EA022979B1 - Фосфолипазы, кодирующие их нуклеиновые кислоты и способы их производства и применения - Google Patents

Abstract

Раскрываются ферменты с активностью фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С (PI-PLC), кодирующие их нуклеиновые кислоты; антитела, специфически связывающиеся с ними; и способы их изготовления и применения; также обеспечиваются промышленные способы и продукты, включающие применение этих фосфолипаз. Кроме того, приводятся способы гидратации для негидрируемых фосфолипидов (НГФ) в липидном матриксе для обеспечения миграции НГФ на границу раздела масло-вода для осуществления реакции и/или удаления НГФ из липидов. Кроме того, приведен способ удаления НГФ, гидрируемых фосфолипидов и лецитинов из растительных масел для получения дегумированного масла или жирового продукта, которые можно применять для производства продуктов питания и/или непищевых приложений.

Description

Настоящее изобретение относится, главным образом, к ферментам фосфолипазам, полинуклеотидам, кодирующим эти ферменты, способам получения и применения этих полинуклеотидов и полипептидов. В альтернативных вариантах осуществления изобретение относится к ферментам фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С (ΡΙ-РЬС), нуклеиновым кислотам, кодирующим их, антителам, которые специфично связываются с ними, и способам их получения и применения. Предусматриваются промышленные способы и продукты, включающие применение этих фосфолипаз. Также в настоящем документе предусматриваются способы гидратации негидратируемых фосфолипидов (ΝΗΡ) в липидной матрице.

Способы обеспечивают миграцию ΝΗΡ к поверхности контакта масло-вода, тем самым позволяя проведение реакции или удаление ΝΗΡ из липидов. В определенных вариантах осуществления предусматриваются способы удаления ΝΗΡ, гидратируемых фосфолипидов и лецитинов (в совокупности известных как камеди) из растительных масел с получением продукта в виде рафинированного масла или жира, который можно использовать для производства продуктов питания и/или непищевых применений. В определенных вариантах осуществления в настоящем документе предусмотрены способы гидратации ΝΗΡ с последующей ферментативной обработкой и удалением различных фосфолипидов и лецитинов. Способы, представленные в настоящем документе, можно применять на практике либо для неочищенных, либо для рафинированных гидратацией масел. В определенном варианте осуществления в настоящем документе предусмотрены способы получения фосфолипидов из пищевого масла.

Уровень техники

Неочищенные растительные масла, получаемые способами либо прессования, либо экстракции растворителем, представляют собой комплексную смесь триацилглицеринов, фосфолипидов, стеринов, токоферолов, свободных жирных кислот, металлических микроэлементов и других менее значительных соединений. Является желательным удаление фосфолипидов, свободных жирных кислот и металлических микроэлементов для получения качественного салатного масла с мягким вкусом, светлым цветом и длительным сроком годности или масла, пригодного для преобразования в сырье, готовое для химической или ферментативной конверсии в биотопливо (метиловые или этиловые сложные эфиры), биопластик (эпоксидированное масло) и другие традиционные материалы на основе нефти.

Удаление фосфолипидов обуславливает практически все потери, связанные с очисткой растительных масел. Большинство молекул фосфолипидов обладают как гидрофильной функциональной группой, так и липофильными цепями жирных кислот, они обычно являются превосходными природными эмульгаторами. Функциональная группа в фосфолипидах может представлять собой любую или несколько из множества известных типов, некоторые из которых проиллюстрированы на схеме 1 ниже.

Схема 1

Функциональные группы в фосфолипидах

© -С^СН^СН^	-холин
© - сн^н^н,	-этан опа мин
—н	-кислота
1 он „оД^ 0 н	-инозитол
- СН2СНСООН 1<1На	-серин
Функциональные группы

Фосфолипиды, содержащие функциональные группы -холин, -инозитол и -этаноламин, обладают наилучшей аффинностью к воде, в то время как кислоты, соли кислот (с кальцием (Са), магнием (Мд) и железом (Ре)) и соли -этаноламина (Са, Мд и Ре) обладают значительно более низкой аффинностью к

- 1 022979 воде. Фосфатидная кислота и соли фосфатидной кислоты широко известны как негидратируемые фосфолипиды! или N11Р. Табл. 1 содержит относительные степени гидратации различных фосфолипидов, как описано в 8еп Сир1а, А.К., Ре!!е 8еЕеп Ап§1г1скш1йе1 88, раде§ 79-86 (1986), и позднее в 8едег§, ГС, е! а1., ЕКдитттд-ТНеогу апб Ргасйсе, опубликованной Лшепсап ΘΪ1 СЬеш1§1§'§ 8ос1е!у в ЕФЫе 1а1§ апб Θΐ1δ ргос姧тд: Ьа§1с рппшраН апб шобегп ргасйсез: А'огк! соп£егепсе ргосеебшдз'Уебйеб Ьу 1)а\тс1 Епск§оп, (1990) раде§ 88-93.

Таблица 1

Относительные степени гидратации

Фосфолипиды	Относительная степень гидратации
Фосфатидилхолин (РС)	100
Фосфатидилинозитол (ΡΙ)	44
Кальциевая соль фосфатидилинозитола	24
Фосфатидилэтаноламин (РЕ)	16
Фосфатидная кислота (РА)	8,5
Кальциевая соль фосфатидилэтаноламина	0,9
Кальциевая соль фосфатидной кислоты	0,6

Соли фосфолипидов с кальцием, магнием и железом образуются ферментом, присутствующим в масличных семенах, фосфолипазой О (РРО). Фермент остается бездействующим в зрелом семени до тех пор, пока не повреждается защитное покрытие семени в ходе хранения или подготовки семян перед извлечением масла. Реакция РЕЕ) в семени приводит к отщеплению -холина, -инозитола, -серина или -этаноламина от фосфатной группы с образованием фосфатидной кислоты (РА). Кроме того, поскольку отщепление происходит в присутствии избытка двухвалентных металлов (Са, Мд и Ре), образуются ΝΗΡ. Комплекс фосфатидной кислоты с ионами кальция представлен ниже

О

СНг-О-С-К!

О I к₂-С-о-с-н

I о

СНз-О-Р-Оо- Са²*

Кальциевая соль фосфатидной кислоты

Фосфолипиды обычно измеряют в масле в качестве содержания фосфора в миллионных долях. В табл. 2 представлены типичные количества фосфолипидов, присутствующих в основных масличных культурах, и распределение различных функциональных групп в качестве процента фосфолипидов, присутствующих в масле.

Таблица 2

Типичные уровни и распределение фосфолипидов для основных масличных семян

В табл. 3 ниже представлены типичные количества и распределения фосфолипидов для соевых камедей. В табл. 3, как есть означает типичную композицию фосфолипидов, удаленных из растительного масла, с удерживаемым маслом (2 молекулы фосфолипидов и 1 молекула масла), дающую содержание не растворимых в ацетоне веществ, равное 67%. Нормализованная означает композицию фосфолипидов без какого-либо присутствующего масла, дающую содержание не растворимых в ацетоне веществ, равное 100%.

- 2 022979

Таблица 3

Типичные количества фосфолипидов и распределения для соевых камедей

	Проценткак есть	Процент для нормализованной
Фосфатидилхолин (РС)	33,9	47,2
Фосфатидилэтаноламин (РЕ)	14,3	19,9
Фосфатидилсерин (Р8)	0,4	0,6
Фосфатидная кислота (РА)	6,4	8,9
Фосфатидилинозитол (ΡΙ)	16,8	23,4
Всего	71,8	100,0

Конверсия фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина, фосфатидилсерина, фосфатидилинозитола и фосфатидной кислоты в их лизо- или фосфоформы значительно изменяет экономические показатели рафинирования в современном промышленном процессе очистки. Конверсия всех фосфолипидов в их лизоформы, устраняющая потерю нейтральных масел, соответствует увеличению выхода вплоть до 1,4%, в то время как конверсия всех фосфолипидов в их фосфоформы соответствует увеличению выхода масла вплоть до 3,0% для неочищенного масла с содержанием фосфора 1000 м.д. на протяжении рафинирования гидратацией.

Фосфолипиды можно частично или полностью удалять из растительных масел несколькими различными известными способами. Наиболее широко используемыми процессами в промышленности является рафинирование гидратацией, рафинирование кислотой, очистка щелочью и ферментативное рафинирование. Иллюстративные способы описаны в патентах США №№ 4049686; 4698185; 5239096; 5264367;5286886; 5532163; 6001640; 6103505; 6127137; 6143545; 6172248; 6548633; 7494676 и 7226771 и публикациях США №№ 2007/0134777, 2005/0059130, 2008/0182322 и 2009/0069587.

Существующие способы не являются достаточными для удаления или реакции негидратируемых фосфолипидов, присутствующих в масле, поскольку ΝΗΡ не доступны для гидратации или реакции для обеспечения их удаления.

Существует потребность в экономичных и эффективных способах удаления ΝΗΡ, гидратируемых фосфолипидов и лецитинов (в совокупности известных как камеди) из растительных масел для получения продукта в виде рафинированного масла или жира, который можно использовать для производства продуктов питания и/или непищевых применений.

Фосфолипазы представляют собой ферменты, которые гидролизуют сложноэфирные связи фосфолипидов. В соответствии с их значением в метаболизме фосфолипидов эти ферменты широко распространены среди прокариот и эукариот. Фосфолипазы влияют на метаболизм, конструирование и реорганизацию биологических мембран и вовлечены в каскады передачи сигнала. Известно несколько типов фосфолипаз, которые отличаются их специфичностью в зависимости от положения связи, на которую осуществляется воздействие в молекуле фосфолипида.

Ферменты фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С (Р1-РБС) представляют собой семейство эукариотических внутриклеточных ферментов, которые играют важную роль в процессах передачи сигнала. Катализируемая Р1-РЬС реакция представляет собой

1-фосфатидил-Ш-миоинозитол 4,5-бифосфат (также называемый Р1Р₂, фосфатидилинозитолбифосфатом) + Н₂Оо Ш-миоинозитол 1,4,5-трифосфат (также называемый 1Р₃, инозитолтрифосфатом) + диацилглицерин.

Семейства ферментов фосфолипазы С (РЬС) идентифицированы в бактериях и в эукариотических трипаносомах. Ферменты РЬС относятся к семейству гидролаз и фосфодиэстераз. РЬС участвуют в метаболизме фосфатидилинозитол-4,5-бифосфата (Р1Р₂) и каскадах липидной передачи сигнала зависимым от кальция образом. Изоформы РЬС могут отличаться их способом активации, уровнями экспрессии, каталитической регуляцией, локализацией в клетке, авидностью связывания с мембранами и распределением в тканях. Все они способны катализировать гидролиз Р1Р₂ на две важных молекулы вторичных посредников, которые продолжают каскад для изменения клеточных ответов, таких как пролиферация, дифференцировка, апоптоз, ремоделирование цитоскелета, везикулярный транспорт, проводимость ионных каналов, эндокринная функция и нейротрансмиссия. РЬС описаны, например, в Сагтеп С., I. Βΐοΐ. Сйет. 270 (1995) 18711-18714, Лапад Υ., Т ΒίοΙ. Сйет, 271 (1996) 29528-29532, \\ аддопег Ό., I. Βΐοΐ. Сйет. 270 (1995) 19422-19429, Мо1еси1аг РгоЬез Ргобис! Зйее! 2001, и Запо е! а1., Ат. I. Рйу§ю1. кипу Се11 Мо1. Рйу§ίο1. 281: 844-851, 2001.

Ферменты фосфолипазы А1 (РЬА1) удаляют жирную кислоту в 1 положении с образованием свободной жирной кислоты и 1-лизо-2-ацилфосфолипида. Ферменты фосфолипазы А2 (РЬА2) удаляют жирную кислоту во 2 положении с образованием свободной жирной кислоты и 1-ацил-2лизофосфолипида. Ферменты РЕА1 и Р1.А2 могут быть внутри- или внеклеточными, мембраносвязан- 3 022979 ными или растворимыми. Внутриклеточная РЬЛ2 встречается практически в каждой клетке млекопитающих. Ферменты фосфолипазы С (РЬС) удаляют фосфатную группу с образованием 1,2диацилглицерина и фосфатного сложного эфира. Ферменты фосфолипазы Ό (РЬО) образуют 1,2диацилглицерофосфат и основную группу.

Сущность изобретения

В настоящем документе предусматриваются полипептиды и полинуклеотиды, кодирующие полипептиды, имеющие активность фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С (Р1-РЬС) или эквивалентного фермента и/или активность другой фосфолипазы, включая активность фосфолипазы А, В, С, Ό, пататина, фосфатазы фосфатидной кислоты (РАР) и/или ацилгидролазы липидов (ЬАН) или эквивалентного фермента, и способы получения и применения этих полинуклеотидов и полипептидов. В одном аспекте в настоящем документе предусматриваются полипептиды, например ферменты, обладающие активностью фосфолипазы, например активностью фосфолипазы А, В, Ό или С, например активностью фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С (Р1-РЬС). Ферментативная активность полипептидов и пептидов, представленных в настоящем документе, включает (содержит или состоит из) активность фосфолипазы, активность фосфолипазы С или активность фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С (Р1-РЬС), включая гидролиз липидов, реакции ацидолиза (например, замена этерифицированной жирной кислоты свободной кислотой), реакции транс-этерификации (например, обмен жирными кислотами между триацилглицеридами), синтез сложных эфиров, реакции переэтерификации и активность ацилгидролазы липидов (ЬАН). В другом аспекте полипептиды, представленные в настоящем документе, используют для синтеза энантиомерно чистых хиральных продуктов. Полипептиды, представленные в настоящем документе, можно использовать в различных фармацевтических, сельскохозяйственных и промышленных контекстах, включая производство косметических средств и нутрицевтиков.

Кроме того, полипептиды, представленные в настоящем документе, можно использовать в пищевой промышленности, пивоварении, добавках для ванн, производстве спирта, синтезе пептидов, энантиоселективности, получении шкур в кожевенной промышленности, обработке отходов и деградации животных отходов, регенерации серебра в фотопромышленности, медицинском обслуживании, обесклеивании шелка, деградации биопленки, конверсии биомассы в этанол, биологической защите, противомикробных средствах и дезинфицирующих средствах, средствах для персонального ухода и косметических средствах, биотехнологических реагентах, в увеличении выхода крахмала в процессе влажного измельчения кукурузы и в качестве фармацевтических средств, таких как способствующие пищеварению средства и противовоспалительные (антифлогистонные) средства.

В определенных вариантах осуществления в настоящем документе предусматриваются композиции (например, фосфолипаза, фосфолипаза С, фосфатидилинозитол-специфическая фосфолипаза С (Р1-РЬС)) и способы получения масел с низким содержанием фосфолипидов, например масел с более низким содержанием фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина, фосфатидилсерина, фосфатидилинозитола и/или фосфатидной кислоты. Композицией или способом, предусмотренными в настоящем документе, можно обрабатывать любое масло, например растительное масло, например масло канолы, соевое масло или животное масло, или жир, например сало. Любые продукты питания, готовые в пищу продукты или продукты выпекания, жарки или варки (например, соусы, маринады, приправы, распыляемые масла, маргарины, масла для выпекания, майонез, кулинарные жиры, салатные масла, черпаемые ложкой и наливаемые приправы и т.п. и продукты, изготовленные с ними) могут содержать растительное масло или животный жир, обработанные композицией или способом, предусмотренными в настоящем документе. Растительные масла, модифицированные масла с более низким содержанием фосфолипидов можно применять в любых продуктах питания, годных в пищу продуктах или продуктах выпекания или варки, например соусах, маринадах, приправах, распыляемых маслах, маргаринах, маслах для выпекания, майонезе, кулинарных жирах, салатных маслах, черпаемых ложкой и наливаемых приправах и т.п. В одном варианте осуществления в настоящем документе предусмотрены масла, такие как растительные масла, например масло канолы или соевое масло, и продукты питания или продукты выпекания или варки, включая соусы, маринады, приправы, распыляемые масла, маргарины, масла для выпекания, майонез, кулинарные жиры, салатные масла, черпаемые ложкой и наливаемые приправы и т.п., где масло или продукт питания, продукт выпекания или варки модифицированы с использованием фермента, представленного в настоящем документе. В одном аспекте эти растительные масла, например масло канолы, касторовое масло, кокосовое масло, кориандровое масло, кукурузное масло, хлопковое масло, масло лесного ореха, конопляное масло, льняное масло, масло пенника лугового, оливковое масло, пальмовое масло, пальмоядровое масло, арахисовое масло, рапсовое масло, рисовое масло, сафлоровое масло, масло сасанквы, соевое масло, подсолнечное масло, таловое масло, масло камелии, различные виды природных масел, имеющих измененный состав жирных кислот, полученных с помощью генетически модифицированных организмов (СМО) или традиционной селекции, такие как высокоолеиновое, низколиноленовое или низконасыщенное масло (высокоолеиновое масло канолы, низколиноленовое соевое масло или высокостеариновые подсолнечные масла), животные жиры (таловый жир, сало, жир масла и куриный жир), рыбий жир (жир тихоокеанской корюшки, жир печени трески, жир хоплостета, жир сардин, жир сельди и жир менхадена) или смеси любых из указанных выше, и продукты питания или продукты выпекания,

- 4 022979 жарки или варки, содержат масла с более низким содержанием жирных кислот, включая масла с низким содержанием пальмитиновой кислоты, миристиновой кислоты, лауриновой кислоты, стеариновой кислоты, каприловой кислоты (октановая кислота) и т.д., переработанные с использованием композиции или способа, представленных в настоящем документе.

В одном аспекте в настоящем документе предусмотрены полипептиды, например ферменты и каталитические антитела, обладающие активностью фосфолипазы, например фосфолипазы С, например фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С (Р1-РЬС), термостабильными и термоустойчивыми видами ферментативной активности, и специфическими к жирным кислотам или селективными к жирным кислотам видами активности, и видами ферментативной активности, устойчивыми к низким или высоким значениям рН, и полинуклеотиды, кодирующие эти полипептиды, включая векторы, клеткихозяева, трансгенные растения и не являющиеся человеком животные, и способы получения и применения этих полинуклеотидов и полипептидов.

В другом аспекте в настоящем документе предусматриваются выделенные, синтетические или рекомбинантные нуклеиновые кислоты (а), кодирующие полипептид, обладающий ферментативной активностью фосфолипазы, например фосфолипазы С, например фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С (Р1-РЬС), и (ί) обладающие по меньшей мере приблизительно 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88,

89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более или 100% идентичностью последовательности с 8ЕЦ ГО N0: 5 и кодирующие полипептид, имеющий по меньшей мере одно, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать, пятнадцать, шестнадцать, семнадцать, восемнадцать, девятнадцать, двадцать, двадцать одно, двадцать два, двадцать три, двадцать четыре, двадцать пять, двадцать шесть, двадцать семь, двадцать восемь, двадцать девять или тридцать или более или все из аминокислотных изменений (мутаций), состоящих из изменений, описанных в табл. 12, 13, 14 и/или 15, или эквивалентных аминокислотных замен или мутаций, или любую их комбинацию, и необязательно идентичность последовательностей определяют с помощью анализа с алгоритмом сравнения последовательностей или визуальным исследованием, и необязательно алгоритм сравнения последовательностей представляет собой алгоритм ВЬЛ8Т версии 2.2.2, где установлены параметры фильтрования Ь1а81а11-р ЫаЧр-Д пг ра!аа -Р Р, и все другие параметры установлены как параметры по умолчанию;

(ίί) кодирующие полипептид, обладающий аминокислотной последовательностью, как указано в 8ЕЦ ГО N0: 6 и имеющий по меньшей мере одно, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать, пятнадцать, шестнадцать, семнадцать, восемнадцать, девятнадцать, двадцать, двадцать одно, двадцать два, двадцать три, двадцать четыре, двадцать пять, двадцать шесть, двадцать семь, двадцать восемь, двадцать девять или тридцать или более или все из аминокислотных изменений (мутаций), состоящих из изменений, описанных в табл. 12, 13, 14 и/или 15, или эквивалентных аминокислотных изменений или замен (мутаций), или любую их комбинацию.

(ίίί) гибридизующиеся в жестких условиях с нуклеиновой кислотой, содержащей 8ЕЦ ГО N0: 5 и кодирующей полипептид, имеющий по меньшей мере одно, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать, пятнадцать, шестнадцать, семнадцать, восемнадцать, девятнадцать, двадцать, двадцать одно, двадцать два, двадцать три, двадцать четыре, двадцать пять, двадцать шесть, двадцать семь, двадцать восемь, двадцать девять или тридцать или более или все из аминокислотных изменений (мутаций), состоящих из изменений, описанных в табл. 12, 13, 14 и/или 15, или эквивалентных аминокислотных изменений или замен (мутаций), или любую их комбинацию, где жесткие условия включают стадию промывания, включающую промывание в 0,2Х 88С при температуре приблизительно 65°С в течение приблизительно 15 мин;

(ίν) представляющие собой нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность 8ЕЦ ГО N0: 7, 8ЕЦ ГО N0: 9 или 8ЕЦ ГО N0: 10 или состоящую из них; или (ν) имеющие по меньшей мере приблизительно 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89,

90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более или 100% идентичность последовательности с 8ЕЦ ГО N0: 7, 8 НО ГО N0: 9 или 8НО ГО N0: 10;

(b) последовательность нуклеиновой кислоты согласно (а), кодирующая полипептид, имеющий ферментативную активность фосфолипазы, например фосфолипазы С, например фосфатидилинозитолспецифической фосфолипазы С (Р1-РЬС), но лишенная нативной сигнальной последовательности или аминокислотной последовательности пробелка;

(c) последовательность нуклеиновой кислоты согласно (а) или (Ь), кодирующая полипептид, обладающий ферментативной активностью фосфолипазы, например фосфолипазы С, например фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С (Р1-РЬС), но лишенная нативной промоторной последовательности;

(Д) нуклеиновая кислота согласно (с), кроме того, содержащая гетерологичную промоторную по- 5 022979 следовательность или другую последовательность регуляции транскрипции;

(е) последовательность нуклеиновой кислоты по любому из (а)-(б), кроме того, содержащая нуклеиновую кислоту, кодирующую гетерологичную аминокислотную последовательность, или, кроме того, содержащую гетерологичную нуклеотидную последовательность;

(ί) нуклеиновая кислота согласно (е), где нуклеиновая кислота, кодирующая гетерологичную аминокислотную последовательность, содержит или состоит из последовательности, кодирующей гетерологичную (лидерную) сигнальную последовательность, или метку, или эпитоп, или гетерологичная нуклеотидная последовательность содержит гетерологичную промоторную последовательность;

(д) нуклеиновая кислота согласно (б), (е) или (ί), где гетерологичная нуклеотидная последовательность кодирует гетерологичную (лидерную) сигнальную последовательность, содержащую или состоящую из Ν-концевого и/или С-концевого удлинения для направления в эндоплазматическую сеть (ЕК) или эндомембрану или в растительную эндоплазматическую сеть (ЕК) или эндомембранную систему, или гетерологичная последовательность кодирует участок рестрикции;

(й) нуклеиновая кислота согласно (б), (е) или (ί), где гетерологичная промоторная последовательность содержит или состоит из конститутивного или индуцибельного промотора, или специфического для типа клеток промотора, или специфического для растения промотора, или специфического для бактерий промотора;

(ί) нуклеиновая кислота согласно любому из (а)-(й), где активность фосфолипазы, например фосфолипазы С, например фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С (Р1-РЬС), является термостабильной;

(]) нуклеиновая кислота согласно любому из (а)-(й), где активность фосфолипазы, например фосфолипазы С, например фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С (Р1-РЬС), является термоустойчивой;

(к) последовательность нуклеиновой кислоты, полностью комплементарная нуклеотидной последовательности согласно любому из (а)-(]).

В одном аспекте выделенная, синтетическая или рекомбинантная нуклеиновая кислота кодирует полипептид или пептид, обладающий активностью фосфолипазы, например фосфолипазы С, например фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С (Р1-РЬС), которая является термостабильной. Полипептиды и пептиды, кодируемые нуклеиновыми кислотами, представленными в настоящем документе, или любой полипептид или пептид, представленный в настоящем документе, могут сохранять ферментативную или связывающую активность (например, связывание субстрата) в условиях, включающий диапазон температур от приблизительно -100 до приблизительно -80°С, от приблизительно -80 до приблизительно -40°С, от приблизительно -40 до приблизительно -20°С, от приблизительно -20 до приблизительно 0°С, от приблизительно 0 до приблизительно 5°С, от приблизительно 5 до приблизительно 15°С, от приблизительно 15 до приблизительно 25°С, от приблизительно 25 до приблизительно 37°С, от приблизительно 37 до приблизительно 45°С, от приблизительно 45 до приблизительно 55°С, от приблизительно 55 до приблизительно 70°С, от приблизительно 70 до приблизительно 75°С, от приблизительно 75 до приблизительно 85°С, от приблизительно 85 до приблизительно 90°С, от приблизительно 90 до приблизительно 95°С, от приблизительно 95 до приблизительно 100°С, от приблизительно 100 до приблизительно 105°С, от приблизительно 105 до приблизительно 110°С, от приблизительно 110 до приблизительно 120°С или 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115°С или более. В настоящем документе предусмотрены термостабильные полипептиды, которые сохраняют активность фосфолипазы, например фосфолипазы С, например фосфатидилинозитолспецифической фосфолипазы С (Р1-РЬС), при температуре в диапазонах, описанных выше, при приблизительно рН 3,0, приблизительно рН 3,5, приблизительно рН 4,0, приблизительно рН 4,5, приблизительно рН 5,0, приблизительно рН 5,5, приблизительно рН 6,0, приблизительно рН 6,5, приблизительно рН 7,0, приблизительно рН 7,5, приблизительно рН 8,0, приблизительно рН 8,5, приблизительно рН 9,0, приблизительно рН 9,5, приблизительно рН 10,0, приблизительно рН 10,5, приблизительно рН 11,0, приблизительно рН 11,5, приблизительно рН 12,0 или более.

В одном аспекте полипептиды, представленные в настоящем документе, могут быть термоустойчивыми и могут сохранять активность фосфолипазы, например фосфолипазы С, например фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С (Р1-РЬС) после воздействия температуры в диапазоне от приблизительно -100 до приблизительно -80°С, от приблизительно -80 до приблизительно -40°С, от приблизительно -40 до приблизительно -20°С, от приблизительно -20 до приблизительно 0°С, от приблизительно 0 до приблизительно 5°С, от приблизительно 5 до приблизительно 15°С, от приблизительно 15 до приблизительно 25°С, от приблизительно 25 до приблизительно 37°С, от приблизительно 37 до приблизительно 45°С, от приблизительно 45 до приблизительно 55°С, от приблизительно 55 до приблизительно 70°С, от приблизительно 70 до приблизительно 75°С, от приблизительно 75 до приблизительно 85°С, от приблизительно 85 до приблизительно 90°С, от приблизительно 90 до приблизительно 95°С, от приблизительно 95 до приблизительно 100°С, от приблизительно 100 до приблизительно 105°С, от приблизительно 105 до приблизительно 110°С, от приблизительно 110 до приблизительно 120°С или 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115°С или более.

- 6 022979

В некоторых вариантах осуществления термоустойчивые полипептиды сохраняют активность фосфолипазы, например фосфолипазы С, например фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С (Р1-РЬС) после воздействия температуры в диапазонах, описанных выше, при приблизительно рН 3,0, приблизительно рН 3,5, приблизительно рН 4,0, приблизительно рН 4,5, приблизительно рН 5,0, приблизительно рН 5,5, приблизительно рН 6,0, приблизительно рН 6,5, приблизительно рН 7,0, приблизительно рН 7,5, приблизительно рН 8,0, приблизительно рН 8,5, приблизительно рН 9,0, приблизительно рН 9,5, приблизительно рН 10,0, приблизительно рН 10,5, приблизительно рН 11,0, приблизительно рН 11,5, приблизительно рН 12,0 или более.

В другом аспекте в настоящем документе предусмотрены зонды нуклеиновой кислоты или праймеры для амплификации для выделения, получения и/или идентификации нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, обладающий активностью фосфолипазы, например фосфолипазы С, например фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С (Р1-РЬС). В одном варианте осуществления зонд нуклеиновой кислоты, например зонд для идентификации нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, обладающий активностью фосфолипазы, например фосфолипазы С, например фосфатидилинозитолспецифической фосфолипазы С (Р1-РЬС), включает зонд, содержащий или состоящий по меньшей мере из приблизительно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 или более последовательно расположенных оснований последовательности, представленной в настоящем документе, или ее фрагментов или подпоследовательностей, где зонд идентифицирует нуклеиновую кислоту путем связывания или гибридизации. Зонд может содержать олигонуклеотид, содержащий по меньшей мере приблизительно от 10 до 50, приблизительно от 20 до 60, приблизительно от 30 до 70, приблизительно от 40 до 80 или приблизительно от 60 до 100 последовательно расположенных оснований последовательности, содержащей последовательность, представленную в настоящем документе, или ее фрагменты или подпоследовательности. Зонд может содержать олигонуклеотид, содержащий по меньшей мере приблизительно от 10 до 50, приблизительно от 20 до 60, приблизительно от 30 до 70, приблизительно от 40 до 80 или приблизительно от 60 до 100 последовательно расположенных оснований последовательности нуклеиновой кислоты, представленной в настоящем документе, или ее подпоследовательности.

В одном варианте осуществления последовательности пары праймеров для амплификации нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, обладающий активностью фосфолипазы, например фосфолипазы С, например фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С (Р1-РЬС), содержат пару праймеров, содержащую или состоящую из пары праймеров, способной амплифицировать нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность, представленную в настоящем документе, или ее фрагменты или подпоследовательности. Один или каждый представитель последовательностей пары праймеров для амплификации может содержать олигонуклеотид, содержащий по меньшей мере приблизительно от 10 до 50 последовательно расположенных оснований последовательности.

В одном варианте осуществления способы амплификации нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, обладающий активностью фосфолипазы, например фосфолипазы С, например фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С (Р1-РЬС), включают амплификацию матричной нуклеиновой кислоты с помощью последовательностей пары праймеров для амплификации, способной амплифицировать последовательность нуклеиновой кислоты, представленной в настоящем документе, или ее фрагменты или подпоследовательности.

В одном варианте осуществления векторы, экспрессирующие кассеты, экспрессирующие векторы, плазмиды, или носители для клонирования содержат нуклеиновую кислоту, представленную в настоящем документе, или ее подпоследовательность. В одном аспекте вектор, экспрессирующая кассета, экспрессирующий вектор, плазмида или носитель для клонирования могут содержать или содержатся в вирусном векторе, фаге, фагмиде, космиде, фосмиде, бактериофаге, искусственной хромосоме, аденовирусном векторе, ретровирусном векторе или аденоассоциированном вирусном векторе; или бактериальной искусственной хромосоме (ВАС), происходящем из бактериофага Р1 векторе (РАС), искусственной хромосоме дрожжей (УАС), или искусственной хромосоме млекопитающих (МАС).

В одном аспекте экспрессирующая кассета содержит нуклеиновую кислоту, представленную в настоящем документе, которая функционально связана с промотором. Промотор может представлять собой вирусный, бактериальный промотор, промотор млекопитающих или растений. В одном аспекте промотор растений может представлять собой промотор картофеля, риса, кукурузы, пшеницы, табака или ячменя. Промотор может представлять собой конститутивный промотор. Конститутивный промотор может включать СаМУ35§. В другом аспекте промотор может представлять собой индуцибельный промотор. В одном аспекте промотор может представлять собой тканеспецифичный промотор или промотор, регулируемый окружающей средой, или промотор, регулируемый в зависимости от стадии развития. Таким образом, промотор может представлять собой, например, промотор, специфичный для семян, специфичный для листьев, специфичный для корней, специфичный для стебля, или промотор, индуцируемый опаданием листвы. В одном аспекте экспрессирующая кассета может дополнительно содержать экспрессирующий вектор растений или вирусов растений.

В одном варианте осуществления клетка-хозяин или трансформированная клетка содержит нуклеи- 7 022979 новую кислоту, представленную в настоящем документе. В одном аспекте клетка-хозяин или трансформированная клетка может представлять собой бактериальную клетку, клетку млекопитающего, клетку гриба, дрожжевую клетку, клетку насекомых или клетку растений. В одном аспекте клетка растений может представлять собой клетку картофеля, пшеницы, риса, кукурузы, табака или ячменя. Трансформированная клетка может представлять собой любую из клеток-хозяев, известных специалистам в данной области, включая прокариотические клетки, эукариотические клетки, такие как бактериальные клетки, клетки грибов, клетки дрожжей, клетки млекопитающих, клетки насекомых или клетки растений. Иллюстративные клетки бактерий включают клетки любого вида из рода ЕксНепсИг ВасШик, §1гер1отусек, §а1топе11а, Ркеийотопак и §1арйу1ососсик, включая, например, ЕксйейсЫа сой, Ьас1ососсик 1асйк, ВасШик киЫШк, ВасШик сегеик, §а1топе11а 1урЫтшгит, Ркеийотопак йиогексепк. Иллюстративные клетки грибов включают клетки любого вида ЛкретдШик, иллюстративные клетки дрожжей включают клетки любого вида из РюЫа, 8ассйатотусек, §с1/окассНаготусек или Зсйтаппютусек, включая РюЫа ракЮпк, Зассйаготусек сегеуыае или §сН|/окасс1аготусек ротЬе. Иллюстративные клетки насекомых включают любой вид 8ройор1ета или ОтокорШа, включая ИгокорНйа §2 и §ройор!ета §Г9. Иллюстративные клетки животных включают клетки СНО, СО§ или меланомы Во\\ек или любую клеточную линию мыши или человека.

В другом варианте осуществления трансгенные не являющиеся человеком животные содержат нуклеиновую кислоту, представленную в настоящем документе, или вектор, экспрессирующую кассету, экспрессирующий вектор, плазмиду или носитель для клонирования, представленные в настоящем документе. Трансгенным не являющимся человеком животным может быть мышь, крыса, коза, кролик, овца, свинья или корова.

В одном варианте осуществления трансгенное растение или семя содержит нуклеиновую кислоту, представленную в настоящем документе, или вектор, экспрессирующую кассету, экспрессирующий вектор, плазмиду или носитель для клонирования, представленные в настоящем документе. В одном варианте осуществления растение представляет собой растение кукурузы, растение сорго, растение картофеля, растение томата, растение пшеницы, масличное растение, растение рапса, растение сои, растение риса, растение ячменя, траву, семя хлопчатника, пальму, растение кунжута, растение арахиса, растение подсолнуха или растение табака; трансгенное семя. В одном варианте осуществления семя представляет собой кукурузное семя, пшеничное зерно, масличное семя, семя рапса, семя сои, ядро кокосового ореха, семя подсолнуха, семя кунжута, рис, ячмень, арахис, семя хлопчатника, семя пальмы, арахис, семя кунжута, семя подсолнуха или семя растения табака.

В одном аспекте в настоящем документе предусмотрены антисмысловой олигонуклеотид или ингибиторная РНК, содержащие нуклеиновую кислоту, представленную в настоящем документе или состоящие из них.

В другом аспекте в настоящем документе предусмотрен способ ингибирования трансляции последовательности фосфолипазы (транскрипт, мРНК) в клетке, включающий введение в клетку или экспрессию в клетке антисмыслового олигонуклеотида или ингибиторной РНК, содержащих последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в настоящем документе, или состоящих из них.

В одном варианте осуществления выделенные, синтетические или рекомбинантные полипептиды обладают активностью фосфолипазы, например фосфолипазы С, например фосфатидилинозитолспецифической фосфолипазы С (Р1-РЬС), или представляют собой полипептиды, способные индуцировать иммунный ответ, специфичный для фосфолипазы, например фосфолипазы С, например фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С (Р1-РЬС) (например, эпитоп); и в альтернативных аспектах пептиды и полипептиды, представленные в настоящем документе, содержат последовательность (a) содержащую аминокислотную последовательность (ί) обладающую по меньшей мере 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более или 100% идентичностью последовательности с §ЕО ГО N0: 6, и имеющую по меньшей мере одно, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать, пятнадцать, шестнадцать, семнадцать, восемнадцать, девятнадцать, двадцать, двадцать одно, двадцать два, двадцать три, двадцать четыре, двадцать пять, двадцать шесть, двадцать семь, двадцать восемь, двадцать девять или тридцать или более или все из аминокислотных изменений (мутаций), состоящих из изменений, описанных в табл. 12, 13, 14 и/или 15, или эквивалентных аминокислотных изменений или замен (мутаций), или любую их комбинацию, где необязательно идентичность последовательностей определяют с помощью анализа с алгоритмом сравнения последовательностей или визуальным исследованием;

(й) кодируемую нуклеиновой кислотой, представленной в настоящем документе;

(Ш) имеющую по меньшей мере приблизительно 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более или 100% идентичность последовательности с §Е0 ГО N0: 8;

(b) полипептид согласно (а), но лишенный нативной сигнальной последовательности и/или последовательности пробелка;

(c) полипептид согласно (а) или (Ь), кроме того, содержащий гетерологичную аминокислотную последовательность или гетерологичную часть;

- 8 022979 (ά) полипептид согласно (с), где гетерологичная аминокислотная последовательность или гетерологичная часть содержит гетерологичную (лидерную) сигнальную последовательность, маркер, поддающуюся детекции метку или эпитоп, или состоит из них;

(е) полипептид согласно (ά), где гетерологичная (лидерная) сигнальная последовательность содержит Ν-концевое и/или С-концевое удлинение для нацеливания на эндоплазматическую сеть (ЕК) или эндомембрану, или на растительную эндоплазматическую сеть (ЕК), или систему эндомембран, или состоит из них;

(ί) полипептид по любому из (а)-(е), где фосфолипаза, например фосфолипаза С, например фосфатидилинозитол-специфическая фосфолипаза С (Р1-РЬС), катализирует реакцию, включающую

1-фосфатидил-ГО-миоинозитол 4,5-бифосфат (также называемый Р1Р₂, фосфатидилинозитолбифосфатом)+Н₂О^ГО-миоинозитол 1,4,5-трифосфат (также называемый 1Р₃, инозитолтрифосфатом) + диацилглицерин;

(д) полипептид согласно (а)-(£), где активность фосфолипазы, например фосфолипазы С, например фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С (Р1-РЬС), является термостабильной;

(к) полипептид согласно (а)-(£), где активность фосфолипазы, например фосфолипазы С, например фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С (Р1-РЬС), является термоустойчивой;

(ί) полипептид согласно любому из (а)-(к), где (ί) полипептид является гликозилированным или полипептид содержит по меньшей мере один участок гликозилирования, (и) полипептид согласно (ί), где гликозилирование представляет собой Ν-связанное гликозилирование или О-связанное гликозилирование; (ίίί) полипептид согласно (ί) или (и), где полипептид является гликозилированным после экспрессии в клетках дрожжей; или (ίν) полипептид согласно (ίίί), где клетка дрожжей представляет собой Р. ра81оЙ8 или 8. рошЬе;

(ί) полипептид согласно любому из (а)-(1), кроме того, содержащий композицию, содержащую по меньшей мере один второй фермент, или по меньшей мере один второй фермент фосфолипазы, или содержащийся в ней; или (к) полипептид согласно (]), где по меньшей мере один второй фермент фосфолипазы содержит полипептид, имеющий последовательность, как указано в 8ЕО ГО N0: 2 и/или 8Е0 ГО N0: 4, или по меньшей мере один из их вариантных ферментов, как описано в табл. 8 и 9.

В одном аспекте выделенный, синтетический или рекомбинантный полипептид может содержать полипептид, представленный в настоящем документе, который лишен сигнальной (пептидной) последовательности, например лишен его гомологичной сигнальной последовательности, и в одном аспекте содержит гетерологичную сигнальную (пептидную) последовательность. В одном аспекте выделенный, синтетический или рекомбинантный полипептид может содержать полипептид, представленный в настоящем документе, содержащий гетерологичную сигнальную последовательность, такую как гетерологичная сигнальная последовательность фосфолипазы или не фосфолипазы (например, не фосфолипазы, не фосфолипазы С или не фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С (Р1-РБС)). В одном аспекте химерные белки содержат первый домен, содержащий сигнальную последовательность, представленную в настоящем документе, и по меньшей мере второй домен. Белок может представлять собой слитый белок. Второй домен может содержать фермент. Фермент может представлять собой фосфолипазу, например фосфолипазу С, например фосфатидилинозитол-специфическую фосфолипазу С (Р1-РЬС), представленную в настоящем документе, или другой фермент.

В одном аспекте активность фосфолипазы, например фосфолипазы С, например фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С (Р1-РЬС), включает удельную активность при приблизительно 37°С в диапазоне от приблизительно 100 до приблизительно 1000 единиц на 1 мг белка. В другом аспекте активность фосфолипазы, например фосфолипазы С, например фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С (Р1-РЬС), включает удельную активность от приблизительно 500 до приблизительно 750 единиц на 1 мг белка. Альтернативно активность фосфолипазы включает удельную активность при 37°С в диапазоне от приблизительно 500 до приблизительно 1200 единиц на 1 мг белка. В одном аспекте активность фосфолипазы включает удельную активность при 37°С в диапазоне от приблизительно 750 до приблизительно 1000 единиц на 1 мг белка. В другом аспекте термоустойчивость включает сохранение по меньшей мере половины удельной активности фосфолипазы при 37°С после нагревания до повышенной температуры. Альтернативно, термоустойчивость может включать сохранение удельной активности при 37°С в диапазоне от приблизительно 500 до приблизительно 1200 единиц на 1 мг белка после нагревания до повышенной температуры.

В одном варианте осуществления выделенные, синтетические или рекомбинантные полипептиды, представленные в настоящем документе, содержат по меньшей мере один участок гликозилирования. В одном аспекте гликозилирование может представлять собой Ν-связанное гликозилирование. В одном аспекте полипептид может быть гликозилированным после экспрессии в Р. ра81оЙ8 или 8. ротЬе или в растениях, таких как продуцирующие масло растения, например соя, канола, рис, подсолнух или генетически модифицированные (ОМО) варианты этих растений.

В одном аспекте полипептид может сохранять активность фосфолипазы, например фосфолипазы С, например фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С (Р1-РЬС) ,в условиях, включающих при- 9 022979 близительно рН 6,5, рН 6, рН 5,5, рН 5, рН 4,5 или рН 4,0 или ниже. В другом аспекте полипептид может сохранять активность фосфолипазы, например фосфолипазы С, например фосфатидилинозитолспецифической фосфолипазы С (Р1-РЬС), в условиях, включающих приблизительно рН 7, рН 7,5, рН 8,0, рН 8,5, рН 9, рН 9,5, рН 10, рН 10,5, рН 11, рН 11,5, рН 12,0 или более.

В одном варианте осуществления препараты белка содержат полипептид, представленный в настоящем документе, где препарат белка содержит жидкость, твердое вещество или гель.

В одном аспекте гетеродимеры, представленные в настоящем документе, содержат полипептид и второй домен. В одном аспекте второй домен может представлять собой полипептид, и гетеродимер может представлять собой слитый белок. В одном аспекте второй домен может представлять собой эпитоп или метку. В одном аспекте гомодимеры, представленные в настоящем документе, содержат полипептид, представленный в настоящем документе.

В одном варианте осуществления иммобилизованные полипептиды, представленные в настоящем документе, обладают активностью фосфолипазы, например фосфолипазы С, например фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С (Р1-РЬС), где полипептид содержит полипептид, представленный в настоящем документе, полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой, представленной в настоящем документе, или полипептид, содержащий полипептид, представленный в настоящем документе, и второй домен. В одном аспекте полипептид, представленный в настоящем документе, может быть иммобилизован на клетке, везикуле, липосоме, пленке, мембране, металле, смоле, полимере, керамике, стекле, микроэлектроде, графитовой частице, грануле, геле, пластине, кристалле, таблетке, пилюле, капсуле, порошке, агломерате, поверхности, пористой структуре, чипе или капиллярной трубке, или материалах, таких как зерна, шелуха, кора, кожа, волосы, эмаль, кость, скорлупа и материалы, происходящие из них. Полинуклеотиды, полипептиды и ферменты, представленные в настоящем документе, можно изготавливать в твердой форме, такой как порошок, лиофилизированный препарат, гранулы, таблетка, плитка, кристалл, капсула, пилюля, драже, или в жидкой форме, такой как водный раствор, аэрозоль, гель, паста, взвесь, водная/масляная эмульсия, крем, капсула или суспензия везикул или мицелл.

В одном аспекте в настоящем документе предусмотрены выделенные, синтетические или рекомбинантные антитела, которые специфично связываются с полипептидом, представленным в настоящем документе. В другом аспекте выделенные, синтетические или рекомбинантные антитела представляют собой моноклональные или поликлональные антитела, или их антигенсвязывающие фрагменты. В одном аспекте в настоящем документе предусмотрена гибридома, содержащая антитело, представленное в настоящем документе.

В одном варианте осуществления в настоящем документе предусмотрен чип, содержащий иммобилизованный полипептид, иммобилизованную нуклеиновую кислоту или антитело, представленные в настоящем документе, или их комбинацию.

В одном варианте осуществления добавки в корм для животного содержат полипептид, представленный в настоящем документе, например полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой, представленной в настоящем документе. В одном аспекте полипептид в пищевой добавке может быть гликозилированным. В одном варианте осуществления съедобные матрицы для доставки фермента содержат полипептид, представленный в настоящем документе, например полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой, представленной в настоящем документе. В одном аспекте матрица для доставки включает драже. В одном аспекте полипептид может быть гликозилированным. В одном аспекте активность фосфолипазы является термоустойчивой. В другом аспекте активность фосфолипазы является термостабильной.

В одном варианте осуществления способы выделения или идентификации полипептида, имеющего активность фосфолипазы, например фосфолипазы С, например фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С (Р1-РЬС), включают стадии: (а) предоставления антитела, представленного в настоящем документе; (Ь) предоставления образца, содержащего полипептиды; и (с) контактирования образца стадии (Ь) с антителом стадии (а) в условиях, где антитело может специфично связываться с полипептидом, тем самым выделяя или идентифицируя полипептид, обладающий активностью фосфолипазы, например фосфолипазы С, например фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С (Р1-РЬС).

В одном варианте осуществления способы получения антител против фосфолипазы включают введение не являющемуся человеком животному нуклеиновой кислоты, представленной в настоящем документе, или полипептида, представленного в настоящем документе, или их подпоследовательности в количестве, достаточном для индуцирования гуморального иммунного ответа, тем самым получая антитело против фосфолипазы. В настоящем документе предусмотрены способы получения антитела против фосфолипазы, включающие введение не являющемуся человеком животному нуклеиновой кислоты, представленной в настоящем документе, или полипептида, представленного в настоящем документе, или их подпоследовательностей в количестве, достаточном для индуцирования иммунного ответа.

В одном варианте осуществления способы получения рекомбинантного полипептида включают стадию: (А) (а) предоставления нуклеиновой кислоты, представленной в настоящем документе, где нуклеиновая кислота необязательно связана с промотором, где нуклеиновая кислота содержит нуклеиновую кислоту, представленную в настоящем документе; и (Ь) экспрессии нуклеиновой кислоты стадии (а) в условиях, которые позволяют экспрессию полипептида, тем самым получая рекомбинантный полипеп- 10 022979 тид; или (В) способ согласно (А), кроме того, включающий трансформацию клетки-хозяина нуклеиновой кислотой стадии (а) с последующей экспрессией нуклеиновой кислоты стадии (а), тем самым получая рекомбинантный полипептид в трансформированной клетке.

В одном варианте осуществления способы идентификации полипептида, обладающего активностью фосфолипазы, включают стадии: (а) предоставления полипептида, представленного в настоящем документе; (Ь) предоставления субстрата фосфолипазы и (с) контактирования полипептида с субстратом стадии (Ь) и детекции уменьшения количества субстрата или увеличения количества продукта реакции, где снижение количества субстрата или увеличение количества продукта реакции выявляет полипептид, обладающий активностью фосфолипазы.

В другом варианте осуществления способы идентификации субстрата фосфолипазы включают стадии: (а) предоставления полипептида, представленного в настоящем документе; (Ь) предоставления тестируемого субстрата и (с) контактирования полипептида стадии (а) с тестируемым субстратом стадии (Ь) и детекции уменьшения количества субстрата или увеличения количества продукта реакции, где уменьшение количества субстрата или увеличение количества продукта реакции идентифицирует тестируемый субстрат в качестве субстрата фосфолипазы.

В другом аспекте способы определения того, связывается ли специфично тестируемое соединение с полипептидом, включают стадии: (а) экспрессии нуклеиновой кислоты или вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, в условиях, позволяющих трансляцию нуклеиновой кислоты в полипептид, где нуклеиновая кислота содержит нуклеиновую кислоту, представленную в настоящем документе; (Ь) предоставления тестируемого соединения; (с) контактирования полипептида с тестируемым соединением и (6) определения того, связывается ли специфично тестируемое соединение стадии (Ь) с полипептидом.

В другом аспекте способы определения того, связывается ли специфично тестируемое соединение с полипептидом, включают стадии: (а) предоставления полипептида, представленного в настоящем документе; (Ь) предоставления тестируемого соединения; (с) контактирования полипептида с тестируемым соединением и (6) определения того, связывается ли специфично тестируемое соединение стадии (Ь) с полипептидом.

В одном варианте осуществления способы идентификации модулятора активности фосфолипазы включают стадии: (А) (а) предоставления полипептида, представленного в настоящем документе; (Ь) предоставления тестируемого соединения; (с) контактирования полипептида стадии (а) с тестируемым соединением стадии (Ь) и измерения активности фосфолипазы, где изменение активности фосфолипазы, измеренной в присутствии тестируемого соединения, по сравнению с активностью в отсутствие тестируемого соединения обеспечивает определение того, что тестируемое соединение модулирует активность фосфолипазы; (В) способ согласно (А), где активность фосфолипазы измеряют путем предоставления субстрата фосфолипазы и детекции уменьшения количества субстрата или увеличения количества продукта реакции или увеличения количества субстрата или уменьшения количества продукта реакции; (с) способ согласно (В), где снижение количества субстрата или увеличение количества продукта реакции с тестируемым соединением по сравнению с количеством субстрата или продукта реакции без тестируемого соединения идентифицирует тестируемое соединение в качестве активатора активности фосфолипазы; или (6) способ согласно (В), где увеличение количества субстрата или уменьшение количества продукта реакции с тестируемым соединением по сравнению с количеством субстрата или продукта реакции без тестируемого соединения идентифицирует тестируемое соединение в качестве ингибитора активности фосфолипазы.

В одном аспекте способы выделения или извлечения нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид с активностью фосфолипазы, из образца, включают стадии: (А) (а) предоставления полинуклеотидного зонда, содержащего нуклеиновую кислоту, представленную в настоящем документе; (Ь) выделения нуклеиновой кислоты из образца или обработку образца так, чтобы нуклеиновая кислота в образце была доступна для гибридизации с полинуклеотидным зондом стадии (а); (с) комбинирования выделенной нуклеиновой кислоты или обработанного образца стадии (Ь) с полинуклеотидным зондом стадии (а) и (6) выделения нуклеиновой кислоты, которая специфично гибридизуется с полинуклеотидным зондом стадии (а), тем самым выделяя или извлекая из образца нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид с активностью фосфолипазы; (В) способ согласно (А), где образец представляет собой или содержит образец из окружающей среды; (С) способ согласно (В), где образец из окружающей среды представляет собой или содержит образец воды, образец жидкости, образец почвы, образец воздуха или биологический образец; или (Ό) способ согласно (С), где биологический образец получен из бактериальной клетки, клетки простейших, клетки насекомых, клетки дрожжей, клетки растений, клетки грибов или клетки млекопитающих.

В одном варианте осуществления способы выделения или извлечения нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, обладающий активностью фосфолипазы из образца, включают стадии: (а) предоставления последовательностей пары праймеров для амплификации нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, обладающий активностью фосфолипазы, где пара праймеров способна амплифицировать нуклеиновую кислоту, представленную в настоящем документе; (Ь) выделения нуклеиновой кислоты из образца или обработку образца так, чтобы нуклеиновая кислота в образце была доступна для гибридиза- 11 022979 ции с парой праймеров для амплификации; и (с) объединения нуклеиновой кислоты стадии (Ь) с парой праймеров для амплификации стадии (а) и амплификация нуклеиновой кислоты из образца, тем самым, выделяя или извлекая нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, обладающий активностью фосфолипазы, из образца. В одном варианте осуществления образец представляет собой образец из окружающей среды, например образец воды, образец жидкости, образец почвы, образец воздуха или биологический образец, например бактериальную клетку, клетку простейших, клетку насекомых, клетку дрожжей, клетку растений, клетку грибов или клетку млекопитающих. Один или каждый член пары праймеров для амплификации может включать олигонуклеотид, содержащий по меньшей мере приблизительно от 10 до 50 или более последовательно расположенных оснований последовательности, представленной в настоящем документе.

В одном варианте осуществления способы увеличения термоустойчивости или термостабильности полипептида фосфолипазы включают гликозилирование полипептида фосфолипазы, где полипептид содержит по меньшей мере тридцать последовательно расположенных аминокислот полипептида, представленного в настоящем документе; или полипептида, кодируемого последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в настоящем документе, тем самым увеличивая термоустойчивость или термостабильность полипептида фосфолипазы. В одном аспекте специфическая активность фосфолипазы может быть термостабильной или термоустойчивой при температуре в диапазоне от более чем приблизительно 37 до приблизительно 95°С.

В одном варианте осуществления способы сверхэкспрессии рекомбинантного полипептида фосфолипазы, например фосфолипазы С, например фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С (ΡΙРЬС), в клетке включают экспрессию вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, представленную в настоящем документе, или последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в настоящем документе, где идентичность последовательностей определяют с помощью анализа с алгоритмом сравнения последовательностей или визуальным исследованием, где сверхэкспрессию обеспечивают с использованием высокоактивного промотора, бицистронного вектора или амплификации гена в векторе.

В одном варианте осуществления способы получения варианта нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид с активностью фосфолипазы, включают стадии: (А) (а) предоставления матричной нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеиновую кислоту, представленную в настоящем документе; и (Ь) модификации, делеции или вставки одного или нескольких нуклеотидов в матричной последовательности или их комбинации с получением варианта матричной нуклеиновой кислоты; (В) способ согласно (А), кроме того, включающий экспрессию варианта нуклеиновой кислоты с получением варианта полипептида фосфолипазы; (С) способ согласно (А) или (В), где модификации, вставки или делеции вносят способом, включающим ПЦР с пониженной точностью, шаффлинг, олигонуклеотид-направленный мутагенез, объединяющую ПЦР, мутагенез с помощью половой ПЦР, мутагенез ίη νίνο, кассетный мутагенез, возвратно-множественный мутагенез, экспоненциально-множественный мутагенез, сайт-специфический мутагенез, повторную сборку гена, мутагенез с насыщением сайтов гена (О88М), синтетическую повторную сборку лигированием (8ЬК) или их комбинацию; (Ό) способ согласно любому из (А)-(С), где модификации, вставки или делеции вносят способом, включающим рекомбинацию, рекомбинацию возвратной последовательности, мутагенез с модификацией ДНК фосфотиоатом, мутагенез с содержащей урацил матрицей, мутагенез с содержащими разрывы дуплексами, мутагенез с репарацией точек несоответствия, мутагенез с дефектом репарации штамма-хозяина, химический мутагенез, мутагенез радиогенного происхождения, мутагенез с делецией, мутагенез с рестрикцией и селекцией, мутагенез с рестрикцией и исправлением ошибок, синтез искусственного гена, множественный мутагенез, получение химерного мультимера нуклеиновой кислоты и их комбинацию; (Е) способ согласно любому из (Ά)-(Ό), где способ многократно повторяют до тех пор, пока не получают (вариантную) фосфолипазу, обладающую измененной или отличающейся (вариантной) активностью, или измененной или отличающейся (вариантной) стабильностью по сравнению с полипептидом, кодируемым матричной нуклеиновой кислотой, или измененной или отличающейся (вариантной) вторичной структурой по сравнению с полипептидом, кодируемым матричной нуклеиновой кислотой, или с измененной или отличающейся (вариантной) посттрансляционной модификаций по сравнению с полипептидом, кодируемым матричной нуклеиновой кислотой; (Р) способ согласно (Е), где вариант полипептида фосфолипазы является термоустойчивым и сохраняет некоторую активность после воздействия увеличенной температуры; (О) способ согласно (Е), где полипептид варианта фосфолипазы обладает увеличенным гликозилированием относительно гликозилирования фосфолипазы, кодируемой матричной нуклеиновой кислотой; (Н) способ согласно (Е), где полипептид варианта фосфолипазы обладает активностью фосфолипазы при высокой температуре, где фосфолипаза, кодируемая матричной нуклеиновой кислотой, не является активной при высокой температуре; (Ι) способ согласно любому из (А)-(Н), где способ многократно повторяют до тех пор, пока не получат фосфолипазу, кодирующую последовательность, в которой используются кодоны, измененные по сравнению с кодонами матричной нуклеиновой кислоты; или (1) способ согласно любому (А)-(Н), где способ многократно повторяют до тех пор, пока не получают ген фосфолипазы, обладающий повышенным или пониженным уровнем экспрессии транскрипта или повышенной или пониженной стабильностью относительно уровня экспрессии и стабильности матричной нуклеиновой кислоты.

- 12 022979

В одном аспекте предусмотрены способы модификации кодонов в нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид фосфолипазы, причем способы включают стадии: (а) предоставления нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид с активностью фосфолипазы, содержащей нуклеиновую кислоту, представленную в настоящем документе; и, (Ь) идентификации кодона в нуклеиновой кислоте стадии (а) и замены его отличающимся кодоном, кодирующим ту же аминокислоту, что и замененный кодон, тем самым модифицируя нуклеиновую кислоту, кодирующую фосфолипазу.

В одном варианте осуществления предусмотрены способы получения библиотеки нуклеиновых кислот, кодирующих множество модифицированных активных центров фосфолипазы или участков связывания субстрата, где модифицированные активные центры или участки связывания субстрата происходят из первой нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, кодирующую первый активный центр или первый участок связывания субстрата, причем способ включает стадии: (А) (а) предоставления первой нуклеиновой кислоты, кодирующей первый активный центр или первый участок связывания субстрата, где первая последовательность нуклеиновой кислоты содержит нуклеиновую кислоту, представленную в настоящем документе, и нуклеиновая кислота кодирует активный центр фосфолипазы или участок связывания субстрата фосфолипазы; (Ь) предоставления набора мутагенных олигонуклеотидов, которые кодируют встречающиеся в природе варианты аминокислот во множестве из выбранных для нацеливания кодонов в первой нуклеиновой кислоте; и (с) использования набора мутагенных олигонуклеотидов для получения набора кодирующих активный центр или связывающий субстрат участок вариантов нуклеиновых кислот, кодирующих ряд вариантов аминокислот в каждом кодоне аминокислоты, который был подвергнут мутагенезу, тем самым получая библиотеку нуклеиновых кислот, кодирующих множество модифицированных активных центров фосфолипазы или участков связывания субстрата; (В) способ согласно (А), включающий мутагенез первой нуклеиновой кислоты стадии (а) способом, включающим оптимизированную систему направленных изменений, мутагенез с насыщением сайтов гена (ΟδδΜ), синтетическую повторную сборку лигированием (8ЬК); (С) способ согласно (А) или (В), включающий мутагенез первой нуклеиновой кислоты стадии (а) или ее вариантов способом, включающим ПЦР с пониженной точностью, шаффлинг, олигонуклеотид-направленный мутагенез, объединяющую ПЦР, мутагенез посредством половой ПЦР, мутагенез ίη νίνο, кассетный мутагенез, возвратно-множественный мутагенез, экспоненциально-множественный мутагенез, сайт-специфический мутагенез, повторную сборку гена, мутагенез с насыщением сайтов гена (ΟδδΜ), синтетическую повторную сборку лигированием (δΒΚ) И их комбинацию; или (Ό) способ согласно (А) или (В), включающий мутагенез первой нуклеиновой кислоты стадии (а) или ее вариантов способом, включающим рекомбинацию, рекомбинацию возвратной последовательности, мутагенез с модификацией ДНК фосфотиоатом, мутагенез с содержащей урацил матрицей, мутагенез с содержащими разрывы дуплексами, мутагенез с репарацией точек несоответствия, мутагенез с дефектом репарации штамма-хозяина, химический мутагенез, мутагенез радиогенного происхождения, мутагенез с делецией, мутагенез с рестрикцией и селекцией, мутагенез с рестрикцией и исправлением ошибок, синтез искусственного гена, множественный мутагенез, получение химерного мультимера нуклеиновой кислоты и их комбинации.

В одном аспекте способы получения низкомолекулярного соединения включают стадии: (а) предоставления множества биосинтетических ферментов, способных синтезировать или модифицировать низкомолекулярное соединение, где один из ферментов содержит фермент фосфолипазу, кодируемую нуклеиновой кислотой, представленной в настоящем документе; (Ь) предоставления субстрата по меньшей мере для одного из ферментов стадии (а); и (с) реакции субстрата стадии (Ь) с ферментами в условиях, которые облегчают множество биокаталитических реакций, с получением низкомолекулярного соединения с помощью серии биокаталитических реакций.

В другом аспекте способы модификации низкомолекулярного соединения включают стадии: (А) (а) предоставления фермента фосфолипазы, где фермент содержит полипептид, представленный в настоящем документе, или полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой, представленной в настоящем документе; (Ь) предоставления низкомолекулярного соединения и (с) реакции фермента стадии (а) с низкомолекулярным соединением стадии (Ь) в условиях, которые облегчают ферментативную реакцию, катализируемую ферментом фосфолипазой, тем самым, модифицируя низкомолекулярное соединение ферментативной реакцией фосфолипазы; (В) способ согласно (А), включающий множество низкомолекулярных субстратов для фермента стадии (а), тем самым получая библиотеку модифицированных низкомолекулярных соединений, получаемых с помощью по меньшей мере одной ферментативной реакции, катализируемой ферментом фосфолипазой; (С) способ согласно (А) или (В), кроме того, включающий множество дополнительных ферментов в условиях, которые облегчают множество биокаталитических реакций ферментами, с получением библиотеки модифицированных низкомолекулярных соединений, получаемых множеством ферментативных реакций; (Ό) способ согласно (С), кроме того, включающий стадию тестирования библиотеки для определения того, присутствует ли в библиотеке конкретное модифицированное низкомолекулярное соединение, которое проявляет желаемую активность; или (Е) способ согласно (Ό), где стадия тестирования библиотеки, кроме того, включает стадии систематического удаления всех, кроме одной, биокаталитических реакций, используемых для получения части из множества модифицированных низкомолекулярных соединений из библиотеки, с тестированием части модифици- 13 022979 рованных низкомолекулярных соединений на наличие или отсутствие конкретного модифицированного низкомолекулярного соединения с желаемой активностью, и идентификации по меньшей мере одной конкретной биокаталитической реакции, в результате которой образуется модифицированное низкомолекулярное соединение с желаемой активностью.

В другом аспекте способы определения функционального фрагмента фермента фосфолипазы включают стадии: (А) (а) предоставления фермента фосфолипазы, где фермент содержит полипептид, представленный в настоящем документе, или полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой, представленной в настоящем документе; и (Ь) удаления множества аминокислотных остатков из последовательности стадии (а) и тестирования оставшейся подпоследовательности в отношении активности фосфолипазы, тем самым определяя функциональный фрагмент фермента фосфолипазы; или (В) способ согласно (А), где активность фосфолипазы измеряют путем предоставления субстрата фосфолипазы и тестирования уменьшения количества субстрата или увеличения продукта реакции.

В одном аспекте предусмотрен способ инженерии цельных клеток с новыми или модифицированными фенотипами с использованием анализа метаболических изменений в режиме реального времени, причем способ включает стадии: (а) получения модифицированной клетки посредством модификации генетического набора клетки, где генетический набор модифицирован добавлением в клетку нуклеиновой кислоты, представленной в настоящем документе; (Ь) культивирования модифицированной клетки с получением множества модифицированных клеток; (с) измерения по меньшей мере одного параметра метаболизма клетки посредством контроля клеточной культуры стадии (Ь) в режиме реального времени; и (ά) анализ данных стадии (с) для определения наличия отличий измеренного параметра от сравнительного измерения в немодифицированной клетке в аналогичных условиях, тем самым идентифицируя полученный с помощью способов инженерии фенотип клетки с использованием анализа метаболических изменений в режиме реального времени; (В) согласно (А), где генетический набор клетки модифицируют способом, включающим делецию последовательности или модификацию последовательности в клетке, или нокаут экспрессии гена; (С) способ согласно (А) или (В), кроме того, включающий селекцию клетки, содержащей новый полученный способами инженерии фенотип; или (Ό) способ согласно (С), кроме того, включающий культивирование отобранной клетки, тем самым, получая новый штамм, содержащий новый полученный способами инженерии фенотип.

В одном варианте осуществления способы получения трансгенного растения включают следующие стадии: (а) введение гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты в растительную клетку, где гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в настоящем документе, тем самым получая трансформированную клетку растений; и (Ь) получение трансгенного растения из трансформированной клетки. В одном аспекте стадия (а) может дополнительно включать введение гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты электропорацией или микроинъекцией в протопласты клеток растений. В другом аспекте стадия (а) может дополнительно включать введение гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты непосредственно в ткань растений бомбардировкой частицами с ДНК. Альтернативно стадия (а) может дополнительно включать введение гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты в ДНК клетки растения с использованием хозяина АдгоЬасЮпит 1итсГас1СП5. В одном аспекте клетка растения может представлять собой клетку картофеля, кукурузы, риса, пшеницы, табака или ячменя.

В одном варианте осуществления способы экспрессии гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты в растительной клетке включают следующие стадии: (а) трансформация клетки растений гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, функционально связанной с промотором, где гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты содержит нуклеиновую кислоту, представленную в настоящем документе; (Ь) выращивание растения в условиях, при которых гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты экспрессируется в клетке растений.

В одном аспекте в настоящем документе предусмотрены детергентные композиции, содержащие полипептид фосфолипазы, представленный в настоящем документе, или полипептид фосфолипазы, кодируемый нуклеиновой кислотой, представленной в настоящем документе. В одном аспекте фосфолипаза представляет собой не поверхностно-активную фосфолипазу или поверхностно-активную фосфолипазу. В другом аспекте фосфолипаза включена в состав неводной жидкой композиции, отлитого твердого тела, лиофилизированного порошка, гранулированной формы, формы в виде частиц, прессованной таблетки, драже, формы геля, пасты, аэрозоля или формы взвеси.

В одном аспекте способы мытья предмета включают стадии: (а) предоставления композиции, содержащей полипептид фосфолипазы, представленный в настоящем документе, или полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой, представленной в настоящем документе; (Ь) предоставления предмета и (с) контактирования полипептида стадии (а) и предмета стадии (Ь) в условиях, где композиция может отмыть предмет.

В одном варианте осуществления в настоящем документе предусмотрены композиции, содержащие полипептид фосфолипазы, представленный в настоящем документе, или полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой, представленной в настоящем документе.

В одном аспекте способы смягчения, лечения или предупреждения опосредуемой липополисахари- 14 022979 дом (ЬР§) токсичности включат введение пациенту фармацевтической композиции, содержащей полипептид, представленный в настоящем документе, или полипептид, кодируемый последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в настоящем документе.

