокислотных остатков являются на 18 выше в наборе 3, поскольку это отражает отличие между нумерацией аминокислот в зрелом белке (8Ер П) 34) по сравнению с белком, включающим сигнальную последовательность (8Ер П) 25).

Зрелые белки Аеготопаз за1тотс1да ΟΏ8Χ (8Ер П) 4) и Аеготопаз йудгорййа ΟΏ8Χ (8Ер П) 34) отличаются пятью аминокислотами. Таковые представляют собой Т1г38ег, О1п182Буз, 01и309А1а, 8ег310Азп и О1у318-, где за1тотс1да остаток указывается первым, а йудгорййа остаток указывается последним. Белок йубгорййа имеет длину только 317 аминокислот и не содержит остатка в положении 318. Аеготопаз за1тотс1да ΟΏ8Χ имеет в значительной степени более высокую активность на полярных липидах, таких как субстраты на основе галактолипида, чем белок Аеготопаз йудгорййа. Сканирование сайтов осуществляли во всех пяти аминокислотных положениях.

Аминокислотный набор 4.

Аминокислотный набор 4 представляет собой 83, Р182, Е309, 8310 и -318.

Аминокислотный набор 5:

Р138, Ώ15Ν, 8180, 818Υ, Υ30Ρ, Ώ1 16Ν, П116Е, Ώ157Ν, Υ226Ρ, Ώ228Ν Υ230Ρ.

- 26 020035

Аминокислотный набор 6.

Аминокислотный набор 6 представляет собой

8егЗ, Ьеи17, Ьуз22, Ме123, С1у40, Азп80,

Рго81, Ьу§82, Азп 87, Αδη88, Тгр111, Уа1112, А1а114, Туг117, Ьеи118, Рго156, С1у159,

О1п160, А8П161, Рго162, 8ег163, А1а164, Аг§165, 8ег166, О1п167, Ьуз168, Уа1169,

Уа1170, О1и171, А1а172, Туг179, ΗΪ3180, Азп181, О1п182, Ме1209, Ьеи210, Аг§211,

Азп215, Ьуз284, Ме1285, О1п289, Уа1290, 61и309, 8ег310, -318.

Нумерация аминокислот в наборе 6 относится к аминокислотным остаткам в Р10480 (8ЕР ГО Νθ. 25) - соответствующие аминокислоты в других каркасных последовательностях могут быть определены с помощью гомологичного выравнивания и/или структурного выравнивания до Р10480 и/или 1ΐνΝ.

Аминокислотный набор 7.

Аминокислотный набор 7 представляет собой

8егЗ, Ьеи17, Ьуз22, Ме123, О1у40, Азп80,

Рго81, Ьуз82, Азп 87, Азп88, Тгр111, Уа1112, А1а114, Туг117, Ьеи118, Рго156, О1у159,

О1П160, А8П161, Рго162, 8ег163, А1а164, Аг_ё165, 8ег166, 61п167, Ьуз168, Уа1169,

Уа1170, О1и171, А1а172, Туг179, ΗΪ8180, Азп181, О1п182, Ме1209, Ьеи210, Аг§211,

Азп215, Ьуз284, Ме1285, О1п289, Уа1290, О1и309, 8ег310, -318, Υ30Χ (где X является выбранным из А, С, Ό, Е, О, Н, I, К, Ь, Μ, Ν, Р, р, К, 8, Т, V или ^), Υ226Χ (где X является выбранным из А, С, Ό, Е, О, Н, I, К, Ь, Μ, Ν, Р, Р, К, 8, Т, V или ^), Υ230Χ (где X является выбранным из А, С, Ό, Е, О, Н, I, К, Ь, Μ, Ν, Р, Р, К, 8, Т, V или ^), 818Х (где X является выбранным из А, С, Ό, Е, Р, Н, I, К, Ь, Μ, Ν, Р, Ω, К, Т, или Υ), ^157X (где X является выбранным из А, С, Е, Р, О, Н, I, К, Ь, Μ, Р, р, К, 8, Т, V, или Υ).

Нумерация аминокислот в наборе 6 относится к аминокислотным остаткам в Р10480 (8ЕР ГО Νθ. 25) - соответствующие аминокислоты в других каркасных последовательностях могут быть определены с помощью гомологичного выравнивания и/или структурного выравнивания до Р10480 и/или 1^.

Предпочтительно вариант фермента включает одну или более из следующих модификаций аминокислот по сравнению с исходным ферментом:

83Е, А, О, К, Μ, Υ, К, Р, Ν, Т или О;

Е309Р, К или А, предпочтительно Р или К;

-318Υ, Н, 8 или Υ, предпочтительно Υ.

Предпочтительно X О^8X мотив представляет собой Ь. Таким образом, предпочтительно исходный фермент включает аминокислотный мотив СГО8Р.

Предпочтительно указанная первая исходная липидацилтрансфераза может включать любую из следующих аминокислотных последовательностей: 8ЕР ГО Νθ. 34, 8ЕР ГО Νθ. 3, 8ЕР ГО Νθ. 4, 8Ер ГО Νθ. 5, 8Ер ГО Νθ. 6, 8Ер ГО Νθ. 7, 8Ер ГО Νθ. 8, 8Ер ГО Νθ. 9, 8Ер ГО Νθ. 10, 8Ер ГО Νθ. 11,

8Ер ГО Νθ. 12, 8Ер ГО Νθ. 13, 8Ер ГО Νθ. 14, 8Ер ГО Νθ. 1, 8Ер ГО Νθ. 15, 8Ер ГО Νθ.25,

8Ер ГО Νθ. 26, 8Ер ГО Νθ. 27, 8Ер ГО Νθ. 28, 8Ер ГО Νθ. 29, 8Ер ГО Νθ. 30, 8Ер ГО Νθ.32,

8Ер ГО Νθ. 33 или 8Ер ГО Νθ. 35.

Предпочтительно указанная вторая родственная липидацилтрансфераза может включать любую из следующих аминокислотных последовательностей: 8ЕР ГО Νθ. 3, 8ЕР ГО Νθ. 34, 8ЕР ГО Νθ.4,

8Ер ГО Νθ. 5, 8Ер ГО Νθ. 6, 8Ер ГО Νθ. 7, 8Ер ГО Νθ. 8, 8Ер ГО Νθ. 9, 8Ер ГО Νθ. 10, 8Ер ГО Νθ.11,

8Ер ГО Νθ. 33 или 8Ер ГО Νθ. 35.

Вариант фермента должен включать по крайней мере одну аминокислотную модификацию по сравнению с исходным ферментом. В некоторых воплощениях вариант фермента может включать по крайней мере 2, предпочтительно по крайней мере 3, предпочтительно по крайней мере 4, предпочтительно по крайней мере 5, предпочтительно по крайней мере 6, предпочтительно по крайней мере 7, предпочтительно по крайней мере 8, предпочтительно по крайней мере 9, предпочтительно по крайней мере 10 модификаций аминокислот по сравнению с исходным ферментом.

При ссылке на специфические аминокислотные остатки в данном описании представляет собой такую, полученную из выравнивания вариантной последовательности со стандартной последовательностью, которая представлена как 8ЕР ГО Νθ. 34 или 8ЕР ГО Νθ. 35.

В одном аспекте вариант фермента предпочтительно включает одну или более из следующих замен аминокислот:

- 27 020035

83А, С, ϋ, Е, Р, О, Η, I, К, Ь, Μ, Ν, Р, (}, к, Т, V, XV или Υ; и/или

Ы7А, С, ϋ, Е, Р, С, Η, I, К, Μ, Ν, Р, (}, к, 8, Т, V, V/ или Υ; и/или

818А, С, ϋ, Е, Р, Η, I, К, к, Μ, Ν, Р, (}, К, Т, XV или Υ; и/или

К22А, С, ϋ, Е, Р, 6, Η, I, к, Μ, Ν, Р, 9, к, 8, Т, V, XV или Υ; и/или

М23А, С, Ό, Е, Р, О, Η, I, К, Ь, Ν, Р, (}, К, 8, Т, V, XV или Υ; и/или

Υ30Α, С, ϋ, Е, О, Η, I, К, к, Μ, Ν, Р, 0, к, 8, Т, V или XV; и/или

О40А, С, ϋ, Е, Р, Η, I, К, к, Μ, Ν, Р, (}, к, 8, Т, V, XV или Υ; и/или

Ν80Α, С, О, Е, Р, 6, Η, I, К, к, Μ, Р, (}, к, 8, Т, V, XV или Υ; и/или

Р81А, С, ϋ, Е, Р, С, Η, I, К, к, Μ, Ν, (}, Я, 8, Т, V, XV или Υ; и/или

К82А, С, ϋ, Е, Р, С, Η, I, Ь, Μ, Ν, Р, <3, к, 8, Т, V, XV или Υ; и/или

Ν87Α, С, ϋ, Е, Р, О, Η, I, К, к, Μ, Р, (}, К, 8, Т, V, XV или Υ; и/или

Ν88Α, С, ϋ, Е, Р, О, Η, I, К, к, Μ, Р, (}, к, 8, Т, V, XV или Υ; и/или

XVI11 А, С, ϋ, Е, Р, 6, Η, I, К, к, Μ, Ν, Р, (), к, 8, Т, V, XV или Υ; и/или

VI12А, С, ϋ, Е, Р, О, Η, I, К, Ь, Μ, Ν, Р, р, К, 8, Т, XV или Υ; и/или

А114С, ϋ, Е, Р, О, Η, I, К, Ь, Μ, Ν, Р, (}, к, 8, Т, V, XV или Υ; и/или

Υ117А, С, ϋ, Е, Р, 6, Η, I, К, к, Μ, Ν, Р, (}, к, 8, Т, V или XV; и/или

Ы 18А, С, ϋ, Е, Р, С, Η, I, К, Μ, Ν, Р, (}, к, 8, Т, V, XV или Υ; и/или

Р156А, С, ϋ, Е, Р, О, Η, I, К, к, Μ, Ν, (}, к, 8, Т, V, XV или Υ; и/или

Э157А, С, Е, Р, 6, Η, I, К, Ь, Μ, Р, Р, к, 8, Т, V, XV или Υ; и/или

О159А, С, ϋ, Е, Р, Η, I, К, к, Μ, Ν, Р, (}, к, 8, Т, V, XV или Υ; и/или (}160А, С, ϋ, Е, Р, О, Η, I, К, к, Μ, Ν, Р, к, 8, Т, V, XV или Υ; и/или

Ν161Α, С, ϋ, Е, Р, О, Η, I, К, к, Μ Р, (}, к, 8, Т, V, XV или Υ; и/или

Р162А, С, ϋ, Е, Р, О, Η, I, К, к, Μ, Ν, 0, к, 8, Т, V, XV или Υ; и/или

8163 А, С, ϋ, Е, Р, О, Η, I, К, к, Μ, Ν, Р, 9, к, Т, V, XV или Υ; и/или

А164С, ϋ, Е, Р, 6, Η, I, К, Ц Μ, Ν, Р, (}, к, 8, Т, V, XV или Υ; и/или к165А, С, ϋ, Е, Р, О, Η, I, К, Ь, Μ, Ν, Р, 8, Т, V, XV или Υ; и/или 8166А, С, ϋ, Е, Р, 6, Η, I, К, Ь, Μ, Ν, Р, 9, к, Т, V, XV или Υ; и/или

С2167А, С, ϋ, Е, Р, О, Η, I, К, Ь, Μ, Ν, Р, к, 8, Т, V, XV или Υ; и/или

К168А, С, ϋ, Е, Р, О, Η, I, к, Μ, Ν, Р, (), к, 8, Т, V, XV или Υ; и/или

У169А, С, ϋ, Е, Р, О, Η, I, К, Ь, Μ, Ν, Р, (}, к, 8, Т, XV или Υ; и/или

У170А, С, ϋ, Е, Р, О, Η, I, К, Ь, Μ, Ν, Р, (}, к, 8, Т, XV или Υ; и/или

Е171А, С, ϋ, Р, 6, Η, 1, К, к, Μ, Ν, Р, (), к, 8, Т, V, XV или Υ; и/или

А172С, ϋ, Е, Р, О, Η, I, К, к, Μ, Ν, Р, (), к, 8, Т, V, XV или Υ; и/или

Υ179Α, С, О, Е, Р, О, Η, I, К, к, Μ, Ν, Р, р, к, 8, Т, V или XV; и/или

Н180А, С, ϋ, Е, Р, 6,1, К, Ь, Μ, Р, (), к, 8, Т, V, XV или Υ; и/или

N181 А, С, ϋ, Е, Р, О, Η, I, К, к, Μ, Р, (}, к, 8, Т, V, XV или Υ; и/или

ζ)182А, С, ϋ, Е, Р, О, Η, I, К, Я, Μ, Ν, Р, к, 8, Т, V, XV или Υ, предпочтительно К; и/или

М209А, С, ϋ, Е, Р, О, Η, I, К, Ь, Ν, Р, (}, к, 8, Т, V, XV или Υ; и/или

Е210 А, С, ϋ, Е, Р, О, Η, I, К, Μ, Ν, Р, (), к, 8, Т, V, XV или Υ; и/или к211 А, С, ϋ, Е, Р, О, Η, I, К, к, Μ, Ν, Р, (}, к, 8, Т, V, XV или Υ; и/или N215 А, С, ϋ, Е, Р, О, Η, I, К, Ь, Μ, Ν, Р, 0, к, 8, Т, V, XV или Υ; и/или

Υ226Α, С, Ц Е, С, Η, I, К, Ь, Μ, Ν, Р, р. к, 8, Т_? V или XV; и/или

Υ230Α, С, ϋ, Е, О, Η, I, К, Ь, Μ, Ν, Р, 9, к, 8, Т, V или XV; и/или

К284А, С, ϋ, Е, Р, О, Η, I, Ь, Μ, Ν, Р, к, 8, Т, V, XV или Υ; и/или

М285А, С, ϋ, Е, Р, О, Η, I, К, Ь, Ν, Р, (), к, 8, Т, V, XV или Υ; и/или

Р289А, С, ϋ, Е, Р, О, Η, I, К, Ц Μ, Ν, Р, к, 8, Т, V, XV или Υ; и/или

У290А, С, ϋ, Е, Р, О, Η, I, К, Ь, Μ, Ν, Р, р, к, 8, Т, XV или Υ; и/или

Е309А, С, ϋ, Р, О, Η, I, К, к, Μ, Ν, Р, ¢, к, 8, Т, V, XV или Υ; и/или

8310А, С, ϋ, Е, Р, (3, Η, I, К, Ь, Μ, Ν, Р, 0, к, Т, V, XV или Υ.

В дополнение к этому или альтернативно к этому, может существовать одно или более Стерминальных удлинений. Предпочтительно, когда дополнительное С-терминальное удлинение состоит

- 28 020035 из одной или более алифатических аминокислот, предпочтительно полярной аминокислоты, более предпочтительно I, Б, V или О. Таким образом, настоящее изобретение дополнительно обеспечивает вариант фермента, включающий одно или более из следующих С-терминальных удлинений: 3181, 318Б, 318ν, 318О.

Предпочтительные варианты ферментов могут обладать сниженной гидролитической активностью в отношении фосфолипида, такого как фосфатидилхолин (ФХ), они могут также обладать повышенной трансферазной активностью из фосфолипида.

Предпочтительные варианты ферментов могут обладать трансферазной активностью из фосфолипида, такого как фосфатидилхолин (ФХ), таковые могут также обладать повышенной гидролитической активностью в отношении фосфолипида.

Модификация одного или более из следующих остатков может приводить к получению варианта фермента, обладающего повышенной абсолютной трансферазной активностью против фосфолипида:

83, Ό157, 8310, Е309, Υ179, N215, К22, 0289, Μ23, Н180, Μ209, Б210, В211, Р81, ν112, N80, Б82, N88, N87.

Специфические предпочтительные модификации, которые могут обеспечивать вариант фермента, обладающего улучшенной трансферазной активностью из фосфолипида, могут быть выбраны из одного или более из следующих:

83А, С, Б, Е, Р, О, Η, I, К, Е, Μ, Ν, Р, О, К., Т, V, XV или Υ; предпочтительно Ν, Е, К, К.,

А, Р или М, наиболее предпочтительно 83А

Б157А, С, Е, Р, С, Η, I, К, Е, Μ, Ν, Р, О, К, 8, Т, V, XV или Υ; предпочтительно Б1578,

К, Е, Ν, О, Т, V, О, К или С

8310А, С, Б, Е, Р, О, Η, I, К, Е, Μ, Ν, Р, 0, В, Т, V, XV или Υ; предпочтительно 83 ЮТ

-318 Е

Е309А, С, Б, Е, Р, О, Η, I, К, Б, Μ, Ν, Р, В, Т, V, IV или Υ; предпочтительно Е309 В,

Е, Б, К. или А

Υ179Α, С, В, Е, Р, О, Η, I, К, Ц Μ, Ν, Р, 0, В, 8, Т, V или XV; предпочтительно Υ179 В,

Т, Е, К., Ν, V, К, 0 или 8, более предпочтительно Е, К., Ν, V, К или О

N215А, С, В, Е, Р, О, Η, I, К, Ь, Μ, Р, 0, В, 8, Т, V, IV или Υ; предпочтительно N215 8,

Е, К. или Υ

К22А, С, В, Е, Р, С, Η, I, Ь, Μ, Ν, Р, 0, К., 8, Т, V, IV или Υ; предпочтительно К.22 Е, К.,

С или А

О289А, С, В, Е, Р, О, Η, I, К, Ь, Μ, Ν, Р, В, 8, Т, V, XV или Υ; предпочтительно 0289 В,

Е, О, Р или N

М23А, С, В, Е, Р, Ο, Η, I, К, Б Ν, Р, 0, В, 8, Т, V, XV или Υ; предпочтительно М23 К, 0,

Е, 6, Т или 8

Н180А, С, В, Е, Р, 6,1, К, Б, Μ, Р, 0, В, 8, Т, V, XV или Υ; предпочтительно Н180 0, В или К

М209 А, С, В, Е, Р, 6, Η, I, К, Б, Ν, Р, 0, В, 8, Т, V, XV или Υ; предпочтительно М209 0,

8, В, А, Ν, Υ, Е, V или Е

Б210А, С, В, Е, Р, С, Η, I, К, Μ, Ν, Р, 0, В, 8, Т, V, XV или Υ; предпочтительно Е210 В,

А, V, 8, Т, I, XV или М

В211 А, С, В, Е, Р, О, Η, I, К, Е, Μ, Ν, Р, 0, 8, Т, V, XV или Υ; предпочтительно В211Т

Р81 А, С, В, Е, Р, 6, Η, I, К, Е, Μ, Ν, 0, В, 8, Т, V, XV или Υ; предпочтительно Р81О

VI12А, С, В, Е, Р, О, Η, I, К, Б, Μ, Ν, Р, 0, В, 8, Т, XV или Υ; предпочтительно VI12С

Ν80Α, С, В, Е, Р, О, Η, I, К, Б, Μ, Р, 0, В, 8, Т, V, XV или Υ; предпочтительно N80 В, О,

Ν, Б, Р, Т, Е, V, А или О

- 29 020035

Й82А, С, О. Е, Г, С, Η, I, Μ, Ν, Р, Р, К., 8, Т, V, Ψ или Υ; предпочтительно ί82Ν, 8 или

Е

Ν88Α, С, ϋ, Е, Г, О, Η, I, К, Ь, Μ, Р, 0, К, 8, Т, V, V/ или Υ; предпочтительно Я88С

Ν87Α, С, Π, Е, Г, О, Η, I, К, Ь, Μ, Р, (}, К, 8, Т, V, Ψ или Υ; предпочтительно Ν87Μ или О

Предпочтительные модификации одного или более из следующих остатков приводят к получению варианта фермента, обладающего повышенной абсолютной трансферазной активностью против фосфолипида:

Ν, К, А, 6

М23 К, (}, Ц О, Τ, 8

Н180К

Ь82 О

Υ179 Е, К, Ν, V, К или Е309 К., 8, Ь или А

Одна предпочтительная модификация представляет собой Ν80Ό. Это, в частности, является случаем, когда стандартная последовательность 8Ер ΙΌ №. 35 используется в качестве остова. Так, стандартная последовательность может представлять собой 8Ер ΙΌ №. 16. Эта модификация может быть в комбинации с одной или более дополнительных модификаций. Таким образом, в предпочтительном воплощении настоящего изобретения нуклеотидная последовательность, кодирующая липидацилтрансферазу для использования в в любом из способов и применений настоящего изобретения, может кодировать липидацилтрансферазу, которая включает ЗЕр ΙΌ №. 35, или аминокислотную последовательность, которая обладает 75% или более, предпочтительно 85% или более, более предпочтительно 90% или более, даже более предпочтительно 95% или более, даже более предпочтительно 98% или более или даже более предпочтительно 99% или более идентичностью по отношению к ЗЕр ΙΌ №. 35.

Как отмечалось выше, при ссылке на специфические аминокислотные остатки в соответствии с данным изобретением нумерация представляет собой такую, которая получена из выравнивания вариантной последовательности со стандартной последовательностью, которая представлена как ЗЕО ΙΌ №. 34 или ЗЕр ΙΌ №. 35

Еще более предпочтительно когда нуклеотидная последовательность, кодирующая липидацилтрансферазу для использования в любом из способов или применений настоящего изобретения, может кодировать липид, включающий аминокислотную последовательность, которая представлена как ЗЕр ΙΌ №. 16, или аминокислотную последовательность, которая представлена как ЗЕр ΙΌ №. 68, или аминокислотную последовательность, которая обладает 70% или более, предпочтительно 75% или более, предпочтительно 85% или более, более предпочтительно 90% или более, даже более предпочтительно 95% или более, даже более предпочтительно 98% или более или даже более предпочтительно 99% или более идентичностью по отношению к ЗЕр ΙΌ №. 16 или ЗЕр ΙΌ №. 68. Этот фермент может считаться вариантом фермента.

Для целей настоящего изобретения степень идентичности основывается на количестве элементов последовательности, которые являются одинаковыми. Степень идентичности в соответствии с настоящим изобретением для аминокислотных последовательностей может быть предпочтительно определена с помощью компьютерных программ, которые являются известными в области техники, например, такой как Уес1ог ΝΤΙ 10 (1пу11го§еп Согр.). Для попарного выравнивания используемая оценка предпочтительно представляет собой ВЬОЗИМ62 со штрафом за внесение делеции в выравнивание 10,0 и со штрафом за продолжение делеции 0,1.

Предпочтительно степень идентичности по отношению к аминокислотной последовательности определяется на протяжении по крайней мере 20 смежных аминокислот, предпочтительно на протяжении по крайней мере 30 смежных аминокислот, предпочтительно на протяжении по крайней мере 40 смежных аминокислот, предпочтительно на протяжении по крайней мере 50 смежных аминокислот, предпочтительно на протяжении по крайней мере 60 смежных аминокислот.

Предпочтительно степень идентичности по отношению к аминокислотной последовательности может определяться на протяжении всей последовательности.

Предпочтительно нуклеотидная последовательность, кодирующая липидацилтрансферазу или фермент липидацилтрансферазу для использования в настоящем изобретении, может быть получаемой, предпочтительно полученной, из организмов, выбранных из одного или более следующих родов: Аеготопак, З1гер1отусек, ЗассЕаготусек, Еас1ососсик, МусоЬас1епит, З1гер1ососсик, Еас1оЬасШик, Веки1й1оЬас1егшт, ВасШик, Сатру1оЬас1ег, УШпопасеае, Ху1е11а, Зи1Го1оЬик, АкрегдШик, ЗсШ/окассЕаготусек, Е1к1епа, №1ккепа, МекогЫ/оЬшт, Ка1к1ота, ХапШотопак, СапШЕа, ТЕегтоЫГШа и СогупеЬас1епит.

- 30 020035

Предпочтительно нуклеотидная последовательность, кодирующая липидацилтрансферазу или фермент липидацилтрансферазу для использования в настоящем изобретении, может быть получаемой, предпочтительно полученной, из одного из следующих организмов: Аеготопак НубторНба, Аеготопак ка1тошс1ба, 81гер1отусек сое11со1ог, 81гер1отусек птокик, МусоЬас1егтт, 81гер1ососсик руодепек, ЬасЮсоссик 1асНк, 81гер1ососсик руодепек, 81гер1ососсик (НетторНбик, 81гер1отусек (НегтокассНап, 81герЮтусек ауегтбШк ЬасЮЬасШик Некебсик, Оеки1П1оЬас1епит беНа1одепапк, Васб1ик кр., Сатру1оЬас1ег )с|ип1, У1Ьг1опасеае, Ху1е11а ГакНбюка, 8и1£о1оЬик ко1Га1апсик, 8ассНаготусек сегеу1к1ае, ЛкретдШик (еггеик, 8сН|/окассНаготусек ротЬе, Ык1епа тпосиа, Ык1епа топосуЮдепек, №1ккеба тептдй1б1к, Меког1п/оЬшт 1об, Ва1к1оша ко1апасеагит, Хапбютопак сатрекНгк, Хапбютопак ахопоробЬ, Сапб1ба рагаркбок1к ТНеттоЬбгба Гикса и СогупеЬас1епит еГПаепк.

В одном аспекте предпочтительно, когда нуклеотидная последовательность, кодирующая липидацилтрансферазу для использования в одном из способов и/или применений настоящего изобретения, кодирует фермент липидацилтрансферазу в соответствии с настоящим изобретением, является получаемой, предпочтительно полученной, или имеет происхождение из одного или более орагнизмов Аеготопак крр., Аеготопак НубгорНба или Аеготопак ка1тошс1ба.

В одном аспекте предпочтительно, когда липидацилтрансфераза для использования в одном из способов и/или применений настоящего изобретения представляет собой фермент липидацилтрансферазу, получаемый, предпочтительно полученный, или имеет происхождение из одного или более организмов Аеготопак крр., Аеготопак НубгорНба или Аеготопак ка1тошс1ба.

Термин трансфераза, как используется в данном описании, употребляется попеременно с термином липидацилтрансфераза.

Предпочтительно липидацилтрансфераза, как определено в данном описании, катализирует одну или более из следующих реакций: интерэстерификацию, трансэстерификацию, алкоголиз, гидролиз.

Термин интерэстерификация относится к катализируемому ферментом переносу ацильных групп между липидным донором и липидным акцептором, в данном описании липидный донор не представляет собой свободную группу ацила.

Термин трансэстерификация, как используется в данном описании, означает катализируемый ферментом перенос ацильной группы из липидного донора (отличного от свободной жирной кислоты) на акцептор ацила (отличный от воды).

Как используется в данном описании, термин алкоголиз относится к ферментативному расщеплению ковалентной связи кислотной производной с помощью реакции с участием ВОН спирта так, что один из продуктов объединяется с Н спирта, а другой продукт соединяется с ОВ группой спирта.

Как используется в данном описании, термин спирт относится к алкильному соединению, содержащему гидроксильную группу.

Как используется в данном описании, термин гидролиз относится к ферментативному катализируемому переносу ацильной группы из липида на ОН группу молекулы воды.

Термин без повышения или без существенного повышения уровня свободных жирных кислот, как используется в данном описании, означает, что предпочтительно липидацилтрансфераза в соответствии с настоящим изобретением обладает 100% трансферазной активностью (т.е. переносит 100% ацильных групп из донора ацила на акцептор ацила, при отсутствии гидролитической активности); однако фермент может переносить менее чем 100% ацильных групп, присутствующих в доноре липидного ацила, на акцептор ацила. В этом случае ацилтрансферазная активность предпочтительно составляет по крайней мере 5%, более предпочтительно по крайней мере 10%, более предпочтительно по крайней мере 20%, более предпочтительно по крайней мере 30%, более предпочтительно по крайней мере 40%, более предпочтительно 50%, более предпочтительно по крайней мере 60%, более предпочтительно по крайней мере 70%, более предпочтительно по крайней мере 80%, более предпочтительно по крайней мере 90% и более предпочтительно по крайней мере 98% общей активности фермента. % трансферазной активности (т.е. трансферазная активность как процент общей ферментативной активности) может быть определена с помощью приведенного Анализа на трансферазную активность, приведенного выше.

В некоторых аспектах настоящего изобретения термин без существенного повышения уровня свободных жирных кислот, как используется в данном описании, означает, что количество свободной жирной кислоты в съедобном масле, обработанном с помощью липидацилтрансферазы в соответствии с настоящим изобретением, является меньшим, чем количество свободной жирной кислоты, образовавшейся в съедобном масле тогда, когда использовался фермент, отличный от липидацилтрансферазы в соответствии с настоящим изобретением, так, как, например, по сравнению с количеством свободной жирной кислоты, образовавшейся тогда, когда использовался традиционный фермент фосфолипаза, например ЬесНаке ИИта™ (Шуохушек А/8, Эептагк).