В другом аспекте в настоящем документе предусмотрены фармацевтические препараты, предшественники фармацевтических препаратов и фармацевтические композиции, содержащие полипептид, представленный в настоящем документе, или полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой, представленной в настоящем документе. В другом аспекте в настоящем документе предусмотрены способы изготовления фармацевтического препарата, предшественника фармацевтического препарата или фармацевтической композиции, включающие добавление полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой, представленной в настоящем документе, в фармацевтический препарат, предшественник фармацевтического препарата или фармацевтическую композицию. В одном аспекте фармацевтическую композицию применяют для предупреждения, лечения или смягчения опосредуемой липополисахаридом (ЬР§) токсичности, или для детоксикации эндотоксина или деацилирования 2'- или 3'-цепи жирной кислоты от липида А.

В одном варианте осуществления способы детоксикации эндотоксина включают контактирование эндотоксина с полипептидом, представленным в настоящем документе, или полипептидом, кодируемым нуклеиновой кислотой, представленной в настоящем документе.

В другом варианте осуществления способы получения варианта кодирующей фосфолипазу последовательности, имеющего увеличенную экспрессию в клетке-хозяине включают модификацию нуклеиновой кислоты, представленной в настоящем документе так, чтобы один, несколько или все мотивы, кодирующие участки Ν-связанного гликозилирования, были модифицированы в мотив, не кодирующий участки гликозилирования.

В одном варианте осуществления в настоящем документе предусмотрены композиции, содержащие смесь ферментов фосфолипаз, содержащие: (а) (ί) полипептид фосфолипазы, представленный в настоящем документе, или полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой, представленной в настоящем документе, и (ίί) по меньшей мере один второй фермент; (Ь) композицию согласно (а), где по меньшей мере один фермент представляет собой фермент фосфолипазу; или (с) композицию согласно (Ь), где по меньшей мере один второй фермент фосфолипазы содержит полипептид, как указано в §ЕЦ ГО N0: 2 и/или §ЕЦ ГО N0: 4, или по меньшей мере один вариант ферментов РЬС, как описано в табл. 8 и 9.

В одном аспекте способы получения биотоплива, например биодизеля, включают стадии: (А) (а) предоставления полипептида фосфолипазы, представленного в настоящем документе, или фермента фосфолипазы, кодируемого нуклеиновой кислотой, представленной в настоящем документе, или композиции, содержащей полипептид, представленный в настоящем документе; (Ь) предоставления композиции, содержащей липид или алкиловый сложный эфир; (с) контактирования полипептида фосфолипазы согласно (а) с композицией согласно (Ь); (В) способ согласно (А), где композиция, содержащая липид или алкиловый сложный эфир представляет собой или содержит масло и/или жир; или (С) способ согласно (А) или (В), где композиция, содержащая липид или алкиловый сложный эфир, представляет собой или содержит водоросли, растительное масло, растительное масло прямой перегонки, растительное масло холодного прессования, отработанное растительное масло, животный жир, топленое сало, жир, сало или желтый жир. В другом аспекте в настоящем документе предусмотрены топлива, например биотоплива, например биодизель, изготовленные способами, которые включают стадии: (А) (а) предоставления полипептида фосфолипазы, представленного в настоящем документе, или фермента фосфолипазы, кодируемого нуклеиновой кислотой, представленной в настоящем документе, или композиции, содержащей полипептид, представленный в настоящем документе; Ь) предоставления композиции, содержащей липид или алкиловый сложный эфир; (с) контактирования полипептида фосфолипазы согласно (а) с композицией согласно (Ь); (В) способ согласно (А), где композиция, содержащая липид или алкиловый сложный эфир, представляет собой или содержит масло и/или жир; или (С) способ согласно (А) или (В), где композиция, содержащая липид или алкиловый эфир, представляет собой или содержит водоросли, растительное масло, растительное масло прямой перегонки, растительное масло холодного прессования, отработанное растительное масло, животный жир, топленое сало, жир, сало или желтый жир.

В другом аспекте сухой экстракт барды (ΌΌδ), сухая барда (ΌΌ8), конденсированный экстракт барды (СЭ8). влажный экстракт барды ГОАС) или сухая гранулированная барда (ΌΌ08) содержат полипептид, представленный в настоящем документе, или полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой, представленной в настоящем документе, или композицией, представленной в настоящем документе.

В другом варианте осуществления в настоящем документе предусматривается биомасса, содержащая: (а) полипептид, представленный в настоящем документе, или полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой, представленной в настоящем документе, или композицию, предоставленную в настоящем документе; (Ь) биомассу согласно (а), где биомасса представляет собой или содержит биомассу животных, водорослей и/или растений или содержащую липиды или лигноцеллюлозную биомассу или материал отходов.

В другом варианте осуществления в настоящем документе предусмотрен продукт на основе нефти, содержащий: (а) полипептид, представленный в настоящем документе, или полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой, представленной в настоящем документе, или композицию, представленную в

- 15 022979 настоящем документе; (Ь) полученный способом, включающим применение полипептида, представленного в настоящем документе, или полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой, представленной в настоящем документе, или композиции, представленной в настоящем документе; или (с) продукт на основе нефти согласно (а) или (Ь), содержащий масло, биодизель, или бензин, или биоэтанол, биобутанол, биопропанол или биометанол или смесь биоэтанола, биобутанола, биопропанола, биометанола и/или биодизеля и газолина.

В одном варианте осуществления в настоящем документе предусмотрен способ гидратации негидратируемых фосфолипидов (ПНР) в липидной матрице путем обеспечения миграции их к поверхности контакта масло-вода. Затем ПНР подвергают реакции и/или удаляют из липидов. В одном варианте осуществления способ включает: а) смешение водной кислоты с пригодным в пищу маслом с получением кислотной смеси, имеющей рН менее чем приблизительно 4; и Ь) смешение основания с кислотной смесью с получением прореагировавшей смеси, имеющей рН приблизительно 6-9. В определенных вариантах осуществления смешение на стадиях а) и/или Ь) приводит к эмульсии, которая содержит водную фазу со средним размером капель от приблизительно 15 до приблизительно 45 мкм. В определенных вариантах осуществления смешение на стадиях а) и/или Ь) приводит к эмульсии, которая содержит по меньшей мере приблизительно 60% водной фазы по объему с размером капель от приблизительно 15 до приблизительно 45 мкм, где процент водной фазы основан на общем объеме водной фазы. В определенных вариантах осуществления смешение на стадиях а) и/или Ь) приводит к эмульсии, которая содержит по меньшей мере приблизительно 60, 70, 80, 90, 93, 95, 96, 97, 98 или 99% водной фазы по объему с размером капель от приблизительно 20 до приблизительно 45 мкм. В определенных вариантах осуществления способ дополнительно включает рафинирование реакционной смеси водой или ферментом с получением рафинированного масла. В определенных вариантах осуществления смешение на стадиях а) и/или Ь) проводят с помощью смесителя с высокими сдвиговыми усилиями со скоростью лопасти по меньшей мере приблизительно 1400, 1600, 1800, 2000, 2100, 2300, 2500, 3000 или 3500 см/с.

В способах, предоставленных в настоящем документе, можно использовать любую кислоту, которую сочтет пригодной специалист в данной области. В определенных вариантах осуществления кислота выбрана из группы, состоящей из фосфорной кислоты, уксусной кислоты, лимонной кислоты, виннокаменной кислоты, янтарной кислоты и их смеси. В способах, предоставленных в настоящем документе, можно использовать любую кислоту, которую сочтет пригодной специалист в данной области. В определенных вариантах осуществления основание выбрано из группы, состоящей из гидроксида натрия, гидроксида калия, силиката натрия, карбоната натрия, карбоната кальция и их комбинации.

В определенных вариантах осуществления способ гидратации негидратируемых фосфолипидов в годном в пищу масле, кроме того, включает стадию рафинирования гидратацией или ферментативного рафинирования для получения рафинированного масла. В одном варианте осуществления в настоящем документе предусмотрен способ, где после гидратации ПНР следует ферментативная обработка и удаление различных фосфолипидов и лецитинов. Такие способы можно осуществлять на практике либо на неочищенных, либо на рафинированных гидратацией, маслах.

В определенных вариантах осуществления способ рафинирования масла, представленный в настоящем документе, включает: а) смешение водного раствора кислоты с пищевым маслом с получением кислотной смеси, имеющей рН приблизительно от 1 до 4, Ь) смешение основания с кислотной смесью с получением прореагировавшей смеси, имеющей рН приблизительно 6-9, и с) рафинирование прореагировавшей смеси водой или ферментом с получением рафинированного масла. В определенных вариантах осуществления смешение на стадии а) и/или Ь) приводит к эмульсии, которая содержит водную фазу со средним размером капель от приблизительно 15 до приблизительно 45 мкм. В определенных вариантах осуществления смешение на стадиях а) и/или Ь) приводит к эмульсии, которая содержит по меньшей мере приблизительно 60% водной фазы по объему с размером капель от приблизительно 15 до приблизительно 45 мкм, где процент водной фазы основан на объеме водной фазы.

В одном варианте осуществления в настоящем документе предусмотрен способ удаления ПНР, гидратируемых фосфолипидов и лецитинов (в совокупности известных как камеди) из растительных масел с получением продукта в виде рафинированного масла или жира, который можно использовать для производства пищевых продуктов и/или непищевых применений. В определенных вариантах осуществления в способах рафинирования, предоставленных в настоящем документе, используется вода, различные кислоты и/или различные основания или их комбинация.

В другом аспекте в настоящем документе предусмотрен способ увеличения скорости реакции фосфолипазы, используемой в способе ферментативного рафинирования так, чтобы ферментативная реакция имела длительность менее приблизительно одного часа.

В другом аспекте в настоящем документе предусмотрен способ рафинирования композиции на основе масла, в котором как гидратируемые, так и негидратируемые фосфолипиды можно обрабатывать в едином процессе, где ферментативная реакция завершается в течение менее приблизительно одного часа.

В одном варианте осуществления в настоящем документе предусмотрен способ гидролиза, расщепления или разрушения содержащей фосфолипид композиции, включающий:

(А) (а) предоставление полипептида фосфолипазы; (Ь) предоставление композиции, содержащей

- 16 022979 фосфолипид; и (с) контактирование полипептида стадии (а) с композицией стадии (Ь) в условиях, где фосфолипаза гидролизует, расщепляет или разрушает содержащую фосфолипид композицию;

(B) способ согласно (А), где композиция содержит содержащий фосфолипид липидный бислой или мембрану; или (C) способ согласно любому из (А) или (В), где композиция содержит клетку растения, бактериальную клетку, клетку дрожжей, клетку насекомых или клетку животных.

В одном варианте осуществления в настоящем документе предусмотрен способ разжижения или удаления содержащей фосфолипид композиции, включающий:

(a) предоставление полипептида фосфолипазы;

(b) предоставление композиции, содержащей фосфолипид; и (c) контактирование полипептида стадии (а) с композицией стадии (Ь) в условиях, где фосфолипаза удаляет или разжижает содержащую фосфолипид композицию.

В одном варианте осуществления в настоящем документе предусмотрен способ очистки фитостерина или тритерпена, включающий:

А1) (А1а) предоставление композиции, содержащей полипептид фосфолипазы;

(А1Ь) предоставление композиции, содержащей фитостерин или тритерпен; и (А1с) контактирование полипептида стадии (а) с композицией стадии (Ь) в условиях, где полипептид может катализировать гидролиз фосфолипида в композиции;

(В1) способ согласно (А1), где фитостерин или тритерпен содержит растительный стерин;

(С1) способ согласно (В1), где растительный стерин происходит из растительного масла;

(ΌΙ) способ согласно (С1), где растительное масло включает кокосовое масло, масло канолы, масло какао, кукурузное масло, хлопковое масло, льняное масло, оливковое масло, пальмовое масло, арахисовое масло, масло, полученное из рисовой шелухи, сафлоровое масло, кунжутное масло, соевое масло или подсолнечное масло;

(Е1) способ согласно любому из (А1)-(Л1), кроме того, включающий применение неполярных растворителей для количественной экстракции свободных фитостеринов и фитостериловых эфиров жирных кислот; или (ΡΙ) способ согласно (Е1), где фитостерин или тритерпен включает β-ситостерин, кампестерин, стигмастерин, стигмастанол, β-ситостанол, ситостанол, десмостерин, халинастерин, пориферастерин, клионастерин или брассикастерин.

В одном варианте осуществления в настоящем документе предусмотрен способ рафинирования масла или жира, включающий:

(А1) (А1а) предоставление композиции, содержащей полипептид фосфолипазы;

(А1Ь) предоставление композиции, содержащей масло или жир, содержащие фосфолипид; и (А1с) контактирование полипептида стадии (А1а) с композицией стадии (А1Ь) в условиях, где полипептид может катализировать гидролиз фосфолипида в композиции;

(В1) способ согласно (А1), где полипептид находится в водном растворе, который добавляют в композицию;

(С1) способ согласно (В1), где уровень воды составляет приблизительно от 0,5 до 5%;

(Л1) способ согласно любому из (А1)-(С1), где длительность процесса составляет менее чем приблизительно 2 ч;

(Е1) способ согласно любому из (А1)-(С1), где длительность процесса составляет менее чем приблизительно 60 мин;

(Р1) способ согласно любому из (А1)-(С1), где длительность процесса составляет менее чем приблизительно 30 мин, менее чем приблизительно 15 мин или менее чем приблизительно 5 мин;

(01) способ согласно любому из (А1)-(Р1), где условия гидролиза включают температуру приблизительно от 25 до 70°С;

(Н1) способ согласно любому из (А1)-(01), где условия гидролиза включают применение щелочей;

(Ι1) способ согласно любому из (А1)-(Н1), где условия гидролиза включают рН приблизительно от 3 до 10;

(Л) способ согласно любому из (А1)-(11), где условия гидролиза включают добавление эмульгаторов и/или смешение после контактирования стадии (А1)(А1с);

(К1) способ согласно любому из (А1)-(Л), включающий добавление реагента для расслоения эмульсии и/или нагревание или охлаждение для обеспечения отделения водной фазы;

(Ь1) способ согласно любому из (А1)-(К1), включающий рафинирование перед стадией контактирования для сбора лецитина центрифугированием, а затем добавление РЬС, РЬС и/или РЬА для удаления негидратируемых фосфолипидов;

(М1) способ согласно любому из (А1)-(Ь1), включающий рафинирование гидратацией неочищенного масла до менее чем 10 м.д. фосфора для пищевых масел и дополнительную физическую очистку до менее чем приблизительно 50 м.д. фосфора для биодизельных масел; или (N1) способ согласно любому из (А1)-(М1), включающий добавление кислоты для обеспечения

- 17 022979 гидратации негидратируемых фосфолипидов.

В одном варианте осуществления в настоящем документе предусмотрен способ рафинирования масла или жира, включающий:

(а1) предоставление композиции, содержащей полипептид фосфолипазы;

(Ы) предоставление композиции, содержащей содержащий фосфолипид жир или масло; и (с1) контактирование полипептида стадии (а1) и композиции стадии (Ы) в условиях, где полипептид может катализировать гидролиз фосфолипида в композиции.

В одном варианте осуществления в настоящем документе предусмотрен способ физической очистки содержащей фосфолипид композиции, включающий:

(А-1) (А-1а) предоставление композиции, содержащей полипептид фосфолипазы;

(А-1Ь) предоставление композиции, содержащей фосфолипид; и (А-1с) контактирование полипептида стадии (А-1а) с композицией стадии (А-1Ь) до, в процессе или после физической очистки;

(В-1) способ согласно (А-1), где полипептид добавляют до физической очистки, и композиция, содержащая фосфолипид, содержит растение, и полипептид экспрессируется трансгенно в растении, причем полипептид добавляют в процессе дробления семян или другой части растения или полипептид добавляют после дробления или перед очисткой;

(С-1) способ согласно (А-1), где полипептид добавляют в процессе физической очистки;

(Ό-1) способ согласно (А-1), где полипептид добавляют после физической очистки в интенсивном смесителе или ретенционном смесителе; после стадии нагревания; в центрифуге; в соапсток; в смывную воду; или на стадии отбеливания или дезодорирования; или (Е-1) способ согласно любому из (Λ-1)-(Ό-1), кроме того, включающий добавление фермента фосфолипазы А (РЬА), фосфолипазы В (РЬВ), фосфолипазы С (РЬС), фосфолипазы Ό (РЬЭ) или фосфатазы или их комбинации.

В одном варианте осуществления в настоящем документе предусмотрен способ щелочной очистки содержащей фосфолипид композиции, включающий:

(А1) (А1а) предоставление композиции, содержащей полипептид, обладающий активностью фосфолипазы;

(А1Ь) предоставление композиции, содержащей фосфолипид; и (А1с) контактирование полипептида стадии (А1а) с композицией стадии (А1Ь) до, в процессе или после щелочной очистки;

(В1) способ согласно (А1), где полипептид добавляют до добавления кислоты или щелочи;

(С1) способ согласно любому из (А1)-(В1), где полипептид добавляют в процессе щелочной очистки и различные уровни кислоты и щелочи добавляют в зависимости от уровней фосфора и уровней свободных жирных кислот; или (Ό1) способ согласно любому из (А1)-(В1), где полипептид добавляют после щелочной очистки в интенсивном смесителе или ретенционном смесителе; после стадии нагревания; в центрифуге; в соапсток; в смывную воду или на стадии отбеливания или дезодорирования; или (Е1) способ согласно любому из (А1)-(О1), где условия щелочной очистки обеспечивают добавлением концентрированного раствора щелочи, или где условия щелочной очистки включают применение концентрированного раствора щелочи, более концентрированного, чем промышленный стандарт 11%, или где условия щелочной очистки включают применение концентрированного раствора щелочи, который является концентрированным на 12-50%;

(Р1) способ согласно любому из (А1)-(Е1), где композиция, содержащая фосфолипид, содержит растение;

(01) способ согласно любому из (Р1), где полипептид экспрессируется в растении трансгенно;

(Н1) способ согласно любому из (А1)-(01), где полипептид добавляют в процессе дробления семени или другой части растения или полипептид добавляют после дробления или перед очисткой; или (11) способ согласно любому из (А1)-(Н1), включающий процесс, указанный на фиг. 10; или процесс, указанный на фиг. 10, в котором добавляют достаточное количество кислоты для обеспечения снижения содержания металлического кальция и магния.

В одном варианте осуществления в настоящем документе предусмотрен способ деацилирования 2'или 3'-цепи жирной кислоты из липида А, включающий контактирование липида А с полипептидом фосфолипазы.

В одном варианте осуществления в настоящем документе предусмотрен способ уменьшения массы камеди и увеличения содержания нейтрального масла (триглицерида) путем снижения удержания масла включающий:

(А1) (А1а) предоставление композиции, содержащей полипептид фосфолипазы;

(А1Ь) предоставление композиции, содержащей фосфолипид жир или масло; и (А1с) контактирование полипептида стадии (А1а) и композиции стадии (А1Ь) в условиях, где полипептид может катализировать гидролиз фосфолипида в композиции в течение времени, достаточного для снижения массы камеди и увеличения количества нейтральных масел;

- 18 022979 (В1) препарат белка согласно (А1), где препарат белка содержит состав, содержащий неводную жидкую композицию, отлитое твердое тело, порошок, лиофилизированный порошок, гранулярную форму, форму в виде частиц, прессованную таблетку, драже, пилюлю, форму геля, гидрогель, пасту, аэрозоль, спрей, лосьон, состав взвеси, водную/масляную эмульсию, крем, капсулу, везикулу, или мицеллярную суспензию; или (С1) способ согласно (А1) или (В1), включающий применение смешения композиции с высоким сдвиговым усилием с последующим смешением без сдвигового усилия или с низким сдвиговым усилием по меньшей мере с одним полипептидом по изобретению, обладающим активностью фосфолипазы, для обеспечения надлежащего контактирования фосфолипидного субстрата с фосфолипазой.

В одном варианте осуществления в настоящем документе предусмотрено масло или жир, продуцируемые способами, предоставленными в настоящем документе.

Ферменты для применения в способах, предоставленных в настоящем документе, включают ферменты, обладающие активностью фосфолипазы. Активность фосфолипазы включает, например, активность фосфолипазы С (РБС), активность фосфолипазы А (РБА), активность фосфолипазы А1 или активность фосфолипазы А2, активность фосфолипазы В (РБВ), включая активность фосфолипазы В1 или фосфолипазы В2, активность фосфолипазы Б (РББ), включая активность фосфолипазы Б1 или активность фосфолипазы Б2. В одном варианте осуществления ферменты для применения в настоящем документе включают полипептиды, обладающие активностью фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С (Р1-РЬС), или эквивалентного фермента, и/или активностью другой фосфолипазы, включая активность фосфолипазы А, В, С, Б, пататина, фосфатаз фосфатидной кислоты (РАР) и/или ацилгидролазы липидов (БАН) или эквивалентного фермента.

В определенных вариантах осуществления фермент для применения в способах, представленных в настоящем документе, выбран из фосфолипазы А, фосфолипазы С, фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С или их комбинации. В определенных вариантах осуществления фермент для применения в способах, предоставленных в настоящем документе, выбран из фосфолипазы С, фосфатидилинозитолспецифической фосфолипазы С или их комбинации. В определенных вариантах осуществления фермент для применения в способах, предоставленных в настоящем документе, представляет собой фермент фосфатидилинозитол-специфическую фосфолипазу С, как описано в настоящем документе. В определенных вариантах осуществления фермент для применения в способах, предоставленных в настоящем документе, выбран из фосфолипазы С, и фермента, содержащего 8Е0 1Б N0: 8. В определенных вариантах осуществления фермент для применения в способах, предоставленных в настоящем документе, представляет собой фермент, содержащий 8Е0 ГО N0: 8.

В другом варианте осуществления в настоящем документе предусмотрен способ получения фосфолипида из пищевого масла. В определенном варианте осуществления фосфолипиды, получаемые способами, предоставленными в настоящем документе, включают множество фосфолипидов, включая, но не ограничиваясь ими, фосфатидилхолин (РС), фосфатидилэтаноламин (РЕ), фосфатидилсерин (Р8), фосфатидилинозитол (Р1), фосфатидную кислоту (РА), лизофосфатидилхолин (ЬРС), лизофосфатидилэтаноламин (ЕРЕ), лизофосфатидилсерин (БР8), лизофосфатидилинозитол (БР1), лизофосфатидную кислоту (БРА), холин (С), этаноламин (Е), серин (8) и инозитол (I).

В другом варианте осуществления в настоящем документе предусмотрен способ получения холина (С), этаноламина (Е), серина (8) или инозитола (I) из пищевого масла.

Подробное описание одного или нескольких вариантов осуществления данного изобретения представлено далее на прилагаемых ниже чертежах и описании. Другие свойства, цели и преимущества изобретения будут очевидны из описания, чертежей и из формулы изобретения.

Все публикации, патенты, патентные заявки, последовательности из ОеиВаик и материалы АТСС, цитированные в данном описании для любых целей, таким образом, полностью включены в данное описание в качестве ссылок.

Краткое описание чертежей

Описанные ниже чертежи иллюстрируют варианты осуществления изобретения, и не подразумевается, что они ограничивают объем изобретения, охватываемый формулой изобретения.

На фиг. 1 схематично показан иллюстративный способ очистки растительного масла с использованием фосфолипаз по изобретению;

на фиг. 2 - иллюстративный процесс рафинирования по изобретению для физически очищенных масел, как подробно рассмотрено ниже;

на фиг. 3 - гидролиз фосфатидов фосфолипазой С по изобретению, как подробно рассмотрено ниже; на фиг. 4 - иллюстративный процесс щелочной очистки по изобретению и альтернативный вариант осуществления, включающий применение фосфолипазы С по изобретению в качестве добавки для щелочной очистки (щелочная очистка с длительным перемешиванием), как подробно рассмотрено ниже; на фиг. 5 - применение фосфолипазы С по изобретению в качестве добавки для рафинирования, как подробно рассмотрено ниже;

на фиг. 6 - иллюстративный процесс щелочной очистки по изобретению и альтернативный вариант осуществления, включающий применение фосфолипазы С по изобретению в качестве добавки для ще- 19 022979 лочной очистки (щелочная очистка с длительным перемешиванием), как подробно рассмотрено ниже; на фиг. 7 - другой вариант способов по изобретению, где в способе используют две стадии центрифугирования, как подробно рассмотрено ниже;

на фиг. 8 - другой вариант способов по изобретению, где в способе используют три стадии центрифугирования, как подробно рассмотрено ниже;

на фиг. 9 - другой иллюстративный вариант этого процесса, в котором используется обработка кислотой и имеется стадия центрифугирования перед стадией рафинирования, как подробно рассмотрено ниже;

на фиг. 10 - массовая доля отдельных типов фосфолипидов (РЬ) фосфатидной кислоты (РА), фосфатидилэтаноламина (РЕ), фосфатидилинозитола (ΡΙ), фосфатидилхолина (РС) относительного общего содержания РЬ, остающегося после обработки мутантными фосфолипазами по изобретению;

на фиг. 11 - улучшенные мутанты, полученные способом мутагенеза с насыщением сайтов гена или ОЗЗМ, отобранные для включения в библиотеку повторной сборки генов, которая включает иллюстративные фосфолипазы по изобретению;

на фиг. 12 - спиртовой процесс, который может включать ферменты по изобретению;

на фиг. 13 - композиция фосфолипидов в извлеченных влажных камедях в контрольных примерах;

на фиг. 14 - сравнение фосфолипидов согласно контрольным примерам против примеров с использованием способов, представленных в настоящем документе, где рН на стадии Ь) доводят до рН 7,0;

на фиг. 15 сравнивается потеря нейтрального масла в фазу камеди в контрольных реакциях с нейтральным рН против реакций с доведенным рН при рН 7,0, параллельно;

на фиг. 16 сравнивается потеря нейтрального масла в фазу камеди в условиях различных рН, где используется фосфолипаза А1;

на фиг. 17 представлено распределение капель в водной фазе, полученной способом согласно примеру 17А;

на фиг. 18 - распределение капель в водной фазе, полученной способом согласно примеру 17В;

на фиг. 19 - распределение капель в водной фазе, полученной способом согласно примеру 17С;

на фиг. 20 - распределение капель в водной фазе, полученной способом согласно примеру 17Ό;

на фиг. 21 - сравнительное распределение капель в водной фазе, полученной способами согласно примерам 17А, 17В, 17С и 17Ό.

Подобные символы на различных чертежах указывают на подобные элементы.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к полипептидам, обладающим активностью фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С (ΡΙ-РЬС) или эквивалентного фермента и/или активностью другой фосфолипазы, включая активность фосфолипазы А, В, С, Э. пататина, фосфатаз фосфатидной кислоты (РАР) и/или ацилгидролаз липидов (ΕΑΗ), или активностью эквивалентного фермента, к полинуклеотидам, кодирующим их, антителам, которые специфично связываются с ними, и способам их получения и применения.

В одном варианте осуществления активность фермента фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С (ΡΙ-РЬС) у полипептидов по изобретению включает

1-фосфатидил-Ш-миоинозитол 4,5-бифосфат (также называемый ΡΙΡ₂, фосфатидилинозитолбифосфатомЦЩО-^Ш-миоинозитол 1,4,5-трифосфат (также называемый ΙΡ₃, инозитолтрифосфатом) + диацилглицерин.

В альтернативных вариантах осуществления ферменты по изобретению могут эффективно расщеплять глицеринфосфатную сложноэфирную связь в маслах, таких как растительные масла, например фосфолипиды масличных семян, с образованием экстрагируемого водой фосфорилированного основания и диглицерида.

В альтернативных вариантах осуществления фосфолипазы по изобретению обладают активностью ацилгидролазы липидов (БАИ); или могут расщеплять глицеринфосфатные сложноэфирные связи в фосфатидилхолине (РС), фосфатидилэтаноламине (РЕ), фосфатидилсерине (РЗ), фосфатидилинозитоле (ΡΙ), фосфатидной кислоте и/или сфингомиелине, или они обладают комбинацией этих видов активности. Например, в одном аспекте фосфолипаза по изобретению является специфичной к одному или нескольким специфическим субстратам, например, фермент по изобретению может обладать специфичностью действия в отношении РЕ и РС; РЕ и ΡΙ; РЕ и РЗ; РЗ и РС; РЗ и ΡΙ; ΡΙ и РС; РЗ, ΡΙ и РС; РЕ, ΡΙ и РС; РС, РЕ и РЗ; РЕ, РЗ и ΡΙ или РЕ, РЗ, ΡΙ и РС.

В альтернативных вариантах осуществления фосфолипазу по изобретению (например, фермент фосфатидилинозитол-специфическую фосфолипазу С (ΡΙ-РЬС) или фермент с эквивалентной активностью) можно использовать для ферментативного рафинирования масел, например неочищенных масел, поскольку фосфатная группа растворима в воде и ее легко удалять. Диглицеридный продукт остается в масле, и, таким образом, потери снижаются. РЬС по изобретению можно применять в дополнение к или вместо РЬА1 и РЬА2 в коммерческом рафинировании масла, таком как способ ΒΝΖΥΜΑΧ®, где фосфолипиды гидролизуют с помощью РЬА1 и РЬА2.

В альтернативных вариантах осуществления фосфолипазы по изобретению являются активными

- 20 022979 при высокой и/или при низкой температуре или на протяжении широкого диапазона температур, например они могут быть активными при температурах в диапазоне от 20 до 90°С, от 30 до 80°С или от 40 до 70°С. Также изобретение относится к фосфолипазам, которые обладают активностью при щелочных рН или кислых рН, например при низкой кислотности воды. В альтернативных аспектах фосфолипазы по изобретению могут обладать активностью в кислых рН, таких как рН 6,5, рН 6,0, рН 5,5, рН 5,0, рН 4,5, рН 4,0, рН 3,5, рН 3,0, рН 2,5, рН 2,0 или при более кислых рН (т.е. <рН 2,0). В альтернативных аспектах фосфолипазы по изобретению могут обладать активностью при щелочных рН, таких как рН 7,5, рН 8,0, рН 8,5, рН 9,0, рН 9,5, рН 10,0 или более щелочные рН (т.е. >рН 10,0). В одном аспекте фосфолипазы по изобретению являются активными в диапазоне температур от приблизительно 40 до приблизительно 70, 75 или 80°С или более, в условиях низкой водной активности (низкого содержания воды).

Также изобретение относится к способам получения РЬС и/или модификации активности иллюстративных фосфолипаз по изобретению для получения ферментов с альтернативными желаемыми свойствами, например с активностью фермента фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С (Р1-РЬС), имеющего альтернативные субстраты, или с видами активности в различных условиях окружающей среды, например при различных температурах, рН и т.п. Например, фосфолипазы, полученные способами по изобретению, могут обладать измененной субстратной специфичностью, специфичностью связывания субстрата, характером расщепления субстрата, термической стабильностью, рН/профилем активности, рН/профилем стабильности (таким как увеличенная стабильность при низких, например рН<6 или рН<5, или высоких, например рН>9, значениях рН), устойчивостью к окислению, зависимостью от Са²'. удельной активностью и т.п. Изобретение относится к изменению любого представляющего интерес свойства. Например, изменение может приводить к варианту, который по сравнению с исходной фосфолипазой обладает измененным рН и температурным профилем активности.

В альтернативных вариантах осуществления фосфолипазы по изобретению применяют на различных стадиях переработки масел, таких как экстракция масла, например, при удалении фосфолипидных камедей, в процессе, называемом рафинирование масла, как описано в настоящем документе. Изобретение относится к композициям (например, содержащим ферменты по изобретению) и способам обработки масел, например неочищенных масел, и производства масел, например растительных масел, из различных источников, таких как масло из рисовой шелухи, сои, рапса, арахиса, кунжута, подсолнуха и кукурузы. Ферменты фосфолипазы по изобретению можно применять вместо РЬА, например фосфолипазы А2, на любой стадии переработки растительного масла.

В определенных вариантах осуществления пригодные ферменты для применения в способах, предоставленных в настоящем документе, включают один или несколько ферментов фосфолипазы А (РЬА), ферментов фосфолипазы С (РЬС), ферментов фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С (Р1РЬС) или их комбинации. Ферменты РЬА включают фосфолипазу А1 (РЬА1) и/или фосфолипазу А2 (РЬА2).

Как используют в настоящем документе, неочищенное масло относится к (также называемому нерафинированным маслом) прессованному или экстрагированному маслу или их смеси, например, из растительных источников, включая, но не ограничиваясь ими, масло асаи, миндальное масло, масло бабассу, масло семян черной смородины, масло семян огуречника, масло канолы, масло кешью, касторовое масло, кокосовое масло, кориандровое масло, кукурузное масло, хлопковое масло, масло крамбе, масло льняного семени, масло виноградных зерен, масло из лесного ореха, конопляное масло, масло ятрофы, масло хохобы, льняное масло, масло ореха макадамия, масло ядра манго, масло пенника лугового, горчичное масло, костяное масло, оливковое масло, пальмовое масло, пальмоядровое масло, пальмовый олеин, арахисовое масло, масло американского ореха, кедровое масло, фисташковое масло, маковое масло, рапсовое масло, рисовое масло, сафлоровое масло, масло камелии, кунжутное масло, масло из семян ши, соевое масло, подсолнечное масло, таловое масло, масло тсубаки, ореховое масло, типы природных масел, обладающих измененным составом жирных кислот, полученных с помощью генетически модифицированных организмов (СМО) или традиционной селекции, такие как высокоолеиновое, низколиноленовое или низконасыщенное масло (высокоолеиновое масло канолы, низколиноленовое соевое масло или высокостеариновые подсолнечные масла). Дополнительные иллюстративные масла, пригодные для применения в способах, предоставленных в настоящем документе, описаны в настоящем документе. В определенном варианте осуществления общее содержание фосфатидов в неочищенном масле может варьировать в пределах 0,5-3% мас./мас., что соответствует содержанию фосфора в диапазоне 2001200 м.д. или 250-1200 м.д.

Как используют в настоящем документе, рафинированное масло относится к маслу, полученному после удаления ΝΗΓ, гидратируемых фосфолипидов и лецитинов (в совокупности известных как камеди) из масла с получением продукта в виде рафинированного масла или жира, который можно использовать для производства пищи и/или непищевых применений. Различные способы рафинирования известны в данной области и описаны выше. В определенных вариантах осуществления рафинированное масло обладает содержанием фосфолипидов менее чем приблизительно 200 м.д. фосфора, менее чем приблизительно 150 м.д. фосфора, менее чем приблизительно 100 м.д. фосфора, менее чем приблизительно 50 м.д. фосфора, менее чем приблизительно 40 м.д. фосфора, менее чем приблизительно 30 м.д.

- 21 022979 фосфора, менее чем приблизительно 20 м.д. фосфора, менее чем приблизительно 15 м.д. фосфора, менее чем приблизительно 10 м.д. фосфора, менее чем приблизительно 7 м.д. фосфора, менее чем приблизительно 5 м.д. фосфора, менее чем приблизительно 3 м.д. фосфора или менее чем приблизительно 1 м.д. фосфора.

Как используют в настоящем документе, термин негидратируемые фосфолипиды или NΗΡ относится к фосфатидной кислоте и солям фосфатидной кислоты, например солям фосфатидной кислоты с кальцием, магнием и железом; и солям этаноламина с кальцием, магнием и железом.

Как используют в настоящем документе, рафинированное гидратацией масло относится к маслу, полученному после процесса рафинирования гидратацией. В определенных вариантах осуществления рафинированное гидратацией масло получают перемешиванием 1-3% мас./мас. горячей воды с теплым (60-90°С) неочищенным маслом в течение 30-60 мин. В определенных вариантах осуществления стадия рафинирования гидратацией удаляет фосфатиды и клейкие камеди, которые становятся не растворимыми в масле после гидратации. Г идратированные фосфатиды и камеди можно отделять от масла осаждением, фильтрацией или центрифугированием.

Получение нуклеиновых кислот и манипулирование ими

Изобретение относится к выделенным, синтетическим и рекомбинантным нуклеиновым кислотам (например, иллюстративная последовательность ЗЕЦ ΙΌ ΝΟ: 5 и нуклеиновые кислоты, кодирующие ЗЕЦ ГО ΝΟ: 6), содержащим (и имеющим) одно или несколько изменений аминокислотных остатков (например, мутаций), как указано в табл. 12-15, включая экспрессирующие кассеты, такие как экспрессирующие векторы, кодирующие полипептиды и фосфолипазы по изобретению. Также изобретение включает способы выявления новых последовательностей фосфолипазы с использованием нуклеиновых кислот по изобретению. Также предусмотрены способы модификации нуклеиновых кислот по изобретению, например, посредством синтетической повторной сборки лигированием, оптимизированной системы направленных изменений и/или мутагенеза с насыщением.

Нуклеиновые кислоты по изобретению могут быть получены, выделены и/или обработаны, например, посредством клонирования и экспрессии библиотек кДНК, амплификации транскрипта или геномной ДНК посредством ПЦР и т.п. Для применения на практике способов по изобретению гомологичные гены могут быть модифицированы воздействием на матричную нуклеиновую кислоту, как описано в данном описании. Изобретение можно применять на практике совместно с любым способом или протоколомили устройством, известными в данной области, которые полностью описаны в научной и патентной литературе.

В альтернативных вариантах осуществления последовательности генов по изобретению или гены, используемые для применения на практике изобретения, включают сегмент ДНК, вовлеченный в образование полипептидной цепи, включая, среди прочего, области, предшествующие и следующие после кодирующей области, такие как лидерная и концевая часть, промоторы и энхансеры, а также, где это применимо, последовательности (интроны), встроенные между отдельными кодирующими сегментами (экзонами).

В альтернативных вариантах осуществления нуклеиновые кислоты или последовательности нуклеиновых кислот по изобретению или используемые для применения изобретения на практике могут содержать олигонуклеотид, нуклеотид, полинуклеотид или фрагмент любого из них, ДНК или РНК (например, мРНК, рРНК, тРНК, иРНК) геномного или синтетического происхождения, которая может быть одноцепочечной или двухцепочечной и может быть представлена смысловой или антисмысловой (комплементарной) цепью, пептидно-нуклеиновую кислоту (ΡNА) или любое ДНК-подобное или РНКподобное вещество природного или синтетического происхождения, включая, например, иРНК, рибонуклеопротеины (например, двухцепочечные иРНК, например, иРНП). Термин охватывает нуклеиновые кислоты, т.е. олигонуклеотиды, содержащие известные аналоги природных нуклеотидов. В альтернативных вариантах осуществления нуклеиновые кислоты или последовательности нуклеиновых кислот по изобретению или используемые для применения на практике изобретения, также охватывают подобные нуклеиновым кислотам структуры с синтетическими каркасами, см., например, Ма!а (1997) Тох1со1. Арр1. РЬагтасо1. 144: 189-197; З1гаи88-Зоикир (1997) ВюсЬет18Ьу 36:8692-8698; Зат§1ад (1996) АпЬзепзе №с1ею АсИ Эгид Иеу 6: 153-156.

Общие способы

Нуклеиновые кислоты, используемые для осуществления данного изобретения, любые из РНК, 1РНК, антисмысловой нуклеиновой кислоты, кДНК, геномной ДНК, векторов, вирусов или их гибридов, можно выделять из множества источников, можно получать способами генной инженерии, можно амплифицировать и/или экспрессировать/получать рекомбинантными способами. Рекомбинантные полипептиды, полученные из этих нуклеиновых кислот, можно индивидуально выделять или клонировать и можно тестировать в отношении желаемой активности. Можно использовать любые рекомбинантные экспрессирующие системы, включая экспрессирующие системы клеток бактерий, млекопитающих, дрожжей, насекомых или растений.

Альтернативно, такие нуклеиновые кислоты можно синтезировать ш νίΐΓΟ хорошо известными способами химического синтеза, как описано, например, в Абатк (1983) 1. Ат. СЬет. Зос, 105:661; Βе1οи8ον

- 22 022979 (1997) ΝιιοΚία Λοίά8. Ке8., 25:3440-3444; Ртепке1 (1995) Ргее Кай1е. Вю1. Мей., 19:373-380; В1оттег8 (1994) Вюскет18Ру, 33:7886-7896; №папд (1979) Ме1к. Еп/уток 68:90; Вго\уп (1979) Мекк. Епхуток, 68:109; Веаисаде (1981) Тегга. ЬеР., 22:1859; в патенте США № 4458066.

Способы для манипулирования с нуклеиновыми кислотами, такие как, например, субклонирование, введение зонда (например, мечение со случайными праймерами с использованием полимеразы Кленова, ник-трансляция, амплификация), секвенирование, гибридизация и т.п. полностью описаны в научной и патентной литературе, см., например, 8атЬгоок, ей., МОРЕСиЬЛК ^ΟΝΙΝΟ: А ЬАВОКАТОКУ МА№ иАЬ (2ΝΏ ЕО.), ν. 1-3, Со1й 8ргшд НагЬог ЬаЬотакогу, (1989); СИККЕЭТ РКОТОСОЬ8 ΙΝ МОЬЕСиЬАК ВЮЬООУ, Аи8иЬе1, ей. ,1оНп \\Э1еу & 8оп8, 1пс., \еи Уогк (1997); ЬАВОКАТОКУ ТЕС11\ЮЕЕ8 ΙΝ В1ОСНЕМ18ТКУ ΛΝΙ) МОЬЕСиЬАК ВЮЬООУ: ΗΥΕΜΌ^^Ν \\ΤΙΊ 1 \ЕСЕЕ1С АСЮ РКОВЕ8, Рай I. Ткеогу апй ШсШс ас1й Ргерагайоп, Ту88еи, ей. Е18еу1ег, Ν.Υ. (1993).

Другими подходящими способами получения и манипулирования с нуклеиновыми кислотами, используемыми для осуществления способов по изобретению, являются клонирование из геномных образцов и, если желательно, скрининг и повторное клонирование вставок, выделенных или амплифицированных, например, из геномных клонов или клонов кДНК. Источники нуклеиновой кислоты, используемой в способах по изобретению, включают геномные библиотеки или библиотеки кДНК, содержащиеся, например, в искусственных хромосомах млекопитающих (МАС), см., например, патенты США №№ 5721118; 6025155; искусственных хромосомах человека, см., например, Ко8епРе1й (1997) Ν;·ιΙ. ОеиеЕ 15:333-335; искусственных хромосомах дрожжей (ΥΛί'.'); искусственных хромосомах бактерий (ВАС); искусственных хромосомах Р1, см., например, \Уооп (1998) Оепотю8, 50:306-316; векторах, полученных на основе Р1 (РАС8), см., например, Кет (1997) В|о1ескп1уие8, 23:120-124; космидах, рекомбинантных вирусах, фагах или плазмидах.

В одном аспекте нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид по изобретению, соединена в соответствующем участке с лидерной последовательностью, способной направлять секрецию транслируемого полипептида или его фрагмента.

Изобретение относится к слитым белкам и нуклеиновым кислотам, кодирующим их. Полипептид по изобретению можно подвергать слиянию с гетерологичным пептидом или полипептидом, таким как Ν-концевые идентификационные пептиды, которые придают желаемые свойства, такие как повышение стабильности или упрощение очистки. Пептиды и полипептиды по изобретению также можно синтезировать и экспрессировать в качестве слитых белков с одним или несколькими дополнительными доменами, связанными с ними, например, для получения более иммуногенного пептида, для упрощения выделения рекомбинантного синтезированного пептида, для идентификации и выделения антител и экспрессирующих антитела В-клеток и т.п. Облегчающие определение и очистку домены включают, например, пептиды, хелатирующие металлы, такие как полигистидиновые участки и молекулы гистидинтриптофана, которые делают возможной очистку на иммобилизованных металлах, домены белка А, которые делают возможной очистку на иммобилизованных иммуноглобулинах, и домен, используемый в системе очистки удлинения/аффинности РЬАО8 (1ттипех Согр., 8еай1е ^А). Добавление расщепляемых линкерных последовательностей, таких как фактор Ха или энтерокиназа (1иуйтодеи, 8ап Э1едо СА), между доменом для очистки и пептидом или полипептидом, содержащим мотив, облегчает очистку. Например, экспрессирующий вектор может включать кодирующую эпитоп последовательность нуклеиновой кислоты, связанную с шестью остатками гистидина с последующим тиоредоксином и участком расщепления энтерокиназой (см., например, ^йкатз (1995) Вюскет18йу, 34:1787-1797; ИоЬек (1998) Ргсйет Ехрг. РштЕ, 12:404-414). Остатки гистидина облегчают определение и очистку, в то время как участок расщепления энтерокиназой обеспечивает средство очистки эпитопа от остального слитого белка. Технология, относящаяся к векторам, кодирующим слитые белки, и применение слитых белков полностью описаны в научной и патентной литературе, см., например, Кго11 (1993) ^NА Се11. Вю1., 12:441-53.

Последовательности контроля транскрипции и трансляции

Изобретение относится к последовательностям нуклеиновых кислот (например, ДНК) по изобретению, функционально связанным с последовательностью(ями) для контроля экспрессии (например, транскрипционными или трансляционными), например с промоторами или энхансерами, для управления и модулирования синтеза/экспрессии РНК. Последовательность для контроля экспрессии может находиться в экспрессирующем векторе. Иллюстративные бактериальные промоторы включают 1ас1, 1;κΖ, Т3, Т7, дрр 1атЬйа РК, РЬ и Рр. Иллюстративные эукариотические промоторы включают предранний промотор СМУ, промотор Н8У тимидинкиназы, ранний и поздний промотор 8У40, ЬТК ретровирусов и промотор мышиного металлотионеина Ι.

Промоторы, пригодные для экспрессии полипептида в бактериях, включают промоторы 1ас или Рр Е. сой, промотор 1ас1, промотор 1;κΖ, промотор Т3, промотор Т7, промотор дрЕ промотор 1атЬйа РК, промотор 1атЬйа РЬ, промоторы из оперонов, кодирующих гликолитические ферменты, такие как промотор 3-фосфоглицераткиназы (РОК) и кислой фосфатазы. Эукариотические промоторы включают предранний промотор СМУ, промотор Н8У тимидинкиназы, промоторы теплового шока, ранний и поздний промотор 8У40, ЬТК ретровирусов и промотор металлотионеина-1 мыши. Также могут быть использованы другие промоторы, известные тем, что они контролируют экспрессию генов в прокариотических

- 23 022979 или эукариотических клетках или их вирусах.

Экспрессирующие кассеты, векторы и носители для клонирования

Изобретение относится к экспрессирующим векторам и носителям для клонирования, содержащим нуклеиновые кислоты по изобретению, например последовательности, кодирующие фосфолипазы по изобретению. Экспрессирующие векторы и носители для клонирования по изобретению могут содержать частицы вирусов, бакуловирус, фаг, плазмиды, фагмиды, космиды, фосмиды, искусственные бактериальные хромосомы, вирусную ДНК (например, ДНК вируса осповакцины, аденовируса, поксвируса птиц, вируса псевдобешенства и производных §У40), искусственные хромосомы на основе Р1, дрожжевые плазмиды, искусственные хромосомы дрожжей и любые другие векторы, специфические для конкретных представляющих интерес хозяев (таких как ВасШик, ЛкрегдШик и дрожжи). Векторы по изобретению могут включать хромосомные, нехромосомные последовательности и синтетические последовательности ДНК. Большое количество подходящих векторов известно специалистам в данной области, и они являются коммерчески доступными. Иллюстративные векторы включают бактериальные векторы рОЕ (О|адеп, §ап О|едо, СА), плазмиды рВШекспр! (§1га1адепе, §ап О|едо, СА), векторы ркН, (векторы 1атЬйа-2АР (§1га1адепе); р1гс99а, рКк223-3, рЭР540, рК1Т2Т (РЬатташа); эукариотические: рХТ1, р§05 (§1га1адепе), р§УК3, рВРУ, рМ§0, р8УБ8У40 (РЬагташа). Однако можно использовать любую другую плазмиду или другой вектор при условии, что они способны реплицироваться и являются устойчивыми в хозяине. В соответствии с настоящим изобретением могут быть использованы векторы с низкой копийностью или с высокой копийностью.

В альтернативных вариантах осуществления термин экспрессирующая кассета включает нуклеотидную последовательность, которая способна влиять на экспрессию структурного гена (т.е. кодирующей белок последовательности, такой как фосфолипаза по изобретению) в хозяине, совместимом с такими последовательностями. Экспрессирующие кассеты могут включать, по меньшей мере, промотор, функционально связанный с кодирующей полипептид последовательностью; и, необязательно, с другими последовательностями, например с сигналами терминации транскрипции. Также могут быть использованы дополнительные факторы, например энхансеры. В альтернативных вариантах осуществления функционально связанный относится к расположению промотора выше последовательности ДНК, так чтобы промотор опосредовал транскрипцию последовательности ДНК. В альтернативных вариантах осуществления экспрессирующие кассеты включают плазмиды, экспрессирующие векторы, рекомбинантные вирусы, любую форму рекомбинантного вектора с депроинизированной ДНК и т.п.

В альтернативных вариантах осуществления векторы по изобретению содержат нуклеиновую кислоту, которая может инфицировать, трансфицировать, временно или постоянно трансдуцировать клетку. В альтернативных вариантах осуществления вектор может представлять собой депротеинизированную нуклеиновую кислоту или нуклеиновую кислоту в комплексе с белком или липидом. Вектор необязательно содержит вирусные или бактериальные нуклеиновые кислоты, и/или белки, и/или мембраны (например, клеточную мембрану, вирусную липидную оболочку и т.д.). Векторы включают, но не ограничиваются ими, репликоны (например, РНК-репликоны, бактериофаги), с которыми можно соединять фрагменты ДНК и делать их реплицирующимися. Таким образом, векторы включают, но не ограничиваются ими, РНК, автономную самореплицирующуюся кольцевую или линейную ДНК или РНК (например, плазмиды, вирусы и т.п., см., например, патент США № 5217879) и включают как экспрессирующие, так и неэкспрессирующие плазмиды. Если рекомбинантный микроорганизм или клеточная культура описаны как содержащие экспрессирующий вектор, то в этом случае включается как экстрахромосомную кольцевую, так и линейную ДНК, и ДНК, которая встраивается в хромосому(ы) хозяина. В случае, если вектор поддерживается в клетке-хозяине, вектор может либо стабильно реплицироваться клетками в процессе митоза в качестве автономной структуры, либо он является встроенным в геном хозяина.

В альтернативных вариантах осуществления изобретение относится к плазмидам, которые могут быть обозначены с помощью строчной буквы р, которой предшествуют и/или за которой следуют прописные буквы и/или числа. В альтернативных вариантах осуществления исходная плазмида является коммерчески доступной, общедоступной без ограничений или она может быть сконструирована на основе доступных плазмид в соответствии с опубликованными методиками. В альтернативных вариантах осуществления плазмиды, эквивалентные описанным в данном описании плазмидам, известны в данной области и будут очевидны среднему специалисту в данной области.

В альтернативных вариантах осуществления экспрессирующий вектор может содержать промотор, участок связывания рибосомы для инициации трансляции и терминатор транскрипции. Также вектор может включать соответствующие последовательности для усиления экспрессии. Экспрессирующие векторы млекопитающих могут содержать ориджин репликации, любые необходимые участки связывания рибосом, участок полиаденилирования, доноры сплайсированных фрагментов и акцепторные участки, последовательности терминации транскрипции и фланкирующие 5'-конец нетранскрибируемые последовательности. В некоторых аспектах для получения требуемых нетранскрибируемых генетических элементов можно использовать последовательности ДНК, полученные из участков сплайсинга иполиаденилирования §У40.

В одном аспекте экспрессирующие векторы содержат один или несколько генов селективных мар- 24 022979 керов для обеспечения селекции клеток-хозяев, содержащих вектор. Такие селективные маркеры включают гены, кодирующие дигидрофолатредуктазу, или гены, придающие устойчивость к неомицину, для культур эукариотических клеток, гены, придающие устойчивость к тетрациклину или ампициллину для Е. сой. и ген ТКР1 8. сегеу1К1ае. Могут быть выбраны промоторные участки из любых других желаемых генов с использованием векторов с хлорамфениколтрансферазой (САТ) или других векторов с селективными маркерами.

Также для повышения уровня экспрессии векторы для экспрессии полипептида или его фрагмента в эукариотических клетках могут содержать энхансеры. Энхансеры представляют собой цис-регуляторные элементы ДНК длиной, как правило, приблизительно от 10 до приблизительно 300 п.о., которые воздействуют на промотор и повышают его транскрипцию. Примеры включают энхансер 8У40 на поздней стороне ориджина репликации с 100-270 п.о., энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер вируса полиомы на поздней стороне ориджина репликации и энхансеры аденовирусов.

Последовательность ДНК можно встраивать в вектор различными методами. Как правило, последовательность лигируют с вектором в желаемом положении после расщепления вставки и вектора соответствующими эндонуклеазами рестрикции. Альтернативно, можно лигировать тупые концы вставки и вектора. В данной области известно множество технологий клонирования, например, как описано АикиЬе1 и 8атЬгоок. Такие методики и другие входят в компетенцию специалистов в данной области.

Вектор может быть в форме плазмиды, вирусной частицы или фага. Другие векторы включают хромосомные, нехромосомные и синтетические последовательности ДНК, производные 8У40; бактериальные плазмиды, фаговую ДНК, бакуловирус, плазмиды дрожжей, векторы, полученные из комбинаций плазмидной и фаговой ДНК, вирусную ДНК, такую как ДНК вируса осповакцины, аденовируса, поксвируса птиц и вируса псевдобешенства. Различные векторы для клонирования и экспрессирующие векторы для использования в прокариотических и эукариотических хозяевах описаны, например, 8атЬгоок.

Конкретные бактериальные векторы, которые могут быть использованы, включают коммерчески доступные плазмиды, содержащие генетические элементы хорошо известного вектора для клонирования рВК.322 (АТСС 37017), рКК223-3 (РЬагтааа Рте СЬетюа1к, Иррка1а, Швеция), СЕМ1 (Рготеда Вю1ес, Мабюоп, Ж И8А) рЦЕ70, рЦЕ60, рОЕ-9 (фадеп), рИ10, рк1Х174 рВЫекспр! II К8, рИН8А, рИН16а, рИН18А, р\Н46А (81га1адепе), р!гс99а, рКК223-3, рКК233-3, ΌΚ540, рКГТ5 (РЬагтааа), рКК232-8 и рСМ7. Конкретные эукариотические векторы включают р8У2САТ, рОС44, рХТ1, р8С (81га1адепе) р8УК3, рВРУ, рМ8С и р8УЪ (РЬагтааа). Однако можно использовать любой другой вектор при условии, что он способен реплицироваться и является устойчивым в клетке-хозяине.

Клетки-хозяева и трансформированные клетки

Также изобретение относится к трансформированной клетке, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты по изобретению, например последовательность, кодирующую фосфолипазу по изобретению, вектор по изобретению. Клетка-хозяин может представлять собой любую из клеток-хозяев, известных специалистам в данной области, включая прокариотические клетки, эукариотические клетки, такие как клетки бактерий, клетки грибов, клетки дрожжей, клетки млекопитающих, клетки насекомых или клетки растений. Ферменты по изобретению можно экспрессировать в любой клетке-хозяине, например в любой клетке бактерий, любой клетке дрожжей, например РюЫа ракЮпк, 8ассЬаготусек сегеу151ае или 8сЫ/окассЬаготусек ротЬе. Иллюстративные клетки бактерий включают любой вид рода ЕксЬепсЫа, ВасШик, 81гер!отусек, 8а1топе11а, Ркеиботопак и 81арЬу1ососсик, включая, например, ЕксЬепсЫа соЬ, ЬасЮсосснк 1асЬк, ВасШик киЫШк, ВасШик сегеик, 8а1топе11а 1урЫтигшт, Ркеиботопак Йиогексепк. Иллюстративные клетки грибов включают любой вид АкрегдШик. Иллюстративные клетки дрожжей включают любой вид РюЫа, 8ассЬаготусек, 8сЫ/окассЬаготусек или 8сЬ№апЫотусек, включая РюЫа рак1ог1к, 8ассЬаготусек сегеуШае или 8сЫ/окассЬаготусек ротЬе. Иллюстративные клетки насекомых включают любой вид 8ро6ор!ега или ИгокорЫ1а, включая ИгокорЬйа 82 и 8ро6ор!ега 8£9. Иллюстративные клетки животных включают клетки СНО, СО8 или меланомы Во\\ек или любую клеточную линию мыши или человека. Выбор подходящего хозяина находится в пределах квалификации специалистов в данной области.

Вектор может быть введен в клетку-хозяин с использованием любой из различных технологий, включая трансформацию, трансфекцию, трансдукцию, вирусную инфекцию, генные пушки или Τΐопосредованный перенос генов. Конкретные способы включают трансфекцию с фосфатом кальция, трансфекцию, опосредуемую ИЕАЕ-декстраном, липофекцию или электропорацию (Όπνίκ Ь., ИШпег М., ВаЬеу Ь. Вакю МеШобк ш Мо1еси1аг Вю1оду (1986)).

Когда это целесообразно, клетки-хозяева, полученные способами инженерии, можно культивировать на общепринятых питательных средах, модифицированных соответствующим образом для активации промоторов, селекции трансформантов или амплификации генов по изобретению. После трансформации подходящего штамма клеток-хозяев и выращивания штамма клеток-хозяев до приемлемой плотности клеток выбранный промотор можно индуцировать соответствующими способами (например, сменой температуры или химическим индуцированием) и клетки можно культивировать в течение дополнительного периода времени для того, чтобы получить возможность продуцировать желаемый полипептид или его фрагмент.

- 25 022979

Клетки можно собирать центрифугированием, разрушать физическими или химическими способами и полученный неочищенный экстракт можно сохранять для дальнейшей очистки. Микробные клетки, используемые для экспрессии белков, можно разрушать любым общепринятым способом, включая циклы замораживания и оттаивания, разрушение ультразвуком, механическое разрушение или использование средств для лизиса клеток. Такие способы хорошо известны специалистам в данной области.

Экспрессированный полипептид или его фрагмент можно извлекать и очищать из культур рекомбинантных клеток методами, включающими осаждение сульфатом аммония или этанолом, экстрагирование кислотой, анионную или катионную обменную хроматографию, хроматографию с фосфоцеллюлозой, хроматографию гидрофобного взаимодействия, аффинную хроматографию, хроматографию с гидроксилапатитом и хроматографию с лектином. Если необходимо, для завершения конфигурации полипептида можно использовать стадии рефолдинга. Если необходимо, для конечной стадии очистки можно использовать высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ).

Также для экспрессии рекомбинантного белка можно использовать различные системы клеточных культур млекопитающих. Примеры систем экспрессии млекопитающих включают линии фибробластов почки обезьяны СО8-7 и другие клеточные линии, способные экспрессировать белки совместимого вектора, такие как клеточные линии С127, 3Т3, СНО, НеЬа и ВНК.

Конструкции в клетках-хозяевах можно использовать общепринятым образом для продуцирования продукта гена, кодируемого рекомбинантной последовательностью. В зависимости от хозяина, используемого в процессе рекомбинантного продуцирования, полипептиды, продуцируемые клеткой-хозяином, содержащей вектор, могут быть гликозилированными или могут быть негликозилированными. Полипептиды по изобретению также могут включать начальный аминокислотный остаток метионина или не включать его.

Также для получения полипептида по изобретению можно использовать бесклеточные системы трансляции. В бесклеточных системах трансляции можно использовать мРНК, транскрибированные с конструкции ДНК, содержащей промотор, функционально связанный с нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид или его фрагмент. В некоторых аспектах перед проведением реакции транскрипции ίη νίίΓΟ конструкция ДНК может быть линеаризована. Затем транскрибированную мРНК инкубируют с соответствующим бесклеточным экстрактом для трансляции, таким как экстракт ретикулоцитов кролика, с получением желаемого полипептида или его фрагмента.

Экспрессирующие векторы могут содержать один или несколько генов селективных маркеров для обеспечения фенотипического признака для селекции трансформированных клеток-хозяев, такого как дигидрофолатредуктаза или устойчивость к неомицину для культур эукариотических клеток, или такого как устойчивость к тетрациклину или ампициллину в Е. сой.

Иллюстративный фермент Р1-РЬС (обладающий последовательностью, указанной в 8ЕО ГО N0: 6, содержащий (и имеющий) одно или более изменений аминокислотных остатков (например, мутаций), как указано в табл. 12-15) был сверхэкспрессирован в активной форме в различных хозяйских системах, включая грамотрицательные бактерии, такие как Е. сой, грамположительные бактерии, такие как любые ВасШик 8р. (например, ВасШиз киЬййк, ВасШик сегеик), дрожжевые клетки-хозяева (включая, например, РюЫа ракЮпк. Зассйатотусек кр., такие как 8. сеге\а81ае и 8. ротЬе) и йасЮсоссик 1асЙ8, или клетки млекопитающих, грибов, растений или насекомых. Активный фермент экспрессируется в каждой хозяйской системе с различных конструкций. Эти экспрессирующие конструкции нуклеиновой кислоты могут содержать нуклеотиды, кодирующие полноразмерную открытую рамку считывания (состоящую из сигнальной последовательности, пропоследовательности и кодирующей зрелый белок последовательности), или они могут содержать эти генетические элементы либо отдельно, либо в комбинации с гетерологичными генетическими элементами, которые служат в качестве сигнальной последовательности и/или пропоследовательности для открытой рамки считывания зрелого белка. Каждая из этих систем может служить в качестве коммерческого продуцирующего хозяина для экспрессии РЬС для применения в ранее описанных ферментативных процессах рафинирования масла.

Амплификация нуклеиновых кислот

При осуществлении изобретения на практике нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды по изобретению, или модифицированные нуклеиновые кислоты можно воспроизводить, например, путем амплификации. Изобретение относится к последовательностям пары праймеров для амплификации нуклеиновых кислот, кодирующих полипептиды с активностью фосфолипазы. В одном аспекте пары праймеров способны амплифицировать последовательности нуклеиновых кислот по изобретению. Специалист в данной области может конструировать последовательности пары праймеров для амплификации для любой части или для полной длины этих последовательностей.

Изобретение относится к последовательностям пары праймеров для амплификации нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, обладающий активностью фосфолипазы, где пара праймеров способна амплифицировать нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность по изобретению, или ее фрагменты или подпоследовательности. Один или каждый член последовательностей пары праймеров может содержать олигонуклеотид, содержащий по меньшей мере приблизительно от 10 до 50 последовательно расположенных оснований последовательности или приблизительно 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,

- 26 022979

20, 21, 22, 23, 24 или 25 последовательно расположенных оснований последовательности.

Изобретение относится к паре праймеров для амплификации, где пара праймеров включает первый член, имеющий последовательность, как указано, из приблизительно первых (5') 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 остатков нуклеиновой кислоты по изобретению, и второй член, имеющий последовательность, как указано, из приблизительно первых (5') 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 остатков цепи, комплементарной цепи для первого члена. Изобретение относится фосфолипазам, полученным амплификацией, например, с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), с использованием пары праймеров для амплификации по изобретению. Изобретение относится к способам получения фосфолипаз амплификацией, например, с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), с использованием пары праймеров для амплификации по изобретению. В одном аспекте пара праймеров для амплификации амплифицирует нуклеиновую кислоту из библиотеки, например из библиотеки генов, такой как библиотека окружающей среды.

Реакции амплификации также можно использовать для определения количества нуклеиновой кислоты в образце (такого как количество транскрипта в клеточном образце), внесения метки в нуклеиновую кислоту (например, для использования на матрицах или в блотах), обнаружения нуклеиновой кислоты или определения количества конкретной нуклеиновой кислоты в образце. В одном аспекте изобретения амплифицируют транскрипт, выделенный из клетки или библиотеки кДНК. Специалист в данной области может выбрать и разработать приемлемые олигонуклеотидные праймеры для амплификации. Способы амплификации также хорошо известны в данной области и включают, например, полимеразную цепную реакцию, ПЦР (см., например, РСК ргоЮсок, А дшйе Ю те11юй8 апй аррйсакопз, ей. Ιηηίδ, Аса4еш1с Рге88, Ν.Υ. (1990) и РСК 81га1ед1е8 (1995), ей. Ιηηίδ, Асайетю Рте88, 1пс., Ν.Υ.), лигазную цепную реакцию (ЛЦР) (см., например, \Уи (1989) Оепопис8. 4:560; Ьапйедтеп (1988) 8с1епсе 241:1077; Ватпдег (1990) Оепе, 89:117); транскрипционную амплификацию (см., например, Κ\\ό1ι (1989) Ргос. Νη11. Асай. 8с1., И8А, 86:1173) и самоподдерживающуюся репликацию последовательности (см., например, Оиа1еШ (1990) Ргос. Νηΐ1. Асай. 8сь, И8А, 87:1874); амплификацию с репликазой О Ве1а (см., например, 8ιηί11ι (1997) 1. СНп. МюгоЬю1., 35:1477-1491), автоматизированный анализ амплификацией с репликазой О-Ье1а (см., например, Вигд (1996) Мо1. Се11. РгоЬе8, 10:257-271) и другие технологии, опосредуемые РНКполимеразой (например, NА8ВА, Сапдепе, М188188аида, Ойапо); см. также Вегдег (1987) Ме(1юй8 Еп/утоЕ 152:307-316; 8атЬгоок; Аи8иЬе1; патенты США №. 4683195 и 4683202; 8оокпапап (1995) Вю1ескпо1оду, 13:563-564.

Определение степени идентичности последовательностей

Изобретение относится к выделенным и рекомбинантным нуклеиновым кислотам, содержащим последовательности, обладающие по меньшей мере приблизительно 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более или полной (100%) идентичностью последовательности с иллюстративной нуклеиновой кислотой по изобретению (например, 8Еф ΙΌ ΝΟ: 5 и кодирующая одну или несколько мутаций, указанных в табл. 12-15, как рассмотрено в примере 3, или ее ферментативно активный фрагмент, и нуклеиновые кислоты, кодирующие 8Еф ГО ΝΟ: 6 и кодирующие одну или несколько мутаций, указанных в табл. 12-15, как рассмотрено в примере 3, или ее ферментативно активный фрагмент) на протяжении области по меньшей мере приблизительно 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550 или более остатков. Изобретение относится к полипептидам, содержащим последовательности, обладающие по меньшей мере приблизительно 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более или полной (100%) идентичностью последовательности с иллюстративным полипептидом по изобретению. Степень идентичности (гомологии) последовательностей можно определять с использованием любой компьютерной программы и связанных с ней параметров, включая программы, описанные в настоящем документе, такие как ВЬА8Т 2.2.2. или РА8ТА версии 3.0ΐ78, с параметрами по умолчанию. В альтернативных вариантах осуществления идентичность последовательностей может быть на протяжении области по меньшей мере приблизительно 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400 последовательно расположенных остатков или полной длины нуклеиновой кислоты или полипептида. Степень идентичности (гомологии) последовательностей можно определять с использованием любой компьютерной программы связанных с ней параметров, включая программы, описанные в настоящем документе, такие как ВЬА8Т 2.2.2 или РА8ТА версии 3.0ΐ78, с параметрами по умолчанию.

Гомологичные последовательности также включают последовательности РНК, в которых остатки уридина замещают остатки тимина в последовательности нуклеиновой кислоты. Гомологичные последовательности могут быть получены с использованием любой из методик, описанных в данном описании, или могут быть получены в результате коррекции ошибок при секвенировании. Следует понимать, что последовательности нуклеиновых кислот, указанные в настоящем документе, могут отображаться в традиционном формате отдельных символов (см., например, 8кует, ЬиЬеп. Вюскет18ку, 3гй Ей., \У.Н. Ргеетап & Со., №\ν Υο^к) или в любом другом формате, в котором записывается название нуклеотидов в

- 27 022979 последовательности.