Термин существенно состоит из, как используется в данном описании, когда относится к продукту или композиции, предпочтительно означает, что продукт или композиция могут состоять из других продуктов или композиций, но только до максимальной концентрации предпочтительно 10%, такой как 5%, такой как 3%, такой как 2%, или 1%, или 0,5%, или 0,1%.

- 31 020035

В одном предпочтительном воплощении липидацилтрансфераза используется в комбинации с липазой, обладающей одной или более из следующих ферментных характеристик: гликолипазная активность (Е.С. 3.1.1.26, фосфолипазная А2 активность (Е.С. 3.1.1.4) или фосфолипазная А1 активность (Е.С. 3.1.1.32). Предпочтительно, когда липазные ферменты являются хорошо известными в уровне техники и включают в качестве примера следующие липазы: фосфолипазу А1 БЕС1ТА8Е® ИЬТКА (№\'охуте5 А/8, Иептагк), фосфолипазу А2 (например, фосфолипазу А2 из ЫРОМОИ® 22Ь от Вюса1а1у818, ЫРОМАХ® и ЬузоМах РЬА2® от Оепесог), ЫРОЬА8Е® (Nονοζуте8 А/8, Эептагк).

Также может быть предпочтительным объединять применение липидацилтрансферазы с фосфолипазой, такой как фосфолипаза А1, фосфолипаза А2, фосфолипаза В, фосфолипаза С и/или фосфолипаза Ό.

Сочетанное применение может осуществляться последовательно или одновременно, например обработка с помощью липидацилтрансферазы может осуществляться до или во время дополнительной ферментной обработки. Альтернативно, дополнительная ферментная обработка может осуществляться до или во время обработки с помощью липидацилтрансферазы.

В случае последовательных ферментных обработок в некоторых воплощениях может быть желательным удалять первый используемый фермент, например, с помощью тепловой дезактивации или при использовании иммобилизованного фермента, перед обработкой с помощью второго (и/или третьего и т.д.) фермента.

Посттранскрипционная и посттрансляционная модификации.

Предпочтительно липидацилтрансфераза в соответствии с настоящим изобретением может кодироваться любой из нуклеотидных последовательностей, описанных в данном патенте.

В зависимости от используемой хозяйской клетки могут осуществляться посттранскрипционная и/или посттрансляционная модификации. Предусматривается, что липидацилтрансфераза для использования в способах и/или применениях в соответствии с настоящим изобретением охватывает липидацилтрансферазы, которые подверглись посттранскрипционной и/или посттрансляционной модификации.

Только в качестве примера, экспрессия нуклеотидной последовательности, показанной в данном описании как 8Е0 ΙΌ Νο. 49 (см. фиг. 57), в хозяйской клетке (такой как ВасШиз 1юйеш£огт18, например) приводит к посттранскрипционной и/или посттрансляционной модификациям, что ведет к получению аминокислотных последовательностей, представленных в данном описании как 8Е0 ΙΌ Νο. 68 (см. фиг. 73).

8Е0 ΙΌ Νο. 68 является такой же, как и 8Е0 ΙΌ Νο. 16 (представлена на фиг. 1), за исключением того, что 8Е0 ΙΌ Νο. 68 подверглась посттрансляционной и/или посттранскрипционной модификациям для удаления 38 аминокислот.

Изолированная.

В одном аспекте липидацилтрансфераза представляет собой извлеченную/изолированную липидацилтрансферазу. Таким образом, полученная липидацилтрансфераза может быть в изолированной форме.

В другом аспекте нуклеотидная последовательность, кодирующая липидацилтрансферазу для использования в настоящем изобретении, может быть в изолированной форме.

Термин изолированный означает, что последовательность или белок является, по крайней мере, существенно свободным по крайней мере от одного другого компонента, с которым последовательность или белок обычно ассоциируется в природе или как он обнаружен в природе.

Очищенная.

В одном аспекте липидацилтрансфераза может быть в очищенной форме.

В другом аспекте нуклеотидная последовательность, кодирующая у липидацилтрансферазу для использования в настоящем изобретении, может быть в очищенной форме.

Термин очищенная означает, что последовательность находится в относительно чистом состоянии, например является по крайней мере приблизительно на 51% чистой, или по крайней мере приблизительно на 75%, или по крайней мере приблизительно на 80%, или по крайней мере приблизительно на 90% чистой, или по крайней мере приблизительно на 95% чистой, или по крайней мере приблизительно на 98% чистой.

Клонирование нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид в соответствии с настоящим изобретением.

Нуклеотидная последовательность, кодирующая либо полипептид, который обладает специфическими свойствами, как определено в данном описании, либо полипептид, который является приемлемым для модификации, может быть изолирована из любой клетки или организма, продуцирующего указанный полипептид. В области техники являются хорошо известными различные способы для изоляции нуклеотидных последовательностей.

Например, может быть сконструирована геномная ДНК и/или кДНК библиотека при использовании хромосомной ДНК или информационной РНК из организма, продуцирующего этот полипептид. Если аминокислотная последовательность полипептида является известной, то могут быть синтезированы и

- 32 020035 использованы меченые олигонуклеотидные зонды для идентификации клонов, кодирующих полипептид из геномной библиотеки, полученной из организмов. Альтернативно, меченые олигонуклеотидные зонды, содержащие последовательности, гомологичные гену другого известного полипептида, могут использоваться для идентификации клонов, кодирующих полипептид. В последнем случае используются условия гибридизации и промывания более низкой жесткости.

Альтернативно, клоны, кодирующие полипептид, могут быть идентифицированы путем встраивания фрагментов геномной ДНК в экспрессионный вектор, такой как плазмида, трансформации негативной по ферменту бактерии с помощью полученной ДНК библиотеки и последующего высаживания трансформированных бактерий на агар, содержащий фермент, который ингибируется полипептидом, с помощью чего могут быть идентифицированы клоны, экспрессирующие полипептид.

Еще в одном альтернативном воплощении нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид, может быть получена синтетически с помощью установленных стандартных способов, например с помощью фосфорамидатного способа, описанного Веисаде 8.Ь. е! а1. (1981), Те!гайейгои Ье!!егк. 22, р. 1859-1869, или способа, описанного МаИНек е! а1. (1984), ЕМВО 1. 3, р. 801-805. При фосфороамидатном способе олигонуклеотиды синтезируются, например, в автоматическом ДНК синтезаторе, очищаются, отжигаются, лигируются и клонируются в приемлемые векторы.

Нуклеотидная последовательность может иметь смешанное геномное и синтетическое происхождение, смешанное синтетическое и кДНК происхождения или смешанное геномное и кДНК происхождения, полученное с помощью лигирования фрагментов синтетического, геномного или кДНК происхождения (если это является приемлемым) в соответствии со стандартными методиками. Каждый лигированный фрагмент соответствует различным частям цельной нуклеотидной последовательности. ДНК последовательность может также быть полученной с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) при использовании специфических праймеров, например, как описано в И8 4683202 или у 8а1к1 В.К е! а1. (8с1еисе (1988), 239, р. 487-491).

Нуклеотидные последовательности.

Настоящее изобретение также охватывает нуклеотидные последовательности, кодирующие полипептиды, обладающие специфическими свойствами, как определено в данном описании. Термин нуклеотидная последовательность, как используется в данном описании, относится к олигонуклеотидной последовательности или полинуклеотидной последовательности, а также варианту, гомологам, фрагментам и их производным (таким как их части). Нуклеотидная последовательность может иметь геномное, или синтетическое, или рекомбинантнре происхождение, при этом она может быть двухцепочечной или одноцепочечной, представляя собой либо смысловую, либо антисмысловую цепочку.

Термин нуклеотидная последовательность в отношении настоящего изобретения включает геномную ДНК, кДНК, синтетическую ДНК и РНК. Предпочтительно это означает ДНК, более предпочтительно кДНК для кодирующей последовательности.

В предпочтительном воплощении нуклеотидная последовательность рег ке, кодирующая полипептид, обладающий специфическими свойствами, как определено в данном описании, не охватывает нативную нуклеотидную последовательность в ее природном окружении, когда она является связанной с природной(ыми), ассоциированной(ыми) с ней последовательностью(ями), которая(ые) также пребывает(ют) в своем природном окружении. Для облегчения ссылки, будем называть это предпочтительное воплдощение ненативной нуклеотидной последовательностью. В этой связи термин нативная нуклеотидная последовательность означает цельную нуклеотидную последовательность, которая находится в своем нативном окружении и когда является оперативно связанной с цельным промотором, с которым она обычно ассоциируется, при этом промотор также находится в своем нативном окружении. Таким образом, полипептид настоящего изобретения может экспрессироваться нуклеотидной последовательностью в ее нативном организме, но где нуклеотидная последовательность не находится под контролем промотора, с которым она обычно ассоциируется в таком организме.

Предпочтительно полипептид не является нативным полипептидом. В этой связи термин нативный полипептид означает цельный полипептид, который находится в своем нативном окружении и тогда, когда он экспрессирован его нативной нуклеотидной последовательностью.

Типично, нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептиды, обладающие специфическими свойствами, как определено в данном описании, получают при использовании методик рекомбинантной ДНК (т.е. при использовании рекомбинантной ДНК). Однако в альтерантивном воплощении изобретения нуклеотидная последовательность может быть синтезирована, полностью или частично, при использовании химических способов, хорошо известных в уровне техники (см. СагиШегк М.Н. е! а1. (1980), Шс. ЛсИ. Век. 8ушр. 8ег. 215-23 и Ηογπ Т. е! а1. (1980), Νι,κ. Λαά. Век. 8ушр. 8ег. 225-232).

Молекулярная эволюция.

Когда нуклеотидная последовательность, кодирующая фермент, была изолирована, или путативная нуклеотидная последовательность, кодирующая фермент, была идентифицирована, то может быть желательным модифицировать выбранную нуклеотидную последовательность, например может быть желательным мутировать последовательность для того, чтобы получить фермент в соответствии с настоящим изобретением.

- 33 020035

Мутации могут быть введены при использовании синтетических олигонуклеотидов. Такие олигонуклеотиды содержат нуклеотидные последовательности, фланкирующие желаемые сайты мутаций.

Приемлемый способ является раскрытым у Μοππαβα еί а1. (Вю1ес1то1оду (1984), 2, р. 646-649). Другой способ введения мутаций в нуклеотидные последовательности, кодирующие фермент, описаны у №1δοη и Ьопд (Апа1уйса1 ВюсйетШгу (1989), 180, р. 147-151).

Вместо сайт-направленного мутагенеза так, как описано выше, можно вводить мутации случайным образом, например, при использовании коммерческого набора, такого как набор для ПЦР мутагенеза СеηеΜο^р11 РСК от 8^03^^, или диверсифицированного набора для ПЦР случайного мутагенеза от ОогИесН. ЕР 0583265 относится к способам оптимизации мутагенеза на основе ПЦР, которые могут также сочетаться с применением мутагенных ДНК аналогов, таких как те, что описаны в ЕР 0866796. Методики подверженной ошибкам ПЦР являются приемлемыми для получения вариантов липидацилтрансфераз с желательными характеристиками. \УО 02/06457 относится к молекулярной эволюции липаз.

Третий способ для получения новых последовательностей представляет собой фрагментацию неидентичных нуклеотидных последовательностей либо при использовании любого числа рестрикционных ферментов, либо фермента, такого как ДНКаза I, и повторную сборку полных нуклеотидных последовательностей, кодирующих функциональные белки. Альтернативно, можно использовать одну или множественные неидентичные нуклеотидные последовательности и вводить мутации во время повторной сборки цельной нуклеотидной последовательности. Методики перестановки в ДНК и перестановки в семействах являются приемлемыми для получения вариантов липидацилтрансфераз с желательными характеристиками. Приемлемые способы для осуществления перестановки могут быть найдены в ЕР 0752008, ЕР 1138763, ЕР 1103606. Перестановка может также сочетаться с другими формами ДНК мутагенеза, как описано в И8 6180406 и \\'О 01/34835.

Таким образом, является возможным получать многочисленные сайт-направленные или случайные мутации в нуклеотидной последовательности либо ίη νίνΌ, либо ίη νίΙΐΌ и осуществлять последующий скрининг на улучшенную функциональность кодируемого полипептида различными способами. При использовании компьютерного моделирования биологического эксперимента и экзоопосредованных способов рекомбинации (см. \УО 00/58517, И8 6344328, И8 6361974), например, молекулярную эволюцию можно осуществлять тогда, когда полученный вариант сохраняет очень низкую гомологию с известными ферментами или белками. Такие варианты, полученные таким образом, могут обладать значительной структурной аналогией с известными трансферазными ферментами, но имеют очень низкую гомологию аминокислотной последовательности.

В качестве нелимитирующего примера, в дополнение, мутации или природные варианты полинуклеотидной последовательности могут подвергаться рекомбинации либо с мутациями дикого типа, либо с другими мутациями или природными вариантами с получением новых вариантов. Такие новые варианты могут также подвергаться скринингу на улучшенную функциональность кодируемого полипептида.

Применение упомянутых выше и подобных способов молекулярной эволюции позволяет идентифицировать и отобрать варианты ферментов настоящего изобретения, которые обладают желательными характеристиками без каких-либо предварительных знаний о структуре или функции белка, а также позволяет получить неспрогнозированные, но благоприятные мутации или варианты. Существуют многочисленные примеры применения молекулярной эволюции в области техники для оптимизации или изменения ферментативной активности, такие примеры включают, но без ограничения, один или более из перечисленных выше: оптимизированная экспрессия и/или активность в хозяйской клетке или ίη νιΙΐΌ, повышенная ферментативная активность, измененная специфичность в отношении субстрата и/или продукта, повышенная или сниженная ферментативная или структурная стабильности, измененная ферментативная активность/специфичность в предпочтительных условиях окружающей среды, например температура, рН, субстрат.

Как будет очевидным для специалиста в данной области техники, при использовании методик молекулярной эволюции фермент может подвергаться изменению для улучшения функциональности фермента.

Предпочтительно нуклеотидная последовательность, кодирующая липидацилтрансферазу, используемую в данном изобретении, может кодировать вариант липидацилтрансферазы, т.е. липидацилтрансфераза может содержать по крайней мере одну аминокислотную замену, делецию или присоединение, по сравнению с исходным ферментом. Вариантные ферменты сохраняют по крайней мере 1, 2, 3, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 97, 99% гомологии с исходным ферментом. Приемлемые исходные ферменты могут включать любой фермент с эстеразной или липазной активностью. Предпочтительно исходный фермент выравнивают до рГат00657 консенсусной последовательности.

В предпочтительном воплощении вариантный фермент липидацилтрансферазы сохраняет или включает по крайней мере один или более аминокислотных остатков рГат00657 консенсусных последовательностей, обнаруженных в 6Ό8Χ, ΟΑΚΟΥ и НРТ блоках.

Ферменты, такие как липазы с отсутствующей или низкой липидацилтрансферазной активностью, в водном окружении могут подвергаться мутации при использовании методик молекулярной эволюции для введения или совершенствования трансферазной активности, полученный таким образом фермент

- 34 020035 липидацилтрансферазы со значительной трансферазной активностью является приемлемым для использования в композициях и способах настоящего изобретения.

Предпочтительно нуклеотидная последовательность, кодирующая липидацилтрансферазу для использования в одном из способов и/или применений настоящего изобретения, может кодировать липидацилтрансферазу, которая может представлять собой вариант с улучшенной ферментативной активностью на полярных липидах, предпочтительно фосфолипидах и/или гликолипидах, по сравнению с исходным ферментом. Предпочтительно такие варианты также обладают низкой или не обладают активностью на лизополярных липидах. Улучшенная активность на полярных липидах, фосфолипидах и/или гликолипидах может быть результатом гидролиза и/или трансферазной активности или их комбинацией.

Вариант липидацилтрансферазы может иметь сниженное влияние на триглицериды, и/или моноглицериды, и/или диглицериды по сравнению с исходным ферментом.

Предпочтительно вариант фермента может не обладать влиянием на триглицериды и/или моноглицериды и/или диглицериды.

Альтернативно, вариант фермента может обладать повышенной термостабильностью. Вариант фермента может иметь повышенную активность в отношении одного или более из следующих: полярные липиды, фосфолипиды, лецитин, фосфатидилхолин, гликолипиды, дигалактозил моноглицерид, моногалактозил моноглицерид.

Варианты липидацилтрансферазы являются известными, и один или более таких вариантов могут быть приемлемыми для использования в способах и применениях в соответствии с настоящим изобретением и/или в ферментных композициях в соответствии с настоящим изобретением. Только в качестве примера, варианты липидацилтрансферазы описываются в следующих ссылках, которые могут использоваться в соответствии с настоящим изобретением: Ш1!оп & Виск1еу 1. Вю1. С1ет. 1991 1ап. 15: 266(2):997-1000; ВоЬейкоп е! а1. 1. Вю1. С1ет. 1994 1ап. 21; 269(3):2146-50; ВгитИк е! а1. 1. Вас!епо1. 1996 Арг.; 178(7):2060-4; Рее1тап е! а1. Рго!ет 8с1. 1998 Маг.; 7(3):587-99.

Аминокислотные последовательности.

Настоящее изобретение также охватывает применение аминокислотных последовательностей, которые кодируются нуклеотидной последовательностью, которая кодирует липидацилтрансферазу для использования в одном из способов и/или применений настоящего изобретения.

Как используется в данном описании, термин аминокислотная последовательность является синонимом с термином полипептид и/или термином белок. В некоторых случаях термин аминокислотная последовательность является синонимичным с термином пептид.

Аминокислотная последовательность может быть получена/изолирована из приемлемого источника, или она может быть получена синтетически, или она может быть получена при использовании методик рекомбинантной ДНК.

Предпочтительно аминокислотные последовательности могут быть получены из изолированных полипептидов, описанных в данном патенте, с помощью стандартных методик.

Один приемлемый способ для определения аминокислотных последовательностей из изолированных полипептидов представляет собой следующий

Очищенный полипептид может быть лиофилизирован, и 100 мкг лиофилизированого материала может растворяться в 50 мкл смеси 8 М мочевины и 0,4 М гидрокарбоната аммония, рН 8,4. Растворенный белок может быть денатурирован и восстановлен в течение 15 мин при 50°С после покрытия азотом и прибавления 5 мкл 45 мМ дитиотреитола. После охлаждения до комнатной температуры 5 мкл 100 мМ йодацетамида может прибавляться для дериватизации остатков цистеина в течение 15 мин при комнатной температуре в темноте в атмосфере азота.

135 мкл воды и 5 мкг эндопротеиназы Ьук-С в 5 мкл воды может прибавляться к упомянутой выше реакционной смеси, и переваривание может осуществляться при 37°С в атмосфере азота в течение 24 ч.

Полученные пептиды могут быть разделены с помощью ВЭЖХ с обратной фазой на νΥΟΛί’ С18 колонке (0,46x15 см; 10 мкм; Т1е 8ерагайоп Сгоир, СаШогша, И8А) при использовании растворителя А: 0,1% ТФУ в воде и растворителя В: 0,1% ТФУ в ацетонитриле. Выбранные пептиды могут повторно подвергаться хроматографии на Оеуе1окП С18 колонке при использовании той же системы растворителей, перед Ν-терминальным секвенированием. Секвенирование может быть осуществлено при использовании секвенатора 476А от АррНеб В1окук!етк с помощью импульсных жидкостных быстрых циклов в соответствии с инструкциями производителя (Аррйеб В1окук!етк, Са11£огша, И8А).

Идентичность последовательностей или гомология последовательностей.

В данном описании термин гомолог означает сущность, обладающую определенной гомологией с аминокислотными последовательностями, представляющими предмет данного изобретения, и нуклеотидными последовательностями, представляющими предмет данного изобретения. В данном описании термин гомология может быть эквивалентным с идентичностью.

Гомологичная аминокислотная последовательность и/или нуклеотидная последовательность будут обеспечивать и/или кодировать полипептид, который сохраняет функциональную активность и/или улучшает эту активность фермента.

- 35 020035

В контексте данного изобретения гомологичная последовательность взята для включения аминокислотной последовательности, которая может быть по крайней мере на 75, 85 или 90% идентичной, предпочтительно по крайней мере на 95 или 98% идентичной последовательности, которая составляет предмет данного изобретения. Типично, гомологи будут включать те же активные сайты и т.п., что и аминокислотная последовательность, представляющая предмет изобретения. Несмотря на то что гомология также может рассматриваться с точки зрения подобия (т.е. аминокислотные остатки, обладающие подобными химическими свойствами/функциями), в контексте настоящего изобретения является предпочтительным выражать гомологию с точки зрения идентичности последовательности.

В контексте данного изобретения гомологичная последовательность взята для включения нуклеотидной последовательности, которая может быть по крайней мере на 75, 85 или 90% идентичной, предпочтительно по крайней мере на 95 или 98% идентичной последовательности, кодирующей полипептид настоящего изобретения (последовательность, которая представляет собой предмет данного изобретения). Типично, гомологи будут включать одинаковые последовательности с теми, которые кодируют активные сайты и т.п., что и последовательность, представляющая предмет изобретения. Несмотря на то что гомология также может рассматриваться с точки зрения подобия (т.е. аминокислотные остатки, обладающие подобными химическими свойствами/функциями), в контексте настоящего изобретения является предпочтительным выражать гомологию с точки зрения идентичности последовательности.

Сравнение на гомологию может осуществляться визуально, или чаще, с использованием легкодоступных программ сравнения последовательностей. Такие коммерчески доступные компьютерные программы могут подсчитывать % гомологии между двумя или более последовательностями.

% гомологии может подсчитываться на протяжении смежных последовательностей, т.е. одна последовательность представляет собой выровненную с другой последовательностью, и каждая аминокислота в одной последовательности непосредственно сравнивается с соответствующей аминокислотой в другой последовательности, один остаток одновременно. Это называется выравнивание без пробелов. Типично, такие выравнивания без пробелов осуществляют только на протяжении относительно небольшого количества остатков.

Несмотря на то что это очень простой и унифицированный способ, он не принимает во внимание, что, например, могут существовать иным образом идентичные пары последовательностей, одна вставка или делеция будут причиной того, что последующие аминокислотные остатки не будут подвергаться выравниванию, потенциально приводя, таким образом, к большому снижению % гомологии, когда осуществляется общее выравнивание. Следовательно, наилучшие способы сравнения последовательностей предназначены для получения оптимальных выравниваний, которые принимают во внимание возможные инсерции и делеции при отсутствии неправильного наложения штрафных санкций на общий балл гомологии. Этого достигают путем встраивания пробелов в выравнивание последовательностей для того, чтобы постараться максимизировать локальную гомологию.

Однако эти более сложные способы назначают штраф за пробел в последовательности на каждый пробел, который появляется в выравнивании, так что для одинаковых номеров идентичных аминокислот выравнивание последовательностей с настолько малым количеством пробелов, насколько это является возможным - отражение более высокого родства между двумя сравниваемыми последовательностями будет достигаться более высокий балл, чем для таковой с большим количеством пробелов. Цена подобных пробелов типично используется, чтобы назначить относительно высокую цену за существования пробела для каждого последующего остатка в пробеле. Это представляет собой наиболее часто используемую систему балльного оценивания пробела. Высокие штрафы за пробел будут, безусловно, получать оптимизированные выравнивания с меньшим количеством пробелов. Наиболее оптимизированные программы выравнивания позволяют модифицировать штрафы за пробелы в последовательности. Однако является желательным применять значения по умолчанию при использовании такого программного обеспечения для сравнения последовательностей.

Подсчет максимального % гомологии, таким образом, прежде всего требует получения оптимального выравнивания, принимая во внимание штрафы за пробелы в последовательности. Приемлемая компьютерная программа для осуществления такого выравнивания представляет собой Уес!ог ΝΊΊ (ΙπνίΙΐΌдеп Согр.). Примеры других программ, которые могут осуществлять сравнение последовательностей, включают, но без ограничения, ВЬА8Т программное обеспечение (см. Аи5иЬе1 е! а1. 1999, 81юг1 Рго!осо1§ в Мо1еси1аг Вю1оду, 4-е изд. - Глава 18) и РА8ТА (А115с1ш1 е! а1. 1990, 1. Мо1. Вю1. 403-410). Как ВЬА8Т, так и РА8ТА являются доступными для автономного поиска и поиска в режиме оп-1те (см. Аи5иЬе1 е! а1. 1999, р. 7-58 - 7-60). Однако для некоторых применений является предпочтительным использовать программу Уес!ог ΝΊΊ. Новое средство ВЬА8Т 2 8ес.|иепсе5 также является доступным для сравнения белковой и нуклеотидной последовательностей (см. РΕМ8 МюгоЫо1. Ьей. 1999, 174(2):247-50; РΕМ8 МюгоЫо1. Ьей. 1999, 177(1):187-8 и 1а11апа@псЫ.п1т.ш11.доу).

Несмотря на то что заключительный % гомологии может измеряться с точки зрения идентичности, процесс выравнивания сам по себе типично не основывается на попарном сравнении все-или-ничего. В качестве альтернативы, обычно используется пересчитанный балл подобия матрицы для каждого попарного сравнения на основе химического подобия или эволюционной отдаленности. Пример такой обычно

- 36 020035 используемой матрицы представляет собой ВЕО8ИМ62 матрицу - матрицу по умолчанию для ВЬАБТ пакета программ. Программы Уес1ог ЫТ1 в общем случае используют либо общедоступные параметры по умолчанию, либо обыкновенную таблицу сравнения символов, если такая обеспечивается (см. руководство для пользователей для дополнительных деталей). Для некоторых применений является предпочтительным использовать параметры по умолчанию для Уес1ог ЫТ1 программного обеспечения.

Альтернативно, процент гомологии может быть подсчитан при использовании множественного элемента выравнивания в Уес1ог ЫТ1 (1пуйгодеп Согр.) на основе алгоритма, аналогичного СЬиБТЛЕ (Н1ддш8 Ώ.Θ. & Бйагр Р.М. (1988), Оепе 73(1), 237-244).

Если программное обеспечение дает оптимальное выравнивание, то является возможным подсчитать % гомологии, предпочтительно % идентичности последовательностей. Программное обеспечение представляет собой часть сравнения последовательностей и обеспечивает числовое выражение результата.

В случае если будут использоваться штрафы за пробелы при определении идентичности последова тельности, то предпочтительно используются следующие параметры для попарного выравнивания.

ДЛЯ ВБА8Т

ОТКРЫТИЕ ПРОБЕЛА 0

УДЛИНЕНИЕ ПРОБЕЛА___________ 0

ДЛЯ СЫЖТАЬ	ДНК	БЕЛОК
ДЛИНА СЛОВА	2	1	К тройка
ШТРАФ ЗА ПРОБЕЛ В ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ	15	10
УДЛИНЕНИЕ ПРОБЕЛА	6,66	0,1

В одном воплощении идентичность последовательности предпочтительно для нуклеотидных последовательностей определяется при использовании СЕиБТАЕ при использовании штрафа за пробел в последовательности и удлинение пробела, как определено выше.

Предпочтительно степень идентичности в отношении нуклеотидной последовательности определя-

ется	на протяжении	по крайней мере	20	смежных	нуклеотидов,	предпочтительно
на	протяжении	по	крайней	мере	30	смежных	нуклеотидов,	предпочтительно
на	протяжении	по	крайней	мере	40	смежных	нуклеотидов,	предпочтительно
на	протяжении	по	крайней	мере	50	смежных	нуклеотидов,	предпочтительно
на	протяжении	по	крайней	мере	60	смежных	нуклеотидов,	предпочтительно

на протяжении по крайней мере 100 смежных нуклеотидов.

Предпочтительно степень идентичности в отношении нуклеотидной последовательности может быть определена на протяжении всей последовательности.

В одном воплощении степень идентичности аминокислотной последовательности в соответствии с настоящим изобретением может быть предпочтительно определена с помощью компьютерных программ, известных из уровня техники, таких как Уес1ог ЫТ1 10 (1пуйгодеп Согр.). Для попарного выравнивания используемая матрица предпочтительно представляет собой ВЕО8ИМ62 со штрафом за открытие пробела 10,0 и со штрафом за удлинение пробела 0,1.

Предпочтительно степень идентичности в отношении аминокислотной последовательности определяется на протяжении по крайней мере 20 смежных аминокислот, предпочтительно на протяжении по крайней мере 30 смежных аминокислот, предпочтительно на протяжении по крайней мере 40 смежных аминокислот, предпочтительно на протяжении по крайней мере 50 смежных аминокислот, предпочтительно на протяжении по крайней мере 60 смежных аминокислот.

Предпочтительно степень идентичности в отношении аминокислотной последовательности может быть определена на протяжении всей последовательности.

Последовательности могут также содержать делеции, инсерции или замены аминокислотных остатков, которые обеспечивают молчащие изменения и приводят к получению функционально эквивалентного вещества. Преднамеренная замена аминокислот может быть осуществлена на основе их подобия в полярности, заряде, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатической природы остатков при условии, что сохраняется вторичная связывающая активность вещества. Например, нега тивно заряженные аминокислоты включают аспарагиновую кислоту и глутаминову кислоту; позитивно заряженные аминокислоты включают лизин и аргинин; а аминокислоты с незаряженными полярными концевыми группами, обладающие подобными значениями гидрофильности, включают лейцин, изолейцин, валин, глицин, аланин, спарагин, глутамин, серин, треонин, фенилаланин и тирозин.

Консервативные замены могут быть осуществлены, например, в соответствии с таблицей, приведенной ниже. Аминокислоты в том же блоке во второй колонке и предпочтительно в той же строке третьей колонки могут быть замещены друг другом.

- 37 020035

Алифатические	Неполярные	О АР
1Ь V
Полярные незаряженные	С 8ТМ
N0
Полярные заряженные	ϋΕ
кк
Ароматические		ΗΡΨΥ

Настоящее изобретение также охватывает гомологичные замещения (термины замещения и замены, оба, используются в данном описании для понимания замены существующего аминокислотного остатка альтернативным остатком), которые могут осуществляться, т.е. замещения подобного на подобный, такие как основной на основной, кислый на кислый, полярный на полярный и т.п. Могут также осуществляться негомологичные замещения, т.е. замены остатков одного класса на остаток другого класса, или альтернативно, при вовлечении неприродных аминокислот, таких как орнитин (в данном описании далее обозначается как Ζ), орнитин диаминомасляная кислота (в данном описании далее обозначается как В), норлейцин орнитин (в данном описании далее обозначается как О), пириилаланин, тиенилаланин, нафтилаланин и фенилглицин.

Замены могут также осуществляться с помощью неприродных аминокислот.

Варианты аминокислотных последовательностей могут включать приемлемые спейсерные группы, которые могут быть встроены между любыми двумя аминокислотными остатками последовательности, включая алкильные группы, такие как группы метила, этила или пропила в дополнение к аминокислотным спейсерам, таким как остатки глицина или β-аланина. Дополнительная форма вариации вовлекает присутствие одного или более аминокислотных остатков в форме пептоида, что является хорошо понятным квалифицированному специалисту в данной области техники. Во избежание сомнений, форма пептоида используется для обозначения варианта аминокислотных остатков, в котором группа заместителя α-углерода на остатке атома азота является более предпочтительной, чем α-углерод. Способы получения пептидов в форме пептоида являются хорошо известными в области техники, например, 81топ ЕД. е1 а1., Р\А8 (1992), 89(20), 9367-9371 и Ног^е11 Э.С., Тгепбз Вю1есЬпо1. (1995), 13(4), 132-134.

Нуклеотидные последовательности для использования в настоящем изобретении или кодирующие полипептид, обладающий специфическими свойствами, определенными в данном описании, могут включать в себя синтетические или модифицированные нуклеотиды. Ряд различных типов модификаций олигонуклеотидов является известным в области техники. Такие включают метилфосфонатные и фосфортиоатные скелеты и/или добавления цепей акридина или полилизина на 3'- и/или 5'- концах молекулы. Для целей настоящего изобретения является понятным, что нуклеотидные последовательности, описанные в данном изобретении, могут быть модифицированы с помощью любого из способов, известных в области техники. Такие модификации могут осуществляться для того, чтобы улучшить ш у1уо активность или длительность существования нуклеотидных последовательностей.

Настоящее изобретение также охватывает применение нуклеотидных последовательностей, которые являются комплементарными последовательностям, которые обсуждаются в данном описании, или любой производной, фрагменту или их производной. Если последовательность является комплементарной их фрагменту, то такая последовательность может использоваться в качестве зонда для идентификации подобных кодирующих последовательностей в других организмах и т.п.

Полинуклеотиды, которые не являются на 100% гомологичными последовательностям настоящего изобретения, но подпадают под объем изобретения, могут быть получены разными путями. Другие варианты последовательностей, описанных в данном изобретении, могут быть получены, например, путем зондирования ДНК библиотек, полученных из спектра индивидуумов, например индивидуумов из различных популяций. Кроме того, могут быть получены другие вирусные/бактериальные или клеточные гомологи, в частности клеточные гомологи, обнаруженные в клетках млекопитающих (например, клетках крыс, мышей, коров и приматов), и такие гомологи и их фрагменты в общем случае будут способными селективно гибридизоваться с последовательностями, показанными в списке последовательностей в данном описании. Такие последовательности могут быть получены путем зондирования кДНК библиотек или геномных ДНК библиотек, полученных из других видов животных, и зондирования таких библиотек с помощью зондов, включающих всю или часть любой из последовательностей, приведенных в приложенном списке последовательностей, при условиях от средней до высокой степени жесткости. Подобные рассуждения применяются для получения видовых гомологов и аллельных вариантов полипептидных или нуклеотидных последовательностей в соответствии с изобретением.

Варианты и штамо/видоспецифичные гомологи могут также быть получены при использовании вырожденной ПЦР, которая будет использовать праймеры, которые предназначены для нацеливания последовательностей в вариантах и гомологах, кодирующих консервативные аминокислотные последовательности в рамках последовательностей настоящего изобретения. Консервативные последовательности могут быть предсказаны, например, путем прибавления аминокислотных последовательностей из нескольких вариантов/гомологов. Выравнивание последовательностей будет осуществляться при использовании

- 38 020035 компьютерной программы, известной в области техники. Например, широко используется программа ОСО νί^οηκίη РбеИр.

Праймеры, которые используются в вырожденной ПЦР, будут содержать одно или более вырожденное положение и будут использоваться при условиях жесткости, более низких, чем те, которые используются для клонирования последовательностей с праймерами единичной последовательности против известных последовательностей.

Альтернативно, такие полинуклеотиды могут быть получены с помощью сайт-направленного мутагенеза охарактеризованных последовательностей. Это может быть полезным, например, тогда, когда изменения последовательности молчащего кодона требуются для оптимизации предпочтительности кодонов для частной хозяйской клетки, в которой полинуклеотидные последовательности экспрессируются. Другие изменения последовательности могут быть желательными для того, чтобы ввести сайты узнавания рестрикции полипептида или для того, чтобы изменить свойство или функцию полипептидов, кодируемых полинуклеотидами.

Полинуклеотиды (нуклеотидные последовательности) в соответствии с изобретением могут использоваться для получения праймера, например ПЦР праймера, праймера для альтерантивной реакции амплификации, зонда, например, меченых с помощью метки, способной к выявлению, с помощью традиционных средств при использовании радиоактивных или нерадиоактивных меток, или полинуклеотиды могут быть клонированы в векторы. Такие праймеры, зонды и другие фрагменты будут иметь длину по крайней мере 15, предпочтительно по крайней мере 20, например по крайней мере 25, 30 или 40 нуклеотидов и также охватываются термином полинуклеотид в соответствии с изобретением, как используется в данном описании.

Полинуклеотиды, такие как ДНК полинуклеотиды и зонды, в соответствии с изобретением могут быть получены рекомбинантным путем, синтетически или с помощью любого способа, доступного специалисту в данной области техники. Они могут быть также клонированы с помощью стандартных методик.

В общем случае праймеры будут получать путем синтетических способов, вовлекающих пошаговое получение желаемой последовательности нуклеиновой кислоты по одному нуклеотиду за один прием. Методики для осуществления этого с использованием автоматических способов являются доступными в области техники.

Более длинные полинуклеотиды в общем случае будут получать при использовании рекомбинантных способов, например при использовании методик клонирования на основе ПЦР (полимеразная цепная реакция). Это будет вовлекать создание пары праймеров (например, содержащих приблизительно 15-30 нуклеотидов), фланкирующих липид-нацеливающий участок последовательности, который является желательным для клонирования, приведение праймеров в контакт с иРНК или кДНК, полученной из клеток животных или человека, осуществление полимеразной цепной реакции в условиях, которые приводят к амплификации желаемого участка, изолирование амплифицированного фрагмента (например, путем очистки реакционной смеси на агарозном геле) и получение амплифицированной ДНК. Праймеры могут быть сконструированы таким образом, чтобы содержать приемлемые сайты распознавания рестрикционных ферментов, так, чтобы амплифицированная ДНК могла быть клонирована в приемлемый клонирующий вектор.

Г ибридизация.

Настоящее изобретение также охватывает применение последовательностей, которые являются комплементарными последовательностям настоящего изобретения или последовательностям, которые являются способными к гибридизации либо с последовательностями настоящего изобретения, либо с последовательностями, которые являются комлементарными к ним.

Термин гибридизация, как используется в данном описании, будет включать процесс, с помощью которого цепочка нуклеиновой кислоты объединяется с комплементарной цепью путем спаривания пар основ, а также процесс амплификации, как осуществляется с помощью методик на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Настоящее изобретение также охватывает применение нуклеотидных последовательностей, которые являются способными гибридизоваться с последовательностями, которые являются комплементарными последовательностям, которые составляют предмет изобретения и обсуждаются в данном описании, или любой производной, фрагменту или их производным.

Настоящее изобретение также охватывает последовательности, которые являются комплементарными последовательностям, которые способны гибридизоваться с нуклеотидными последовательностями, обсуждаемыми в данном описании.

Условия гибридизации основываются на температуре плавления (Тт) нуклеотидсвязывающего комплекса, как описывается Вегдег и К1тте1 (1987, Ошбе ΐο Мо1еси1аг С1ошид ТесНп1цие5, МеШобк ίη Еигуто1о§у, νο1. 152, Асабетю Ргекк, 8аи О|едо СА), и на обеспечении определенной жесткости, как объясняется ниже.

Максимальная жесткость типично возникает при температурах приблизительно Тт-5°С (на 5°С ниже Тт зонда); высокая - при температурах приблизительно на 5-10°С ниже Тт; средняя жесткость

- 39 020035 при температурах приблизительно на 10-20°С ниже Тт и низкая жесткость при температурах приблизительно на 20-25°С ниже Тт. Как будет понятно квалифицированному специалисту в данной области техники, гибридизация при максимальной жесткости может использоваться для идентификации или определения идентичных нуклеотидных последовательностей, в то время как гибридизация при средней (или низкой) жесткости может использоваться для идентификации или определения подобных или родственных нуклеотидных последовательностей.

Предпочтительно настоящее изобретение охватывает применение последовательностей, которые являются комплементарными последовательностям, способным гибридизоваться при условиях высокой жесткости или средней жесткости с нуклеотидными последовательностями, кодирующими полипептиды, обладающие специфическими свойствами, как определено в данном описании.

Более предпочтительно настоящее изобретение охватывает применение последовательностей, которые являются комплементарными последовательностям, способным гибридизоваться при условиях высокой жесткости (например, 65°С и 0,1х 88С {1х 88С = 0,15 М №С1, 0,015 М №1-цитрат рН 7,0}) с нуклеотидными последовательностями, кодирующими полипептиды, обладающие специфическими свойствами, как определено в данном описании.

Настоящее изобретение также относится к применению нуклеотидных последовательностей, которые могут гибридизоваться с нуклеотидными последовательностями, обсуждаемыми в данном описании (включая последовательности, комплементарные тем, что обсуждаются в данном описании).

Настоящее изобретение также относится к применению нуклеотидных последовательностей, которые являются комплементарными последовательностям, способным гибридизоваться с нуклеотидными последовательностями, которые обсуждаются в данном описании (включая последовательности, комплементарные тем, что обсуждаются в данном описании).

Также в объем настоящего изобретения включаются применения полинуклеотидных последовательностей, которые способны гибридизоваться с нуклеотидными последовательностями, обсуждаемыми в данном описании, при условиях от средней до максимальной жесткости.

В предпочтительном аспекте настоящее изобретение охватывает применение нуклеотидных последовательностей, которые могут гибридизоваться с нуклеотидными последовательностями, обсуждаемыми в данном описании или их комплементом, при жестких условиях (например, при 50°С и 0,2х 88С).

В более предпочтительном аспекте настоящее изобретение охватывает применение нуклеотидных последовательностей, которые могут гибридизоваться с нуклеотидными последовательностями, обсуждаемыми в данном описании или их комлементом, при условиях высокой жесткости (например, при 65°С и 0,1х 88С).

Экспрессия полипептидов.

Нуклеотидная последовательность для использования в настоящем изобретении или кодирующая полипептид, обладающий специфическими свойствами, как определено в данном описании, могут быть введены в рекомбинантный вектор, способный к репликации. Вектор может использоваться для репликации и экспрессии нуклеотидной последовательности в форме полипептида в и/или из совместимой хозяйской клетки. Экспрессия может контролироваться при использовании контрольных последовательностей, которые включают промоторы/энхансеры и другие сигналы для регуляции экспрессии. Могут использоваться прокариотические промоторы и промоторы, функциональные в эукариотических клетках. Могут использоваться тканеспецифические и стимулоспецифические промоторы. Также могут использоваться химерные промоторы, включающие элементы последовательности из двух или более различных промоторов, описанных выше.

Полипептид, который продуцируется рекомбинантной клеткой путем экспрессии нуклеотидной последовательности, может секретироваться или может быть содержаться внутриклеточно в зависимости от используемой последовательности и/или вектора. Кодирующие последовательности могут быть сконструированы с сигнальными последовательностями, которые направляют секрецию вещества, кодируемого последовательностями, через мембрану определенной прокариотической или эукариотической клетки.

Конструкции.

Термин конструкция, который является синонимичным с такими терминами, как конъюгат, кассета и гибрид, включает нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, обладающий специфическими свойствами, как определено в данном описании, для использования в соответствии с настоящим изобретением, непосредственно или опосредованно связанную с промотором. Пример непосредственного присоединения представляет собой обеспечение приемлемой спейсерной группы, такой как последовательность интрона, такого как 8Ы-интрон или АЭН интрон, между промотором и нуклеотидной последовательностью настоящего изобретения. То же самое касается термина слитый в отношении настоящего изобретения, который включает непосредственное или опосредованное присоединение. В некоторых случаях термины не охватывают природную комбинацию нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, обычно ассоциированный с промотором гена дикого типа и когда они оба находятся в своем природном окружении.

- 40 020035

Конструкция может даже содержать или экспрессировать маркер, который позволяет осуществлять селекцию генетической конструкции.

Для некоторых применений является предпочтительным, когда конструкция включает, по крайней мере, нуклеотидную последовательность настоящего изобретения или нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, обладающий специфическими свойствами, как определено в данном описании, оперативно связанную с промотором.

Организм.

Термин организм относительного настоящего изобретения включает любой организм, который может включать нуклеотидную последовательность в соответствии с настоящим изобретением или нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, обладающий специфическими свойствами, как определено в данном описании, и/или продукты, полученные из него.

Термин трансгенный организм в отношении настоящего изобретения включает любой организм, который включает нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, обладающий специфическими свойствами, как определено в данном описании, и/или продукты, полученные из него, и/или в данном описании промотор может позволять осуществлять экспрессию нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, обладающий специфическими свойствами, как определено в данном описании, в организме. Предпочтительно нуклеотидная последовательность встраивается в геном организма.

Термин трансгенный организм не охватывает нативных нуклеотидных кодирующих последовательностей в их природном окружении, когда они находятся под контролем их нативного промотора, который также находится в своем природном окружении.

Таким образом, трансгенный организм настоящего изобретения включает организм, включающий какую-либо одну или комбинацию нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, обладающий специфическими свойствами, как определено в данном описании, конструкции, как определено в данном описании, векторы, как определено в данном описании, плазмиды, как определено в данном описании, клетки, как определено в данном описании, или их продукты. Например, трансгенный организм может также включать нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, обладающий специфическими свойствами, как определено в данном описании, под контролем промотора, не ассоциированного с последовательностью, кодирующей липидацилтрансферазу в природе.

Трансформация хозяйских клеток/организма.

Примеры приемлемых прокариотических хозяев включают бактерии, такие как Εχοΐί и ВасШик ΙΕΙκηίίοηηίδ. предпочтительно Β.ΙΕΙκηίΓοπηίδ.

Руководства по трансформации прокариотических хозяев являются хорошо описанными в уровне техники, например, см. БатЬгсюк е1 а1. (ΜοΚα.ι1;·ΐΓ Οοπίπβ: А ^аЬο^аΐο^у Мапиа1, 2-е изд., 1989, С'о1б 8ргтд Η;πΕογ ^аЬο^аΐο^у Ргекк). Если используется прокариотический хозяин, то нуклеотидная последовательность предпочтительно может требовать модификации перед осуществлением трансформации, такой как удаление интронов.

В другом воплощении трансгенный организм может представлять собой дрожжи.

Клетки нитчатых грибов могут трансформироваться при использовании различных способов, известных в уровне техники, таких как процесс, вовлекающий получение протопласта и трансформацию протопластов, после чего осуществляют регенерацию клеточной стенки известным способом. Применение АкрегдШик в качестве хозяйского микроорганизма описывается в ЕР 0238023.

Другой хозяйский организм может представлять собой растение. Обзор общих методик, используемых для трансформации растений, может быть найден в статьях ΡοϊΓνΚιικ (Аппи. Веу. Р1ап1. Р11укю1. Р1ап1. Μο1. Βίο1. [1991], 42:205-225) и СНпкЮи (Ад^ο-Εοοб-Iηби8ΐ^у Ηί-Тесй Магсй/Аргй 1994, 17-27). Дополнительные методики по трансформации растений могут быть найдены в ЕР-А-0449375.

Общие методики по трансформации грибов, дрожжей и растений представлены в следующих разделах.

Трансформированные грибы.

Хозяйский организм может представлять собой грибы, такие как мицелиальные грибы. Примеры таких приемлемых хозяев включают любой член, принадлежащий к семействам ТНетютусек, Асгеп-тошит, АкрегдШик, РешсШшт, Μικογ, Nеи^ο8ρο^а. Тпс1юбегта и т.п.

Обзор способов трансформации мицелиальных грибов приведен в И8-А-5741665, который показывает, что стандартные методики для трансформации мицелиальных грибов и культивирования грибов являются хорошо известными в области техники. Обширный обзор методик применительно к Нсгакка может быть найден, например, у Эау18 и бе 8еггек, Мебюбк Εηζутο1. (1971), 17А: 79-143.

Дополнительные методики по трансформации мицелиальных грибов рассматриваются в И8-А-5674707.

В одном аспекте хозяйский организм может представлять собой род АкрегдШик, такой как АкрегдП1ик шдег.

Трансгенный АкрегдШик в соответствии с настоящим изобретением может также быть получен, например, в соответствии с методиками Тигпег О. 1994 (УесЮгк Γογ депейс тап^ρи1аι^οп. в МагйпеШ 8.Ό.,

- 41 020035

Ктд1югп ЕК. (ред.), АкрегдШик: 50 уеагк οη. Ргодгекк ίη тбик1па1 тюгоЬюйду, νο1. 29. Е1кеу1ег Атк!егбат, 1994, р. 641-666).

Обзор генной экспрессии в мицелиальных грибах приведен у Рип! е! а1. (2002), Тгепбк Вю1ес111ю1. 2002 Мау; 20(5): 200-6, АгсЕег & РеЬегбу СиЕ Ке\. ВюйсЬпсЕ (1997), 17(4): 273-306.

Трансформированные дрожжи.

Обзор принципов гетерологичной генной экспрессии в дрожжах обеспечивается, например, в Ме^бк Μο1. Вю1. (1995), 49: 341-54 и Сигг. Ορίη. В^есМ. (1997), Ос!.; 8(5): 554-60.

В этой связи дрожжи, такие как виды 8ассЕаготусек сегеу1кае1 или Р1сЫа ракЮпк (см. РЕМ8 МюгоЬю1. Ке\'. 2000, 24(1): 45-66), могут использоваться в качестве вектора для гетерологичной генной экспрессии.

Обзор принципов гетерологичной генной экспрессии в 8ассЕаготусек сеге\'1К1ае и секреции генных продуктов приведен в НшсЕсЛГе Е. Кеппу (1993, Уеак1 ак а \^ге1ис1е Гэг 111е е.\ргеккюп οΓ 1^ΚΐΌ1οβοιικ депек, Уеак1к, νο1. 5, ЛпПюпу Н. Идке и 1. 81иаг1 Нагл^п, ред., 2-е изд., Асабетю Ргекк ЬЙ.).

Для трансформации дрожжей было разработано несколько прописей трансформации. Например, трансгенный 8ассЕаготусек в соответствии с настоящим изобретением может быть получен в соответствии с методиками Ншпеп е! а1. (1978, РгосеебЛдк οΓ Ле №11юпа1 Асабету οΓ 8аепсек οΓ Ле И8А. 75, 1929); Веддк, ΕΌ. (1978, №!иге, Εο^ο^ 275, 104) и Ιΐο, Н. е! а1. (1983, 1. ВайегюЛду. 153, 163-168).

Трансформированные дрожжевые клетки могут быть отобраны при использовании различных селективных маркеров, таких как ауксотрофные маркеры доминантной устойчивости к антибиотикам.

Приемлемый дрожжевой хозяйский организм может быть отобран из биотехнологически релевантных видов дрожжей, таких как, но без ограничения, виды дрожжей, выбранных из РюЫа крр., Напкепи1а крр., К1иууе^οтусеκ, Уаггслуйиа крр., 8асс11аготусек крр., включая 8.се^еν^κ^ае. или 8сΗ^ζοκассΗа^οтусеκ крр., включая 8с11^ζοκасс11а^οтусеκ ροтЬе.

Штамм метилотрофных дрожжей вида РюЫа ракЮпк может использоваться в качестве хозяйского организма.

В одном воплощении хозяйский организм может представлять собой виды Напкепи1а, такие как Н.ρο1утο^ρЬа (как описано в \УО 01/39544).

Трансформированные растения/растительные клетки.

Хозяйский организм, приемлемый для настоящего изобретения, может представлять собой растение. Обзор общих методик может быть найден в статьях Рοΐ^укиκ (Аппи. Ке\'. Р1ап1. Р11укю1. Р1ап1. Μο1. Вю1. (1991), 42: 205-225) и СЬпкйи (Ад^ο-Рοοб-Iηбиκΐ^у НЕТесН МагсЬ/Аргб 1994, 17-27) или в \УО 01/16308. Трансгенное растение может продуцировать, например, повышенные уровни эстеров фитостерина и эстеров фитостанола.

Таким образом, настоящее изобретение также относится к способу получения трансгенного растения с повышенными уровнями эстеров фитостерина и эстеров фитостанола, включающий этапы трансформации растительной клетки с помощью липидацилтрансферазы, как определено в данном описании (в частности, с помощью экспрессионного вектора или конструкции, включающей липидацилтрансферазу, как определено в данном описании), и выращивание растения из трансформированной растительной клетки.

Секреция.

Часто является желательным, чтобы полипептид секретировался из хозяина экспрессии в культуральную среду, из которой фермент может быть более легко получен. В соответствии с настоящим изобретением лидерная последовательность для секреции может быть отобрана на основе желательного экспрессионного хозяина. Гибридные сигнальные последовательности могут также использоваться в контексте настоящего изобретения.

Типичные примеры лидерных последовательностей секреции не являются ассоциированными с нуклеотидной последовательностью, кодирующей липидацилтрансферазу в природе, и представляют собой такие, которые имеют происхождение из гена грибковой амилогликозидазы (АС) (д1аА - аминокислотные версии 18 и 24, например, из АкрегдШик), гена α-фактора (дрожжи, например 8асс11аготусек, К1иууе^οтусеκ и Напкепи1а) или гена α-амилазы (ВасШик).

Определение.

В области техники являются известными разнообразные прописи для определения и измерения экспрессии аминокислотной последовательности. Примеры включают твердофазный иммуносорбентный анализ (ЕМЗА), радиоиммуноанализ (К1А) и сортировку флуоресцентно-активированных клеток (РАС8).

Квалифицированному специалисту в данной области техники известно широкое разнообразие меток и методик конъюгации, которые могут использоваться в различных анализах нуклеиновой кислоты и аминокислотном анализе.

Ряд компаний, таких как РЕагтааа Вю1ес11 (Р|кса1а\\'ау, ΝΡ), Ргатеда (Ма^^п, νΙ) и И8 ВюсРетюа1 ГАгр. (С^еИпй, ОН), обеспечивают коммерческие наборы и прописи для осуществления этих процедур.

- 42 020035

Приемлемые репортерные молекулы или метки включают такие на основе радионуклидов, ферментов, флуоресцентных веществ, хемилюминисцентных веществ или хромогенных агентов, а также субстраты, кофакторы, ингибиторы, магнитные частицы и т.п. Патенты, описывающие применение таких меток, включают И8-А-3817837; И8-А-3850752; И8-А-3939350; И8-А-3996345; И8-А-4277437; И8-А-4275149 и И8-А-4366241.

Кроме того, рекомбинантные иммуноглобулины могут быть получены так, как описано в и8-А-4816567.

Слитые белки.

Липидацилтрансфераза для использования в настоящем изобретении может быть получена в виде слитого белка, например, с целью его экстракции и очистки. Примеры партнеров слияния белка включают глутатион-8-трансферазу (О8Т), 6хН1к, ОАБ4 (ДНК-связывающие домены и/или домены активации транскрипции) и β-галактозидазу. Также может быть приемлемым включать сайт для воздействия протеолитических ферментов между партнером слияния белка и белковой последовательностью, которая представляет интерес, для того, чтобы вычленить последовательности белка. Предпочтительно слитый белок не будет препятствовать активности белковой последовательности.

Системы для экспрессии слитых генов в Е.сой были рассмотрены в Сигг. Орт. Вю1ес1то1. (1995), 6(5): 501-6.

Аминокислотная последовательность полипептида, обладающего специфическими свойствами, как определено в данном описании, может быть лигирована с ненативной последовательностью для кодирования слитого белка. Например, для скрининга пептидных библиотек на агенты, способные влиять на активность вещества, может быть полезным кодировать химерное вещество, экспрессирующее ненативный эпитоп, который узнается коммерчески доступным антителом.