Различные программы для сравнения последовательностей, указанные в настоящем документе, используются в этом аспекте изобретения. Идентичность (гомологию) белков и/или последовательностей нуклеиновых кислот можно оценивать с использованием любого из различных алгоритмов сравнения последовательностей и программ, известных в данной области. Такие алгоритмы и программы включают, но не ограничиваются ими, ТВЬАЗТЫ, ВЬАЗТР, РАЗТА, ТРАЗТА и СЬиЗТАЬ^ (Рсаг8оп апД Ыртап, Ргос. Ыа!1. АсаД. 8сЦ ИЗА, 85 (8):2444-2448, 1988; А1!8сйи1 с! а1., 1. Мо1. Вю1., 215 (3):403-410, 1990; Тйотр8оп с! а1., ЫисШс АсМ. Кс8., 22(2):4673-4680, 1994; Шддш8 с! а1., Мс!йоД8 Епхуто1., 266:383-402, 1996; А1!8сйи1 с! а1., 1. Мо1. Вю1., 215 (3):403-410, 1990; А1!8сйи1 с! а1., Ыа!игс Оспс!ю8, 3:266-272, 1993).

Гомологию или идентичность можно определять с использованием программного обеспечения для анализа последовательностей (например, Зсциспсс Апа1у818 ЗоП\\агс Раскадс, Оспсйсз Сотри!сг Огоир, Итусг8Йу, ^18соп81п Вю!ссйпо1оду Ссп!сг, 1710 Итустйу Ауспис, МаФзоп, XVI 53705). Такое программное обеспечение сопоставляет сходные последовательности, присваивая степени гомологии различным делециям, заменам и другим модификациям. Термины гомология и идентичность в контексте двух или более последовательностей нуклеиновых кислот или полипептидов относятся к двум или более последовательностям или подпоследовательностям, которые являются одинаковыми или обладают точно определенным процентным количеством аминокислотных остатков или нуклеотидов, которые оказываются одинаковыми при сравнении и выравнивании для максимального соответствия в пределах окна сравнения или обозначенной области, которое измеряется с использованием любого количества алгоритмов сравнения последовательностей или выравниванием вручную и визуальным исследованием. При сравнении последовательностей одна последовательность может выступать в качестве эталонной последовательности, с которой сравнивают анализируемые последовательности. При использовании алгоритма сравнения последовательностей анализируемую и эталонную последовательности вносят в компьютер, координаты подпоследовательностей обозначают, если необходимо, и определяют параметры программы алгоритма для последовательностей. Можно использовать параметры по умолчанию или можно назначить альтернативные параметры. Затем на основании параметров программы алгоритм сравнения последовательностей вычисляет процентную идентичность последовательностей для анализируемой последовательности относительно эталонной последовательности.

Как используют в настоящем документе, окно сравнения относится к сегменту любого из числа последовательно расположенных остатков. Например, в альтернативных аспектах изобретения, последовательно расположенные остатки с любой длиной в диапазоне от 20 до полной длины иллюстративной последовательности по изобретению сравнивают с эталонной последовательностью из того же числа последовательно расположенных положений после оптимального выравнивания двух последовательностей. Если эталонная последовательность обладает требуемой идентичностью последовательности с иллюстративной последовательностью по изобретению, например 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более идентичностью последовательности с последовательностью по изобретению, то эта последовательность находится в объеме изобретения. В альтернативных вариантах осуществления подпоследовательности в диапазоне приблизительно от 20 до 600, приблизительно от 50 до 200 и приблизительно от 100 до 150 сравнивают с эталонной последовательностью того же числа последовательно расположенных положений после оптимального выравнивания двух последовательностей.

Способы выравнивания последовательностей для сравнения хорошо известны в данной области. Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения может быть проведено, например, посредством алгоритма локальной гомологии Зтйй & Vа!с^таη, АДу. Арр1. Ма!й., 2:482, 1981, посредством алгоритма выравнивания по гомологии ЫссД1стап & 1. Мо1. Вю1., 48:443, 1970, посредством поиска сходства способом Рсг8оп & Пртап, Ргос. Ыа!'1. АсаД. Зек, И8А, 85:2444, 1988, посредством компьютеризованного использования этих алгоритмов (ОАР, ВЕ8ТР1Т, РА8ТА и ТРА8ТА в V^8соη8^η СспсОс8 ЗоП\уагс Раскадс, Оспсйс8 Сотри!сг Огоир, 575 Зсюпсс Иг., МаД|8оп. VI), или посредством выравнивания вручную и визуального исследования. Другие алгоритмы для определения гомологии и идентичности включают, например, помимо программы ВЬАЗТ (Ва8Ю Ьоса1 Айдптсп! Зсагсй Тоо1 в Ыа!юпа1 Ссп!сг Гог Вю1одюа1 йГогтаПоп), АМОК АМАЗ (Апа1у818 ой Ми1йр1у Айдпсй Зссщспсс), АМРЗ (Рго!сш Ми1йр1с Зссщспсс Айдптсп!), АЗЗЕТ (Айдпсй Зсдтсп! З1аЙ8Йса1 Еуа1иа!юп Тоо1), ВАЫИЗ, ВЕЗТЗСОК, ВЮЗсАы (Вю1одюа1 Зссщспсс Сотрагайус Апа1у818 ЫоДс), ВЫМРЗ (ВЬоск8 1МРгоусй Зсагсйсг), РАЗТА, 1п!сгуа18 & Рот!8, ВМВ, С1.АЗТ/А. V., С1.АЗТ.А. V., СОЫЗЕМЗиЗ, ЕСОЫЗЕМЗиЗ, VСОNЗЕNЗυЗ, алгоритм Зтйй^а!сгтап, ^ЛΚVIN, алгоритм Ьа8 №да8, РИАТ (РогссД ЫискойДс Айдптсп! Тоо1), Ргатсайдп, Ргатс8сагсй, ^ΥNЛМIС, Р1ЙТЕК, РЗАР (РЙ8!сп8ку Зссщспсс Апа1у818 Раскадс), ОАР (О1оЬа1 Айдптсп! Ргодгат), СЕНАЕ О1ВВЗ, 0αι0ικ8ΐ 1ЗЗС (Зсп81Йус Зссщспсс Сотрап8оп), РАПОИ (Ьоса1 Зсциспсс Айдптсп!), ЬСР (Ьоса1 Соп!сп! Ргодгат), МАСАV (Ми1йр1с Айдптсп! Соп8!гис!юп & Апа1у818 Vо^кЬсηсй), МАР (Ми1йр1с Айдптсп! Ргодгат), МВЬКР, МВЬКЫ, Р1МА (Райст1пДиссД Ми1й-8сдиспсс Айдптсп!), ЗАОА (Зсциспсс Айдптсп! Ьу Оспсйс А1догййт) и VΗАТ-IР. Такие программы для выравнивания также могут быть использованы для скрининга геномных баз данных для идентификации полинуклеотидных последовательностей, по существу, с идентичными последовательно- 28 022979 стями. Доступным является ряд геномных баз данных, например, основная часть генома человека доступна в качестве части проекта секвенирования генома человека (О1ЬЬ8, 1995). Было отсеквенировано несколько геномов, например Μ. депйаПит (Ргакег е! а1., 1995), Μ. _)аппа8сЬп (ВиИ е! а1., 1996), Н. 1пДиеп/ае (Р1е18сЬтапп е! а1., 1995), Е. сок (В1айпег е! а1., 1997) и дрожжи (δ. сегеуыае) (Μе\γе5 е! а1., 1997) и Ό. те1апода8!ег (Лйатк е! а1., 2000). Значительный прогресс также был достигнут в секвенировании геномов моделей организмов, таких как мышь, С. е1едап8 и ЛгаЬайор818 8р. Базы данных, содержащие информацию геномов, снабженных некоторой функциональной информацией, поддерживаются различными организациями и являются доступными через Интернет.

Также для осуществления изобретения на практике используют алгоритмы ΒΕΆδΤ, ΒΕΆδΤ 2.0 и ΒΕΆδΤ 2.2.2. Они описаны, например, в Л1!8сЬи1 (1977) Ыие. ЛшЙ8 Ке8., 25: 3389-3402, и Л1!8сЬи1 (1990), 1. Μο1. Βίο1., 215:403-410 соответственно. Программное обеспечение для осуществления анализов ΒΕΆδΤ является общедоступным через Ыа!1опа1 Сеп!ег Гог Β^ο!есЬηο1οду 1пГогтаОоп. Этот алгоритм включает первичную идентификацию пар последовательностей с максимальным сходством (ΗδΡ) посредством идентификации коротких слов с длиной V в представляющей интерес последовательности, которые либо совпадают, либо удовлетворяют некоторому оцениваемому положительно порогу значения Т при выравнивании со словом такой же длины в последовательности из базы данных. Т определяется как порог значений для соседних слов (Л1!8сЬи1 (1990) выше). Эти изначальные совпадения соседних слов выступают в роли предшественников для начала поиска при обнаружении более длинных ΗδΡ, содержащих их. Поиск совпадений слов распространяется в обоих направлениях вдоль каждой последовательности до тех пор, пока суммарное значение для выравнивания может повышаться. Суммарные значения вычисляются с использованием для нуклеотидных последовательностей параметров Μ (значение компенсации за пару совпавших остатков; всегда >0). Для аминокислотных последовательностей для вычисления суммарного значения используется оценочная матрица. Продолжение поиска совпадений слов в каждом направлении останавливают, если суммарное значение для выравнивания снижается по величине X ниже максимально достижимого значения; суммарное значение снижается до нуля или ниже при накоплении одного или нескольких выровненных остатков с отрицательным значением или если достигнут конец любой последовательности. Параметры алгоритма ΒΕΆδΤ V, Т и X определяют чувствительность и скорость выравнивания. Программа ΒΕΆδΤΝ (для нуклеотидных последовательностей) использует в качестве параметров по умолчанию длину слова (XV) 11, ожидаемое значение (Е) 10, М = 5, N = -4 и сравнение обеих цепей. Для аминокислотных последовательностей программа ΒΕΆδΤΡ использует в качестве параметров по умолчанию длину слова 3 и ожидаемые значения (Е) 10 и оценочную матрицу ΒΕΘδυΜ62 (см. НешкоГГ & НешкоГГ (1989) Ргос. №И. Лсай. δοΐ., υδΑ, 89:10915), фрагменты для выравнивания (В) 50, ожидаемое значение (Е) 10, М = 5, N = -4 и сравнение обеих цепей.

Алгоритм ΒΕΑδΤ также осуществляет статистический анализ сходства между двумя последовательностями (см., например, Кат1ш & А1!8сЬи1 (1993) Ргос. №!1. Асай. δοΐ., υδΑ, 90:5873). Один способ определения сходства, обеспечиваемый алгоритмом ΒΕΑδΤ, представляет собой наименьшую суммарную вероятность (Ρ(Ν)), которая предполагает указание вероятности, с которой совпадение между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями может произойти случайным образом. Например, нуклеиновая кислота рассматривается как сходная с контрольной последовательностью, если наименьшая суммарная вероятность при сравнении анализируемой нуклеиновой кислоты с контрольной нуклеиновой кислотой составляет менее чем приблизительно 0,2, более предпочтительно менее чем приблизительно 0,01 и предпочтительно менее чем приблизительно 0,001. В одном аспекте гомологию последовательности белка и нуклеиновой кислоты оценивают с использованием Βηδχ Ьоса1 Α1^дηтеη! δеа^ск №о1 (ΒΕΑδΤ). Например, для осуществления следующих задач используют пять конкретных программ ΒΕΑδΤ: (1) ΒΕΑδΤΡ и ΒΕΑδΤ3 сравнивают представляющую интерес аминокислотную последовательность с базой данных последовательностей белков; (2) ΒΕΑδΤΝ сравнивает представляющую интерес нуклеотидную последовательность с базой данных нуклеотидных последовательностей; (3) ΒΕΑδΤΧ сравнивает концептуальные продукты трансляции с шести рамок представляющей интерес нуклеотидной последовательности (обе нити) с базой данных белковых последовательностей; (4) ΤΒΕΑδΤΝ сравнивает представляющую интерес белковую последовательность с базой данных нуклеотидных последовательностей, транслируемых со всех шести рамок считывания (обе цепи); и (5) ΤΒΕΑδΤΧ сравнивает продукты трансляции с шести рамок представляющей интерес нуклеотидной последовательности с продуктами трансляции с шести рамок базы данных нуклеотидных последовательностей. Программы ΒΕΑδΤ идентифицируют гомологичные последовательности посредством идентификации сходных сегментов, которые в данном описании называются парами сегментов с максимальным сходством между представляющей интерес последовательностью аминокислоты или нуклеиновой кислоты и анализируемой последовательностью, которая предпочтительно получена из последовательности белка или нуклеиновой кислоты из базы данных. Пары сегментов с максимальным сходством предпочтительно идентифицируются (т.е. выравниваются) посредством оценочных матриц, многие из которых известны в данной области. В одном аспекте оценочная матрица представляет собой матрицу ΒΕΘδυΜ62 (Ооппе! е! а1., δс^еηсе, 256:1443-1445, 1992; НешкоГГ апй НешкоГГ, Ρο!е^η8, 17:49-61, 1993). В меньшей степени предпочтительно также могут быть использованы матрицы РАМ или РАМ250 (см.,

- 29 022979 например, 8с11\\аг1/ апД ОауНоГГ. еДк., 1978, МаДтсск Гог Бс1ссДпд ЭМапсе РскЦюпДйрк: АДак оГ Рто1сш 8сциепсс апД 81гис1игс, ХУаДипЦоп: №Допа1 ВютсДюа1 КекеагсЬ РоипДаДоп).

В одном аспекте изобретения для определения того, обладает ли нуклеиновая кислота требуемой идентичностью последовательности, чтобы находиться в объеме изобретения, используют программы NСВI ВЬА8Т 2.2.2, параметры по умолчанию для Ь1ак1р. В программе ВЬА8Т 2.2.2 существует приблизительно 38 устанавливаемых параметров. В этом иллюстративном аспекте изобретения используют все величины по умолчанию, за исключением параметра фильтрации по умолчанию (т.е. все параметры установлены по умолчанию за исключением фильтрации, которая установлена на 0РР); вместо него используют параметр -Р Р, который выключает фильтрацию. Применение фильтрации по умолчанию часто приводит к противоречиям Каг1т-АИзсЬи1 вследствие короткой длины последовательности.

Величины по умолчанию, используемые в этом иллюстративном аспекте изобретения, как рассмотрено выше, включают

РШег Гог 1о\у сотр1схДу: 0N > \УогД 8ίζα 3 > МаДтх: В1окит62 > 0ар С’оЧк: Е.хМспсс: 11 > Ех1сп8юп: 1

Другие параметры по умолчанию представляют собой фильтр низкой комплексности 0РР, размер слова 3 для белка, матрицу ВЬ08ИМ62, штраф за внесение пропуска -11 и штраф за продолжение делеции -1.

Иллюстративные параметры программы NСВI ВЬА8Т 2.2.2 указаны в примере 1 ниже. Следует отметить, что параметр по умолчанию -V принимает значение 0. Это означает, что если он не установлен, размер слова принимает значение по умолчанию, равное 3 для белков и 11 для нуклеотидов.

Гибридизация нуклеиновых кислот

Изобретение относится к выделенным, синтетическим или рекомбинантным нуклеиновым кислотам, которые в жестких условиях гибридизуются с иллюстративной последовательностью по изобретению, например с последовательностью, указанной в 8ЕЦ ГО N0: 5 и имеющей одну или несколько мутаций, указанных в табл. 12-15, как описано в примере 3, или с нуклеиновой кислотой, которая кодирует полипептид, содержащий последовательность, указанную 8ЕЦ ГО N0: 6 и которая кодирует одну или несколько мутаций, указанных в табл. 12-15, как описано в примере 3, или их ферментативно активный фрагмент.

Жесткие условия могут представлять собой высоко жесткие условия, умеренно жесткие условия и/или условия с низкой жесткостью, включая условия с высокой и сниженной жесткостью, описанные в данном описании. В альтернативных аспектах длина нуклеиновых кислот по изобретению, определенных по их способности гибридизоваться в жестких условиях, может составлять приблизительно от пяти остатков до полной длины нуклеиновой кислоты по изобретению, например иллюстративной нуклеиновой кислоты по изобретению. Например, их длина может составлять по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400 или более остатков. Нуклеиновые кислоты, которые короче полной длины, также включены. Эти нуклеиновые кислоты могут быть пригодны, например, в качестве зондов для гибридизации, зондов для мечения, олигонуклеотидных зондов для ПЦР, 1РНК (одноцепочечной или двухцепочечной), антисмысловой последовательности или последовательности, кодирующей пептиды, связывающиеся с антителами (эпитопами), мотивов, активных центров, связывающих доменов, регуляторных доменов и т.п.

В одном аспекте нуклеиновые кислоты по изобретению определяются по их способности гибридизоваться в условиях высокой жесткости, включающих условия приблизительно с 50% формамидом при температуре от 37 до 42°С. В одном аспекте нуклеиновые кислоты по изобретению определяются по их способности гибридизоваться в условиях пониженной жесткости, включающих условия приблизительно с 35-25% формамидом при температуре приблизительно от 30 до 35°С. Альтернативно, нуклеиновые кислоты по изобретению определяются по их способности гибридизоваться в условиях высокой жесткости, включающих условия с температурой 42°С в 50% формамиде, 5Х 88РЕ, 0,3% 8Ό8 и с нуклеиновой кислотой, блокирующей повторяющиеся последовательности, такие как со1-1 или ДНК спермы лосося (например, 200 нг/мл расщепленной и денатурированной ДНК спермы лосося). В одном аспекте нуклеиновые кислоты по изобретению определяются по их способности гибридизоваться в условиях пониженной жесткости, включающих 35% формамид при температуре от пониженной до 35°С.

После гибридизации фильтр можно промывать 6Х 88С, 0,5% 8Ό8 при 50°С. Эти условия считаются умеренными условиями при концентрации формамида выше 25% и низкими условиями при концентрации формамида ниже 25%. Конкретный пример умеренных условий гибридизации представляет собой условия, когда описанную выше гибридизацию проводят при концентрации формамида 30%. Конкретный пример условий гибридизации низкой жесткости представляет собой условия, когда описанную выше гибридизацию проводят при концентрации формамида 10%.

Диапазон температур, соответствующий конкретному уровню жесткости, можно далее сужать путем вычисления соотношения пуринов и пиримидинов в представляющей интерес нуклеиновой кислоте

- 30 022979 и коррекции температуры соответствующим образом. Нуклеиновые кислоты по изобретению также определяются их способностью гибридизоваться в условиях высокой, умеренной и низкой жесткости, как указано в Ли8иЬе1 и ЗатЬгоок. Варьирование указанных выше диапазонов и условий можно использовать для осуществления изобретения на практике, и они хорошо известны в данной области. Условия гибридизации рассмотрены ниже.

Олигонуклеотидные зонды и способы их использования

Изобретение относится к зондам нуклеиновых кислот для идентификации и/или выделения нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, обладающий активностью фосфолипазы. В одном аспекте зонд содержит или состоит из нуклеиновой кислоты по изобретению, например нуклеиновой кислоты, имеющей последовательность, указанную в §ЕЦ ГО N0: 5 и имеющую одно или несколько изменений оснований (мутаций), как указано в табл. 12-15, как описано в примере 3 ниже, или нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, содержащий последовательность, указанную в §ЕЦ ГО N0: 6, и кодирующей одно или несколько изменений аминокислот (мутаций), как указано в табл. 12-15, или ее ферментативно активный фрагмент. Альтернативно, зонд по этому изобретению может представлять собой по меньшей мере приблизительно 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 или 150 или приблизительно от 10 до 50, приблизительно от 20 до 60, приблизительно от 30 до 70 последовательно расположенных оснований последовательности нуклеиновой кислоты по изобретению.

Зонды идентифицирует нуклеиновую кислоту путем связывания или гибридизации. В альтернативных вариантах осуществления гибридизация включает процесс, в котором цепь нуклеиновой кислоты связывается с комплементарной цепью путем спаривания оснований. Реакции гибридизации могут быть чувствительными и селективными так, чтобы конкретную представляющую интерес последовательность можно было идентифицировать даже в образцах, в которых она присутствует в низких концентрациях. Пригодные жесткие условия могут определяться, например, концентрациями соли или формамида в растворах для предгибридизации и гибридизации или температурой гибридизации и хорошо известны в данной области. Например, жесткость можно увеличивать путем уменьшения концентрации соли, увеличения концентрации формамида, или увеличения температуры гибридизации, изменения времени гибридизации, как подробно описано ниже. В альтернативных аспектах нуклеиновые кислоты по изобретению определяются их способностью гибридизоваться в условиях различной жесткости (например, высокой, средней и низкой), как указано в настоящем документе.

Зонды можно использовать в матрицах по изобретению, см. обсуждение ниже, включая, например, капиллярные матрицы. Зонды по изобретению также можно использовать для выделения и/или идентификации других кодирующих фосфолипазу нуклеиновых кислот или полипептидов, обладающих активностью фосфолипазы.

Зонды по изобретению можно использовать для определения того, содержит ли биологический образец, такой как образец почвы, организм с последовательностью нуклеиновой кислоты по изобретению. По таким методикам получают биологический образец, потенциально содержащий организм, из которого была выделена нуклеиновая кислота, и из образца получают нуклеиновые кислоты. Нуклеиновые кислоты подвергают контактированию с зондом в условиях, которые делают возможной специфичную гибридизацию зонда с любой комплементарной последовательностью, которая представлена в них.

При необходимости условия, которые делают возможной специфическую гибридизацию зонда с комплементарной последовательностью, можно определять контактированием образца с комплементарными последовательностями из образцов, о которых известно, что они содержат комплементарную последовательность, а также с контрольными последовательностями, которые не содержат комплементарной последовательности. Условия гибридизации, такие как концентрация соли в буфере для гибридизации, концентрация формамида в буфере для гибридизации или температура гибридизации, можно варьировать для идентификации условий, которые дают возможность зонду специфично гибридизоваться с комплементарными нуклеиновыми кислотами (см. обсуждение конкретных условий гибридизации).

Если образец содержит организм, из которого нуклеиновая кислота была выделена, тогда определяют наличие специфической гибридизации зонда. Наличие гибридизации может быть определено путем мечения зонда поддающимся детекции веществом, таким как радиоактивный изотоп, флуоресцентный краситель или фермент, способный катализировать образование детектируемого продукта. Специалистам в данной области известны различные способы использования меченых зондов для определения наличия комплементарных нуклеиновых кислот в образце. Они включают анализы саузерн-блот, нозерн-блот, методы гибридизации колоний и дот-блот анализ. Протоколы для каждого из указанных методов представлены в Ли8иЬе1 и ЗатЬгоок.

Альтернативно, более одного зонда (по меньшей мере один из которых способен специфично гибридизоваться с любой комплементарной последовательностью, которая присутствует в образце нуклеиновой кислоты) можно использовать в реакции амплификации для определения, содержит ли образец организм, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты по изобретению (например, организм, из которого нуклеиновая кислота была выделена). В одном аспекте зонды включают олигонуклеотиды. В одном аспекте реакция амплификации может включать реакцию ПЦР. Протоколы ПЦР описаны в Аи- 31 022979

5иЬе1 и ЗатЬгоок (см. обсуждение реакций амплификации). По таким методикам нуклеиновые кислоты в образце контактируют с олигонуклеотидными зондами, проводят реакцию амплификации и определяют любой полученный продукт амплификации. Продукт амплификации можно определять проведением гель-электрофореза продуктов реакции и окрашиванием геля интеркалирующим красителем, таким как бромистый этидий. Альтернативно, один или несколько зондов можно метить радиоактивным изотопом и наличие радиоактивного продукта амплификации можно определять радиоавтографией после гельэлектрофореза.

Зонды, полученные из последовательностей вблизи 3'- и 5'-концов последовательностей по изобретению, также можно использовать в методах прогулки по хромосоме для идентификации клонов, содержащих дополнительные, например геномные, последовательности. Такие методы дают возможность выделить из организма хозяина гены, которые кодируют дополнительные белки.

В одном аспекте последовательности нуклеиновых кислот по изобретению используют в качестве зондов для идентификации и выделения родственных нуклеиновых кислот. В некоторых аспектах идентифицированные таким образом родственные нуклеиновые кислоты могут представлять собой кДНК или геномную ДНК из организмов, отличных от организма, из которых нуклеиновая кислота по изобретению была впервые выделена. В таких способах образец нуклеиновой кислоты контактируют с зондом в условиях, которые позволяют зонду специфично гибридизоваться с родственными последовательностями. Затем проводят детекцию гибридизации зонда с нуклеиновыми кислотами из родственного организма с использованием любого из способов, описанных выше.

В реакциях гибридизации нуклеиновых кислот условия, используемые для достижения конкретного уровня жесткости, будут варьировать в зависимости от природы гибридизуемой нуклеиновой кислоты. Например, при выборе условий гибридизации могут рассматриваться длина, степень комплементарности, состав нуклеотидной последовательности (например, содержание СС относительно АТ) и тип нуклеиновой кислоты (например, РНК или ДНК) в гибридизуемых участках нуклеиновых кислот. В альтернативных вариантах осуществления нуклеиновая кислота иммобилизована, например, на фильтре. Гибридизация может быть проведена в условиях низкой жесткости, умеренной жесткости или высокой жесткости. В качестве примера гибридизации нуклеиновой кислоты сначала проводят прегибридизацию полимерной мембраны, содержащей иммобилизованные денатурированные нуклеиновые кислоты в течение 30 мин при 45°С в растворе, состоящем из 0,9М ПаС1, 50 мМ ПаН₂РО₄, рН 7,0, 5,0 мМ Па₂ЕЭТА. 0,5% δΌδ, 10Х ЭепНагШ и 0,5 мг/мл полирибоадениловой кислоты. Затем в раствор добавляют приблизительно 2х10⁷ срт (имп. мин) (удельная активность 4-9х10⁸ срт/мкг) меченого на конце ³²Р олигонуклеотидного зонда. В альтернативных вариантах осуществления через 12-16 ч инкубации мембрану промывают в течение 30 мин при комнатной температуре в IX §ЕТ (150 мМ ПаС1, 20 мМ гидрохлорида Тг15, рН 7,8, 1 мМ Па2ЕЭТА), содержащем 0,5% δΌδ, с последующим промыванием в течение 30 свежим 1Х §ЕТ при Тт-10°С для олигонуклеотидного зонда. Мембрану затем подвергают воздействию пленки для радиоавтографии для определения сигналов гибридизации.

Варьируя жесткость условий гибридизации, используемых для идентификации нуклеиновых кислот, таких как кДНК или геномные ДНК, которые гибридизуются с детектируемым зондом, можно идентифицировать и выделять нуклеиновые кислоты с различными уровнями гомологии. Жесткость можно варьировать проведением гибридизации при различных температурах ниже температуры плавления зонда. Температура плавления, Тт, представляет собой температуру (при определенной ионной силе и рН), при которой 50% последовательности-мишени гибридизуется с абсолютно комплементарным зондом. Очень жесткие условия выбирают из условий, равных или приблизительно на 5°С ниже, чем Тт для конкретного зонда. Температура плавления зонда может быть вычислена с использованием следующих формул. Для зондов длиной от 14 до 70 нуклеотидов температуру плавления (Тт) вычисляют с использованием формулы

Тт = 81,5+16,6(1од[Па+])+0,41 (фракция С+С)-(600/П), где П означает длину зонда.

Если гибридизацию проводят в растворе, содержащем формамид, температура плавления может быть вычислена с использованием формулы

Тт = 81,5+16,6(1од[Па+])+0,41 (фракция С+С)-(0,63% формамида)-(600/П), где П означает длину зонда.

Прегибридизацию можно проводить в 6Х §§С, 5Х реагенте ОепНагШ, 0,5% δΌδ, 100 мкг денатурированной фрагментированной ДНК спермы лосося или в 6Х §§С, 5Х реагенте ОепНагШ, 0,5% δΌδ, 100 мкг денатурированной фрагментированной ДНК спермы лосося, 50% формамиде. Формулы для растворов §§С и ЭепНагб! и других растворов приведены, например, в ЗатЬгоок.

Гибридизацию проводят с добавлением детектируемого зонда в растворы для прегибридизации, перечисленные выше. В случае, если зонд содержит двухцепочечую ДНК, его денатурируют перед добавлением раствора для гибридизации. Фильтр контактируют с раствором для гибридизации на достаточный период времени для того, чтобы дать возможность зонду гибридизоваться с кДНК или с геномными ДНК, содержащими последовательности, комплементарные ему или гомологичные ему. Для зондов с длиной более 200 нуклеотидов гибридизацию можно проводить при температуре на 15-25°С ниже Тт.

- 32 022979

Для более коротких зондов, таких как олигонуклеотидные зонды, гибридизацию можно проводить при температуре на 5-10°С ниже Тт. В одном аспекте для гибридизации в 6Х 88С гибридизацию проводят при приблизительно 68°С. В одном аспекте для гибридизации в растворах, содержащих 50% формамид, гибридизацию проводят при приблизительно 42°С. Все из указанных выше способов гибридизации можно считать проводимыми в условиях высокой жесткости.

После гибридизации для удаления любых неспецифично связанных детектируемых зондов фильтр промывают. Жесткость, используемая для промывания фильтров, также может варьировать в зависимости от природы гибридизуемых нуклеиновых кислот, длины гибридизуемых нуклеиновых кислот, степени комплементарности, состава нуклеотидиой последовательности (например, содержание 0С относительно АТ) и типа нуклеиновой кислоты (например, РНК или ДНК). Примеры постепенно повышающихся условий жесткости состоят в следующем: 2Х 88С, 0,1% 8Ό8 при комнатной температуре в течение 15 мин (низкая жесткость); 0,1Х 88С, 0,5% 8Ό8 при комнатной температуре в течение от 30 мин до 1 ч (умеренная жесткость); 0,1Х 88С, 0,5% 8Ό8 в течение от 15 до 30 мин при температуре от температуры гибридизации до 68°С (высокая жесткость) и 0,15М ЫаС1 в течение 15 мин при 72°С (очень высокая жесткость). Конечное промывание с низкой жесткостью может быть проведено в 0,1Х 88С при комнатной температуре. Приведенные выше примеры являются только иллюстрацией одного набора условий, который может быть использован для промывания фильтров или матриц. Специалисту в данной области известно, что существует множество способов промывания с различной жесткостью, все из которых можно использовать для осуществления изобретения на практике.

Нуклеиновые кислоты, которые гибридизовались с зондом, идентифицируют посредством радиоавтографии или других общепринятых способов. Приведенную выше методику можно модифицировать для идентификации нуклеиновых кислот с пониженным уровнем гомологии с последовательностью образца. Например, для получения нуклеиновых кислот со сниженной гомологией с образцом для определения можно использовать менее жесткие условия. Например, температуру гибридизации можно снижать на интервал 5°С в диапазоне от 68 до 42°С в буфере для гибридизации с концентрацией Να' приблизительно 1М. После гибридизации фильтр можно промывать 2Х 88С, 0,5% 8Ό8 при температуре гибридизации. Эти условия рассматриваются как умеренные условия при температуре выше 50°С и низкие условия при температуре ниже 50°С. Конкретный пример умеренных условий гибридизации представляет собой пример, где представленную выше гибридизацию проводят при 55°С. Пример условий гибридизации низкой жесткости представляет собой пример, где представленную выше гибридизацию проводят при 45°С.

В альтернативных вариантах осуществления гибридизацию можно проводить в буферах, таких как 6Х 88С, содержащий формамид при температуре 42°С. В этом случае концентрацию формамида в буфере для гибридизации можно снижать на 5% интервал в диапазоне от 50 до 0% для идентификации клонов со сниженным уровнем гомологии с образцом. После гибридизации фильтр можно промывать 6Х 88С, 0,5% 8Ό8 при 50°С. Эти условия рассматриваются как умеренные условия при концентрации формамида выше 25% и низкие условия при концентрации формамида ниже 25%. В альтернативных вариантах осуществления умеренные условия гибридизаций представляют собой условия, где представленную выше гибридизацию проводят в 30% формамиде. В альтернативных вариантах осуществления условия гибридизации низкой жесткости представляют собой условия, где представленную выше гибридизацию проводят в 10% формамиде.

Эти зонды и способы по изобретению можно использовать для выделения нуклеиновых кислот, имеющих последовательность по меньшей мере с приблизительно 99%, приблизительно 98%, приблизительно 97%, приблизительно 96%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 55% или по меньшей мере 50% гомологией с последовательностью нуклеиновой кислоты по изобретению, содержащей по меньшей мере приблизительно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400 или 500 ее последовательно расположенных оснований и последовательностей, комплементарных им. Гомологию можно определять с использованием алгоритма выравнивания. Например, гомологичные полинуклеотиды могут обладать кодирующей последовательностью, которая является природным аллельным вариантом одной из описанных в настоящем документе кодирующих последовательностей. Такие аллельные варианты могут иметь замену, делецию или вставку одного или нескольких нуклеотидов по сравнению с нуклеиновыми кислотами по изобретению.

Кроме того, приведенные выше методики можно использовать для выделения нуклеиновых кислот, которые кодируют полипептиды, имеющие по меньшей мере приблизительно 99%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 60%», по меньшей мере 55% или по меньшей мере 50% идентичность (гомологию) с полипептидом по изобретению или фрагментами, содержащими по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 или 150 его последовательно расположенных аминокислот, которая определяется с использованием алгоритма выравнивания последовательностей (например, таких как алгоритм РА8ТА версии 3.0178 с параметрами по умолчанию или программа ВЬА8Т 2.2.2 с иллюстративными параметрами, указанными в настоящем документе).

- 33 022979

Ингибирование экспрессии фосфолипаз

Кроме того, изобретение относится к нуклеиновым кислотам, комплементарным (например, антисмысловые последовательности к) нуклеиновым кислотам по изобретению, например кодирующим фосфолипазу нуклеиновым кислотам. Антисмысловые последовательности способны ингибировать транспорт, сплайсинг или транскрипцию кодирующих фосфолипазу генов. Ингибирование можно осуществлять путем нацеливания на геномную ДНК или матричную КНК (мРНК, транскрипт). Транскрипцию или функцию нуклеиновой кислоты-мишени можно ингибировать, например, гибридизацией и/или расщеплением. Одна особенно пригодная группа ингибиторов, предусматриваемых настоящим изобретением, включает олигонуклеотиды, которые способны связывать либо ген, либо транскрипт, в любом случае, предотвращая или ингибируя продукцию или функцию фермента фосфолипазы. Связывание может происходить путем специфичной к последовательности гибридизации. Другой пригодный класс ингибиторов включает олигонуклеотиды, которые вызывают инактивацию или расщепление транскрипта фосфолипазы. Олигонуклеотид может обладать ферментативной активностью, которая вызывает такое расщепление, как, например, рибозимы. Олигонуклеотид может быть химически модифицированным или конъюгированным с ферментом или композицией, способной расщеплять комплементарную нуклеиновую кислоту. Группу из множества различных подобных олигонуклеотидов можно подвергать скринингу в отношении олигонуклеотидов с желаемой активностью.

Ингибирование экспрессии фосфолипазы может иметь множество промышленных применений. Например, ингибирование экспрессии фосфолипазы может замедлить или предотвратить порчу продукта. Порча продукта может происходить, когда липиды или полипептиды, например структурные липиды или полипептиды, подвергаются ферментативной деградации. Это может приводить к порче или гниению фруктов и овощей. В одном аспекте композиции по изобретению, которые ингибируют экспрессию и/или активность фосфолипазы, например антител, антисмысловых олигонуклеотидов, рибозимов и РНК1, используют для замедления или предотвращения порчи. Таким образом, в одном аспекте изобретение относится к способам и композициям, включающим нанесение на растение или растительный продукт (например, плод, семя, корень, лист и т.д.) антител, антисмысловых олигонуклеотидов, рибозимов и РНК1 по изобретению для замедления или предотвращения порчи. Эти композиции также могут экспрессироваться растением (например, трансгенным растением) или другим организмом (например, бактерией или другими микроорганизмом, трансформированными геном фосфолипазы по изобретению).

Композиции по изобретению для ингибирования экспрессии фосфолипазы (например, антисмысловые молекулы, ίΚΝΛ, рибозимы, антитела) можно использовать в качестве фармацевтических композиций.

Антисмысловые олигонуклеотиды

Изобретение относится к антисмысловым олигонуклеотидам, способным связывать транскрипт, которые могут ингибировать активность фосфолипазы путем нацеливания на мРНК. Стратегии для разработки антисмысловых олигонуклеотидов полностью описаны в научной и патентной литературе, и специалист в данной области может сконструировать такие олигонуклеотиды для фосфолипазы с использованием новых реагентов по изобретению. Например, протоколы прогулок по гену''/картирования РНК для поиска эффективных антисмысловых олигонуклеотидов хорошо известны в данной области, см., например, Но (2000) МекНобк Еп/уток, 314:168-183, где описан анализ для картирования РНК, который основан на стандартных молекулярных технологиях, для обеспечения легкого и достоверного способа эффективного выбора антисмысловой последовательности. См. также διηίΐΐι (2000) Еиг. 1. РНагт. δά., 11:191-198.

В качестве антисмысловых олигонуклеотидов используются природные нуклеиновые кислоты. Антисмысловые олигонуклеотиды могут иметь любую длину; например, в альтернативных аспектах длина антисмысловых олигонуклеотидов составляет приблизительно от 5 и 100, приблизительно от 10 до 80, приблизительно от 15 до 60, приблизительно от 18 до 40. Оптимальная длина может быть определена общепринятым скринингом. Антисмысловые олигонуклеотиды могут быть представлены в любой концентрации. Оптимальная концентрация может быть определена общепринятым скринингом. Известно большое множество синтетических, неприродных аналогов нуклеотидов и нуклеиновых кислот, которые могут решить эту потенциальную проблему. Например, можно использовать пептидно-нуклеиновые кислоты (РNА), содержащие неионные каркасы, такие как элементы №(2-аминоэтил)глицина. Также могут быть использованы антисмысловые олигонуклеотиды с фосфоротиоатными связями, как описано в \У0 97/03211; 96/39154; Мака (1997) Тох1со1 Арр1. РНагтасоЕ, 144:189-197; Апйкепсе ТНегареикгск, еб. А§гата1 (Нитапа Ргекк, То1о\уа, N1, 1996). Антисмысловые олигонуклеотиды с синтетическими аналогами каркаса ДНК, относящиеся к данному изобретению, также могут включать нуклеиновые кислоты с фосфородитиоатом, метилфосфонатом, фосфорамидатом, алкилфосфотриэфиром, сульфаматом, 3'-тиоацеталем, метилен(метилимино), 3'-№карбаматом и морфолинокарбаматом, как описано выше.

Для создания большого количества олигонуклеотидов, которые можно быстро исследовать на наличие конкретных олигонуклеотидов, которые обладают соответствующей аффинностью связывания и специфичностью к любой мишени, такой как смысловые и антисмысловые последовательности фосфолипазы по изобретению, можно использовать комбинаторные химические методы (см., например, Оо1б

- 34 022979 (1995) ί. ο£Βΐο1. СЬет., 270:13581-13584).

Ингибиторные рибозимы

Изобретение относится к рибозимам, способным связывать транскрипт фосфолипазы, которые могут ингибировать активность фермента фосфолипазы путем нацеливания на РНК. Стратегии для разработки рибозимов и селекции специфичной к фосфолипазе антисмысловой последовательности для воздействия полностью описаны в научной и патентной литературе, и специалист в данной области может разработать такие рибозимы с использованием новых реагентов по изобретению. Рибозимы действуют посредством связывания РНК-мишени с помощью связывающего РНК-мишень участка рибозима, который находится в непосредственной близости от ферментативного участка РНК, который расщепляет РНК-мишень. Таким образом, рибозим распознает и связывает РНК-мишень посредством комплементарного спаривания оснований и после связывания с соответствующим участком действует, ферментативно расщепляя и инактивируя РНК-мишень. Расщепление РНК-мишени подобным образом нарушает ее способность направлять синтез кодируемого белка, если расщепление происходит в кодирующей последовательности. После того как рибозим связался и расщепил свою РНК-мишень, он обычно высвобождается из этой РНК и, таким образом, может связывать и расщеплять новые мишени.

В некоторых случаях ферментативная природа рибозима может давать преимущества по сравнению с другими технологиями, такими как технологии антисмысловых последовательностей (где молекула нуклеиновой кислоты просто связывается с нуклеиновой кислотой-мишенью для блокирования ее транскрипции, трансляции или ассоциации с другой молекулой), поскольку эффективная концентрация рибозима, необходимая для осуществления обработки лекарственных средств, может быть ниже, чем концентрация антисмыслового олигонуклеотида. Это потенциальное преимущество отражает способность рибозима действовать ферментативно. Таким образом, единичная молекула рибозима способна расщеплять множество молекул РНК-мишеней. Кроме того, рибозим, как правило, представляет собой высокоспецифичный ингибитор со специфичностью ингибирования, зависящей не только от механизма связывания спариванием оснований, но также от механизма, посредством которого молекула ингибирует экспрессию РНК, с которой она связывается. Значит ингибирование происходит вследствие расщепления РНКмишени и, таким образом, специфичность определяется, как соотношение скорости расщепления РНКмишени и скорости расщепления РНК, которая не является мишенью. Этот механизм расщепления зависит от факторов, которые являются дополнительными для факторов, вовлеченных в спаривание оснований. Таким образом, специфичность действия рибозима может быть более высокой, чем специфичность антисмыслового олигонуклеотида, связывающего тот же участок РНК.

Молекула РНК ферментативного рибозима может находиться в форме мотива в виде головки молотка, но также она может находиться в форме мотива в виде шпильки, мотива вируса гепатита дельта, мотива интрона группы Ι или в форме РНК, подобной РНКазе Р (в ассоциации со вспомогательной последовательностью РНК). Примеры таких мотивов в виде головки молотка описаны Κοκκί (1992) А1йк КекеагсЬ апй Ηιιιηαη Ке1гоу1ги5е5 8: 183; мотивов в виде шпильки в Штре1 (1989) ВюсЬепикйу 28:4929, и Штре1 (1989) ВюсЬет15йу 28:4929 и Штре1 (1990) Шс. Ас1Й8 Кек., 18:299; мотива вируса гепатита дельта в Реггойа (1992) ВюсЬет15йу 31:16; мотив РНКазы Р в Оиетег-Такайа (1983) Се11. 35:849 и интрона группы Ι в патенте США № 4987071, выданном СесЬ. Перечисление этих конкретных мотивов не предназначено для ограничения. Специалистам в данной области будет понятно, что ферментативная молекула РНК по изобретению обладает специфичным участком связывания субстрата, комплементарным одному или нескольким участкам РНК гена-мишени и имеет нуклеотидную последовательность в этом участке связывания субстрата или рядом с ним, которая придает молекуле активность в отношении расщепления РНК.

Интерференция РНК (ΡΗΚΐ)

В одном аспекте изобретение относится к ингибиторной молекуле РНК, так называемой молекуле ΡΗΚί, содержащей последовательность фосфолипазы по изобретению. Молекула ΡΗΚί содержит двухцепочечную молекулу РНК (йкРИК). ΡΗΚί может ингибировать экспрессию гена фосфолипазы. В одном аспекте длина ΡΗΚί составляет приблизительно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более дуплексных нуклеотидов. Поскольку изобретение не ограничивается конкретным механизмом действия, ΡΗΚί может проникать в клетку и вызывать деградацию одноцепочечной РНК (κκΡΗΚ) со сходными или идентичными последовательностями, включая эндогенные мРНК. Если клетка подвергается воздействию двухцепочечной РНК (йкРИХ), мРНК гомологичного гена селективно деградируется в процессе, называемом интерференцией РНК (ΡΗΚί). Возможный основной механизм, помимо ΡΗΚί, представляет собой разрушение двухцепочечной РНК (йкРИХ), совпадающей со специфичной последовательностью гена на короткие фрагменты, называемые короткими интерферирующими РНК, которые запускают деградацию мРНК, которая совпадает с их последовательностью. В одном аспекте ΡΗΚί по изобретению используется в лекарственных средствах для подавления генов, см., например, ЗЬиеу (2002) Эгид Э1ксоу. Тойау, 7:1040-1046. В одном аспекте изобретение относится к способам селективной деградации РНК с использованием ΡΗΚί по изобретению. Способ может быть осуществлен ίη уйго, ех νίνο или ίη νίνο. В одном аспекте молекулы ΡΗΚί по изобретению могут быть использованы для получения мутации с потерей функции в клетке, органе или животном. Способы получения и использования молекул ΡΗΚί для селек- 35 022979 тивной деградации РНК хорошо известны в данной области, см., например, патенты США №№ 6506559; 6511824;6515109;6489127.

Модификация нуклеиновых кислот

Изобретение относится к способам получения вариантов нуклеиновых кислот по изобретению, например нуклеиновых кислот, кодирующих фермент фосфолипазу. В альтернативном варианте осуществления изобретение относится к способам модификации фермента по изобретению, например, мутацией его кодирующей последовательности случайными или стохастическими способами, или нестохастическим или направленным изменением, таким как мутагенез с насыщением сайта гена™ (С88М), для изменения рН-диапазона активности фермента или диапазона оптимальной активности, температурного диапазона активности активность или диапазона оптимальной активности, специфичности, активности (кинетики); использования в ферменте гликозилирования, фосфорилирования или металлов (например, Са, Мд, Ζη, Ре, №), например, для влияния на рН/температурную стабильность. Изобретение относится к способам модификации фермента по изобретению, например, мутацией его кодирующей последовательности, например, посредством С88М, для увеличения его устойчивости к активности протеаз. Изобретение относится к способам модификации фермента по изобретению, например, путем мутации его кодирующей последовательности, например, посредством С88М, для модификации использования в ферменте хелаторов металлов для Са, Мд, №, которые не хелатируют Ζη. Изобретение относится к способам модификации фермента по изобретению, например, мутацией его кодирующей последовательности, например, посредством С88М, чтобы он имел желаемую комбинацию видов активности, например, специфичные к Р1, РА и РС/РЕ РЬС.

В одном варианте осуществления мутагенез с насыщением сайта гена (С88М) или С88М включает способ, в котором используются вырожденные олигонуклеотидные праймеры для введения точковых мутаций в полинуклеотид, как подробно описано ниже. В одном варианте осуществления оптимизированная система направленных изменений или оптимизированные направленные изменения включает способ повторной сборки фрагментов сходных последовательностей нуклеиновых кислот, например сходных генов, и подробно пояснен ниже. В одном варианте осуществления синтетическая повторная сборка лигированием или 8РК включает способ лигирования фрагментов олигонуклеотидов нестохастическим образом и подробно объяснен ниже.

В альтернативных вариантах осуществления изобретение относится к вариантам иллюстративных нуклеиновых кислот и полипептидов по изобретению, включая, например, 8ЕЦ ГО N0: 8, кодируемую, например, 8ЕЦ ГО N0: 7, 8ЕЦ ГО N0: 8 или 8ЕЦ ГО N0: 9. В альтернативных вариантах осуществления варианты полинуклеотидов или полипептидов по изобретению представляют собой нуклеиновые кислоты или полипептиды, модифицированные в одной или нескольких парах оснований, кодонах, интронах, экзонах или аминокислотных остатках (соответственно), но, тем не менее, сохраняют биологическую активность фосфолипазы. Варианты можно получать любым из множества способов, например, таких как ПЦР с пониженной точностью, шаффлинг, олигонуклеотид-направленный мутагенез, объединяющая ПЦР, мутагенез с помощью половой ПЦР, мутагенез ίη угуо, кассетный мутагенез, возвратномножественный мутагенез, экспоненциально-множественный мутагенез, сайт-специфический мутагенез, повторная сборка гена, С88М и любая их комбинация. Способы получения вариантов фосфолипаз, обладающих активностью при рН или температуре, например, которые отличаются от фосфолипазы дикого типа, включены в эти способы.

Эти способы можно повторять или использовать в различных комбинациях для получения ферментов фосфолипаз с измененной или отличающейся активностью или с измененной или отличающейся стабильностью относительно активности и стабильности фосфолипазы, кодируемой матричной нуклеиновой кислотой. Эти способы также можно повторять или использовать в различных комбинациях, например, для получения изменений в экспрессии гена/транскрипта, трансляции транскрипта или стабильности транскрипта. В другом аспекте генетический набор клетки изменяют, например, посредством модификации гомологичного гена ех угуо с последующим повторным встраиванием в клетку.

Нуклеиновую кислоту по изобретению можно изменять любыми способами, например, случайными или стохастическими способами, или неслучайными способами, или способами направленных изменений.

Способы случайных мутаций в генах хорошо известны в данной области, см., например, патент США № 5830696. Например, для случайной мутации в гене можно использовать мутагены. Мутагены включают, например, облучение ультрафиолетовым светом или гамма-облучение, или химический мутаген, например, митомицин, азотистую кислоту, фотоактивируемые псоралены, отдельно или в сочетании, для индуцирования повреждений ДНК, поддающихся репарации посредством рекомбинации. Другие химические мутагены включают, например, бисульфит натрия, азотистую кислоту, гидроксиламин, гидразин или муравьиную кислоту. Другие мутагены представляют собой аналоги нуклеотидных предшественников, например нитрозогуанидин, 5-бромурацил, 2-аминопурин или акридин. Эти вещества можно добавлять в реакцию ПЦР вместо нуклеотидных предшественников, вызывая, таким образом, мутации в последовательности. Также можно использовать интеркалирующие вещества, такие как профлавин, акрифлавин, хинакрин и т.п.

- 36 022979

Можно использовать любую технологию молекулярной биологии, например, случайный мутагенез посредством ПЦР, см., например, Юсе (1992) Ргос. Ν;·ιΐ1. Асаб. Зск, ИЗА, 89:5467-5471; или комбинаторный множественный кассетный мутагенез, см., например, Сгатеп (1995) В1о1есНп1цие5, 18:194-196. Альтернативно, нуклеиновые кислоты, например гены, могут быть повторно собраны после случайной или стохастической фрагментации, см., например, патенты США №№ 6291242; 6287862; 6287861; 5955358; 5830721; 5824514; 5811238; 5605793. В альтернативных аспектах модификации, вставки или делеции вносят с помощью ПЦР с пониженной точностью, шаффлинга, олигонуклеотид-направленного мутагенеза, объединяющей ПЦР, мутагенеза с помощью половой ПЦР, мутагенеза ш νίνο, кассетного мутагенеза, возвратно-множественного мутагенеза, экспоненциально-множественного мутагенеза, сайтспецифического мутагенеза, повторной сборки гена, мутагенеза с насыщением сайтов гена (СЗЗМ), синтетической повторной сборки лигированием (ЗЬК), рекомбинации, рекомбинации возвратной последовательности, мутагенеза модификацией ДНК фосфотиоатом, мутагенеза с содержащей урацил матрицей, мутагенеза с содержащими разрывы дуплексами, мутагенеза с репарацией точек несоответствия, мутагенеза с дефектом репарации цепи хозяина, химического мутагенеза, мутагенеза радиогенного происхождения, мутагенеза с делецией, мутагенеза с рестрикцией и селекцией, мутагенеза с рестрикцией и исправлением ошибок, синтеза искусственного гена, множественного мутагенеза, получением химерного мультимера нуклеиновой кислоты и/или сочетанием этих и других способов.

В следующих ниже публикациях описаны различные возвратные рекомбинационные методики и/или способы, которые могут быть включены в способы по изобретению: З1еттег (1999) Мо1еси1аг Ьгеебшд оГ У1гикек Гог 1агде11пд апб обкг сНтса1 ргорегйек, Титог Тагдейпд, 4:1-4; №кк (1999) №йиге Βίο!есЬпо1оду, 17:893-896; СЬапд (1999) Еуо1и1юп оГ а су!окше икшд ΩΝΛ ГатЛу кНиГЛтд, №йиге Β^ο!есЛиο1оду, 17:793-797; МткЬи11 (1999) Рго!ет еуо1иЯоп Ьу то1еси1аг Ьгеебшд, СиггеШ Ор1топ ш СЬет1са1 Βίο1оду, 3:284-290; СНг1к11апк (1999) ПЛес!еб еуо1ийоп оГ (Нупнбте кишке Гог А2Т рЬокрЬогу1айоп икшд ЭХА ГатЛу кЬиГЙтд, №11иге Β^ο!есЛиο1οду, 17:259-264; Сгатеп (1998) ЭНА кЬиГЙтд оГ а ГатЛу оГ депек Ггот бгуегке креаек ассе1ега!ек бЛес!еб еуокШоп, №1й1ге, 391:288-291; Сгатеп (1997) Мо1еси1аг еуо1иЯоп оГ ап агкепа!е бе!ох1ЙсаЯоп раШгау Ьу ЭКА кЬиГЙтд, №йиге Β^ο!есЛиο1οду, 15:436-438; 2Ьапд (1997) ИЛесйб еуо1ийоп оГ ап еПссЛуе Гисоыбаке Ггот а да1ас1ок1баке Ьу ^NΛ кНиГГЛпд апб ксгеепгпд, Ргос. №й1. Асаб. Зск, ИЗА, 94:4504-4509; Райей е! а1. (1997) АррЛсайопк оГ ^NΛ ЗЬийНпд ΐο РЬагтасеийса1к апб Уассшек, СиггеШ Оршгоп ш Β^ο!есЛиο1οду, 8:724-733; Сгатеп е! а1. (1996) СопкДисЛоп апб еуо1иЛоп оГ апЯЬобурЬаде ЛЬгаЛек Ьу ^NΛ Шине Мебкше, 2:100-103; Сгатеп е! а1. (1996) 1тргоуеб дгееп Пиогексеп! рго!еш Ьу то1еси1аг еуо1иЛоп икшд кЬиГЙтд №йиге Β^ο!есЛиο1οду 14:315-319; Са!ек е! а1. (1996)

ΛПЛи^ιу ке1ес!гуе 1ко1аЛоп оГ Лдапбк Ггот рерйбе ЛЬгаЛек биоидН бЛр1ау оп а 1ас гергекког Ьеабр1есе биптег, 1оита1 оГ Мо1еси1аг Β^ο1οду, 255:373-386; З!еттег (1996) Зехиа1 РСК апб АккетЬ1у РСК, 1п: ТЬе Епсус1ореб1а оГ Мо1еси1аг Β^ο1οду. УСН РиЬЛкЬегк, №ν ΥοτΚ, р. 447-457; СгатеЛ апб З!еттег (1995) СотЬта!оЛа1 ти1Лр1е саккейе тШадепеЛк сгеа!ек а11 Иге регти!аЛопк оГ штат апб \\Лб1уре саккейек, ЛюТесНшсцкк, 18:194-195; З!еттег е! а1. (1995) Зшд1е-к!ер аккетЬ1у оГ а депе апб епЛге р1акт1б Гогт 1агде питЬегк оГ оЛдобеохуЛЬопис1еойбек, Сепе, 164:49-53; З!еттег (1995) ТЬе Еуо1иЛоп оГ Мо1еси1аг СотрШаЛоп, Заепсе, 270: 1510; З!еттег (1995) ЗеагсЫпд Зедиепсе Зрасе, Β^ο/ТесЛиο1οду, 13:549-553; З!еттег (1994) Кар1б еуо1иЛоп оГ а рго!еш ш νίίτο Ьу ^NΛ кЬиГГЛпд, №йиге 370:389-391 и З!еттег (1994) ^NΛ кЬиГЙтд Ьу гапбот ГгадтеЫаЯоп апб геаккетЬ1у: 1п уйго гесотЬтайоп Гог то1еси1аг еуоЫЯоп., Ргос. №!1. Асаб. Зск, ИЗА, 91:10747-10751.

Способы внесения мутаций для получения разнообразия включают, например, сайт-направленный мутагенез (Лтд е! а1. (1997) АрргоасЬек !о ^NΛ ти!адепек1к: ап оуегу1ег, Апа1. Β^οсЬет., 254(2):157-178; Эа1е е! а1. (1996) ОЛдопис1еойбе-бЛес!еб гапбот ти!адепек1к икшд !Ье рЬокрЬого!Ыоа!е те!Ьоб, Ме!Ьобк Мо1. Βίο1., 57:369-374; ЗтйЬ (1985) 1п уйго ти1адепек1к, Апп. Кеу. Сепе!., 19:423-462; йоШеи! & ЗЬой1е (1985) З!га!ед1ек апб аррПсаЛопк оГ ш νίίτο ти!адепек1к, Заепсе, 229:1193-1201; СаЛег (1986) ЗЛе-б1гес!еб ти1адепек1к, Βίοάκιπ. ί., 237:1-7 и Кипке1 (1987) ТЬе еГйаепсу оГ оЛдопис1еоЛбе бЛес!еб тЫадепеЛк, ш Шсйю Аабк & Мо1еси1аг Β^ο1οду (Ескк!еш Р. апб П11еу Э.М.к ебк., ЗрЛпдег Уег1ад, Βе^1^п)); мутагенез с содержащими урацил матрицами (Кипке1 (1985) Кар1б апб еГйаеп! кйе-креайс ти!адепек1к гйЬои! рЬепо1урю ке1есЛой Ргос. №й1. Асаб. Зск, ИЗА, 82:488-492; Кипке1 е! а1. (1987) Кар1б апб еГйаеп! ти1адепек1к гйЬои! рЬепо!ур1с кексйоп Ме!Ьобк т Еиζутο1., 154,367-382 и Βакк е! а1. (1988) Ми!ап! Тгр гергеккогк гйЬ пег ^NА-Ь^пб^пд креаПаЛек, Заепсе, 242:240-245); олигонуклеотид-направленный мутагенез (Ме!Ьобк 1п Епхуток, 100:468-500 (1983); Ме!Ьобк ш Еиζутο1., 154:329-350 (1987); Ζο1Κτ & ЗтйЬ (1982) ОЛдопис1еойбе-бЛес!еб тЫадепеЛк икшд М13-беЛуеб уес!огк: ап еГйаеп! апб депега1 ргосебиге Гог !Ье ргобисЛоп оГ рот! тЫаЯопк ш апу ^NΛ Ггадтеп!, ШсйК Аабк. Кек. 10:6487-6500; Ζο1Κτ & ЗтйЬ (1983) ОЛдопис1еойбе-бЛес!еб тЫадепеЛк оГ ОЙА Ггадтеп!к с1опеб ш!о М13 уес!огк, Ме!Ьобк т Епхуток, 100:468-500 и Ζο1Κτ & ЗтйЬ (1987) ОЛдопис1еойбе-б1гес!еб тЫадепеЛк: а Лтр1е те!Ьоб икшд !νο ο1ίдопис1еоЛбе рйтегк апб а к^пд1е-к!^аибеб ОЙА !етр1а!е, Ме!Ьобк ш Еиζутο1., 154:329-350); мутагенез с модификацией ДНК фосфоротиоатом (Тау1ог е! а1. (1985) ТЬе ике оГ рЬокрЬого!Ыоа!е-тоб1Йеб ОЙА ш гек!Лсйоп еп/уте геасЛопк !о ргераге тскеб ^NΛ. Ν^1. Аабк. Кек., 13:8749-8764; Тау1ог е! а1. (1985) ТЬе гар1б депегайоп оГ оЛдопис1еойбе-б1гес!еб тЫайопк а! ЫдЬ Ггедиепсу икшд рЬокрЬого!Ыоа!е-тоб1Йеб 0^, Ν^1. Аабк Кек., 13:8765-8787 (1985); Nакатауе (1986) 1пЫЫйоп оГ гекйгсЯоп епбопис1еаке Να I с1еауаде

- 37 022979

Ьу рНокр1юго(Нюа(е дгоирк апй йк аррйсайоп (о ойдопис1еоййе-ййес1ей ти1адепек1к, №с1. Ас1йк Кек., 14:9679-9698; Зауегк е( а1. (1988) Υ-Т Ехопис1еакек Ы рйокрйогоЫ1оа1е-Ьакей ойдопис1еоййе-ййес1ей ти!адепек1к, N^1. АсЫк. Кек., 16:791-802 и Зауегк е( а1. (1988) З!гапй кресШс с1еауаде оГ рйокрйогоЫ1оа1есойашЫд ^NА Ьу геасйоп \\ЙН геййсйоп епйопис1еакек ш Не ргекепсе оГ еЫЫЫт ЬготЫе, №с1. Аайк. Кек., 16:803-814); мутагенез с использованием разрывов в дуплексе ДНК (Кгатег е( а1. (1984) ТНе даррей йир1ех ^NЛ арргоасН (о ойдопис1еоййе-Ытес1ей ти!айоп сопкйисйоп, №с1. Аайк. Кек., 12:9441-9456; Кгатег & Ρτίΐζ (1987) МеЫойк ш Епζуто1. 0йдопис1еоййе-й1тес1ей сопкйисйоп оГ тЫайопк \аа даррей йир1ех ^NА. 154:350-367; Кгатег е( а1. (1988) 1тргоуей ег^утаНс ш уйго геасйопк ш (Не даррей йир1ех ^NА арргоасН (о ойдопис1еоййе-Ыгес1ей сопкйисйоп оГ тЫайопк, №с1. Аайк. Кек., 16:7207 и Ρτίΐζ е( а1. (1988) 0Пдопис1еоНйе-ййес(ей сопкйисйоп оГ тЫайопк: а даррей йир1ех ^NА ргосейиге \\йНои( ег^утайс геасйопк ш \йго, №с1. Аайк. Кек. 16:6987-6999).

Дополнительные протоколы, используемые в способах по изобретению, включают репарацию ошибочно спаренных оснований (Кгатег (1984) Рот( М|кта(сН Керай, Се11. 38:879-887), мутагенез с использованием штаммов-хозяев с дефектной репарацией (Сайет е( а1. (1985) Нпргоуей ойдопис1еоййе кйеййес(ей тШадепейк ийпд М13 уесЮгк, №с1. Аайк. Кек., 13:4431- 4443 и айет (1987) Нпргоуей ойдопис1еоНйе-ййес(ей тШадепейк цкшд М13 уесЮгк, Ме(Нойк ш Епζуто1., 154:382-403), мутагенез с делециями (ЕдЫейагаайей (1986) Ике оГ ойдопис1еоййек (о депега(е 1агде йе1ейопк, №с1. Лайк Кек., 14:5115), рестрикцию с селекцией, и рестрикцию с селекцией и рестрикцией с исправлением ошибок (Ае11к е( а1. (1986) 1трог(апсе оГ йуйгодеп-Ьопй Готтайоп ш к(аЬ^1^ζ^пд (Не йапййоп к(а(е оГ киЬНПйп, РЫ1. Тгапк. К. Зос. Ьопй., А 317:415-423), мутагенез посредством синтеза целого гена (№ипЫаг е( а1. (1984) То1а1 купЫейк апй с1отпд оГ а депе сойшд Гог Не йЬопис1еаке З ргсНет, Зйепсе, 223:1299-1301; Закатаг апй КНогапа (1988) То1а1 купЫейк апй ехргекйоп оГ а депе Гог Не а-киЬипй оГ Ьоуте гой ои(ег кедтеп( диатпе пис1еоййе-ЬЫЫпд рго(ет Дтапкйисш), №с1. Аййк. Кек., 14:6361-6372; Ае11к е( а1. (1985) Саккейе тШадепейк: ап еГПс1еп( те(Ной Гог депегайоп оГ ти1йр1е тЫайопк а! йейпей кйек, Сепе, 34:315-323 и Сгипйк(гот е( а1. (1985) 0йдопис1еоййе-ййес1ей тЫадепейк Ьу тюгокса1е 'кНо(-дип' депе купЫейк, №с1. Аайк. Кек., 13:3305-3316), репарацию двухцепочечных разрывов (Мапйеск (1986); Ато1й (1993) Рго(ет епдтеейпд Гог ипикиа1 епуйоптеп(к, СштеЫ 0р1топ ш В1о(есНпо1оду, 4:450-455; 0Идопис1еоййе-ййеЫей йоиЬ1ек(гапй Ьгеак герай ш р1акпййк оГ ЕксйейсЫа сой: а те(Ной Гог кйе-кресйю тШадепейк, Ргос. №Ы. Асай. ЗсГ, ИЗА, 83:7177-7181). Дополнительные детали многих из приведенных выше методов можно найти в МеГНойк ш Еηζуто1оду, ν. 154, где также описаны приемлемые способы контроля проблем поиска повреждений при различных способах мутагенеза.

Также см. патент США № 5605793, выданный З(еттег (25 февраля 1997 г.), Ме(Нойк Гог 1п Уйго КесотЫпайоп; патент США № 5811238, выданный З(еттег е( а1. (22 сентября 1998 г.), Ме(Нойк Гог Сепегайпд Ро1упис1еоййек На\апд Эекйей СйатаЫейкйск Ьу 1(ега(Ае Зе1есйоп апй КесотЫпайоп; патент США № 5830721, выданный З(еттег е( а1. (3 ноября 1998 г.), ^NЛ МШадепейк Ьу Капйот Ргадтейайоп апй КеаккетЬ1у; патент США № 5834252, выданный З(еттег е( а1. (10 ноября 1998 г.), Епй-Сотр1етеп1агу Ро1утегаке Кеасйоп; в патенте США № 5837458, выданном МЫкНий е( а1. (17 ноября 1998 г.), Ме(Нойк апй Сотроййопк Гог Се11и1аг апй Ме(аЬоПс Епдтеейпд; А0 95/22625, З(еттег и Статей, МШадепейк Ьу Капйот Ргадтейайоп апй КеаккетЬ1у; А0 96/33207, З(еттег и ЫрксНиМ, Епй Сотр1етеп!агу Ро1утегаке СНаш Кеасйоп; А0 97/20078, З(еттег и Статей, Ме(Нойк Гог Сепегайпд Ро1упис1еоййек На\апд Эекйей СНатаЫейкйск Ьу 1(ега(Ае Зе1есйоп апй КесотЫпайоп; А0 97/35966, М1пкйи11 и З(еттег, МеЫойк апй Сотроййопк Гог Се11и1аг апй Ме(аЬоПс Епдтеейпд; А0 99/41402 Риппопеп е( а1., Тагдейпд оГ Сепейс Уассше Уес(огк; А0 99/41383, Риппопеп е( а1., Апйдеп ЫЬтату НптшЫаНоп; А0 99/41369, Риппопеп е( а1., Сепейс Уассше Уес(ог Епдтеейпд; А0 99/41368, Риппопеп е( а1., 0рЫтЫа(юп оГ 1ттипотойи1а(огу Ргорегйек оГ Сепейс Уассшек; ЕР 752008, З(еттег и Статей, ^NЛ МЫадепейк Ьу Капйот РгадтеЫайоп апй КеаккетЬ1у; ЕР 0932670, З(еттег Е\'оАтд Се11и1аг ^NЛ ир(аке Ьу КесигкАе Зедпепсе КесотЫпайоп; А0 99/23107, З(еттег е( а1., Моййгсайоп оГ У1гик ТгорАт апй Нок( Капде Ьу Уйа1 Сепоте ЗйиГГйпд; А0 99/21979, Ар! е( а1., Нитап Рар^11отаν^^ик Уес(огк; А0 98/31837 йе1 Сагйауге е( а1., ЕνоЫйоп оГ АНо1е Се11к апй 0гдапАтк Ьу КесигкАе Зедиепсе КесотЫпайоп; А0 98/27230, Райеп апй З(еттег, МеЫойк апй Сотроййопк Гог Ро1урерййе Епдтеейпд; А0 98/27230, З(еттег е( а1., МеЫойк Гог 0рЫтЫаНоп оГ Сепе ТНегару Ьу КесигкАе Зедиепсе ЗНиГГНпд апй Зе1есйоп, А0 00/00632, МеЫойк Гог Сепегайпд ШдН1у ЭАегке ЫЬгаг1ек, А0 00/09679, МеЫойк Гог 0Ь(аНйпд ш Уйго КесотЬшей Ро1упис1еоййе Зедиепсе Вапкк апй КекиЫпд Зедиепсек, А0 98/42832, Агпо1й е( а1., КесотЫпайоп оГ Ро1упис1еоййе Зедиепсек Ийпд Капйот ог ОеПпей Рйтегк, А0 99/29902, Агпо1й е( а1., МеЫой Гог Стеайпд Ро1упис1еоййе апй Ро1урерййе Зедиепсек, А0 98/41653, Ушй, Ап ш Уйго МеЫой Гог Сопйтисйоп оГ а ^NЛ ЫЬтату, А0 98/41622, Вотсйей е( а1., МеЫой Гог Сопкйисйпд а ЫЬтату Ийпд ^NЛ ЗйиГЫпд и А0 98/42727, Рай и 2аЫпд, Зедиепсе Айетайопк ийпд Ното1одоик КесотЫпайоп.