Изобретение будет далее описываться, только в качестве примера, со ссылкой на следующие фигуры и примеры:

фиг. 1 показывает аминокислотную последовательность мутантной зрелой липидацилтрансферазы Аеготопак ка1тошс1ба (ОСАТ) с мутацией Акп80Акр (в частности, аминокислота 80 содержится в зрелой последовательности) (8ЕО ГО Νθ. 16);

фиг. 2 показывает аминокислотную последовательность (8ЕО ГО Νθ. 1) липидацилтрансферазы из Аеготопак НубгорНПа (АТСС # 7965);

фиг. 3 показывает р£ат00657 консенсусную последовательность из базы данных версии 6 (8ЕО ГО Νθ. 2);

фиг. 4 показывает аминокислотную последовательность (8ЕО ГО Νθ. 3), полученную из организма Аеготопак НубгорНПа (Р10480; ОИ121051);

фиг. 5 показывает аминокислотную последовательность (8ЕО ГО Νθ. 4), полученную из организма Аеготопак ка1тошс1ба (ААО098404; ОТ9964017);

фиг. 6 показывает аминокислотную последовательность (8ЕО ГО Νθ. 5), полученную из организма 81герЮтусек сое1юо1от А3(2) (депозитный номер ОепЬапк: Ν₽ 631558);

фиг. 7 показывает аминокислотную последовательность (8ЕО ГО Νθ. 6), полученную из организма 81герЮтусек сое1юо1от А3(2) (депозитный номер ОепЬапк: САС42140);

фиг. 8 показывает аминокислотную последовательность (8ЕО ГО Νθ. 7), полученную из организма 8ассНаготусек сетеу1к1ае (депозитный номер ОепЬапк: Р41734);

фиг. 9 показывает аминокислотную последовательность (8ЕО ГО Νθ. 8), полученную из организма Ка1к1оша (депозитный номер ОепЬапк: АЬ646052);

фиг. 10 показывает 8ЕО ГО Νθ. 9. Код доступа САВ39707,1 8сое1 NСВI белка ОТ4539178 консервативный гипотетический белок |81гер1ошусек сое1юо1от А3(2)];

фиг. 11 показывает аминокислоту, которая представлена как 8ЕО ГО Νθ. 10. Код доступа САС01477,1 8сое2 NСВI белка ОТ9716139 консервативный гипотетический белок |81гер1отусек сое1юо1от А3(2)];

фиг. 12 показывает аминокислотную последовательность (8ЕО ГО Νθ. 11). Код доступа САВ88833,1 8сое3 NСВI белка ОТ7635996 путативный секретируемый белок |81гер1отусек сое1юо1от А3(2)];

фиг. 13 показывает аминокислотную последовательность (8ЕО ГО Νθ. 12). Код доступа САВ89450,1 8сое4 NСВI белка ОТ7672261 путативный секретируемый белок |81гер1отусек сое1юо1от А3(2)];

фиг. 14 показывает аминокислотную последовательность (8ЕО ГО Νθ. 13). Код доступа САВ62724,1 8сое5 NСВI белка ОТ6562793 путативный липопротеин |81гер1отусек сое1юо1от А3(2)];

фиг. 15 показывает аминокислотную последовательность (8ЕО ГО Νθ. 14). Код доступа ААК.84028,1 8пт1 NСВI белка ОТ15082088 ОО8Ь-липаза |81герЮтусек птокик];

фиг. 16 показывает аминокислотную последовательность (8ЕО ГО Νθ. 15) липидацилтрансферазы из Аеготопак ка1тошаба киЬкр. 8а1тошс1ба (АТСС # 14174);

фиг. 17 показывает 8ЕО ГО Νθ. 19. Код доступа САВ39707,1 8сое1 NСВI белка ОТ4539178 консервативный гипотетический белок |81гер1отусек сое1юо1от А3(2)];

фиг. 18 показывает аминокислотную последовательность (8ЕО ГО Νθ. 25) слитой конструкции, ис- 43 020035 последовательность последовательность последовательность фермента фермента фермента липидацилтрансферазы липидацилтрансферазы липидацилтрансферазы из из из пользуемой для мутагенеза гена липидацилтрансферазы Αе^οтοηак НуйгорНПа. Подчеркнутые аминокислоты представляют собой сигнальный пептид ксиланазы;

фиг. 19 показывает полипептидную 81герЮтусек (8ЕО ГО Νο. 26);

фиг. 20 показывает полипептидную

ТНегпюЫПйа (8ЕО ΙΌ Νο. 27);

фиг. 21 показывает полипептидную

ТНегпюЫПйа (НЕС) ΙΌ Νο. 28);

фиг. 22 показывает полипептид фермента липидацилтрансферазы из ί’οΓνί'κΕκΕπιιηι еНйаепк СЭ8Х 300 аминокислот (8ЕО ГО Νο. 29);

фиг. 23 показывает полипептид фермента липидацилтрансферазы из NονοкрЫηдοЬ^ит а^οта!^с^νο^апк СЭ8Х 284 аминокислоты (8ЕО ГО Νο. 30);

фиг. 24 показывает полипептид фермента липидацилтрансферазы из 81герЮшусек сοе1^сο1ο^ 6Ό8Χ 269 аа (НЕС) ГО Νο. 31);

фиг. 25 показывает полипептид фермента липидацилтрансферазы из 81герЮшусек ауегппиНк/СП8Х 269 аминокислот (8ЕО ГО Νο. 32);

фиг. 26 показывает полипептид фермента липидацилтрансферазы из 81герЮшусек (8ЕО ГО Νο. 33);

фиг. 27 показывает аминокислотную последовательность (8ЕО ΙΌ Νο. 34), полученную из организма Аегопюпак НуйгорНПа (Р10480; 6Р121051) (в частности, таковая представляет собой зрелую последовательность);

фиг. 28 показывает аминокислотную последовательность (8ЕО ГО Νο. 35) мутанта зрелой липидацилтрансферазы Аегопюпак ка1пюшс1Йа (6САТ) (в частности, таковая представляет собой зрелую последовательность);

фиг. 29 (НегпюкассНап;

фиг. 30 (НегпюкассНап;

фиг. 31

Н1кса/СП8Х 548 аминокислот;

фиг. 32 показывает нуклеотидную последовательность (8ЕО ГО Νο. 39) из ТНегпюЫПйа Никса;

фиг. 33 показывает аминокислотную последовательность (8ЕО ГО Νο. 40) из ТНегпюЫПйа Н1кса/СП8Х;

фиг. 34 показывает аминокислотную последовательность (8ЕО ГО Νο. 41) из Сο^уηеЬас!е^^ит еП1аепк/СП8Х 300 аминокислот;

фиг. 35 показывает нуклеотидную последовательность (8ЕО ГО Νο. 42) из Сο^уηеЬас!е^^ит еНПаепк;

фиг. 36 показывает аминокислотную последовательность (8ЕО ГО Νο. 43) из 8.сοе1^сο1ο^/С^8X 268

показывает	нуклеотидную	последовательность	(8Ер	ГО	Νο. 36)	из	81герЮтусек
показывает	аминокислотную	последовательность	(8Ер	ГО	Νο. 37)	из	81герЮтусек
показывает	аминокислотную	последовательность	(8Ер	ГО	Νο. 38)	из	ТНегпюЬЕЕа

аминокислот;

фиг. 37 показывает нуклеотидную последовательность (8ЕО ГО Νο. 44) из 8.сοе1^сο1ο^;

фиг. 38 показывает аминокислотную последовательность (8ЕО ГО Νο. 45) из 8.ауетшйШк;

фиг. 39 показывает нуклеотидную последовательность (8ЕО ГО Νο. 46) из 8.ауетшйШк;

фиг. 40 показывает аминокислотную последовательность (8ЕО ГО Νο. 47) из ТНегпюЫПйа Н1кса/СП8Х;

фиг. 41 показывает нуклеотидную последовательность (8ЕО ГО Νο. 48) из ТНегпюЫПйа Н1кса/СП8Х;

фиг. 42 показывает выравнивание Ь131 и гомологов из 8.ауегшй111к и Т.Никса, иллюстрирует сохранение СЭ8Х мотива (6Ό8Υ в Ь131 и 8.ауетшйШк и Т.Никса), 6ΑΝΏΥ блока, который представляет собой либо ΟΟΝΏΑ, либо ΟΟΝΩΕ, и НРТ блока (считается консервативным каталитическим гистидином). Эти три консервативных блока являются выделенными;

фиг. 43 показывает 8ЕО ГО Νο. 17, которая представляет собой аминокислотную последовательность липидацилтрансферазы из СапбИа рап-ф^Екю;

фиг. 44 показывает 8ЕО ГО Νο. 18, которая представляет собой аминокислотную последовательность липидацилтрансферазы из СапбИа рап-ф^Екю;

фиг. 45 показывает представление кристаллической структуры 1ΙνΝ.ΡΠΒ в виде полоски, которая содержит глицерин в активном сайте, фигура получена при использовании устройства для визуального просмотра Эеер νΕ\ν 8\\1кк-Р0В;

фиг. 46 показывает боковой вид кристаллической структуры 1ΙνΝ.ΡΠΒ при использовании устройства для визуального просмотра Пеер У1ете 8\\'1кк-РПВ, с глицерином в активном сайте - остатки в пределах 10 А активного сайта глицерина закрашены черным;

фиг. 47 показывает вид сверху кристаллической структуры ΠνΝ.ΡΌΒ при использовании устройства для визуального просмотра Пеер νΕ\ν 8^1кк-РПВ, с глицерином в активном сайте - остатки в пределах 10 А активного сайта глицерина закрашены черным;

фиг. 48 показывает выравнивание 1;

- 44 020035 фиг. 49 показывает выравнивание 2;

фиг. 50 и 51 показывают выравнивание 1ΙνΝ к Р10480 (Р10480 представляет собой последовательность базы данных для фермента А.НуйгорНПа), Это выравнивание получали из РРАМ базы данных и использовали в процессе построения модели;

фиг. 52 показывает выравнивание, где Р10480 представляет собой последовательность базы данных для Аеготопаз 1уйторЫ1а. Эта последовательность используется для конструирования модели и селекции сайта. Следует отметить, что показан полный белок (8ЕО ΙΌ №. 25), зрелый белок (эквивалент 8ЕО ΙΌ №. 34) начинается на остатке 19. А. за1 представляет собой 6Ό8Χ липазу Аеготопаз за1тошс1йа (8ЕО ΙΌ №. 4), А.Нуй представляет собой 6Ό8Χ липазу Аеготопаз 1уйгорЫ1а (8ЕО ΙΌ №. 34). Консенсусная последовательность содержит а * в положении отличия между приведенными последовательностями;

фиг. 53 показывает генную конструкция, которая используется в примере 1;

фиг. 54 показывает оптимизированную по кодонам генную конструкцию (№ 052907), которая используется в примере 1;

фиг. 55 показывает последовательность вставки Χ^Ι, содержащей ЬАТ-КЬМ3' предшественник гена, -35 и -10 блоки являются подчеркнутыми;

фиг. 56 показывает ВМЬ780-КЬМ3'САР50 (включающую 8ЕО ΙΌ №. 16 - верхняя колонка) и ВМЬ780 (хозяйский штам без конструкции - нижняя колонка) через 48 ч роста при 37°С на 1% трибутириновом агаре;

фиг. 57 показывает нуклеотидную последовательность из Аеготопаз за1тошс1йа (8ЕО ΙΌ №. 49), включающую сигнальную последовательность (ртеЬАТ - положения 1-87);

фиг. 58 показывает нуклеотидную последовательность (8ЕО ΙΌ №. 50), кодирующую липидацилтрансферазу в соответствии с настоящим изобретением, полученную из организма Аеготопаз 1уйторЫ1а;

фиг. 59 показывает нуклеотидную последовательность (8ЕО ΙΌ №. 51), кодирующую липидацилтрансферазу в соответствии с настоящим изобретением, полученную из организма Аеготопаз за1тошс1йа;

фиг. 60 показывает нуклеотидную последовательность (8ЕО ΙΌ №. 52), кодирующую липидацилтрансферазу в соответствии с настоящим изобретением, полученную из организма 81тер1отусез сое11со1ог А3(2) (депозитный номер СепЬапк NС 003888, 1:8327480, 8328367);

фиг. 61 показывает нуклеотидную последовательность (8ЕО ΙΌ №. 53), кодирующую липидацилтрансферазу в соответствии с настоящим изобретением, полученную из организма 81тер1отусез сое11со1ог А3(2) (депозитный номер СепЬапк АЬ939131, 1:265480, 266367);

фиг. 62 показывает нуклеотидную последовательность (8ЕО ΙΌ №. 54), кодирующую липидацилтрансферазу в соответствии с настоящим изобретением, полученную из организма 8асс1аготусез сетеу1з1ае (депозитный номер СепЬапк Ζ75034);

фиг. 63 показывает нуклеотидную последовательность (8ЕО ΙΌ №. 55), кодирующую липидацилтрансферазу в соответствии с настоящим изобретением, полученную из организма Яа1з1оша;

фиг. 64 показывает нуклеотидную последовательность, которая представлена как 8ЕО ΙΌ №. 56, кодирующую NСВI белок с кодом доступа САВ39707,1 0Ι:4539178 консервативный гипотетический белок [81тер1отусез сое11со1ог А3(2)];

фиг. 65 показывает нуклеотидную последовательность, которая представлена как 8ЕО ΙΌ №. 57, кодирующую 8сое2 NСВI белок с кодом доступа САС01477,1 0Ι:9716139 консервативный гипотетический белок [81тер1отусез сое1юо1ог А3(2)];

фиг. 66 показывает нуклеотидную последовательность, которая представлена как 8ЕО ΙΌ №. 58, кодирующую 8сое3 NСВI белок с кодом доступа САВ88833,1 0Ι:7635996 путативный секретируемый белок [81тер1отусез сое1юо1ог А3(2)];

фиг. 67 показывает нуклеотидную последовательность, которая представлена как 8ЕО ΙΌ №. 59, кодирующую 8сое4 NСВI белок с кодом доступа САВ89450,1 0Ι:7672261 путативный секретируемый белок [81тер1отусез сое1юо1ог А3(2)];

фиг. 68 показывает нуклеотидную последовательность, которая представлена как 8ЕО ΙΌ №. 60, кодирующую 8сое5 NСВI белок с кодом доступа САВ62724,1 0Ι:6562793 путативный липопротеин [81тер1отусез сое1юо1ог А3(2)];

фиг. 69 показывает нуклеотидную последовательность, которая представлена как 8ЕО ΙΌ №. 61, кодирующую 8пт1 NСВI белок с кодом доступа ААК84028,1 СЕ15082088 СО8Ь-липаза [81тер1отусез птозиз|;

фиг. 70 показывает нуклеотидную последовательность (8ЕО ΙΌ №. 62), кодирующую липидацилтрансферазу из Аеготопаз ЬуйторЫ1а (АТСС # 7965);

фиг. 71 показывает нуклеотидную последовательность (8ЕО ΙΌ №. 63), кодирующую липидацилтрансферазу из Аеготопаз заЬпошсИа зиЬзр. 8а1тошс1йа (АТСС # 14174);

фиг. 72 показывает нуклеотидную последовательность (8ЕО ΙΌ №. 24), кодирующую фермент из Аеготопаз ЬуйторЫ1а, включая сигнальный пептид ксиланазы;

- 45 020035 фиг. 73 показывает аминокислотную последовательность мутантной зрелой липидацилтрансферазы (ССАТ) Аеготопаз 5а1тошсИа с мутацией Л5п80Л5р (в частности, аминокислота 80 находится в зрелой последовательности), представленной в данном описании как 8ЕО ΙΌ Ыо. 16, и после осуществления посттрансляционной модификации как 8ЕО ΙΌ Ыо. 68 - аминокислотные остатки 235 и 236 8ЕО ΙΌ Ыо. 68 не являются ковалентно связанными после осуществления посттрансляционной модификации. Два образованных пептида удерживаются вместе с помощью одного или более 8-8 мостиков. Аминокислота 236 в 8ЕО ΙΌ Ыо. 68 соответствует аминокислотному остатку под номером 274 в 8ЕО ΙΌ Ыо. 16, показанной в данном описании;

фиг. 74а показывает общепринятый способ рафинирования гидратацией/очистки неочищенного пищевого масла. В конце процедуры рафинирования гидратацией масляную фазу и смоляную фазы разделяют. После этого масляная фаза и смоляная фаза могут быть далее обработаны обычными/известными из уровня техники способами;

фиг. 74Ь показывает способ в соответствии с настоящим изобретением для рафинирования гидратацией/очистки неочищенного пищевого масла при помощи фермента. Масляная фаза, полученная при разделении масляной и смоляной фаз, имеет значительно больший выход, в сравнении с масляной фазой сравнительного способа (например, показанного на фиг. 74а, т.е. рафинирование гидратацией без добавления фермента). Масляная фаза и/или смоляная фаза могут, по желанию, подвергаться дальнейшей переработке, такой как последующая обычная переработка;

фиг. 75 показывает структурную схему способа рафинирования гидратацией лабораторного масштаба в соответствии с настоящим изобретением;

фиг. 76 показывает диаграмму для анализа смоляной фазы и масляной фазы после рафинирования гидратацией (т.е. стадия 1 фиг. 74а или 74Ь);

фиг. 77 показывает смоляную фазу через 3 ч после рафинирования гидратацией неочищенного соевого масла в соответствии с настоящим изобретением;

фиг. 78 показывает % смолы через 30 мин рафинирования гидратацией неочищенного соевого масла с и без применения фермента;

фиг. 79 показывает влияние количества воды (1,5, 2 или 2,5%) на количество смолы после рафинирования гидратацией неочищенного соевого масла;

фиг. 80 показывает влияние с и без применения фермента при помощи рафинирования с различными количествами воды (1,5, 2 или 2,5%) на количество смолы после рафинирования гидратацией неочищенного соевого с и без применения фермента;

фиг. 81 показывает ррт фосфора в масляной фазе после рафинирования гидратацией неочищенного соевого масла с различным количеством фермента. Колонка 1 представляет собой контроль без фермента;

фиг. 82 показывает % триглицерида в смоляной фазе после рафинирования гидратацией неочищенного соевого масла с различным количеством фермента. Колонка 1 представляет собой контроль без фермента;

фиг. 83 показывает относительный % РА в смоляной фазе после рафинирования гидратацией неочищенного соевого масла с различным количеством фермента. Колонка 1 представляет собой контроль без фермента;

фиг. 84 показывает относительный % РЕ в смоляной фазе после рафинирования гидратацией неочищенного соевого масла с различным количеством фермента. Колонка 1 представляет собой контроль без фермента;

фиг. 85 показывает увеличенный выход масла (%), полученный при ферментативном рафинировании, относительно контроля. Масла центрифугированы при различных относительных центрифугирующих силах в течение 3 мин;

фиг. 86 показывает содержание (%) смолы и количество триглицерида в смоле, полученной из масел, центрифугированных различное время (минуты показаны в полосах) и при различных относительных центрифугирующих силах. Партия 3: контроль, 55°С, 4: с ферментом (КЬМ3'), 55°С;

фиг. 87 показывает вязкость как функцию скорости сдвига. Измерения основываются на смоле из партии 1: контроль, 70°С и партии 2: с ферментом, 70°С;

фиг. 88 показывает выход масла (%), рассчитанный из количества смолы (контроль) за вычитанием количества смолы (ферментативный образец);

фиг. 89 показывает результаты анализа ТСХ смоляной фазы. Содержание триглицерида (%) в смолах, полученных рафинированием с возрастающим количеством ЫаОН (0, 0,1, 0,2, 0,5, 1, 1,5 и 1,9 мл 4%-ного раствора);

фиг. 90 показывает СС-результаты. Содержание (%) свободных жирных кислот, фитостеринов и эстеров фитостеринов в маслах, рафинированных возрастающими количествами в мл ЫаОН - Образец 1: контроль (без фермента и ЫаОН); Образец 2-8: ферментативные образцы с КЬМ3' (0,1 ТГОИ-К/г) и возрастающими количествами ЫаОН (0, 0,1, 0,2, 0,5, 1, 1,5 и 1,9 мл 4%-ного раствора);

фиг. 91 показывает результаты анализа ТСХ смоляной фазы. Относительная деградация фосфолипидов (РА, РЕ, РС и Р!) в смолах. Образец 1: контроль (без фермента и ЫаОН), Образец 2-7: фермента

- 46 020035 тивные образцы с КЬМ3' (0,1 Т1РИ-К/г) и возрастающими количествами №1ΘΗ;

фиг. 92 показывает микроскопический анализ смол, полученных обычным рафинированием гидратацией и ферментативным рафинированием гидратацией в соответствии с настоящим изобретением (рисунки с 200- и 400-кратным увеличением при 25°С);

фиг. 93 показывает рентгеноскопический анализ смоляных фаз, полученных обычным рафинированием и ферментативным рафинированием;

фиг. 94 показывает воронки осаждения (день 3). Левая: контроль, правая: масло, обработанное ферментом;

фиг. 95 показывает микроскопический анализ смол, полученных обычным рафинированием гидратацией и ферментативным рафинированием гидратацией;

фиг. 96 показывает увеличенный выход масла, полученный при ферментативном рафинировании, относительно контроля;

фиг. 97 показывает потери масла в контроле и образце, полученном ферментативным рафинированием гидратацией (в соответствии с настоящим изобретением), которые выполняли с 1, 1,5 и 2% воды. Расчет потери масла: (% смолы/% триглицеридов в смоле) х 100%;

фиг. 98 показывает относительную деградацию фосфатидной кислоты и фосфатидилэтаноламина в ферментативных (КЬМ3') образцах смолы, по сравнению с контролем (без фермента);

фиг. 99 показывает измерение вязкости ферментативных смоляных фаз, полученных после рафинирования с различными количествами воды (1,25, 1,5, 1,75 и 2%);

фиг. 100 показывает смоляную фазу после рафинирования гидратацией неочищенной соли при помощи КЬМ3' и с добавлением акцептора, как показано в табл. 1 примера 9;

фиг. 101 показывает относительное количество фосфолипида в смоляной фазе, проанализированной при помощи ВЭТСХ;

фиг. 102 показывает 1СР анализ фосфора в масле, полученном после рафинирования гидратацией неочищенного соевого масла (табл. 1 примера 9);

фиг. 103: Пример 13. ТСХ (пропускаемый буфер 1) образцов с 1 по 9 через 30 мин инкубации; фиг. 104: Пример 13. ТСХ (пропускаемый буфер 1) образцов с 1 по 9 через 240 мин инкубации;

фиг. 105: Пример 13. ТСХ (пропускаемый буфер 6) образцов с 1 по 9 через 30 мин инкубации. РЕ = фосфатидилэтаноламин, РА = фосфатидная кислота, Р1 = фосфатидилинозитол и РС = фосфатидилхолин;

фиг. 106: Пример 13. ТСХ (пропускаемый буфер 6) образцов с 1 по 9 через 240 мин инкубации. РЕ = фосфатидилэтаноламин, РА = фосфатидная кислота, Р1 = фосфатидилинозитол и РС = фосфатидилхолин;

фиг. 107: Пример 13. Относительная деградация фосфолипидов ферментативной обработкой неочищенного масла при помощи липидацилтрансферазы (КЬМ3') и фосфолипазы С (РЬС). Время реакции 240 мин;

фиг. 108: Пример 13. Реакция фосфолипиддиглицеридацилтрансферазы;

фиг. 109: Пример 13. Взаимосвязь фосфолипазы С и КЬМ3' на уровень диглицерида (ОАО) при рафинировании неочищенного соевого масла;

фиг. 110: Пример 13. ТСХ анализа;

фиг. 111 показывает влияние добавления фермента на триглицерид;

фиг. 112 показывает влияние времени реакции на триглицерид;

фиг. 113 показывает ТСХ анализ диглицерид/РС субстрат, инкубированный с ацилтрансферазой в течение 30 и 90 мин, как подробно описано в примере 13;

фиг. 114 показывает ТСХ анализ диглицерид/РС субстрат, инкубированный с ацилтрансферазой в течение 30 и 90 мин, как подробно описано в примере 13;

фиг. 115 показывает влияние фермента ацилтрансферазы на формирование триглицерида в субстрате диглицерид/РС 80/20;

фиг. 116 показывает влияние времени инкубации на формирование триглицерида в субстрате диглицерид/РС 80/20;

фиг. 117 показывает структурную схему для ферментативного рафинирования гидратацией;

фиг. 118 показывает ТСХ анализ образцов смоляной фазы после рафинирования гидратацией при 55°С и инкубации в течение 0, 1 или 7 дней, как подробно описано в примере 15;

фиг. 119 показывает ТСХ анализ образцов смоляной фазы после рафинирования гидратацией при 45°С и инкубации в течение 0, 1 или 7 дней, как подробно описано в примере 15.

Пример 1.

Экспрессия КЬМ3' в ВасШик КсНешГогпик.

Нуклеотидную последовательность (8ЕО ΙΌ Νο. 49), кодирующую липидацилтрансферазу (8ЕО ΙΌ Νο. 16, далее в данном описании КЬМ3'), экспрессировали в ВасШик КсНешГогпик в виде слитого белка с сигнальным пептидом В.КсНешГогпик [альфа]-амилазы (ЬАТ) (см. фиг. 53 и 54). Для оптимальной экспрессии в ВасШик оптимизированную по кодонам генную конструкцию (№ 052907) заказывали на СепеаИ (СепеааИ АО, КедепкЬигд, Оегтапу).

- 47 020035

Конструкция № 052907 содержала неполный ЬАТ промотор (только -10 последовательность) в передней части ЕАТ-КЬМ3' предшественника гена и ЬАТ транскрипции (Т1а!), расположенный ниже от ЕАТ-КЬМ3' предшественника гена (см. фиг. 53 и 55). Для создания Х1о1 фрагмента, который содержит ЕАТ-КЬМ3' предшественник гена, фланкированный полным ЬАТ промотором на 5'-конце и ЬАТ терминатор на 3'-конце, осуществляли ПЦР (полимеразную цепную реакцию) амплификацию с помощью праймеров Р1а15Хйо1 РМ и ЕВ82Х1о1 Κν и генной конструкции 052907 в качестве матрицы.

Р1а15ХЬо1_РАУ:

ссссес1сеаедс1Шс1Шедааеаааа1а1аедеаааа1дд1ас£1к11ааааайс §даа1аШа1асаа1а1са1а1§ШсасаПдааадддд

ΕΒ82ΧΗοΙ_Κν: 1ццаа1с1сдаде11йа1ссШасс11ц1с1сс

ПЦР осуществляли на термоциклере с использованием Рйикюп Ыдй Р1йей1у ДНК-полимеразы (Ршп/ушек ΟΥ, Екроо, Рш1апй) в соответствии с инструкциями производителя (температура отжига 55°С).

Полученный ПЦР фрагмент переваривали с помощью рестрикционного фермента Х1о1 и лигировали с Т4 ДНК лигазой в Х1о1 переваренную р1Са1И в соответствии с инструкциями поставщика Цпуйгодеп, СайкЬай, СайР. И8А).

Смесь лигирования трансформировали в штамм В.киЬ1Шк 8С6,1 так, как описано в патентной заявке США И820020182734 (публикация международной заявки МО 02/14490). Последовательность ХИо! вставки, содержащую ЕАТ-КЬМ3' предшественник гена, подтверждали с помощью секвенирования ДНК (ВакеС1еаг, 1.ек!еп, Т1е \е111ег1апс1к), и один из правильных клонов плазмиды обозначали как ρIСаΐΗ-К^М3'(ο^^1) (фиг. 53). ρ1СаΐΗ-К^М3'(οπ1) трансформировали в штамм В.1^сйеη^ίο^ш^κ ВМЬ780 (производный от ВКА7 и ВМЬ612, см. МО 2005/111203) при пермиссивной температуре (37°С).

Выбирали один резистентный к неомицину (пеоК) и резистентный к хлорамфениколу (СтК) трансформант, обозначали его как ВМЬ780 (р1Са1И-КЕМ3' (оп1)). Плазмиду в ВМЬ780 (ρ1СаΐΗ-К^М3'(ο^^1)) интегрировали в Са1И участок в геноме В.1^сйешίο^ш^κ путем выращивания штамма при непермиссивной температуре (50°С) в среде с 5 мкг/мл хлорамфеникола. Отбирали один СтК резистентный клон и обозначали его как ВМ^780-ρ1СаΐΗ-К^М3' (оп1). ВМЕ780-р1Са1И- КЬМ3'(оп1) вновь выращивали при пермессивной температуре в течение нескольких поколений без антибиотиков для размыкания векторных последовательностей и потом отбирали один чувствительный к неомицину (пео8) СтК клон. В этом клоне векторные последовательности р1Са1И в хромосоме вырезали (включая ген устойчивости к неомицину) и оставляли только СаΐΗ-^АТК^М3' кассету. Потом СаΐΗ-^АТК^М3' кассету в хромосоме подвергали амплификации путем выращивания штамма в/на среде с увеличивающимися концентрациями хлорамфеникола. После различных циклов амплификации один клон (резистентный к 50 мкг/мл хлорамфеникола) отбирали и обозначали как ВМ^780-К^М3'СΛР50. Для проверки КЬМ3' экспрессии ВМЬ780КСМ3'САР50 и ВМЬ780 (хозяйский штамм, не содержащий конструкции) выращивали в течение 48 ч при 37°С на агаровых пластинках сердечном настое (Вас!о) с 1% трибутирином. Свободная зона, что является показательным для липидацилтрансферазной активности, была четко заметной вокруг ВМЬ780К^М3'СΛР50, но не вокруг хозяйского штамма ВМЬ780 (см. фиг. 56). Этот результат показывает, что существенное количество КЬМ3' экспрессируется в штамме В.1^сйеп^ίο^ш^κ ВМ^780-К^М3'СΛР50 и что эти молекулы КЬМ3' являются функциональными.

Сравнительный пример 1.

Векторная конструкция.

Плазмидная конструкция являлась рС832пе^ Ν80Ό, которая представляет собой рССтШ производную, несущую последовательность, кодирующую зрелую форму нативной глицерофосфолипидхолестерин ацилтрансферазы из Аеготопак ка1тошсИа, содержащей замену Акп на Акр в положении 80 (КЬМ3'), под контролем р32 промотора и с сигнальной последовательностью ССТ-азы.

Хозяйский штамм, используемый для экспрессии, представляет собой штамм ВасШик киЬ1Шк О821ААргЕ.