В определенных заявках США предоставлены дополнительные детали, касающиеся различных способов внесения разнообразия, включая ЗНиРРЬШС 0Р С0^0N АЬТЕКЕП СЕЖЗ, Райеп е( а1., поданную 28 сентября 1999 г., (серийный номер США № 09/407800); ЕУΟ^υТIΟN 0Р АН0ЕЕ СЕЬЬЗ ЛN^ 0КСАМЗМЗ ΒΥ КЕСИКЗ1УЕ ЗЕ^υЕNСЕ КЕС0МВINЛТI0N, йе1 Сагйауге е! а1, поданную 15 июля 1998 г. (серийный номер США № 09/166188), и 15 июля 1999 г. (серийный номер США №

- 38 022979

09/354922); ОЬЮОкиСЬЕОТГОЕ ΜΕΌΙΑΤΕΌ \Е'СЕЕ1С АСИ) КЕСОМВ1кАТ1Ок, Статей е! а1., поданную 28 сентября 1999 г. (серийный номер США № 09/408392) и ОЬЮОкиСЬЕОТГОЕ МЕЭ1АТЕЭ ]ХиСЬЕ1С АСИ) КЕСОМВ1кАТ1Ок, Статей е! а1., поданную 18 января 2000 г. (РСТ/И8 00/01203); и§Е ОР СО1)О\-УАН1Е1) ОЕ1С.О\ССЕЕОТП)Е §¥\Т11Е§1§ РОК §У\Т11ЕНТ1С δΗυΡΡΡΙΝΟ, \Уе1сН е! а1., поданную 28 сентября 1999 г. (серийный номер США № 09/408393); МЕТНОЭ8 РОК МАКШС СНАКАСТЕК ΑΙΈΙΝΟΑ РОЕУМ;СЕЕОТП)Е8 & РОЕУРЕРТП)Е8 НАУ!кС ΌΕδΙΚΕΌ СНАКАСТЕК1§Т1С§, §ейГопоу е! а1., поданную 18 января 2000 г. (РСТ/и§ 00/01202) и, например, МЕТНОЭ8 РОК МАКШО СНАКАСТЕК δ^ΙΝΟδ, РОРУМ;СРЕОТП)Е8 & РОРУРЕРТП)Е8 НАУ!кС 1)Е§ПКЕ1) СНАКАСТЕК18Т1С8, §еИГопоу е! а1., поданную 18 июля 2000 г. (серийный номер США № 09/618579); МЕТНОЭ8 ОР ЕОЕЕ'ЕАТ1М... ПАТА §ТКиСТиКЕ§ РОК и§Е ΙΝ ЕУОЬиТЮкАКУ БПМиЬАТЮЖ', §ейГопоу и §1еттет, поданную 18 января 2000 г. (РСТ/и§ 00/01138); и §1\С.ЕЕ-8ТИАМ)Е1) \Е'СЕЕ1С АСЮ ТЕМРЬАТЕ-МЕП1АТЕП ЕЕСО\1В1\АТ1О\ АМ) \В'СЕЕ1С АСЮ РИАСМЕУТ 18ОРАТ1О№', АГГйоЙет, поданную 6 сентября 2000 г. (серийный номер США № 09/656549).

Нестохастические способы или способы направленных изменений включают, например, мутагенез с насыщением (например, С§§М), синтетическую повторную сборку лигированием (§ЬК) или их комбинации, и используются для модификации нуклеиновых кислот по изобретению для получения фосфорилаз с новыми или измененными свойствами (например, активность в высококислых или щелочных условиях, при высоких температурах и т.п.). Для полипептидов, кодируемых модифицированными нуклеиновыми кислотами, можно проводить скрининг в отношении активности перед тестированием на активность фосфорилазы или другую активность. Можно использовать любые приемы или протоколы, например использование капиллярной платформы для матрицы. См., например, патенты США № 6280926; 5939250.

Мутагенез с насыщением или С88М

В одном аспекте изобретения для получения фосфолипаз с новыми или измененными свойствами используют нестохастическую модификацию генов, процесс направленных изменений. Варианты этого способа были названы мутагенезом сайта гена, мутагенезом с насыщением сайта, мутагенезом с насыщением сайта гена или просто О88М. Его можно использовать с другими процессами мутагенеза. См., например, патенты США № 6171820; 6238884. В одном аспекте С88М включает предоставление матричного полинуклеотида и множества олигонуклеотидов, где каждый олигонуклеотид содержит последовательность, гомологичную матричному полинуклеотиду, тем самым осуществляя нацеливание на конкретную последовательность матричного полинуклеотида, и последовательность, которая представляет собой вариант гомологичного гена; получение потомков полинуклеотидов, содержащих нестохастические варианты последовательности путем репликации матричного полинуклеотида с олигонуклеотидами, тем самым, получая полинуклеотиды, содержащие гомологичные варианты последовательности гена.

В одном аспекте используют праймеры с кодонами, содержащие вырожденную последовательность Ν,Ν,Ο/Т, для внесения точковых мутаций в полинуклеотид так, чтобы получить ряд производных полипептидов, в которых в каждом положении аминокислоты представлен полный диапазон единичных аминокислотных замен, например, для модификации выбирают аминокислотный остаток в активном центре фермента или участке связывания лиганда. Эти олигонуклеотиды могут содержать смежную первую гомологичную последовательность, вырожденную последовательность Ν,Ν,Ο/Т и необязательно вторую гомологичную последовательность. Расположенные ниже производные продукты трансляции, полученные в результате применения таких олигонуклеотидов, включают все возможные замены аминокислот в любом положении аминокислоты на протяжении полипептида вследствие того, что вырожденные последовательности Ν,Ν,Ο/Т включают кодоны для всех 20 аминокислот. В одном аспекте один такой вырожденный олигонуклеотид (содержащий, например, одну вырожденную кассету Ν,Ν,Ο/Т) используется для того, чтобы подвергать любой исходный кодон исходной полинуклеотидной матрицы полному диапазону замен кодонов. В другом аспекте используют по меньшей мере две кассеты - либо в одном и том же олигонуклеотиде, либо в разных, для того, чтобы подвергать по меньшей мере два исходных кодона в исходной полинуклеотидной матрице полному диапазону замен кодонов. Например, можно получать более одной последовательности Ν,Ν,Ο/Т в одном олигонуклеотиде для внесения аминокислотных мутаций более чем в одно положение. В этом множестве последовательностей Ν,Ν,Ο/Т могут быть непосредственно смежными или отделенными одной или несколькими дополнительными нуклеотидными последовательностями. В другом аспекте можно использовать олигонуклеотиды, подходящие для внесения вставок или делеций либо отдельно, либо в комбинации с кодонами, содержащими последовательность Ν,Ν,Ο/Т, для внесения любой комбинации или перестановки аминокислотных вставок, делеций и/или замен.

В одном аспекте одновременный мутагенез в двух или более смежных положениях аминокислот проводят с использованием олигонуклеотида, который содержит смежные триплеты Ν,Ν,Ο/Т, т.е. вырожденную последовательность (Ν,Ν,Ο/^π. В другом аспекте используются вырожденные кассеты с вырожденностью, меньшей чем вырожденность последовательности Ν,Ν,Ο/Т. Например, может быть желательно в некоторых случаях использовать (например, в олигонуклеотиде) вырожденную триплетную по- 39 022979 следовательность, содержащую только один Ν, где указанный N может находиться в первом, втором или в третьем положении триплета. В остальных двух положениях триплета можно использовать любые другие основания, включая любые их комбинации или перестановки. Альтернативно, в некоторых случаях может быть желательно использовать (например, в олигонуклеотидах) вырожденную триплетную последовательность Ν,Ν,Ν.

В одном аспекте использование вырожденных триплетов (например, триплетов Ν,Ν,Ο/Τ) делает возможным систематическое и легкое получение полного диапазона возможных природных аминокислот (всего 20 аминокислот) в любом положении аминокислоты в полипептиде (в альтернативных аспектах способы также включают получение менее чем всех возможных замен в положении аминокислотного остатка или кодона). Например, для полипептида из 100 аминокислот может быть получено 2000 различных образцов (т.е. 20 возможных аминокислот на одно положение X 100 положений аминокислот). Используя олигонуклеотид или набор олигонуклеотидов, содержащих вырожденный триплет Ν,Ν,Ο/Τ, все 20 возможных природных аминокислот могут кодироваться 32 отдельными последовательностями. Таким образом, в реакционном сосуде, в котором исходная полинуклеотидная последовательность подвергается мутагенезу с насыщением, при использовании по меньшей мере одного такого олигонуклеотида образуются 32 различных производных полинуклеотида, кодирующих 20 различных полипептидов. Напротив, использование невырожденного олигонуклеотида при сайт-направленном мутагенезе приводит к получению только одного производного полипептидного продукта в реакционном сосуде. Невырожденные олигонуклеотиды необязательно можно использовать в комбинации с описанными вырожденными праймерами; например можно использовать невырожденные олигонуклеотиды для получения конкретных точковых мутаций в функционирующем полинуклеотиде. Это обеспечивает один из способов получения конкретных молчащих точковых мутаций, точковых мутаций, приводящих к соответствующему изменению аминокислоты, и точковых мутаций, которые приводят к образованию стоп-кодонов и соответствующей экспрессии полипептидных фрагментов.

В одном аспекте в каждом реакционном сосуде для мутагенеза с насыщением содержатся полинуклеотиды, кодирующие по меньшей мере 20 молекул производных полипептидов (например, фосфолипазы) так, чтобы все 20 природных аминокислот были представлены в одном конкретном положении аминокислоты, соответствующем положению кодона, в который в исходном полинуклеотиде была внесена мутация (в других аспектах используется менее чем все 20 природных комбинаций). Вырожденные 32кратно производные полипептиды, полученные из реакционного сосуда после каждого мутагенеза с насыщением, можно подвергать клональной амплификации (например, можно клонировать в подходящем хозяине, например в хозяине Е. сой, с использованием, например, экспрессирующего вектора) и можно подвергать анализу экспрессии. Если при анализе идентифицируют, что отдельный производный полипептид проявляет положительные изменения свойств (таких как повышенная активность фосфорилазы в щелочных или кислых условиях при сравнении с исходным полипептидом), его можно секвенировать для идентификации соответствующей положительной аминокислотной замены, находящейся в нем.

В одном аспекте при внесении мутации в любое положение аминокислоты исходного полипептида с использованием мутагенеза с насыщением, как описано в данном описании, положительные изменения аминокислот могут быть идентифицированы в более чем одном положении аминокислоты. Можно получить одну или несколько новых производных молекул, которые содержат комбинацию всех или части из этих положительных аминокислотных замен. Например, если 2 конкретных положительных изменения аминокислот идентифицировано в каждом из 3 положений аминокислот в полипептиде, перестановки включают 3 возможности в каждом положении (без изменений по сравнению с исходной аминокислотой, и в каждом из двух положений) и в 3 положениях. Таким образом, существует 3x3x3 или 27 конечных возможностей, включая 7, которые были ранее рассмотрены - 6 единичных точковых мутаций (т.е. по 2 в каждом из трех положений) и без изменений во всех положениях.

В другом аспекте мутагенез с насыщением сайта можно использовать совместно другим стохастическим или нестохастическим способом варьирования последовательности, например синтетической повторной сборкой лигированием (см. ниже), шаффлингом, химеризацией, рекомбинацией и другими способами внесения мутаций и средствами для осуществления мутагенеза. Настоящее изобретение относится к многократному использованию любого способа(ов) внесения мутаций, включая мутагенез с насыщением.

Синтетическая повторная сборка лигированием (8ЬК)

Изобретение относится к системе нестохастической модификации гена, называемой синтетической повторной сборкой лигированием или просто 8ЬК, метод направленных изменений, для получения фосфолипаз с новыми или измененными свойствами. 8ЬК представляет собой способ нестохастического лигирования олигонуклеотидных фрагментов друг с другом. Этот способ отличается от стохастического олигонуклеотидного шаффлинга тем, что структурные блоки нуклеиновой кислоты не перемещаются, соединяются или химеризуются случайным образом, а предпочтительно собираются нестохастически. См., например, патентную заявку США № (υ88Ν) 09/332835 с названием 8уШйейс Ыдайоп КеаккетЫу ίη Э|гес1е6 Ез^иНом, поданную 14 июня 1999 г. (υ88Ν 09/332835). В одном аспекте 8ЬК включает следующие стадии: (а) получение матричного полинуклеотида, где матричный полинуклеотид содержит

- 40 022979 последовательность, кодируемую гомологичным геном; (Ь) получение множества полинуклеотидов структурных блоков, где полинуклеотиды структурных блоков разработаны для перекрестной повторной сборки с матричным полинуклеотидом в предопределенной последовательности, и полинуклеотид структурного блока содержит последовательность, которая представляет собой вариант гомологичного гена, и последовательность, гомологичную матричному полинуклеотиду, фланкирующую последовательность варианта; (с) комбинирование полинуклеотида структурного блока с матричным полинуклеотидом, так чтобы полинуклеотид структурного блока перекрестно повторно собирался с матричным полинуклеотидом, с получением полинуклеотидов, содержащих варианты последовательностей гомологичного гена.

8ЬК не зависит от наличия высокого уровня гомологии между перемещающимися полинуклеотидами. Таким образом, этот способ можно использовать для нестохастического получения библиотек (или наборов) производных молекул, содержащих свыше 10¹⁰⁰ различных химер. 8ЬК можно использовать для получения библиотек, содержащих свыше 10¹⁰⁰⁰ различных производных химер. Таким образом, аспекты по настоящему изобретению включают нестохастические способы получения набора окончательных химерных молекул нуклеиновых кислот с итоговым порядком сборки, который выбирают в соответствии с замыслом. Этот способ включает стадии получения в соответствии с замыслом множества конкретных структурных блоков нуклеиновых кислот, имеющих подходящие взаимно совместимые лигируемые концы, и сборки этих структурных блоков нуклеиновых кислот, так чтобы полностью достигался разработанный порядок сборки.

Взаимно совместимые лигируемые концы структурных блоков нуклеиновых кислот, предназначенных для сборки, рассматриваются как пригодные для этого типа упорядоченной сборки, если они способны соединять структурные блоки в предопределенном порядке. Таким образом, весь порядок сборки, в котором структурные блоки нуклеиновых кислот могут быть соединены, определяется конструкцией лигируемых концов. Если используется более одной стадии сборки, тогда весь порядок сборки, в котором структурные блоки нуклеиновых кислот могут быть соединены, также определяется последовательным порядком стадии(ий) сборки. В одном аспекте соединенные структурные фрагменты обрабатывают ферментом, таким как лигаза (например, ДНК-лигаза Т4), для достижения ковалентного связывания структурных фрагментов.

В одном аспекте конструкцию олигонуклеотидных структурных блоков получают с помощью анализа набора матриц с исходной последовательностью нуклеиновой кислоты, которые служат основой для получения набора конечных производных химерных полинуклеотидов. Эти исходные олигонуклеотидные матрицы, таким образом, служат в качестве источника информации в последовательности, которая облегчает разработку структурных блоков нуклеиновых кислот, которые предназначены для внесения мутаций, например химеризации или шаффлинга.

В одном аспекте данного способа последовательности множества исходных матриц нуклеиновых кислот выравнивают для того, чтобы выбрать одну или несколько пограничных точек. Пограничные точки могут быть локализованы в области гомологии, и они содержат один или несколько нуклеотидов. Эти пограничные точки предпочтительно являются общими по меньшей мере для двух исходных матриц. Таким образом, пограничные точки можно использовать для обозначения границ олигонуклеотидных структурных блоков, предназначенных для образования в целях перегруппировки исходных полинуклеотидов. Пограничные точки, идентифицированные и выбранные в исходных молекулах, служат в качестве потенциальных точек химеризации при сборке конечных производных химерных молекул. Пограничная точка может представлять собой область гомологии (содержащую по меньшей мере одно гомологичное нуклеотидное основание), общую по меньшей мере для двух исходных полинуклеотидных последовательностей. Альтернативно, пограничная точка может представлять собой область гомологии, которая является общей по меньшей мере для половины исходных полинуклеотидных последовательностей, или она может представлять собой область гомологии, которая является общей по меньшей мере для двух третей исходных полинуклеотидных последовательностей. Более того, в одном аспекте пригодные пограничные точки представляют собой область гомологии, которая является общей по меньшей мере для трех четвертей полинуклеотидных последовательностей, или она может быть общей для почти всех исходных полинуклеотидных последовательностей. В одном аспекте пограничная точка представляет собой область гомологии, которая является общей для всех исходных полинуклеотидных последовательностей.

В одном аспекте повторную сборку лигированием осуществляют тщательно, чтобы получить исчерпывающую библиотеку производных химерных полинуклеотидов. Другими словами, все возможные упорядоченные комбинации структурных блоков нуклеиновых кислот представляются в виде набора конечных химерных молекул нуклеиновых кислот. В то же время, в другом варианте осуществления порядок сборки (т.е. порядок присоединения каждого структурного блока в последовательности от 5' к 3' каждой конечной химерной нуклеиновой кислоты) в каждой комбинации является запрограммированным (или нестохастическим), как описано выше. Вследствие нестохастической природы данного изобретения вероятность нежелательных побочных продуктов значительно снижается.

В другом аспекте способ повторной сборки лигированием осуществляют систематически. Напри- 41 022979 мер, способ осуществляют с целью получения систематически разделенной библиотеки производных молекул с отделами, в которых систематически может быть проведен скрининг, например, друг за другом. Другими словами, изобретение предусматривает, чтобы посредством селективного и целесообразного использования структурных блоков нуклеиновых кислот, соединенных при селективном и целесообразном использовании последовательных постадийных реакций сборки, мог быть осуществлен замысел, где конкретный набор производных продуктов получают в любом из нескольких реакционных сосудов. Это делает возможным осуществление систематического исследования и скрининга. Таким образом, эти способы дают возможность систематически исследовать потенциально очень большое количество производных молекул в уменьшенных группах. Вследствие способности осуществлять химеризацию таким образом, что он является универсальным и в то же время исчерпывающим и систематическим, особенно при наличии низкого уровня гомологии среди исходных молекул, такие способы обеспечивают получение библиотеки (или набора), содержащей большое количество производных молекул. Вследствие нестохастической природы повторной сборки лигированием в соответствии с настоящим изобретением полученные производные молекулы предпочтительно включают библиотеку конечных химерных молекул нуклеиновых кислот с таким порядком сборки, в целом, который выбран при разработке. Способы мутагенеза с насыщением и оптимизированного направленного изменения также могут быть использованы для получения различных молекулярных производных образцов. Следует понимать, что изобретение предусматривает свободу выбора и контроля в отношении пограничных точек, размера и количества структурных блоков нуклеиновых кислот и размера и конструкции соединенных элементов. Более того, следует понимать, что требование наличия межмолекулярной гомологии не являются особо строгими для удобства использования по изобретению. Более того, пограничные точки могут быть выбраны даже в областях небольшой межмолекулярной гомологии и при ее отсутствии. Например, вследствие качания кодонов, т.е. вырожденности кодонов, в структурный блок нуклеиновой кислоты можно вносить нуклеотидные замены без изменения аминокислоты, которая изначально кодируется в соответствующей исходной матрице. Альтернативно, может быть изменен кодон так, чтобы код для исходной аминокислоты изменялся.

Изобретение предусматривает, что такие замены могут быть внесены в структурный блок нуклеиновой кислоты для повышения частоты межмолекулярных гомологичных пограничных точек и, таким образом, сделать возможным повышение количества соединений, которые происходят между структурными блоками, которые, в свою очередь, делают возможным получение большего количества производных химерных молекул.

В другом аспекте синтетический характер стадии, на которой образуются структурные блоки, дает возможность сконструировать и внести нуклеотиды (например, один или несколько нуклеотидов, которые могут представлять собой, например, кодоны или интроны, или регуляторные последовательности), которые позднее могут быть необязательно удалены в процессе ш уйго (например, посредством мутагенеза) или в процессе ш νί\Ό (например, используя способность к сплайсингу генов в организме хозяина). Следует понимать, что во множестве примеров введение этих нуклеотидов также может быть желательно по другим причинам, в дополнение к потенциальной пользе в виде получения подходящей пограничной точки.

В одном аспекте структурный блок нуклеиновой кислоты используют для внесения интрона. Таким образом, функциональные интроны вносят в искусственный ген, полученный способами, описанными в настоящем документе. Искусственно внесенный интрон(ы) может быть функциональным в клеткаххозяевах для сплайсинга генов, аналогично тому, как встречающиеся в природе интроны функционально служат в сплайсинге генов.

Оптимизированная система направленных изменений

Изобретение относится к нестохастической системе модификации генов, называемой оптимизированной системой направленных изменений для получения фосфолипаз с новыми или измененными свойствами. Оптимизированные направленные изменения направлены на использование повторяющихся циклов редуктивной перестройки, рекомбинации и селекции, которые делают возможными направленные молекулярные изменения нуклеиновых кислот посредством рекомбинации. Оптимизированные направленные изменения позволяют получать большую группу измененных химерных последовательностей, где полученная группа значительно обогащена последовательностями, которые имеют заданное число случаев кроссинговера.

Элемент кроссинговера представляет собой точку в химерной последовательности, где происходит переключение последовательностей с одного исходного варианта на другой исходный вариант. Такая точка обычно находится в точке соединения, где олигонуклеотиды из двух источников лигируются совместно с образованием единой последовательности. Этот способ дает возможность вычислять точные концентрации олигонуклеотидных последовательностей так, что конечная химерная группа последовательностей обогащена на выбранное количество элементов кроссинговера. Это обеспечивает больший контроль над выбранными химерными вариантами с заданным числом случаев кроссинговера.

Кроме того, данный способ относится к удобным способам исследования огромного количества возможных вариантов участков белка по сравнению с другими системами. Ранее, если получалось, на- 42 022979 пример, 10 химерных молекул в ходе реакции, было чрезвычайно сложно тестировать такое большое количество химерных вариантов в отношении конкретной активности. Более того, значительная часть группы производных имеет очень большое число случаев кроссинговера, что приводит к белку, который с меньшей вероятностью обладает повышенным уровнем конкретной активности. При использовании этих способов группа химерных молекул может быть обогащена такими вариантами, которые имеют конкретное число случаев кроссинговера. Таким образом, несмотря на то, что все еще образуется 10¹³ химерных молекул в ходе реакции, каждая из молекул, выбранная для дальнейшего анализа, с большей вероятностью будет иметь, например, только три случая кроссинговера. Вследствие того, что получающаяся в результате группа из производных может быть изменена так, чтобы иметь предопределенное число случаев кроссинговера, границы функционального множества среди химерных молекул уменьшается. Это обеспечивает более контролируемое количество переменных при вычислении олигонуклеотида, который из оригинальных исходных полинуклеотидов может быть ответственным за влияние на конкретное свойство.

Один способ получения химерной полинуклеотидной последовательности производного представляет собой создание олигонуклеотидов, соответствующих фрагментам или участкам каждой исходной последовательности. Каждый олигонуклеотид в одном аспекте включает уникальный участок, который перекрывается так, что смешение вместе олигонуклеотидов приводит к новому варианту, который обладает каждым олигонуклеотидным фрагментом, собранным в правильном порядке. Дополнительную информацию также можно найти, например, в υ88Ν 09/332835; патенте США № 6361974.

Число олигонуклеотидов, полученных для каждого исходного варианта, соответствует суммарному числу полученных кроссинговеров в химерной молекуле, которая в конечном итоге образуется. Например, можно получить три исходных варианта нуклеотидных последовательностей для проведения реакции лигирования, чтобы найти химерный вариант, например, с более высокой активностью при высокой температуре. В качестве одного примера может быть получен набор из 50 олигонуклеотидных последовательностей, соответствующих каждому участку каждого исходного варианта. Таким образом, в ходе процесса повторной сборки лигированием может произойти вплоть до 50 случаев кроссинговера в каждой химерной последовательности. Вероятность того, что каждый из полученных химерных полинуклеотидов будет содержать олигонуклеотиды из каждого исходного варианта в переменном порядке очень низка. Если каждый олигонуклеотидный фрагмент представлен в реакции лигирования в том же молярном количестве, тогда вероятно, что в некоторых положениях олигонуклеотиды из одного и того же исходного полинуклеотида будут лигироваться друг с другом и, таким образом, не приведут к случаю кроссинговера. Если концентрация каждого олигонуклеотида из каждого источника сохраняется постоянной в ходе любой стадии лигирования в этом примере, тогда существует вероятность 1/3 (в случае 3 источников) того, что олигонуклеотид из того же исходного варианта будет лигироваться в химерную последовательность и не приведет к получению кроссинговера.

Таким образом, плотность распределения вероятностей (РЭР) может быть определена для предсказания количества случаев кроссинговера, которые могут произойти в ходе каждой стадии реакции лигирования, с учетом определенного количества исходных вариантов, количества олигонуклеотидов, соответствующих каждому варианту, и концентрации каждого варианта в ходе каждой стадии реакции лигирования. Статистические и математические способы помимо определения РЭР описаны ниже. Используя такие способы, можно вычислить такую плотность распределения вероятностей и, таким образом, обогатить группу химерных производных предопределенным количеством случаев кроссинговера, получаемых в результате конкретной реакции лигирования. Более того, можно определить число мишеней для случаев кроссинговера, и систему затем запрограммировать на вычисление исходных количеств каждого исходного олигонуклеотида в ходе каждой стадии реакции лигирования для вычисления плотности распределения вероятностей, которая зависит от предопределенного количества случаев кроссинговера. Эти способы направлены на использование повторяющихся циклов редуктивной перестройки, рекомбинации и селекции, которые делают возможными направленные молекулярные изменения нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, посредством рекомбинации. Эта система дает возможность получить большую группу измененных химерных последовательностей, где полученная группа значительно обогащена последовательностями, которые имеют заданное число случаев кроссинговера. Элемент кроссинговера представляет собой точку в химерной последовательности, где происходит переключение последовательностей с одного исходного варианта на другой исходный вариант. Такая точка обычно находится в точке соединения, где олигонуклеотиды из двух источников лигируются совместно с образованием единичной последовательности. Способ дает возможность вычислять точные концентрации олигонуклеотидных последовательностей, так что конечная химерная группа последовательностей обогащена выбранным числом случаев кроссинговера. Это обеспечивает больший контроль над выбранными химерными вариантами с предопределенным числом случаев кроссинговера.

Кроме того, эти способы относятся к удобным способам исследования огромного количества возможных вариантов участков белка по сравнению с другими системами. Используя эти способы, описанные в данном описании, группа химерных молекул может быть обогащена такими вариантами, которые имеют конкретное число случаев кроссинговера. Таким образом, несмотря на то, что в ходе реакции мо- 43 022979 жет образоваться 10¹³ химерных молекул, причем каждая из молекул, выбранная для дальнейшего анализа, с большой вероятностью будет иметь, например, только три случая кроссинговера. Вследствие того что образовавшаяся в результате группа из производных может быть изменена, чтобы иметь заданное число случаев кроссинговера, границы функционального множества среди химерных молекул будут уменьшаться. Это обеспечивает более контролируемое число переменных при вычислении олигонуклеотида, который из оригинальных исходных полинуклеотидов может быть ответственным за влияние на конкретное свойство.

В одном аспекте способ дает возможность получить химерную полинуклеотидную последовательность производного посредством получения олигонуклеотидов, соответствующих фрагментам или участкам каждой исходной последовательности. Каждый олигонуклеотид в одном аспекте включает уникальную область перекрывания, так что смешивание олигонуклеотидов вместе приводит к новому варианту, который имеет каждый олигонуклеотидный фрагмент, присоединенный в правильном порядке. См. также υ88Ν 09/332835.

Количество олигонуклеотидов, полученное для каждого исходного варианта взаимосвязано с общим числом конечных кроссинговеров в химерной молекуле, которая образуется в конечном итоге. Например, могут быть предоставлены три исходных варианта нуклеотидной последовательности для проведения реакции лигирования в целях нахождения химерного варианта, обладающего, например, наибольшей активностью при высокой температуре. В качестве одного примера может быть получен набор из 50 олигонуклеотидных последовательностей, соответствующих каждому участку каждого исходного варианта. Таким образом, в ходе процесса повторной сборки лигированием может произойти вплоть до 50 случаев кроссинговера в каждой химерной последовательности. Вероятность того, что каждый из полученных химерных полинуклеотидов будет содержать олигонуклеотиды из каждого исходного варианта в переменном порядке, очень низка. Если каждый олигонуклеотидный фрагмент представлен в реакции лигирования в том же молярном количестве, тогда вероятно, что в некоторых положениях олигонуклеотиды из одного и того же исходного полинуклеотида будут лигироваться друг с другом и, таким образом, не приведут к случаю кроссинговера. Если концентрация каждого олигонуклеотида из каждого источника сохраняется постоянной в ходе любой стадии лигирования в этом примере, тогда существует вероятность 1/3 (в случае 3 источников) того, что олигонуклеотид из того же исходного варианта будет лигироваться в химерную последовательность и не приведет к получению кроссинговера.

Таким образом, плотность распределения вероятностей (РБР) может быть определена для предсказания количества случаев кроссинговера, которые могут произойти в ходе каждой стадии реакции лигирования, с учетом определенного количества исходных вариантов, количества олигонуклеотидов, соответствующих каждому варианту, и концентрации каждого варианта в ходе каждой стадии реакции лигирования. Статистические и математические способы помимо определения РБР описаны ниже. Используя такие способы, можно вычислить такую плотность распределения вероятностей и, таким образом, обогатить группу химерных производных предопределенным количеством случаев кроссинговера, получаемых в результате конкретной реакции лигирования. Более того, можно определить число мишеней для случаев кроссинговера, и затем систему запрограммировать на вычисление исходных количеств каждого исходного олигонуклеотида в ходе каждой стадии реакции лигирования для вычисления плотности распределения вероятностей, которая зависит от предопределенного количества случаев кроссинговера.

Определение случаев кроссинговера

Варианты осуществления изобретения включают систему и программное обеспечение, которые дают возможность получить требуемую плотность распределения вероятностей (РБР) для кроссинговера, с числом исходных генов, предназначенных для повторной сборки, и числом фрагментов при повторной сборке в качестве входных данных. Выходные данные этой программы представляют собой фрагментую РБР, которая может быть использована для определения способа получения повторно собранных генов и для определения РБР кроссинговера этих генов. Обработку, описанную в настоящем документе, предпочтительно осуществляют в МАТБАВ® (ТНе МакНетоткк, №Нск, МаккасНикейк), языке программирования и средстве проектирования для технической обработки данных.

Повторяющиеся способы

При применении на практике данного изобретения эти способы могут быть многократно повторены. Например, некоторую нуклеиновую кислоту (или конкретную нуклеиновую кислоту), ответственную за измененный фенотип фосфолипазы, идентифицируют, повторно выделяют, снова модифицируют, повторно тестируют на наличие активности. Эти способы могут многократно повторяться до тех пор, пока не будет сконструирован желаемый фенотип. Например, в клетку способами инженерии может быть внедрен целый биохимический анаболический или катаболический путь, включая, например, активность фосфолипазы.

Аналогично, если определено, что конкретный олигонуклеотид совсем не влияет на желательное свойство (например, новый фенотип фосфолипазы), тогда он может быть удален в качестве переменной при синтезе более крупных исходных олигонуклеотидов, которые включают удаляемую последовательность. Поскольку встраивание последовательности в более крупную последовательность предотвращает любые случаи кроссинговера, то не будет больше существовать никаких вариантов этих последователь- 44 022979 ностей в производных полинуклеотидах. Эта повторяющаяся практика определения олигонуклеотидов, которые более всего соответствуют желаемому свойству и которые не соответствуют, делает возможным более эффективное исследование всех возможных вариантов белков, которые могут обеспечивать конкретное свойство или активность.

Шаффлинг ΐη νίνο

В способах по изобретению используется шаффлинг молекул ίη νί\Ό, который обеспечивает получение вариантов полипептидов по изобретению, например антител, ферментов фосфолипазы и т.п. Может быть осуществлен шаффлинг ίη νί\Ό, где используется природное свойство клеток осуществлять рекомбинацию мультимеров. Несмотря на то что рекомбинация ίη νί\Ό обеспечивает главный природный путь молекулярного разнообразия, генетическая рекомбинация остается относительно сложным способом, который включает 1) распознавание наличия гомологии; 2) расщепление цепи, вытеснение цепи и метаболические стадии, приводящие к продукции рекомбинантной хиазмы, и, наконец, 3) разделение хиазмы на отдельные рекомбинированые молекулы. Для формирования хиазмы необходимо распознавание гомологичных последовательностей.

В одном аспекте изобретение относится к способу получения гибридного полинуклеотида, по меньшей мере, из первого полинуклеотида и второго полинуклеотида. Изобретение можно использовать для получения гибридного полинуклеотида посредством введения, по меньшей мере, первого полинуклеотида и второго полинуклеотида, у которых общим является по меньшей мере один участок частичной гомологии последовательностей, в подходящую клетку-хозяин. Участки частичной гомологии последовательностей обеспечивают процесс, который приводит к реорганизации последовательностей с получением гибридного полинуклеотида. Гибридный полинуклеотид, как используют в настоящем документе, представляет собой любую нуклеотидную последовательность, которая получена способом по настоящему изобретению и содержит последовательность по меньшей мере из двух исходных полинуклеотидных последовательностей. Такие гибридные полинуклеотиды могут быть получены в результате случаев межмолекулярной рекомбинации, которые обеспечивают интеграцию последовательности между молекулами ДНК. Кроме того, такие гибридные полинуклеотиды могут быть результатом внутримолекулярной редуктивной перестройки, в которой повторяющиеся последовательности используют для изменения нуклеотидной последовательности в молекуле ДНК.

Получение вариантов последовательностей

Также изобретение относится к способам получения вариантов последовательностей нуклеиновой кислоты и последовательностей фосфолипазы по изобретению или выделения фермента фосфолипазы, например фосфолипазы с измененной последовательностью, с использованием нуклеиновых кислот и полипептидов по изобретению. В одном аспекте изобретение относится к вариантам гена фосфолипазы по изобретению, которые могут быть изменены любыми способами, включая, например, случайные или стохастические способы, или нестохастические способы, или способы направленных изменений, которые описаны выше.

Выделенные варианты могут быть вариантами природного происхождения. Вариант также может быть получен ίη уйго. Варианты можно получать с использованием способов генной инженерии, таких как сайт-направленный мутагенез, случайный химический мутагенез, делеции с экзонуклеазой III и стандартные методы клонирования. Альтернативно, такие варианты, фрагменты, аналоги или производные можно получать с использованием химического синтеза или модификаций. Другие способы получения вариантов также известны специалистам в данной области. Они включают способы, в которых последовательности нуклеиновых кислот, полученные из природных изолятов, модифицируют с получением нуклеиновых кислот, которые кодируют полипептиды, обладающие свойствами, которые повышают их ценность для промышленного или лабораторного применения. По таким методикам получают и охарактеризовывают большое количество вариантов последовательностей с одним или несколькими различиями в нуклеотидах относительно последовательности, полученной из природного изолята. Эти различия в нуклеотидах могут приводить к замене аминокислот относительно полипептидов, кодируемых нуклеиновыми кислотами из природных изолятов.

Например, варианты можно получать с использованием ПЦР с пониженной точностью. При ПЦР с пониженной точностью ПЦР осуществляют в условиях, где точность копирования ДНК-полимеразы низкая, так что по всей длине продукта ПЦР образуется большое число точковых мутаций. ПЦР с пониженной точностью описана, например, Ьеипд, ЭЛУ. е1 а1., в Тесйпище, 1:11-15, 1989 и Са16те11 К.С. & 1оусе С.Р., РСК МеШобк АррЬс, 2:28-33, 1992. В кратком изложении, по таким методикам нуклеиновые кислоты, предназначенные для внесения в них мутаций, смешивают с праймерами для ПЦР, буфером для реакции, М§С1₂, МпС1₂, Тац-полимеразой и с 6ПТР в соответствующей концентрации для достижения большого количества точковых мутаций вдоль всей длины продукта ПЦР. Например, реакцию можно проводить с использованием 20 пмоль нуклеиновой кислоты, предназначенной для внесения в нее мутаций, 30 пмоль каждого праймера для ПЦР, буфера для реакции, содержащего 50 мМ КС1, 10 мМ Тп5 НС1 (рН 8,3) и 0,01% желатин, 7 мМ М§С1₂, 0,5 мМ МпС1₂, 5 единиц Тац-полимеразы, 0,2 мМ 6СТР, 0,2 мМ 6АТР, 1 мМ 6СТР и 1 мМ 6ТТР. ПЦР проводят в течение 30 циклов, состоящих из 94°С в течение 1 мин, 45°С в течение 1 мин и 72°С в течение 1 мин. Однако следует понимать, что эти параметры могут быть

- 45 022979 изменены в соответствующих случаях. Нуклеиновые кислоты с внесенными в них мутациями клонируют в соответствующий вектор и оценивают активность полипептидов, кодируемых нуклеиновыми кислотами с внесенными в них мутациями.

Варианты также можно получать с использованием олигонуклеотид-направленного мутагенеза с получением сайт-специфических мутаций в любой представляющей интерес клонированной ДНК. Мутагенез посредством олигонуклеотидов описан, например, в Ре1б1ааг-Окоп (1988) 8с1епсе 241:53-57. В кратком изложении по таким методикам множество двухцепочечных олигонуклеотидов с одной или несколькими мутациями, предназначенными для внесения в клонированную ДНК, синтезируют и встраивают в клонированную ДНК, предназначенную для внесения в нее мутаций. Клоны, содержащие ДНК с внесенными в нее мутациями, выделяют и оценивают активность полипептидов, которые она кодирует.

Другим способом получения вариантов является объединяющая ПЦР.

Объединяющая ПЦР включает сборку продуктов ПЦР из смеси небольших фрагментов ДНК. Большое количество различных реакций ПЦР происходит параллельно в одной и той же пробирке с продуктами одной реакции, являющимися затравками для продуктов другой реакции. Объединяющая ПЦР описана, например, в патенте США № 5965408.

Еще одним способом получения вариантов является мутагенез с помощью половой ПЦР. При мутагенезе с помощью половой ПЦР ускоряется искусственная гомологичная рекомбинация ίη νίΐΓΟ между молекулами ДНК с различными, но высоко сходными последовательностями ДНК, вследствие случайной фрагментации молекулы ДНК, основанной на гомологии последовательностей, с последующим закреплением продуктов кроссинговера посредством удлинения праймеров в реакции ПЦР. Мутагенез с помощью половой ПЦР описан, например, в 81еттег (1994) Ргос. Ν;·ι11. Асаб. 8гЦ И8А, 91:10747-10751. В кратком изложении по таким методикам множество нуклеиновых кислот, предназначенных для рекомбинации, расщепляют ДНКазой с получением фрагментов со средним размером 50-200 нуклеотидов. Фрагменты с желательным средним размером очищают и ресуспендируют в смеси для ПЦР. ПЦР проводят в условиях, которые облегчают рекомбинацию между фрагментами нуклеиновых кислот. Например, ПЦР может быть проведена при ресуспендировании очищенных фрагментов в концентрации 10-30 нг/мкл в растворе с 0,2 мМ каждого бЭТР, 2,2 мМ М§С1₂, 50 мМ КС1, 10 мМ ТШ НС1, рН 9,0 и 0,1% ТгПоп Х-100. Добавляют 2,5 ед. Тад-полимеразы на 100:1 реакционной смеси и проводят ПЦР с использованием следующего режима: 94°С в течение 60 с, 94°С в течение 30 с, 50-55°С в течение 30 с, 72°С в течение 30 с (30-45 раз) и 72°С в течение 5 мин. Однако следует понимать, что эти параметры могут быть изменены соответствующим образом. В некоторых аспектах в реакции ПЦР могут быть включены олигонуклеотиды. В других аспектах может быть использован фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I в первой группе реакций ПЦР, и Тад-полимераза может быть использована в следующей группе реакций ПЦР. Рекомбинантные последовательности выделяют и оценивают активность полипептидов, которые они кодируют.

Варианты также могут быть получены посредством мутагенеза ίη νίνο. В некоторых вариантах осуществления создают случайные мутации в представляющей интерес последовательности посредством воспроизведения представляющей интерес последовательности в бактериальном штамме, таком как штамм Е. соП, который осуществляет мутации посредством одного или нескольких путей репарации ДНК. Такие штаммы-мутаторы обладают увеличенным количеством случайных мутаций по сравнению с родительским организмом дикого типа. Воспроизведение ДНК в одном из этих штаммов приведет со временем к образованию случайных мутаций в ДНК. Штаммы мутаторов, пригодные для использования в мутагенезе ίη νί\Ό, описаны, например, в публикации РСТ № \УО 91/16427.

Варианты также можно получать с использованием кассетного мутагенеза. В кассетном мутагенезе небольшой участок двухцепочечной молекулы ДНК замещается синтетической олигонуклеотидной кассетой, которая отличается от нативной последовательности. Олигонуклеотид часто содержит полностью и/или частично отобранную случайным образом нативную последовательность.

Также для получения вариантов можно использовать возвратно-множественный мутагенез. Возвратно-множественный мутагенез представляет собой алгоритм для белковой инженерии (белковый мутагенез), разработанный для получения различных групп фенотипически сходных мутантов, члены которых отличаются по аминокислотной последовательности. Для данного способа используют механизм с обратной связью для контроля успешных циклов комбинаторного кассетного мутагенеза. Возвратномножественный мутагенез описан Агкш (1992) Ргос. Ν;Π1. Асаб. 8ск И8А 89:7811-7815.

В некоторых вариантах осуществления варианты получают с использованием экспоненциальномножественного мутагенеза. Экспоненциально-множественный мутагенез представляет собой способ получения комбинаторных библиотек с большим процентным содержанием уникальных и функциональных мутантов, где небольшие группы остатков случайным образом отбираются параллельно для идентификации в каждом измененном положении аминокислот, которые приводят к функциональным белкам. Экспоненциально-множественный мутагенез описан, например, Эекд^е 8. (1993) ВюксЬпо1оду Рек., 11:1548-1552, 1993. Случайный и сайт-направленный мутагенез описаны, например, в Агпо1б Р.Н. (1993) Сиггеп! Орююп ίη ВюксЬпо1оду, 4:450-455.

В некоторых вариантах осуществления варианты создают с использованием методов шаффлинга,

- 46 022979 где часть из множества нуклеиновых кислот, которые кодируют различные полипептиды, соединяются вместе с получением химерных последовательностей нуклеиновых кислот, которые кодируют химерные полипептиды, как описано, например, в патентах США №№ 5965408; 5939250.

Изобретение также относится к вариантам полипептидов по изобретению, содержащим последовательности, в которых один или несколько аминокислотных остатков (например, иллюстративного полипептида по изобретению) заменены консервативным или неконсервативным аминокислотным остатком (например, консервативным аминокислотным остатком), и такие замененные аминокислотные остатки могут быть или не могут быть кодируемыми генетическим кодом. Консервативные замены представляют собой замены, при которых происходит замена данной аминокислоты в полипептиде другой аминокислотой со сходными свойствами. Таким образом, полипептиды по изобретению включают полипептиды с консервативными заменами в последовательностях по изобретению, включая, но не ограничиваясь ими, следующие замены: замена алифатической аминокислоты, такой как аланин, валин, лейцин и изолейцин, другой алифатической аминокислотой; замена серина треонином или наоборот; замена кислых остатков, таких как аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота, другим кислым остатком; замена остатка, несущего амидную группу, такого как аспарагин и глутамин, другим остатком несущим амидную группу; замена основного остатка, такого как лизин и аргинин, другим основным остатком; и замена ароматического остатка, такого как фенилаланин, тирозин, другим ароматическим остатком. Другие варианты представляют собой варианты, в которых один или несколько аминокислотных остатков полипептидов по изобретению включают заместитель.

Другие варианты, находящиеся в объеме изобретения, представляют собой варианты, в которых полипептид ассоциирован с другим соединением, таким как соединение, увеличивающее время полужизни полипептида, например полиэтиленгликоль.

Дополнительные варианты, находящиеся в объеме изобретения, представляют собой варианты, в которых к полипептиду присоединены дополнительные аминокислоты, такие как лидерная последовательность, секреторная последовательность, пробелковая последовательность или последовательность, которая облегчает очистку, обогащение или стабилизацию полипептида.

В некоторых аспектах варианты, фрагменты, производные и аналоги полипептидов по изобретению сохраняют такую же биологическую функцию или активность, что и у иллюстративных полипептидов, например активность фосфолипазы, как описано в настоящем документе. В других аспектах вариант, фрагмент, производное или аналог включает пробелок, так что вариант, фрагмент, производное или аналог может быть активирован при отщеплении участка пробелка с получением активного полипептида.

Оптимизация кодонов для достижения высокого уровня экспрессии белка в клетке-хозяине

Изобретение относится к способам модификации кодирующих фосфолипазу нуклеиновых кислот для модификации использования кодонов. В одном аспекте изобретение относится к способам модификации кодонов в нуклеиновой кислоте, кодирующей фосфолипазу, для повышения или снижения экспрессии в клетке-хозяине. Изобретение также относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим фосфолипазу, модифицированным для повышения их экспрессии в клетке-хозяине, к ферментам фосфолипазам, модифицированным таким образом, и к способам получения модифицированных ферментов фосфолипаз. Способ включает идентификацию непредпочтительного или менее предпочтительного кодона в кодирующей фосфолипазу нуклеиновой кислоте и замену одного или нескольких из непредпочтительных или менее предпочтительных кодонов предпочтительным кодоном, кодирующим ту же аминокислоту, что и замененный кодон, так, чтобы по меньшей мере один непредпочтительный кодон или менее предпочтительный кодон в нуклеиновой кислоте был заменен предпочтительным кодоном, кодирующим туже аминокислоту. Предпочтительный кодон представляет собой кодон, часто встречающийся в кодирующих последовательностях генов в клетке-хозяине, и непредпочтительный или менее предпочтительный кодон представляет собой кодон, редко встречающийся в кодирующих последовательностях генов в клетке-хозяине.

Клетки-хозяева для экспрессии нуклеиновых кислот, экспрессирующих кассет и векторов по изобретению включают клетки бактерий, дрожжей, грибов, клетки растений, клетки насекомых и клетки млекопитающих. Таким образом, изобретение относится к способам оптимизации использования кодонов во всех указанных клетках, где нуклеиновые кислоты и полипептиды с измененными кодонами получают с помощью нуклеиновых кислот с измененными кодонами. Иллюстративные клетки-хозяева включают грамотрицательные бактерии, такие как ЕксЬегЫйа со!; грамположительные бактерии, такие как любые ВасШик (например, В. сегеик) З1гер1отусек, ЬасФЬасШик даккеп, ЬасФсосспк 1асйк, БасЮсосснк сгетопк, ВасШик киЬйНк. Иллюстративные клетки-хозяева также включают эукариотические организмы, например различные дрожжи, такие как ЗассЬаготусек кр., включая ЗассЬаготусек сегеуыае, ЗсЫ/окассЬаготусек ротЬе, РюЫа ракЮпк и Ыиууеготусек 1асЬк, Ш^епЛа ро1утогрЬа, АкрегдШик тдег, клетки и клеточные линии млекопитающих и клетки и клеточные линии насекомых. Таким образом, изобретение также относится к нуклеиновым кислотам и полипептидам, оптимизированным для экспрессии в указанных организмах и видах.

Например, кодоны кодирующей фосфолипазу нуклеиновой кислоты, выделенной из бактериальной клетки, модифицируют таким образом, чтобы нуклеиновая кислота оптимально экспрессировалась в бак- 47 022979 териальной клетке, отличной от бактерий, из которых фосфолипаза происходит, в клетке дрожжей, грибов, в клетке растений, клетке насекомых или клетке млекопитающих. Способы оптимизации кодонов хорошо известны в данной области, см., например, патент США № 5795737; Васа (2000) 1п1. 1. Рага8Йо1., 30:113-118; На1е (1998) РЮеш Ехрг. РипГ., 12:185-188; Хапни (2001) 1пГеск 1ттип., 69:7250-7253. См. а18о Хагит (2001) 1пГес!. 1ттип., 69:7250-7253, где описаны оптимизированные кодоны в мышиных системах; ОйсЬкоиют (2002) Рго1еш Ехрг. РипГ, 24:18-24, где описаны оптимизированные кодоны у дрожжей; Репд (2000) Вюскет18ку, 39:15399-15409, где описаны оптимизированные кодоны в Е. сок; Нитркгеу8 (2000) Рго1еш Ехрг. РикГ., 20:252-264, где описано использование оптимизированных кодонов, которые влияют на секрецию в Е. со11.

Трансгенные животные, не относящиеся к человеку

Изобретение относится к трансгенным животным, не относящимся к человеку, содержащим нуклеиновую кислоту, полипептид, экспрессирующую кассету или вектор или трансфицированную или трансформированную клетку по изобретению. Трансгенные животные, не относящиеся к человеку, могут представлять собой, например, коз, кроликов, овец, свиней, коров, крыс и мышей, содержащих нуклеиновые кислоты по изобретению. Эти животные могут быть использованы, например, в качестве моделей ш νί\Ό для исследования активности фосфолипазы или в качестве моделей для скрининга модуляторов активности фосфолипазы. Кодирующие последовательности полипептидов, предназначенные для экспрессии в трансгенных животных, не относящихся к человеку, могут быть сконструированы конститутивными или находящимися под контролем тканеспецифичных, специфичных для стадий развития или индуцибельных факторов регуляции транскрипции. Трансгенные животные, не относящиеся к человеку, могут быть разработаны и получены с использованием любого способа, известного в данной области; см., например, патенты США №№ 6211428; 6187992; 6156952; 6118044; 6111166; 6107541; 5959171; 5922854; 5892070; 5880327; 5891698; 5639940; 5573933; 5387742; 5087571, где описано получение и использование трансформированных клеток и яйцеклеток и трансгенных мышей, крыс, кроликов, овец, свиней и коров. См. также, например, Ро11оск (1999) 1. 1ттипо1. Ме11юй8, 231:147-157, где описано получение рекомбинантных белков в молоке у трансгенных молочных животных; Вадш81 (1999) N31. Вю1есНпо1., 17:456-461, где демонстрируется получение трансгенных коз. В патенте США № 6211428 описано получение и использование трансгенных млекопитающих, не относящихся к человеку, в головном мозге которых экспрессируется конструкция нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность ДНК. В патенте США № 5387742 описана инъекция клонированных рекомбинантных или синтетических последовательностей ДНК в оплодотворенную мышиную яйцеклетку, имплантация инъецированных яйцеклеток в ложнобеременных самок и выращивание до рождения трансгенных мышей, клетки которых экспрессируют белки, связанные с патологией при болезни Альцгеймера. В патенте США № 6187992 описано получение и использование трансгенной мыши, геном которой содержал поломку в гене, кодирующем белок-предшественник амилоида (АРР).

Для осуществления способов по изобретению также можно использовать животных с нокаутом. Например, в одном аспекте трансгенные или модифицированные животные по изобретению включают животное с нокаутом, например мышь с нокаутом, полученную способами инженерии, для того, чтобы не происходило экспрессии или чтобы они не были способны экспрессировать фосфолипазу.

Трансгенные растения и семена

Изобретение относится к трансгенным растениям и семенам, содержащим нуклеиновую кислоту, полипептид (например, фосфолипазу), экспрессирующую кассету или вектор или трансфецированную или трансформированную клетку по изобретению. Изобретение также относится к растительным продуктам, например маслам, семенам, листьям, экстрактам и т.п., содержащим нуклеиновую кислоту и/или полипептид (например, фосфолипазу) по изобретению. Трансгенное растение может быть двудольным (йюо1) или однодольным растением (топосо!). Изобретение также относится к способам получения и использования указанных трансгенных растений и семян. Трансгенное растение или клетка растения, экспрессирующие полипептид по изобретению, могут быть сконструированы в соответствии с любым способом, известным в данной области. См., например, патент США № 6309872.

Нуклеиновые кислоты и экспрессирующие конструкции по изобретению можно вводить в клетку растений любыми способами. Например, нуклеиновые кислоты или экспрессирующие конструкции могут встраиваться в геном желаемого растительного хозяина, или нуклеиновые кислоты или экспрессирующие конструкции могут представлять собой эписомы. Встраивание в геном желаемого растения может быть таким, чтобы продуцирование фосфолипазы регулировалась эндогенными элементами контроля транскрипции и/или трансляции хозяина. Изобретение также относится к растениям с нокаутом, где вставка последовательности гена, например, посредством гомологичной рекомбинации, нарушает экспрессию эндогенного гена. Способы получения растений с нокаутом хорошо известны в данной области, см., например, 8керр (1998) Ргос. №к. Асай. 8с1, И8А, 95:4368-4373; М1ао (1995) Р1ап1 1., 7:359-365. См. описание трансгенных растений ниже.

Нуклеиновые кислоты по изобретению можно использовать для придания желаемых свойств, по существу, любому растению, например растениям, содержащим масличные семена, таким как рис, соя, рапс, подсолнух, кунжут и арахис. Нуклеиновые кислоты по изобретению можно использовать для

- 48 022979 управления метаболическими путями растений в целях оптимизации или изменения экспрессии фосфолипазы. Это может изменять активность фосфолипазы в растении. Альтернативно, фосфолипазу по изобретению можно использовать для получения трансгенного растения для продуцирования соединения, которое в природе растением не продуцируется. Это может привести к снижению стоимости продукции или к получению нового продукта.

В одном аспекте первая стадия получения трансгенного растения включает получение экспрессирующей конструкции для экспрессии в клетке растений. Эти технологии хорошо известны в данной области. Они могут включать выбор и клонирование промотора кодирующей последовательности для облегчения связывания рибосом с мРНК и выбор подходящей последовательности терминатора гена. Одним иллюстративным конститутивным промотором является СаМУ358 из вируса мозаики цветной капусты, который, как правило, вызывает высокий уровень экспрессии в растениях. Другие промоторы являются более специфичными и отвечают на сигнал из внутренней и наружной окружающей среды растения. Иллюстративным индуцируемым светом промотором является промотор гена саЬ, кодирующего основной связывающий хлорофилл а/Ь белок.

В одном аспекте нуклеиновую кислоту модифицируют для достижения более высокой экспрессии в клетке растений. Например, последовательность по изобретению может иметь более высокое процентное содержание нуклеотидных пар А-Т по сравнению с содержанием, которое обнаруживается в растении, в некоторых из которых преобладают нуклеотидные пары О-С. Таким образом, нуклеотиды А-Т в кодирующей последовательности можно заменять нуклеотидами О-С без значительного изменения аминокислотной последовательности для повышения продуцирования продукта гена в клетках растений.

Для идентификации клеток растений или ткани, в которых успешно интегрировался трансген в конструкцию гена, может быть добавлен ген селективного маркера. Это может быть необходимым, поскольку достижение встраивания и экспрессии генов в клетках растений является редким случаем, происходящим только в нескольких процентах тканей-мишеней или клеток-мишеней. Гены селективных маркеров кодируют белки, которые придают устойчивость к средствам, которые обычно токсичны для растений, таким как противомикробные средства или гербициды. Только те клетки растений, которые обладают встроенным геном селектируемого маркера, выживают при выращивании на среде, содержащей соответствующее противомикробное средство или гербицид. Как и в случае других встраиваемых генов, для правильного функционирования маркерных генов также необходимы промоторная и терминаторная последовательности.

В одном аспекте получение трансгенных растений или семян включает встраивание последовательности по изобретению и, необязательно, маркерных генов в выбранную экспрессирующую конструкцию (например, плазмиду) совместно с внесением промоторной и терминаторной последовательностей. Это может включать перенос модифицированного гена в растение с помощью приемлемого способа. Например, конструкция можно встраивать непосредственно в геномную ДНК клетки растений с использованием способов, таких как электропорация и микроинъекция в протопласты клетки растений, или конструкции можно вводить непосредственно в ткань растения с использованием баллистических способов, таких как бомбардировка частицами ДНК. Например, см., например, Скп8кои (1997) Р1ап1 Мо1. Вю1., 35:197203; Раи1о\\8к1 (1996) Мо1. Вюкескпок, 6:17-30; К1еш (1987) Νβίυιβ, 327:70-73; Такит (1997) Оепе8 Оепек. 8у8к., 72:63-69, где обсуждается использование бомбардировки частицами для введения трансгенов в пшено; и Айат (1997) выше использования бомбардировки частицами для введения ΥАС в клетки растений. Например, КшекаР (1997) выше использовал бомбардировку частицами для получения трансгенных хлопковых растений. Устройство для ускорения частиц описано в патенте США № 5015580; и коммерчески доступным является устройство для ускорения частиц ВюКай (ВюН8рс8) РЭ8-2000; см. также йокп, патент США № 5608148 и ЕШ8, патент США № 5681730, где описана опосредуемая частицами трансформация голосемянных.

В одном аспекте протопласты можно иммобилизовывать и инъецировать нуклеиновыми кислотами, например экспрессирующей конструкцией. Несмотря на то что регенерация из протопластов не является легкой для зерновых, регенерация растений возможна в бобовых с использованием соматического эмбриогенеза из каллюса, полученного из протопласта. Сформированные можно трансформировать депротеинизированной ДНК с использованием технологии с генной пушкой, где ДНК покрывают вольфрамовыми быстролетящими микрочастицами, пробивающими 1/100 размера клетки, что приводит к переносу ДНК глубоко в клетки и органеллы. Затем в трансформированной ткани индуцируется регенерация, как правило, посредством соматического эмбриогенеза. Этот способ оказался успешным для некоторых видов зерновых, включая маис и рис.

Нуклеиновые кислоты, например, экспрессирующие конструкции, также можно вводить в клетки растений с использованием рекомбинантных вирусов. Клетки растений можно трансформировать с использованием вирусных векторов, таких как, например, векторы, полученные из вируса табачной мозаики (Коииепйа1 (1997) Р1апк Мо1. Вю1., 33:989-999), см. РоРа (1996) И8е ок \Ра1 герксои8 ког кке ехрге88юп ок депе8 ш р1ап18, Мо1. Вюкескпок, 5:209-221.

Альтернативно, нуклеиновые кислоты, например, экспрессирующие конструкции, можно комбинировать с подходящими фланкирующими участками Т-ДНК и вводить в традиционный вектор-хозяин

- 49 022979

Αд^οЬас!е^^ит ШтеГааепк. Функция вирулентности хозяина Αд^οЬас!е^^ит !итеГас1епк направляет вставку конструкции и соседнего маркера в ДНК клетки растения при инфицировании клетки бактериями. Способ трансформации, опосредованный Αд^οЬас!е^^ит ШтеГаиепк, включая нейтрализацию и использование бинарных векторов, подробно описан в научной литературе. См., например, НогксЬ (1984) δάепсе, 233:496-498; Рга1еу (1983) Ργόο. №И. Αсай. δΥ. υδΑ, 80:4803 (1983); Оепе ^апк^т !о Ρ1;·πιΐ5. Ρο!гукик, ей. ^ргшдег-Уег1ад, Βе^1^η 1995). ДНК в клетке Α. ШтеГаиепк находится в бактериальной хромосоме, а также в другой структуре, известной как Τί-плазмида (индуцирующая опухоль). Τί-плазмида содержит участок ДНК, называемый Т-ДНК (длина -20 т.п.н.), который переносится в клетку растений в процессе инфекции, и набор генов νίτ (вирулентность), которые управляют процессом инфекции. Α. !итеГааепк может инфицировать растение только через повреждения: при повреждении корня или стебля оно подает определенные химические сигналы, в ответ на которые активируются гены νίτ Α.

и они направляют ряд событий по переносу Т-ДНК из Τί-плазмиды в хромосому растения.

Затем Т-ДНК проникает в клетку растений через повреждение. Существует предположение, что Т-ДНК ждет репликации и транскрипции ДНК растения, а затем встраивается в доступную ДНК растения. Для того чтобы использовать Α. ФтеГааепк в качестве трансгенного вектора, необходимо удалить индуцирующий опухоль фрагмент Т-ДНК при сохранении краевых участков Т-ДНК и генов νίτ. Затем встраивают трансген между краевыми участками Т-ДНК, где он перемещается в клетку растений и встраивается в хромосомы растений.

Изобретение относится к трансформации однодольных растений с использованием нуклеиновых кислот по изобретению, включая основные злаковые, см. №е1 (1997) ΡΡιιιΙ Μο1. ΒΟΡ, 35:205-218. См. также, например, НогксЬ, δ№ιτ^ (1984) 233:496; Рта1еу (1983) Ριτκ. Ν;·ιΐ1. Αсай. δοΐ, υδΑ, 80:4803; ΤΙινΡ_)ает (1997) выше; Ρ;·ιγ1< (1996) ΡΡιιιΙ Μο1. Β^Ρ, 32:1135-1148, где описано встраивание Т-ДНК в геномную ДНК. См. также П'На11шп, патент США № 5712135, где описан способ стабильного встраивания ДНК, содержащей ген, который является функциональным в клетке зерновых или других однодольных растений.

В одном аспекте третья стадия может включать селекцию и регенерацию всех растений, способных передавать встроенный целевой ген следующему поколению. Такие способы регенерации основаны на методиках с определенными фитогормонами в среде для выращивания культуры ткани, как правило, на основе биоцидного и/или гербицидного маркера, который вводится вместе с желательными нуклеотидными последовательностями. Регенерация растений из культивированных протопластов описана Етапк е! а1., в Ρι^ι^Ρ^^ 1ко1айоп апй Си1!иге, НапйЬоок оГ ΡΡιιιΙ Се11. Си1!иге, р. 124-176, ΜасΜ^1Шаη Ρι^ίδΐικ^ Сотрапу, №ν Уогк, 1983 и Βί^ί^, Кедепетайоп оГ ΡΡιπΙδ, ΡΡιιιΙ Ρ^ο!οр1а8!8, р. 21-73, СКС ΡϊΌδδ, Βοса Ка!оп, 1985. Регенерации также можно добиться из каллюса растений, эксплантатов, органов или их частей. Такие способы регенерации описаны, главным образом, К1ее (1987) в Αηη. Реу. оГ ΡΡιιιΙ ΡΡγδ., 38:467-486. Для получения целых растений из трансгенных тканей, таких как незрелые зародыши, они могут быть выращены под контролем окружающих условий на ряде сред, содержащих пищевые добавки и гормоны, по способу, известному как культура тканей. После получения целого растения и получения семян начинается оценка потомства.

После того как экспрессирующая кассета стабильно встроена в трансгенные растения, ее можно вводить в другие растения посредством полового скрещивания. Можно использовать любой из различных стандартных способов выведения в зависимости от вида, предназначенного для скрещивания. Поскольку трансгенная экспрессия нуклеиновых кислот по изобретению приводит к изменениям фенотипа, то можно осуществить половое скрещивание растений, содержащих рекомбинантные нуклеиновые кислоты по изобретению, со вторым растением для получения конечного продукта. Таким образом, семя по изобретению может быть получено при скрещивании двух трансгенных растений по изобретению или при скрещивании растения по изобретению и другого растения. Желаемые эффекты (например, экспрессия полипептидов по изобретению с получением растения, в котором изменен характер цветения) могут быть усилены, если оба родительских растения экспрессируют полипептиды (например, фосфолипазу) по изобретению. Желаемые эффекты могут быть переданы последующим поколениям растений стандартными способами размножения.

Нуклеиновые кислоты и полипептиды по изобретению экспрессируются в любом растении или семени или встроены в него. Трансгенные растения по изобретению могут представлять собой двудольные или однодольные растения. Примерами однодольных трансгенных растений по изобретению являются травы, такие как мятлик луговой (мятлик, Роа), кормовая трава, такая как овсянница, райграс, медленно растущая трава, такая как Αд^ο8!^8, и зерновые, например пшеница, овес, рожь, ячмень, рис, сорго и маис (кукуруза). Примерами двудольных трансгенных растений по изобретению являются табак, бобовые, такие как люпины, картофель, свекла сахарная, горох, фасоль и соя, и крестоцветные растения (семейство Β^а88^сасеае), такие как цветная капуста, рапс и близко родственная модель организма Α^аЬ^йοр8^8 !йайапа. Таким образом, трансгенные растения и семена по изобретению включают широкий диапазон растений, включая, но не ограничиваясь ими, виды из родов Αηаса^й^ит, Α^асЬ^8, Α8ра^ади8, Αύ-ора, Ανеηа, Β^а88^са, СПгик, Сйгийик, Сарккит, СайЬатик, Сосок, СоГГеа, Сисии-ик, СиситЬйа, Оаисик, Е1ае1к, Ргадапа, О1усше, Ооккуршт, НеПапЙшк, Не!егосаШк, Ногйеит, Нуоксуатик, Ьас!иса, Ыпит, БоПит,

- 50 022979

Ьиршик, Ьусорег81соп, Ма1и8, Матйой Ма)огапа, Мебюадо, №сойапа, О1еа, Огу/а, Ратеит, Рапшкеипп, Регкеа, Рйа8ео1и8, Р181ас1йа, Р18ит, Руги8, Ргипи8, Карйапи8, К1сти8, 8еса1е, 8епесю, 8тар18, 8о1агшт, 8огдйит, ТйеоЬготи8, ТпдопеПа, ТтШсит, УШа, УЙ18, У1дпа и 2еа.

В альтернативных вариантах осуществления нуклеиновые кислоты по изобретению экспрессируются в растениях (например, в трансгенных растениях), таких как растения, содержащие масличные семена, например, рис, соя, рапс, подсолнух, кунжут и арахис. Нуклеиновые кислоты по изобретению можно экспрессировать в растениях, которые содержат волокнистые клетки, включая, например, хлопок, хлопковое дерево (капок, Се1йа реШапбга), иву пустынную, креозотовый куст, терескен шерстистый, бальзу, рами, кенаф, коноплю, розель, джут, сизаль, абаку и лен. В альтернативных вариантах осуществления трансгенные растения по изобретению могут являться членами рода Оо88уршт, включая члены любого из видов Оо88уршт, такие как Ο. агйогеит; Ο. йегЬасеит, Ο. ЬагЬа6еп8е и Ο. Й1Г8и1ит.

Изобретение также относится к трансгенным растениям, предназначенным для использования при получении больших количеств полипептидов (например, фосфолипазы или антител) по изобретению. Например, см. Ра1тдгеп (1997) Тгепб8 Оепей, 13:348; Сйопд (1997) Тгапядетс Ке8., 6:289-296 (где продуцируется человеческий белок молока β-казеин в трансгенных растениях картофеля с использованием ауксин-индуцируемого двунаправленного промотора маннопин-синтеназы (та81',2') с опосредуемыми ЛдгоЬас1егшт 1птеГас1еп8 способами трансформации в пластинке листа).