Уровень экспрессии измеряли как трансферазную активность, выраженную в виде % эстерефицированного холестерина, вычисленного из разницы между свободным холестерином в контрольном образце и свободным холестерином в образце фермента в реакции ФХ (Т_ФХ) в качестве донора и холестерина в качестве акцепторной молекулы.

Условия культивирования.

мл ЬВ бульона (продукт ферментативного переваривания казеина, 10 г/л; дрожжевой экстракт с низким содержанием натрия, 5 г/л; хлорид натрия, 5 г/л; инертные таблетированные добавки, 2 г/л) с добавкой 50 мг/л канамицина инокулировали при использовании одной колонки и инкубировали при 30°С в течение 6 ч при 205 об/мин. 0,7 мл этой культуры использовали для инокуляции 50 мл 8А8 среды

- 48 020035 (К₂НРО₄, 10 г/л; ΜОР8 (3-морфолинопропан сульфоновая кислота), 40 г/л; хлорид натрия, 5 г/л; противовспенивающий агент (8ΐη 260), 5 капель/л; обезжиренная соевая мука, 20 г/л; Вюзргтдег 106 (100% ί,Ιν ΥΕ), 20 г/л) с добавлением 50 мг/л канамицина и раствора гидролизатов с высоким содержанием мальтозного крахмала (60 г/л). Инкубацию осуществляли в течение 40 ч при 30°С и 180 об/мин перед отделением культуральных супернатантов путем центрифугирования при 19000 об/мин в течение 30 мин. Супернатант переносили в чистую пробирку и непосредственно использовали для измерения трансферазной активности.

Получение субстратов и осуществление ферментативной реакции.

ФХ (АудЛ! Ро1аг Ь1р108 # 441601) и холестерин (81§та С8503) пересчитывали в соотношении 9:1, растворяли в хлороформе и выпаривали до осушения.

Субстрат получали путем диспергирования 3% ФХ:Холестерин 9:1 в 50 мМ Нерез буфера рН 7.

0,250 мл раствора субстрата переносили в 3 мл стеклянную колбу с завинчивающейся крышкой. Прибавляли 0,025 мл супернатанта культуры и смесь инкубировали при 40°С в течение 2 ч. Также готовили стандартный образец с водой вместо фермента. Нагревание реакционной смеси в кипящей водяной бане в течение 10 мин останавливало ферментную реакцию. К реакционной смеси прибавляли 2 мл 99% этанола перед тем, как подвергнуть анализу на определение холестерина.

Определение холестерина.

100 мкл субстрата, содержащего 1,4 ед./мл холестериноксидазы (8ΕΚνΑ Е1ес1гор1югел8 ОтЪН кат. № 17109), 0,4 мг/мл АВТ8 (81дта А-1888), 6 ед./мл пероксидазы (81дта 6782) в 0,1 М Трис-НС1, рН 6,6 и 0,5% Тритон Х-100 (81§та Х-100) инкубировали при 37°С в течение 5 мин перед прибавлением и смешиванием с 5 мкл образца реакционной смеси. Реакционную смесь инкубировали в течение дополнительных 5 мин и измеряли значение ОЭ₄₀₅. Содержание холестерина подсчитывали из анализов стандартных растворов холестерина, содержащих 0,4, 0,3, 0,20, 0,1, 0,05 и 0 мг/мл холестерина в 99% ЕЮН.

Результаты.

Таблица показывает среднее значение 8 различных экспрессий культур.

Штамм	пр а >РС
О821ААргЕ[рС832пем1	74,2 ±10,1^ь
^а Τφχ представляет собой трансферазную активность, выраженную как % эстерефицированного холестерина, вычисленного из разницы между свободным холестерином в контрольном образце и свободным холестерином в образце фермента в реакции ФХ (Трс) в качестве донора и холестерина в качестве акцепторной молекулы. ^ь Среднее значение 8 различных экспрессий культуры

Пример 2.

Использование липидацилтрансферазы в рафинировании гидратацией.

Материалы и методы.

Фермент:

КЕ\13': липидацилтрансфераза, изученная в примере 1, имеющая 8ЕЕ) II) №. 68 (также упомянутая авторами как К932) - 1128 Т1РЕ/мл.

Масло:

8ВО 1: Неочищенное соевое масло от 8о1ае, АагЬиз, ЭК. 27.09.2007 Ое1Це (на основании бобов из Канады).

8ВО2: Неочищенное соевое масло из Бразилии.

К8О 3: Неочищенное экстрагированное рапсовое масло из Ка^18Йатη АагЬиз.

К8О 4: Неочищенное прессованное рапсовое масло от 8сзпо1з, АагЬиз, ЭК.

Стандартная смесь соевых лецитинов (8Т16) от 8ресйа Е1рцЕ Германия.

Методы.

ВЭ-ТСХ:

Аппликатор: Автоматический самплер для ТСХ 4, СΑΜΑО.

Пластинка для ВЭ-ТСХ: 20x10 см, Μе^ск № 1.05641. Активируется за 10 мин при 160°С перед использованием.

Нанесение.

Масляная фаза: 5 мкл 8% раствора масла в хлороформе:метаноле 2:1 были нанесены на пластину для ВЭ-ТСХ, используя автоматический самплер для ТСХ.

Фаза смолы: фаза смолы из 10 г масла была растворена в 7,5 мл смеси хлороформ:метанол 2:1.

мкл образца нанесли на пластинку для ВЭ-ТСХ.

Аппликатор для ТСХ.

Пропускаемый буфер 6: хлороформ:1-пропанол:метилацетат:метанол: 0,25% КС1 в воде 25:25:25:10:9.

Пропускаемый буфер 5: Р-эфир: МТВЕ 30:70.

Элюирование: пластинка была элюирована 7 см с использованием автоматической камеры хроматографирования АОС2 от Сатад.

- 49 020035

Хроматографирование.

Пластина была высушена в печке в течение 10 мин при 160°С, охлаждена и погружена в 6% ацетат меди в 16% Н₃РО₄. Высушивалась дополнительно 10 мин при 160°С и сразу же оценивалась.

После хроматографирования пластины были просканированы на сканере Сатад и была вычислена площадь каждого компонента (пятна) на пластинке ТСХ.

Вычисление.

Масляная фаза.

Количество фосфолипида в масляной фазе было вычислено путем анализа стандартного лецитина с известными концентрациями фосфолипидов (РЕ, РА, ΡΙ, РС, Р8) при различных концентрациях на той же пластине ТСХ, как и в случае образцов масла. На основании стандартной смеси была построена кривая калибровки для каждого фосфолипида, и она использовалась для вычисления концентрации для каждого фосфолипида в образце масла.

На основании молекулярной массы концентрации фосфолипидов были преобразованы в м.д. Р (фосфора).

Фаза смолы.

Содержание триглицерида в фазе смолы было вычислено на основании анализа стандарта очищенного растительного масла на той же пластине, как в случае фазы смолы. На основании анализа растительного масла была построена кривая калибровки, и она использовалась для вычисления триглицерида в фазе смолы.

Анализ фосфолипидов в фазе смолы был основан на применении различных объемов фазы смолы из контроля (без добавленного фермента) на той же пластине, как и в случае других фаз смолы. На основании анализа фосфолипидов (РЕ и РА) в контрольной смоле была построена кривая калибровки, и она использовалась для вычисления количества фосфолипидов в обработанных ферментом образцах относительно количества фосфолипида в контроле, которое было определено как 100%.

Измерение рН.

рН образцов при рафинировании масла был проанализирован методом флуоресценции, описанным в <Ь11р://^^^.31-ика.сот/бо^п1оабк/йубгор тап.рбГ>, т.е. измерение рН проводилось при использовании НубгоР1а1е® НР96С от Ргекепк, бокеГ Епдег! 81г. 11, Ό-93053 Регенсбург, Германия.

НубгоР1а1е® представляет собой стерильный, полистироловый микротитровальный планшет, как правило, с 96 лунками с 96 интегрированными датчиками. Датчик иммобилизирован внизу каждой лунки. Датчик может быть считан снизу. Это может быть сделано почти любым коммерчески доступным ридером для флуоресцентного планшета. Количественное определение базируется на 2 различных флуоресцентных красителях: чувствительный к рН индикатор и инертный референтный краситель. Эта комбинация гарантирует точный сигнал с внутренним эталоном для того, чтобы достигнуть самых точных результатов экспериментов.

рН может альтернативно быть измерен при использовании рН электрода согласно Во Υаид е! а1. 6АОС8, уо1. 83, Ш. 7 (2006), р. 653-658.

Определение воды в масле.

Остаточная вода в масле определяется методом АОС8 Са 2с-25 или эквивалентным. Анализ ГЖХ.

Капиллярный газовый хроматограф Регкш Е1тег Аи1окук1ет 9000, оборудованный ШСОТ спаянной кварцевой колонкой 12,5 мх0,25 мм ВДхпленки толщиной 0,1 мкм из 5% фенилметил силикона (СР 811 8 СВ от СНготраск).

Газ-носитель: гелий.

Инжектор. Р881 охлажденная расщепленная инъекция (начальная темп. 50°С, нагревают до 385°С), объем 1,0 мкл.

ПИД датчик: 395°С.

Программа печи (используемая с 30.10.2003): Температура печи, °С.

Изотермический, время, мин.

Скорость изменения температуры, °С/мин.

1	2	3
90	280	350
1	0	10
15	4

Приготовление образца: 50 мг образца растворили в 12 мл пиридина, содержащего внутренний стандарт гептадекан, 0,5 мг/мл. 500 мкл раствора образца затем перенесли в укупоренный флакон, добавили 100 мкл М8ТРА:ТМС8 - 99:1 (№метил-№триметилсилил-трифторацетамид) и проводили реакцию в течение 20 мин при 60°С.

Вычисление: факторы ответа для стерина, стеринпальмитата и стеарата стерина были определены на основании чистого материала сравнения (взвешивание и добавление 8-10 мг чистого материала в 12 мл пиридина, содержащего внутренний стандарт гептадекан, 0,5 мг/мл).

Количественное определение фермента, Т1Ри.

Субстрат.

0,6% Ι.-α 95% растительного фосфатидилхолина (Ауапй # 441601), 0,4% Тритон-Х 100 (Сигма

- 50 020035

Х-100) и 5 мМ СаС1₂ растворили в 0,05 М НБРБ8 буфере с рН 7.

Процедура испытания.

мкл субстрата добавили в кювету, используя автоматический анализатор КопеБаЬ.

Во время Т=0 мин было добавлено 4 мкл ферментативного раствора. Также был проанализирован холостой раствор с водой вместо фермента. Образец смешали и инкубировали при 30°С в течение 10 мин.

Содержание свободных жирных кислот в образце было проанализировано при использовании комплекта ХББА С от \АКО ОтЬН.

Ферментативная активность ТИЧ/ рН 7 была вычислена как микромоль жирной кислоты, полученной в минуту при условиях испытания.

Процедура рафинирования в лабораторном масштабе.

100 г неочищенного соевого масла масштабировали в 250 мл колбе В1ие Сар с крышкой и нагревали до 50, или 55, или 60, или 65, или 70°С.

Затем к маслу добавили воду, что сопровождалось добавлением фермента. Масло гомогенизировали с помощью мешалки 1/Ига Тиггах в течение 30 с и затем встряхивали в течение 30 мин при магнитном перемешивании при 450 об/мин. Через 30, 120 или 180 мин 10 мл масла перенесли в 12-мл центрифужную пробирку (предварительно масштабированную). Масло нагрели до 97°С в бане с кипящей водой в течение 10 мин и затем немедленно центрифугировали при 5000д в течение 5 мин. Масло декантировали от смоляной фазы и пробирки дренировали в течение 30 мин и определяли вес обеих фаз (см. фиг. 75).

Масляная фаза была проанализирована на свободные стерины, стериновые эстеры и свободные жирные кислоты путем ГЖХ, а масляная фаза была также проанализирована с помощью ТСХ (см. фиг. 76).

Результаты.

Пример 2а.

В этом эксперименте КБМ3' была проверена в процессе рафинирования гидратацией неочищенного 8ВО 1.

Были протестированы различные дозировки КБМ3' от 0,1 до 0,5 ТПЧ/г масла, а также было проверено воздействие смешивания и11га Тиггах.

Таблица ниже вместе с фиг. 77 показывает четкое сокращение фазы смолы и улучшенный выход масла (в масляной фазе) в образцах, обработанных КБМ3'.

Отмечалось увеличение приблизительно на 2% масла и наблюдалась тенденция того, что был получен увеличенный выход путем повышения дозировки фермента.

Смешивание также оказало влияние на фазу смолы. Было замечено, что обработка масла и11га Тиггах в течение 30 с сразу после добавления фермента давало меньшую фазу смолы, но эффект добавления фермента был почти таким же со смешиванием и11га Тиггах или без него. В промышленности нормально накачивать масло через статический миксер или динамический миксер после добавления и, чтобы подражать этому в лабораторном масштабе, было решено использовать смешивание и11га Тиггах.

2460-150 (Пример 2а)1* 2 3 4 5* 6 7 8

Неочищенное соевое масло 8о1ае 4.27-9-07	г	100	100	100	100	100	100	100	100
К.БМЗ’ ΙΟΟΤΙΡΕ/мл	мл	0	0,1	0,25	0,5	0	0,1	0,25	0,5
Дополнительная вода	мл	2,00	1,90	1,75	1,50	2,00	1,90	1,75	1,50
ΤΙΡΕ/г масла		0,00	0,10	0,25	0,50	0,00	0,10	0,25	0,50
% воды		2	2	2	2	2	2	2	2
иНга Тиггах		-	-	-	-	+	+	+	+
рн		5,39	5,7	5,91	5,72	5,55	5,99	5,72	5,49
Фаза смолы, %		8,48	6,36	5,73	4,76	6,19	4,63	4,44	4,19
Масляная фаза %		91,5	93,6	94,3	95,2	93,8	95,4	95,6	95,8

* Контроль без добавления фермента

- 51 020035

Пример 2Ь.

Два различных неочищенных 8ВО были протестированы при рафинировании гидратацией согласно стандартной процедуре с добавлением КБМ3' фермента или без него. Дозировка фермента составляла 0,25 ТРЕ/г.

Рецепт.

2460-151 (Пример 2Ь)	1	2	3	4
8ВО 1	г	100	100
8ВО2	г			100	100
КЬМЗ’ ΙΟΟΤΙΡΕ/мл	мл	0	0,25	0	0,25
Дополнительная вода	мл	2,00	1,75	2,00	1,75
ΤΙΡΕ/г масла		0,00	0,25	0,00	0,25
% воды		2	2	2	2
РН		5,78	5,75	5,73	5,68

Результаты, показанные в таблице ниже, указывают на четкое сокращение фазы смолы и через 30 и через 120 мин реакции, что соответствует более высокому выходу масла. Анализ стерина и стеринового эстера в масляной фазе показал высокую конверсию стерина в стериновый эстер в обработанных ферментом образцах. Также замечено, что количество свободной жирной кислоты (СЖК) увеличилось, потому что также имела место гидролитическая активность.

Результаты.

2460-151	8ВО 1	8ВО 1	8ВО2	8ВО2
КЬМЗ’, масло Е/г	0	0,25	0	0,25
% Смола, 30 мин	6,20	5,21	5,66	4,80
% Смола, 120 мин	5,59	4,86	5,24	3,90
% Масло, 30 мин	93,8	94,79	94,34	95,2
% Масло, 120 мин	94,41	95,14	94,76	96,1
Масляная фаза
Общее количество СЖК	0,37	0,53	0,64	0,85
Стерины	0,31	0,09	0,27	0,07
Стериновый эстер	0,14	0,47	0,12	0,50

Пример 2с.

В этом эксперименте были протестированы различные дозировки КБМ3' в рафинировании гидратацией 8ВО2 при 50°С. Были также протестированы различные уровни воды, а именно 1,5, 2 и 2,5%, в процессе с добавлением фермента и без него.

Рецепт.

2460-152 (Пример 2с)	1	2	3	4	5	6	7	8
8ВО2	г 100	100	100	100	100	100	100	100
КЬМЗ’ 100Т1РЕ/мл	мл 0	0,1	0,25	0,4	0	0,25	0	0,25
Дополнительная вода	мл 2,00	1,90	1,75	1,60	1,50	1,25	2,50	2,25
Масло ΤΙΡΕ/γ	0,00	0,10	0,25	0,40	0,00	0,25	0,00	0,25
% вода	2	2	2	2	1,5	1,5	2,5	2,5
рН	5,32	5,92	5,72	5,59	5,58	5,73	5,30	5,81

Результаты, показанные в таблицах, а также на фиг. 78-84, четко указывают уменьшенное количество фазы смолы и, поскольку сумма фазы смолы и масляной фазы составляет 100%, приходят к заключению, что ацилтрансфераза (КБМ3') способствует улучшению выхода масла в масляной фазе.

Было также замечено, что содержание фосфолипида в фазе смолы было уменьшено в обработанных ферментом образцах. И фосфатидилэтаноламин (РЕ) и фосфатидная кислота (РА) были уменьшены в фазе смолы относительно количества этих фосфолипидов в фазе смолы без обработки фермента. Количество триглицерида в фазе смолы было также меньшим в обработанных ферментом фазах смолы, что также подтверждает увеличение выхода масла (в масляной фазе) в обработанных ферментом образцы.

Количество воды, добавленной к неочищенному соевому маслу, также показало, как ожидалось, воздействие на количество фазы смолы, но результаты также подтвердили эффект ацилтрансферазы на выход при различном добавлении воды относительно контроля без добавления фермента (см. фиг. 80).

В экспериментах рафинирования гидратацией рН был в диапазоне от 5,5 до 6, что объясняет высокую активность фермента при низкой дозировке и высокую конверсию стерина в стериновые эстеры.

- 52 020035

Результаты.

2460-152		1	2	3	4	5	6	7	8
Фаза смолы
Смола, 30 мин	%	6,48	5,14	5,68	5,19	5,73	4,85	7,06	6,03
Смола, 120 мин;	%	5,79	5,88	4,86	4,94	5,65	5,07	6,12	5,96
Анализ ТСХ
Фосфор	М.д.	66	73	64	58	76	62	65	62
РА,	% отн.	100	61	45	35	86	47	105	50
РЕ	% отн.	100	45	24	18	88	26	102	34
Триглицерид	%	65	26	37	29	62	41	62	38
Анализ ГЖХ
СЖК	%	0,63	0,71	0,78	0,87	0,57	0,79	0,57	0,73
Свободные стерины		0,27	0,12	0,06	0,05	0,27	0,06	0,26	0,11
Стериновые эстеры		0,18	0,41	0,47	0,51	0,12	0,53	0,13	0,40

Исследования были сделаны в двойном повторении, и результаты использовались для статистической оценки результатов с использованием программного обеспечения 81а1С.1гар1нс 8 Р1и8.

Пример 2б.

Чтобы исследовать эффект К1.М3' на выход масла в различной температуре, фермент был протестирован в рафинировании гидратацией 8ΒΟ2 при 55, 60, 65 и 70°С.

Рецепт.

2460-154, 155, 156 и 157 1	2	3	4
8ВО 2 КЬМЗ’ ΙΟΟΤΙΡΕ/мл	г 100 мл 0	100 0,10	100 0,20	100 0,30
Дополнительная вода	мл 2,00	1,90	1,80	1,70
Масло ΤΙΡΕ/γ	0,00	0,10	0,20	0,30
% воды	2	2	2	2

Результаты, показанные в таблице ниже, четко иллюстрируют эффект К1.М3' на количество фазы смолы. Дозировка 0,1 ТГРЕ/г масла при всех температурах дала существенное сокращение количества смолы. Увеличение количества фермента до 0,2 и 0,3 дополнительно немного уменьшило фазу смолы.

Результаты.

% фаза смолы путем рафинирования гидратацией 8ΒΟ2 при различной температуре, времени реакции и дозировке фермента.

Температура Время реакции °С минуты	Фермент Фермент 0 ΤΙΡΕ/γ 0,1 ΤΙΡΕ/γ	Фермент 0,2 ΤΙΡΕ/γ	Фермент 0,3 ΤΙΡΕ/γ
55	30	6,53	4,77	5,12	5,54
60	30	6,64	4,83	4,73	4,55
65	30	6,79	5,63	5,05	4,94
70	30	6,49	4,58	4,36	4,23
55	120	6,29	4,94	4,72	4,80
60	120	5,79	4,76	4,47	4,05
65	120	6,70	5,37	4,84	5,39
70	120	5,05	4,41	3,39	3,00

Пример 3.

Ферментативное рафинирование гидратацией на экспериментальном заводе.

Рецепт.

Компоненты применяли в экспериментальных испытаниях рафинирования гидратацией.

Партия 1: контроль, 70°С.

Партия 2: с ферментом (а именно, липидацилтрансфераза К932 - иногда упоминаемая авторами как КЬМ3' - которая имеет аминокислотную последовательность, показанную авторами как 8ЕС) ΙΌ Мо. 68), 70°С.

Партия 3: контроль, 55°С.

Партия 4: с ферментом (а именно, липидацилтрансфераза К932 - иногда упоминаемая авторами как КЬМ3' - которая имеет аминокислотную последовательность, показанную авторами как 8ЕС) ΙΌ Ν^ 68), 55°С.

	Количество	1	Партия
2	3	4
№ в журнале		2460-158	2460	-160
Неочищенное соевое масло	кг	20	20	20	20
К932, 1128 Т1РЕ/мл	Мл	0	3,55	0	3,55
Дополнительная вода	Мл	400,30	396,10	400,1	396,47
Масло Т1РЕ-ЮТ		0,00	0,2	0,00	0,2
Вода	%	2	2	2	2

- 53 020035

Экспериментальная заводская процедура рафинирования гидратацией.

Масло было первоначально нагрето под Ν₂ и при встряхивании в 50-литровом резервуаре. Впоследствии к маслу была добавлена вода (и фермент). В начальных экспериментах (партии 1 и 2) масло было рециркулировано после добавления воды и фермента с помощью гомогенизатора (8буег8оп, СНекНат, Швеция). В партиях 3 и 4 для снижения встряхивания в резервуаре использовался только рециркуляционный насос.

Образцы масла были собраны (партии 1-4) для лабораторного анализа через 30 мин ферментативной активности и их поместили в баню с кипящей водой (10 мин), чтобы инактивировать фермент. Инактивация оставшегося масла в резервуаре была осуществлена путем нагрева масла до 75°С (при встряхивании). Впоследствии, центрифугирование было выполнено в предварительно подогретой (горячей водой) центрифуге (А1£а Ьауа1) и масляная фаза была набрана в ведра и взвешена. Тестировались различные регуляторы емкости центрифуги, не было возможности контролировать отделенную фазу смолы, поскольку объем центрифуги был слишком большой по сравнению с количеством масла. Фаза смолы была, таким образом, собрана с крышки центрифуги, где она накопилась.

Лабораторное рафинирование гидратацией и центрифугирование.

100 г неочищенного соевого масла масштабировали в 250 мл колбе В1ие Сар с крышкой и нагревали до 55°С. К маслу добавили воду, что сопровождалось добавлением фермента. Масло гомогенизировали с помощью мешалки И11га Тиггах в течение 30 с и затем встряхивали в течение 30 мин при магнитном перемешивании при 450 об/мин. Через 30 мин 10 мл масла перенесли в 12-мл центрифужную пробирку (предварительно масштабированную). Масло нагрели до 97°С в бане с кипящей водой в течение 10 мин и затем немедленно центрифугировали при различных относительных силах центрифугирования (500, 1000, 2500 и 5000) в течение разного периода времени (3, 6 и 10 мин).

Масло декантировали из фазы смолы и пробирки дренировали в течение 15 мин и определяли вес обеих фаз. Масляная фаза была проанализирована на свободные фитостерины, стеринэстеры и свободные жирные кислоты путем ГЖХ, а масляная фаза была проанализирована с помощью ВЭ-ТСХ.

Результаты и обсуждение.

Выход масла.

Фиг. 85 показывает увеличение выхода масла, полученного из ферментативного рафинирования неочищенного соевого масла в соответствии с существующим изобретением по сравнению с контролем. Масло центрифугируется при увеличенной относительной центрифугирующей силе (гс£) (500, 1000, 2500 и 5000) в течение 3 мин, и выход масла вычисляют из количества (%) смолы в контроле с вычетом количества смолы в ферментативных образцах.

Четко замечено, что выход масла увеличивается при ферментативном рафинировании по сравнению с контролем и что выход масла увеличивается с уменьшением ОЦС.

Эффект центрифугирования.

Количество триглицеридов в смоле и количество смолы, полученной из образцов масла, центрифугируемых в разное время (минуты в столбцах), показано для партий 3 и 4 на фиг. 86.

Результаты иллюстрируют, что ОЦС влияет на количество (%) смолы, полученной в результате обычного рафинирования (синие столбцы). Первоначально, при низкой ОЦС (500-1000) количество смолы является высоким (высокое содержание триглицеридов) по сравнению с количеством, полученным при относительных силах центрифугирования, составляющих 2500-5000. Время центрифугирования (3, 6 и 10 мин), по-видимому, не влияет на количество смолы, по крайней мере, не при центрифугировании при 5000 ОЦС.

При инспектировании смолы, полученной при ферментативном рафинировании согласно существующему изобретению, обнаружено, что на количество, по-видимому, не влияет ОЦС и время. Не ограничиваясь теорией, этот факт может объясняться различиями в вязкости между смолами, полученными из обычного и ферментативного рафинирования согласно существующему изобретению. На фиг. 87 показаны показатели вязкости на основании фаз смолы. Вязкость уменьшается с увеличением скорости сдвига для обоих типов смолы, однако вязкость уменьшается до более высокой степени в смолах, полученных при ферментативном рафинировании в соответствии с существующим изобретением.

Кроме того, увеличение выхода масла, уменьшение вязкости, достигнутые с помощью существующего изобретения, могут иметь другую выгоду для промышленного рафинирования гидратацией. Вероятно, что может быть увеличена производительность.

- 54 020035

Пример 4.

Оценка №О11 при рафинировании гидратацией неочищенного соевого масла.

Рецепт.

Таблица 1 Образцы для испытаний рафинирования гидратацией

Журнал 2460-181	1	2	3	4	5	6	7	8
Неочищенное соевое масло	г	100	100	100	100	100	100	100	100
К932 100 ΤΙΡΕ/мл	мл	0	0,1	0,1	о,1	0,1	0,1	0,1	0,1
4% раствор ИаОН	мл	0	0	0,1	0,2	0,5	1	1,5	1,9
Дополнительная вода	мл	2,00	1,90	1,80	1,70	1,40	0,90	0,40	0,00
Масло ΤΙΡΕ-Κ/γ		0,00	0,10	0,10	0,10	0,10	0,10	0,10	0,10
% воды		2	2	2	2	2	2	2	2

Лабораторная процедура рафинирования гидратацией.

100 г неочищенного соевого масла масштабировали в 250 мл колбе В1ие Сар с крышкой и нагревали до 55°С. К маслу добавили воду и №О1 Е что сопровождалось добавлением фермента. Масло гомогенизировали с помощью мешалки ЦИта Тиггах в течение 30 с и затем встряхивали в течение 30 мин при магнитном перемешивании при 450 об/мин. Через 30 мин приблизительно 10 мл масла перенесли в 12-мл центрифужную пробирку (предварительно масштабированную). Масло нагрели до 97°С в бане с кипящей водой в течение 10 мин.

Результаты и обсуждение.

Анализ выхода масла.

Фиг. 88 показывает увеличение выхода масла, полученное при ферментативном рафинировании с КЕМ3' (а именно, липидацилтрансфераза К932 - иногда упоминаемая авторами как КЕМ3' - которая имеет аминокислотную последовательность, показанную авторами как ВЕС) ΙΌ №. 68) (0,1 Т1РЕ-К/г) и увеличивающемся количестве №О11 (0, 0,1, 0,2, 0,5, 1, 1,5 и 1,9 мл 4%-ного раствора). Вычисления основаны на количестве смолы в контроле за вычетом количества смолы в ферментативных образцах.

Самое высокое увеличение выхода масла достигается ферментативным рафинированием без №О1 Е и вообще увеличенный выход масла (%) уменьшается с увеличением количества №О11. Это наиболее вероятно можно объяснить увеличением омыления триглицеридов с увеличением количества №О11. Однако, инспектируя триглицериды в контроле и ферментативных образцах смолы (фиг. 89), обнаружено, что содержание не заметно выше в обработанной №О11 смоле, чем то, которое обычно наблюдается без №О11. Уровень триглицерида в ферментативных образцах без №О11 аналогично является сопоставимым с предыдущими наблюдениями.