Используя известные методики, специалист в данной области может проводить отбор растений по изобретению, определяя повышение или снижение количества трансгенной мРНК или белка в трансгенном растении. Средства для определения и количественной оценки мРНК или белков хорошо известны в данной области.

Полипептиды и пептиды

Изобретение относится к выделенным, синтетическим или рекомбинантным полипептидам, обладающим идентичностью последовательностей (например, по меньшей мере приблизительно 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более или полной (100%) идентичностью последовательностей) с иллюстративной последовательностью по изобретению, например 8ЕЦ ГО Ν0: 6, имеющей одно или несколько изменений последовательности (например, мутаций), как указано в табл. 12-15, как рассмотрено в примере 3 ниже, или их ферментативно активным фрагментам.

Как рассмотрено выше, идентичность может быть на протяжении всей длины полипептида или идентичность может быть на протяжении ее подпоследовательности, например области по меньшей мере приблизительно из 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700 или более остатков. Полипептиды по изобретению также могут быть короче, чем полная длина иллюстративных полипептидов. В альтернативном варианте осуществления изобретение относится к полипептидам (пептидам, фрагментам) с размером в диапазоне от 5 остатков до полной длины полипептида, например фермента, такого как фосфолипаза, например фосфолипаза; иллюстративные размеры составляют приблизительно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400 или более остатков, например, последовательно расположенных остатков иллюстративных фосфолипаз. Пептиды по изобретению могут быть пригодны, например, в качестве зондов для мечения, антигенов, толерогенов, мотивов, активных центров фосфолипазы, связывающих доменов, регуляторных доменов и т.п.

В одном аспекте изобретение относится к полипептидам, имеющим последовательности, как указано в 8ЕЦ ГО Ν0: 6, содержащим (и имеющим) одно или несколько изменений аминокислот (например, мутаций), как указано в табл. 12-15, и их подпоследовательности, например их активные центры (каталитические домены), обладающие активностью фосфолипазы, например активностью фосфолипазы С (РЬС), например активностью Р1-РЬС. В одном аспекте полипептид обладает активностью фосфолипазы, но лишен активности гидролиза нейтралных масел (триглицеридов). Например, в одном аспекте полипептид обладает активностью фосфолипазы, но лишен какой-либо активности, которая влияет на фракцию нейтральных масел (триглицеридов). В одном аспекте изобретение относится к процессу рафинирования, включающему применение полипептида по изобретению, обладающего активностью фосфолипазы, но не активностью липазы.

Как используют в настоящем документе, термины аминокислота или аминокислотная последовательность относятся к олигопептиду, пептиду, полипептиду или белковой последовательности или к фрагменту, участку или субъединице любого из них и к природным или синтетическим молекулам.

Как используют в настоящем документе, термины полипептид и белок относятся к аминокислотам, соединенным друг с другом пептидными связями или модифицированными пептидными связями, т.е. к изостерическим пептидам, и может содержать модифицированные аминокислоты, отличные от 20 кодируемых генами аминокислот. Термин полипептид также включает пептидные и полипептидные фрагменты, мотива и т.п. Также термин включает гликозилированные полипептиды. Пептиды и полипептиды по изобретению также включают все формы миметиков и пептидомиметиков, как подробнее описано ниже.

Как используют в настоящем документе, термин выделенный означает, что материал извлечен из

- 51 022979 его естественного окружения (например, из природного окружения, если он является встречающимся в природе). Например, встречающийся в природе полинуклеотид или полипептид, находящийся в живом животном, не является выделенным, но тот же полинуклеотид или полипептид, отделенный от некоторых или всех сосуществующих веществ в природной системе, является выделенным. Такие полинуклеотиды могут являться частью вектора и/или такие полинуклеотиды или полипептиды могут являться частью композиции и все-таки быть выделенными, поскольку такой вектор или композиция не являются частью их природного окружения. Как используют в настоящем документе, термин очищенный не подразумевает абсолютной чистоты; скорее, он подразумевается как относительное определение. Отдельные нуклеиновые кислоты, полученные из библиотеки, традиционно очищают до электрофоретической гомогенности. В альтернативных аспектах изобретение относится к нуклеиновым кислотам, очищенным от остальной геномной ДНК или от других последовательностей в библиотеке или другой окружающей среде по меньшей мере на один, два, три, четыре, пять или более порядков величины.

Полипептиды и пептиды по изобретению можно выделять из природных источников, они могут быть синтетическими или они могут представлять собой полученные рекомбинантными способами полипептиды. Пептиды и белки можно рекомбинантно экспрессировать ίη уйго или ίη угуо. Пептиды и полипептиды по изобретению можно получать и выделять с использованием любого способа, известного в данной области. Полипептид и пептиды по изобретению также можно синтезировать, целиком или частично, с использованием химических способов, хорошо известных в данной области. См., например, СагиШеге (1980) №с1ею Ааб. Ке8. 8ушр. 8ег., 215-223; Нот (1980) №с1ею Лаб Ке8. 8ушр. 8ег., 225-232; Ванда А.К., Тйегареийс Рер11без анб РгоЮпъ, РогшиПйоп, Ргосе88шд анб Эейуегу 8у§1еш8 (1995) ТесНпош1с РнЫЕНтд Со., ^аηса8ΐе^, РА. Например, синтез пептида можно проводить с использованием различных твердофазных способов (см., например, КоЬегде (1995) 8аепсе 269:202; Метйе1б (1997) МеШобк Еп7ушо1., 289:3-13) и можно применять автоматический синтез, например, с использованием АВ1 431 А Рерйбе 8уШ11е51/ег (Регкш Е1шег) в соответствии с инструкциями, предоставляемыми изготовителем.

Пептиды и полипептиды по изобретению также могут быть гликозилированными. Гликозилирование может быть добавлено посттрансляционно либо химически, либо клеточными биосинтетическими механизмами, где последние включают использование известных мотивов гликозилирования, которые могут быть нативными в последовательности, или могут быть добавлены в виде пептида, или могут быть добавлены в кодирующую последовательность нуклеиновой кислоты. Гликозилирование может представлять собой О-гликозилирование или ^гликозилирование.

Пептиды и полипептиды по изобретению, как определено выше, включают все формы миметиков и пептидомиметиков. Термины миметик и пептидомиметик относятся к синтетическому химическому соединению, которое обладает, по существу, такими же структурными и/или функциональными характеристиками, что и полипептиды по изобретению. Миметик может либо целиком состоять из синтетических, неприродных аналогов аминокислот, либо он представляет собой химерную молекулу частично с аминокислотами природных пептидов и частично с аналогами аминокислот. Миметик также может включать любое количество консервативных замен природных аминокислот, поскольку такие замены также, по существу, не изменяют структуру и/или активность миметика. Как в случае полипептидов по изобретению, которые представляют собой консервативные варианты, общепринятые способы экспериментирования позволяют определить, что миметик входит в объем данного изобретения, т.е. что его структура и/или функция, по существу, не изменены. Таким образом, в одном аспекте композиция миметика находится в объеме изобретения, если он обладает активностью фосфолипазы.

Композиции миметиков полипептидов по изобретению могут содержать любую комбинацию неприродных структурных компонентов. В альтернативном аспекте композиции миметиков по изобретению включают одну или все из следующих трех структурных групп: а) группы со связью с остатками, отличной от природной амидной связи (пептидная связь); Ь) неприродные остатки вместо природных аминокислотных остатков или с) остатки, которые приводят к вторичной структурной мимикрии, т.е. к индуцированию или стабилизации вторичной структуры, например конформации β-петли, γ-петли, βслоя, α-спирали и т.п. Например, полипептид по изобретению может быть охарактеризован как миметик, если все или некоторые его остатки присоединены химическими способами, отличными от природных пептидных связей. Отдельные остатки пептидомимика могут быть соединены пептидными связями, другими химическими связями или способами конденсации, такими как, например, в случае глутаральдегида, сложных эфиров Югидроксисукцинимида, бифункциональных малеинимидов, Н'Ы'-дициклогексилкарбодиимида (ЭСС) или Ю№-диизопропилкарбодиимида (Э1С). Присоединенные группы, которые могут быть альтернативными традиционной амидной связи (пептидной связи), включают, например, кетометилен (например, -С(=О)-СН2- для -С(=О)-МН-), аминометилен (СН2-МН), этилен, олефин (СН=СН), простой эфир (СН2-О), тиоэфир (СН2-8), тетразол (СШ-), тиазол, ретроамид, тиоамид или сложный эфир (см., например, 8ра1о1а (1983) в СНепиМгу апб ВюсНениМгу о£ Ашшо аабх Рер11без апб РгоЮпъ, уо1. 7, р. 267-357, Рерйбе ВаскЬоге МобЛ^а^^, Магсе11 Эеккег, №У).

Полипептид по изобретению также может быть охарактеризован в качестве миметика по наличию всех или нескольких неприродных остатков на месте природных аминокислотных остатков. Неприрод- 52 022979 ные остатки полностью описаны в научной и патентной литературе; некоторые иллюстративные неприродные композиции, подходящие в качестве миметиков природных аминокислотных остатков и руководства, описаны ниже. Миметики ароматических аминокислот могут быть получены заменой, например, Б- или Ь-нафтилаланином; Б- или Ь-фенилглицином; Б- или Ь-2-тиенилаланином; Б- или Ь-1, -2,3- или 4-пиренилаланином; Б- или Ь-3-тиенилаланином; Б- или Ь-(2-пиридинил)аланином; Б- или Ь-(3пиридинил)аланином; Б- или Ь-(2-пиразинил)аланином; Б- или Ь-(4-изопропил)фенилглицином; Б(трифторметил)фенилглицином; Б-(трифторметил)фенилаланином; Б-п-фторфенилаланином; Б- или Ьп-бифенилфенилаланином; Б- или Ь-п-метоксибифенилфенилаланином; Б- или Ь-2-индол(алкил)аланинами и Б- или Ь-алкиламинами, где алкил может представлять собой замещенный или незамещенный метил, этил, пропил, гексил, бутил, пентил, изопропил, изобутил, вторичный изобутил, изопентил или некислотные аминокислоты. Ароматические кольца неприродных аминокислот включают, например, ароматические кольца тиазолила, тиофенила, пиразолила, бензимидазолила, нафтила, фуранила, пирролила и пиридила.

Миметики кислых аминокислот можно получать заменой, например, некарабоксилатными аминокислотами при сохранении отрицательного заряда; (фосфоно)аланином; сульфатированным треонином. Карбоксильные боковые группы (например, аспартильная или глутамильная) также могут быть селективно модифицированными посредством реакции с карбоимидами (К'-К-С-К-К.'), такими как, например,

1- циклогексил-3-(2-морфолинил-(4-этил)карбодиимид или 1-этил-3-(4-азоний-4,4-диметилпентил)карбодиимид. Аспартил или глутамил также могут быть превращены в остатки аспарагинила и глутаминила реакцией с ионами аммония. Миметики основных аминокислот могут быть получены заменой, например, (в дополнение к лизину и аргинину) аминокислот орнитином, цитруллином или гуанидинуксусной кислотой или гуанидиналкилуксусной кислотой, где алкил определен выше. Производным нитрила (например, содержащим С№группу вместо СООН) можно заменить аспарагин или глутамин. Остатки аспарагинила и глутаминила могут быть дезаминированы до соответствующих остатков аспартила или глутамила. Миметики аргининовых остатков могут быть получены реакцией аргинила, например, с одним или несколькими общепринятыми реагентами, включая, например, фенилглиоксаль, 2,3бутандион, 1,2-циклогександион или нингидрин, предпочтительно в щелочных условиях. Миметики остатка тирозина могут быть получены реакцией тирозила, например, с ароматическими соединениями диазония или тетранитрометаном. ^ацетилимидазол и тетранитрометан могут быть использованы для образования О-ацетилтирозильных продуктов и 3-нитропроизводных соответственно. Миметики остатка цистеина могут быть получены реакцией остатков цистеинила, например, с α-галоацетатами, такими как

2- хлоруксусная кислота или хлорацетамид, и соответствующими аминами; с получением карбоксиметильных или карбоксиамидометильных производных. Миметики цистеиновых остатков также могут быть получены реакцией остатков цистеинила, например, с бромтрифторацетоном, α-бромв-(5-имидозоил)пропионовой кислотой; хлорацетилфосфатом, ^алкилмилеинимидами, 3-нитро-2пиридилдисульфидом; метил-2-пиридилдисульфидом; п-хлорртутьбензоатом; 2-хлорртуть-4нитрофенолом или хлор-7-нитробензоокса-1,3-диазолом. Миметики лизина могут быть получены (и N концевые остатки могут быть изменены) реакцией лизинила, например, с ангидридом янтарной или другой карбоновой кислоты. Лизин и другие α-аминосодержащие остатки также могут быть получены реакцией с имидоэфирами, такими как метилпиколинимидат, пиридоксальфосфат, пиридоксаль, хлорборгидрид, тринитробензолсульфоновая кислота, О-метилизомочевина, 2,4-пентандион, и реакцией с глиоксилатом, катализируемой трансамидазой. Миметики метионина могут быть получены реакцией, например, с сульфоксидом метионина. Миметики пролина включают, например, пипеколиновую кислоту, тиазолидинкарбоновую кислоту, 3- или 4-гидроксипролин, дегидропролин, 3- или 4-метилпролин или 3,3диметилпролин. Миметики гистидиновых остатков могут быть получены реакцией гистидила, например, с диэтилпрокарбонатом или парабромфенацилбромидом. Другие миметики включают, например, миметики, полученные гидроксилированием пролина и лизина; фосфорилированием гидроксильных групп остатков серила или треонила; метилированием α-аминогрупп лизина, аргинина и гистидина; ацетилированием ^концевого амина; метилированием остатков амида главной цепи или заменой N метиламинокислотами; или амидированием С-концевых карбоксильных групп.

Остаток полипептида, например аминокислота, по изобретению также может быть заменен аминокислотой (или остатком пептидомиметика) с противоположной хиральностью. Таким образом, любая аминокислота, встречающаяся в природе в Ь-конфигурации (которая также может называться К или 8 в зависимости от целостной химической структуры), может быть заменена аминокислотой такого же структурного типа или пептидомиметиком, но с противоположной хиральностью, называемой Баминокислотой, но также может называться К- или 8-формой.

Изобретение также относится к способам модификации полипептидов по изобретению либо посредством природных процессов, таких как посттрансляционный процессинг (например, фосфорилирование, ацилирование и т.д.), либо посредством способов химической модификации и полученных модифицированных полипептидов. Модификации можно осуществлять на любом участке полипептида, включая остов пептида, боковые цепи аминокислот и N или С-концы. Следует понимать, что один и тот

- 53 022979 же тип модификации может быть выражен в той же или другой степени в разных участках данного полипептида. Также данный полипептид может иметь многие типы модификаций. Модификации включают ацетилирование, ацилирование, АЭР-рибозилирование, амидирование, ковалентное присоединение флавина, ковалентное присоединение группы гема, ковалентное присоединение нуклеотида или производного нуклеотида, ковалентное присоединение липида или производного липида, ковалентное присоединение фосфатидилинозитола, циклизацию с образованием поперечных связей, образование дисульфидной связи, деметилирование, образование ковалентных поперечных связей, образование цистеина, образование пироглутамата, формилирование, γ-карбоксилирование, гликозилирование, образование ОР1-якоря, гидроксилирование, иодинирование, метилирование, миристоилирование, оксидирование, пегилирование, протеолитический процессинг, фосфорилирование, пренилирование, рацемизацию, селеноилирование, сульфатацию и опосредуемую транспортной РНК вставку аминокислоты в белок, такую как аргинилирование. См., например, Сгс1дй!оп Т.Е. РгоЮиъ -Зйис!игс апД Мо1сси1аг Ргорсгйс8 2пД ЕД., ν.Η. Ргсстап апД Сотрапу, Ысу Уогк (1993); Ро8йгап81а!юпа1 Соуа1сп! МоДйюайоп ой Рго!сш8, В.С. 1ойп8оп, ЕД., АсаДстю Ргс88, Ысу Уогк, р. 1-12 (1983).

Также для синтеза полипептида или фрагментов по изобретению можно использовать твердофазные способы химического синтеза пептидов. Такой способ известен в данной области с начала 1960-х (Мстйс1Д К.В., I. Ат. Сйст. Зос, 85:2149-2154, 1963) (см. также З!суай 1М. апД Уоипд ΙΩ., ЗойД Рйа8с РсрйДс Зуп1йс818, 2пД ЕД., Рюгсс Сйстюа1 Со., КоскйогД, 111, р. 11-12)) и в последнее время используется в коммерчески доступных лабораторных наборах для разработки и синтеза пептидов (СатЬпДдс Кс8сагсй Вюсйстюай). В таких коммерчески доступных лабораторных наборах, главным образом, используются идеи Н.М. Осу8сп с! а1., Ргос. ЫаЙ. АсаД. Зс!., ИЗА, 81:3998 (1984) и они обеспечивают синтез пептидов от концов множества стержней или булавок, все из которых соединены в едином планшете. При использовании такой системы планшет со стержнями или булавками переворачивают и вставляют во второй планшет с соответствующими лунками или резервуарами, которые содержат растворы для присоединения или заякоривания соответствующей аминокислоты на концах стержней или шпилек. При повторении этой стадии процесса, т.е. переворачивание и помещение концов стержней и булавок в соответствующие растворы, из аминокислот выстраиваются желаемые пептиды. Кроме того, является доступным ряд доступных систем для синтеза пептидов РМОС. Например, сборку полипептида или фрагмента можно осуществить на твердой подложке с использованием устройства для автоматического синтеза пептидов АррйсД Вю8у8!ст8, 1пс. МоДс1 431 АТМ. Такое оборудование обеспечивает легкую доступность пептидов по изобретению либо непосредственным синтезом, либо синтезом ряда фрагментов, которые можно связывать с использованием других известных способов.

Ферменты фосфолипазы

Изобретение относится к полипептидам, имеющим активность фосфолипазы, к нуклеиновым кислотам, кодирующим их, антителам, которые связывают их, пептидам, соответствующим антигенным участкам фермента (эпитопам) и активным центрам, регуляторным и связывающим доменам и к способам их получения и применения. В одном аспекте полипептиды по изобретению обладают активностью фосфолипазы или любой комбинацией видов активности фосфолипазы, как описано в настоящем документе (например, активность фермента фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С (Р1-РЙС) и т.д.). В альтернативных аспектах фосфолипазы по изобретению обладают активностью, модифицированной относительно активности иллюстративных фосфолипаз, описанных в настоящем документе.

Как используют в настоящем документе, термин фосфолипаза охватывает ферменты, обладающие любой активностью фосфолипазы, например активностью расщепления глицеринфосфатной сложноэфирной связи (катализ гидролиза глицеринфосфатной сложноэфирной связи), например, в масле, таком как неочищенное масло или растительное масло. Активность фосфолипазы по изобретению может обеспечивать образование экстрагируемого водой фосфорилированного основания и диглицерида. Термин активность фосфолипазы охватывает гидролиз глицеринфосфатных сложноэфирных связей при высоких температурах, низких температурах, щелочных значениях рН и кислотных значениях рН, расщепление глицеринфосфатного сложного эфира с образованием экстрагируемого водой фосфорилированного основания и диглицерида, расщепление сложноэфирных связей между глицерином и фосфорной кислотой в фосфолипиах, и другие виды активности, такие как способность связывать и гидролизовать субстрат, такой как масло, например неочищенное масло или растительное масло, при этом субстрат также включает растительные и животные фосфатидилхолины, фосфатидилэтаноламины, фосфатидилсерины и сфингомиелины. Активность фосфолипазы может включать активность фосфолипазы С (РЬС); активность Р1-РЙС, активность фосфолипазы А (РЬА), такую как активность фосфолипазы А1 или фосфолипазы А2; активность фосфолипазы В (РЬВ), такую как активность фосфолипазы В1 или фосфолипазы В2, включая активность лизофосфолипазы (ЬРЬ) и/или активность лизофосфолипазы-трансацилазы (ЬРТ А); активность фосфолипазы Ό (РЬИ), такую как активность фосфолипазы Ό1 или фосфолипазы Ό2; и/или активность пататина, или любую их комбинацию. Активность фосфолипазы может включать гидролиз гликопротеина, например, такого как гликопротеин, встречающийся в клубнях картофеля или любом растении рода Зо1а!шт, например Зо1айит !иЬсго8ит. В альтернативных вариантах осуществления активность фосфолипазы может включать ферментативную активность пататина, такую как эстеразная ак- 54 022979 тивность пататина (см., например, Етене/ (2002) Вю1есЬпо1. Ргод. 18:635-640). В определенных вариантах осуществления активность фосфолипазы может включать активность ацилгидролазы (ЬАН) липидов.

В альтернативных вариантах осуществления фосфолипазы РЬС по изобретению используют (например, катализируют гидролиз) различные фосфолипидные субстраты, включая фосфатидилхолин (РС), фосфатидилэтаноламин (РЕ), фосфатидилсерин (Р8), фосфатидилинозитол (Р1) и/или фосфатидную кислоту (РА) или их комбинацию. Кроме того, эти ферменты могут обладать различными степенями активности в отношении лизофосфолипидных форм этих фосфолипидов. В различных аспектах ферменты РЬС по изобретению могут демонстрировать предпочтение к фосфатидилхолину и фосфатидилэтаноламину в качестве субстратов.

В альтернативных вариантах осуществления фосфатидилинозитол-фосфолипазы РЬС по изобретению используют множество фосфолипидных субстратов, включая фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, фосфатидилинозитол и фосфатидную кислоту или их комбинацию. В альтернативных вариантах осуществления эти ферменты могут обладать различными степенями активности в отношении лизофосфолипидных форм этих фосфолипидов. В различных аспектах ферменты фосфатидилинозитол-РЬС по изобретению могут демонстрировать предпочтение к фосфатидилинозитолу в качестве субстрата.

В альтернативных вариантах осуществления активность фосфолипазы может включать специфичность в отношении одного или нескольких специфических субстратов, например, фермент по изобретению может обладать специфичностью действия в отношении РЕ и РС; РЕ и Р1; РЕ и Р8; Р8 и РС; Р8 и Р1; Р1 и РС; Р8, Р1 и РС; РЕ, Р1 и РС; РС, РЕ и Р8; РЕ, Р8 и Р1 или РЕ, Р8, Р1 и РС или любой их комбинации.

В альтернативных вариантах осуществления фосфолипаза по изобретению может обладать полифункциональной активностью, например комбинацией одного или нескольких видов ферментативной активности, описанных в настоящем документе. Например, в одном аспекте полипептид по изобретению является ферментативно активным, но лишен активности липазы или лишен какой-либо ферментативной активности, которая влияет на нейтральную фракцию масел (триглицеридом). Может быть желательным использовать такой полипептид в конкретном процессе, например в процессе рафинирования, где важно, чтобы фракция нейтрального масла не была повреждена (уменьшена в количестве, деградирована, например гидролизована). Таким образом, в одном аспекте изобретение относится к процессу рафинирования, включающему применение полипептида по изобретению, обладающего активностью фосфолипазы, но не активностью липазы.

В альтернативных вариантах осуществления полипептиды по изобретению, обладающие ферментативной активностью пататина, могут использовать множество фосфолипидных субстратов, включая фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, фосфатидилинозитол и фосфатидную кислоту или их комбинацию. Кроме того, эти ферменты могут обладать различными степенями активности в отношении лизофосфолипидных форм этих фосфолипидов. В различных аспектах пататины по изобретению основаны на консервативности сходства аминокислотной последовательности. В различных аспектах эти ферменты обладают разнообразным набором биохимических свойств и могут выполнять реакции, характерные для классов ферментов РЬА1, РЬА2, РЬС или РБЭ.

В альтернативных вариантах осуществления полипептиды по изобретению, включающие фосфолипазы Рй-Э по изобретению, могут использовать множество фосфолипидных субстратов, включая фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, фосфатидилинозитол и фосфатидную кислоту или их комбинацию. Кроме того, эти ферменты могут обладать различными степенями активности в отношении лизофосфолипидных форм этих фосфолипидов. В одном аспекте эти ферменты пригодны для осуществления реакций переэтерификации с образованием структурированных фосфолипидов.

В альтернативных вариантах осуществления полипептиды по изобретению обладают активностью, включающей расщепление глицеринфосфатной сложноэфирной связи, способность гидролизовать фосфатные сложноэфирные связи, включая активность пататина, ацилгидролазы липидов (ЬАН), фосфолипазы А, В, С и/или фосфолипазы Ό или любую их комбинацию.

Как используют в настоящем документе, 1 единица фермента представляет собой количество фермента, требуемого для обеспечения переработки реакцией 1 мкмоль субстрата в минуту в определенных условиях.

В альтернативных вариантах осуществления изобретение относится к полипептидам с сигнальными последовательностями или без них и к самим сигнальным последовательностям (например, выделенные пептиды сигнальных последовательностей). Изобретение относится к фрагментам или подпоследовательностям ферментов по изобретению, например пептидам или полипептидам, содержащим или состоящим из каталитических доменов (активных центров), участков связывания, регуляторных доменов, эпитопов, сигнальных последовательностей, препродоменов и т.п. Также изобретение включает иммобилизованные фосфолипазы, антитела против фосфолипазы и их фрагменты. Изобретение относится к гетерокомплексам, например слитым белкам, гетеродимерам и т.д., содержащим фосфолипазы по изобретению. Определение пептидов, соответствующим антигенным центрам фермента (эпитопам), активным центрам, участкам связывания, сигнальным последовательностям, и т.п. можно проводить с помощью общепринятых протоколов скрининга.

- 55 022979

Эти ферменты и способы по изобретению можно использовать для достижения более полного рафинирования масел с высоким содержанием фосфора, в частности масел риса, сои, кукурузы, канолы и подсолнечного масла. Например, в одном аспекте при расщеплении посредством Р1-РЬС, фосфатидилинозитол конвертируется в диацилглицерин и фосфоинозитол. Диацилглицерин распределяется в водную фазу (увеличение выхода масла) и фосфоинозитол распределяется в водную фазу, где он удаляется в качестве компонента тяжелой фазы в процессе центрифугирования. Фермент по изобретению, например Р1-РЬС по изобретению, можно включать в процесс либо химической, либо физической очистки.

В альтернативных аспектах ферменты по изобретению обладают активностью фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С (Р1-РЬС), активностью фосфатидилхолин-специфической фосфолипазы С, активностью фосфатазы фосфатидной кислоты, активностью фосфолипазы А и/или активностью родственной пататину фосфолипазы. Эти ферменты можно использовать отдельно или в комбинации друг с другом или с другими ферментами по изобретению или с другими ферментами. В одном аспекте изобретение относится к способам, где эти ферменты (включая фосфатидилинозитол-специфическую фосфолипазу С (Р1РЬС), фосфатидилхолин-специфическую фосфолипазу С, и/или фосфолипазу Ό (совместно с фосфатазой), фосфатазу фосфатидной кислоты, фосфолипазу А, родственные пататину фосфолипазы по изобретению) используют отдельно или в комбинации при рафинировании масел, например растительных масел, например масел с высоким содержанием фосфора, таких как соевое масло, кукурузное масло, масло канолы, рисовое и подсолнечное масло. Эти ферменты и способы по изобретению можно использовать для достижения более полного рафинирования масел с высоким содержанием фосфора, в частности соевого масла, кукурузного масла, масла канолы, рисового и подсолнечного масла. При расщеплении посредством Р1-РЬС, фосфатидилинозитол конвертируется в диацилглицерин и фосфоинозитол. Диацилглицерин распределяется в водную фазу (увеличение выхода масла) и фосфоинозитол распределяется в водную фазу, где он удаляется в качестве компонента тяжелой фазы в процессе центрифугирования. Фермент по изобретению, например Р1-РЬС по изобретению, можно включать в процесс либо химической, либо физической очистки.

В одном аспекте изобретение относится к композициям, например растворам, содержащим цитрат натрия при нейтральных рН для гидратации негидратируемых веществ. Например, изобретение относится к растворам цитрата натрия в диапазоне рН приблизительно от 4 до 9, или от 5 до 8, или от 6 до 7, которые можно использовать для гидратации негидратируемых фосфолипидов (включая ферменты по изобретению) в маслах с высоким содержанием фосфора. В одном аспекте гидратацию негидратируемых фосфолипидов проводят хелатированием кальция и магния, ассоциированных с фосфолипидами, тем самым позволяя ранее нерастворимым солям фосфолипидов более легко распределяться в водную фазу. В одном аспекте после перемещения фосфолипидов к поверхности контакта вода/масло или в водную фазу, фосфолипаза по изобретению (например, фосфолипаза-специфическая фосфогидролаза по изобретению) или другая фосфолипаза конвертирует фосфолипид в диацилглицерин и фосфатный сложный эфир.

В одном аспекте содержания кальция и магния снижают добавлением кислоты или щелочи (см. обсуждение щелочных процессов).

Ферменты по изобретению являются высокоселективными катализаторами. Как и в случае других ферментов, они катализируют реакции с высокой стерео-, регио- и хемоселективностью, которые не имеют себе равных в общепринятой синтетической химии. Более того, ферменты по изобретению являются в высокой степени универсальными. Они могут быть адаптированы для функционирования в органических растворителях, действия при крайних значениях рН (например, высоких рН и низких рН), крайних температурах (например, высоких температурах и низких температурах), крайних уровнях содержания солей (например, высоком и низком содержании солей) и катализируют реакции с соединениями, которые являются структурно неродственными их природным физиологическим субстратам. Ферменты по изобретению могут быть предназначены для того, чтобы они реагировали с широким диапазоном природных и неприродных субстратов, таким образом, обеспечивая модификацию практически любых основных органических соединений. Ферменты по изобретению также могут быть предназначены для того, чтобы они были высоко энантио- и региоселективными. Высокая степень специфичности к функциональным группам, проявляемая этими ферментами, позволяет отслеживать каждую реакцию в синтетической последовательности, что приводит к новому активному соединению. Ферменты по изобретению также могут быть предназначены для катализа многих разнообразных реакций, несвойственных их нативной физиологической функции в природе.

В соответствии с настоящим изобретением используют уникальные каталитические свойства ферментов. В то время как использование биокатализаторов (т.е. очищенных или неочищенных ферментов, неживых или живых клеток) в химических превращениях обычно требует идентификации конкретного биокатализатора, который взаимодействует с конкретным исходным соединением. В соответствии с настоящим изобретением используют подобранные биокатализаторы, т.е. ферменты по изобретению, и условия реакции, которые являются особыми для функциональных групп, которые находятся в различных исходных соединениях, таких как низкомолекулярные соединения. Каждый биокатализатор специфичен для одной функциональной группы или нескольких сходных функциональных групп и может вза- 56 022979 имодействовать с различными исходными соединениями, содержащими эту функциональную группу. Биокаталитические реакции приводят к получению группы производных из единственного исходного соединения. Эти производные можно подвергать подвергнуты другому циклу биокаталитических реакций с получением второй группы производных соединений. При каждом повторе биокаталитического получения производных может быть получено тысячи вариантов исходных соединений.

Настоящее изобретение относится к способам идентификации единичного активного фермента РЬС в библиотеке, где библиотека характеризуется рядом биокаталитических реакций, используемых для ее получения, так называемой биосинтетической историей. Один вариант осуществления включает скрининг библиотеки на виды биологической активности и прослеживание биосинтетической истории дает возможность идентифицировать конкретную последовательность реакций получения активного соединения. Последовательностью реакций можно повторять и определять структуру синтезированного соединения. В этом варианте осуществления для этого способа идентификации не требуются технологии иммобилизации; и соединения можно синтезировать и анализировать в свободной форме в растворе с использованием практически любого типа скрининга. В этом варианте осуществления высокая степень специфичности ферментативных реакций для функциональных групп дает возможность проследить конкретные ферментативные реакции, посредством которых была создана биокаталитически полученная библиотека.

Также изобретение относится к способам выявления новых фосфолипаз с использованием нуклеиновых кислот, полипептидов и антител по изобретению. В одном аспекте проводят скрининг библиотек фага лямбда для выявления фосфолипаз на основе экспрессии. Применение библиотек фага лямбда в скрининге позволяет определение токсичных клонов; улучшение доступа к субстрату; снижение необходимости в получении способами инженерии хозяина, обход потенциальных любых ошибок, возникающих вследствие множественных удалений в библиотеках; и ускорение роста при низких плотностях клонов. Скрининг библиотек фага лямбда можно проводить в жидкой фазе или в твердой фазе. Скрининг в жидкой фазе обеспечивает большую универсальность условий анализа; дополнительную универсальность субстрата; повышенную чувствительность для слабых клонов и легкость автоматизации по сравнению с твердофазным анализом.

В альтернативных вариантах осуществления методические стадии проводят с использованием роботизации, например, для обеспечения выполнения тысяч биокаталитических реакций и скрининга за короткий период времени, например за сутки, а также для обеспечения высокого уровня точности и воспроизводимости (см. описание матриц ниже). В результате, библиотека производных соединений может быть получена всего за несколько недель. Для других описаний модификаций молекул, включая низкомолекулярные соединения, см. РСТ/ϋδ 94/09174.

Сигнальные последовательности фосфолипаз

Изобретение относится к сигнальным последовательностям фосфолипазы (например, сигнальные пептиды (8Р)), например пептидам, содержащим сигнальные последовательности, и/или химерным полипептидам, где пептиды или химеры имеют сигнальную последовательность, как описано в настоящем документе. Изобретение относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим эти сигнальные последовательности (8Р, например пептид, обладающий последовательностью, содержащей/состоящий из Пконцевых остатков полипептида по изобретению). В одном аспекте изобретение относится к сигнальной последовательности, содержащей пептид, содержащий/состоящий из последовательности, как указано в остатках 1-20, 1-21, 1-22, 1-23, 1-24, 1-25, 1-26, 1-27, 1-28, 1-28, 1-30, 1-31, 1-32 или 1-33 полипептида по изобретению, например полипептида, содержащего последовательность, как указано в 8ЕЦ ГО ПО: 6, и имеющего одну или несколько мутаций, как указано в табл. 12-15, или его ферментативно активного фрагмента. Любой из этих пептидов может быть часть химерного белка, например рекомбинантного белка. Пептид сигнальной последовательности можно приспосабливать к другому ферменту по изобретению (например, фосфолипазе по изобретению, из которой он не происходит), или к другой фосфолипазе, или к любому полипептиду, как рассмотрено ниже.

Иллюстративные сигнальные последовательности включают остатки 1-37 8ЕЦ ГО ПО: 4 и остатки 1-23 8ЕЦ ГО ПО: 6.

В некоторых аспектах фосфолипазы по изобретению не обладают сигнальными последовательностями. В одном аспекте изобретение относится к фосфолипазам по изобретению, лишенным всей сигнальной последовательности или ее части. В одном аспекте изобретение относится к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей сигнальную последовательность из одной фосфолипазы, функционально связанную с последовательностью нуклеиновой кислоты отличающейся фосфолипазы, или, необязательно, может быть желательной сигнальная последовательность из белка, не являющегося фосфолипазой.

Препродомены фосфолипазы, связывающие домены и каталитические домены

В дополнение к сигнальным последовательностям (например, сигнальным пептидам (8Р)), как рассмотрено выше, изобретение относится к препродоменам, связывающим доменам (например, связывающему субстрат домену) и каталитическим доменам (СО). Домены 8Р, связывающие домены, препродомены и/или СО по изобретению могут представлять собой выделенные, синтетические или рекомби- 57 022979 нантные пептиды, или они могут быть частью слитого белка, например, в качестве гетерологичного домена в химерном белке. Изобретение относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим эти каталитические домены (СЭ) (например, активные центры), препродомены, связывающие домены и сигнальные последовательности (ЗР, например, пептид, имеющий последовательность, содержащую/состоящую из Ν-концевых остатков полипептида по изобретению).

Сигнальные последовательности (ЗР), связывающие домены, каталитические домены (СЭ) и/или препропоследовательности фосфолипазы по изобретению могут представлять собой выделенные пептиды или последовательности, связанные с другой фосфолипазой или полипептидом, не являющимся фосфолипазой, например, в виде слитого (химерного) белка. В одном аспекте полипептиды, содержащие сигнальные последовательности ЗР и/или препропоследовательности фосфолипазы по изобретению, содержат последовательности, гетерологичные фосфолипазам по изобретению (например, слитый белок, содержащий ЗР и/или препропоследовательность по изобретению и последовательности из другой фосфолипазы или не являющегося фосфолипазой белка). В одном аспекте изобретение относится к фосфолипазам по изобретению с гетерологичными СЭ, ЗР и/или препропоследовательностями, например последовательностями с сигнальной последовательностью дрожжей. Фосфолипаза по изобретению может содержать гетерологичные СЭ, ЗР и/или препропоследовательность в векторе, например векторе серии рРЮ ОпуПгодеп, Саг1кЬай, СА).

В одном аспекте ЗР, СЭ и/или препропоследовательности по изобретению идентифицируют после идентификации новых полипептидов фосфолипазы. Пути, посредством которых белки сортируются и транспортируются в нужные отделы клетки, часто называются путями направления белков. Одним из наиболее важных элементов во всех из указанных направляющих систем является короткая аминокислотная последовательность на Ν-конце вновь синтезированного полипептида, называемая сигнальной последовательностью. Эта сигнальная последовательность направляет белок в соответствующий ему отдел клетки, и она удаляется в процессе транспорта или при достижении белком пункта назначения. Большинство лизосомальных, мембранных или секретируемых белков обладают Ν-концевой сигнальной последовательностью, которая маркирует их для транспорта в просвет эндоплазматической сети. Сигнальные последовательности могут варьировать в длину от 13 до 45 или более аминокислотных остатков. Различные способы распознавания сигнальных последовательностей известны специалистам в данной области. Например, в одном аспекте новые сигнальные пептиды гидролазы идентифицируют способом, называемым З1дпа1Р. В З1дпа1Р используется комбинированная нейронная сеть, которая распознает как сигнальные пептиды, так и их участки расщепления (№е1кеп е1 а1., [йеп11Пса11оп о£ ргокагуойс апй еикагуойс ыдпа1 рерййек апй ргейюйоп о£ 1Ье1г с1еауаде кйек., Рго1еш Епдшеегшд, νο1. 10, Νο. 1, р. 1-6 (1997).

В некоторых аспектах фосфолипаза по изобретению может не обладать ЗР, и/или препропоследовательностями, и/или каталитическими доменами (СЭ). В одном аспекте изобретение относится к фосфолипазам, лишенным всех или части ЗР, СЭ и/или препродомена. В одном аспекте изобретение относится к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей сигнальную последовательность (ЗР), СЭ и/или препропоследовательность из одной фосфолипазы, функционально связанную с последовательностью нуклеиновой кислоты отличающейся фосфолипазы, или, необязательно, могут быть желательными сигнальная последовательность (ЗР), СЭ и/или препродомен из не являющегося фосфолипазой белка.

Изобретение также относится к выделенным, синтетическим или рекомбинантным полипептидам, содержащим сигнальные последовательности (ЗР), препродомен и/или каталитические домены (СЭ) по изобретению и гетерологичные последовательности. Гетерологичные последовательности представляют собой последовательности, искусственно ассоциированные (например, в случае фосфолипазы) с ЗР, препродоменом и/или СЭ. Последовательность, с которой ЗР, препродомен и/или СЭ могут быть искусственно ассоциированы, может находиться на Ν-конце, С-конце ЗР, препродомена и/или СЭ, и/или на обоих концах ЗР и/или СЭ. В одном аспекте изобретение относится к выделенному, синтетическому или рекомбинантному полипептиду, содержащему (или состоящему из) полипептид, содержащий сигнальную последовательность (ЗР), препродомен и/или каталитический домен (СЭ) по изобретению, при условии, что он не ассоциирован с любой последовательностью, с которой он ассоциирован в природе (например, последовательностью фосфолипазы). Аналогично, в одном аспекте изобретение относится к выделенным или рекомбинантным нуклеиновым кислотам, кодирующим эти полипептиды. Таким образом, в одном аспекте выделенная, синтетическая или рекомбинантная нуклеиновая кислота по изобретению содержит кодирующую последовательность для сигнальной последовательности (ЗР), препродомена и/или каталитического домена (СЭ) по изобретению и гетерологичную последовательность (т.е. последовательность, искусственно ассоциированную с сигнальной последовательностью (ЗР), препродоменом и/или каталитическим доменом (СЭ) по изобретению). Гетерологичная последовательность может находиться на 3'-конце, 5'-конце и/или на обоих концах последовательности, кодирующей ЗР, препродомен и/или СЭ.

Полипептиды по изобретению включают фосфолипазы в активной и неактивной форме. Например, полипептиды по изобретению включают пробелки перед созреванием или процессингом препропоследовательностей, например, ферментом процессинга пробелка, таким как конвертаза пробелка, с получением активного зрелого белка. Полипептиды по изобретению включают ферменты, неактивные по дру- 58 022979 гим причинам, например перед активацией посредством событий посттрансляционного процессинга, например воздействия эндо- и экзопептидаз или протеаз, событий фосфорилирования, амидирования, гликозилирования или сульфатации, событий димеризации и т.п. Способы идентификации последовательностей препро-домена и сигнальных последовательностей хорошо известны в данной области, см., например, Уап бе Уеп (1993) Сгй. Реν. Опсод., 4 (2): 115-136; двухгибридный скрининг дрожжей для идентификации белок-белковых взаимодействий, описанный, например, в МШег (2004) МеШобк Мо1. Вю1. 261:247-62; Неутпск (2004) МеШобк Мо1. Вю1. 282:223-41, и8РЫ 6617122; 6190874. Например, для идентификации препропоследовательности белок очищают от внеклеточного окружения и Ν-концевую белковую последовательность определяют и сравнивают с непроцессированной формой.

Полипептиды по изобретению могут быть изготовлены в виде белкового препарата в жидкой, твердой, полутвердой или гелеобразоной форме. Например, препарат белка по изобретению может содержать состав, содержащий неводную жидкую композицию, отлитое твердое тело, порошок, лиофилизированный порошок, гранулированную форму, форму в виде частиц, прессованную таблетку, драже, пилюлю, форму геля, гидрогель, пасту, аэрозоль, спрей, лосьон или состав взвеси.

Полипептиды по изобретению включают все активные формы, включая активные подпоследовательности, например каталитические домены (СО) или активные центры фермента по изобретению. В одном аспекте изобретение относится к каталитическим доменам или активным центрам, как указано ниже. В одном аспекте изобретение относится к пептиду или полипептиду, содержащему или состоящему из домена активного центра, как предсказано с использованием базы данных, такой как РГат (которая представляет собой большую коллекцию множества выровненных последовательностей и скрытых моделей Маркова, охватывающих многие семейства белков, ТНе РГат ргсЛет ГатШек ба1аЬаке, А. Ва1етап, Е. Випеу, Ь. Сеггий, Р. ЭитЫп, Ь. Е1\уП1ег, 8.Р. Еббу, 8. ОпГГнЫ- 1опе8, К.Ь. Но\уе, М. МагкНаН, апб Е.Ь.Ь. 8оппНаттег, №ю1ею Лабк РекеагсН, 30(1):276-280, 2002) или ее эквивалент.

Изобретение относится к слитым Ν-концевым или С-концевым подпоследовательностям ферментов по изобретению (например, сигнальным последовательностям, препропоследовательностям) с другими полипептидами, активными белками или фрагментами белков. Получение фермента по изобретению (например, фермента фосфолипазы С) также можно проводить путем экспрессии фермента в качестве неактивного слитого белка, который впоследствии активируется протеолитическим расщеплением (с использованием активности либо эндогенной, либо экзогенной протеазы, например трипсина), которое приводит к разделению партнера слитого белка и зрелого фермента, например фермента фосфолипазы С. В одном аспекте слитый белок по изобретению экспрессируется из гибридной нуклеотидной конструкции, которая кодирует одну открытую рамку считывания, содержащую следующие элементы: нуклеотидная последовательность для слитого белка, линкерная последовательность (определяемая как нуклеотидная последовательность, которая кодирует гибкую аминокислотную последовательность, которая связывает два менее подвижных белковых домена), участок, распознаваемый протеазой для расщепления, и последовательность зрелого фермента (например, любой фермент по изобретению, например фосфолипаза). В альтернативных аспектах, слитый белок может содержать последовательность пептатлиазы, последовательность ксиланазы, последовательность фосфатазы фосфатидной кислоты или другую последовательность, например последовательность, для которой ранее было показано, что она экспрессируется в представляющей интерес хозяйской системе.

Можно использовать любую хозяйскую систему (см. обсуждение выше), например, любые бактерии, например грамположительные бактерии, такие как ВасШик, или грамотрицательные бактерии, такие как Е. сой, или любые дрожжи, например РюЫа рак1ойк. Расположение нуклеотидных последовательностей в химерной нуклеотидной конструкции можно определять, исходя из уровней экспрессии белка, достигаемых с помощью каждой слитой конструкции. В направлении от 5'-конца нуклеотидной конструкции к 3'-концу конструкции, в одном аспекте нуклеотидные последовательности собирают следующим образом: сигнальная последовательность/слитый белок/линкерная последовательность/участок расщепления, распознаваемый протеазой/зрелый фермент (например, любой фермент по изобретению, например фосфолипаза) или сигнальная последовательность/пропоследовательность/зрелый фермент/ линкерная последовательность/слитый белок. Экспрессия фермента (например, любого фермента по изобретению, например фосфолипазы) в качестве неактивного слитого белка может увеличить общую экспрессию последовательности фермента, может снизить какую-либо потенциальную токсичность, ассоциированную со сверхпродукцией активного фермента и/или может увеличить срок годности фермента перед применением, поскольку фермент является неактивным до тех пор, пока слитый белок, например пептатлиаза, не отделится от фермента, например белка фосфолипазы.

В различных аспектах изобретение относится к специализированным составам для активации фосфолипазы по изобретению, экспрессируемой в качестве слитого белка. В одном аспекте активацию активности фосфолипазы, первоначально экспрессируемой в качестве неактивного слитого белка, осуществляют с использованием протеолитической активности или потенциально протеолитической активности в комбинации с Ν-концевой или С-концевой пептидазой. Эту активацию можно проводить различными путями и в различные моменты процесса производства/хранения перед применением в рафинировании масла. Иллюстративные способы по изобретению включают расщепление с помощью эндогенной

- 59 022979 активной молекулы, экспрессируемой продуцирующим хозяином, при секреции слитой конструкции в ферментационную среду; расщепление с помощью активности эндогенной протеазы, которая активируется или приходит в контакт с внутриклеточно экспрессируемой слитой конструкции при разрушении клеток-хозяев; пропускание неочищенной или очищенной слитой конструкции через колонку с иммобилизованной активной протеазой для осуществления расщепления, и активацию фермента (например, фосфолипазы по изобретению, например фосфолипазы С) перед включением фермента в состав; обработку неочищенной или очищенной слитой конструкции растворимым источником протеолитической активности; активацию фосфолипазы (например, фосфолипазы по изобретению, например фосфолипазы С) на предприятии, осуществляющем рафинирование масла, с использованием либо растворимого, либо нерастворимого источника протеолитической активности непосредственно перед применением в процессе; и/или активацию активности фосфолипазы (например, фосфолипазы по изобретению, например фосфолипазы С) путем непрерывной циркуляции состава слитой конструкции через колонку с иммобилизованной активной протеазой при пониженной температуре (например, любая температура приблизительно от 4 до 20°С). Эту активацию можно проводить перед доставкой на предприятие для применения или ее можно проводить на рафиновочном предприятии.

Гликозилирование

Пептиды и полипептиды по изобретению (например, гидролазаы, антитела) также могут быть гликозилированными, например, в одном аспекте, содержащими по меньшей мере один участок гликозилирования, например Ν-связанного или О-связанного гликозилирования. В одном аспекте полипептид может быть гликозилирован после экспрессии в Р. ра81оп8 или 8. ротЬе. Гликозилирование можно быть добавлено постгрансляционно либо химически, либо с помощью клеточных биосинтетических механизмов, где последние из них включают использование известных мотивов гликозилирования, которые могут быть нативными для последовательности или могут быть добавлены в качестве пептида или добавлены в нуклеиновую кислоту, кодирующую последовательность.

Анализы активности фосфолипазы

Изобретение относится к выделенным, синтетическим или рекомбинантным полипептидам (например, ферментам, антителам), обладающим активностью фосфолипазы или любой комбинацией видов активности фосфолипазы, и к нуклеиновым кислотам, кодирующим их. Для определения того, обладает ли полипептид активностью фосфолипазы, можно использовать любые из множества анализов активности фосфолипазы, известных в данной области, и они входят в объем изобретения. Общепринятые протоколы определения активности фосфолипазы А, В, Ό и С, пататина и ацилгидролазы липидов или активности липазы, хорошо известны в данной области.

Иллюстративные анализы активности включают анализы мутности, анализы (флуоресцентные) с метилумбеллиферил-фосфохолином, анализы (флуоресцентные) с фосфолипаой Атр1ех гей, анализы способом тонкослойной хроматографии (ТЬС), цитолитические анализы и анализы с пнитрофенилфосфорилхолином. С использованием этих анализов полипептиды, пептиды или антитела можно быстро подвергать скринингу в отношении активности фосфолипазы.

Активность фосфолипазы может включать активность ацилгидролазы липидов (ЬАН). См., например, ктепе/ (2001) Ыр1й8 36: 1169-1174, где описан анализ смешанных мицелл на основе монододецилпростого эфира октаэтиленгликоля для определения активности ацилгидролазы липидов у пататина. В Ри18пойот (2000) 1. Адпс. Роой С1ет. 48: 155-160 описана иллюстративная активность ацилгидролазы липидов (ЬАН) у пататина.

Анализы мутности для определения активности фосфолипазы. описаны, например, в КаиГГтапп (2001) Сопуег81оп оГ ВасШи8 1Негтоса1епи1а1и8 Пра8е иНо ап еГкаей рко8ркоИра8е \νίΐ1ι шсгеа8ей аскуку Ю\\агй8 1опд-с1ипп Гаку асу1 8иЬ81га1е8 Ьу йкес1ей еνο1икοη апй гакопа1 йе81дп, Рго1еш Епдтеекпд 14:919928; 1ЬгаЫт (1995) Езайепсе шрксакпд рко8ркокра8е а8 а укЫепсе ГасЮг оГ СапФйа а1Ысап8, 1пГес!. 1ттип. 63: 1993-1998.

Анализы (флуоресцентные) с метилумбеллиферил-фосфохолином для определения активности фосфолипазы описаны, например, в Ооойе (1997) Езайепсе Гог се11 8игГасе апй ш1ета1 рко8ркокра8е аскуку ш а8ий1ап едд8, Эеуе1ор. Ого\\к1 Э|ГГег. 39:655-660; Э|а/ (1999) Эпес! Йиоге8сепсе-Ьа8ей Нра8е аскуку а88ау, ВюТес1тк|ие8 27:696-700.

Анализы фосфолипазы (флуоресцентные) Атр1ех Кей для определения активности фосфолипазы доступны с помощью наборов, например, детекция фосфатидилхолин-специфической фосфолипазы с использованием набора для анализа фосфатидилхолин-специфической фосфолипазы с Атр1ех Кей от Мо1еси1аг РгоЬе8 1пс. (Еидепе, ОК), согласно инструкциям изготовителя. Флуоресценцию измеряют на флуоресцентном устройстве для считывания микропланшетов с использованием возбуждения при 560±10 нм и детекции флуоресценции при 590±10 нм. Анализ является чувствительным при очень низких концентрациях фермента.

Анализы способом тонкослойной хроматографии (ТЬС) для определения активности фосфолипазы описаны, например, в Кеупо1й8 (1991) Ме1кой8 ш Еп/уто1. 197:3-13; Тадисй (1975) Рко8ркоИра8е Ггот С1о8кзйшт поууа !уре А.1, ВюсЫт. Вюрку8. Ас!а 409:75-85. Тонкослойная хроматография (ТЬС) представляет собой широкоиспользуемый способ для детекции активности фосфолипазы. Различные моди- 60 022979 фикации этого способа используют для экстракции фосфолипидов из водных анализируемых смесей. В некоторых анализах РЬС гидролиз останавливают добавлением смеси хлороформ/метанол (2:1) к реакционной смеси. Не вступивший в реакцию исходный материал и диацилглицерин экстрагируют в органическую фазу и его можно фракционировать с помощью ТЬС, в то время как коневая группа остается в водной фазе. Для более точного измерения расщепления фосфолипидов можно использовать радиоактивно меченные субстраты (см., например, Кеупо16к (1991) МеШобк ш Еп/уто1. 197:3-13). Соотношения продуктов и реактантов можно использовать для вычисления истинного количества моль субстрата, гидролизуемого в единицу времени. Если все компоненты экстрагируются в равной степени, любые потери при экстракции влияют на все компоненты в равной степени. Отделения продуктов расщепления фосфолипидов можно проводить с помощью ТЬС на силикагеле со смесью хлороформ/метанол/вода (65:25:4), используемой в качестве системы растворителей (см., например, ТадисЫ (1975) ВюсЫт. ВюрЬук. Ас1а 409:75-85).

Анализы с п-нитрофенилфосфорилхолином для определения активности фосфолипазы описаны, например, в КогЬкпкаЮ (1999) I. С1ш. МюгоЬю1. 37:3742-3745; Вегка (1981) 1пТес£. 1ттип. 34: 1071-1074. Этот анализ основан на ферментативном гидролизе аналога субстрата п-нитрофенилфосфорилхолина с высвобождением желтого хромогенного соединения п-нитрофенола, поддающегося детекции при 405 нм. Этот субстрат удобен для высокопроизводительного скрининга.

Цитолитический анализ может осуществлять детекцию фосфолипаз с цитолитической активностью на основе лизиса эритроцитов. Токсические фосфолипазы могут взаимодействовать с мембранами эукариотических клеток и гидролизовать фосфатидилхолин и сфингомиелин, вызывая лизис клеток. См., например, ТЬЬа11 (1993) М1сгоЪю1. Кеу. 57:347-366.

Гибридные (химерные) фосфолипазы и библиотеки пептидов

В одном аспекте изобретение относится к гибридным фосфолипазам и слитым белкам, включая пептидные библиотеки, содержащие последовательности по изобретению. Пептидные библиотеки по изобретению можно использовать для выделения модуляторов (например, активаторов или ингибиторов) пептидов-мишеней, таких как субстраты фосфолипазы, рецепторы, ферменты и т.д. Пептидные библиотеки по изобретению можно использовать для идентификации соответствующих партнеров для связывания мишеней, таких как лиганды, например цитокины, гормоны и т.п.

В одном аспекте изобретение относится к гибридным фосфолипазам и слитым белкам, включающим пептидные библиотеки, содержащие последовательности по изобретению. Пептидные библиотеки по изобретению можно использовать для выделения пептидных модуляторов (например, активаторов или ингибиторов) мишеней, таких как субстраты фосфолипазы, рецепторы, ферменты. Пептидные библиотеки по изобретению можно использовать для идентификации формальных связывающих партнеров мишеней, таких как лиганды, например цитокины, гормоны и т.п. В одном аспекте изобретение относится к химерным белкам, содержащим сигнальную последовательность (8Р) и/или каталитический домен (СЭ) по изобретению и гетерологичную последовательность (см. выше).

Также изобретение относится к способам получения усовершенствованных и гибридных фосфолипаз с использованием нуклеиновых кислот и полипептидов по изобретению. Например, изобретение относится к способам получения ферментов, которые обладают активностью, например активностью фосфолипазы (например, такой как активность фосфолипазы А, В, С или Ό, эстеразная активность пататина, расщепление глицеринфосфатной сложноэфирной связи, расщепление сложноэфирной связи в фосфолипиде в растительном масле) при крайних щелочных рН и/или кислотных рН, высоких и низких температурах, осмотических условиях и т.п. Изобретение относится к способам получения гибридных ферментов (например, гибридных фосфолипаз).

В одном аспекте способами по изобретению продуцируются новые гибридные полипептиды с использованием клеточных процессов, которые встраивают последовательность первого полинуклеотида, так, чтобы полученные гибридные полинуклеотиды кодировали полипептиды, демонстрирующие активность, происходящую из первых биологически активных полипептидов. Например, первые полинуклеотиды могут представлять собой иллюстративную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую иллюстративную фосфолипазу по изобретению. Первая нуклеиновая кислота может кодировать фермент из одного организма, который эффективно функционирует в конкретных окружающих условиях, например при высоком содержании соли. Она может быть встроена с помощью фермента, кодируемого вторым полинуклеотидом из отличающегося организма, который функционирует эффективно в других окружающих условиях, таких как крайне высокие температуры, например, когда две нуклеиновые кислоты могут продуцировать гибридную молекулу, например, путем рекомбинации и/или редуктивной перестройки. Гибридный полинуклеотид, содержащий последовательности из первого и второго исходных полинуклеотидов, может кодировать фермент, который обладает характеристиками обоих ферментов, кодируемых исходными полинуклеотидами. Таким образом, фермент, кодируемый гибридным полинуклеотидом, может эффективно функционировать в условиях окружающей среды, общих для каждого из ферментов кодируемых первым и вторым полинуклеотидами, например при высоком процентном содержании соли и предельных температурах.

Альтернативно, гибридный полипептид, полученный этим способом по изобретению, может прояв- 61 022979 лять специализированную ферментативную активность, не проявляемую исходными ферментами. Например, после рекомбинации и/или редуктивной перестройки полинуклеотидов, определяющих виды активности фосфолипазы, можно проводить скрининг полученного гибридного полипептида, кодируемого гибридным полинуклеотидом, в отношении специализированных видов активности, полученных из каждого из исходных ферментов, т.е. в отношении типа связи, на которую действует фосфолипаза, и температуры, при которой фосфолипаза функционирует. Таким образом, например, можно проводить скрининг фосфолипазы для определения тех химических функциональных свойств, которые отличают гибридную фосфолипазу от исходных фосфолипаз, таких как (а) амидные (пептидные) связи, т.е. фосфолипазы; (Ь) сложноэфирные связи, т.е. фосфолипазы и липазы; (с) ацетали, т.е. гликозидазы и, например, температуры, рН или концентрации соли, при которых функционирует гибридный полипептид.

Источники полинуклеотидов, предназначенных для объединения с нуклеиновыми кислотами по изобретению, могут быть выделены из отдельных организмов (изолятов), коллекций организмов, которые были выращены на определенных средах (обогащенные культуры), или некультивированных организмов (образцы из окружающей среды). Использование независимого от культивирования подхода для получения полинуклеотидов, кодирующих новые виды биологической активности из образцов из окружающей среды, является наиболее предпочтительным, поскольку оно обеспечивает доступ к неизмененным источникам биологического разнообразия. Библиотеки окружающей среды получают из образцов из окружающей среды и представляют собой совокупные геномы природных организмов, сохраненные в клонирующих векторах, которые могут быть воспроизведены в подходящих прокариотических хозяевах. Вследствие того, что клонированную ДНК исходно выделяют непосредственно из образцов из окружающей среды, библиотеки не ограничиваются небольшой фракцией прокариот, которые могут быть выращены в монокультуре. Кроме того, упорядочивание ДНК из окружающей среды, представленной в этих образцах, может обеспечить более единообразную репрезентацию ДНК из всех видов, представленных в исходном образце. Это может привести к резкому повышению эффективности поиска представляющих интерес генов из менее представленных компонентов образца, который на несколько порядков значимости может быть более редко встречающимся по сравнению с доминантными видами.

Например, библиотеки генов, полученные из одного или нескольких некультивированных микроорганизмов, анализируют в отношении представляющей интерес активности. Потенциальные пути, кодирующие представляющие интерес биологически активные молекулы, сначала переносят в прокариотические клетки в форме библиотек для экспрессии генов. Полинуклеотиды, определяющие представляющие интерес виды активности, выделяют из библиотек и вводят в клетку-хозяина. Клетку-хозяин выращивают в условиях, которые обеспечивают рекомбинацию и/или редуктивную перестройку, с получением потенциально активных биологических молекул с новыми или усиленными видами активности.

Микроорганизмы, из которых могут быть получены гибридные полинуклеотиды, включают прокариотические микроорганизмы, такие как ЕиЬас1епа и АгскаеЬаскепа, и низшие эукариотические микроорганизмы, такие как грибы, некоторые водоросли и простейшие. Полинуклеотиды можно выделять из образцов из окружающей среды. Нуклеиновую кислоту можно выделять без культивирования организма или ее можно выделять из одного или нескольких культивированных организмов. В одном аспекте такие микроорганизмы могут быть экстремофилами, такими как гипертермофилы, психрофилы, психротрофы, галофилы, барофилы и ацидофилы. В одном аспекте для получения гибридных ферментов могут быть использованы полинуклеотиды, кодирующие ферменты фосфолипазы, выделенные из экстремофильных микроорганизмов. Такие ферменты могут функционировать при температурах свыше 100°С, например в горячих источниках на суше и в термических кратерах на больших глубинах при температурах ниже 0°С, например в арктических водах, в окружающей среде Мертвого моря, насыщенной солью, при значениях рН приблизительно 0, например в месторождениях угля и геотермических богатых серой источниках, или при значениях рН свыше 11, например в осадках сточных вод. Например, фосфолипазы, клонированные и экспрессированные из экстремофильных организмов, могут проявлять высокую активность в широком диапазоне температур и рН.

Полинуклеотиды, выбранные и выделенные, как описано в настоящем документе, включая по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту по изобретению, вводят в подходящую клетку-хозяин. Подходящая клетка-хозяин представляет собой любую клетку, способную обеспечивать рекомбинацию и/или редуктивную перестройку. Выбранные полинуклеотиды могут находиться в векторе, который включает соответствующие последовательности контроля. Клетка-хозяин может представлять собой клетку высших эукариот, такую как клетка млекопитающих, или клетку низших эукариот, такую как клетка дрожжей, или предпочтительно клетка-хозяин может представлять собой прокариотическую клетку, такую как бактериальная клетка. Введение конструкции в клетку-хозяина можно обеспечивать трансфекцией с фосфатом кальция, трансфекцией, опосредуемой ПЕАВ-декстраном, или электропорацией (Эау18 е1 а1., 1986).

Иллюстративными подходящими хозяевами могут быть любые из клеток-хозяев, известных специалистам в данной области, включая прокариотические клетки, эукариотические клетки, такие как клетки бактерий, клетки грибов, клетки дрожжей, клетки млекопитающих, клетки насекомых или клетки растений. Иллюстративные клетки бактерий включают любые виды родов Е8скепсЫа, ВасШи8, 81гер1о- 62 022979 тусе8, 8а1топе11а, Р8еи6отопа8 и 81арйу1ососси8, включая, например, Е8сйепс1йа сой, Ьас1ососси8 1асЙ8, Васй1и8 8иЬйЙ8, Васй1и8 сегеи8, 8а1топе11а (урйипипит, Р8еи6отопа8 Г1иоге8сеп8. Иллюстративные клетки грибов включают любые виды Л8регдШи8. Иллюстративные клетки дрожжей включают любые виды РюЫа, 8ассйаготусе8, 5сЫ/о8ассйаготусе8 или 8сйтаппютусе8, включая РюЫа ра8Юп8, 8ассйаготусе8 сеге\а81ае или 5сЫ/о8ассйаготусе8 ротЬе. Иллюстративные клетки насекомых включают любые виды 8ро6ор1ега или Ого8орЫ1а, включая Ого8орЫ1а 82 и 8ро6ор1ега 8Г9. Иллюстративные клетки животных включают клетки СНО, СО8 или меланомы Во\уе8 или любую клеточную линию мыши или человека. Выбор соответствующего хозяина находится в пределах квалификации специалистов в данной области. Предполагается, что селекция соответствующего хозяина для рекомбинации и/или редуктивной перестройки или только для экспрессии рекомбинантного белка находится в пределах квалификации специалистов в данной области, исходя из указаний, приведенных в настоящем документе. Системы клеточных культур млекопитающих, которые можно использовать для рекомбинации и/или редуктивной перестройки или только для экспрессии рекомбинантного белка включают, например, линии фибробластов почки обезьяны СО8-7, описанные в 8У40-1гап8Гогте6 81т1ап се118 8иррой 1йе герйсайоп оГ еаг1у 8У40 тШапб (ОЫ/тап, 1981), С127, 3Т3, СНО, НеЬа и ВНК. Экспрессирующие векторы млекопитающих должны содержать ориджин репликации, подходящий промотор и энхансер, а также любые необходимые участки связывания рибосом, участки полиаденилирования, доноры сплайсированного фрагмента и акцепторные участки, последовательности терминации транскрипции и фланкирующие 5'-конец нетранскрибируемые последовательности. Для получения требуемых нетранскрибируемых генетических элементов можно использовать последовательности ДНК, полученные из участков сплайсинга и полиаденилирования 8У40.

Клетки-хозяева, содержащие представляющие интерес полинуклеотиды (для рекомбинации и/или редуктивной перестройки или только для экспрессии рекомбинантного белка), можно культивировать в общепринятых питательных средах, модифицированных соответствующим образом для активации промоторов, селекции трансформантов или амплификации генов. Условия культивирования, такие как температура, рН и т.п., представляют собой условия, ранее использованные для клетки-хозяина, выбранной для экспрессии, и они будут понятны специалисту в данной области. Затем клоны, которые идентифицированы как обладающие специфической ферментативной активностью, можно секвенировать для идентификации полинуклеотидной последовательности, кодирующей фермент, обладающий увеличенной активностью.

В другом аспекте нуклеиновые кислоты и способы по настоящему изобретению можно использовать для получения новых полинуклеотидов для биохимических каскадов, например каскадов из одного или нескольких оперонов или кластеров генов или их фрагментов. Например, бактерии и множество эукариот обладают координированным механизмом регуляции генов, продукты которых вовлечены в сходные процессы. Гены образуют группы в структурах, называемых кластерами генов, на одной хромосоме и транскрибируются вместе под контролем единой регуляторной последовательности, включая единый промотор, который инициирует транскрипцию целого кластера. Таким образом, кластер генов представляет собой группу соседних генов, которые, как правило, либо идентичны, либо являются родственными в отношении их функции.

ДНК кластера генов можно выделять из различных организмов и лигировать в векторы, в частности в векторы, содержащие регуляторные последовательности для экспрессии, которые могут контролировать и регулировать продукцию детектируемого белка или совокупную активность, связанную с белком, в лигированном кластере генов. Использование векторов, которые обладают исключительно высокой способностью к встраиванию экзогенной ДНК, является особенно подходящим для таких кластеров генов и описано в данном описании в качестве примера, включая Г-фактор (или фактор фертильности) Е. сой. Г-Фактор Е. сой представляет собой плазмиду, которая инициирует самоперенос с высокой частотой в процессе конъюгации и является идеальной для получения и стабильного воспроизведения крупных фрагментов ДНК, таких как кластеры генов из смешанных микробных образцов. В качестве векторов для клонирования можно использовать фосмиды, космиды или векторы с искусственной бактериальной хромосомой (ВАС). Их получают из Г-фактора Е. сой, который способен стабильно встраивать большие сегменты геномной ДНК. В случае интеграции с ДНК из смешанного некультивированного образца из окружающей среды это делает возможным получать большие геномные фрагменты в форме ДНК библиотеки из окружающей среды. Космидные векторы изначально были разработаны для клонирования и воспроизведения крупных сегментов геномной ДНК. Клонирование в космидные векторы подробно описано 8атЬгоок е1 а1., в Мо1еси1аг С1отпд: А ЬаЬогакгу Мапиа1, 2п6 Е6., Со16 8рппд НагЬог ЬаЬогакгу Рге88 (1989). После дотирования в соответствующий вектор два или более векторов, содержащих различные гены синтетазы поликетида, могут быть введены в подходящую клетку-хозяин. Участки частичной гомологии последовательностей, общие для кластеров генов, будут промотировать процессы, которые приведут к реорганизации последовательностей, приводящей к гибридному кластеру генов. Может быть проведен скрининг нового гибридного кластера генов на наличие усиленной активности, не обнаруживаемой в исходных кластерах генов.

Таким образом, в одном аспекте изобретение относится к способу получения биологически актив- 63 022979 ного гибридного полипептида с использованием нуклеиновой кислоты по изобретению и к скринингу такого полипептида на наличие активности (например, усиленной активности) посредством:

1) введения в подходящую клетку-хозяин, по меньшей мере, первого функционально связанного полинуклеотида (например, нуклеиновой кислоты по изобретению) и второго функционально связанного полинуклеотида, где, по меньшей мере, первый полинуклеотид и второй полинуклеотид имеют по меньшей мере один общий участок частичной гомологии последовательностей;

2) выращивания клетки-хозяина в условиях, которые обеспечивают реорганизацию последовательностей, приводящую к функционально связанному гибридному полинуклеотиду;

3) экспрессии гибридного полипептида, кодируемого гибридным полинуклеотидом;

4) скрининга гибридного полипептида в условиях, которые обеспечивают идентификацию желаемой биологической активности (например, усиленной биологической активности); и

5) выделения полинуклеотида, кодирующего гибридный полипептид.

Методы анализа на наличие различных видов ферментативной активности известны специалистам в данной области и описаны в настоящем описании. Такие способы можно использовать при выделении полипептидов иполинуклеотидов по изобретению.

Перестройка ίη У1уо может быть направлена на межмолекулярный процесс, в совокупности называемый рекомбинацией. В бактериях она, как правило, рассматривается как КесА-зависимый феномен. Изобретение может основываться на процессе рекомбинации в клетке-хозяине для рекомбинации и перестройки последовательностей или способности клеток обеспечивать редуктивные процессы для снижения комплексности псевдоповторяющихся последовательностей в клетке посредством делеции. Этот процесс редуктивной перестройки осуществляется посредством внутримолекулярного, КесАнезависимого процесса. Таким образом, в одном аспекте изобретения новые полинуклеотиды можно получать способом редуктивной перестройки. Способ включает получение конструкций, содержащих последовательности (исходные кодирующие последовательности), их вставку в соответствующий вектор и их последующее введение в соответствующую клетку-хозяин. Перестройка отдельных молекулярных элементов происходит посредством комбинаторных процессов между последовательностями в конструкции, обладающей участками гомологии, или между псевдоповторяющимися единицами. В ходе перестройки происходит рекомбинация и/или снижение комплексности и протяженности повторяющихся последовательностей, и она приводит к получению новых молекулярных образцов.

Для повышения скорости перестройки можно использовать различные способы обработки. Они могут включать обработку ультрафиолетовым светом или повреждающими ДНК химическими веществами и/или использование линий клеток-хозяев, проявляющих повышенный уровень генетической нестабильности. Таким образом, способ рекомбинации может включать гомологичную рекомбинацию или природное свойство псевдоповторяющихся последовательностей направлять свои собственные изменения.

Повторяющиеся или псевдоповторяющиеся последовательности участвуют в генетической нестабильности. Псевдоповторы представляют собой повторы, которые не ограничиваются их структурой оригинальной единицы. Псевдоповторяющиеся единицы могут быть представлены в виде набора последовательностей в конструкции; последовательно расположенных единиц сходных последовательностей. После лигирования соединения между последовательностями становятся, по существу, незаметными, и псевдоповторяющаяся природа конечной конструкции становится постоянной на молекулярном уровне. Делеция в клетке происходит для снижения комплексности полученной конструкции посредством взаимодействий между псевдоповторяющимися последовательностями. Псевдоповторяющиеся единицы обеспечивают практически безграничный набор матриц, с помощью которых могут происходить случаи переноса. Конструкции, содержащие псевдоповторы, таким образом, эффективно обеспечивают достаточную молекулярную гибкость, чтобы случаи делеций (и, возможно, вставок) могли происходить, по существу, в любом месте в пределах псевдоповторяющихся единиц. В случае если все псевдоповторяющиеся последовательности лигированы в одинаковой ориентации, например голова к хвосту или наоборот, клетка не может различить отдельные единицы. Следовательно, редуктивный процесс может произойти по всей последовательности. Напротив, если, например, единицы представлены в ориентации голова к голове, в большей степени, чем голова к хвосту, инверсия определяет конечную точку соседней единицы, так что формирование делеций способствует потере отдельных единиц. Таким образом, для настоящего способа предпочтительно, чтобы последовательности находились в одинаковой ориентации. Случайная ориентация псевдоповторяющихся последовательностей приведет к потере эффективности рекомбинации, в то время как постоянная ориентация последовательностей обеспечит наибольшую эффективность. Однако, несмотря на то, что наличие непрерывных последовательностей в одинаковой ориентации снижает эффективность, оно, тем не менее, может обеспечить достаточную гибкость для эффективного получения новых молекул. Могут быть получены конструкции с псевдоповторяющимися последовательностями в одинаковой ориентации для обеспечения более высокой эффективности.

Последовательности могут быть собраны в ориентации голова к хвосту с использованием любого из различных способов, включая следующие: а) можно использовать праймеры, которые включают полиА-головной конец и поли-Т-хвост, которые в случае, если получены одноцепочечными, будут обеспечи- 64 022979 вать ориентацию; это дополняется наличием первых нескольких оснований в праймерах, полученных из РНК и, таким образом, они легко удаляются РНКазой Н; Ь) можно использовать праймеры, которые включают уникальные участки для расщепления рестриктазами; могут потребоваться множественные участки, ряд уникальных последовательностей и повторяющиеся стадии синтеза и лигирования; с) внутренние несколько оснований праймера можно тиолировать и можно использовать экзонуклеазу для получения молекул с правильными хвостами.

Выделение повторно собранных последовательностей основано на идентификации клонирующих векторов с уменьшенным индексом повторов (ΚΙ). Повторно собранные кодирующие последовательности затем можно выделять посредством амплификации. Продукты повторно клонируют и экспрессируют. Выделение клонирующих векторов со сниженным ΚΙ может быть достигнуто: 1) использованием векторов, только стабильно поддерживаемых в случае, если в конструкции снижена комплексность; 2) физическим получением укороченных векторов физическими методами; в этом случае может быть получен клонирующий вектор с использованием стандартных способов выделения плазмид и разделения по размеру либо в агарозном геле, либо на колонке с низкомолекулярным порогом с использованием стандартных методик; 3) получением векторов, содержащих разделенные гены, которые могут быть отобраны при уменьшении размера вставки; 4) использованием технологий направленной селекции с экспрессирующим вектором и соответствующей селекцией.

Кодирующие последовательности (например, гены) из родственных организмов могут демонстрировать высокую степень гомологии и кодировать совершенно разные белковые продукты. Эти типы последовательностей особенно полезны в настоящем изобретении в качестве псевдоповторов. Однако этот способ не ограничивается такими практически идентичными повторами.

Следующий пример демонстрирует способ по изобретению. Описаны кодирующие последовательности нуклеиновых кислот (псевдоповторы), полученные из трех (3) уникальных образцов. Каждая последовательность кодирует белок с различным набором свойств. Каждая из последовательностей отличается единственной или несколькими парами оснований в определенном положении в последовательности. Псевдоповторяющиеся последовательности отдельно или совместно амплифицируют и лигируют в случайные объединенные последовательности, так чтобы в группе лигируемых молекул были возможны различные перестановки и комбинации. Количества псевдоповторяющихся единиц может контролироваться условиями сборки. Среднее количество псевдоповторяющихся единиц в конструкции определяют как индекс повторов (ΚΙ). После формирования конструкции могут быть или не могут быть разделены по размеру в агарозном геле в соответствии с опубликованными протоколами, встроены в клонирующий вектор и трансфецированы в соответствующую клетку-хозяин. Затем клетки размножаются и происходит редуктивная перестройка. Если желательно, скорость редуктивной перестройки можно увеличивать путем внесения повреждений в ДНК. Является ли снижение ΚΙ опосредованным образованием делеции между повторяющимися последовательностями по внутримолекулярному механизму или оно опосредуется случаями, подобными рекомбинации по межмолекулярным механизмам, несущественно. Конечным результатом является перестройка молекул во всех возможных комбинациях. В одном аспекте способ необязательно включает дополнительную стадию скрининга членов библиотеки из перестроенной группы для идентификации индивидуальных перестроенных членов библиотеки, обладающих способностью связываться, или иначе взаимодействовать, или катализировать конкретную реакцию (например, таких как каталитические домены фермента) с предопределенной макромолекулой, такой как, например, белковый рецептор, олигосахарид, вирион или другое предопределенное соединение или структура. Полипептиды, например фосфолипазы, которые идентифицируют с помощью таких библиотек, можно использовать для различных целей, например в промышленных способах, описанных в настоящем документе, и/или можно подвергать одному или нескольким дополнительным циклам шаффлинга и/или селекции.

В другом аспекте предусматривается, что перед или в ходе рекомбинации или перестройки, полинуклеотиды, полученные способом по изобретению, можно подвергать воздействию средств или способов, которые обеспечивают внесение мутаций в исходные полинуклеотиды. Внесение таких мутаций может повышать разнообразие конечных гибридных полинуклеотидов и полипептидов, кодируемых ими. Средства или способы, которые обеспечивают мутагенез, могут включать, но не ограничиваться ими: (+)-СС-1065 или синтетический аналог, такой как (+)-СС-1065-(№-аденин) (см. 8ип апД Ниг1су, (1992)); ^ацетилированный или деацетилированный 4'-фтор-4-аминобифенильный аддукт, способный ингибировать синтез ДНК (см., например, νаη Де Ро11 с! а1. (1992)); или ^ацетилированный или деацетилированный 4-аминобифенильный аддукт, способный ингибировать синтез ДНК (см. также νаη Де Ро11 е! а1. (1992), р. 751-758); трехвалентный хром, трехвалентную соль хрома, ДНК-аддукты на основе полициклических ароматических углеводородов (РАН), способные ингибировать репликацию ДНК, такие как 7-бромметилбенз[а]антрацен (ВМА), трис(2,3-дибромпропил)фосфат (Тпк-ВР), 1,2-дибром-3хлорпропан (БВСР), 2-бромакролеин (2ВА), бензо[а]пирен-7,8-дигидродиол-9-10-эпоксид (ВРБЕ), галогеновая соль платины(11), №гидрокси-2-амино-3-метилимидазо[4,5-Г]хинолин (Н-гидрокси-1О) и №гидрокси-2-амино-1-метил-6-фенилимидазо[4,5-Г]пиридин (№гидрокси-РЫР). Иллюстративные способы замедления или остановки амплификации ПЦР включают УФ-свет, (+)-СС-1065 и (+)-СС-1065-(К3- 65 022979 аденин). В частности, включенные средства представляют собой ДНК-аддукты или полинуклеотиды, содержащие ДНК-аддукты из полинуклеотидов или группы полинуклеотидов, которые могут быть удалены методом, включающим нагревание раствора, содержащего полинуклеотиды, перед дальнейшей обработкой.

Способы скрининга и устройство для исследования οη-1ΐηβ

В осуществлении на практике способов по изобретению могут быть использованы различные устройства и способы в отношении полипептидов и нуклеиновых кислот по изобретению, например, для скрининга полипептидов в отношении активности фосфолипазы, для скрининга соединений в качестве потенциальных модуляторов активности (например, усиление или ингибирование активности фермента), для антител, которые связываются с полипептидом по изобретению, для нуклеиновых кислот, которые гибридизуются с нуклеиновой кислотой по изобретению, и т.п.

Твердые подложки с иммобилизованным ферментом

Ферменты фосфолипазы, их фрагменты и нуклеиновые кислоты, которые кодируют ферменты и фрагменты, можно прикреплять к твердой подложке. Это часто является экономичным и эффективным при применении фосфолипаз в промышленных процессах. Например, набор или коктейль ферментов фосфолипаз (или их активных фрагментов), которые используют в конкретной химической реакции, можно связывать с твердой подложкой и окунать в бак для переработки. Может происходить ферментативная реакция. Затем твердую подложку можно извлекать из бака вместе с ферментами, прикрепленными к ней, для повторного применения. В одном варианте осуществления изобретения с твердой подложкой связывается выделенная нуклеиновая кислота по изобретению. В другом варианте осуществления изобретения твердая подложка выбрана из группы из геля, смолы, полимера, керамики, стекла, микроэлектрода и любой их комбинации.

Например, твердые подложки, пригодные для этого изобретения, включают гели. Некоторые примеры гелей включают Зсрйаго8с, желатин, глутаральдегид, обработанный хитозаном глутаральдегид, альбумин-глутаральдегид, хитозан-ксантан, гель Тоуорсаг1 (полимерный гель), альгинат, альгинатполилизин, каррагенан, агарозу, глиоксилагарозу, магнитную агарозу, декстран-агарозу, поли(карбамоилсульфонатный) гидрогель, ВЗА-РЕО гидрогель, фосфорилированный поливиниловый спирт (РVА), моноаминоэтил-Ы-аминоэтил (МАЫА) амин или любую их комбинацию.

Другие твердые подложки, пригодные для настоящего изобретения, представляют собой смолы или полимеры. Некоторые примеры смол или полимеров включают целлюлозу, акриламид, нейлон, вискозу, полиэфир, анионообменную смолу, АМВЕКЫТЕ™ ХАЭ-?, АМВЕКЫТЕ™ ХАЭ-8, АМВЕКЫТЕ™ 1КА94, АМВЕКиТЕ™ 1КС-50, поливинил, полиакриловый полиметакрилат, или любую их комбинацию.

Другим типом твердой подложки, пригодным в настоящем изобретении, является керамика. Некоторые примеры включают непористую керамику, пористую керамику, ЗЮ₂, А1₂О₃. Другим типом твердой подложки, пригодным для настоящего изобретения, является стекло. Некоторые примеры включают непористое стекло, пористое стекло, аминопропиловое стекло или любую их комбинацию. Другим типом твердой подложки, который можно использовать, является микроэлектрод. Примером является покрытый полиэтиленимином магнетит. В качестве твердой подложки можно использовать графитовые частицы.

Другие иллюстративные твердые подложки, используемые для осуществления изобретения на практике, включают продукты на основе диатомитовой земли и силикаты. Некоторые примеры включают диатомиты СБЫТЕ®, КЕЫ1ТЕ®, Э1АСТ^®, РК1М1З1Ь®, ЭМРЕ®, и синтетические силикаты кальция и магния М1СКО-СЕБ®, САТРЬО®, З1ЬАЗОКВ™ и СЕЬКАТЕ®. Другим примером твердой подложки является клетка, такая как эритроцит.

Способы иммобилизации

Существует множество способов, которые могут быть известны специалисту в данной области, для иммобилизации ферментов или фрагментов или нуклеиновых кислот на твердую подложку. Некоторые примеры таких способов включают, например, электростатическое формирование капель, электромеханические способы, путем адсорбции, путем ковалентного присоединения, путем перекрестного сшивания, путем химической реакции или процесса, путем инкапсулирования, путем окружения, с помощью альгината кальция или с помощью поли(2-гидроксиэтилметакрилата). Подобные способы описаны в Мс!йоД8 ш Еп/утокду, 1ттоЫП/сД Еп/утс8 апД Сс118, Рай С 1987. АсаДстю Ргс88. ЕДйсД Ьу З.Р. Со1оуюк апД О. Кар1ап. №1итс 136; и ИптоЫП/аЕоп ой Еп/утс8 апД Сс118. 1997. Нитапа Ргс88. ЕДйсД Ьу О.Р. Вюксг8!ай. Зспс8: Мс!йоД8 т Вю!ссйпо1оду, ЕДйсД Ьу I. М. Vа1кс^.

Капиллярные матрицы

В способах по изобретению можно использовать капиллярные матрицы, такие как ОIОЛМАТКIX™, Э|усг8а Согрогайоп, Зап Эюдо, СА. Нуклеиновые кислоты или полипептиды по изобретению можно имммобилизовывать или наносить на матрицу, в том числе на капиллярную матрицу. Матрицы можно использовать для скрининга или исследования библиотек композиций (например, низкомолекулярных соединений, антител, нуклеиновых кислот и т.д.) в отношении их способности связываться с нуклеиновой кислотой или полипептидом по изобретению или модулировать их активность. Капиллярные матрицы относятся к другой системе для хранения и скрининга образцов. Например, уст- 66 022979 ройство для скрининга образцов может включать множество капилляров, составляющих матрицу из смежных капилляров, где каждый капилляр содержит по меньшей мере одну стенку, определяющую просвет для хранения образца. Кроме того, устройство может включать промежуточный материал, расположенный между соседними капиллярами в матрице, и одну или несколько эталонных шкал в промежуточном материале. Капилляр для скрининга образца, где капилляр адаптирован для того, чтобы быть связанным в матрице капилляров, может включать первую стенку, определяющую просвет для удержания образца, и вторую стенку, образованную из фильтрующего материала, для фильтрации энергии возбуждения, передаваемой в просвет для возбуждения образца.

Полипептид или нуклеиновая кислота, например лиганд, можно вводить в первом компоненте по меньшей мере в одну часть капилляра капиллярной матрицы. Каждый капилляр капиллярной матрицы может содержать по меньшей мере одну стенку, определяющую просвет для хранения первого компонента. После первого компонента в капилляр могут подаваться пузырьки воздуха. В капилляр можно подавать второй компонент, где второй компонент отделен от первого компонента пузырьком воздуха. Представляющий интерес образец можно подавать в качестве первой жидкости, меченной поддающимися детекции частицами, в капилляр капиллярной матрицы, где каждый капилляр капиллярной матрицы содержит по меньшей мере одну стенку, определяющую просвет для хранения первой жидкости и поддающихся детекции частиц, и где по меньшей мере одна стенка покрыта связывающим материалом для связывания поддающейся детекции частицы по меньшей мере с одной стенкой. Кроме того, способ может включать удаление первой жидкости из капиллярной трубки, где связанные поддающиеся детекции частицы остаются в капилляре, и подачу второй жидкости в капиллярную трубку.

Капиллярная матрица может включать множество отдельных капилляров, содержащих по меньшей мере одну стенку, определяющую просвет. Внешняя стенка капилляра может представлять собой одну или несколько стенок, сплавленных вместе. Аналогично, стенка может определять просвет цилиндрической, квадратной, шестиугольной или любой другой геометрической формы, при условии, что стенки формируют просвет для хранения жидкости или образца. Капилляры капиллярной матрицы могут находиться вместе в непосредственной близости с формированием плоскостной структуры. Капилляры могут быть связаны друг с другом, посредством сплавления (например, если капилляры изготовлены из стекла), склеивания, связывания или они могут быть скрепленными стенка к стенке. Капиллярная матрица может быть образована любым количеством отдельных капилляров, например, в диапазоне от 100 до 4000000 капилляров. Капиллярная матрица может формировать микропланшет для титрования, имеющий приблизительно 100000 или более отдельных капилляров, связанных вместе.

Матрицы или биочипы

Нуклеиновые кислоты или полипептиды по изобретению могут быть иммобилизованы или нанесены на матрицу. Матрицы можно использовать для скрининга или анализа библиотек композиций (например, низкомолекулярных соединений, антител, нуклеиновых кислот и т.д.) в отношении их способности связываться с нуклеиновой кислотой или полипептидом по изобретению или модулировать их активность. Например, в одном аспекте данного изобретения анализируемым параметром является экспрессия транскрипта гена фосфолипазы. Один, или несколько, или все транскрипты клетки можно определять гибридизацией образца, содержащего транскрипты клетки, или нуклеиновые кислоты, репрезентативные или комплементарные транскриптам клетки, гибридизацией с иммобилизованными нуклеиновыми кислотами на матрице, или биочипе. С использованием матрицы нуклеиновых кислот на микрочипе некоторые или все транскрипты клетки могут быть одновременно определены количественно. Альтернативно, можно использовать матрицы, содержащие геномные нуклеиновые кислоты, для определения генотипа вновь полученного способами инженерии штамма, полученного способами по изобретению. Также для одновременного количественного определения множества белков можно использовать полипептидные матрицы.

В альтернативных вариантах осуществления изобретение относится к матрицам или микроматрицам или биочипам, или чипам, содержащим множество элементов-мишеней, где каждый элементмишень может содержать определенное количество одного или нескольких полипептидов (включая антитела) или нуклеиновых кислот, иммобилизованных на определенной площади поверхности с субстратом, и по меньшей мере одна нуклеиновая кислота и/или полипептид представляет собой нуклеиновую кислоту и/или полипептид по этому изобретению.

Настоящее изобретение может быть осуществлено на практике с, или может содержать любой известной матрицей, также называемой микроматрицей, или матрицей нуклеиновых кислот, или полипептидной матрицей, или матрицей антител, или биочипом, или их вариантами. Матрицы представляют собой, в общем, множество пятен или элементов-мишеней, где каждый элемент-мишень содержит определенное количество одной или нескольких биологических молекул, например олигонуклеотидов, иммобилизованных на определенной площади поверхности с субстратом для специфического связывания молекулы образца, например транскриптов мРНК.

В осуществлении на практике способов по изобретению можно использовать любую известную матрицу и/или способ получения и использования матриц, в целом или частично, или их варианты, как описано, например, в патентах США №№ 6277628; 6277489; 6261776; 6258606; 6054270; 6048695;

- 67 022979

6045996; 6022963; 6013440; 5965452; 5959098;5856174; 5830645; 5770456; 5632957; 5556752; 5143854; 5807522; 5800992; 5744305; 5700637; 5556752; 5434049; см. также, например, νΟ 99/51773; 99/09217; 97/46313; 96/17958; см. также, например, 1оЬпз!оп (1998) Сигг. Βω!, 8:Ρ171-Ρ174; δсΗитте^ (1997) Β^ο!есЬη^^иек, 23:1087-1092; Кет (1997) Β^ο!есЬη^^иек, 23:120-124; δο1^ηак-Το1йο (1997) Оепек, СЬготокотек & Сапсег, 20:399-407; Βον!е11 (1999) ка!иге Оепейск δирр., 21:25-32. См. также опубликованные патентные заявки США №№ 20010018642; 20010019827; 20010016322; 20010014449; 20010014448; 20010012537; 20010008765.

Антитела и способы скрининга на основе антител

Изобретение относится к выделенным, синтетическим или рекомбинантным антителам, которые специфично связываются с фосфолипазой по изобретению. Эти антитела можно использовать для выделения, идентификации и количественного определения фосфолипаз по изобретению или сходных полипептидов. Эти антитела можно использовать для ингибирования активности фермента по изобретению. Эти антитела можно использовать выделения полипептидов, родственных полипептидам по изобретению, например, родственных ферментов фосфолипаз.

Антитело по изобретению может включать пептид или полипептид, полученный из, смоделированный после или, по существу, кодируемый геном иммуноглобулинов или генами иммуноглобулинов, или его фрагменты, способные специфически связываться с антигеном или эпитопом, см., например, Рипйатеп!а1 1ттипо1оду, Пнгй ЕйШоп, ν.Ε. Ριη1, ей., Ратеп Ρτοδδ, Ν.Υ. (1993); Vйкοη (1994) 1. 1ттипо1. Μе!Ьοйк, 175:267-273; АагтикЬ (1992) 1. ΒΦ^ι. Β^Ηγ®. Μе!Ьοйк, 25:85-97. Термин антитело включает антигенсвязывающие фрагменты, т.е. антигенсвязывающие участки (например, фрагменты, подпоследовательности, гипервариабельные участки (СОР)), которые сохраняют способность связывать антиген, включая (ί) РаЬ-фрагмент, одновалентный фрагмент, состоящий из доменов УЪ, УН, СЬ и СН1; (ίί) Р(аЬ')₂ фрагмент, двухвалентный фрагмент, содержащий два РаЬ-фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (ίίί) Рй-фрагмент, состоящий из доменов УН и СН1; (ίν) Ρνфрагмент, состоящий из доменов УЪ и УН на одном плече антитела, (ν) йΑЬ-фрагмент (^агй е! а1. (1989) кашгс, 341:544-546), который состоит из домена УН; и (νί) отдельного гипервариабельного участка (СОР). Одноцепочечные антитела также входят в понятие термина антитело.

Антитела можно использовать в иммунопреципитации, окрашивании (например, ΡΑСδ), в иммуноаффинных колонках и т.п. Если желательно, последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие специфические антигены, можно получать путем иммунизации с последующим выделением полипептида или нуклеиновой кислоты, амплификацией или клонированием и иммобилизацией полипептида на матрице по изобретению.

Альтернативно, способы по изобретению можно использовать для модификации структуры антител, продуцируемых клеткой, предназначенной для модификации, например, аффинность антител можно повышать или снижать. Более того, способность получать или модифицировать антитела может представлять собой полученный способами инженерии фенотип в клетке посредством способов по изобретению.

Способы иммунизации, получения и выделения антител (поликлональных и моноклональных) известны специалистам в данной области и описаны в научной и патентной литературе, см., например, СоИдап, Π,'ΡΡΕΝΤ ΡΡΟΤΟί'ΟΙ,δ ΙΝ IΜΜυNΟ^ΟΟΥ, ’№Пеу/Отеепе, ΝΥ (1991); δΐΐΟ (ейк.) ΒΑδΚ.’ ΑΝΏ ί'ΡΙΝΚ'ΑΡ IΜΜυNΟ^ΟΟΥ (7^!Ь ей.) Ьапде \1есйса1 ΡиЬ1^саί^οηδ, Ьок Αωβ, СΑ (ЗШез); Оойшд, ΜΟΝΟί'ΡΟΝΑΡ ΑΝΤΙΒΟΌΙΕδ: ΡΡΙΝί'ΙΡΡΕδ ΑΝΏ ΡΡΑСΤIСЕ (2й ей.) /01^11 нс Юкк, Νβν Аогк, ΝΥ (1986); КоЬ1ег (1975) ХаПие 256:495; Наг1о» (1988) ΑΝΤΙΒΟΌΙΕδ, Α ΕΑΒΟΡΑΤΟΡΥ ΜΑΝΕΑΕ, Со1й δр^^ηд НагЬог ΡиЬ1^саι^οηк. Νρ» ¥огк. В дополнение к традиционным способам ш утуо с использованием животных антитела также можно получать ш уйто, например с использованием демонстрационных библиотек фагов, экспрессирующих рекомбинантные участки связывания антител. См., например, НоодепЬоот (1997) ’ГгепЙБ Β^ο!есЬηο1., 15:62-70; Ка!/ (1997) Αηηи. Рру. Β^^δ. ΒωΜ δίΓίκΕ, 26:27-45.

Полипептиды можно использовать для получения антител, которые специфично связываются с полипептидами или фрагментами. Полученные в результате антитела могут быть использованы в методах иммуноаффинной хроматографии для выделения или очистки полипептида, или для определения наличия полипептида в биологическом образце. В таких методиках препарат белка, такой как экстракт или биологический образец, контактируют с антителами, способными специфично связываться с одним из полипептидов по изобретению.

В иммуноаффинных методиках антитела присоединяют к твердой подложке, такой как гранулы или другая матрица колонки. Препарат белка контактируют с антителами в условиях, при которых антитела специфично связываются с одним из полипептидов по изобретению. После промывания для удаления неспецифично связанных белков элюируют специфично связавшиеся полипептиды.

Способность белков в биологическом образце связываться с антителами можно определять с использованием любой из различных методик, известных специалистам в данной области. Например, связывание может быть определено мечением антител детектируемой меткой, такой как флуоресцентное вещество, ферментативная метка или радиоизотоп. Альтернативно, связывание антител с образцом может быть определено с использованием вторичных антител с такой детектируемой меткой на них. Кон- 68 022979 кретные способы анализа включают анализы ЕЫ8А, сэндвич-анализы, радиоиммунные анализы и вестерн-блот-анализы.

Поликлональные антитела, полученные против полипептидов по изобретению можно получать путем непосредственной инъекции полипептидов животному или введения полипептидов животному, например, не относящемуся к человеку. Полученные таким образом антитела будут затем связывать сам полипептид. Таким образом, даже последовательность, кодирующая только фрагмент полипептида, может быть использована для получения антител, которые могут связываться с целым нативным полипептидом. Такие антитела затем можно использовать для выделения полипептида из клеток, экспрессирующих данный полипептид.

Для получения моноклональных антител можно использовать любой способ, который обеспечивает получение антител, продуцируемых непрерывными культурами клеточных линий. Примеры включают способы с гибридомами, способ с триомами, способ В-клеточной гибридомы и способ ЕВУ-гибридомы (Со1е, е! а1., 1985, Моηос1оηа1 АпйЬоб1е8 апб Сапсег ТЬегару, А1ап К. Ей, 1пс., р. 77-96).

Способы, описанные для получения одноцепочечных антител (патент США № 4946778), можно адаптировать для получения одноцепочечных антител против полипептидов по изобретению. Альтернативно, для экспрессии гуманизированных антител против указанных полипептидов или их фрагментов можно использовать трансгенных мышей.

Антитела, полученные против полипептидов по изобретению, можно использовать для скрининга аналогичных полипептидов из других организмов и образцов. В таких способах полипептиды из организма контактируют с антителами и определяют те полипептиды, которые специфически связываются с антителами. Для определения антител могут быть использованы любые из описанных выше методик.

Наборы

Изобретение относится к наборам, содержащим композиции, например нуклеиновые кислоты, экспрессирующие кассеты, векторы, клетки, полипептиды (например, набор, имеющий по меньшей мере одну фосфолипазу по изобретению) и/или антитела по изобретению (например, набор, имеющий по меньшей мере одно антитело по изобретению). Наборы могут содержать ферменты для переработки (получения) биотоплив, детергентов или для обработки или переработки пищевых продуктов, кормов, биомассы, добавок в пищу или в корма или питательных добавок и т.п. Наборы также могут содержать учебный материал, обучающий методикам и промышленному использованию изобретения, как описано в данном описании.

Промышленное и медицинское применение ферментов по изобретению

Изобретение относится ко многим промышленным применениям и медицинским применениям с использованием полипептидов по изобретению, например фосфолипазы и других ферментов по изобретению, например фосфолипаз А, В, С и Ό, пататинов, включая конвертирование негидратируемого фосфолипида в гидратируемую форму, получение биотоплив и переработку биомассы, рафинирование масла, переработку масел из растений, рыб, водорослей и т.п., среди многих других применений. В любых из этих альтернативных промышленных применений и медицинских применений ферменты можно добавлять в конкретном порядке, например фосфолипазы с отличающейся специфичностью добавляют в конкретном порядке, например сначала добавляют фермент с активностью гидролиза РС и РЕ (или добавляют два фермента, один с активностью гидролиза РС, а другой с активностью гидролиза РЕ), затем добавляют фермент с активностью гидролиза Р1 (например, активностью РЬС или Р1-РЬС) или любая их комбинация.

Любые или все из способов по изобретению можно применять в производственном масштабе, например, в переработке или очистке масла в масштабе приблизительно от 15000; 25000; 50000; 75000 или 100000 фунтов (6,8, 11,3, 22,7, 34,0, 45,4 т) очищенного масла/сутки до приблизительно 1, 2, 3, 4, 5 или 6 или более миллионов фунтов (454, 907, 1361, 1814, 2268, 2722 т) очищенного масла/сутки.

Способы применения ферментов фосфолипаз в промышленных применениях хорошо известны в данной области. Например, фосфолипазы и способы по изобретению можно применять для переработки жиров и масел, как описано, например, в публикации патентной заявки !Р Н6-306386, в которой описана конверсия фосфолипидов, присутствующих в маслах и жирах, в растворимые в воде вещества, содержащие группы фосфорной кислоты.

Фосфолипазы по изобретению можно использовать для переработки растительных масел и фосфолипидов, таких как растительные масла и фосфолипиды, происходящие или выделенные из рисовой шелухи, сои, канолы, пальмы, семян хлопчатника, кукурузы, ядра косточек пальм, кокоса, арахиса, кунжута, подсолнуха. Фосфолипазы по изобретению можно использовать для переработки эфирных масел, например эфирных масел из масел семян плодов, например виноградных косточек, абрикоса, огуречника и т.д. Фосфолипазы по изобретению можно использовать для переработки масел и фосфолипидов в различных формах, включая неочищенные формы, рафинированные формы, камеди, смывную воду, глину, кремнизем, соапсток и т.п. Фосфолипиды по изобретению можно использовать для переработки масел с высоким содержанием фосфора, рыбьих жиров, животных масел, растительных масел, масел из водорослей и т.п. Во многих аспектах изобретения каждый раз можно использовать фосфолипазу С, альтернативно можно использовать фосфолипазу Ό по изобретению и фосфатазу (например, с использованием

- 69 022979 комбинации РЬО/фосфатаза для увеличения выхода масла с высоким содержанием фосфора, такого как соевое масло).

Фосфолипазы по изобретению можно использовать для переработки и получения пищевых масел, биодизельных масел, липосом для фармацевтических средств и косметических средств, структурированных фосфолипидов и структурированных липидов. Фосфолипазы по изобретению можно использовать в экстракции масел. Фосфолипазы по изобретению можно использовать для переработки и получения различных мыл.

В другом варианте осуществления в настоящем документе предусмотрен способ получения фосфолипида из пищевого масла. В определенном варианте осуществления фосфолипиды, полученные способами, предоставленными в настоящем документе, включают различные фосфолипиды, включая, но не ограничиваясь ими, фосфатидилхолин (РС), фосфатидилэтаноламин (РЕ), фосфатидилсерин (Р8), фосфатидилинозитол (Р^, фосфатидную кислоту (РА), лизофосфатидилхолин (ЬРС), лизофосфатидилэтаноламин (ЬРЕ), лизофосфатидилсерин (ЬР8), лизофосфатидилинозитол (ЕРО- лизофосфатидную кислоту (ЬРА), холин (С), этаноламин (Е), серин (8) и инозитол (I).

Переработка пищевых масел: получение 1,3-диацилглицерина (1,3-ЭАС)

Изобретение относится к способам использования фермента(ов) по изобретению для получения 1,3диацилглицерина (1,3-ЭАС). В одном аспекте фосфолипаза С или фосфолипаза Ό вместе с фосфатазой образуют 1,2-диацилглицерин; это повышает выход масла в ходе очистки пищевых масел. При использовании в способе, который включает стадию нейтрализации щелочью, например, в качестве добавки для щелочной очистки, вплоть до 70% 1,2-диацилглицерида (1,2-ЭАС) подвергается миграции ацильной группы и конвертируется в 1,3-ЭАС. 1,3-ЭАС обладает повышенной пользой для здоровья и, таким образом, применение РЬС в качестве добавки при щелочной очистке обеспечивает масло с увеличенной пищевой ценностью.

Изобретение относится к способам использования фермента(ов) по изобретению для получения и обработки пищевых масел, включая получение пищевых масел с увеличенными количествами 1,3-ЭАС. Диацилглицерины представляют собой природные соединения, встречающиеся во многих пищевых маслах. В одном аспекте способа по изобретению, например, способа рафинирования масла, основание (щелочь) вызывает изомеризацию 1,2-ЭАС, продуцируемого с помощью РЬС, до 1,3-ЭАС, что обеспечивает питательную пользу для здоровья относительно 1,2-ЭАС, например, 1,3-ЭАС сжигается в качестве энергии вместо запасания в качестве жира (как в случае 1,2-ЭАС). Путем добавления РЬС в начале процесса щелочного рафинирования (и кислоты и щелочи впоследствии), способы по изобретению обеспечивают увеличенный уровень 1,3-ЭАС (снижение 1,2-ЭАС). С точки зрения пищевой ценности, 1,3-ЭАС лучше для потребителя, чем 1,2-ЭАС. В альтернативных аспектах изобретение включает способ рафинирования масла с использованием РЬС по изобретению, тем самым конечный продукт в виде рафинированного масла содержит не менее чем 0,5, 1,0, 2,0 или 3,0% или более Е3-ЭАС.

Таким образом, изобретение относится к способу получения (путем переэтерификации) очищенного масла (например, диацилглицеринового масла), включая пищевые масла, содержащего увеличенные уровни 1,3-диацилглицерина (Е3-ОАС), где фосфолипазу, такую как фермент по изобретению, добавляют первоначально или добавляют до добавления кислоты или щелочи. Получение ЭАС ферментативным гидролизом из триглицерида обеспечивают переэтерификацией 1,3-ЭАС из 1,2-ЭАС. Содержащее 1,3-ЭАС пищевое масло демонстрирует отличающиеся метаболические эффекты по сравнению с обычными пищевыми маслами. Различия в метаболических каскадах между 1,3-ЭАС и либо 1,2-ЭАС, либо триглицеридами позволяет большей части жирных кислот из 1,3 диацилглицерина сжигаться в качестве энергии, а не запасаться в качестве жира. Клинические испытания показали, что регулярное употребление масла с ЭАС в качестве части продуманной диеты может помочь индивидуумам контролировать их массу тела и телесный жир. Кроме того, метаболизм 1,3-ЭАС снижает циркулирующие в кровотоке триглицериды после приема пищи. Поскольку ожирение и повышенный уровень липидов в крови ассоциированы в качестве факторов риска с хроническими заболеваниями, включая сердечно-сосудистые заболевания и диабет типа II, на эти связанные с образом жизни состояния здоровья можно повлиять благоприятным образом путем регулярного употребления масел с ЭАС.

Употребление содержащего ЭАС масла может происходить различными способами. Таким образом, в одном аспекте изобретение относится к способу использования фермента по изобретению для получения продукта питания, например выпекаемого продукта, обладающего увеличенными уровнями диацилглицерина 1,3-ЭАС и хлебобулочных изделий, содержащих масла с диацилглицерином. В одном аспекте хлебобулочные изделия представляют собой печенья, кексы и сходные хлебобулочные изделия.

В альтернативных вариантах осуществления комбинация ферментов, которые можно использовать в способах по изобретению, включая переработку пищевых масел, включает (где один, несколько или все из ферментов в композиции содержат фермент по настоящему изобретению)

РЬС+РЬРЬС+РЬА (РЬА добавляют после завершения реакций РЬС);

РЬП+фосфатаза+РЬРЬС, а затем РЬА или

РЬС или (РЬС+РЬРЬСЦРЬА, специфичная к фосфатидной кислоте (все ферменты добавляют вместе или последовательно).

- 70 022979

Рафинирование масла и переработка растительного масла

Ферменты по изобретению (например, полипептиды по изобретению, облагающие активностью липазы, фосфолипазы, эстеразы и/или гликозидазы или эквивалентной активностью) можно использовать на различных стадиях переработки растительного масла, например при экстракции растительного масла, в частности при удалении фосфолипидных камедей в процессе, называемом рафинирование масла.

Эти способы по изобретению можно использовать в производственном масштабе, например в масштабе приблизительно от 15000; 25000; 50000; 75000 или 100000 фунтов (6,8, 11,3, 22,7, 34,0, 45,4 т) очищенного масла/сутки до приблизительно 1, 2, 3, 4, 5 или 6 или более миллионов фунтов (454, 907, 1361, 1814, 2268, 2722 т) очищенного масла/сутки.

В одном аспекте изобретение относится к способу рафинирования масла, включающему применение фосфолипазы по изобретению, например РЬС, например Р1-РЬС по изобретению. В одном аспекте способ, кроме того, включает добавление другой фосфолипазы (которая также может представлять собой фосфолипазу по изобретению), например другой РЬС, РЬА, РЬВ, РЬВ или пататина по изобретению, или фермента (который также может представлять собой фермент по изобретению), имеющего активность лизофосфолипазы-трансацилазы (ЬРТА) или активность лизофосфолипазы (ЬРЬ) и активность лизофосфолипазы-трансацилазы (ЬРТА), или их комбинацию, и/или пататин-подобной фосфолипазы (которая также может быть ферментом по изобретению). В одном аспекте все ферменты добавляют вместе, или, альтернативно, ферменты добавляют в конкретном порядке, например после добавления РЬС добавляют РЬА и/или пататин; или сначала добавляют фермент или ферменты по изобретению, имеющие активность РС и РЕ, а затем добавляют Р1-РЬС.

В одном аспекте этот способ обеспечивает улучшение выхода в результате обработки фосфолипазой (например, РЬС по изобретению). В одном аспекте этот способ обеспечивает дополнительное снижение содержания фосфора в масле в результате обработки фосфолипазой (например, РЬА по изобретению).

В одном аспекте изобретение относится к способам, включающим применение фосфолипазы по изобретению, например РЬС или Р1-РЬС по изобретению, для снижения массы камеди и увеличения содержания нейтрального масла (триглицерида) путем снижения удержания масла. В одном аспекте изобретение относится к способам, включающим применение фосфолипазы по изобретению, например, РЬС по изобретению, например, Р1-РЬС по изобретению, для увеличения продукции нейтральных масел и диацилглицерина (БАО) в масляной фазе. В альтернативных аспектах способы по изобретению (например, способы рафинирования) могут включать один или несколько других ферментов, таких как протеаза, амилаза, липаза, кутиназа, другая фосфолипаза (включая, например, фермент по изобретению), карбогидраза, целлюлаза, пектиназа, маннаназа, арабиназа, галактаназа, ксиланаза, оксидаза, например, лактаза и/или пероксидаза, или полипептидов с эквивалентной активностью или их комбинации.

Фосфолипазы по изобретению можно использовать на различных стадиях переработки растительного масла, например, таких как экстракция растительного масла, в частности удаление фосфолипидных камедей в процессе, называемом рафинирование масла, как описано в настоящем документе. Изобретение относится к способам переработки растительных масел из различных источников, таких как рисовая шелуха, соевые бобы, семена рапса, арахис и другие орехи, кунжут, подсолнух, пальма и кукуруза. Способы можно использовать совместно со способами, основанными на экстракции гексаном, с последующим рафинированием неочищенных экстрактов в пищевые масла, включая применение способов и ферментов по изобретению. Первой стадией в последовательности очистки является так называемый процесс рафинирования, который служит для отделения фосфатидов путем добавления воды. Материал, осаждаемый рафинированием, отделяют и далее обрабатывают в смесь лецитинов. Коммерческие лецитины, такие как соевый лецитин и лецитин подсолнуха, представляют собой полутвердые или очень вязкие материалы. Они состоят из смеси полярных липидов, главным образом, фосфолипидов, и масла, главным образом, триглицеридов.

Фосфолипазы по изобретению можно использовать в любой методике рафинирования включая рафинирование гидратацией, рафинирование масла Λ^С0N (например, для соевых бобов), рафинирование масла кайпсо, суперрафинирование, УФ-рафинирование, рафинирование ТОР, унирафинирование, сухое рафинирование и рафинирование ЕЖУМАХ™. См., например, патенты США №№ 6355693; 6162623; 6103505; 6001640; 5558781; 5264367. Различные методики рафинирования, охватываемые способами по изобретению, описаны в ВоскйсН, М. (1998), Ракк апб 0Пк НапбЬоок, ТНе ехйасйоп о£ Уеде1аЬ1е 0Пк (глава 5), 345-445, А0С8 Ргекк, СНатра1дп, 111то1к. Фосфолипазы по изобретению можно использовать в промышленном применении ферментативного рафинирования триглицеридных масел, как описано, например, в ЕР 513709.

В одном аспекте фосфолипазы по изобретению используют для обработки растительных масел, например неочищенных масел, таких как масло рисовой шелухи, сои, канолы, цветочные масла и т.п. В одном аспекте это увеличивает эффективность процесса рафинирования. В одном аспекте изобретение относится к способам ферментативного рафинирования в условиях низкого содержания воды, например в диапазоне приблизительно от 0,1 до 20% воды или от 0,5 до 10% воды. В одном аспекте это приводит к улучшенному отделению тяжелой фазы от масляной фазы в ходе центрифугирования. Улучшенное раз- 71 022979 деление этих фаз может приводить к более эффективному удалению фосфолипидов из масла, включая как гидратируемые, так и негидратируемые масла. В одном аспекте это может обеспечить фракцию камеди, которая содержит меньше удерживаемого нейтрального масла (триглицеридов), тем самым увеличивая общий выход масла в процессе рафинирования.

В одном аспекте фосфолипазы по изобретению, например, полипептид, обладающий активностью РЬС, например активностью Р1-РЬС, используют для обработки масел (например, растительных масел, включая неочищенные масла, такие как масла рисовой шелухи, сои, канолы, цветочные масла и т.п.), например, в процессах рафинирования, для уменьшения массы камеди и увеличения прироста нейтральных масел путем сниженного удержания масла. В одном аспекте фосфолипазы по изобретению, например полипептид, обладающий активностью РЬС, используют для получения диацилглицерина (ОАО) и увеличения его содержания в масляной фазе.

Фосфолипазы по изобретению можно использовать в промышленном применении ферментативного рафинирования, как описано, например, в СА 1102795, в котором описан способ выделения полярных липидов из липидов злаков путем добавления по меньшей мере 50 мас.% воды. Этот способ представляет собой модифицированное рафинирование в том смысле, что в нем используется принцип добавления воды к неочищенной смеси масел.

В одном аспекте изобретение относится к ферментативным процессам, включающим применение фосфолипаз по изобретению (например, РЬС, например Р1-РЬС), включающее гидролиз гидратированных фосфолипидов в масле при температуре приблизительно от 20 до 40°С при щелочных значениях рН, например при рН приблизительно от 8 до 10, с использованием времени реакции приблизительно от 3 до 10 мин. Это может приводить к конечным уровням фосфора в масле менее чем 10 м.д. Изобретение также относится к ферментативным способам, включающим применение фосфолипаз по изобретению (например, Р1-РЬС), включающее гидролиз гидратируемых и негидратируемых фосфолипидов в масле при температуре приблизительно от 50 до 60°С при рН немного ниже нейтрального, например приблизительно от 5 до 6,5, с использованием времени реакции приблизительно от 30 до 60 мин. Это может приводить к конечным уровням фосфора в масле менее 10 м.д.

В одном аспекте изобретение относится к ферментативным способам, в которых используется фермент фосфолипаза С, для гидролиза глицерилфосфоэфирной связи и, тем самым, обеспечения возвращения диацилглицеридной части фосфолипидов обратно в масло, например растительное масло, рыбий жир или масло из водорослей (фосфолипаза С (РЬС), добавка для щелочной очистки); и снижения содержания фосфолипидов на стадии рафинирования до уровней, достаточно низких, чтобы происходила физическая очистка масел с высоким содержанием фосфора (фосфолипаза С (РЬС), добавка для рафинирования). Эти два подхода могут обеспечивать различные уровни и обладают различными конечными применениями.

В различных иллюстративных способах по изобретению ряд различных стадий включают процесс рафинирования, предшествующий главным процессам отбеливания и дезодорирования. Эти стадии включают нагревание, смешение, выдерживание, разделение и высушивание. После стадии нагревания добавляют воду и часто кислоту и перемешивают для обеспечения агломерации нерастворимой фосфолипидной камеди в частицы, которые можно отделять. Хотя вода отделяет многие из фосфатидов при рафинировании, части фосфолипидов являются негидратируемыми фосфатидами (Ν^), присутствующими в качестве солей кальция или магния. Способы рафинирования нацелены на эти Ν^ посредством добавления кислоты. После гидратации фосфолипидов масло перемешивают, выдерживают и разделяют центрифугированием. Наконец, масло сушат и хранят, транспортируют или очищают, как проиллюстрировано на фиг. 1. Полученные камеди либо далее перерабатывают в продукты на основе лецитина, либо обратно добавляют в пищу.

В одном варианте осуществления в настоящем документе предусмотрен способ гидратации негидратируемых фосфолипидов в липидной матрице путем обеспечения миграции их к поверхности контакта масло-вода. Затем негидратируемые фосфолипиды подвергают реакции и/или удаляют из липидов. В одном варианте осуществления способ включает: а) смешение водного раствора кислоты с пищевым маслом с получением кислотной смеси, имеющей рН менее чем приблизительно 4; и Ь) смешение основания с кислотной смесью с получением прореагировавшей смеси, имеющей рН приблизительно 6-9, где смешение на стадиях а) и/или Ь) обеспечивает эмульсию, которая содержит водную фазу со средним размером капель от приблизительно 15 до приблизительно 45 мкм. В определенных вариантах осуществления смешение на стадиях а) и/или Ь) обеспечивает эмульсию, которая содержит по меньшей мере приблизительно 60% водной фазы по объему с размером капель от приблизительно 15 мкм до приблизительно 45 мкм, где процент водной фазы основан на общем объеме водной фазы. В определенном варианте осуществления способы, представленные в настоящем документе, позволяют негидратируемым фосфолипидам в липидной матрице мигрировать в поверхность контакта масло-вода.

В определенных вариантах осуществления смешение на стадиях а) и/или Ь) обеспечивает эмульсию, которая содержит водную фазу со средним размером капель между приблизительно 15-40, 15-35, 17-40, 20-40, 20-30, 25-30, 25-40 или 25-35 мкм. В определенных вариантах осуществления смешение на стадии

- 72 022979

a) обеспечивает эмульсию, которая содержит водную фазу со средним размером капель между приблизительно 15-40, 15-35, 17-40, 20-40, 20-30, 25-30, 25-40 или 25-35 мкм. В определенных вариантах осуществления смешение на стадии

b) обеспечивает эмульсию, которая содержит водную фазу со средним размером капель между приблизительно 15-40, 15-35, 17-40, 20-40, 20-30, 25-30, 25-40 или 25-35 мкм. В определенных вариантах осуществления средний размер капель составляет приблизительно 15, 17, 19, 20, 22, 25, 27, 30, 35 или 40 мкм. В определенных вариантах осуществления средний размер капель составляет приблизительно 20 мкм.

В определенных вариантах осуществления смешение на стадиях а) и/или Ь) обеспечивает эмульсию, которая содержит по меньшей мере приблизительно 60% водной фазы по объему с размером капель от приблизительно 20 до приблизительно 40 мкм, где процент водной фазы основан на общем объеме водной фазы. В определенных вариантах осуществления стадия смешения обеспечивает эмульсию, которая содержит приблизительно 60-95, 60-90, 60-80, 70-95, 80-95% водной фазы по объему с размером капель между приблизительно 20-40, 20-35, 25-40, 30-40, 35-40 или 25-45 мкм, где процент водной фазы основан на общем объеме водной фазы. В определенных вариантах осуществления смешение на стадиях а) и/или Ь) обеспечивает эмульсию, которая содержит по меньшей мере приблизительно 60, 70, 80, 90, 93, 95, 96, 97, 98 или 99% водной фазы по объему с размером капель между приблизительно 15-45, 20-40, 20-45, 25-40, 20-35, 30-40, 35-40 или 25-45 мкм, где процент водной фазы основан на общем объеме водной фазы. В определенных вариантах осуществления стадия смешения а) обеспечивает эмульсию, которая содержит по меньшей мере приблизительно 60, 70, 80, 90, 93, 95, 96, 97, 98 или 99% водной фазы по объему с размером капель приблизительно 15-45, 20-40, 20-45, 25-40, 20-35, 30-40, 35-40 или 25-45 мкм, где процент водной фазы основан на общем объеме водной фазы. В определенных вариантах осуществления стадия смешения Ь) обеспечивает эмульсию, которая содержит по меньшей мере приблизительно 60, 70, 80, 90, 93, 95, 96, 97, 98, или 99% водной фазы по объему с размером капель между приблизительно 15-45, 20-40, 20-45, 25-40, 20-35, 30-40, 35-40 или 25-45 мкм, где процент водной фазы основан на общем объеме водной фазы. В определенных вариантах осуществления, смешение на стадиях а) и/или Ь) обеспечивает эмульсию, которая содержит по меньшей мере приблизительно 10-30% водной фазы по объему с размером капель менее чем приблизительно 10 мкм, где процент водной фазы основан на общем объеме водной фазы. В определенных вариантах осуществления смешение на стадиях а) и/или Ь) обеспечивает эмульсию, которая содержит по меньшей мере приблизительно 20-25% водной фазы по объему с размером капель менее чем приблизительно 10 мкм, где процент водной фазы основан на общем объеме водной фазы. В определенных вариантах осуществления смешение на стадиях а) и/или Ь) обеспечивает эмульсию, которая содержит по меньшей мере приблизительно 60-95% водной фазы по объему с размером капель более чем приблизительно 10 мкм, где процент водной фазы основан на общем объеме водной фазы. В определенных вариантах осуществления смешение на стадиях а) и/или Ь) обеспечивает эмульсию, которая содержит по меньшей мере приблизительно 70-80% водной фазы по объему с размером капель более чем приблизительно 10 мкм, где процент водной фазы основан на общем объеме водной фазы. В определенных вариантах осуществления смешение на стадиях а) и/или Ь) обеспечивает эмульсию, которая содержит по меньшей мере приблизительно 90% водной фазы по объему со средним размером капель приблизительно 20 мкм, где процент водной фазы основан на общем объеме водной фазы.

Без связи с какой-либо конкретной теорией полагают, что на стадии а) соли фосфатидной кислоты и фосфатидилэтаноламина с кальцием, магнием и железом диссоциируют. Свободные катионы кальция, магния и железа реагируют, например, с цитратными, ацетатными или фосфатными анионами из кислоты, с образованием солей металлов. На стадии Ь) катионы металлов из основания, например ионы натрия или калия, образуют комплексы с фосфатидной кислотой или фосфатидилэтаноламином. В определенных вариантах осуществления способ дополнительно включает добавление воды с последующим перемешиванием с высокими сдвиговыми усилиями с образованием механической эмульсии. Затем эмульгированные фосфолипиды удаляют химическим рафинированием или подвергают реакции в ферментативном рафинировании.

В способах, предоставленных в настоящем документе, можно использовать любое устройство для приложения сдвигового усилия и/или смешения. В определенных вариантах осуществления смешение включает приложение сдвигового усилия и перемешивание. В определенном варианте осуществления устройство для смешения представляет собой подвесной смеситель, включая цифровой смеситель 1КА К^ 20 с плоской лопастью с лезвием. В определенных вариантах осуществления устройство для смешения действует при приблизительно 50, 100, 150 или 200 об/мин для нормального перемешивания и приблизительно 250, 300, 350, 400 об/мин или более для интенсивного перемешивания. В определенном варианте осуществления перемешивание со сдвиговым усилием проводят с помощью гомогенизатора 1КА ИНга-Тиггах Т-50 Ьа81с с диспергирующим элементом 8 50 Ν-Ο 45 О при 10000 об/мин.

В определенных вариантах осуществления смеситель представляет собой роторный/статорный смеситель с высоким сдвиговым усилием со скоростью лопасти (радиальная скорость в камере смесителя) по меньшей мере приблизительно 1400 см/с. В определенных вариантах осуществления мощность, по- 73 022979 требляемая смесителем, составляет по меньшей мере 1,0 кВт/метрическая тонна продукта/ч. В определенных вариантах осуществления эмульсии масло/вода в промышленном масштабе получают со скоростями лопасти в диапазоне приблизительно от 1400 до 2300 см/с или даже выше. В определенных вариантах осуществления скорость лопасти составляет приблизительно 1400, 1600, 1800, 2000, 2100, 2300, 2500, 3000 или 3500 см/с. В определенных вариантах осуществления скорость лопасти составляет приблизительно 2300 см/с. В определенных вариантах осуществления мощность, потребляемая смесителем, составляет от приблизительно 1,0 до приблизительно 2,0 кВт/метрическая тонна продукта/ч. В определенных вариантах осуществления и мощность, потребляемая смесителем, составляет приблизительно 2,0 кВт/метрическая тонна продукта/ч. В определенных вариантах осуществления для непрерывного процесса для смесителя с высоким сдвиговым усилием требуется эффективное потребление мощности 10 кВт для переработки 10 метрических тонн масла в час.

В определенных вариантах осуществления примешивание кислоты включает применение сдвигового усилия в течение менее чем приблизительно 1 мин. В определенных вариантах осуществления примешивание кислоты включает применение сдвигового усилия в течение приблизительно 1, 3, 5, 8, 10, 20, 30, 40, 50 или 60 с. В определенных вариантах осуществления примешивание кислоты включает применение сдвигового усилия в течение по меньшей мере приблизительно 1 мин. В определенных вариантах осуществления примешивание кислоты включает применение сдвигового усилия в течение по меньшей мере приблизительно 1 с вплоть до приблизительно 10 мин, от по меньшей мере приблизительно 1 с вплоть до приблизительно 10 мин, от по меньшей мере приблизительно 1 с вплоть до приблизительно 7 мин, от по меньшей мере приблизительно 1 с вплоть до приблизительно 5 мин, от по меньшей мере приблизительно 1 с вплоть до приблизительно 3 мин или от по меньшей мере приблизительно 1 с вплоть до приблизительно 2 мин. В определенных вариантах осуществления примешивание кислоты включает применение сдвигового усилия в течение по меньшей мере приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 мин.

В определенных вариантах осуществления примешивание кислоты включает применение сдвигового усилия путем встряхивания от приблизительно 1 мин до приблизительно 5 ч. В определенных вариантах осуществления кислотную смесь встряхивают в течение по меньшей мере приблизительно 1 мин. В определенных вариантах осуществления перемешивание кислоты продолжают от приблизительно 10 мин до приблизительно 5 ч или более. В определенных вариантах осуществления встряхивание кислоты продолжают от приблизительно 30 мин до приблизительно 5 ч или более. В определенных вариантах осуществления встряхивание кислоты продолжают от приблизительно 30 мин до приблизительно 3 ч или более. В определенных вариантах осуществления встряхивание кислоты продолжают от приблизительно 30 мин до приблизительно 2 ч или более. В определенных вариантах осуществления встряхивание кислоты продолжают в течение приблизительно 1, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 120, 150 или 180 мин.

В определенных вариантах осуществления кислота, используемая на стадии а), выбрана из группы, состоящей из фосфорной кислоты, уксусной кислоты, лимонной кислоты, виннокаменной кислоты, янтарной кислоты и их смесей. В одном варианте осуществления кислота представляет собой лимонную кислоту.

В определенных вариантах осуществления рН кислотной смеси на стадии а) составляет от приблизительно 1 до приблизительно 4. В определенных вариантах осуществления рН кислотной смеси на стадии а) составляет приблизительно 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5 или 4.

В определенных вариантах осуществления примешивание кислоты продолжают до тех пор, пока не диссоциируют соли фосфатидной кислоты и фосфатидилэтаноламина с кальцием, магнием и железом.

В определенных вариантах осуществления водный раствор кислоты, используемый в способе, содержит по меньшей мере приблизительно 5 мас.% кислоты в расчете на общую массу кислоты и воды. В определенных вариантах осуществления водный раствор кислоты, используемый в способе, содержит от по меньшей мере приблизительно 5 вплоть до приблизительно 90%, от приблизительно 5 вплоть до приблизительно 80%, от приблизительно 5 вплоть до приблизительно 70%, от приблизительно 10 вплоть до приблизительно 90%, от приблизительно 20 вплоть до приблизительно 60%, от приблизительно 30 вплоть до приблизительно 60% или от приблизительно 40 вплоть до приблизительно 60 мас.% кислоты в расчете на общую массу кислоты и воды. В определенных вариантах осуществления водный раствор кислоты, используемый в способе, включает по меньшей мере приблизительно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 85, 90 мас.% кислоты в расчете на общую массу кислоты и воды. В определенных вариантах осуществления водный раствор кислоты, используемый в способах, содержит по меньшей мере приблизительно 5 мас.% лимонной кислоты в расчете на общую массу лимонной кислоты и воды.

В определенных вариантах осуществления водный раствор кислоты, используемый в способах, содержит по меньшей мере приблизительно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 или 60 мас.% лимонной кислоты в расчете на общую массу лимонной кислоты и воды. В определенных вариантах осуществления водный раствор кислоты, используемый в способах, содержит по меньшей мере приблизительно 40, 45, 50, 55 или 60 мас.% лимонной кислоты в расчете на общую массу лимонной кислоты и воды. В одном варианте осуществления водный раствор кислоты, используемый в способе, содержит приблизительно 50 мас.% лимонной кислоты в расчете на общую массу лимонной кислоты и воды. В определенных вари- 74 022979 антах осуществления водный раствор кислоты, используемый в способах, содержит по меньшей мере приблизительно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 85, 90 мас.% фосфорной кислоты в расчете на общую массу фосфорной кислоты и воды.

В определенных вариантах осуществления водный раствор кислоты используют в количестве по меньшей мере приблизительно 0,01 мас.% в расчете на общую массу масла. В определенных вариантах осуществления водный раствор кислоты используют в количестве по меньшей мере приблизительно 0,05 мас.% в расчете на общую массу масла. В определенных вариантах осуществления водный раствор кислоты используют в количестве от по меньшей мере приблизительно 0,01 вплоть до приблизительно 10%, от приблизительно 0,01 вплоть до приблизительно 5%, от приблизительно 0,05 вплоть до приблизительно 5%, от приблизительно 0,05 вплоть до приблизительно 3%, от приблизительно 0,05 вплоть до приблизительно 2% или от приблизительно 0,1 вплоть до приблизительно 2 мас.% в расчете на общую массу масла. В определенных вариантах осуществления водный раствор кислоты используют в количестве приблизительно 0,01, 0,05, 0,1, 0,15, 0,2, 0,25, 0,3, 0,5, 1, 2, 5, 7 или 10 мас.% в расчете на общую массу масла.

Основание смешивают с кислотной смесью для получения прореагировавшей смеси, имеющей рН приблизительно 6-9 в водной фазе. Смешение продолжают, чтобы позволить негидратируемым фосфолипидам в липидной матрице мигрировать к поверхности контакта масло-вода. На стадии Ь) можно использовать любое основание, которое специалист в данной области сочтет пригодным. В определенных вариантах осуществления основание выбрано из группы, состоящей из гидроксида натрия, гидроксида калия, силиката натрия, карбоната натрия, карбоната кальция и их комбинации. В одном варианте осуществления основание представляет собой гидроксид натрия. В определенных вариантах осуществления основание добавляют в качестве разбавленного водного раствора, так что основание не омыляет никакое нейтральное масло. В определенных вариантах осуществления основание добавляют в качестве от приблизительно 0,1 вплоть до приблизительно 8 М, от приблизительно 1 вплоть до приблизительно 4 М, от приблизительно 1 вплоть до приблизительно 3 М или от приблизительно 0,5 вплоть до приблизительно 3 М водного раствора. В определенных вариантах осуществления основание добавляют в качестве приблизительно 0,1, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 М водного раствора. В одном варианте осуществления минимальное эффективное количество основания, предназначенного для применения в целях удаления МНР, является таким, что рН водной фазы увеличивается до по меньшей мере приблизительно 6. В определенных вариантах осуществления используемое количество основания является достаточным для увеличения рН водной фазы до приблизительно 6, 6,5, 7, 7,5 или 8. В определенных вариантах осуществления примешивание основания продолжают в течение по меньшей мере приблизительно 1 мин. В определенных вариантах осуществления примешивание основания продолжают в течение от приблизительно 1 мин до приблизительно 5 ч или более. В определенных вариантах осуществления примешивание основание продолжают в течение приблизительно 1, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 120, 150 или 180 мин.

Способы, представленные в настоящем документе, можно проводить при любой температуре, которую сочтет пригодной специалист в данной области. В определенных вариантах осуществления температура в ходе процесса находится в диапазоне от приблизительно 20 до приблизительно 100°С, от приблизительно 20 до приблизительно 90°С, от приблизительно 40 до приблизительно 80°С или от приблизительно 40 до приблизительно 70°С. В определенных вариантах осуществления температура в ходе процесса составляет приблизительно 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100°С.

В определенных вариантах осуществления после реакции с основанием добавляют воду в количестве приблизительно от 0,1 до 5% или более в расчете на общий объем реакционной смеси с последующим перемешиванием с высоким сдвиговым усилием с образованием механической эмульсии, позволяющей фосфолипидам либо эмульгироваться при химическом рафинировании, либо реагировать при ферментативном рафинировании. В определенных вариантах осуществления воду впоследствии добавляют в количестве приблизительно 0,1, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5% или более в расчете на общий объем реакционной смеси.

В одном варианте осуществления в настоящем документе предусмотрен способ, где после гидратации МНР следует ферментативная обработка для удаления различных фосфолипидов и лецитинов. Такие способы можно осуществлять на практике либо на неочищенных, либо на рафинированных гидратацией маслах.

В определенных вариантах осуществления способ рафинирования масла, представленный в настоящем документе, включает: а) смешение водного раствора кислоты с пищевым маслом с получением кислотной смеси, имеющей рН приблизительно от 1 до 4; Ь) смешение основания с кислотной смесью с получением прореагировавшей смеси, имеющей рН приблизительно 6-9; и с) рафинирование прореагировавшей смеси водой или ферментом с получением рафинированного масла, где смешение на стадиях а) и/или Ь) проводят с помощью смесителя с высоким сдвиговым усилием.

В вариантах осуществления, где фермент используют на стадии рафинирования, один или несколько ферментов можно добавлять в масло либо по отдельности, либо вместе. Параметры ферментативной реакции, включающие температуру, рН, и концентрацию фермента можно контролировать для оптимизации реакции для конкретной комбинации ферментов в конкретной системе масел. В способах, предоставленных в настоящем документе, пригодны многие разновидности ферментов и их эквиваленты, вклю- 75 022979 чая семейства фосфолипазы А и фосфолипазы С, которые являются коммерчески доступными. Иллюстративные ферменты описаны в других местах в настоящем документе.

В определенных вариантах осуществления различные фосфолипазы, используемые на стадии ферментативного рафинирования, смешивают вместе перед добавлением в масло, подлежащее обработке. Альтернативно ферменты добавляют в масло по отдельности либо последовательно, либо одновременно.

Количество фермента, используемого в способах, предоставленных в настоящем документе, зависит от условий реакции, типа масла и типа используемого фермента. В определенных вариантах осуществления количество находится в диапазоне от 10 до 20000 единиц, от 20 до 10000 единиц, от 50 до 5000 единиц или от 100 до 2000 единиц на 1 кг масла.

В одном варианте осуществления в настоящем документе предусмотрен способ удаления NНЕ, гидратируемых фосфолипидов и лецитинов (в совокупности известных как камеди) из растительных масел с получением продукта в виде рафинированного масла или жира, который можно использовать для производства пищевых продуктов и/или непищевых применений. В определенных вариантах осуществления в способах рафинирования, предоставленных в настоящем документе, используется вода, различные кислоты и/или различные основания или их комбинация.

В одном варианте осуществления способы, представленные в настоящем документе, пригодны для удаления солей фосфатидной кислоты и фосфатидилэтаноламина из растительных масел. В определенных вариантах осуществления, на стадии а) образуются цитратные соли кальция и магния. Способы, представленные в настоящем документе, устраняют проблемы, ассоциированные с загрязнением оборудования вследствие отложения цитратных солей кальция и магния на послереакционном оборудовании. Цитратные соли кальция и магния растворимы при рН, при которых проводят ферментативную реакцию и дальнейшую переработку в способах, представленных в настоящем документе.

В определенных вариантах осуществления в настоящем документе предусматриваются способы увеличения скорости реакции фосфолипазы, используемой в ферментативном рафинировании, так, чтобы ферментативная реакция имела продолжительность менее чем приблизительно 6, 5, 4, 3, 2 или 1 ч. В определенных вариантах осуществления увеличения скорости реакции достигают путем смешения с высоким сдвиговым усилием прореагировавшей смеси стадии Ь) с образованием механической эмульсии, которую затем подвергают реакции с ферментом.