Анализ жирных кислот, фитостеринов и фитостеринового эстера в масле.

Содержание фитостеринов, фитостериновых эстеров и свободных жирных кислот в контроле и ферментативно обесмоленных маслах изображено на фиг. 90. Содержание фитостериновых эстеров увеличивается с 0,19% (контроль) до 0,42% (0,2 мл №ОН), где оно достигает максимума. После этой точки фитостериновые эстеры уменьшаются до 0,15%. Соответственно, наблюдается начальное уменьшение фитостеринов от 0,3-0,12%, что сопровождается увеличением с 0,12-0,28%.

СЖК также увеличиваются до рН 6,3 (0,2 мл №О1 Г) наиболее вероятно из-за увеличенного омыления.

Результаты четко иллюстрируют, что проведение рафинирования гидратацией при более высоких значениях рН увеличивает трансферазную активность липидацилтрансферазы КЕМ3'. Даже небольшое увеличение рН (например, 0,1 мл №О1 Г) увеличивает образование фитостериновых эстеров приблизительно с 50%, почти не влияя на образование СЖК в масле (увеличивает 0,02%). Увеличение уровня СЖК важно учитывать, поскольку СЖК испаряются во время стадии устранения запаха и, таким образом, расцениваются как потеря масла.

Анализ содержания фосфолипида в масле.

Табл. 2 показывает содержание (м.д) фосфолипидов (фосфатидил-этаноламина и фосфатидной кислоты) в маслах (контроль и ферментативные образцы), обесмоленных с помощью возрастающих количеств (0, 0,1, 0,2, 0,5, 1 и 1,9 мл) №О11.

- 55 020035

Таблица 2 Содержание (м.д.) фосфора из ЗФ, РЕ, РС и общий фосфор в маслах, рафинированных возрастающим количеством (0, 0,1, 0,2, 0,5, 1, 1,5 и 1,9 мл) 4%-ного раствора ЫаОН.

Образец

рН	5,3	5,9	6,3	6,6	7,4	7,8	8,2	8,3
КЬМЗ’ (ΤΙΡΕ-Κ/γ)	0	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1
ЫаОН (мл)	0	0	0,1	0,2	0,5	1	1,5	1,9
РА	34,0	33,8	35,3	38,4	36,8	36,7	34,8	38,8
РЕ	6,8	5,9	5,0	5,6	4,9	4,0	5,0	4,6
РС	1,9	0,8	0	0	0	0,7	2,8	0,9
Общее содержание фосфора	42,8	40,6	40,2	44,1	41,8	41,5	42,6	44,3

Самое высокое сокращение (40,2 м.д.) фосфора наблюдается в маслах, рафинированных с 0,1 мл ЫаОН (рН 6,3), однако сопоставимое содержание получено при нормальных условиях рафинирования (0 мл ЫаОН). Следовательно, по-видимому, увеличение рН на 1,0 единицу действительно влияет на гидролитическую активность КЬМ3'. При рН выше 6,3 (>0,2 мл ЫаОН) наблюдается уменьшенная деградация фосфолипида по сравнению с нормальными ферментативными условиями.

Анализ содержания фосфолипида в смоле.

Фиг. 91 показывает относительную деградацию фосфатидной кислоты (РА), фосфатидилэтаноламина (РЕ), фосфатидилхолина и фосфатидилинозита (И) в ферментативных образцах смолы по сравнению с контролем. Деградация фосфолипидов в контроле установлена на 100%, и содержание в ферментативных образцах вычисляется по отношению к контролю.

Деградация фосфолипида в ферментативных образцах с помощью 0, 0,1 и 0,2 мл ЫаОН аналогична. Следовательно, применение ЫаОН в количестве меньше чем 0,2 мл не ослабляет деградацию фосфолипидов по сравнению с ферментативным рафинированием с помощью только КЬМ3'. Напротив, уменьшенная деградация наблюдается в маслах при применении ЫаОН в большем количестве (0,5, 1 и 1,9 мл).

Заключение.

Увеличение рН с помощью ЫаОН при рафинировании гидратацией неочищенного соевого масла привело, как ожидалось, к увеличению активности КЬМ3'. Образование фитостериновых эстеров увеличилось параллельно с увеличением количества ЫаОН. Максимальный уровень фитостериновых эстеров (0,42%) был получен при рН 6,3 (0,2 мл ЫаОН), за которым последовало непрерывное уменьшение. Подобное поведение наблюдалось для СЖК в масле, уровень которых увеличился с 0,46% в контроле до 0,60% в маслах, рафинированных с помощью 0,2 мл ЫаОН, после чего уменьшился.

Маленькое количество ЫаОН не влияло на гидролитическую активность КЬМ3', как наблюдается у сопоставимых уровней фосфолипидов в маслах, рафинированных с помощью 0 и 0,1 мл ЫаОН. Деградация фосфолипидов в фазе смолы была уменьшена по сравнению с нормальным ферментативным рафинированием (только КЬМ3') при рН выше 7,5 (>0,5 мл ЫаОН).

Самое высокое увеличение выхода масла было достигнуто с помощью ферментативного рафинирования без ЫаОН, и вообще % увеличение выхода масла уменьшалось с увеличением количества ЫаОН.

Заключение данного эксперимента состоит в том, что маленькое количество ЫаОН может быть выгодным для образования фитостериновых эстеров при рафинировании гидратацией, однако ЫаОН не оказывает положительного влияния на выход масла и деградацию фосфолипида.

Пример 5.

Анализ фазы смолы из ферментативного рафинирования гидратацией - Микроскопия и рентгенографический анализ.

Рецепт.

	1	2
Неочищенное соевое масло 8о1ае	г 100	100
К932 100 ΤΙΡΕ-Κ/мл	мл 0	0,20
Дополнительная вода	мл 2,00	1,80
Масло ΤΙΡΕ-Κ/Γ	0,00	0,20
% воды	2	2

100 г неочищенного соевого масла масштабировали в 250 мл колбе В1ие Сар с крышкой и нагревали до 55°С. К маслу добавили воду, что сопровождалось добавлением фермента. Масло гомогенизировали с помощью мешалки и11га Тиггах в течение 30 с и затем встряхивали в течение 30 мин при магнитном перемешивании при 450 об/мин. Через 30 мин масло центрифугировали (2000 гсГ в течение 3 мин). Фаза смолы была взята для микроскопии и рентгенографического анализа.

Результаты и обсуждение.

Микроскопия/рентгенографический анализ.

Смола из контрольных испытаний и испытаний ферментативного рафинирования гидратацией (последние в соответствии с существующим изобретением) была собрана для рентгенографического анализа

- 56 020035 и микроскопии. Фазы смолы были изучены под микроскопом (плоскополяризованный свет) при различных температурах (25, 35, 45, 55 и 65°С). При всех температурах смола была в чешуйчатой фазе (двойные слои липида, разделенные водными слоями), что наблюдается для контрольного и ферментативного образцов (25°С) на фиг. 92.

Несколько различий появляется между контрольным и ферментативным образцами. Контрольная смола кажется более грубой, чем ферментативно рафинированный образец в соответствии с существующим изобретением. Различия между контрольным и ферментативным образцом также могут наблюдаться при рентгенографическом анализе, как видно на фиг. 93.

Больший интервал, составляющий приблизительно 20 А, в контроле по сравнению с обработанным ферментом образцом соответствует длине цепи жирной кислоты (С 18). Интервал выражает водный и фосфолипидный слой, следовательно, больший интервал в контроле может объяснить, что контроль содержит дополнительный монослой жирных кислот или что больше воды поглощается фазой смолы.

Пример 6.

Исследование седиментации.

Рецепт.

		1	2
Неочищенное соевое масло 8о1ае	г	200	200
К932 100 ΤΙΡΕ-Κ/мл	мл	0	0,4
Дополнительная вода	мл	4,00	3,60
Масло Т1РЕ-К/г		0,00	0,20
% воды		2	2

Процедура.

100 г неочищенного соевого масла масштабировали в 250 мл колбе В1ие Сар с крышкой и нагревали до 55°С. К маслу добавили воду, что сопровождалось добавлением фермента. Масло гомогенизировали с помощью мешалки 011га Тиггах в течение 30 с и затем встряхивали в течение 30 мин при магнитном перемешивании при 450 об/мин. Через 30 мин образцы поместили в делительные воронки. Снимки фазы смолы делались через 1, 3 и 6 дней. После 6-го дня смола была взята для анализа микроскопией.

Результаты.

Снимки фаз смолы /микроскопии.

На фиг. 94 фазы масла и смолы могут наблюдаться для контроля и ферментативного образца. Седиментация под действием силы тяжести происходила в течение 3 дней. Между контролем и ферментативным образцом существуют четкие различия, что отмечается как для фазы масла, так и смолы.

Масляная фаза ферментативно обработанного масла (т.е. обработанного в соответствии с существующим изобретением) прозрачнее, чем контроль, и наблюдается уменьшенное количество смолы по сравнению с контролем. Результаты могут быть объяснены на основе анализа микроскопией (фиг. 95). Ферментативно обработанная смола наблюдается в виде эмульсии, в то время как контрольная смола представляет собой чешуйчатую фазу.

Пример 7.

Оценка переменного количества воды при ферментативном рафинировании неочищенного соевого масла

Рецепты.

Журнал 2460-165		1	2	3	4	5	6	7	8
Неочищенное соевое масло 8о1ае	г	100	100	100	100	100	100	100	100
К932 100 ΤΙΡΕ-Κ/мл	Мл	0	0,2	0	0,2	0	0,2	0	0,2
Дополнительная вода	Мл	1,00	0,800	1,50	1,30	2,00	1,80	2,50	2,30
КЬМЗ ’ активность (масло Т1РЕ-К/г)		0,00	0,20	0,00	0,20	0,00	0,20	0,00	0,20
% воды		1	1	1,5	1,5	2	2	2,5	2,5
Журнал 2460-169		1	2	3	4	5	6

Неочищенное соевое масло 8о1ае	г	100	100	100	100	100	100
К932 100 Т1Ри-К/мл	мл				0,2	0,2	0,2
Дополнительная вода	мл	1,00	1,50	2,00	0,80	1,30	1,80
КБМЗ’ активность (масло Т1Р11-К/§)					0,20	0,20	0,20
% воды		1	1,5	2	1	1,5	2

Журнал 2460-170	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
Неочищенное соевое масло	г 100	100	100	100	100	100	100	100	100	100
8о1ае
К932 100 ΤΙΡΕ-Κ/мл	мл 0	0	0	0	0	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
Дополнительная вода	мл 1,00	1,25	1,50	1,75	2,00	0,80	1,05	1,30	1,55	1,80
КЦМЗ ’ активность (масло	0,00	0,00	0,00	0,00	0	0,20	0,20	0,20	0,20	0,20
ΤΙΡΕ-Κ/γ)
% воды	1,00	1,25	1,50	1,75	2,00	1,00	1,25	1,50	1,75	2,00

- 57 020035

Процедура лабораторного рафинирования гидратацией.

100 г неочищенного соевого масла масштабировали в 250 мл колбе В1ие Сар с крышкой и нагревали до 55°С. К маслу добавили воду, что сопровождалось добавлением фермента. Масло гомогенизировали с помощью мешалки И11га Тиггах в течение 30 с и затем встряхивали в течение 30 мин при магнитном перемешивании при 450 об/мин. Через 30 мин 10 мл масла перенесли в 12-мл центрифужную пробирку (предварительно масштабированную). Масло нагрели до 97°С в бане с кипящей водой в течение 10 мин. Пробирки центрифугировали при 300 оцс в течение 3 мин. Масло декантировали из фазы смолы и пробирки дренировали в течение 15 мин, переворачивая пробирку вверх дном. На основании массы фазы смолы был вычислен выход масла.

Результаты и обсуждение.

Выход масла.

Фиг. 96 показывает увеличенный выход масла, полученный при ферментативном рафинировании гидратацией неочищенного соевого масла с разными количествами воды. Увеличенный выход масла вычисляют из количества смолы в контроле за вычетом количества смолы в ферментативных образцах.

Ферментативное рафинирование позволяет получить увеличенный выход масла по сравнению с контролем, и, по-видимому, выход масла увеличивается с уменьшением количества воды. Выход масла увеличивается приблизительно на 50% при ферментативном рафинировании по сравнению с контролем, в то время как содержание воды уменьшается от 2 до 1%.

Эти вычисления основаны на количестве смолы и, следовательно, также включают содержание триглицеридов в фазе смолы. При инспектировании фактической потери масла (на основании количества смолы и содержания триглицерида в смоле) (фиг. 97), потеря масла уменьшается в контроле с увеличением содержания воды. Однако при ферментативном рафинировании количество воды оказывает некоторое влияние на потерю масла. Приблизительно 2% масла теряется при ферментативном рафинировании по сравнению с 3,5-6,5% в контроле.

Уменьшенное количество воды при ферментативном рафинировании гидратацией может быть финансовым преимуществом для промышленности (меньше промышленной воды) и наиболее вероятно также относительно экономии энергии во время высушивания фазы смолы.

Деградация фосфолипида в фазе смолы.

Относительная деградация (%) фосфатидной кислоты (РА) и фосфатидилэтаноламина (РЕ) в ферментативных фазах смолы относительно контроля показана на фиг. 98.

Деградация фосфолипида с помощью КЬМ3', по-видимому, является более выраженной при более низких концентрациях воды. В целом ферментативное рафинирование с помощью КЬМ3' и 1% воды, повидимому, является преимуществом относительно деградации фосфолипидов по сравнению с рафинированием с 2% воды.

Измерения вязкости фазы смолы.

Вязкость ферментативных (КЬМ3' 0,2 ТРЕ-К/г) фаз смолы при рафинировании с различным количеством воды показана на фиг. 99. Различное содержание воды заметно не повлияло на вязкость. При более низкой скорости сдвига (до приблизительно 10) вязкость несколько подобна для всех образцов, однако после этой точки вязкость образцов с самым низким количеством (1,25%) воды увеличивается, в то время как образцов смолы с самым высоким количеством (2%) воды увеличивается.

Пример 8.

Рафинирование гидратацией неочищенного кукурузного масла.

Резюме.

Липидацилтрансфераза, КЬМ3' (иногда упоминаемая авторами как КЬМ3' и которая имеет аминокислотную последовательность, показанную авторами как 8ЕЭ ΙΌ Νο. 68, была протестирована на неочищенном кукурузном масле с целью изучить эффекты на выход масла при рафинировании гидратацией этого масла.

Материалы и методы.

Фермент:

КЬМ3' К932 - 1128 ТРЕ/г.

Масло:

Неочищенное кукурузное масло от СагдШ, май 2008 г.

Процедура рафинирования.

100 г неочищенного кукурузного масла масштабировали в 250 мл колбе В1ие Сар с крышкой и нагревали до 55°С.

Были добавлены вода и фермент и масло гомогенизировали с помощью мешалки И11га Тиггах в течение 30 с и затем встряхивали в течение 30 мин при магнитном перемешивании при 450 об/мин. Через 30 мин 10 мл масла перенесли в 12-мл герметичную центрифужную пробирку и отметили массу масла. Масло нагрели до 97°С в бане с кипящей водой в течение 10 мин, а затем немедленно центрифугировали при 3000 оцс в течение 3 мин. Масло декантировали из фазы смолы и пробирки дренировали в течение 15 мин, переворачивая пробирку вверх дном. На основании массы фазы смолы был вычислен выход масла по отношению к маслу, не обработанному ферментом. Затем фазу смолы проанализировали с помо

- 58 020035 щью ВЭ-ТСХ и была вычислена деградация фосфолипидов в фазе смолы. Результаты.

Процесс рафинирования масла проводился с различными концентрациями К1А-13'.

Таблица 1 Рецепт для рафинирования неочищенного кукурузного масла 2460-182 1 2 3 4 5

Неочищенное кукурузное	г	100	100	100	100	100
масло
К932 100 ΤΙΡΕ-Κ/мл	мл	0	0,050	0,10	0,20	0,50
Дополнительная вода	мл	2,00	1,95	1,90	1,80	1,50
Масло ΤΙΡΕ/γ		0,00	0,05	0,10	0,20	0,50
% воды		2	2	2	2	2

Образцы обрабатывали так, как описано в процедуре рафинирования, и количество влажной смолы было определено в двойном повторении с результатами, показанными ниже.

Таблица 2

Фаза смолы, % при рафинировании гидратацией неочищенного кукурузного масла

Образец Фермент, Единицы/г Фаза смолы Увеличение выхода

1	0	6,0	0,00
2	0,05	5,7	0,28
3	0,1	5,5	0,44
4	0,2	5,6	0,36
5	0,5	5,6	0,38

Из результата в табл. 2 видно, что К1 А-13' способствуют уменьшению количества фазы смолы путем рафинирования гидратацией неочищенного кукурузного масла. Уменьшенное количество фазы смолы соответствует увеличению масляной фазы от 0,28 до 0,44%.

Фаза смолы, изолированная при рафинировании гидратацией неочищенного кукурузного масла, была проанализирована с помощью ТСХ и сокращение содержания фосфатидилэтаноламина и фосфатидной кислоты было вычислено по отношению к количеству в смоле без обработки ферментом (табл. 3)

Таблица 3

ТСХ анализ фазы смолы

Дозировка фермента РА РЕ

Масло ΤΙΡΕ/г Относительное % Относительное %

0	100	100
0,05	88	85
0,1	73	68
0,2	75	72
0,5	72	64

РЕ = фосфатидилэтаноламин, РА = фосфатидная кислота.

Результаты из табл. 3 указывают на активность КЫ3' на фосфолипидах в неочищенном кукурузном масле. Повышенная активность фермента отмечалась до дозировки, равной 0,1 Т1РЕ/г масла. При более высокой дозировке активность фермента по отношению к фосфолипидам выравнивается.

Пример 9.

Рафинирование гидратацией неочищенного соевого масла и добавление акцепторов.

Липидацилтрансфераза, КШ3', была протестирована в неочищенном соевом масле от 8о1ае с целью изучить эффекты добавления акцепторного субстрата для фермента КЫ3'.

В этом исследовании были протестированы фитостериновый продукт беиегс^ 122 от №π^ό1, Германия, а также жирный спирт и лауриловый спирт.

Добавление фитостерина к маслу позволило получить больше стеринового эстера, что сопутствует сокращению образования свободных жирных кислот. Пришли к заключению, что более высокая степень преобразования фосфолипида может быть достигнута без увеличения производства жирных кислот при наличии большего количества акцепторного субстрата.

Материалы и методы.

Фермент:

КШ3' К932 (имеющая аминокислотную последовательность, показанную как 8ЕР ГО №. 68) 1128 Т1РЕ/г.

Фитостерин из сои: Оеηе^ο1 122 N от Оттай, Ше^ί^88еη, Германия. Лауриловый спирт: Сигма Ь-5375.

Масло:

Неочищенное соевое масло от 8о1ае, январь 2008 г.

Стандарт смеси соевых лецитинов (8Т16) от 8рес1та ЫрМ, Германия.

- 59 020035

Процедура рафинирования.

100 г неочищенного соевого масла, фитостерина и лаурилового спирта масштабировали в 250 мл колбе В1ие Сар с крышкой и нагревали до 55°С. Фитостерин полностью растворили в масле перед дальнейшей обработкой.

Были добавлены вода и фермент и масло гомогенизировали с помощью мешалки ИНга Тиггах в течение 30 с и затем встряхивали в течение 30 мин при магнитном перемешивании при 450 об/мин. Через 30 мин 10 мл масла перенесли в 12-мл герметичную центрифужную пробирку и отметили массу масла. Масло нагрели до 97°С в бане с кипящей водой в течение 10 мин, а затем немедленно центрифугировали при 3000 оцс в течение 3 мин. Масло декантировали из фазы смолы и пробирки дренировали в течение 15 мин, переворачивая пробирку вверх дном. На основании массы фазы смолы был вычислен выход масла. Затем фазу смолы и масляную фазу проанализировали с помощью ВЭ-ТСХ и было вычислено количество триглицерида в фазе смолы и деградация фосфолипидов в масляной фазе.

Результаты.

Процесс рафинирования масла проводился с различными концентрациями К1.М3, фитостерина и жирного спирта, как показано в табл. 1.

Таблица 1

Рецепт для рафинирования неочищенного соевого масла 2460-182 12 3 4 5 6 7 8 | 9

Неочищенное соевое масло, 8о1ае	г	100	100	100	100	100	100	100	100	100
4,16-01-2008
К.932 100 ΤΙΡΕ-Κ/мл	мл	0	0,20	0,20	0,20	0,2	0,2	1	1	0,2
Оепего1 122 N	г		0	0,25	0,50	0,75	0,75		0,75
4% ΝβΟΗ	мл						0,2
Лауриловый спирт	г									0,5
Дополнительная вода	мл	2,00	1,80	1,80	1,80	1,80	1,80	1,00	1,00	1,80
РН		4,90	5,65	5,55	5,48	5,41	6,18	5,29	5,27	5,57
Масло ΤΙΡΕ/γ		0,00	0,20	0,20	0,20	0,20	0,20	1,00	1,00	0,20
% воды		2	2	2	2	2	2	2	2	2

Образцы обрабатывали, как описано в процедуре рафинирования, и количество влажной смолы было определено в двойном повторении с результатами, показанными на фиг. 100.

Добавление возрастающего количества фитостерина не способствовало какому-либо уменьшению % смолы, и коррекция рН (испытание 6) не оказывала никакого существенного эффекта на количество смолы, хотя есть тенденция к большему количеству смолы в этом испытании. Добавление 0,2 ТIРΕ/г К1.М3' имело существенный эффект на содержание смолы, и было показано, что увеличение до 1 ТIРΕ/г дополнительно уменьшило количество смолы. Лауриловый спирт не оказывал никакого эффекта на количество смолы.

Масляная фаза, отделенная от смолы, была проанализирована на свободные жирные кислоты, стерины и стериновые эстеры путем ГЖХ.

Результаты в табл. 2 указывают на увеличение свободных жирных кислоты на 0,09% при ферментативной обработке с 0,2 ТIРΕ/г (образец 2), но замечено, что образцы 3-5 с увеличенным уровнем фитостеринов содержат меньше свободных жирных кислот. Также в образцах 7 и 8, обработанных 1 ТIРΕ/г, наблюдается сокращение уровня свободных жирных кислот при добавлении к маслу большего количества стерина. Эти результаты указывают на то, что гидролитическая реакция уменьшается с увеличеним количества стеринов в масле.

Затем следует ожидать, что количество стеринового эстера увеличивается с увеличением стерина в масле. Это также замечено для образца 3, но с увеличением количества стеринов (образцы 4 и 5) количество стериновых эстеров не изменяется. Даже наблюдается тенденция к уменьшенному количеству стеринового эстера в образце 5, но в пределах экспериментальной ошибки. Однако коррекция рН путем добавления ЫаОН имеет сильный эффект на образование стеринового эстера, как отмечалось прежде. Увеличенное количество фермента (образцы 7 и 8) также способствует увеличению образования стеринового эстера.

- 60 020035

Таблица 2

ГЖХ анализы масляной фазы при рафинировании гидратацией образцов (см. табл. 1)

Образец	Свободные жирные кислоты, %	\| Стерины %	\| Стериновый эстер, %
1	0,46	0,30	0,20
2	0,55	0,15	0,40
3	0,54	0,36	0,45
4	0,52	0,60	0,40
5	0,50	0,83	0,38
6	0,55	0,69	0,63
7	0,86	0,12	0,47
8	0,80	0,65	0,64
9	0,53	0,20	0,39

Фаза смолы, изолированная путем рафинирования гидратацией образцов (табл. 1), была проанализирована с помощью ВЭ-ТСХ, и деградация определенных фосфолипидов фосфатидилэтаноламина (РЕ) и фосфатидной кислоты (РА) была определена количественно относительно контрольного образца № 1 (фиг. 101).

Результаты на фиг. 101 указывают на увеличенную деградацию РА и РЕ при добавлении 0,25% стерина.

Но увеличенная дозировка (0,5 и 0,75% стерина) не способствует дальнейшей деградации фосфолипида. Это соответствует наблюдениям за эффектом на образование стеринового эстера (см. табл. 2). Коррекция рН с помощью №О11 также оказывает сильный эффект на деградацию фосфолипида, но это связано с большей активностью фермента с увеличением рН.

Также замечено, что увеличение дозировки фермента до 1 ΤΙΡΕ/г дополнительно деградирует фосфолипиды.

Масляная фаза, изолированная форма при рафинировании гидратацией, была проанализирована ГСР с целью проанализировать количество остаточного фосфора в масле.

Результаты на фиг. 102 указывают на то, что уровень фосфора в масле значительно не зависит от количества стерина в масле, но результаты указывают на то, что увеличение дозировки фермента (1 ΤIΡΕ/г) оказывает эффект на уровень фосфора. Добавление лаурилового спирта (С12-спирта) оказывает отрицательный эффект на уровень фосфора в масляной фазе.

Заключение.

Добавление липидацилтрансферазы КЬМ3' к неочищенному маслу катализирует передачу остатка жирной кислоты от фосфолипида к стерину во время образования стериновых эстеров. На молекулярном уровне количество стерина меньше чем 1/3 количества фосфолипидов в неочищенном соевом масле. Поскольку ацильный акцептор стерин представляет собой ограничивающий фактор для КЬМ3' в неочищенном соевом масле, реакция гидролиза могла бы произойти в зависимости от дозировки фермента и времени реакции.

В этом исследовании было обнаружено, что добавление большего количества стерина к неочищенному маслу позволит получить больше стеринового эстера при обработке масла липидацилтрансферазой КЬМ3', и количество образованных свободных жирных кислот уменьшается по сравнению с маслом, к которому не был добавлен стерин.

Добавление дополнительного стерина не оказывает большого влияния на уровень фосфора в масляной фазе после рафинирования гидратацией, но замечено, что увеличение дозировки КЬМ3' уменьшает уровень фосфора в масляной фазе. Добавление 0,5% лаурилового спирта не оказывало большого эффекта на уровень свободной жирной кислоты, и анализом ГЖХ не было выявлено никакого эстера лаурилового спирта.

Пример 10.

Комбинация липидацилтрансферазы и фосфолипазы С.

Материалы и методы.

Фермент:

Липидацилтрансфераза КЬМ3' К932. 1128 1АТН'г (имеющая аминокислотную последовательность, показанную авторами как 8Ε9 ΙΌ Νο. 68).

Фосфолипаза С, Сигма Р7633 15 единиц/мг.

Масло:

Неочищенное соевое масло от 8οΙπο, Орхус, ЭК.

Процедура рафинирования.

100 г неочищенного соевого масла масштабировали в 250 мл колбе В1ие Сар с крышкой и нагревали до 55°С. Добавили 0,14 мл 50% моногидрата лимонной кислоты. Масло гомогенизировали с помощью мешалки ИНга Тиггах в течение 30 с и затем встряхивали в течение 30 мин при магнитном перемешивании при 450 об/мин. Добавили 0,367 мл 1н. раствора №О11, а затем 2,5% воды и 5 единиц/г масла фосфолипазы С. Масло снова гомогенизировали с помощью мешалки ИНга Тиггах в течение 30 с и затем встряхивали в течение 30 мин при магнитном перемешивании при 450 об/мин. Через 2 ч добавили

- 61 020035

0,2 ЬАТЕ/г масла фермента липидацилтрансферазы КЬМ3' и реакцию продолжали в течение еще 1 ч при перемешивании.

Масло нагрели до 97°С в бане с кипящей водой в течение 10 мин и затем немедленно центрифугировали при 300 оцс в течение 3 мин.

Масло декантировали из фазы смолы. Определили масу фазы смолы и масляной фазы. Масляную фазу проанализировали на остаточные фосфолипиды с помощью ТСХ и м.д. фосфора проанализировали 1СР. Свободный стерин, стериновый эстер, свободную жирную кислоту и диглицерид проанализировали с помощью ГЖХ.

Фазу смолы проанализировали на триглицериды, диглицерид, остаточные фосфолипиды и свободные жирные кислоты.

Деградация фосфолипидов в фазе смолы была проанализирована ТСХ.

Результаты.

Процесс рафинирования с комбинацией липидацилтрансферазы и фосфолипазы С, как ожидают, увеличивает выход масла больше чем на 2% по сравнению с маслом без обработки ферментом. Начальные исследования предполагают, что диглицерид был получен в масляной фазе в обработанном ферментом образце.

В масляной фазе после центрифугирования основная часть стеринов будет этерифицирована.

Предварительные исследования показывают, что уровень фосфора ниже 5 м.д. в масляной фазе и сильную деградацию фосфолипидов в фазе смолы (т.е. фосфатидилхолин (РС) и фосфатидилэтаноламин (РЕ) почти полностью исчезают и происходит сильная деградация фосфатидилинозита (Р1) и фосфатидной кислоты (РА)).

Пример 11.

Липидацилтрансфераза в комбинации с фосфолипазой С.

Материалы и методы.

Фермент:

Липидацилтрансфераза КЬМ3' К932. 1128 ЬАТЕ/г.

Фосфолипаза С Сигма Р7633 15 единиц/мг.

Масло:

Неочищенное соевое масло от 8о1ае, Орхуса, ΌΚ.

Процедура рафинирования.

100 г неочищенного соевого масла масштабировали в 250 мл колбе В1ие Сар с крышкой и нагревали до 55°С. Добавили 3% воды, а затем 0,1 единиц/г масла ацилтрансферазы КЬМ3' и 5 единиц фосфолипазы С. Масло гомогенизировали с помощью мешалки Ь11га Тиггах в течение 30 с и затем встряхивали в течение 30 мин при магнитном перемешивании при 450 об/мин. Через 30 мин 10 мл масла перенесли в 12-мл центрифужную пробирку и отметили массу масла. Масло нагрели до 97°С в бане с кипящей водой в течение 10 мин и затем немедленно центрифугировали при 300 оцс в течение 3 мин. Масляную фазу декантировали из фазы смолы и пробирки дренировали в течение 15 мин, переворачивая пробирку вверх дном. На основании массы фазы смолы был вычислен выход масла. Масляная фаза была проанализирована на остаточные фосфолипиды с помощью ТСХ и 1СР. Свободный стерин, стериновый эстер, свободная жирная кислота и диглицерид были проанализированы с помощью ГЖХ. Фаза смолы была проанализирована на триглицериды, остаточные фосфолипиды и свободную жирную кислоту.

Результаты.

Предварительные исследования свидетельствуют, что процесс рафинирования гидратацией с комбинацией липидацилтрансферазы и фосфолипазы С приводит к существенному увеличению выхода масла больше чем на 2% по сравнению с маслом без обработки ферментом. Начальные исследования показывают, что в масляной фазе образуется диглицерид, и основная часть стеринов в масляной фазе - этерифицирована.

Пример 12.

Ферментативное рафинирование с помощью липидацилтрансферазы КЬМ3' и фосфолипазы С (РЬС).

Материалы и методы.

Фермент:

Липидацилтрансфераза КЬМ3' К932. 1128 ЬАТЕ/г.

Фосфолипаза С Сигма Р7633 15 единиц/мг.

Масло:

Неочищенное соевое масло от 8о1ае, Орхус, ОК.

Процедура рафинирования.

100 г неочищенного соевого масла масштабировали в 250 мл колбе В1ие Сар с крышкой и нагревали до 55°С. Добавили 3% воды, а затем 5 единиц/г масла фосфолипазы С. рН откорректировали до 5,5 с помощью №1ОН. Масло гомогенизировали с помощью мешалки Ь11га Тиггах в течение 30 с и затем встряхивали в течение 15 мин при магнитном перемешивании при 450 об/мин. Через 15 мин образец вынули и добавили 0,1 единиц/г масла ацилтрансферазы. Масло встряхивали в течение еще 15 мин при 55°С.

- 62 020035

Через 2x15 мин 10 мл масла перенесли в 12-мл герметичную центрифужную пробирку и отметили массу масла. Масло нагрели до 97°С в бане с кипящей водой в течение 10 мин, а затем немедленно центрифугировали при 3000 оцс в течение 3 мин.

Масло декантировали из фазы смолы и дренировали в течение 15 мин, переворачивая пробирку вверх дном. На основании массы фазы смолы был вычислен выход масла.

Масляная фаза была проанализирована на остаточные фосфолипиды с помощью ТСХ и К’Р. Свободный стерин, стериновый эстер, свободная жирная кислота и диглицерид были проанализированы ГЖХ.

Фаза смолы была проанализирована на триглицериды, остаточные фосфолипиды и свободные жирные кислоты.

Результаты.

Начальные исследования свидетельствуют, что процесс рафинирования гидратацией с использованием комбинации липидацилтрансферазы и фосфолипазы С увеличивает выход масла больше чем на 2,5 % по сравнению с маслом без обработки ферментом. Предварительные исследования свидетельствуют, что диглицерид был получен в масляной фазе через 15 мин.

Основная часть стеринов в масляной фазе будет этерифицирована.

Предварительные исследования свидетельствуют, что через 15 мин основная часть фосфатидилэтаноламина (РЕ) и фосфатидилхолина (РС) исчезла, но меньше активности может быть замечено по отношению к фосфатидилинозиту (ΡΙ) и фосфатидной кислоте (РА). В образце через 30 мин и центрифугирования также исчезнет основная часть ΡΙ и РА.

Пример 13.

Ферментативное рафинирование с липидацилтрансферазой КЬМ3' и фосфолипазой С (РЬС).

Липидацилтрансфераза КЬМ3' и фосфолипаза С (РЬС) от Сигма были протестированы по отдельности и в комбинациях при рафинировании гидратацией неочищенного соевого масла. Фосфолипаза С при рафинировании масла позволяет получить диглицерид из фосфолипидов в масле. К удивлению, было показано, что КЬМ3' может использовать диглицерид в качестве акцепторной молекулы во время производства триглицерида. Модельные эксперименты с субстратом, содержащим диглицерид и фосфатидилхолин, подтвердили, что липидацилтрансфераза (КЬМ3') катализирует реакцию передачи остатка жирной кислоты от фосфолипида диглицериду во время производства триглицерида.

Коммерческое значение результатов.

Это исследование было начато с целью показать, что комбинация КЬМ3' и фосфолипазы С (РЬС) очень выгодна при рафинировании неочищенных растительных масел.

Фосфолипаза С от Уегепшт, США (а именно, РипГте®) была внедрена для использования при рафинировании масла (\νΟ 2008/036863).

Этот фермент является активным на фосфолипидах (таких как фосфатидилхолин и фосфатидилэтаноламин) в неочищенном масле, формируя диглицерид (диацилглицерин) и фосфорхолин, -этаноламин, -инозит или -кислоту. Диглицерид, произведенный во время этого процесса, является частью масла во время рафинирования масла и, таким образом, способствует улучшению выхода масла.

Изобретатели показали, что липидацилтрансферазы (такие как КЬМ3') могут поспособствовать улучшению выхода при рафинировании масла путем модификации фосфолипидов, сопутствующей образованию стеринового эстера.

Липидацилтрансферазы (такие как КЬМ3') могут использовать стерины в качестве ацильного акцептора, а также другие акцепторы, такие как спирты, включая жирные спирты.

Цель текущего исследования состояла в том, чтобы исследовать любой синергистический эффект при использовании липидацилтрансферазы (например, КЬМ3'), в комбинации с фосфолипазой С.

Материал и методы.

КЬМ3': Глицерофосфолипидхолестеринацилтрансфераза (РообРто ЬукоМах Ο11) (К932) (81Т) ΙΌ №. 68).

Партия № 102629600.

Активность 1128 ЬАТЕ/г.

Фосфолипаза С Р7633 Сигма, от С1о8Цгйшт регйгпдепк, 135,3 мг.

Твердая: 3,8 единицы/мг твердого вещества, 13,2 единицы/мг белка.

Фосфолипаза С Р6621 Сигма, от ВасШик сегеик, 250 единиц.

Диглицерид. Дистилированный диглицерид из подсолнечного масла, Журн. 2641/064.

Фосфатидилхолин, АуапЬ # 441601 Моно-ди-тиглицерид: СΚIN^8ТЕ^® ΜΟNΟ-^I Е 50/Ώ. Неочищенное соевое масло № 18: из Аргентины.

Анализ ВЭ-ТСХ.

Деградация фосфолипидов в фазе смолы из обработанных ферментом образцов была проанализирована путем ВЭ-ТСХ.

Аппликатор: Автоматический самплер для ТСХ 4, САМАС.

Пластинка для ВЭ-ТСХ: 20x10 см, Мегск № 1.05641. Активируется за 10 мин при 160°С перед ис

- 63 020035 пользованием.

Нанесение.

Фазу смолы из 10 г масла растворили в 7,5 мл гексана:изопропанола 3:2.

мкл образца нанесли на пластину ВЭ-ТСХ.

Стандарт фосфолипида (0,5% фосфолипида (8рес1га Ыр1б, Германия)) был нанесен (0,1, 0,3, 0,5, 0,8 и 1,5 мкл) и использовался для вычисления индивидуальных фосфолипидов в смоле.

В некоторых применениях содержание фосфолипида было вычислено по отношению к контрольной смоле, не обработанной ферментом, Этот контрольный образец был нанесен 0,1-0,3-0,5-0,8-1 мкл и использовался для того, чтобы сделать кривые калибровки.

Масляная фаза.

Приблизительно 90 мг были отобраны и растворены в 1 мл гексана:изопропанола 3:2.

мкл образца нанесли на пластину ВЭ-ТСХ. Монодиглицерид 5 мг/мл известной концентрации был нанесен в 0,1-0,3-0,5-0,8-1,5 мкл и использовался для вычисления индивидуальных глицеридных компонентов

Аппликатор ТСХ.

Пропускаемый буфер № 1: Р-эфир: метил-трет-бутилкетон: уксусная кислота 50:50:1.

Пропускаемый буфер № 6: хлороформ:1-пропанол:метилацета:метанол: 0,25% КС1 в воде 25:25:25:10:9.

Элюирование: пластина была элюирована на 7 см с использованием автоматической камеры хроматографирования ЛОС2 от Сатад.

Хроматографирование.

Пластину высушили на нагревателе для пластин ТСХ Сатад ΙΙΙ в течение 6 мин при 160°С, охладили и опустили в 6% ацетат меди в 16% Н₃РО₄. Дополнительно высушивали 10 мин при 160°С и сразу же оценивали.

Плотность компонентов на пластине ТСХ была проанализирована ТСХ сканером Сатад 3.

Газовая хроматография.

Свободная жирная кислота в фазе смолы была проанализирована с помощью ГЖХ. Моно-дитриглицерид, стерин и стериновый эстер масляной фазы были также проанализированы с помощью ГЖХ

Аппарат.

Капиллярный газовый хроматограф Регкт Е1тег Аи1о8у81ет 9000, оборудованный VСОТ спаянной кварцевой колонкой 12,5 мх0,25 мм ВДхпленка толщиной 0,1 мкм из 5% фенилметил силикона (СР 811 8 СВ от СНготраск).

Газ-носитель: гелий.

Инжектор: Ρ88Ι охлажденная расщепленная инъекция (начальная темп. 50°С, нагревают до 385°С), объем 1,0 мкл.

ПИД датчик: 395°С.

Программа печи (используемая с 30.10.2003):	1	2	3
Температура печи, °С.	90	280	350
Изотермический, время, мин.	1	0	10
Скорость изменения температуры, °С/мин.	15	4

Подготовка образца.

Образец растворили в 12 мл гептана:пиридина, 2:1, содержащих внутренний стандарт гептадекан, 0,5 мг/мл. 500 мкл раствора образца перенесли в укупоренный флакон, добавили 100 мкл М8ТЕА (№метил-М-триметилсилил-трифторацетамида) и провели реакцию в течение 15 мин при 60°С.

Вычисление.

На основании чистого материала сравнения были определены факторы ответа для стерина, стеринового эстера, свободных жирных кислот, моно-, ди- и триглицерида.

Экспериментальный.

Ацилтрансфераза К1.М3' и РЬС был протестированы в процессе рафинирования гидратацией с использованием неочищенного соевого масла с рецептами, показанными в табл. 1.

- 64 020035

Таблица 1

	1	2	3	4	5	6	7	8	9
Неочищенное соевое масло из Аргентины	г	10	10	10	10	10	10	10	10	10
		1	2	3	4	5	6	7	8	9
Фосфолипаза С Р7633 Фосфолипаза С Р6621	мл		0,2	0,2	0,2			0,2	0,2	0,2
К932 ЮЕ/мл	мл			0,01	0,05	0,01	0,05		0,01	0,05
Вода	мл	0,250	0,050	0,040	0,000	0,240	0,200	0,050	0,040	0,000
% воды		2,50	2,50	2,50	2,50	2,50	2,50	2,50	2,50	2,50

Фосфолипаза С Р7633 Сигма, от С.регйгпдепк, 135,3 мг твердой: 3,8 единицы/мг твердого вещества, 32,9 мг фермента в 0,5 мл воды.

Фосфолипаза С Р6621 Сигма, от ВасШик сегеик, 250 единиц, растворенных в 1 мл воды. Ацилтрансфераза К1М3' (К932), растворенная до 10 ЬАТЕ/мл.

Неочищенная соя была нагрета до 45°С в стакане ШНеа!оп на 20 мл. Были добавлены вода и фермент.

Образец был гомогенизирован при интенсивном смешивании в течение 30 с.

Образцы поместили в нагревающийся блок при 45°С с магнитным перемешиванием.

По 1 мл образцов отобрали через 30 и 240 мин в эппендорфы и ферменты инактивировали в течение 10 мин при 97°С. Особенно, хотя дезактивация фермента выполнялась в экспериментах - это вообще не делается на практике в промышленности.

Дезактивация выполнялась только в экспериментах авторами таким образом, чтобы точно проанализировать деградацию фермента.

Образцы центрифугировали при 3000 оцс в течение 3 мин. Масляная фаза была отделена от фазы смолы, и обе фазы были проанализированы с помощью ТСХ и ГЖХ.

Результаты.

Анализ ТСХ.

Образцы, отобранные через 30 и 240 мин, были проанализированы ТСХ с результатами, показанными на фиг. 103-106.

Пластины ТСХ (фиг. 103 и 104) были просканированы и использовались для количественного определения 1,2-диглицерида (БАО кп1,2) с результатами, показанными в табл. 2 и 3 ниже.

Относительная деградация фосфолипидов показана на фиг. 107.

Таблица 2

Анализ ТСХ масляной фазы через 30 мин реакции

Тест	Фосфолипаза С Р7633	Фосфолипаза С Р6621	К932 ЮЕ/мл	ОАО δη 1,2
№	Е/г	Е/г	ЮАТЕ/г	%
1	0	0	0	0,33
2	5	0	0	0,72
3	5	0	0,01	0,67
4	5	0	0,05	0,60
5	0	0	0,01	0,37
6	0	0	0,05	0,29
7	0	5	0	1,28
8	0	5	0,01	1,22
9	0	5	0,05	1,19

Таблица 3

Анализ ТСХ масляной фазы через 240 мин реакции

Тест №	Фосфолипаза С Р7633 Е/г	Фосфолипаза С Р6621 Е/г	К932 ЬАТЕ/г	ϋΑΟδη 1,2 %
1	0	0	0	0,27
2	5	0	0	0,64
3	5	0	0,01	0,60
4	5	0	0,05	0,50
5	0	0	0,01	0,34
6	0	0	0,05	0,27
7	0	5	0	1,06
8	0	5	0,01	1,04
9	0	5	0,05	1,01

Результаты из табл. 2 и 3 ясно указывают на образование диглицерида, вызванного РЕС деградацией фосфолипидов. Замечено, что с использованной дозировкой РЕС образование кп 1,2-диглицерида уже достигло максимума через 30 мин реакции. Также замечено, что количество кп 1,2-диглицерида умень

- 65 020035 шается при увеличении дозировки КЬМ3' при использовании в комбинации с РЬС.

Этот эффект наблюдался для обоих ферментов фосфолипаз С, но эффект был самым выраженным при комбинации КЬМ3' с фосфолипазой С Р7633 Сигма, от С.регГппдепк. Это наиболее вероятно объясняется фактом, что РЬС от С.регГппдепк деградировала только маленькую часть фосфолипидов, таким образом, больше субстрата было доступно для КЬМ3'.

Результаты на фиг. 107 также четко показывают, что фосфолипаза С Р7633 Сигма, от С.регГппдепк является, главным образом, активной на фосфатидилхолине (РС), а у фосфолипазы С Р6621 Сигма, от ВасШик сегеик главная активность по отношению к фосфатидилхолину (РС) и фосфатидилэтаноламину (РЕ) и меньше активности по отношению к фосфатидной кислоте (РА) и фосфатидилинозиту (И). Результаты также доказывают, что К1.М3' может использовать все четыре типа фосфолипидов.

Поэтому пришли к заключению, что ацилтрансфераза КЬМ3' может использовать кп 1,2 диглицерид в качестве акцепторной молекулы и катализировать реакцию на фиг. 108.

Анализ ГЖХ.

Образцы № 1-6 масляной фазы из эксперимента в табл. 1 были также проанализированы ГЖХ.

Анализ ГЖХ общего количества диглицерид (ОАО), стерина, стеринового эстера и СЖК перечислен в табл. 4.

Таблица 4

ГЖХ анализ масляной фазы через 30 и 240 мин инкубации

образец №	РЬС Е/г	кьмз Е/г	Время реакции минуты	ϋΑ6 %	Стерин %	Стериновый эстер %	СЖК %
1	0	0	30	1,34	0,25	0,12	0,22
2	5	0	30	2,58	0,26	0,13	0,21
3	5	0,05	30	2,39	0,18	0,26	0,22
4	5	0,1	30	2,10	0,09	0,42	0,28
5	0	0,05	30	1,43	0,15	0,33	0,22
6	0	0,1	30	1,24	0,06	0,49	0,33
1	0	0	240	1,63	0,22	0,13	0,20
2	5	0	240	2,33	0,25	0,13	0,20
3	5	0,05	240	2,13	0,08	0,45	0,29
4	5	0,1	240	2,08	0,04	0,48	0,43
5	0	0,05	240	1,69	0,04	0,49	0,32
6	0	0,1	240	1,68	0,04	0,50	0,56

ГЖХ анализ образцов, отобранных через 30 и 240 мин реакции, подтвердил то, что уже наблюдалось при анализе ТСХ, что фосфолипаза С Р7633 Сигма, от С.регГппдепк производила диглицерид из фосфолипидов в масле. Результаты также подтверждают синергистический эффект уменьшенным количеством диглицерида при комбинации фосфолипазы С с КЬМ3'. Статистическая оценка АNΟVА, использующая программное обеспечение 81а1дгарЫс, эффекта РЬС и КЬМ3' на количество диглицерид четко указывает на эффект взаимодействия между этими двумя ферментами, см. фиг. 109.

РЬС не оказывала никакого существенного эффекта на стерины в масле, но КЬМ3' преобразовывает свободные стерины в стериновые эстеры. Стерины - лучшая акцепторная молекула, чем ЭАО для КЬМ3', поэтому только 10-15% ЭАО в реакционной смеси были преобразованы в триглицерид.

РЬС не оказывает большого влияния на уровень свободных жирных кислот (СЖК), но замечено, что К1.М3' в высокой дозировке и при более длительной реакции способствуют увеличению уровня СЖК.

Ιουτ. 2460-224.

Не ограничиваясь теорией уменьшение диглицерида путем комбинации ацилтрансферазы (КЬМ3') и фосфолипазы С (РЬС) может быть вызвано конкуренцией субстратов (фосфолипида) при совместном использовании этих двух ферментов.

Чтобы доказать, что К1.М3' в состоянии использовать диглицерид в качестве акцептора и катализировать реакцию, упомянутую на фиг. 108, проводился модельный эксперимент с рецептом, показанным ниже в табл. 5.

- 66 020035

Таблица 5

Рецепт для исследования эффекта ацилтрансферазы К1.М3' на субстрат

диглицерид/с	юсфатидилхолин
		1	2	3	4	5	6
Диглицерид/РС 80/20	г	3	3	3	3	3	3
Ацилтрансфераза КЬМЗ': 300 БАТЕ/г	мл	0	0,01		0,01		0,01
Буфер	мл	0,03	0,03	0,03	0,03	0,03	0,03
3% водный раствор соли		0,01		0,01		0,01

Буфер: 1 100 мМ ацетата рН 5,5		X	X
Буфер 2: 100 мМ НЕРЕ8 цН 7				, X	X
Буфер 3. 100 мМ МЕ8 рН 6						X	X

Дистиллированный диглицерид на основании подсолнечного масла и фосфатидилхолин (РС) были смешаны во время нагревания и встряхивании до 80°С, пока РС не растворился в диглицериде.

Субстрат поместили в стакан 1)гаш на 7 мл с винтовой крышкой и нагревали до 55°С. Добавили фермент, буфер и воду и образец встряхивали при магнитном перемешивании при 450 об/мин. Через 30 и 180 мин отобрали образец и проанализировали с помощью ТСХ (фиг. 110).

Пластина ТСХ была просканирована, и содержание триглицерида в образцах было определено количественно на основании стандартной кривой, сделанной из анализа масла канолы, с результатами, показанными в табл. 6.

Таблица 6

рН буф	Фермент Время реакции	Триглицерид %
ера Е/г	минуты
5,5	0	30	1,42
5,5	1	30	1,74
6	0	30	1,63
6	1	30	1,79
7	0	30	1,49
7	1	30	1,55
5,5	0	180	1,75
5,5	1	180	1,79
6	0	180	1,76
6	1	180	1,80
7	0	180	1,67
7	1	180	2,01

Результаты, показанные в табл. 6, были проанализированы статистически АNОVА с использованием программного обеспечения 81а1цгар1нс с результатами, показанными на фиг. 111 и 112.

Статистическая оценка результатов для триглицерида из табл. 6 подтверждает существенное увеличение количества триглицерида при добавлении ацилтрансферазы К1.М3' к субстрату, содержащему диглицерид и фосфатидилхолин.

Доиг. 2460-228.

Эксперимент, упомянутый выше в табл. 5, был изучен в дальнейших деталях, чтобы исследовать эффект более высокого уровня воды на реакцию передачи остатка жирной кислоты от фосфолипида диглицериду во время образования триглицерида. Экспериментальные настройки перечислены в табл. 7.

Таблица 7

Рецепт для исследования эффекта ацилтрансферазы К1.М3' на субстрат диглицерид/фосфатидилхолин

Дистиллированный диглицерид на основании подсолнечного масла и фосфатидилхолин (РС) были смешаны во время нагревания и встряхвании до 80°С, пока РС не растворился в диглицериде.

Субстрат поместили в стакан 1)гаш на 7 мл с винтовой крышкой и нагревали до 55°С. Добавили фермент, буфер и воду и образец встряхивали при магнитном перемешивании при 450 об/мин. Через 30, 90 и 240 мин отобрали образец и проанализировали с помощью ТСХ.

Хроматограммы ТСХ показаны на фиг. 113 и 114.

Пластина ТСХ была просканирована, и содержание триглицерида в образцах было определено количественно на основании стандартной кривой, сделанной из триглицерида (масло канолы). Результаты

- 67 020035 определения триглицерида показаны в табл. 8.

Таблица 8

Анализ триглицерида в диглицериде/РС субстрате, инкубированном с ацилтрансферазой КЬМ3'

Тест №	Триглицерид, % 30 минут	Триглицерид, % 90 минут	Триглицерид, % 240 минут
1	1,33	1,36	1,58
2	1,55	1,91	2,56
3	1,59	2,02	2,65
4	1,57	1,81	2,29
5	1,56	1,91	2,46

Результаты в табл. 8 были проанализированы статистически АNОVА с использованием программного обеспечения 81а!дгарЫс с результатами, показанными на фиг. 115 и 116.

Результаты из табл. 8 и фиг. 115 и 116 четко демонстрируют способность ацилтрансферазы КЬМ3' производить триглицерид из субстрата диглицерида и фосфатидилхолина.

Заключение.

Липидацилтрансфераза КЬМ3', а также фосфолипаза С (РЬС), как известно, способствуют увеличению выхода масла при рафинировании растительного масла.

Эффект липидацилтрансферазы КЬМ3' при рафинировании масла основан на реакции передачи остатка жирной кислоты от фосфолипида стерину во время производства лизофосфолипидов и стериновых эстеров.

Эффект фосфолипазы С (РЬС) основывается на преобразовании фосфолипидов в диглицерид и водорастворимые производные фосфора. Диглицерид, произведенный в этой реакции, будет накапливаться в масляной фазе процессом рафинирования, но не всегда предпочтительно иметь высокий уровень диглицерида в масле, потому что он оказывает влияние на максимальную высоту некоптящего пламени масла и также окажет влияние на свойства кристаллизации большего количества источников насыщенного жира.

В текущем исследовании липидацилтрансфераза КЬМ3' и фосфолипаза С (РЬС) были протестированы по отдельности и в комбинации в процессе рафинирования гидратацией. Эксперименты показали, что Р1,С при рафинировании гидратацией соевого масла производит диглицерид, который является частью масляной фазы. При использовании РРС в комбинации с КЬМ3', к удивлению, было показано, что количество диглицерида, произведенного Р1,С, уменьшилось, и стерин был преобразован в стериновые эстеры, что указывает на синергистический эффект между этими двумя ферментами потому, что КЬМ3' катализирует реакцию передачи остатка жирной кислоты от фосфолипида диглицериду во время образования триглицерида.

Реакция передачи, катализируемая КЬМ3', остатка жирной кислоты от фосфолипида диглицериду во время образования триглицерида, была подтверждена на модельной системе, состоящей из диглицерида и фосфолипида.

Результаты также показали, что у этих двух протестированных фосфолипидов нет одинаковой активности по отношению ко всем типам фосфолипидов, но у КЬМ3' есть почти такая же активность по отношению ко всем четырем типам фосфолипидов, найденных в неочищенном соевом масле. Это также открывает возможность использовать фосфолипазу С в комбинации с КЬМ3', чтобы получить дальнейшее преобразование фосфолипидов.

Пример 14.

Использование КЬМ3' при рафинировании гидратацией неочищенного соевого масла.

Растительное масло, включающее соевое масло, содержит от 1 до 3% фосфолипидов, которые удаляются в процессе рафинирования масла. Процесс рафинирования масла обычно делится на процесс рафинирования гидратацией и процесс нейтрализации. Неочищенное соевое масло с 1-3% фосфолипидов не может быть отправлено на экспорт без рафинирования гидратацией, нацеленного на сокращение содержания фосфора, до 200 м.д. фосфора или ниже, чтобы соответствовать спецификации для водорафинированного неочищенного масла.

Если уровень фосфора намного ниже 200 м.д., это может быть невыгодно. Типично обычное рафинирование приводит к уровню фосфора после центрифугирования, составляющему приблизительно 50 м.д. Это потому, что не возможно контролировать центрифугу, чтобы получить уровни фосфора, которые меньше чем 200 м.д, но как можно ближе к этому уровню.

Напротив, в данном случае использования липидацилтрансферазы водно-рафинированное масло могло бы предпочтительно быть приспособлено приблизительно до 180 м.д. фосфора.

Коррекция уровня фосфора в процессе ферментативного рафинирования гидратацией существующего изобретения может предпочтительно быть сделана путем коррекции межфазы между смолой и маслом в центрифуге, чтобы получить немного больше фосфолипида в масляной фазе. Однако в обычном процессе рафинирования гидратацией фаза смолы является очень толстой и вязкой, поэтому не легко отрегулировать межфазу в центрифуге.

- 68 020035

Изобретатели, к удивлению, обнаружили, что, когда липидацилтрансфераза (например, КЬМ3') используется в рафинировании гидратацией, межфаза может быть отрегулирована в центрифуге без проблем и можно получить рафинированное масло, которое было ближе к спецификации максимально 200 м.д. фосфора.

Экспериментальный.

Липидацилтрансфераза КЬМ3' (8ЕР ГО №. 68) использовалась при рафинировании гидратацией неочищенного соевого масла в процессе, описанном на фиг. 117.

Неочищенное соевое масло, содержащее 1100 м.д. фосфора, подверглось процессу рафинирования гидратацией, показанному на фиг. 117. В первом эксперименте процесс рафинирования проводился без добавления фермента. Во втором эксперименте был добавлен фермент КЬМ3', и после анализа содержания фосфора водно-рафинированного масла была откорректирована к центру центрифуги межфаза между смолой и маслом в центрифуге. Когда процесс был снова уравновешен, фосфор был снова проанализирован.

Результаты испытаний показаны в табл. 1.

Таблица 1

Рафинирование гидратацией	1	2	3
Фермент КЬМЗ’, ЕАТЕ/кг	0	200	200
Точная настройка блока центрифуги	185	185	195
Фосфор в масла после центрифуги, м.д.	44*	35*	185

* не существенный

Заключение.