В другом аспекте в настоящем документе предусмотрен способ рафинирования композиции растительного масла, в котором как гидратируемые, так и негидратируемые фосфолипиды можно обрабатывать в одном процессе, где ферментативная реакция завершается в течение менее чем приблизительно 1 ч.

В определенном варианте осуществления масло включает масло NеосЫойк о1еоаЬипйапк, масло Зсепейектик Штогрйик, масло Еид1епа дгасШк, масло Рйаеойас1у1ит йгсотиШт, масло РкигосЬгуык сайегае, масло Ргутпекшт рагуит, масло ТеЦакейшк сйш, масло ТеЦакейшк киесюа, масло 1косЬгуык да1Ьапа, масло NаηπосЫо^орк^к каИпа, масло Войуососсик Ьгаипй, масло ЭипаИеИа 1егйо1ес1а, масло ^пшсНот кретек, масло ЗрйцИпа кретек, масло СЫогорйусеаке, масло Васййагорйу, масло асаи, миндальное масло, масло бабассу, масло семян черной смородины, масло семян огуречника, масло канолы, масло кешью, касторовое масло, кокосовое масло, кориандровое масло, кукурузное масло, хлопковое масло, масло крамбе, масло льняного семени, масло виноградных зерен, масло из лесного ореха, конопляное масло, масло ятрофы, масло хохобы, льняное масло, масло ореха макадамия, масло ядра манго, масло пенника лугового, горчичное масло, костяное масло, оливковое масло, пальмовое масло, пальмоядровое масло, пальмовый олеин, арахисовое масло, масло американского ореха, кедровое масло, фисташковое масло, маковое масло, рапсовое масло, рисовое масло, сафлоровое масло, масло камелии, кунжутное масло, масло из семян ши, соевое масло, подсолнечное масло, таловое масло, масло тсубаки, ореховое масло, типы природных масел, обладающих измененным составом жирных кислот, полученных с помощью генетически модифицированных организмов (НМО) или традиционной селекции, такие как высокоолеиновое, низколиноленовое или низконасыщенное масло (высокоолеиновое масло канолы, низколиноленовое соевое масло или высокостеариновые подсолнечные масла) или их смеси. В одном варианте осуществления масла, которые можно подвергать обработке, включают, но не ограничиваются ими следующие: масло канолы, касторовое масло, кокосовое масло, кориандровое масло, кукурузное масло, хлопковое масло, масло лесного ореха, конопляное масло, льняное масло, масло ядра манго, масло пенника лугового, косточковое масло, оливковое масло, паломовое масло, пальмоядровое масло, пальмовый олеин, арахисовое масло, рапсовое масло, рисовое масло, сафлоровое масло, масло камелии, соевое масло, подсолнечное масло, таловое масло, масло тсубаки и растительное масло.

В определенных вариантах осуществления способы, представленные в настоящем документе, снижают содержание фосфолипидов в масле до менее чем приблизительно 30 м.д. фосфора, менее чем приблизительно 20 м.д. фосфора, менее чем приблизительно 15 м.д. фосфора, менее чем приблизительно 10 м.д. фосфора, менее чем приблизительно 7 м.д. фосфора, менее чем приблизительно 5 м.д. фосфора или менее чем приблизительно 3 м.д. фосфора. В определенных вариантах осуществления способы, представленные в настоящем документе, снижают содержание фосфолипидов в масле до приблизительно 10 м.д. фосфора, приблизительно 7 м.д. фосфора, приблизительно 5 м.д. фосфора или приблизительно 3 м.д. фосфора.

- 76 022979

После стадии рафинирования рафинированное масло можно отделять от камедей и подвергать дальнейшим стадиями переработки, известным в данной области, включая отбеливание или дезодорирование, которые могут быть необходимыми или желательными, в зависимости от конечного применения, предполагаемого для продукта в виде рафинированного масла.

В определенном варианте осуществления в настоящем документе предусмотрены способы получения фосфолипидов, включающие:

a) смешение водного раствора кислоты с пищевым маслом с получением кислотной смеси, имеющей рН менее чем приблизительно 4;

b) смешение основания с кислотной смесью с получением прореагировавшей смеси, имеющей рН приблизительно 6-9, где смешение на стадиях а) и/или Ь) обеспечивает эмульсию, которая содержит по меньшей мере приблизительно 60% водной фазы по объему с размером капель от приблизительно 15 до приблизительно 45 мкм;

c) смешение фермента, выбранного из фосфолипазы А, фосфолипазы С, фосфатидил-инозитолспецифической фосфолипазы С или их комбинации; и

й) выделение фосфолипидов.

В различных иллюстративных процессах по изобретению уровни фосфора снижаются достаточно низко для физической очистки. Процесс разделения может приводить потенциально к более высоким снижениям выхода, чем щелочная очистка. Кроме того, способы рафинирования могут обеспечивать побочные продукты, которые не могут быть проданы в качестве коммерческого лецитина, см., например, фиг. 2 для иллюстративного процесса рафинирования физически очищенных масел. Таким образом, эти процессы не достигают существенной доли рынка, и процессы щелочной очистки продолжают доминировать в промышленности в случае рисовой шелухи, сои, канолы и подсолнуха. Однако следует отметить, что фермент фосфолипаза С, используемый в специализированном способе рафинирования, может снизить образование камеди и вернуть диглицеридную часть фосфолипидов обратно в масло.

В одном аспекте изобретение относится к способам использования ΡΙ-РЬС по изобретению во фракции камеди. В одном аспекте этого способа масло добавляют к неочищенному маслу с получением эмульсии, которая приводит к перемещению фосфатидилхолина, фосфатидил-этаноламина и фосфатидилинозитола в водную фазу (рафинирование гидратацией).

После центрифугирования эти фосфолипиды являются основными компонентами водной фракции камеди. Фосфолипиды во фракции камеди можно обрабатывать фосфолипазой С или фосфолипазой Ό вместе с фосфатазой (или другими комбинациями, указанными ниже) с получением диацилглицерина (ЭАО) и фосфатного сложного эфира. В этот момент ЭАО можно экстрагировать из других компонентов камедей и обрабатывать липазой в условиях, пригодных для переэтерификации ЭАО, с получением желаемого триацилглицерина (структурированный липид).

В другом аспекте большую часть 1,2-ЭАО можно конвертировать в 1,3-ЭАО путем увеличения рН камеди после реакции с РЬС, например путем добавления щелочи. Затем 1,3-ЭАО можно экстрагировать из камеди и подвергать реакции с липазой в подходящих условиях для переэтерификации 1,3-ЭАО в кп2положении для образования желаемого структурированного триацилглицерина.

В альтернативных аспектах жирные кислоты, используемые в реакции переэтерификации, могут происходить из различных источников, включая свободные жирные кислоты, находящиеся в неочищенном масле.

В одном аспекте фосфолипиды после рафинирования гидратацией используют в комбинации с РЬС по изобретению для образования структурированных липидов. Рафинированное гидратацией масло можно подвергать воздействию РЬС и/или РЬЭ (любой или оба из них могут представлять собой ферменты по изобретению) вместе с фосфатазой или одной из этих комбинаций, с последующим воздействием РЬА (может быть ферментом по изобретению) для снижения уровней фосфора, пригодных для щелочной или физической очистки.

В альтернативных вариантах осуществления комбинация ферментов, которые можно использовать в способах по изобретению, включая эти способы рафинирования, включает (где один, несколько или все из ферментов в комбинации включают фермент по настоящему изобретению):

РЬС+РЬРЬС+РЬА (РЬА добавляют после завершения реакций РЬС);

РЬЭ+фосфатаза+РЬРЬС, а затем РЬА или

РЬС или (РЬС+РЬРЬО+РЬА, специфичные к фосфатидной кислоте (все ферменты добавляют вместе или последовательно).

Щелочная очистка

Изобретение относится к способам использования фосфолипаз (включая ферменты по изобретению) в щелочной очистке, где ферменты используют в качестве добавок для щелочной очистки. В альтернативных аспектах РЬС или РЬЭ и/или фосфатазу используют в способах в качестве добавки до, в ходе или после процесса очистки нейтрализацией щелочью (либо непрерывной, либо периодической очистки). Количество добавляемого фермента может варьировать в зависимости от способа. Уровень воды, используемый в способе, может быть низким, например приблизительно от 0,5 до 5%.

Альтернативно, щелочь добавляют в способе несколько раз. Кроме того, способ можно проводить

- 77 022979 при различных температурах (от 25 до 70°С), с различными кислотами или щелочами и при различных рН (4-12). Можно использовать концентрированные растворы щелочи, например более концентрированные, чем промышленный стандарт 11%, для уменьшения массы камеди. В альтернативных аспектах концентрированный раствор щелочи является концентрированным на приблизительно 12-50%, например приблизительно на 20, 30, 40, 50 или 60% или более концентрированным.

В одном аспекте фермент фосфолипаза С по изобретению гидролизует фосфатид по глицерилфосфоэфирной связи с образованием диглицерида и растворимого в воде фосфатного соединения. Г идролизованный фосфатид перемещается в водную фазу, оставляя диглицерид в масляной фазе, как проиллюстрировано на фиг. 3. Одной из задач добавки для щелочной очистки РЬС является конвертирование фосфолипидных камедей, образованных в ходе нейтрализации, в диацилглицерид, который мигрирует обратно в масляную фазу. Напротив, одной из задач добавки для рафинирования РЬС является снижение количества фосфолипидов в неочищенном масле до эквивалента фосфора менее 10 миллионных долей (м.д.).

Кислоты, которые можно использовать в способе щелочной очистки, включают, но не ограничиваются ими, фосфорную, лимонную, аскорбиновую, серную, фумаровую, малеиновую, хлористоводородную и/или уксусную кислоты. Кислоты используют для гидратации негидратируемых фосфолипидов. Щелочи, которые можно использовать, включают, но не ограничиваются ими, К0Н и №0Н. Щелочи используют для нейтрализации свободных жирных кислот. Альтернативно фосфолипазы, или более конкретно РЬС или РЬБ и фосфатазу, используют для очистки фитостеринов из камеди/соапстока.

В варианте осуществления изобретения, альтернативном относительно добавления фосфолипазы до щелочной очистки, фосфолипазу экспрессируют в растении. В другом варианте осуществления фосфолипазу добавляют в ходе измельчения растения, семян или другой части растения.

Альтернативно, фосфолипазу добавляют после измельчения, но до очистки (т.е. в емкостях для выдерживания). Кроме того, фосфолипазу добавляют в качестве предварительной обработки в процессе очистки либо с кислотой, либо без нее.

Другим вариантом осуществления изобретения, уже описанным, являемся добавление фосфолипазы в процессе щелочной очистки. В этом способе уровни кислоты и щелочи варьируют в зависимости от уровня фосфора и уровня свободных жирных кислот. Кроме того, в этом способе используют широкие диапазоны температуры и рН в зависимости от типа используемого фермента.

В другом варианте осуществления изобретения фосфолипазу добавляют после щелочной очистки (фиг. 5). В одном примере фосфолипазу добавляют в интенсивный смеситель или в ретенционный смеситель перед разделением. Альтернативно фосфолипазу добавляют после стадии нагревания. В другом варианте осуществления фосфолипазу добавляют на стадии центрифугирования. В дополнительном варианте осуществления фосфолипазу добавляют соапстоку. Альтернативно фосфолипазу добавляют к смывной воде. В другом примере фосфолипазу добавляют в ходе стадий отбеливания и/или дезодорирования.

В одном аспекте фермент фосфолипазы, например фосфолипаза С, по изобретению гидролизует фосфатид как из гидратируемых, так и из негидратируемых фосфолипидов в нейтрализованных неочищенных и рафинированных маслах до отбеливания и дезодорирования. Иллюстративные способы щелочной очистки по изобретению проиллюстрированы на фиг. 4 и 6. Фиг. 4 включает иллюстративное время воздействия, температуру и рН для статического смесителя (от 30 до 60 мин, от 50 до 60°С, рН от 5 до 6,5) и ретенционного смесителя (от 3 до 10 мин, от 20 до 40°С). Заданный фермент можно применять в качестве добавки в имеющемся способе щелочной нейтрализации, как проиллюстрировано на фиг. 4. В этом аспекте не требуется, чтобы фермент выдерживал крайние уровни рН, если его добавляют после добавления щелочи. Как проиллюстрировано на фиг. 6 (иллюстративный процесс с предварительным добавлением фермента), в процессе рафинирования неочищенного масла можно использовать любую фосфолипазу, включая, например, фосфолипазу по изобретению, такую как РЬС, Р1-РЬС, РЬВ, РЬА и/или РЬС, как описано, например, в ВаЛеу'к 1пДи51па1 0ί1 & Ра! РгоДис!8 ν.4 (еД. Υ. Н. Нш). На фиг. 7 и 8 проиллюстрированы варианты способов по изобретению, где в способе, который можно использовать для переработки любого масла, например растительного масла, такого как неочищенное соевое масло, используют две или три стадии центрифугирования, как показано на фигуре. Иллюстративный способ, представленный на фиг. 8, имеет стадию центрифугирования перед щелочной очисткой (в дополнение к стадии центрифугирования после щелочной очистки и до стадии промывания, и после промывания водой), в то время как иллюстративный способ, представленный на фиг. 7, не имеет стадию центрифугирования перед щелочной очисткой. На фиг. 9 проиллюстрирован другой иллюстративный вариант этого способа, в котором используется обработка кислотой и имеется стадия центрифугирования перед стадией рафинирования; этот иллюстративный способ можно использовать для переработки любого масла, например растительного масла, такого как неочищенное соевое масло, как представлено на фигуре.

В одном аспекте фосфолипаза по изобретению обеспечивает удаление фосфора до низких уровней, приемлемых в физической очистке. В одном аспекте РЬС по изобретению гидролизует фосфатиды как гидратируемых, так и негидратируемых фосфолипидов в неочищенных маслах перед отбеливанием и дезодорированием. Заданный фермент можно применять в качестве добавки в имеющийся процесс рафинирования, см., например, фиг. 5. Учитывая неоптимальное перемешивание в коммерческом оборудо- 78 022979 вании, вероятно, что потребуется кислота для контактирования негидратируемых фосфолипидов с ферментом на поверхности контакта масло/вода. Таким образом, в одном аспекте используют устойчивую к кислотам РЬС по изобретению.

В одном аспекте способ рафинирования с добавкой РЬС по изобретению может устранять потери в одной или всех трех из областей, указанных в табл. 4. Соответствующие потери в процессе с РЬС могут быть оценены как приблизительно 0,8% против 5,2% в расчете на массу вследствие удаления фосфатида.

Таблица 4

Потери, на снижение которых направлены продукты РЕС

	Добавка для щелочной очистки	Добавка для рафинирования
1) Потери масла на образование и отделение камеди 2,1%	X	X
2) Омыленное масло при добавлении щелочи 3,1%		X
3) Масло, удерживаемое глиной при отбеливании* <1,0%	X	X
Общее снижение выхода -5,2%	-2,1%	-5,2%

Дополнительные потенциальные преимущества этого способа по изобретению включают следующие:

сниженное количество адсорбентов - требуется меньше адсорбентов с более низким (<5 м.д.) содержанием фосфора, сниженное использование химических реагентов - затраты на химические реагенты и переработку, связанные с гидратацией негидратируемых фосфолипидов, меньшее образование отходов - меньше воды требуется для удаления фосфора из масла.

Масла, переработанные (например, рафинированные) способами по изобретению, включают масла семян масличных растений, например соевое масло, рапсовое масло, рисовое масло и подсолнечное масло. В одном аспекте добавка РЬС для щелочной очистки по изобретению может экономить 1,2% относительно существующих способов щелочной очистки. Применение добавки для очистки направлено на соевое масло, которое было рафинировано для получения лецитина, и это также исключают из вычислений величина/нагрузка.

Мишени для эффективности способов по изобретению могут варьировать, в зависимости от применений и, более конкретно, в зависимости от момента добавления фермента, см. табл. 5.

Таблица 5

Мишени для эффективности по применению

	Добавка для щелочной очистки	Добавка для рафинирования
Исходные уровни фосфора в масле	<200 м.д.*	600-1400 м.д.
Конечные уровни фосфора в масле	<10 м.д?	<10 м.д.
Гидратируемые и негидратируемые камеди	Да	Да
Время нахождения	3-10 минут	30 минут
Жидкий состав	Да	Да
Заданное значение рН	8-10®	5,0-5,5к
Заданная температура	20-40°С	~50-60°С
Содержание воды	<5%	1-1,25%
Чистота состава фермента	Без липазы/протеазы	Без липазы/протеазы
Другие ключевые требования	Удаление Ре	Удаление Ре

* Рафинированное гидратацией масло,

Целевые уровни, достигаемые в предыдущей стадии нейтрализации щелочью, но должны сохраняться, * 1-2 ч существования,

Рафинирование кислотой требует фермента, который является стабильным при значительно более кислых условиях: рН 2,3 для 5% лимонной кислоты. (-Коейш υ8РN

- 79 022979

6001640), ίίί рН нейтрализованного масла не является нейтральным. Тестирование в РОЗ указывает на то, что рН находится в щелочном диапазоне от 6,5-10 (9 декабря 2002 г.). Типичный диапазон рН необходимо определять.

Другие способы, которые можно использовать с фосфолипазой по изобретению, например фосфолипазой А₁, могут конвертировать негидратируемые нативные фосфолипиды в гидратируемую форму. В одном аспекте фермент является чувствительным к нагреванию. Это может быть желательным, поскольку нагревание масла может разрушить фермент. Однако рН реакции рафинирования необходимо доводить до рН 4-5 и 60°С для приспосабливания к этому ферменту. При насыщающей дозировке масла 300 ед./кг этот иллюстративный способ является успешным в отношении снижения содержания фосфора в ранее рафинированном гидратацией масла до <10 м.д. Р. Преимущества могут состоять в сниженном содержании Н₂О и полученной экономии с точки зрения использования, хранения и утилизации. В табл. 6 приведены иллюстративные промышленные применения ферментов по изобретению.

Таблица 6

Иллюстративное применение

	Добавка для щелочной очистки	Добавка для рафинирования
Получение соевого масла с лецитином	X
Химически очищенное соевое масло, подсолнечное масло, масло канолы	X	X
Масла с низким содержанием фосфатидов (например, пальмовое)		X

В дополнение к этим различным способам рафинирования фосфолипазы по изобретению можно использовать на любой стадии переработки растительных масел. Например, ферменты фосфолипазы по изобретению можно использовать вместо РЬА, например фосфолипазы А2, на любой стадии переработки растительного масла. Масла, которые перерабатывают или рафинируют способами по изобретению, включают соевое масло, рапсовое масло, кукурузное масло, пальмоядровое масло, масло канолы, подсолнечное масло, кунжутное масло, арахисовое масло, рисовое масло и т.п. Основные продукты этого способа включают триглицериды.

В одном иллюстративном способе, когда фермент добавляют к и подвергают реакции с неочищенным маслом, используемое количество фосфолипазы составляет приблизительно 10-10000 ед. или альтернативно приблизительно 100-2000 ед. на 1 кг неочищенного масла. Обработку ферментом проводят в течение от 5 мин до 10 ч при температуре от 30 до 90°С или альтернативно приблизительно от 40 до 70°С. Условия могут варьировать в зависимости от оптимальной температуры фермента. Количество воды, добавляемой для растворения фермента, составляет 5-1000 мас.ч. на 100 мас.ч. неочищенного масла или альтернативно приблизительно от 10 до 200 мас.ч. на 100 мас.ч. неочищенного масла.

После завершения такой обработки ферментами жидкость с ферментом отделяют с помощью соответствующего устройства, например центробежного сепаратора, и получают переработанное масло. Содержащие фосфор соединения, продуцируемые расщеплением ферментом камедеобразных веществ в таком способе, практически все переходят в водную фазу и удаляются из масляной фазы. После завершения обработки ферментом необходимо, чтобы переработанное масло дополнительно промыли водой или органической или неорганической кислотой, например, такой как уксусная кислота, лимонная кислота, фосфорная кислота, янтарная кислота и эквивалентные кислоты, или солевыми растворами.

В одном иллюстративном способе рафинирования с ультрафильтрацией фермент связывают с фильтром или фермент добавляют в масло перед фильтрацией или фермент используют для периодической очистки фильтров.

В одном иллюстративном способе опосредуемой добавкой фосфолипазы физической очистки воду и фермент добавляют к неочищенному маслу (например, неочищенному растительному маслу). В одном аспекте в способе используют РЬС или РЬЭ по изобретению и фосфатазу. В опосредуемой фосфолипазой физической очистке уровень воды может быть низким, т.е. 0,5-5%, и время процесса должно быть коротким (менее 2 ч, или менее 60 мин, или менее 30 мин, или менее 15 мин, или менее 5 мин). Способ можно выполнять при различных температурах (от 25 до 70°С), с использованием различных кислот и/или щелочей, при различных рН (например, 3-10).

В альтернативных аспектах сначала проводят рафинирование гидратацией для сбора лецитина центрифугированием, а затем добавляют РЬС или РЬС и РЬА по изобретению для удаления негидратируемых фосфолипидов (способ следует выполнять при низкой концентрации воды). В другом аспекте проводят рафинирование гидратацией неочищенного масла до менее чем 10 м.д. (пищевые масла) и после- 80 022979 дующую физическую очистку (менее 50 м.д. для биодизеля). В одном аспекте добавляют эмульгатор и/или неочищенное масло перемешивают в интенсивном смесителе. Альтернативно добавляют реагент для расслоения эмульсии и/или неочищенное масло нагревают для обеспечения отделения водной фазы. В другом аспекте добавляют кислоту для обеспечения гидратации негидратируемых фосфолипидов. Кроме того, фосфолипазы можно использовать для обеспечения очистки фитостеринов из камеди/соапстока.

В одном аспекте изобретение относится к композициям и способам (которые могут включать применение фосфолипаз по изобретению) для рафинирования масла, включающим применение различных количеств кислоты и основания формирования соапстока. С использованием этого аспекта изобретения для рафинирования масла можно использовать кислоту (включая фосфорную и/или лимонную кислоту) для гидратации негидратируемых фосфолипидов в маслах с высоким содержанием фосфора (включая масла сои, канолы и подсолнуха). После гидратации фосфолипидов рН водной фазы можно увеличивать с использованием добавления щелочи: количество добавляемой щелочи может обеспечить благоприятное значение рН для ферментативной активности, но не приведет к образованию в масле существенной фракции соапстока. Поскольку соапсток не образуется, свободные жирные кислоты в масле можно удалять позднее, после стадии рафинирования, в ходе отбеливания и дезодорирования.

Ферменты по изобретению используют для усовершенствования экстракции масла и рафинирования масла (например, растительных масел). В одном аспекте в способе по изобретению используют РЬС по изобретению и по меньшей мере одно средство для разрушения клеточной стенки растений (например, целлюлазу, гемицеллюлазу или сходные с ними, для размягчения стенок и увеличения выхода при экстракции). В этом иллюстративном подходе применения ферментов по изобретению для усовершенствования экстракции масла и рафинирования масла фосфолипазу С по изобретению, а также другие гидролазы (например, целлюлазу, гемицеллюлазу, эстеразу, протеазу и/или фосфатазу) используют на стадиях измельчения, связанных с производством масла (включая, но не ограничиваясь ими, соевое масло, масло канолы, подсолнечное масло, рисовое масло). Используя ферменты до или вместо экстракции растворителем, можно увеличить выход масла и снизить количество гидратируемых и негидратируемых фосфолипидов в неочищенном масле. Снижение количества негидратируемых фосфолипидов может быть результатом конверсии потенциально негидратируемых фосфолипидов в диацилглицерин и соответствующий фосфатный сложный эфир перед образованием комплексов с кальцием или магнием. Общее снижение количества фосфолипидов в неочищенном масле обеспечивает увеличенные выхода в процессе очистки с потенциальным устранением необходимости отдельной стадии рафинирования перед отбеливанием или дезодорированием.

В одном аспекте изобретение относится к способам использования фосфолипазы по изобретению (например, фосфолипаза-специфической фосфогидролазы по изобретению), или другой фосфолипазы в модифицированном способе органической очистки, который может включать добавление фермента (например, Р1-РЬС) в емкость для хранения лимонной кислоты.

Ферменты по изобретению можно использовать в любом способе переработки масла, например, в способах рафинирования или эквивалентных способах. Например, ферменты по изобретению можно использовать в способах, описанных в патентах США №№ 5558781; 5264367; 6001640. В способе, описанном в ^Ν 5558781, используется любая из фосфолипазы А1, А2 или В, по существу, разрушающие лецитин в масле, которые выступают в качестве эмульгатора.

Ферменты и способы по изобретению можно использовать в способах снижения содержания фосфорсодержащих компонентов в пищевых маслах, включающих высокое количество негидратируемого фосфора, с использованием фосфолипазы по изобретению, например полипептида, обладающего активностью фосфолипазы А и/или В, как описано, например, в патенте ЕР 0869167. В одном аспекте пищевое масло представляет собой неочищенное масло, так называемое нерафинированное масло. В одном аспекте способом перерабатывают нерафинированное масло, включая прессованные масла, или экстрагированные масла, или их смесь, например, из рапса, соевых бобов, кунжута, арахиса, кукурузы, рисовой шелухи или подсолнуха. Содержание фосфатидов в неочищенном масле может варьировать от 0,5 до 3% мас./мас., что соответствует содержанию фосфора в диапазоне от 200 до 1200 м.д. или в диапазоне от 250 до 1200 м.д. Помимо фосфатидов неочищенное масло также может содержать небольшие концентрации углеводов, соединений сахаров и комплексов металл/фосфатидная кислота с Са, Мд и Ре. В одном аспекте способ включает обработку фосфолипида или лизофосфолипида фосфолипазой по изобретению, чтобы гидролизовать жирные ацильные группы. В одном аспекте фосфолипид или лизофосфолипид содержит лецитин или лизолецитин. В одном аспекте способа пищевое масло имеет содержание фосфора приблизительно от 50 до 250 м.д., и способ включает обработку масла фосфолипазой по изобретению так, чтобы гидролизовать основную часть фосфолипида, и отделение водной фазы, содержащей гидролизованный фосфолипид, от масла. В одном аспекте перед способом ферментативного рафинирования масло рафинируют гидратацией. В одном аспекте предусмотрены способы производства корма для животных, включающие смешение фосфолипазы по изобретению с кормовым материалом и по меньшей мере одним фосфолипидом.

Ферменты и способы по изобретению можно использовать в способах рафинирования масла, как

- 81 022979 описано, например, в \УО 98/18912. Фосфолипазы по изобретению можно использовать для уменьшения содержания фосфолипида в пищевом масле. Способ может включать обработку масла фосфолипазой по изобретению для гидролиза основной части фосфолипида и отделения водной фазы, содержащей гидролизованный фосфолипид, от масла. Этот способ применим для очистки любого пищевого масла, которое содержит фосфолипид, например, растительных масел, таких как соевое масло, рисовое масло, рапсовое масло и подсолнечное масло, рыбьего жира, водорослей и животных жиров и т.д. Перед ферментативной обработкой растительное масло предпочтительно предварительно удаляют для удаления ила (слизистое вещество), например влажной очисткой. Масло может содержать приблизительно от 50 до 250 м.д. или от 50 до приблизительно 1500 м.д. или более фосфора в качестве фосфолипида в начале обработке фосфолипазой, и способ по изобретению может снижать эту величину до менее чем приблизительно от 5 до 10 м.д.

Ферменты по изобретению можно использовать в способах, описанных в заявке 1Р № Н5-132283, поданной 25 апреля 1993 г., которая включает способ очистки масел и жиров, включающий стадию конвертирования фосфолипидов, присутствующих в маслах и жирах, в растворимые в воде вещества, содержащие группы фосфорной кислоты, и удаление их в качестве растворимых в воде веществ. Действие фермента используют для конвертирования в растворимые в воде вещества. Предпочтительно в качестве фермента используют фермент, обладающий активностью фосфолипазы С.

Ферменты по изобретению можно использовать в способах, описанных в качестве способа органической очистки (ОКР) (1РН, ОшаЬа, №)), который представляет собой способ очитки масел семян. ОКР может иметь преимущества относительно традиционной химической очистки, включая увеличенный выход рафинированного масла, дополнительную стоимость совместно образующихся продуктов, сниженные капитальные затраты и более низкие затраты, связанные с охраной окружающей среды.

Ферменты по изобретению можно использовать в способах обработки масла или жира, животного или растительного, необработанного, полуобработанного или очищенного, включающих добавление к такому маслу или жиру по меньшей мере одного фермента по изобретению, который обеспечивает гидролиз и/или деполимеризацию неглицеридных соединений, содержащихся в масле, как описано, например, в заявке ЕР № 82870032.8. Иллюстративные способы по изобретению для гидролиза и/или деполимеризации неглицеридных соединений в маслах представляют собой:

1) добавление и примешивание к маслам и жирам фермента по изобретению или ферментных комплексов, ранее растворенных в небольшом количестве подходящего растворителя (например, воды). Возможно определенное количество растворителей, но выбирают нетоксический и пригодный для фермента растворитель. Это добавление можно проводить в способах с последовательным добавлением, а также в непрерывных способах. Количество фермента(ов), которое необходимо добавлять к маслам и жирам, согласно этому способу, может варьировать, в зависимости от ферментов и продуктов, подлежащих переработке, приблизительно от 5 до 400 м.д., или приблизительно от 20 до 400 м.д.; например от 0,005 до 0,4 кг фермента на 1000 кг масла или жира, и предпочтительно от 5 до 100 м.д., т.е. от 0,005 до 0,1 кг фермента на 1000 кг масла, эти величины приведены для концентрированных ферментов, т.е. без разбавителя или растворителя;

2) пропускание масла или жира через фиксированный или нерастворимый фильтрующий слой фермента(ов) по изобретению на твердых или полутвердых подложках, предпочтительно представляющих собой пористую или волокнистую структуру. В этом способе ферменты улавливаются в микрополости пористой или волокнистой структуры подложек. Они состоят, например, из смол или синтетических полимеров, карбонатов целлюлозы, гелей, таких как агароза, волокон полимеров или сополимеров с пористой структурой, улавливающих небольшие капли фермента в растворе в их полости. Что касается концентрации фермента, она может доходить вплоть до насыщения подложек.

3) диспергирование масел и жиров в форме мелких капель в разбавленном растворе фермента, в альтернативных аспектах, содержащем приблизительно от 0,05 до 4% или содержащем приблизительно от 0,2 до 4 об.% фермента по изобретению. Этот способ описан, например, в патенте Бельгии № 595219. Цилиндрическую колонну высотой несколько метров с конической крышкой заполняют разбавленным раствором фермента. Для этой цели выбирают растворитель, который является нетоксическим и не смешивающимся с маслом или жиром, подлежащим переработке, предпочтительно воду. Дно колонны оборудуют распределительной системой, в которой масло или жир инжектируются в высокой степени разделенной форме (приблизительно 10000 ед. потока/м²). Таким образом, образуется бесконечное количество капель масла или жира, которые медленно поднимаются в растворе фермента и встречаются на поверхности, непрерывно откачиваясь сверху конической крышки реактора.

Перед обработкой ферментом по изобретению пальмовое масло можно предварительно обрабатывать. Например, приблизительно 30 кг необработанного пальмового масла нагревают при +50°С. Приготавливают 1% растворы в дистиллированной воде с целлюлазами и пектиназами. 600 г каждого из них добавляют к водным растворам масла при энергичном встряхивании в течение нескольких минут. Затем масло выдерживают при +50°С при умеренном встряхивании в течение общего времени реакции 2 ч. Затем, температуру увеличивают до +90°С для инактивации ферментов и получения смеси для фильтрации и дальнейшей переработки. Масло сушат в вакууме и фильтруют с помощью фильтрующей добавки.

- 82 022979

Ферменты по изобретению можно использовать в способах, описанных в патенте ЕР 0513709 В2. Например, изобретение относится к способу уменьшения содержания содержащих фосфор компонентов в животных и растительных маслах путем ферментативного расщепления с использованием фосфолипазы по изобретению. В альтернативных аспектах животные и растительные масла с предварительно удаленным слизистым слоем с содержанием фосфора приблизительно от 50 до 1500 м.д. или приблизительно от 50 до 250 м.д. встряхивают с органической карбоновой кислотой и величину рН полученной смеси доводят приблизительно до рН 4-6, к смеси добавляют раствор фермента, который содержит фосфолипазу А₁, А₂ или В по изобретению в емкости для смешения при вихревом перемешивании и с образованием мелких капель, где образуется эмульсия с 0,5-5 мас.% относительно масла, где указанную эмульсию пропускают по меньшей мере через одну последующую реакционную емкость при вихревом перемешивании в течение времени реакции от 0,1 до 10 ч при температурах в диапазоне от 20 до 80°С и где обработанное масло после отделения от водного раствора имеет содержание фосфора менее 5 м.д.

Способ органической очистки применим как для неочищенного, так и для рафинированного масла. В способе используется добавление в ходе выполнения этого способа органической кислоты в контролируемых условиях процесса, совместно с общепринятым разделением центрифугированием. Воду, отделенную естественным образом от фосфолипидов растительных масел (УОР), возвращают в процесс и повторно используют. Общее использование воды может быть существенно снижено в результате способа органической очистки.

Фосфолипазы и способы по изобретению также можно использовать в ферментативной обработке пищевых масел, как описано, например, в патенте США № 6162623. В этих иллюстративных способах изобретение относится к амфифильному ферменту. Он может быть иммобилизован, например, путем приготовления эмульсии, содержащей непрерывную гидрофобную фазу и диспергированную водную фазу, содержащую фермент и носитель для фермента, и удаления воды из диспергированной фазы до тех пор, пока эта фаза не превратиться в твердые покрытые ферментом частицы. Фермент может представлять собой липазу. Иммобилизованную липазу можно использовать для реакций, катализируемых липазой, таких как переэтерификация моно-, ди- или триглицеридов, снижение кислотности триглицеридного масла или удаление фосфолипидов из триглицеридного масла, когда липаза представляет собой фосфолипазу. Водная фаза может содержать жидкость для ферментации, пищевое триглицеридное масло может представлять собой гидрофобную фазу, и носители включают сахара, крахмал, декстран, растворимые в воде производные целлюлозы и остатки после ферментации.

Этот иллюстративный способ можно использовать для переработки триглицеридов, диглицеридов, моноглицеридов, глицерина, фосфолипидов, гликолипидов или жирных кислот, которые могут быть в гидрофобной фазе. В одном аспекте предусмотрен способ удаления фосфолипидов из триглицеридного масла, включающий смешение триглицеридного масла, содержащего фосфолипиды, с препаратом, содержащим фосфолипазу по изобретению; гидролиз фосфолипидов до лизофосфолипида; отделение гидролизованных фосфолипидов от масла, где фосфолипаза представляет собой иммобилизованную фосфолипазу.

Фосфолипазы и способы по изобретению также можно использовать в ферментативной обработке пищевых масел, как описано, например, в патенте США № 6127137. В этом иллюстративном способе осуществляется гидролиз обеих жирных ацильных групп в неизмененном фосфолипиде. Фосфолипаза по изобретению, используемая в этом иллюстративном способе, не обладает активностью липазы и является активной при очень низких значениях рН. Эти свойства делают ее в высокой степени пригодной для применения в рафинировании масла, поскольку может снижаться как ферментативный, так и щелочной гидролиз (сапонификация) масла. В одном аспекте изобретение относится к способу гидролиза жирных ацилных групп в фосфолипиде или лизофосфолипиде, включающему обработку фосфолипида или лизофосфолипида фосфолипазой, которая гидролизует обе жирные ацильные группы в фосфолипиде и, по существу, свободна от активности липазы. В одном аспекте фосфолипаза по изобретению имеет оптимальную температуру при приблизительно 50°С, измеренную при рН 3-4 в течение 10 мин, оптимальное значение рН 3, измеренное при 40°С в течение приблизительно 10 мин. В одном аспекте фосфолипид или лизофосфолипид содержит лецитин или лизолецитин. В одном аспекте после гидролиза основной части фосфолипида водную фазу, содержащую гидролизованный фосфолипид, отделяют от масла. В одном аспекте изобретение относится к способу удаления фосфолипида из пищевого масла, включающему обработку масла при рН 1,5-3 дисперсией водного раствора фосфолипазы по изобретению, и отделение водной фазы, содержащей гидролизованный фосфолипид, от масла. В одном аспекте перед обработкой фосфолипазой масло обрабатывают для удаления слизистого материала. В одном аспекте перед обработкой фосфолипазой масло содержит фосфолипид в количестве, соответствующем от 50 до 250 м.д. фосфора. В одном аспекте обработку фосфолипазой проводят при 30-45°С в течение от 1 до 12 ч при дозировке фосфолипазы от 0,1 до 10 мг/л в присутствии 0,5-5% воды.

Фосфолипазы и способы по изобретению также можно использовать в ферментативной обработке пищевых масел, как описано, например, в патенте США № 6025171. В этих иллюстративных способах ферменты по изобретению иммобилизуют путем приготовления эмульсии, содержащей непрерывную гидрофобную фазу, такую как триглицеридное масло, и диспергированную водную фазу, содержащую

- 83 022979 амфифильный фермент, такой как липаза или фосфолипаза по изобретению, и носитель, который частично растворен и частично не растворен в водной фазе, и удаление воды из водной фазы до тех пор, пока фаза не превратиться в твердые покрытые ферментом частицы носителя. Нерастворенная часть носителя может представлять собой материал, который не растворим в воде и масле, или растворимый в воде материал в нерастворенной форме, поскольку водная фаза уже насыщена растворимым в воде материалом. Водная фаза может быть образована неочищенной жидкостью для ферментации липазой, содержащей остатки ферментации и биомассу, которая служит в качестве носителя. Иммобилизованная липаза пригодна для перегруппировки сложных эфиров и снижения кислотности масел. После реакции иммобилизованный фермент можно регенерировать для последующей реакции путем добавления воды для обеспечения частичного растворения носителя, и когда полученная водная фаза, содержащая фермент и носитель, диспергируется в гидрофобной фазе упариванием воды, вновь формируя покрытые ферментом частицы носителя.

Фосфолипазы и способы по изобретению также можно использовать в ферментативной обработке пищевых масел, как описано, например, в патенте США № 6143545. Этот иллюстративный способ используют для снижения содержания фосфорсодержащих компонентов в пищевом масле, содержащем высокое количество негидратируемых фосфорсодержащих компонентов, с использованием фосфолипазы по изобретению. В одном аспекте способ используют для снижения содержания фосфорсодержащих компонентов в пищевом масле, имеющем содержание негидратируемых фосфорсодержащих компонентов по меньшей мере 50 м.д., измеренное путем предварительной обработки пищевого масла при 60°С, добавления раствора, содержащего моногидрат лимонной кислоты в воде (добавление воды относительно масла составляет 4,8% мас./мас.; (лимонная кислота) в водной фазе = 106 мМ, в эмульсии вода/масло эмульсия = 4,6 мМ) в течение 30 мин; переноса 10 мл предварительно обработанной воды в масляной эмульсии в пробирку; нагревания эмульсии на кипящей водяной бане в течение 30 мин; центрифугирования при 5000 об/мин в течение 10 мин, переноса приблизительно 8 мл верхней (масляной фазы) в новую пробирку и оставляя для осаждения на 24 ч; и отбора 2 г из верхней прозрачной фазы для измерения содержания дегидратируемых фосфорсодержащих компонентов (м.д.) в пищевом масле. Также способ может включать контактирование масла при рН приблизительно рН от 5 до 8 с водным раствором фосфолипазы А или В по изобретению (например, РЬА1, РЬА2 или РЬВ), который эмульгируют в масле до тех пор, пока содержание фосфора в масле не снизится до менее чем 11 м.д., а затем отделение водной фазы от обработанного масла.

Фосфолипазы и способы по изобретению также можно использовать в ферментативной обработке пищевых масел, как описано, например, в патенте США № 5532163. Изобретение относится к способам очистки масла и жира, посредством которых фосфолипиды в масле и жире, подлежащие обработке, можно эффективно расщеплять и удалять. В одном аспекте изобретение относится к способу очистки масла и жира, который включает реакцию в эмульсии масла и жира с ферментом по изобретению, например ферментом, обладающим активностью расщепления сложноэфирных связей глицерин-жирная кислота в глицерофосфолипидах (например, РЬА2 по изобретению); и к другому способу, в котором обработанные ферментом масло и жир промывают водой или водным раствором кислоты. В одном аспекте водный раствор кислоты, предназначенный для применения на стадии промывания, представляет собой раствор по меньшей мере одной кислоты, например лимонной кислоты, уксусной кислоты, фосфорной кислоты и их солей. В одном аспекте эмульгированное состояние обеспечивают с использованием 30 мас.ч. или более воды на 100 мас.ч. масла и жира. Поскольку масло и жир можно очищать без применения общепринятой стадии щелочной очистки, может быть снижено образование сточной промывочной воды и промышленных отходов. Кроме того, выход масла увеличивается, поскольку в способе по изобретению не происходит потеря нейтрального масла и жира вследствие их включения в эти отходы. В одном аспекте изобретение относится к способу очистки масла и жира, содержащего приблизительно от 100 до 10000 м.д. фосфолипидов, который включает реакцию в эмульгированном состоянии указанного масла и жира с ферментом по изобретению, имеющим активность расщепления сложноэфирных связей глицеринжирная кислота в глицерофосфолипидах. В одном аспекте изобретение относится к способам очистки масла и жира, содержащих приблизительно от 100 до 10000 м.д. фосфолипидов, которые включают реакцию в эмульгированном состоянии масла и жира с ферментом по изобретению, имеющим активность расщепления сложноэфирных связей глицерин-жирная кислота в глицерофосфолипидах; а затем промывание обработанного масла и жира промывочной водой.

Фосфолипазы и способы по изобретению также можно использовать в ферментативной обработке пищевых масел, как описано, например, в патенте США № 5264367. Содержание фосфорсодержащих компонентов и содержание железа в пищевом растительном или животном масле, например, таком как масло, например соевое масло, которое подвергнуто влажной очистке для удаления клейкого материала, снижают ферментативным расщеплением путем контактирования масла с водным раствором фермента по изобретению, например фосфолипазой А1, А2 или В, а затем отделения водной фазы от обработанного масла. В одном аспекте изобретение относится к ферментативному способу снижения содержания содержащих фосфор- и железокомпонентов в масле, очищенном для удаления клейкого материала. Масло, очищенное для удаления клейкого материала, можно обрабатывать ферментом по изобретению, на- 84 022979 пример фосфолипазой С, А1, А2 или В. Можно достигать содержания фосфора менее 5 м.д. и содержания железа менее 1 м.д. Низкое содержание железа может быть преимущественным для стабильности масла.

Фосфолипазы и способы по изобретению также можно использовать для получения переэтерифицированных масел, как описано, например, в патенте США № 5288619. Изобретение относится к способам ферментативной переэтерификации для получения маргарина, имеющего низкое содержание транскислот и низкое содержание жирных кислот средней цепи. Способ включает стадии обеспечения переэтерификации реакционной смеси, содержащей источник стеариновой кислоты и пищевое жидкое растительное масло, переэтерификацию источника стеариновой кислоты и растительного масла с использованием специфичной к 1, 3 положениям липазы, и, наконец, гидрогенизацию смеси жирных кислот с получением рециклированного источника стеариновой кислоты для повторного использования в реакции с растительным маслом. Изобретение также относится к противоточному способу получения переэтерифицированного масла. Способ включает стадии предоставления зоны реакции переэтерификации, содержащей специфичную к 1, 3 положениям липазу, подачи растительного масла в зону переэтерификации, подачу источника стеариновой кислоты, подачу противоточной жидкости сверхкритического газа или сверхкритического сжиженного газа, проведение реакции переэтерификации потока триглицеридов с потоком стеариновой кислоты или сложного моноэфира стеариновой кислоты в зоне реакции, отведение потока переэтерифицированного триглициридного маргарина, отведение противоточной жидкой фазы, гидрогенизацию переэтерифицированной стеариновой кислоты или сложного моноэфира стеариновой кислоты для обеспечения гидрогенизированного рециклированного источника стеариновой кислоты, и подачу гидрогенизированного рециклированного источника стеариновой кислоты в зону реакции.

В одном аспекте в высокой степени ненасыщенное фосфолипидное соединение можно конвертировать в триглицерид путем соответствующего применения фосфолипазы С по изобретению для удаления фосфатной группы в 8п-3 положении, с последующим синтезом 1,3-липазой ацилэфиров. 2-замещенный фосфолипид можно использовать в качестве функционального пищевого ингредиента, или его можно впоследствии селективно гидролизовать в реакторе 160 с использованием иммобилизованной фосфолипазы С по изобретению с получением 1-диглицерида, с последующей ферментативной этерификацией, как описано в настоящем документе, с образованием триглицеридного продукта, имеющего компонент в виде 2-замещенной полиненасыщенной жирной кислоты.

Фосфолипазы и способы по изобретению также можно использовать в способе ферментативного рафинирования, как описано, например, в патенте США № 6001640. Этот способ по изобретению включает стадию рафинирования при производстве пищевых масел. Растительные масла, из которых удалены гидратируемые фосфатиды путем предшествующего способа рафинирования гидратацией, освобождают от негидратируемых фосфатидов путем ферментативной обработки с использованием фосфолипазы по изобретению. Способ может быть мягким, благоприятным с экономической точки зрения и с точки зрения воздействия на окружающую среду. В этом способе рафинирования используют фосфолипазы, которые гидролизуют только лизолецитин, но не лецитин.

В одном аспекте для обеспечения действия фермента по изобретению обе фазы: масляная фаза и водная фаза, которые содержат фермент, должны быть смешаны в однородную смесь. Может быть недостаточно только перемешать их. Хорошую дисперсию фермента в масле обеспечивают, если ее растворяют в небольшом количестве воды, например 0,5-5 мас.% (относительно масла), и эмульгируют в масле в этой форме с образованием капель диаметром (средневзвешенным) менее 10 мкм. Капли могут иметь размер менее 1 мкм. Можно проводить вихревое перемешивание с радиальной скоростью более 100 см/с. Также масло можно циркулировать в реакторе с использованием внешнего ротационного насоса. Водную фазу, содержащую фермент, также можно превращать в тонкую дисперсию под действием ультразвука. Можно использовать устройство для диспергирования.

Ферментативная реакция, вероятно, происходит при более широкой поверхности масляной и водной фазы. Целью всех этих мер по перемешиванию является обеспечение наибольшей возможной поверхности для водной фазы, которая содержит фермент. Добавление поверхностно-активных веществ увеличивает микродиспергирование водной фазы. Таким образом, в некоторых случаях, в раствор фермента добавляют поверхностно-активные вещества с величинами НЬВ более 9, такие как Νηдодецилсульфат, как описано, например, в ЕР-А-0513709. Сходным эффективным способом усиления эмульгирования является добавление лизолецитина. Добавляемые количества могут находиться в диапазоне от 0,001 до 1% относительно масла. Температура в ходе обработки ферментом не является важной. Можно использовать температуры от 20 до 80°С, однако последнюю из них можно использовать только в течение короткого периода времени. В этом аспекте используют фосфолипазу по изобретению, имеющую высокую температурную устойчивость и/или устойчивость к низким рН. Применение температур от 30 до 50°С является оптимальным. Период обработки зависит от температуры, и он может уменьшаться при увеличении температуры. Обычно являются достаточными периоды времени от 0,1 до 10 ч, или от 1 до 5 ч. Реакцию проводят в реакторе для рафинирования, который может быть разделен на ступени, как описано, например, в ΌΕ-Α-4339556. Таким образом, возможно непрерывное действие, а также периодическое действие. Реакцию можно проводить в ступенях с различной температурой. Например, инкуба- 85 022979 цию можно проводить в течение 3 ч при 40°С, затем в течение 1 ч при 60°С. Если реакция протекает в ступенях, это также дает возможность коррекции различных величин рН на отдельных ступенях. Например, на первой ступени рН раствора можно доводить до 7, например, и на второй ступени до 2,5, путем добавления лимонной кислоты. Однако по меньшей мере в одной ступени значение рН раствора фермента должно быть ниже 4 или ниже 3. Если рН впоследствии довести до уровня ниже этого, может произойти ухудшение эффекта. Таким образом, лимонную кислоту можно добавлять к раствору фермента до того, как последний примешивают к маслу.

После завершения обработки ферментом раствор фермента вместе с продуктами расщепления Ν^, содержащимися в нем, можно отделять от масляной фазы, партиями или непрерывно, например, путем центрифугирования. Поскольку ферменты характеризуются высоким уровнем стабильности и количество продуктов расщепления, содержащихся в растворе, является небольшим (они могут выпадать в осадок в виде шлама) одну и ту же водную фазу фермента можно использовать несколько раз. Также существует возможность высвобождения фермента из шлама, см., например, ПЕ-А-4339556, так чтобы раствор фермента, который, по существу, свободен от шлама, можно было использовать вновь. В одном аспекте этого способа рафинирования получают масла, которые содержат менее 15 м.д. фосфора. Одной из целей является содержание фосфора менее 10 м.д. или менее 5 м.д. В случае содержания фосфора менее 10 м.д. является вполне возможной дальнейшая переработка масла способом дистилляционного снижения кислотности. Из масла можно удалять ряд других ионов, таких как ионы магния, кальция, цинка, а также железа, например, до уровня менее 0,1 м.д. Таким образом, этот продукт обладает идеальными предпосылками для высокой устойчивости к окислению в ходе дальнейшей переработки и хранения.

Фосфолипазы и способы по изобретению также можно использовать для снижения количества фосфорсодержащих компонентов в растительных и животных маслах, как описано, например, в патенте ЕР 0513709. В этом способе содержание фосфорсодержащих компонентов, особенно фосфатидов, таких как лецитин и содержание железа в растительных и животных маслах, из которых ранее был удален клейкий материал, например соевое масло, снижают ферментативным расщеплением с использованием фосфолипазы А1, А2 или В по изобретению.

Фосфолипазы и способы по изобретению также можно использовать для очистки жиров или масел, как описано, например, в ЙР 06306386. Изобретение относится к способам очистки жира или масла, включающим стадию превращения фосфолипида в жире или масле в растворимое в воде содержащее группу фосфора вещество и удаления этого вещества. Действие фермента по изобретению (например, Р1РЬС) используют для превращения фосфолипида в это вещество. Таким образом, возможно очистить жир или масло без проведения стадии щелочной очистки, в которой образуются промышленные отходы, содержащие щелочную сточную воду и большое количество масла. Можно достигать увеличения выхода, поскольку потери нейтрального жира или масла с отходами можно снижать до нуля. В одном аспекте камедеобразные вещества конвертируют в растворимые в воде вещества и удаляют в качестве растворимых в воде веществ путем добавления фермента по изобретению, обладающего активностью фосфолипазы С, на стадии рафинирования неочищенного масла и проведения ферментативной обработки. В одном аспекте фосфолипаза С по изобретению обладает активностью, которая расщепляет фосфоэфирные связи глицерина и фосфорной кислоты в фосфолипидах. Если необходимо, способ может включать промывание обработанного ферментом масла водой или водным раствором кислоты. В одном аспекте фермент по изобретению добавляют к и подвергают реакции с неочищенным маслом. Используемое количество фосфолипазы С может составлять от 10 до 10000 единиц или приблизительно от 100 до 2000 единиц на 1 кг неочищенного масла.

Фосфолипазы и способы по изобретению также можно использовать для способов рафинирования гидратацией, как описано, например, в Оук81га, А1Ьей ί., е! а1., О1еадтеих, Согр8 Ога8, Пр1йе8 (1998), 5(5), 367-370. В этом иллюстративном способе способ рафинирования гидратацией используют для получения лецитина и способов сухого рафинирования с использованием осуществляющей рафинирование кислоты и отбеливающей земли. Этот способ может быть экономически обоснованным только для масел с низким содержанием фосфатидов, например, пальмового масла, лауриновых масел и т.д. Для масел семян, имеющих высокое содержание Ν^, используют способ рафинирования кислотой, причем этот способ проводят в маслобойке для обеспечения удаления камеди через муку. В одном аспекте на этом очищенное кислотой масло можно проводить полирующее действие перед физической очисткой.

Фосфолипазы и способы по изобретению также можно использовать для способов рафинирования, описанных, например, в Оук81га, е! а1., Ке8. Эех. Эер., Ν.ν. Уапйетоог1е1е Соогй. Сет, Ι/едет, Ве1д. 1АОС8, ί. Ат. Ой Скет. 8ос. (1989), 66: 1002-1009. В этом иллюстративном способе общий процесс рафинирования вовлекает диспергирование кислоты, такой как Н₃РО₄ или лимонная кислота, в соевом масле, обеспечение времени контакта, а затем примешивание основания, такого как каустическая сода или силикат №, в эмульсию кислоты в масле. Это поддерживает степень нейтрализации, достаточно низкую, чтобы избежать образования мыл, поскольку это привело бы к увеличению потерь масла. Затем масло подают в центробежный сепаратор, где основная часть камедей удаляется из потока масла с образованием фазы камеди с минимальным содержанием масла. Затем поток масла подают во второй центробежный сепаратор для удаления всех оставшихся камедей с получением разбавленной фазы камеди, которую ре- 86 022979 циклируют. Промывание и высушивание или включенная в процесс очистка щелочью завершают этот процесс. После внедрения процесса общего рафинирования по сравнению с классическим процессом щелочной очистки достигают общего улучшения выхода приблизительно 0,5%. В целом рафинированное масло можно далее подвергать щелочной очистке, отбеливать и дезодорировать или отбеливать и подвергать физической очистке.

Фосфолипазы и способы по изобретению также можно использовать для удаления негидратируемых фосфолипидов из растительного масла, например соевого масла, как описано, например, в Нуо1Ьу, ек а1., 8о_)акадеГаЬг., СорепНадеп, Беп., 1. Атег. 0ί1 СНет. 8ос. (1971) 48:503-509. В этом иллюстративном способе рафинированное гидратацией масло смешивают при различных фиксированных значениях рН с буферными растворами с Са, Мд/Са-связывающими реагентами и поверхностно-активными веществами или без них. Негидратируемые фосфолипиды можно удалять в неконвертированном состоянии в качестве компонента мицелл или смешанных эмульгаторов. Более того, негидратируемые фосфолипиды можно удалять конвертированием в диссоциированные формы, например, путем удаления Мд и Са из фосфатидов, которое можно проводить путем подкисления или путем обработки образующими комплексы с Мд/Са или осаждающими Мд/Са реагентами. Удаление или химическая конверсия негидратируемых фосфолипидов может приводить к уменьшенному образованию эмульсии и увеличенному отделению масла со сниженным содержанием кислотности от слоя эмульсии и соапстока.

Фосфолипазы и способы по изобретению также можно использовать для рафинирования растительных масел, как описано, например, ВисНо1б, ек а1., Ртапк£ит1/Ма1п, Оегтапу. Рей ХУйкепксНаП ТесНпо1од1е (1993), 95(8), 300-304. В этом иллюстративном способе по изобретению для рафинирования пищевых растительных масел, используют водные суспензии фермента по изобретению, например, фосфолипазы А2, для гидролиза жирной кислоты, связанной с кп2-положением фосфолипида, с образованием 1-ациллизофосфолипидов, которые нерастворимы в масле и, таким образом, более подвержены физическому отделению. Даже добавление небольших количеств, соответствующих приблизительно 700 единиц лецитазы/кг масла, приводит к остаточной концентрации Р менее 10 м.д., так что химическую очистку можно заменять физической очисткой, устраняя необходимость в нейтрализации, расщеплении соапстока и обработке отработанной воды.

Фосфолипазы и способы по изобретению также можно использовать для рафинирования растительных масел, как описано, например, Еп/уМа.х, БаЫке, К1аик, Берк. О-РБ0, Ьитд1 01-Оак, СНет1е, ОтЬН, РгапкГой Оегтапу. 01еадшеих, Согрк Огак, Ыр1бек (1997), 4(1), 55-57. Этот иллюстративный способ представляет собой способ рафинирования для физической очистки практически любого типа масла. Путем ферментативно катализируемого гидролиза фосфатиды конвертируют в растворимые в воде лизофосфатиды, которые отделяют от масла центрифугированием. Остаточное содержание фосфора в ферментативно рафинированном масле может составлять только 2 м.д. Р.

Фосфолипазы и способы по изобретению также можно использовать для рафинирования растительных масел, как описано, например, С1еепе\уегск, ек а1., Ν.ν. Уато МШк, Ι/едет, Ве1д. Рекк ХУйкепксНаП ТесНпо1од1е (1992), 94:317-22; и, С1аикеп, К1т; №е1кеп, Мипк. №уо/утек А/8, Беп. Бапкк Кет1 (2002) 83(2):24-27. фосфолипазы и способы по изобретению могут включать предварительную очистку растительных масел кислотами, как описано, например, №1ккоп-.ТоНапккоп, ек а1., Ракк 0йк βίν., А1ГаЬауа1 Рооб Епд. АВ, ТитЬа, 8\уеб. Рекк ХУйкепксНаП ТесНпо1од1е (1988), 90(11), 447-51; и, МипсН, Егпкк У. Сегео1 БеикксЫапб ОтЬН, МаппНеш, Оегтапу. Ебйог(к): ХУПкоп, ШсНагб Р. Ртосеебшдк оГ кНе ХУог1б СопГегепсе оп 0йкееб Ртосеккшд ийН/айоп, Сапсип, МХ, №у. 12-17, (2001), Меейпд Баке 2000, 17-20.

Фосфолипазы и способы по изобретению также можно использовать для рафинирования растительных масел, как описано, например, кег/еукка, ек а1., 1пк1. Рг/етук1и М1екпедо ί Т1ик/с/оуедо, ХУагкау, Ро1, Т1ик/с/е 1аба1пе (2001), 36(3/4), 97-110. В этом способе по изобретению ферментативное рафинирование гидратированного рапсового масла с низким содержанием эруковой кислоты проводят с использованием фосфолипазы А2 по изобретению. Фермент может катализировать гидролиз сложноэфирных связей жирных кислот с центральным атомом углерода глицериновой части в фосфолипидах. Он может гидролизовать негидратируемые фосфолипиды до их соответствующих гидратируемых лизосоединений. В случае неочищенного препарата ферментов, лучших результатов можно достигать добавлением 2% препарата на 4 ч (удаление 87% Р).

В другом иллюстративном способе по изобретению для рафинирования масла (или способ рафинирования масла с использованием фермента по изобретению), добавляют кислый полимер, например альгинат или пектин. В этом способе рафинирования масла по изобретению кислый полимер (например, альгиновую кислоту или пектин или более растворимую солевую форму) добавляют к неочищенному маслу с низким содержанием воды (например, в диапазоне приблизительно от 0,5 до 5%). В этом аспекте кислые полимеры могут восстанавливать и/или разрушать комплексы фосфолипид-металл путем связывания кальция и/или магния в неочищенном масле, тем самым повышая растворимость негидратируемых фосфолипидов. В альтернативных аспектах эти фосфолипиды перемещаются на поверхность контакта масло/вода или входят в водную фазу и либо их конвертируют в диацилглицерин и соответствующую боковую цепь, либо неизмененный фосфолипид удаляют путем последующего центрифугирования в качестве компонента тяжелой фазы. Присутствие кислого полимера в водной фазе также может увеличи- 87 022979 вать плотность водной фазы и приводит к увеличенному отделению тяжелой фазы от масляной (масляной) фазы.

В одном иллюстративном способе по изобретению для рафинирования масла (или способ рафинирования масла с использованием фермента по изобретению) изменена методика дезодорирования для получения фракции диацилглицеринов (ОАО). В альтернативном аспекте, если необходимо или желательно, после обуславливаемого ферментом рафинирования условия дезодорирования (температуру, давление, конфигурацию устройства для дистилляции) можно модифицировать для увеличения отделения свободных жирных кислот (РРА) от фракции диацилглицеринов/триацилглицеринов или далее модифицировать для отделения диацилглицеринов от фракции триацилглицеринов. В результате этих модификаций с использованием этого способа по изобретению возможно получить РРА и диацилглицерин пищевой категории, если использовать фермент по изобретению (например, фосфатазу или РЬС или комбинацию РЬС и фосфатаз) для рафинирования пищевого масла способом физической очистки.

В различных аспектах осуществление на практике способов по изобретению, как описано в настоящем документе (или с использованием ферментов по изобретению), имеет преимущества, такие как снижение или устранение растворителя и повторное использование растворителя; более низкие капитальные затраты; снижение затрат на последующую очистку, снижение использования химических реагентов, использования оборудования, длительности обработки, использования энергии (теплоты) и воды/образования отработанной воды; получение более высококачественного масла; отжатое на шнековом прессе масло можно использовать без очистки в некоторых применениях для варки или жарки (это прессованное масло может обладать более высокой стабильностью, характеристиками цвета и запаха и высоким содержанием токоферола); получение более высококачественной муки; получение муки с более низким содержанием жиров (в настоящее время, мука, получаемая с помощью механического пресса, взывает проблемы с пищеварением у жвачных животных); получение улучшенных питательных свойств сниженных уровней глюкозинолятов, танинов, синапина, фитиновой кислоты (как описано, например, в Тссйпо1оду апД Зо1ийоп8 йог Ех1гас!шд ОП8ссД8 апД Ыопрс!го1сит ОЙ8, АОСЗ 1997).

В одном аспекте изобретение относится к способам очистки растительных масел (например, соевого масла, кукурузного масла, хлопкового масла, пальмового масла, арахисового масла, рапсового масла, сафлорового масла, подсолнечного масла, кунжутного масла, рисового масла, кокосового масла или масла канолы) и их побочных продуктов и к способам дезодорирования лецитина, например, как описано в патенте США Ыо. 6172248 или 6172247, где способы включают применение по меньшей мере одного фермента по изобретению, например фосфолипазы С по изобретению. Таким образом, изобретение относится к лецитину и растительным маслам, содержащим по меньшей мере один фермент по изобретению. В иллюстративном способе очистки органической кислотой растительное масло комбинируют с разбавленным водным раствором органической кислоты и подвергают воздействию сдвигового усилия для получения тонкой дисперсии раствора кислоты в масле. Полученную смесь кислоты и масла смешивают при низком сдвиговом усилии в течение времени, достаточного для изолирования примесей в гидратированную фазу примесей, с образованием очищенной фазы растительного масла. В этом иллюстративном способе можно использовать смеситель или рециркуляционную систему (например, рецирукляционную емкость с водой) и/или емкость для хранения фосфатидов или лецитина, например, как описано в патентах США № 4240972, 4049686, 6172247 или 6172248. Эти способы можно выполнять путем периодического или непрерывного процесса. Неочищенное или рафинированное растительное масло можно подавать из емкости для хранения (например, через насос) и можно нагревать. Растительное масло, подлежащее очистке, может представлять собой либо неочищенное, либо рафинированное масло.

В одном аспекте ферменты фосфатидилинозитол-РЬС (Р1-РБС) по изобретению используют для рафинирования растительного масла. Ферменты Р1-РБС по изобретению можно использовать отдельно или в комбинации с другими ферментами (например, РЬС, РЬО, ферментами фосфатазами по изобретению) для увеличения выхода масла в процессе рафинирования растительных масел (включая масло сои, канолы и подсолнуха). Р1-РБС предпочтительно может конвертировать фосфатидилинозитол в 1,2диацилглицерин (ОАО) и фосфоинозитол, но также она может демонстрировать активность в отношении других фосфолипидов, включая фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин или фосфатидную кислоту или их комбинацию. Увеличение выхода может быть достигнуто в качестве увеличения количества ОАО в обработанном ферментом растительном масле и увеличения содержания нейтрального масла вследствие снижения количества масла, удерживаемого в меньшей фракции камеди, которая образуется в результате обработки растительного масла ферментом.

Ферментативная обработка масличных семян

Изобретение относится к композициям (например, ферментам) и способам ферментативной обработки масличных семян, включая сою, канолу, кокос, авокадо и оливковую пасту. В одном аспекте эти способы по изобретению могут увеличивать выход масла и улучшать питательные качества полученной муки. В некоторых аспектах ферментативная обработка масличных семян с использованием ферментов и способов по изобретению обеспечивает экономическую пользу и пользу для окружающей среды, а также альтернативные технологии для экстракции масла и обработки пищевых продуктов для употребления человеком и животными. В альтернативных аспектах способы по изобретению включают применение

- 88 022979 фосфолипаз по изобретению, других фосфолипаз, протеаз, фосфатаз, фитаз, ксиланаз, амилаз (например, α-амилаз), глюканаз (например, β-глюканаз), полигалактуроназ, галактолипаз, целлюлаз, гемицеллюлаз, пектинах и других ферментов, деградирующих клеточную стенку растений, а также смешанных препаратов ферментов и клеточных лизатов.

В альтернативных аспектах способы по изобретению можно осуществлять на практике применительно к другим способам, например ферментативным обработкам, например, карбогидразами, включая целлюлазу, гемицеллюлазу и ферменты с другими неосновными видами деградирующей активности, или к химическим способам, например экстракции гексаном соевого масла. Ферментативная обработка может увеличивать возможность экстракции масла на 8-10%, когда перед экстракцией растворителем проводят ферментативную обработку.

В альтернативных аспектах способы по изобретению можно применять на практике со способами водной экстракции. Способы водной экстракции могут представлять собой более экологически чистые альтернативные технологии экстракции масла. Низкий выход экстракции водного способа можно преодолеть с использованием ферментов, которые гидролизуют структурные полисахариды, образующие клеточную стенку масличных семян, или которые гидролизуют белки, которые образуют клеточные мембраны и мембраны липидных телец, например, с использованием расщепления, включающего расщепление целлюлазой, гемицеллюлазой и/или протопктиназой для экстракции масла из клеток сои. В одном аспекте способы применяют на практике с ферментом по изобретению, как описано Кака1 (2003) I. Адпс. Еооб СЬет. 51:6217-6222, где описано, что наиболее эффективным ферментом для расщепления клеточной стенки является целлюлаза.

В одном аспекте в комбинации со способами по изобретению используют протеазы. Был оценен комбинированный эффект операционных переменных и активности фермента протеазы и целлюлазы на выход экстракции масла и белка, в комбинации с другими параметрами процесса, такими как концентрация фермента, время гидролиза, размер частиц и соотношение твердого вещества и жидкости. В одном аспекте способы осуществляют на практике с помощью фермента по изобретению, как описано Ко5еп1Ьа1 (2001) Еп/уте апб МютоЬ. ТесЬ. 28:499-509, где описано, что применение протеазы может приводить к значительно более высоким выходам масла и белка относительно контроля, когда используют обработанную нагреванием муку.

В одном аспекте в комбинации со способами по изобретению используют полную экстракцию белков, пектина и гемицеллюлозы. Растительная клетка состоит из набора полисахаридов, часто связанных с белками или фенольными соединениями или замещенных ими. Большинство из этих углеводов только частично расщепляются или плохо расщепляются расщепляющими ферментами. Разрушение этих структур путем переработки или деградации ферментами может повысить их питательную доступность. В одном аспекте способы осуществляют на практике с ферментом по изобретению, как описано ОиЫба (2002) I. Адпс. Еооб СЬет. 50: 1933-1938, где описано, что существенной деградации целлюлозы клеточной стенки сои (вплоть до 20%) достигали после полной экстракции белка, пектина и гемицеллюлозы.