В эксперименте с ферментативным водным рафинированием с использованием КЬМ3' было показано, что межфаза между маслом и смолой в центрифуге могла легко быть приспособлена или контролироваться, чтобы получить воднорафинированное масло с уровнем фосфора, близким к спецификации (т.е. ближе, но меньше чем 200 м.д.).

При условиях обычного рафинирования гидратацией не всегда легко приспособить межфазу, потому что консистенция (высокая вязкость) фазы смолы не позволяет осуществить такое регулирование.

Пример 15.

Ферментативная реакция в фазе смолы после ферментативного рафинирования гидратацией растительных масел.

Липидацилтрансфераза, ЬукоМах О11 (КЬМ3') была протестирована при рафинировании гидратацией неочищенного соевого масла. Особенно, фермент не был инактивирован в конце процесса ферментативного водного рафинировании,- как будет обычным практически в промышленности. Поэтому процесс ферментативного рафинирования гидратацией был выполнен в соответствии с экспериментальным протоколом, показанным ниже. В особенности, фермент не был инактивирован после рафинирования.

Изолированная фаза смолы из этого процесса была инкубировали при 40°С и была проанализирована дальнейшая деградация фосфолипида в фазе смолы. К удивлению, результаты показали, что фермент далее гидролизировал фосфолипид в лизофосфолипиды и свободную жирную кислоту. Это объясняется фактом, что фермент связывается с фазой смолы, когда фаза смолы отделяется от масляной фазы центрифугированием.

Также лизофосфолипиды гидролизировались во время хранения, и после 7 дней хранения почти все фосфолипиды исчезли из фазы смолы.

Коммерческое значение результатов.

Ферментативное рафинирование неочищенного соевого масла с помощью КЬМ3' показало, что возможно улучшить выход масла от 0,5 до 1,5%. Фаза смолы, изолированная из этого процесса, как правило, все еще содержит немного масла и фосфолипидов (ЕР 1624047). Известно, что гидролизом фазы смолы масляная фаза может отделиться от смолы, которая может быть изолирована центрифугированием или другими средствами разделения. Эта масляная фаза, содержащая высокие уровни свободной жирной кислоты, может продаваться как кислотное масло с более высокой ценностью, чем нормальная фаза смолы, которая добавляется к еде.

Дальнейший аспект состоит в том, что остающаяся твердая фаза после отделения кислотного масла содержит более высокий уровень фосфора, чем нормальная смола, и может использоваться как источник органического фосфора.

Введение.

К удивлению, изобретатели показали, что липидацилтрансфераза ЬукоМах ОН (КЬМ3') является активной в фазе смолы, изолированной при ферментативном рафинировании гидратацией неочищенного соевого масла. Поэтому задумались, мог ли фермент далее деградировать фосфолипиды в свободные жирные кислоты, которые центрифугированием могли быть изолированы в виде кислотного масла вместе с остатками триглицерида в фазе смолы.

В этом исследовании был исследован эффект различных дозировок фермента и температур рафинирования гидратацией на деградацию фосфолипида в фазе смолы.

- 69 020035

Материалы и методы.

КЬМ3': Глицерофосфолипидхолестеринацилтрансфераза (БообРго ЬузоМах О11) (К932).

Партия № 102629600. Активность 1128 ИАТЕ/г.

Неочищенное соевое масло № 18: из Аргентины.

Анализ ВЭ-ТСХ.

Пластинка для ВЭ-ТСХ: 20x10 см, Мегск № 1,05641. Активируется за 10 мин при 160°С перед ис пользованием.

Нанесение.

мкл образца нанесли на пластину ВЭ-ТСХ.

Стандарт фосфолипида (0,5% фосфолипида (8рес1га ЫрЫ, Германия)) был нанесен (0,1, 0,3, 0,5, 0,8 и 1,5 мкл) и использовался для вычисления индивидуальных фосфолипидов в смоле.

В некоторых применениях содержание фосфолипида было вычислено по отношению к контрольной смоле, не обработанной ферментом. Этот контрольный образец был нанесен 0,1-0,3-0,5-0,8-1 мкл и использовался для того, чтобы сделать кривые калибровки.

Масляная фаза.

мкл образца нанесли на пластину ВЭ-ТСХ. Монодиглицерид 5 мг/мл известной концентрации был нанесен в 0,1-0,3-0,5-0,8-1,5 мкл и использовался для вычисления индивидуальных глицеридных компонентов.

Аппликатор ТСХ.

Пропускаемый буфер № 6: хлороформ:1-пропанол:метилацетат:метанол: 0,25% КС1 в воде 25:25:25:10:9.

Элюирование: пластина была элюирована на 7 см с использованием автоматической камеры хроматографирования АОС2 от Сатад.

Хроматографирование.

Пластину высушили на нагревателе для пластин ТСХ Сатад ΙΙΙ в течение 10 мин при 160°С, охладили и опустили в 6% ацетат меди в 16% Н₃РО₄. Дополнительно высушивали 10 мин при 160°С и непо средственно оценивали.

Газовая хроматография.

Свободная жирная кислота в фазе смолы была проанализирована с помощью ГЖХ.

Моно-ди-триглицерид, стерин и стериновый эстер масляной фазы были также проанализированы с помощью ГЖХ

Аппарат.

Капиллярный газовый хроматограф Регкш Е1тег Лиίо8у8ίет 9000, оборудованный \\СОТ спаянной кварцевой колонкой 12,5 мх0,25 мм ВДхпленка толщиной 0,1 мкм из 5% фенилметил силикона (СР 811 8 СВ от Сйготраск).

Газ-носитель: Гелий.

Инжектор: Р88I охлажденная расщепленная инъекция (начальная темп. 50°С, нагревают до 385°С), объем 1,0 мкл.

ПИД датчик: 395°С.

Программа печи (используемая с 30.10.2003):1

Температура печи, °С.90

Изотермический, время, мин.1

Скорость изменения температуры, °С/мин15

280350

010

Подготовка образца.

Образец растворили в 12 мл гептана:пиридина, 2:1, содержащих внутренний стандарт гептадекан, 0,5 мг/мл. 500 мкл раствора образца перенесли в укупоренный флакон, добавили 100 мкл М8ТБА (Ы-метил-Ы-триметилсилил-трифторацетамида) и провели реакцию в течение 15 мин при 60°С.

Вычисление.

Экспериментальный.

Липидацилтрансфераза К1.М13' была протестирована в неочищенном соевом масле согласно рецептам, показанным в табл. 1.

Эксперименты по рафинированию в табл. 1 проводились при 45 и при 55°С.

- 70 020035

Журн. 2460-220		1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
Неочищенное соевое масло	г	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10
К.932: 100 ЕАТЕ-К/мл	мл	0	0,01	0,02	0,05	0,01	0,02	0,05	0,01	0,02	0,05
Дополнительная вода	мл	0,10	0,09	0,08	0,05	0,09	0,08	0,05	0,09	0,08	0,05
Масло ЕАТЕ-К/г		0,00	0,10	0,20	0,50	0,10	0,20	0,50	0,10	0,20	0,50
% воды		1,00	1,00	1,00	1,00	1,00	1,00	1,00	1,00	1,00	1,00

Неочищенную сою нагревали до 55°С (или 45°С) в стакане АДенЕт на 20 мл. Были добавлены вода и фермент. Образец гомогенизировали при интенсивном смешивании в течение 30 с. Образцы поместили в нагревающийся блок при 55°С (или 45°С) при магнитном перемешивании (450 об/мин). После 30минутной инкубации образцы центрифугировали при 3000 оцс в течение 3 мин.

Масляную фазу отделили от фазы смолы путем переворачивания пробирок в течение 15 мин, вследствие чего смола оставалась в пробирках.

Затем фазу смолы от каждого из образцов 1-4 немедленно заморозили.

Фазу смолы от каждого из образцов 5-8 инкубировали при 40°С в течение 1 дня и затем заморозили.

Фазу смолы от каждого из образцов 9-12 инкубировали 7 дней при 40°С.

Все образцы одновременно проанализировали ТСХ и ГЖХ.

Результаты.

Анализ ТСХ образцов фазы смолы от рафинирования при 55°С показан на фиг. 118, и образцы от рафинирования при 45°С показаны на фиг. 119.

На основании сканирования хроматограммы ТСХ было вычислено относительное содержание фосфолипида в обработанной ферментом фазе смолы по сравнению с фазой смолы без обработки ферментом (см. табл. 2 и 3).

Таблица 2

Относительное содержание фосфолипида в фазе смолы при рафинировании гидратацией при 55°С

образец №	Фермент ЬАТЕ/г	Время ДНИ	ЕРС Отн. %	РС Отн. %	РА Отн. %	РЕ Отн. %	ΡΙ Отн. %
1	0	0	100,0	100	100	100	100
2	0,1	0	571,2	31,2	35,8	26,1	55,0
3	0,2	0	144,5	18,0	24,1	13,1	39,6
4	0,5	0	45,6	3,3	17,1	3,0	16,3
5	0,1	1	452,5	4,6	17,6	3,0	24,6
6	0,2	1	26,7	1,0	15,5	0,4	9,5
7	0,5	1	2,0	0,0	6,2	0,0	2,5
8	0,1	7	3,0	0,0	8,0	0,0	3,2
9	0,2	7	1,0	0,0	4,0	0,0	2,1
10	0,5	7	0,2	0,0	0,0	0,0	2,6

Относительное содержание фосфолипида в фазе смолы при рафинировании гидратацией при 45°С

образец №	Фермент ЕАТЕ/г	Время Дни	РС Отн. %	РА Отн. %	РЕ Отн. %	ΡΙ Отн. %
1	0	0	100,0	100,0	100,0	100,0
2	0,1	0	40,5	48,6	38,5	43,0
3	0,2	0	21,5	33,7	' 22,4	26,9
4	0,5	0	7,4	23,1	9,0	15,6
5	0,1	1	6,4	41,9	6,0 .	17,2
6	0,2	1	2,3	25,7	1,9	12,5
7	0,5	1	1,3	10,7	0,0	4,2
8	0,1	7	0,0	17,1	0,0	8,1
9	0,2	7	2,5	9,4	0,0	4,8
10	0,5	7	0,0	0,0	0,0	3,7

Образцы фазы смолы с 0 дней были отобраны сразу же после реакции рафинирования и центрифугирования. В этой точке основная часть фосфолипида уже деградировала, и было замечено, что количество лизофосфолипида увеличивается (табл. 2). Во время инкубации фазы смолы происходит дальнейший гидролиз фосфолипидов, но также гидролизируют и лизофосфолипиды.

Фазы смолы были проанализированы с помощью ГЖХ на свободные жирные кислоты (СЖК) и триглицерид (см. табл. 3).

Фракция фазы смолы была дважды экстрагирована гексаном:изопропиловым спиртом 2:1, а нерастворимая часть была высушена и количественно определена гравиметрически.

- 71 020035

Таблица 3

ГЖХ анализ СЖК и триглицерида в фазе смолы и нерастворимом материале

Образец №	Инкубаци Дни	я Фермент ЬАТЕ/Г	Сухое основание % СЖК	Сухое основание % Триглицерид	Сухое основание % СЖК+Триглицерид	Гексан :1Р А Нерастворимый, %.
1	0	0	1,9	64,0	66,0	2,7
2	0	0,1	7,0	41,5	48,6	3,6
3	0	0,2	8,2	42,5	50,7	6,0
4	0	0,5	7,4	43,1	50,5	26,9
5	1	0,1	16,3	36,4	52,7	15,7 без
6	1	0,2	16,6	39,8	56,4	обозначения даты.
7	1	0,5	12,6	40,3	53,0	41,1
8	7	0,1	21,2	37,3	58,5	35,6
9	7	0,2	19,2	37,1	56,4	33,3
10	7	0,5	14,6	42,1	56,7	38,7

Результаты, показанные в табл. 3, четко подтверждают, что ферментативный гидролиз продолжается во время хранения фазы смолы при 40°С до 7 дней.

Содержание фазы смолы, которая не экстрагируется органическим растворителем (гексан изопропиловый спирт 2:1), является мерой для количества твердого вещества в фазе смолы. Когда фосфолипиды в фазе смолы гидролизируют в СЖК и фосфатидилглицерин, количество материала, которое не растворяется в гексане:изопропаноле, увеличивается. После 7 дней инкубации более чем 90% фазы смолы состоит из СЖК, триглицерида и фосфатидилглицерина, и никаких фосфолипидов не остается в фазе смолы. Состав фазы смолы после инкубации позволяет более легко разделить ее на масляную фазу и твердую/водорастворимую фазу, потому что никаких эмульгаторов (фосфолипидов и лизофосфолипидов) не оставляется в смоле.

Заключение.

Во время ферментативного рафинирования с помощью липидацилтрансферазы (например, КГМ3') выделяется фаза смолы, которая содержит активный фермент. Инкубация фазы смолы при 40°С дополнительно гидролизует фосфолипиды в фазе смолы. В зависимости от дозировки фермента все фосфолипиды, а также лизофосфолипиды, гидролизируются в жирные кислоты и фосфатидилглицерин. Удаление фосфолипидов в фазе смолы позволяет изолировать масляную фазу, содержащую свободные жирные кислоты и остаток триглицерида в фазе смолы.

В эксперименте по рафинированию, проводимом при 55°С, наблюдались более высокие уровни деградации фосфолипида, чем при проведении эксперимента при 45°С. В обоих экспериментах фермент был активным в фазе смолы после разделения и была тенденция к общей более высокой степени гидролиза во время хранения при 40°С при проведении рафинирования гидратацией при 55°С.

Все публикации, упомянутые в данном описании, введены в данное описание как ссылки. Различные модификации и вариации описанных способов и систем настоящего изобретения будут понятными квалифицированному спеицалисту в данной области техники без отступления от буквы и духа настоящего изобретения. Несмотря на то что настоящее изобретение было описано в связи со специфическими предпочтительными воплощениями, следует понимать, что изобретение, как оно заявлено, не является ограниченным такими специфическими воплощениями. На самом деле, различные модификации описанных способов осуществления изобретения, которые являются очевидными квалифицированному специалисту в области биохимии и биотехнологии или родственных областей, предназначены для включения в объем приведенных ниже пунктов формулы изобретения.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ рафинирования гидратацией пищевого масла (предпочтительно неочищенного пищевого масла), который включает следующие стадии:

(a) смешивание приблизительно 0,1-5% мас./мас. воды с пищевым маслом (предпочтительно неочищенным пищевым маслом) и липидацилтрансферазой;

(b) перемешивание этой смеси в течение от приблизительно 10 до приблизительно 180 мин при температуре от приблизительно 45 до приблизительно 90°С и (c) разделение масляной фазы и смоляной фазы, где используемая липидацилтрансфераза имеет трансферазную активность (ТгИ на 1 мг фермента) по меньшей мере 25 ТгИ/мг протеина фермента, которую определяют с использованием следующего анализа:

a) 50 мг холестерина и 450 мг форсфатидилхолина сои растворяют в хлороформе и хлороформ выпаривают при 40°С в вакууме, 300 мг РС холестерина 9:1 диспергируют при 40°С в 10 мл 50 мМ буфера НЕРЕ8 рН 7 для формирования субстрата;

b) 250 мкл субстрата добавляют в стакан с крышкой при 40°С, добавляют 25 мкл раствора фермента и инкубируют в течение агитации 10 мин при 40°С;

c) после 10 мин добавляют 5 мл гексан:изопропанол 3:2;

ά) количество эфира холестерина анализируют с помощью НРТЬС с использованием для калибровки в качестве стандарта холестериновый стеарат;

е) трансферазную активность рассчитывают как количество сформировавшегося в минуту эфира холестерина.
2. Способ по п.1, дополнительно включающий (ά) инкубирование смоляной фазы, содержащей активный липидацилтрансферазный фермент, в течение от минимум приблизительно 2 ч до максимум 7 дней и (е) отделение масла от смоляной фазы.
3. Способ обработки смоляной фазы (предпочтительно получаемой или полученной после рафинирования, такого как рафинирование гидратацией или ферментативное рафинирование либо их комбинация, пищевого масла), в котором смоляную фазу инкубируют с одним или большим количеством липидацилтрансферазных ферментов отдельно или в комбинации с одним или большим количеством фосфолипазных С ферментов в течение от минимум приблизительно 2 ч до максимум 7 дней и отделяют масло от смоляной фазы.
4. Способ по любому из пп.1-3, в котором рН составляет от приблизительно 5,0 до приблизительно 10,0.
5. Способ по любому из пп.1-4, в котором липидацилтрансфераза включает ΟΌ8Χ мотив и/или ΟΛΝΩΥ мотив.
6. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором липидацилтрансферазный фермент характеризуется как фермент, который обладает ацилтрансферазной активностью и который включает мотив аминокислотной последовательности ΟΌ8Χ, где X представляет собой один или более из следующих аминокислотных остатков: Ь, А, V, Ι, Е, Υ, Н, О. Т, Ν, М или 8.
7. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором липидацилтрансфераза получена из организмов, выбранных из одного или более следующих родов: Λе^οтοηа5. 81герЮтусе5, 8асс11аготусе5, Ьасίοοοοοϋδ, Му^Ьа^егшт, 8ί^ерΐοсοсси8, ЕасЮЬасШик, ОекиШюЬаЛегшт, ВасШик, Сатру^ЬаЛег, VIЬгюпасеае, Ху1е11а, 8υ1Γο1οόυ5, АкрегдШик, 8сΗ^ζο5ассΗа^οтусе5. Ыйепа, Нелепа, Ме8ο^й^ζοЬ^ит, Катюша, ХапНют-юнак и СапШба.
8. Способ по п.7, в котором липидацилтрансфераза получена из организма рода Λе^οтοηа5.
9. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором липидацилтрансфераза представляет собой полипептид, обладающий липидацилтрансферазной активностью, где полипептид получают экспрессией любой из нуклеотидных последовательностей, представленных как 8ЕО ΙΌ Νο. 49, 8ЕО ΙΌ Νο. 36, 8ЕО ΙΌ Νο. 39, 8ЕО ΙΌ Νο. 42, 8ЕО ΙΌ Νο. 44, 8ЕО ΙΌ Νο. 46, 8ЕО ΙΌ Νο. 48, 8ЕО ΙΌ Νο. 50, 8ЕО ΙΌ Νο. 51, 8ЕО ΙΌ Νο. 52, 8ЕО ΙΌ Νο. 53, 8ЕО ΙΌ Νο. 54, 8ЕО ΙΌ Νο. 55, 8ЕО ΙΌ Νο. 56, 8ЕО ΙΌ Νο. 57, 8ЕО ΙΌ Νο. 58, 8ЕО ΙΌ Νο. 59, 8ЕО ΙΌ Νο. 60, 8ЕО ΙΌ Νο. 61, 8ЕО ΙΌ Νο. 62 или 8ЕО ΙΌ Νο. 63, или нуклеотидной последовательности, которая обладает 75% или большей идентичностью с ней.
10. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором липидацилтрансфераза представляет собой полипептид, обладающий липидацилтрансферазной активностью, где полипептид получают экспрессией:

a) нуклеотидной последовательности, представленной как 8ЕО ΙΌ Νο. 49, или нуклеотидной последовательности, которая обладает 75% или большей идентичностью с ней;

b) нуклеиновой кислоты, которая кодирует указанный полипептид, где указанный полипептид является по крайней мере на 70% идентичным с полипептидной последовательностью, представленной в 8ЕО ΙΌ Νο. 16, или с полипептидной последовательностью, представленной в 8ЕО ΙΌ Νο. 68; или

c) нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется при условиях средней жесткости с нуклеиновым

- 73 020035 зондом, содержащим нуклеотидную последовательность, показанную как 8Εφ ΙΌ №. 49.
11. Способ по п.10, в котором липидацилтрансфераза представляет собой полипептид, полученный экспрессией нуклеотидных последовательностей в ВасШик ПсНешГогшЕ.
12. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором липидацилтрансфераза представляет собой полипептид, обладающий липидацилтрансферазной активностью, где полипептид включает любую из аминокислотных последовательностей, представленных как 8Εφ ΙΌ Но. 68, 8Εφ ΙΌ Но. 16, 8Εφ ΙΌ Но. 1, 81Χ) ΙΌ Ко. 3, 8ΕΟ ΙΌ Ко. 4, 8ΕΟ ΙΌ Ко. 5, 8ΕΟ ΙΌ Ко. 6, 81Χ) ΙΌ Ко. 7, 8ΕΟ ΙΌ Ко. 8, 8ΕΟ ΙΌ Ко. 9, 8IX) ΙΌ №. 10, 81Χ) ΙΌ №. 11, 8Εφ ΙΌ №. 12, 8ΕΟ ΙΌ №. 13, 81Χ) ΙΌ №. 14, 8ΕΟ ΙΌ №. 15, 81Χ) ΙΌ №. 17, 8Εφ ΙΌ №. 18, 8Εφ ΙΌ №. 34, 8Εφ ΙΌ №. 35, 8Εφ ΙΌ №. 38, или аминокислотную последовательность, которая обладает 75% или большей идентичностью с ней.
13. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором липидацилтрансфераза представляет собой полипептид, обладающий липидацилтрансферазной активностью, где полипептид включает аминокислотную последовательность, представленную как 8Εφ ΙΌ №. 68, или аминокислотную последовательность, которая обладает 75% или большей идентичностью с ней.
14. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором фосфолипазу С дополнительно смешивают с маслом, и/или водой, и/или липидацилтрансферазой.
15. Применение липидацилтрансферазы в рафинировании гидратацией пищевого масла для увеличения выхода масла в масляной фазе после завершения процесса рафинирования гидратацией, где используемая липидацилтрансфераза имеет трансферазную активность (ТгИ на 1 мг фермента) по меньшей мере 25 ТгИ/мг протеина фермента, которую определяют с использованием следующего анализа:

a) 50 мг холестерина и 450 мг фосфатидилхолина сои растворяют в хлороформе и хлороформ выпаривают при 40°С в вакууме, 300 мг РС холестерина 9:1 диспергируют при 40°С в 10 мл 50 мМ буфера НΕРΕ8 рН 7 для формирования субстрата;

b) 250 мкл субстрата добавляют в стакан с крышкой при 40°С, добавляют 25 мкл раствора фермента и инкубируют в течение агитации 10 мин при 40°С;

c) после 10 мин добавляют 5 мл гексан:изопропанол 3:2;

ά) количество эфира холестерина анализируют с помощью НРТЬС с использованием для калибровки в качестве стандарта холестериновый стеарат;

е) трансферазную активность рассчитывают как количество сформировавшегося в минуту эфира холестерина.
16. Применение липидацилтрансферазы в рафинировании гидратацией пищевого масла для уменьшения вязкости смоляной фазы после завершения процесса рафинирования гидратацией.
17. Применение липидацилтрансферазы в комбинации с фосфолипазой С в рафинировании гидратацией пищевого масла для увеличения выхода масла, и/или для увеличения уровней триглицерида в масляной фазе после завершения процесса рафинирования гидратацией, и/или для уменьшения уровня диглицерида в масляной фазе после завершения процесса рафинирования гидратацией.
18. Применение липидацилтрансферазы (отдельно или в комбинации с фосфолипазой С) в инкубировании смоляной фазы (которая получена после рафинирования пищевого масла, такого как рафинирование гидратацией, ферментативное рафинирование или их комбинация) для увеличения выхода масла и/или получения твёрдой фазы (после отделения кислого масла) с увеличенным уровнем фосфора по сравнению с необработанной смолой.
19. Применение по любому из пп.15-18, в котором 0,1-4% мас./мас. воды смешивают с пищевым маслом.
20. Применение по любому из пп.15-19, в котором фермент добавляют к пищевому маслу при температуре от приблизительно 45 до приблизительно 90°С.
21. Применение по любому из пп.15-20, в котором рН в способе рафинирования составляет от приблизительно 5,0 до приблизительно 10,0.
22. Применение по любому из пп.15-21, в котором липидацилтрансферазу вводят в реакцию с пищевым маслом на время от приблизительно 10 до 180 мин.
23. Применение по любому из пп.15-22, в котором липидацилтрансфераза включает ΟΌ8Χ мотив и/или САКЭУ мотив.
24. Применение по любому из пп.15-23, в котором липидацилтрансферазный фермент характеризуется как фермент, который обладает ацилтрансферазной активностью и который включает мотив аминокислотной последовательности ΟΌ8Χ, где Χ представляет собой один или более из следующих аминокислотных остатков: Ь, А, V, Ι, Р, Υ, Н, ф, Т, Ν, М или 8.
25. Применение по любому из пп.15-24, в котором липидацилтрансфераза получена из организмов, выбранных из одного или более следующих родов: Аеготопак, 8!гер!отусек, 8ассйаготусек, Ьас!ососсик, МусоЬас!епит, 8!гер!ососсик, Ьас!оЬасШик, Оеки1й!оЬас!епит, ВасШик, Сатру1оЬас!ег, V^Ь^^οηасеае. Xу1е11а, 8и1Го1оЬик, АкрегдШик, 8с^окассйаготусек, ЬШепа, №1ккепа, Мекο^ЫζοЬ^ит, Ка1к!оша, XаηШοтοпак и СапШйа.
26. Применение по п.25, в котором липидацилтрансфераза получена из организма рода Аеготопак.
27. Применение по любому из пп.15-26, в котором липидацилтрансферазу получают экспрессией

- 74 020035 любой из нуклеотидных последовательностей, представленных как 8Е0 ΙΌ №. 49, 8Е0 ΙΌ №. 36, 8Е0 ГО №. 39, 8ЕО ГО №. 42, 8ЕО ГО №. 44, 8ЕО ГО №. 46, 8ЕО ГО №. 48, 8ЕО ГО №. 50, 8ЕО ГО №. 51, 8ЕО ГО №. 52, 8ЕО ГО №. 53, 8ЕО ГО №. 54, 8ЕО ГО №. 55, 8ЕО ГО №. 56, 8ЕО ГО №. 57, 8ЕО ГО №. 58, 8ЕО ΙΌ №. 59, 8ЕО ΙΌ №. 60, 8ЕО ΙΌ №. 61, 8ЕО ΙΌ №. 62 или 8ЕО ΙΌ №. 63, или нуклеотидной последовательности, обладающей 75% или большей идентичностью с ней.
28. Применение по любому из пп.15-27, в котором липидацилтрансфераза представляет собой полипептид, полученный экспрессией:

a) нуклеотидной последовательности, представленной как 8ЕО ГО №. 49, или нуклеотидной последовательности, которая обладает 75% или большей идентичностью с ней;

b) нуклеиновой кислоты, которая кодирует указанный полипептид, где указанный полипептид является по крайней мере на 70% идентичным с полипептидной последовательностью, представленной в 8ЕО ГО №. 16, или с полипептидной последовательностью, представленной в 8ЕО ГО №. 68; или

c) нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется при условиях средней жесткости с нуклеиновым зондом, содержащим нуклеотидную последовательность, показанную как 8ЕО ГО №. 49.
29. Применение по п.28, в котором липидацилтрансфераза представляет собой полипептид, полученный экспрессией нуклеотидной последовательности в ВасШик НсНешГотик.
30. Применение по любому из пп.15-29, в котором липидацилтрансфераза представляет собой полипептид, включающий любую из аминокислотных последовательностей, представленных как 8ЕО ГО №. 68, 8ЕО ГО №. 16, 8ЕО ГО №. 1, 8ЕО ГО №. 3, 8ЕО ГО №. 4, 8ЕО ГО №. 5, 8ЕО ГО №. 6, 8ЕО ГО №. 7, 8ЕО ГО №. 8, 8ЕО ГО №. 9, 8ЕО ГО №. 10, 8ЕО ГО №. 11, 8ЕО ГО №. 12, 8ЕО ГО №. 13, 8ЕО ГО №. 14, 8ЕО ГО №. 15, 8ЕО ГО №. 17, 8ЕО ГО №. 18, 8ЕО ГО №. 34, 8ЕО ГО №. 35, 8ЕО ГО №. 38 или аминокислотную последовательность, обладающую 75% или большей идентичностью с ней.
31. Применение по любому из пп.15-30, в котором липидацилтрансфераза представляет собой полипептид, включающий аминокислотную последовательность, представленную как 8ЕО ГО №. 68, или аминокислотную последовательность, обладающую 75% или большей идентичностью с ней.
32. Применение по любому из пп.15-31, в котором липидацилтрансферазу применяют в комбинации с фосфолипазой С.