В одном аспекте способы по изобретению, кроме того, включают включение различных ферментативных обработок в обработку семян, например семян канолы, причем эти обработки включают применение протеаз, целлюлаз и гемицеллюлаз (в различных комбинациях друг с другом и с одним или несколькими ферментами по изобретению). Например, способы могут включать ферментативные обработки семян канолы при влажности от 20 до 40 в ходе инкубации с ферментами перед выполнением общепринятого способа; как описано, ЗотЫм (1990) Ргос. Сап. ШкЕ Еооб §сЕ ТесЬпо1. 3:656. Кроме того, способы по изобретению могут включать включение протеаз, амилаз, полигалактуроназ (в различных комбинациях друг с другом и с одним или несколькими ферментами по изобретению) для гидролиза клеточного материала в кокосовой муке и высвобождения кокосового масла, которое можно выделять центрифугированием, как описано, например, МсС1опе (1986) I. оГ Еооб 8сЕ 51: 695-697. Кроме того, способы по изобретению могут включать включение пектиназ, амилаз, протеаз, целлюлаз в различных комбинациях (друг с другом и с одним или несколькими ферментами по изобретению), обеспечивая существенное увеличение выхода (-70% в лучшем случае) в процессе ферментативной экстракции масла авокадо, как описано, например, ВиепгоЦго (1986) Вю1есЬ. Ьейетк 8(7): 505-506. В способах по изобретению для экстракции оливкового масла, оливковую пасту обрабатывают целлюлазой, гемицеллюлазой, полигалактуроназой, пектин-метилтрансферазой, протеазой и их комбинациями (друг с другом и с одним или несколькими ферментами по изобретению), как описано, например, Мойебото (1976) Ас1а Уйатш. Еп/уто1. (МПапо) 30: 13.

Очистка фитостеринов из растительных масел

Изобретение относится к способам очистки фитостеринов и тритерпенов или растительных стеринов из растительных масел. Фитостерины, которые можно очищать с использованием фосфолипаз и способов по изобретению, включают β-ситостерин, кампестерин, стигмастерин, стигмастанол, β-ситостанол, ситостанол, десмостерин, халинастерин, пориферастерин, клионастерин или брассикастерин. Растительные стерины являются важными сельскохозяйственными продуктами для промышленности здравоохранения и пищевой промышленности. Таким образом, фосфолипазы и способы по изобретению использу- 89 022979 ют для получения эмульгаторов для производителей косметических средств и стероидных промежуточных соединений и предшественников для получения гормональных фармацевтических средств.

Фосфолипазы и способы по изобретению используют для получения (например, очистки) аналогов фитостеринов и их сложных эфиров для применения в качестве средств, снижающих уровень холестерина, с кардиологической пользой для здоровья. Фосфолипазы и способы по изобретению используют для очистки стеринов растений для снижения уровней холестерина в сыворотке путем ингибирования всасывания холестерина в просвете кишечника. Фосфолипазы и способы по изобретению используют для очистки растительных стеринов, которые обладают иммуномодулирующими свойствами в чрезвычайно низких концентрациях, включая усиленный клеточный ответ Т-лимфоцитов и цитотоксическую способность естественных киллерных клеток против злокачественной клеточной линии. Фосфолипазы и способы по изобретению используют для очистки растительных стеринов для лечения туберкулеза легких, ревматоидного артрита, управления течением заболевания у ВИЧ-инфицированных пациентов и ингибирования иммунного стресса, например, у участников марафонов.

Фосфолипазы и способы по изобретению используют для очистки стериновых компонентов, присутствующих в стериновых фракциях продовольственных растительных масел (например, кокосового масла, масла канолы, масла какао, кукурузного масла, хлопкового масла, льняного масла, оливкового масла, пальмового масла, арахисового масла, рисового масла, сафлорового масла, кунжутного масла, сои, подсолнечного масла), таких как ситостерин (40,2-92,3%), кампестерин (2,6-38,6%), стигмастерин (031%) и 5-авенастерин (1,5-29%).

Способы по изобретению могут включать выделение происходящих из растений стеринов из масличных семян путем экстракции растворителем хлороформ-метанолом, гексаном, метиленхлоридом или ацетоном, с последующей сапонификацией и хроматографической очисткой полученных обогащенных общих стеринов. Альтернативно растительные образцы можно экстрагировать сверхкритической жидкостной экстракцией со сверхкритическим диоксидом углерода с получением экстрактов общих липидов, которые можно обогащать стеринами, и стерины выделять. Для последующей охарактеризации и количественного определения стериновых соединений, неочищенный изолят можно очищать и разделять широким множеством хроматографических способов, включая колоночную хроматографию (СС), газовую хроматографию, тонкослойную хроматографию (ТЬС), нормально-фазовую высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ), обращенно-фазовую ВЭЖХ и капиллярную электрохроматографию. Из всех способов хроматографического выделения и разделения, использование методик СС и ТЬС является наиболее удобным, доступным и пригодным для извлечения, очистки, количественных анализов и предварительной оценки стеринов в тестируемых образцах.

Фитостерины утрачиваются из растительных масел в качестве побочных продуктов в способах очистки масла. Фосфолипазы и способы по изобретению используют фитостерины, выделенные из таких побочных продуктов, для образования обогащенных фитостерином продуктов, выделенных из таких побочных продуктов. В способах выделения и очистки фитостеринов по изобретению могут использоваться побочные продукты маслоперерабатывающей промышленности, и они могут включать действия, такие как молекулярная дистилляция, экстракция жидкости жидкостью и кристаллизация.

Способы по изобретению могут включать способы экстракции липидов для экстракции фитостеринов. Например, в способах по изобретению могут использоваться неполярные растворители, такие как гексан (широко используемый для экстракции большинства типов растительных масел) в количественном отношении для экстракции свободных фитостеринов и фитостериловых эфиров жирных кислот. Стерилгликозиды и ацилированные жирной кислотой стерилгликозиды только частично экстрагируются гексаном, и увеличение полярности растворителя обеспечивает более высокий процент экстракции. Одним из способов, который можно использовать, является способ с хлороформ-метанолом БИдЬ и Эуег для экстракции всех классов стериновых липидов, включая фосфолипиды. Один из иллюстративных способов как для количественного разделения, так и для количественного анализа фитостериновых классов липидов включает инжектирование экстракта липидов в систему ВЭЖХ.

Фосфолипазы и способы по изобретению можно использовать для удаления стеринов из жиров и масел, как описано, например, в патенте США № 6303803. Этот способ представляет собой способ снижения содержания стерина в содержащих стерин жирах и маслах. Он является эффективным и экономичным способом на основе аффинности холестерина и других стеринов к амфипатическим молекулам, которые формируют гидрофобные, текучие бислои, такие как фосфолипидные бислои.

Агрегаты фосфолипидов контактируют, например, с содержащим стерин жиром или маслом в водной среде, а затем перемешивают. Молекулярная структура этой агрегированной смеси фосфолипидов имеет высокую аффинность к холестерину и другим стеринам и может селективно удалять такие молекулы из жиров и масел. Смесь для водного разделения перемешивают в течение периода времени, достаточного для селективного снижения содержания стеринов в продукте в виде жира/масла путем распределения стерина в часть фосфолипидных агрегатов. Жир или масло со сниженным содержанием стеринов отделяют от водной смеси для разделения. Альтернативно соответственно обогащенную стерином фракцию также можно выделять из водной смеси для разделения. Эти стадии можно проводить при температуре окружающей среды: минимизируются затраты на нагревание, а также возможность термической

- 90 022979 деградации продукта. Кроме того, требуется минимальное количество оборудования, и, поскольку все требуемые материалы представляют собой материалы пищевой категории, способы не требуют специальных мер предосторожности, связанных с хранением, удалением отходов, или загрязнением конечного продукта(ов).

Фосфолипазы и способы по изобретению можно использовать для удаления стеринов из жиров и масел, как описано, например, в патенте США № 5880300. Фосфолипидные агрегаты контактируют, например, с содержащим стерин жиром или маслом в водной среде, а затем перемешивают. После надлежащего перемешивания жир или масло со сниженным содержанием стеринов отделяют от водной смеси для разделения. Альтернативно соответственно обогащенный стерином фосфолипид также можно выделять из водной смеси для разделения. Растительные (например, плодовые) масла содержат растительные стерины (фитостерины), которые также можно удалять с использованием способов по настоящему изобретению. Этот способ применим для продукта в виде жира/масла на любой стадии цикла коммерческой переработки. Например, способ по изобретению можно применять для рафинированных, отбеленных и дезодорированных масел (масел КВЭ) или на любой стадии переработки перед достижением статуса КВЭ. Хотя масло КВЭ может обладать измененной плотностью по сравнению с маслом в состоянии до КВЭ, способы по изобретению легко адаптировать как для масел КВЭ, так и для масел в состоянии до КВЭ, или для различных других продуктов в виде жира/масла, варьируя содержание фосфолипидов, состав фосфолипидов, соотношения фосфолипид:вода, температуру, давление, условия перемешивания и условия разделения, как описано ниже.

Альтернативно ферменты и способы по изобретению можно использовать для выделения фитостеринов или других стеринов на промежуточных стадиях переработки масла. Например, известно, что фитостерины утрачиваются в процессе дезодорирования растительных масел. Содержащую стерин фракцию дистиллята, например, из промежуточной стадии переработки можно подвергать способам экстракции стерина, описанным выше. Это обеспечивает обогащенный стерином лецитин или другой фосфолипидный материал, который можно далее перерабатывать для выделения экстрагированных стеринов.

Детергентные композиции

Изобретение относится к детергентным композициям, содержащим одну или несколько фосфолипаз по изобретению, и к способам получения и применения этих композиций. Изобретение охватывает се способы получения и применения детергентных композиций, см., например, патент США № 6413928; 6399561; 6365561; 6380147. Детергентные композиции могут представлять собой водную композицию из одной и двух частей, неводную жидкую композицию, отлитое твердое тело, гранулярную форму, форму частиц, прессованную таблетку, гель и/или пасту и форму взвеси. Изобретение также относится к способам, способным быстро удалять крупные пищевые загрязнения, пленки остатков пищи и другие незначительные пищевые композиции с использованием этих детергентных композиций. Фосфолипазы по изобретению могут способствовать удалению пятен с помощью каталитического гидролиза фосфолипидов. Фосфолипазы по изобретению можно использовать в детергентах для мытья посуды и в детергентах для стирки тканей.

Истинное содержание активного фермента зависит от способа изготовления детергентной композиции и не является критически важным при условии, что детергентный раствор обладает желаемой ферментативной активностью. В одном аспекте количество фосфолипазы, присутствующее в конечном растворе, находится в диапазоне приблизительно от 0,001 до 0,5 мг на 1 г детергентной композиции.

Конкретный фермент, выбираемый для применения в способе и продуктах по этому изобретению, зависит от условий конечного применения, включая физическую форму продукта, применение рН, применение температуры и типы почвы, подлежащие деградации или изменению. Фермент можно выбирать для обеспечения оптимальной активности и стабильности для любого данного набора условий применения. В одном аспекте полипептиды по настоящему изобретению являются активными в диапазонах рН от приблизительно 4 до приблизительно 12 и в диапазоне температур от приблизительно 20 до приблизительно 95°С. Детергенты по изобретению могут содержать катионные, полуполярные неионные или цвиттерионные поверхностно-активные вещества или их смеси.

Фосфолипазы по настоящему изобретению можно включать в состав порошковых и жидких детергентов, имеющих рН от 4,0 до 12,0, на уровнях от приблизительно 0,01 до приблизительно 5% (предпочтительно от 0,1 до 0,5%) по массе. Эти детергентные композиции также могут включать другие ферменты, такие как известные протеазы, целлюлазы, липазы или эндогликозидазы, а также моющие компоненты и стабилизаторы. Добавление фосфолипаз по изобретению в общепринятые моющие композиции не приводит к какому-либо специальному ограничению применения. Иными словами, любая температура и рН, пригодные для детергента, также пригодны для настоящих композиций, при условии, что рН находится в указанном выше диапазоне и температура является меньшей, чем описанная температура денатурации фермента. Кроме того, полипептиды по изобретению можно использовать в моющей композиции без детергентов, вновь либо отдельно, либо в комбинации с моющими компонентами и стабилизаторами.

Настоящее изобретение относится моющим и дезинфицирующим композициям, включая детергентные и/или дезинфицирующие композиции для очистки и/или дезинфекции твердых поверхностей, детергентные композиции для очистки и/или дезинфекции тканей, композиции для мытья посуды, очи- 91 022979 щающие композиции для полости рта, очищающие композиции для зубов и/или растворы для очистки контактных линз.

В одном аспекте изобретение относится к способу мытья объекта, включающему контактирование объекта с фосфолипазой по изобретению в условиях, достаточных для мытья. Фосфолипаза по изобретению может быть включена в качестве детергентной добавки. Детергентная композиция по изобретению, например, может быть изготовлена в качестве детергентной композиции для ручной или машинной стирки, содержащей фосфолипазу по изобретению. Добавка для стирки, пригодная для предварительной обработки окрашенных тканей, может содержать фосфолипазу по изобретению. Композиция смягчителя для тканей может содержать фосфолипазу по изобретению. Альтернативно фосфолипазу по изобретению можно изготавливать в качестве детергентной композиции для применения в основных действиях по очистке бытовых поверхностей. В альтернативных аспектах детергентные добавки и детергентные композиции по изобретению могут содержать один или несколько других ферментов, таких как протеаза, липаза, кутиназа, другая фосфолипаза, карбогидраза, целлюлаза, пектиназа, маннаназа, арабиназа, галактаназа, ксиланаза, оксидаза, например, лактаза и/или пероксидаза. Свойства фермента(ов) по изобретению выбирают так, чтобы они были совместимыми с выбранным детергентом (т.е. оптимальное значение рН, совместимость с другими ферментативными и неферментативными ингредиентами и т.д.) и фермент(ы) присутствовал в эффективных количествах. В одном аспекте ферменты фосфолипазы по изобретению используют для удаления из тканей материалов с неприятным запахом. Различные детергентные композиции и способы их получения, которые можно использовать для применения изобретения на практике, описаны, например, в патентах США №№ 6333301; 6329333; 6326341; 6297038; 6309871; 6204232; 6197070; 5856164.

Обработка отходов

Фосфолипазы по изобретению можно использовать для обработки отходов. В одном аспекте изобретение относится к способу расщепления твердых отходов с использованием фосфолипаз по изобретению. Способы могут включать уменьшение массы и объема, по существу, необработанных твердых отходов. Твердые отходы можно обрабатывать способом ферментативного расщепления в присутствии ферментативного раствора (включая фосфолипазы по изобретению) при контролируемой температуре. Твердые отходы можно конвертировать в разжиженные отходы и любые остаточные твердые отходы. Полученные разжиженные отходы можно отделять от каких-либо остаточных твердых отходов. См., например, патент США № 5709796.

Детоксикация

Фосфолипазы (например, ΡΙ-РЬС по изобретению) можно использовать в способах детоксикации, например, для детоксикации эндотоксинов, например композиций, содержащих липополисахариды (ЬРЗ), и изобретение относится к способам детоксикации с использованием по меньшей мере одного фермента по изобретению, например полипептида, содержащего последовательность, указанную в ЗЕЦ ГО ΝΟ: 6 и имеющую одну или несколько мутаций, как указано в табл. 12-15, или его ферментативно активного фрагмента.

В одном аспекте фосфолипазу по изобретению используют для детоксикации липополисахарида (ЬРЗ). В одном аспекте эту детоксикацию проводят путем деацилирования 2'- и/или 3'-цепей жирных кислот из липида А. В одном аспекте фосфолипазу (например, ΡΙ-РЬС) по изобретению используют для гидролиза 2'-лауроиловой и/или 3'-миристоиловой цепи из липида, например липида А (например, из бактериального эндотоксина). В одном аспекте способ по изобретению используют для разрушения эндотоксина, например токсина из грамотрицательных бактерий, например из Е. соП.

В одном аспекте фосфолипазу (например, ΡΙ-РЬС) по изобретению используют для смягчения эффектов отравления токсинами (например, при текущей инфекции грамотрицательными бактериями) или для профилактического предупреждения эффектов эндотоксинов в ходе инфекции (например, инфекции у животного или человека). Таким образом, изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей фосфолипазу (например, ΡΙ-РЬС) по изобретению, и к способу применения гидролазы по изобретению для смягчения или предупреждения токсических эффектов липополисахарида (ЬРЗ), например, в ходе сепсиса.

Переработка продуктов питания

Фосфолипазы по изобретению можно использовать для переработки продуктов питания, например, для изменения их стабильности, времени полужизни, вкуса, консистенции, улучшения из статуса питательности и т.п. Например, в одном аспекте фосфолипазы по изобретению используют для получения кислых фосфолипидов для регулирования горького вкуса в продуктах питания.

В одном аспекте изобретение относится к способам сыроварения с использованием фосфолипаз по изобретению (и, таким образом, изобретение также относится к сырам, содержащим фосфолипазы по изобретению). В одном аспекте ферменты по изобретению (например, фосфолипаза А, лизофосфолипаза или их комбинацию) используют для обработки сыров для усиления вкуса, для увеличения выхода и/или для стабилизации сыров, например, путем снижения тенденции к обезжириванию или в одном аспекте ферменты по изобретению используют для получения сыра из молока для сыроварения. Эти способы по изобретению могут включать любой способ или протокол, например, как описано, например, в патен- 92 022979 тах США №№ 6551635 и 6399121, \У0 03/070013, \У0 00/054601. Например, в одном аспекте фосфолипазы по изобретению используют для стабилизации жировой эмульсии в молоке или содержащих молоко композициях, например сливках, и используют для стабилизации композиций молока, например для изготовления сливок или сливочных напитков. В одном аспекте изобретение относится к способам усиления вкуса сыра с использованием по меньшей мере одного фермента по изобретению, причем способ включает инкубацию белка, жира и протеазы и липазы в водной среде в условиях, которые обеспечивают усиление вкуса сыра (например, уменьшенную горечь) например, как описано в \У0 99/66805. В одном аспекте фосфолипазы по изобретению используют для усиления вкуса сыра (например, сычужной закваски) путем смешения с водой, протеазой и липазой (по изобретению) при повышенной температуре, например приблизительно от 75 до 95°С, как описано, например, в патенте США № 4752483. В одном аспекте фосфолипазы по изобретению используют для ускорения вызревания сыра путем добавления фермента по изобретению (например, липазы или фосфолипазы) к сыру (например, молоку для сыроварения) перед добавлением к молоку коагулянта или путем добавления фермента по изобретению к сычужной закваске с солью до прессования, например, как описано в патенте США № 4707364. В одном аспекте липазу по изобретению используют для деградации триглицеридов в жире молока для высвобождения свободных жирных кислот, обеспечивая усиление вкуса. Также в любом из этих способов по изобретению можно использовать протеазу, см., например, ВтшД181 (2001) 1. оГ РооД 8сг 66: 1100-1107. В другом аспекте в этих способах или в любом из способов по изобретению можно использовать комбинацию эстераз, липаз, фосфолипаз и/или протеаз.

В одном аспекте фосфолипазу по изобретению используют для снижения содержания фосфорсодержащих компонентов в продукте питания, например в масле, таком как растительное масло, имеющее высокое содержание негидратируемых фосфорсодержащих компонентов, например, как описано в \У0 98/26057.

Конверсия биомассы и получение чистых биотоплив

Изобретение относится к полипептидам, включая ферменты (фосфолипазы (РЬ), например РЬА, РЬС или РЬБ по изобретению) и антитела по изобретению, и к способам конверсии биомассы или любого лигноцеллюлозного материала (например, любой композиции, содержащей целлюлозу, гемицеллюлозу и лигнин), в топливо (например, биоэтанол, биопропанол, биобутанол, биопропанол, биометанол, биодизель), в дополнение кормам, к продуктам питания и химическим реагентам. Например, в альтернативном варианте осуществления фермент(ы) по изобретению, используемые для конверсии биомассы и для продукции биотоплив, могут обладать активностью одной или нескольких фосфолипаз, включая активность фосфолипазы С (РЬС); активность Р1-РЬС, активность фосфолипазы А (РЬА), такую как активность фосфолипазы А1 или фосфолипазы А2; активность фосфолипазы Ό (РЬБ), такую как активность фосфолипазы Ό1 или фосфолипазы Ό2; активность фосфолипазы В (РЬВ), например, активность фосфолипазы и лизофосфолипазы (ЬРЬ) или активность фосфолипазы и лизофосфолипазы-трансацилазы (ЬРТ А) или активность фосфолипазы и лизофосфолипазы (ЬРЬ) и активность лизофосфолипазытрансацилазы (ЬРТА); или активность пататина или их комбинацию.

Таким образом, композиции и способы по изобретению обеспечивают эффективные и надежные альтернативы или дополнения применению продуктов на основе нефти, например, в качестве смеси биотоплив, таких как биометанол, биоэтанол, биопропанол, биобутанол и т.п., с дизельным топливом, бензином, керосином и т.п. Изобретение относится к организмам, экспрессирующим ферменты по изобретению, для участия в химических циклах, вовлекающих конверсию природной биомассы. В одном аспекте ферменты и способы конверсии биомассы используют в наборе ферментов для переработки фосфолипидов. Изобретение относится к способам выявления и внедрения наиболее эффективных ферментов для обеспечения этих важных новых процессов конверсии биомассы и альтернативных процессов энергетической промышленности.

Композиции и способы по изобретению можно использовать для предоставления эффективных и надежных альтернатив или дополнений применению продуктов на основе нефти, например, в качестве смеси биоэтанола, биопропанола, биобутанола, биопропанола, биометанола и/или биодизеля и бензина. Изобретение относится к организмам экспрессирующим ферменты по изобретению для участия в химических циклах, вовлекающих конверсию природной биомассы. Изобретение относится к способам выявления и внедрения наиболее эффективных ферментов для обеспечения этих важных новых процессов конверсии биомассы и альтернативных процессов энергетической промышленности.

Изобретение относится к способам, ферментам и смесям ферментов или коктейлям по изобретению, для перереботки материала, например, материала биомассы, содержащего целлоолигосахарид, олигомер арабиноксилана, лигнин, лигноцеллюлозу, ксилан, глюкан, целлюлозу и/или ферментируемый сахар, включающим контактирование композиции с полипептидом по изобретению, или полипептидом, кодируемым нуклеиновой кислотой по изобретению, где необязательно материал происходит из сельскохозяйственной культуры (например, пшеницы, ячменя, картофеля, проса, древесины топлива), представляет собой побочный продукт производства продуктов питания или кормов, представляет собой лигноцеллюлозные отходы производства или представляет собой растительные остатки или бумажные отходы или отходы производства бумаги, и необязательно растительные остатки включают стебли, листья,

- 93 022979 скорлупу, шелуху, кукурузу или сердцевины кукурузных початков, кукурузную солому, кукурузное волокно, сено, солому (например, рисовую солому или пшеничную солому), жмых сахарного тростника, свекловичную пульпу, цитрусовую пульпу и кожуру цитрусовых, древесину, древесные щепки, древесную стружку, древесную пульпу, отходы в виде пульпы, древесные отходы, древесные опилки и муку, отходы строительства и/или демонтажа и лом (например, древесина, древесная стружка и мука), и необязательно бумажные отходы включают выброшенную или использованную бумагу для фотокопирования, компьютерную бумагу для принтера, бумагу тетрадей, бумагу записных книжек, машинописную бумагу, газеты, журналы, картон и бумажные упаковочные материалы, и переработанную бумагу из макулатуры. Кроме того, можно использовать городские отходы, например, бумажную фракцию городских твердых отходов, городских древесных отходов и городских отходы озеленения, совместно с другими материалами, содержащими сахар, крахмал и/или целлюлозу. В альтернативных аспектах переработка материала, например материала биомассы, приводит к образованию биоспирта, например биоэтанола, биометанола, биобутанола или биопропанола.

Альтернативно полипептид по изобретению может сам экспрессироваться в материале растительной биомассы или сырье.

Способы по изобретению также включают получение переработанной или конвертированной (например, способом, включающим применение фермента по изобретению) биомассы или растительного материала, например, содержащего липиды или лигноцеллюлозного материала (обработанного, например, ферментами по изобретению) и преобразования его в топливо (например, биоспирт, например биоэтанол, биометанол, биобутанол или биопропанол или биодизель) путем ферментации (например, дрожжами) и/или химического синтеза. В одном аспекте продуцированные сахара ферментируют и/или неферментированные продукты газифицируют.

Способы по изобретению также включают конверсию водорослей, растительного масла, такого как растительные масла холодного прессования или отработанные растительные масла, животные жиры и сала (например, топленое сало, жир или желтый жир), или сточные воды, с использованием ферментов по изобретению, и преобразования их в топливо (например, биоспирт, например биоэтанол, биометанол, биобутанол или биопропанол или биодизель) ферментацией и/или химическим синтезом или конверсией.

Ферменты по изобретению (включая, например, организмы, такие как микроорганизмы, например грибы, дрожжи или бактерии, образующие и в некоторых аспектах секретирующие рекомбинантные ферменты по изобретению) можно использовать в или включать/внедрять на любой стадии процесса конверсии биомассы, например на любой одной стадии, нескольких стадиях, или включать на всех стадиях, или во все из следующих способов процесса конверсии биомассы, или во все из этих альтернатив биотоплива.

Прямое сжигание: сжигание материала путем прямого нагревания, является наиболее простой технологией переработки биомассы; может быть очень экономичным, если источник биомассы находится близко.

Пиролиз: представляет собой термическую деградацию биомассы нагреванием в отсутствие кислорода. В одном аспекте биомассу нагревают до температуры приблизительно от 800 до 1400° Р (от 427 до 760°С), но не подают кислород для поддержания горения, приводящего к образованию газа, жидкого топлива и угля.

Газификация: биомассу можно использовать для выработки метана путем нагревания или анаэробного расщепления. Из биомассы можно получать сингаз, смесь монооксида углерода и водорода.

Газ из органических отходов: получают разложением (анаэробным расщеплением) находящегося под землей мусора на свалках. Когда органические отходы разлагаются, они образуют газ, состоящий из приблизительно 50% метана, основного компонента природного газа.

Анаэробное расщепление: конвертирует органическое вещество в смеси метана, основного компонента природного газа и диоксида углерода. В одном аспекте биомассу, такую как смывные воды (сточные воды), компост или отходы пищевой промышленности, смешивают с водой и подают в емкость биореактора для ферментативного гидролиза без воздуха.

Ферментация.

Спиртовая ферментация: топливный спирт получают конверсией целлюлозной массы и/или крахмала в сахар, ферментацией сахара в спирт, затем разделением смеси спирта и воды дистилляцией. Сырье, такое как специально предназначенные для этого культуры (например, пшеницу, ячмень, картофель, просо, древесину тополя), сельскохозяйственные остатки и отходы (например, рисовую шелуху, кукурузную солому, пшеничную солому, жмых сахарного тростника, рисовую шелуху, кукурузное волокно, свекловичную пульпу, цитрусовую пульпу и кожуру цитрусовых), отходы лесничества (например, щепки твердой древесины и мягкой древесины, остатки пиломатериалов из твердой и мягкой древесины, деревянную стружку и древесную муку), городские отходы (например, бумажную фракцию городских твердых отходов, городские древесные отходы, городские отходы озеленения), древесные отходы (например, отходы лесопилки, отходы целлюлозного производства, строительные отходы, отходы демонтажа, древесную стружку и древесную пыль) и бумажные отходы или другие материалы, содержащие сахар,

- 94 022979 крахмал и/или целлюлозу, можно конвертировать в сахара, а затем в спирт, ферментацией дрожжами. Альтернативно материалы, содержащие сахара, можно конвертировать непосредственно в спирт ферментацией.

Переэтерификация: иллюстративную реакцию конверсии масла в биодизель называют переэтерификацией. Процесс переэтерификации осуществляет реакцию спирта (такого как метанол) с триглицеридными маслами, содержащимися в растительных маслах, животных жирах или рециклированных жирах, с образованием алкиловых эфиров жирных кислот (биодизеля) и глицерина. Реакция требует нагревания и катализатора в виде сильного основания, такого как гидроксид натрия или гидроксид калия.

Биодизель: биодизель представляет собой смесь аклиловых сложных эфиров жирных кислот, полученную из растительных масел, животных жиров или рециклированных жиров. Биодизель можно использовать в качестве топлива для транспортных средств в его чистой форме, но обычно его используют в качестве добавки к нефтяному дизелю для снижения уровней вещества в форме частиц, монооксида углерода, углеводородов и токсических веществ в воздухе вследствие дизельных автомобилей.

Гидролиз: включает гидролиз соединения, например биомассы, такой как лигноцеллюлозный материал, катализируемый с использованием фермента по настоящему изобретению.

Когенерация: представляет собой одновременное получение более чем одной формы энергии с использованием одного топлива и установки. В одном аспекте когенерация биомассы имеет большее потенциальное развитие, чем образование биомассы отдельно, поскольку когенерация обеспечивает образование как тепла, так и электричества.

В одном аспекте полипептиды по изобретению обладают активностью гидролазы, например фосфолипазы, пататина, и/или другой сходной ферментативной активностью для получения топлива (например, биоспирта, например биоэтанола, биометанола, биобутанола, биопропанола или биодизеля) из органического материала, например биомассы, такой как композиции, происходящие из растений и животных, включая любую сельскохозяйственную культуру или другое обновляемое сырье, сельскохозяйственный остаток или отходы животноводства, органические компоненты городских и промышленных отходов, или отходы или лом строительства или демонтажа, или микроорганизмы, такие как водоросли или дрожжи.

В одном аспекте полипептиды по изобретению используют в способах конверсии любой биомассы, например биомассы животных, водорослей и/или растений, включая содержащую липиды или лигноцеллюлозную биомассу, в топливо (например, биоспирт, например биоэтанол, биометанол, биобутанол или биопропанол или биодизель), или в ином случае используют в способах гидролиза или расщепления биоматериалов так, чтобы их можно было использовать в качестве топлива (например, биоспирт, например биоэтанол, биометанол, биобутанол, или биопропанол, или биодизель), или чтобы упростить переработку биомассы в топливо.

Ферменты по изобретению, включающие смесь ферментов или коктейли по изобретению, также можно использовать в очистке глицерина. Побочный продукт в виде глицерина содержит непрореагировавший катализатор и мыла, которые нейтрализуют кислотой. Воду и спирт удаляют с получением 5080% неочищенного глицерина. Остальные примеси включают не вступившие в реакцию жиры и масла, которые можно обрабатывать с использованием полипептидов по изобретению. На больших биодизельных установках по изобретению глицерин можно далее очищать, например, до 99% или более высокой чистоты для фармацевтической и косметической промышленности.

Топлива (включая биоспирты, такие как биоэтанолы, биометанолы, биобутанолы, или биопропанолы, или биодизели), полученные с использованием полипептидов по изобретению, включая смесь ферментов или коктейли по изобретению, можно использовать с топливными оксигенатами для улучшения характеристик горения. Добавление кислорода приводит к более полному сгоранию, что снижает выделение монооксида углерода. Это является другим экологическим преимуществом замены нефтяных топлив биотопливами (например, топливом по изобретению). Биотопливо, полученное с использованием композиций и/или способов по этому изобретению, можно смешивать с бензином с получением смеси Е10 (приблизительно 5-10% этанол и приблизительно 90-95% бензин), однако его можно использовать в более высоких концентрациях, таких как Е85, или в чистой форме. Биотопливо, полученное с использованием композиций и/или способов по изобретению, можно смешивать с нефтяным дизелем с получением смеси В20 (20% биодизель и 80% нефтяной дизель), хотя можно использовать и другие уровни смешения вплоть до В100 (чистый биодизель).

Изобретение также относится к способам получения биотоплив (включая биоспирты, такие как биоэтанолы, биометанолы, биобутанолы, или биопропанолы, или биодизели) из композиций, содержащих любую биомассу, например биомассу животных, водорослей и/или растений, включая содержащую липиды или лигноцеллюлозную биомассу. Материал биомассы можно получать из сельскохозяйственных культур в качестве побочного продукта производства продуктов питания или кормов, или в качестве лигноцеллюлозных отходов производства, таких как растительные остатки, бумажные отходы или отходы или лом строительства и/или демонтажа. Примеры пригодных растительных источников или растительных остатков для обработки полипептидами по изобретению включают бурые водоросли, морские водоросли, зерна, семена, стебли, листья, скорлупу, шелуху, стержни кукурузных початков, кукурузную

- 95 022979 солому, сено, травы (например, аира голубая, такая как Зогдйакйит пи!апк; или просто, например, виды Ратсит, такие как Ратсит уидаШт) и т.п., а также древесину, древесную стружку, древесную пульпу и древесную муку. Примеры бумажных отходов, пригодных для обработки полипептидами по изобретению, включают выброшенную бумагу для фотокопирования, компьютерную бумагу для принтера, бумагу тетрадей, бумагу записных книжек, машинописную бумагу и т.п., а также газеты, журналы, картон и бумажные упаковочные материалы. Примеры отходов и лома строительства и демонтажа включают древесину, древесные опилки, древесную стружку и древесную муку.

В одном варианте осуществления ферменты, включающие смесь ферментов или коктейли по изобретению, и способы по изобретению можно использовать совместно с более традиционными способами получения этанола, метанола, пропанола, бутанола, пропанола и/или дизеля из биомассы, например, такими как способы, включающие гидролиз липидов и/или лигноцеллюлозных материалов, подвергая любую высушенную биомассу, например биомассу животных, водорослей и/или растений, включая содержащий липиды или лигноцеллюлозный материал биомассы в реакторе воздействию катализатора, состоящего из разбавленного раствора сильной кислоты и соли металла; это может снижать энергию активации или температуру гидролиза целлюлозы с получением более высоких выходов сахаров; см., например, патенты США №№ 6660506 и 6423145.

Другой иллюстративный способ, который охватывает применение ферментов по изобретению, включая смесь ферментов или коктейли по изобретению, включает гидролиз любой биомассы, например биомассы животных, водорослей и/или растений, включая содержащую липиды или лигноцеллюлозную биомассу, содержащую гемицеллюлозу, целлюлозу и лигнин, или любой другой полисахарид, который можно гидролизовать ферментом по этому изобретению, подвергая материал стадии гидролиза первой ступени в водной среде при температуре и давлении, выбранных для обеспечения, в основном, деполимеризации гемицеллюлозы без существенной деполимеризации целлюлозы до глюкозы. Эта стадия приводит к взвеси, в которой жидкая водная фаза содержит растворенные моносахариды, образовавшиеся при деполимеризации гемицеллюлозы и твердую фазу, содержащую целлюлозу и лигнин. Стадия гидролиза второй ступени может включать условия так, чтобы, по меньшей мере, основная часть целлюлоза деполимеризовалась, причем такая стадия приводит к жидкой водной фазе, содержащей растворенные/растворимые продукты деполимеризации целлюлозы. См., например, патент США № 5536325. Ферменты по изобретению (включая смеси ферментов по изобретению или коктейли) можно добавлять на любой ступени этого иллюстративного способа.

Другой иллюстративный способ, охватывающий применение ферментов по изобретению, включая смесь ферментов или коктейли по изобретению, включает обработку любой биомассы, например биомассы животных, водорослей и/или растений, включающей содержащий липиды или лигноцеллюлозный материал биомассы, с помощью одной или нескольких стадий гидролиза сильной кислотой, разбавленной до приблизительно от 0,4 до 2%; и обработку непрореагировавшего лигноцеллюлозного компонента гидролизованного кислотой материала биомассы щелочной делигнификацией с образованием предшественников биодеградируемых термопластмасс и производных. См., например, патент США № 6409841. Ферменты по изобретению можно добавлять на любой стадии этого иллюстративного способа.

Другой иллюстративный способ, охватывающий применение ферментов по изобретению, включая смесь ферментов или коктейли по изобретению, включает предварительный гидролиз любой биомассы, например биомассы животных, водорослей и/или растений, содержащей липиды или лигноцеллюлозный материал биомассы, в реакторе для предгидролиза; добавление кислотной жидкости к твердому материалу (например, лигноцеллюлозному материалу) с получением смеси; нагревание смеси до температуры реакции; поддержание температуры реакции в течение периода времени, достаточного для фракционирования лигноцеллюлозного материала на солюбилизированную часть, содержащую по меньшей мере приблизительно 20% лигнина из лигноцеллюлозного материала, и твердую фракцию, содержащую целлюлозу; удаление солюбилизированной части из твердой фракции при температуре реакции или приблизительно при температуре реакции, где целлюлоза в твердой фракции становится более подверженной ферментативному расщеплению; и выделение солюбилизированной части. См., например, патент США № 5705369. Ферменты по изобретению можно добавлять на любой стадии этого иллюстративного способа.

Изобретение относится к способам получения композиций моторного топлива (например, для двигателей с искровым зажиганием) на основе жидких углеводородов, смешанных со спиртом топливной категории, полученным с использованием фермента или способа по изобретению. В одном аспекте топлива, произведенные с использованием фермента по изобретению, включают, например, смеси жидкий угольный газ или жидкие природные газы-этанол. В одном аспекте сорастворителем является происходящий из биомассы 2-метилтетрагидрофуран (МТНР). См., например, патент США № 6712866.

В одном аспекте способы по изобретению для ферментативной деградации любой биомассы, например биомассы животных, водорослей и/или растений, включая содержащую липиды или лигноцеллюлозную биомассу, например, для производства биотоплив (включая биоспирты, такие как биоэтанолы, биометанолы, биобутанолы, или биопропанолы, или биодизели) из любого органического материала, также могут включать применение ультразвуковой обработки материала биомассы; см., например, па- 96 022979 тент США № 6333181.

В другом аспекте способы по изобретению производства биотоплив (включая биоспирты, такие как биоэтанолы, биометанолы, биобутанолы, или биопропанолы, или биодизели) из целлюлозного субстрата включают предоставление реакционной смеси в форме взвеси, содержащей целлюлозный субстрат, фермент по этому изобретению и агент для ферментации (например, в реакционной емкости, такой как биореактор с полунепрерывной подпиткой твердыми веществами), и реакционную смесь подвергают реакции в условиях, достаточных для начала и поддержания реакции ферментации (как описано, например, в патентной заявке США № 20060014260). В одном аспекте с помощью экспериментальных или теоретических вычислений можно определить оптимальную частоту подпитки. В одном аспекте дополнительные количества целлюлозного субстрата и фермента предоставляют в реакционную емкость с интервалом(ами) согласно оптимизированной частоте подпитки.

Один иллюстративный способ получения биотоплив (включая биоспирты, такие как биоэтанолы, биометанолы, биобутанолы, или биопропанолы, или биодизели) по изобретению описан в публикациях патентных заявок США № 20050069998; 20020164730; и в одном аспекте он включает стадии измельчения любой биомассы, например биомассы животных, водорослей и/или растений, включая содержащую липиды или лигноцеллюлозную биомассу (например, до размера 15-30 мм), воздействие на полученный продукт предварительной обработки путем парового взрыва (например, при температуре 190-230°С) в течение от 1 до 10 мин в реакторе; сбор предварительно обработанного материала в циклон или сходное устройство; и разделение жидкой и твердой фракций фильтрацией в фильтрационном прессе, подачу твердой фракции в емкость для ферментации и добавление одного или нескольких ферментов по изобретению, например фермента целлюлазы и/или β-глюкозидазы (например, растворенного в цитратном буфере при рН 4,8).

Другой иллюстративный способ получения биотоплив (включая биоспирты, такие как биоэтанолы, биометанолы, биобутанолы, или биопропанолы, или биодизели) по изобретению, содержащих биоэтанолы, биометанолы, биобутанолы или биопропанолы, с использованием ферментов по изобретению, включает предварительную обработку исходного материала, содержащего любую биомассу, например биомассу животных, водорослей и/или растений, включая сырье содержащей липиды или лигноцеллюлозной биомассы, содержащее по меньшей мере гемицеллюлозу и целлюлозу. В одном аспекте исходный материал включает картофель, сою (рапс), ячмень, рис, кукурузу, рожь, пшеницу, свеклу, или сахарный тростник, или компонент, или отходы, или побочный продукт производства пищевых продуктов и кормов. Исходный материал (сырье) подвергают реакции в условиях, которые разрушают структуру растительных волокон для обеспечения, по меньшей мере, частичного гидролиза гемицеллюлозы и целлюлозы. Разрушающие условия могут включать, например, воздействие на исходный материал средней температуры от 180 до 270°С при рН от 0,5 до 2,5 в течение периода приблизительно от 5 с до 60 мин; или температуры от 220 до 270°С при рН от 0,5 до 2,5 в течение периода от 5 до 120 с, или эквивалентных условий. Это приводит к сырью с увеличенной доступностью для расщепления ферментом, например ферментом целлюлазой по изобретению. Патент США № 6090595.

Иллюстративные условия для применения ферментов по изобретению в гидролизе любой биомассы, например биомассы животных, водорослей и/или растений, включая содержащую липиды или лигноцеллюлозную биомассу, включают реакции при температурах приблизительно от 30 до 48°С и/или рН приблизительно от 4,0 до 6,0. Другие иллюстративные условия включают температуру приблизительно от 30 до 60°С и рН приблизительно от 4,0 до 8,0.

Глюканазы (или целлюлазы), маннаназы, ксиланазы, амилазы, ксантаназы и/или гликозидазы, например целлобиогидролазы, маннаназы и/или β-глюкозидазы по изобретению можно применять для конверсии биомассы в топлива, и в производстве этанола, например, как описано в заявках РСТ № \УО 0043496 и \УО 8100857. Глюканазы (или целлюлазы), маннаназы, ксиланазы, амилазы, ксантаназы и/или гликозидазы, например целлобиогидролазы, маннаназы и/или β-глюкозидазы по изобретению можно использовать для производства ферментируемых сахаров и глюкансодержащей биомассы, которую можно превращать в топливный этанол.

Биодизели - применение ферментов по изобретению для их получения

Изобретение относится к композициям, включающим ферменты по изобретению, и способам получения биодизельных топлив, включая любое биотопливо, например биодизель, содержащих алкиловые сложные эфиры, полученные переэтерификацией растительных масел и/или животных жиров.

Например, в альтернативных аспектах полипептиды по изобретению, включая смесь ферментов или коктейли по изобретению, используют в способах переэтерификации путем реакции спирта (такого как этанол, пропанол, бутанол, пропанол, метанол) с триглицеридным маслом, содержащимся в растительном масле, животном жире или рециклированных жирах, с образованием алкиловых сложных эфиров жирных кислот - включая биодизель - и глицерина. В одном аспекте биодизель получают из соевого масла или использованных кулинарных жиров. Животные жиры, другие растительные масла и другие использованные масла также можно использовать (и перерабатывать с помощью ферментов, например фосфолипаз, по изобретению) для получения биодизеля в зависимости от их стоимости и доступности. В

- 97 022979 другом аспекте для получения биодизельного топлива с использованием ферментов по изобретению используют смеси всех типов жиров и масел.

Изобретение относится к композициям, включая ферменты по изобретению, и к способам переработки желтого жира - термин, первоначально присвоенный в утилизационной промышленности. Желтый жир, который можно перерабатывать с использованием композиций и способов по изобретению, включает жир из масел для жарения, например, из фритюрниц или жироуловителей из ресторанов, или из различных (например, низкокачественных) категорий сала из утилизационных предприятий. Таким образом, изобретение также относится к маслам, жирам, маслам для жарения, растительным маслам, отработанным жирам из ресторанов и жирам технологической категории, содержащим по меньшей мере один фермент по этому изобретению.

Желтый жир, переработанный с использованием композиций по изобретению, включая ферменты, и способы по изобретению, можно использовать для напыления на дороги, например, для борьбы с запылением, или для добавок в корма для животных или кормов или пищевых добавок.

В другом аспекте композиции по изобретению, включающие ферменты, и способы по изобретению, можно использовать для переработки липидов, например жиров, таких как отработанные жиры ресторанов, для получения биотоплива, например биодизельного топлива, например, для автомобилей, автобусов, грузовых автомобилей или лодок. В одном аспекте биодизель, изготовленный с использованием композиции или способа по изобретению, можно получать из любого обновляемого растительного источника, например соевых бобов, и/или из жира, такого как желтый жир.

Композиции по изобретению, включающие ферменты, и способы по изобретению можно использовать для переработки 8УО или растительного масла прямой перегонки, включая любое растительное масло, которое может заправлять дизельный двигатель, например, где переработка включает переэтерификацию липидов в топливе, например, для применения при более низких температурах.

Композиции по изобретению, включая ферменты, и способы по изобретению можно использовать для переработки \УУО или отработанного растительного масла для получения, например, желтого жира, включая жир из ресторанов; в одном аспекте жир необходимо фильтровать для удаления частиц пищи. Желтый жир, переработанный с помощью композиций по изобретению, включая ферменты, и способов по изобретению, может относиться к категории БУОЛУУО, включающей любой жир, например отработанный жир ресторанов, который может содержать топленое говяжье сало и другие животные продукты.

Переработка сухого экстракта барды

В другом аспекте ферменты (например, фосфолипазы) по изобретению можно использовать для обработки/переработки сухого экстракта барды (ΌΌδ), сухой барды (ΌΌδ), конденсированного экстракта барды (ί'.Όδ), влажного экстракта барды (Ό\νθ) и сухой гранулированной барды (ΌΌΟ8); сухая барда может представлять собой злаковый побочный продукт процесса перегонки и может включать растворимые вещества. Эти способы могут включать сухое измельчение растительных побочных продуктов, например, для применения в кормах, например, для птиц, крупного рогатого скота, свиней и других домашних животных. Таким образом, ферменты по изобретению можно использовать для обработки/переработки зерна, например злаков, которые являются побочным продуктами любого процесса перегонки, включая способы с использованием любого источника зерна, например традиционных источников из пивоварен, или альтернативно из предприятия по производству этанола (завод, мельница или сходные с ними). Ферменты по изобретению можно использовать для обработки/переработки высушенной пульпы из перегонных предприятий; затем эту пульпу можно использовать для различных целей, например, в качестве кормов для животных, особенно жвачных животных; таким образом, изобретение относится к способам переработки кормов для животных, таких как жвачные животные, и к переработанному ферментом корму, содержащему фитазы по этому изобретению.

Ферменты по изобретению можно использовать отдельно или с другими ферментами для переработки сухого экстракта барды (ΌΌδ), сухой барды (ΌΌδ), конденсированного экстракта барды (ί'.Όδ), влажного экстракта барды (Ό\νθ) и сухой гранулированной барды (ΌΌΟ8). Например, ферменты по изобретению можно использовать на любой стадии процесса производства спирта, проиллюстрированного на фиг. 12. Ферменты по изобретению можно использовать для увеличения биодоступности фосфора в любом биотопливе или потенциальном биотопливе, включая фосфор, находящийся в сухом экстракте барды (ΌΌδ), сухой барде (ΌΌ8), конденсированном экстракте барды (ί'.Όδ), влажном экстракте барды (Ό\νθ) и сухой гранулированной барде (ΌΌΟ8) (см., например, С. МагПпе/ Ате/сиа, 2004, РоиИгу §аепсе, 83:971-976).

Производство алкоголя или питьевого спирта

Ферменты по изобретению также можно применять в переработке сухой барды для производства спирта - спирта как в алкоголе, например для производства пива или виски (в дополнение к применению в переработке биомассы для получения биотоплив). Ферменты по изобретению этому изобретению могут быть использованы на предприятиях по производству этанола, например, для переработки зерен, таких как кукуруза. Сухую барду можно изготавливать, сначала перемалывая зерно (например, кукурузу) до крупной консистенции и добавляя его в горячую воду. После охлаждения добавляют дрожжи и смесь

- 98 022979 ферментируют в течение от нескольких суток до недели. Твердые вещества, остающиеся после ферментации, представляют собой сухую барду. Фитазы по изобретению можно использовать на любой стадии этого процесса.

Составы

Изобретение относится к новым составам, содержащим ферменты по изобретению, и к составам фосфолипаз по изобретению, включая составы, которые включают новые ферменты по изобретению. Ферменты по изобретению можно применять или включать в состав отдельно или в качестве смеси фосфолипаз по изобретению или других фосфолипаз или других ферментов, таких как ксиланазы, целлюлазы, протеазы, липазы, амилазы, или окислительно-восстановительные ферменты, такие как лакказы, пероксидазы, каталазы, оксидазы или редуктазы. Их можно использовать в виде состава в твердой форме, такого как порошок, лиофилизированный препарат, гранула, таблетка, брусок, кристалл, капсула, пилюля, драже, или в жидкой форме, как, например, форма водного раствора, аэрозоля, геля, пасты, взвеси, эмульсии вода/масло, крема, капсулы, или везикулярная или мицеллярная суспензия. Составы по изобретению могут содержать любой или комбинацию из следующих ингредиентов: полиолы, такие как полиэтиленгликоль, поливиниловый спирт, глицерин, сахар, такой как сахароза, сорбит, трегалоза, глюкоза, фруктоза, мальтоза, манноза, гелеобразующее средство, такое как гуаровая камедь, каррагенан, альгинат, декстраны, производное целлюлозы, пектин, соль, такая как хлорид натрия, сульфат натрия, сульфат аммония, хлорид кальция, хлорид магния, хлорид цинка, сульфат цинка, соль жирной кислоты и производного жирной кислоты, хелатор металлов, такой как ЕЭТА, ЕСТА, цитрат натрия, противомикробное средство, такое как жирная кислота или производное жирной кислоты, парабен, сорбат, бензоат, дополнительное модулирующее соединение для блокирования воздействия фермента, такого как протеаза, белки-наполнители, такие как В8А, гидролизат пшеницы, боратовое соединение, аминокислота или пептид, подходящее модулирующее рН или температуру соединение, эмульгатор, такой как неионный и/или ионный детергент, окислительно-восстановительный агент, такой как цистин/цистеин, глутатион, окисленный глутатион, восстановитель или антиоксидантное соединение, такое как аскорбиновая кислота, или диспергирующий агент.

Для увеличения стабильности фермента можно использовать сшивание и модификацию белка, такую как пегилирование, модификация жирной кислотой, гликозилирование.

Другие применения фосфолипаз по изобретению

Фосфолипазы по изобретению также можно использовать для исследования системы передачи сигнала фосфоинозитида (Р1); для диагностики, прогнозирования и разработки способов лечения биполярных нарушений (см., например, Рапбеу (2002) №игор8усЬорЬагшасо1оду 26:216-228); в качестве антиоксидантов; в качестве модифицированных фосфолипидов; в качестве пенообразующих и гелеобразующих средств; для получения ангиогенных липидов для васкуляризации тканей; для идентификации модуляторов фосфолипазы, например РЬА, РЬВ, РЬС, РЬЭ и/или пататина (агонистов или антагонистов), например ингибиторов для применения в качестве антинеопластических средств, противовоспалительных средств и в качестве болеутоляющих средств. Их можно использовать для получения кислых фосфолипидов для регулирования горького вкуса в продуктах питания и фармацевтических средствах. Их можно использовать для очистки жиров. Их можно использовать для идентификации пептидных ингибиторов для лечения вирусных, воспалительных, аллергических и сердечно-сосудистых заболеваний. Их можно использовать для получения вакцин. Их можно использовать для получения глицеридов жирных кислот и фосфатидилглицеринов.

Фосфолипазы по изобретению, например ферменты РЬС, используют для получения иммунотоксинов и различных лекарственных средств для терапии злокачественной опухоли.

Фосфолипазы по изобретению можно использовать вместе с другими ферментами для обесцвечивания (т.е. удаления хлорофилла) и в детергентах (см. выше), например, вместе с другими ферментами (например, липазами, протеазами, эстеразами, фосфатазами). Например, в любом примере, где используют РЬС, можно использовать РЬЭ и фосфатазу в комбинации для получения того же результата, что и в случае РЬС отдельно.

В табл. 7 ниже обобщенно представлены иллюстративные способы и составы по изобретению.

- 99 022979

Таблица 7

Иллюстративные способы по изобретению | Назначения
Химическое применение для рафинирования масла
Без применения кислоты	Устранение химических реагентов
Без применения щелочи	Устранение химических реагентов
Диапазон количеств используемой кислоты и щелочи (от отсутствия избытка до избытка)	Снижение количества химических реагентов/альтернативный вариант осуществления способа рафинирования
Другие типы кислоты и щелочи	Альтернативные варианты осуществления способа рафинирования
Воздействие воды в рафинировании масла с помощью РЬС
Применение силикагеля	Замена стадии промывания водой
Применение осушающего воду агента	Устранение воды в конечном продукте
Воздействие более низкого количества воды в ходе обработки щелочью	Устранение воды в конечном продукте
Минимальное содержание воды (<5%)	Устранение воды в конечном продукте
Максимальное содержание воды (>5%)	Альтернатива способа
Профили влажности для рафинирования с помощью РЬС	Альтернативный вариант осуществления способа рафинирования
Зависимость масла от содержания воды для рафинирования с помощью РЬС	Альтернативный вариант осуществления способа рафинирования
Удаление ίη §Ии свободных жирных кислот, РРА

Добавление хелатирующего агента для РРА

Альтернативный вариант осуществления способа рафинирования; экономия энергии

Влияние режима перемешивания на рафинирование масла с помощью РЬС

Рафинирование с помощью РЬС с минимальным перемешиванием

Защита фермента от вызываемой перемешиванием денатурации, экономия энергии

Рафинирование с помощью с помощью РЬС при первоначальном перемешиванием с помощью сдвигающего усилия, а затем лопастном перемешивании

Порядок добавления химических реагентов

Порядок добавления: фермент-вода, затем кислота, а затем щелочь

Альтернативный осуществления рафинирования вариант способа

Позволяет РЬС действовать до воздействия кислоты или щелочи, потенциально вызывающих инактивацию РЬС вследствие рН или хелатирования металлов

Альтернативные варианты осуществления способа рафинирования масла с помощью РЬС в отношении температуры и времени

Стадия обработка ферментом (время): <60 мин, предпочтительно <30 мин

Альтернативный осуществления рафинирования вариант способа

Стадия обработка ферментом (температура): 5070°С, возможно <50°С (например, КТ)

Преимущества рафинирования масла с помощью РЬС

Альтернативный осуществления рафинирования вариант способа

Получение соапстока с минимизированным содержанием РЬ и обогащенного растворимыми в воде фосфатными сложными эфирами

Уменьшение содержания нейтрального масла камеди с использованием РЬС

Способ обеспечения увеличения ϋΑΟ растительных маслах (например, 1,З-ϋΑΟ)

Преимущества использования растительных масел с увеличенным содержанием ϋΑΟ с другими маслами для пользы для здоровья

Разработка способа рафинирования, при котором масле практически не остается активности РЬС

Разработка способа рафинирования масла, при котором в масле не остается поддающегося детекции белка РЬС

Применение фермента для получения ϋΑΟ из камедеобразной массы с лецитином

Применение РЬС со специализированными маслами (обогащенными РА, ΡΙ)

Альтернативный осуществления рафинирования

Альтернативный осуществления рафинирования

Альтернативный осуществления рафинирования вариант способа вариант способа вариант способа

Иллюстративная польза продукта

Альтернативный осуществления рафинирования/улучшение регулирования вариант способа

Альтернативный вариант осуществления способа рафинирования/улучшение регулирования

Иллюстративная польза продукта

Иллюстративная польза продукта

- 100 022979

Применение специфичных к ΡΑ/ΡΙ ферментов (например, специфичных к 596Ε82/ΡΙ)	Альтернативный вариант осуществления способа рафинирования
Применение специфичных к РА/ферментов ΡΙ (например, специфичных к 596Ε82/ΡΙ) + специфичных к РС/РЕ ферментов; влияние порядка добавления	Альтернативный вариант осуществления способа рафинирования Альтернативный вариант
Периодический или непрерывный процесс	осуществления способа рафинирования
Применение ресуспендированной обработанной РЬС камеди для дальнейших действий по рафинированию	Альтернативный вариант осуществления способа рафинирования
Баланс масс для ЭАС, РРА, Р, металлов, нейтрального масла в камеди	Альтернативный вариант осуществления способа рафинирования
Прочее
Добавление РЕС к хлопьевидным ядрам масличных семян до экструзии	Альтернативный вариант осуществления способа Альтернативный вариант
Мелкомасштабный анализ рафинирования	осуществления способа рафинирования
Применение других ферментов для уменьшения массы камеди (например, фермента РУКОЬА8Е®, хлорофиллаза, пероксидаза, липаза, лакказа, манназа, протеаза, лактаза, амилаза и т.д. или их комбинаций)	Альтернативный вариант осуществления способа рафинирования
Применение соединения для лучшего способствования разделению масло/камедь	Альтернативный вариант осуществления способа рафинирования
Увеличение твердости камеди из обработанного РЕС масла	Альтернативный вариант осуществления способа рафинирования
Гликозилированные/дегликозилированные варианты фосфолипазы	Альтернативный вариант осуществления способа рафинирования
Иллюстративные составы по изобретению	Назначение
Иллюстративный жидкий состав для стабильности	Стабилизация фермента для
Применение соединений для увеличения стабильности РЕС при различных диапазонах рН и температуры (полиолы, соли, металлы...)	максимальной продукции ЭАО, возможно для изменения субстратной специфичности или направления образования продукта в сторону типа 1,3-ϋΑΟ Стабилизация фермента для
Применение гидрофобной системы для доставки РЕС (липосомы, гидратированный фермент в каплях очищенного масла)	максимальной продукции ϋΑΟ, возможно для изменения субстратной специфичности или направления образования продукта в сторону типа 1,3-ЭАО
Твердый состав для стабильности	Стабилизация фермента(ов) и
Применение различных систем носителей фосфолипазы РЕС (смолы для иммобилизации, пористые матрицы, гели, гранулы, порошки, таблетки, везикулы/мицеллы, инкапсулирующие материалы, структурированные жидкости и т.д.) для стабилизации фосфолипазы и коферментов	простота отделения фермента от фазы камеди или масла после рафинирования; возможность повторного использования препарата фермента; физическое отделение фазы фермента в процессе переработки масла; воздействие РЬС на ΡΙ/ΡΑ Снижение стоимости
Применение отходов рафинирования (компонентов камеди, шелуха семян) для состава РЬС	ингредиентов состава, лучшая способность к смешиванию фермента с маслом, термическая стабилизация фермента
Иллюстративный состав и способы способствования активности	Более быстрое время
Применение химических реагентов или фермента для лучшего диспергирования фермента в масле (например, шипучая матрица и т.д.)	реакции/процесс рафинирования/снижение использования химических реагентов
Повторное использование камедей/фермента для дальнейших реакций рафинирования	Возможность повторного использования фермента Универсальность способа;
Использование составов, которые усиливают изолирование или улавливание ферментом РЬ для гидролиза	различные ферменты могут требовать различных составах или их можно добавлять на различных стадиях способа
Использование множества составов для предотвращения инактивации одной РЬС компонентом препарата другой РИС с другой субстратной специфичности	Защита активности РБС в варианте осуществления с форматом нескольких ферментов
Использование множества составов для предотвращения инактивации одной РЬС компонентом в препарате другого фермента (гидролаза, оксидаза)	Защита активности РБС в варианте осуществления с форматом нескольких ферментов
Использование периодического добавления щелочи, как например, в составе для добавления щелочи с замедленным высвобождением	Защита фермента от вызываемой перемешиванием денатурации, экономия энергии

- 101 022979

Инактивация и модулирование активности ферментов путем гликозилирования

Это изобретение относится к способам, включающим применение рекомбинантной технологии для получения и экспрессии ферментов или других белков с биологической активностью, например вредоносных или токсических ферментов (где ферменты или другие белки обычно не гликозилированы) в неактивной или менее активной, но реактивируемой форме. Способ включает добавление одного или нескольких участков гликозилирования (например, Ν-связанного или О-связанного гликозилирования) в ферменты или другие белки с биологической активностью (например, фермент по настоящему изобретению) путем конструирования кодирующей последовательности, включающей новый участок(участки) гликозилирования; экспрессии, кодирующей вариант последовательности в эукариотических клетках или эквивалентной сконструированной системе или системе ш νίίτο, способной к посттрансляционному гликозилированию. Например, последовательность из 3 аминокислот NXЗ/Т представляет собой участок гликозилирования в эукариотических клетках, прокариотические клетки не осуществляют гликозилирования. Таким образом, изобретение включает добавление по меньшей мере одной последовательности из 3 аминокислот NXЗ/Т к белку так, чтобы его активность снижалась или инактивировалась вследствие посттрансляционного гликозилирования.

Гликозилирование может приводить к добавлению 2 молекул Ν-ацетилглюкозамина ^СЫс^с) к остатку Ν. Последующее добавление может быть специфическим для организма. В большинстве видов затем к NС1исNас добавляются сахара маннозы (Мапп), причем количество остатков Мапп находится в диапазоне от 10 до 100. Также в некоторых видах может добавляться сиаловая кислота. В РюЫа после добавления NС1исNас может добавляться от 10 до 25 остатков Мапп.

Эти способы включают применение любого дегликозилирующего фермента или набора ферментов, многие из которых были идентифицированы и/или являются коммерчески доступными. Например, фермент эндогликозидаза Н осуществляет расщепление последнего Ν^^№^ оставляя один NС1исNас, присоединенный к остатку Ν. Фермент ΡNСакеР отщепляет все сахара и конвертирует аминобоковую цепь остатка Ν в гидроксильную группу, приводя к тому, что аминокислота Ν в ферменте становится аспартатом (Ό). Таким образом, способы включают применение эндогликозидазы Н и/или ΡNСакеР или эквивалентных ферментов ш νίνο или ш νίίτο для реактивации частично или полностью сконструированных временно инактивированных белков.

Способ включает нацеливание ферментов или других полипептидов на секреторный путь хозяина так, чтобы произошло гликозилирование фермента. Новые участки гликозилирования конструируют так, чтобы гликозилирование инактивировало фермент или модифицировало его активность, например снижало его активность или иным образом модифицировало активность, например блокировало участок связывания субстрата. Поскольку фермент является неактивным или менее активным, вредоносные или токсические ферменты могут экспрессироваться на более высоких уровнях, поскольку отрицательные эффекты их активности более не являются ограничением для того, сколько белка может накапливаться в клетках-хозяевах. Неактивный гликозилированный фермент можно реактивировать (частично или полностью) путем удаления сахаров, например, с использованием коммерчески доступных дегликозилирующих ферментов, например путем удаления сахаров ш νίίτο или удаления сахаров ш νίνο с использованием подходов инженерии цельных клеток.

В одном аспекте к любому белку, например ферменту по изобретению, добавляют участок-мишень, такой как NXЗ/Т, для эукариотического гликозилирования. Это позволяет специалисту в данной области добавить участки гликозилирования к представляющему интерес белку, ожидая его конвертирования в белок, который является временно неактивным после гликозилирования при экспрессии этого белка в эукариотической клетке-хозяине, и направления белка на секреторный путь клетки-хозяина.

Таким образом, изобретение относится к способам получения ферментов, которые обычно являются чрезмерно вредоносными или токсичными, чтобы клетка-хозяин могла выдерживать их в больших количествах. Эффект может быть временным, поскольку является возможной регенерация активного фермента (дегликозилированием, например, посттрансляционной модификацией/дегликозилированием) для последующей работы, требующей активного фермента.

В одном аспекте изобретение относится к способам получения и экспрессии белка, имеющего биологическую активность, активность которого временно инактивирована гликозилированием, включающим: (а) предоставление нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, обладающий биологической активностью, где белок не является природным образом гликозилированным; (Ь) встраивание по меньшей мере одной кодирующей мотив гликозилирования последовательности в кодирующую белок нуклеиновую кислоту, где гликозилированная форма белка является неактивной; (с) встраивание нацеливающей последовательности в белок так, чтобы он направлялся на секреторный путь клетки-хозяина, где клеткахозяин способна распознавать мотив гликозилирования и гликозилировать белок; и (б) экспрессию модифицированной нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине. В одном аспекте способ дополнительно включает дегликозилирование экспрессированного белка, тем самым реактивируя активность белка, например фермента, такого как фермент по изобретению. В одном аспекте клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку. В одном аспекте инактивированный экспрессированный рекомбинантный белок реактивируют дегликозилированием ш νίίτο либо химическим, либо ферментативным.

- 102 022979

Определение встраивания одного или нескольких мотивов гликозилирования для временной инактивации белка вовлекает только общепринятые способы получения кодирующих вариант нуклеиновых кислот, например, путем ОЗЗМ, и общепринятые протоколы скрининга, например, анализы активности или связывания.

Фермент, активность которого является вредоносной для клетки-хозяина, инактивировали путем гликозилирования. Поскольку он являлся неактивным, он мог накапливаться на значительно более высоких уровнях в эукариотических клетках-хозяевах. Поскольку он более не был активен, он более не был способен оказывать его отрицательные эффекты. Инактивация токсического фермента являлась временной благодаря дегликозилированию с использованием ЕпДоН или РЫОа8с Р, что приводило к полному восстановлению нормальной активности фермента. Большое количество гликозилированного неактивного фермента, накопленного в среде, указывало на то, что он хорошо переносился хозяином в неактивной форме.

Понятно, что представленное выше подробное описание и прилагаемые примеры являются только иллюстративными, и их не следует истолковывать как ограничение объема объекта. Различные изменения и модификации описанным вариантам осуществления будут понятны специалистам в данной области. Такие изменения и модификации, включая, но не ограничиваясь ими, изменения и модификации, касающиеся способов применения, предоставленных в настоящем документе, можно вносить без отклонения от их сущности и объема. Патенты, патентные публикации и другие публикации, на которые в настоящем документе представлены ссылки, включены в качестве ссылок.

Изобретение далее описано с помощью представленных ниже примеров; однако следует понимать, что изобретение не ограничивается такими примерами.

Примеры

Пример 1. Программа ВЬАЗТ, использованная для определения профиля идентичности последовательностей.

В этом примере описана иллюстративная программа для установления идентичности последовательностей для определения того, относится ли нуклеиновая кислота к объему изобретения. Используют программу ЫСВ1 ВЬАЗТ 2.2.2, параметры по умолчанию для Ь1а8!р. Использовали все величины по умолчанию, за исключением параметров фильтрации по умолчанию (т.е. все параметры, установленные как параметры по умолчанию, за исключением фильтрации, которая была установлена на ОРР); вместо нее использовали параметр -Р Р, которой выключает фильтрацию. Применение фильтрации по умолчанию часто приводит к противоречиям Каг1т-А118сйи1 вследствие короткой длины последовательности. Величины по умолчанию, используемые в этом примере, включают

ΡϊΙΐβΓ Гог 1ο\ν сотр1ехку: ΟΝ > АУоЫ δΐζε: 3 > Майтх: В1о§ит62 > Оар Со§18: Ех1з1епсе: 11 > ΕχΙεηδϊοη: 1

Другие параметры по умолчанию представляют собой фильтр низкой комплексности ОРР, размер слова 3 для белка, матрицу ВЬОЗиМ62, штраф за внесение пропуска -11 и штраф за продолжение делеции -1. Параметр -V был установлен на значение по умолчанию, равное 0. Это означает, что если он не установлен, размер слова принимает значение по умолчанию, равное 3 для белков и 11 для нуклеотидов. Параметры являются следующими:

- 103 022979 «ΚΕΑ ОМЕ.Ыз. 1x1» > Ыаз1а11 агдишепГз:

>

> -р Ргодгат Кате [8Ьтд] > -й ОШаЬазе [3ίπη§] > ЙеГаик = пг > -ί (/>иегу РИе [РПе Ιη] > ЙеГаик = з!йт > -е ЕхресГайоп уа1ие (Е) [Кеа1] > ЙеГаик =10.0 > -т акдптеп! νϊβγν оркопз:

> 0 = ранчлчзе, > 1 = цисгу-апскогей зЬо\ут§ ШепЬЬез, > 2 = циегу-апскогей по ШепННез, > 3 = Йа1 диегу-апскогей, зНо\у МепЬЬез, > 4 = Да1 диегу-апскогей, по ЫепЬЬез, > 5 = чиегу-апскогей по ШепППез ап<1 ЫиШ епйз, > 6 = Йа1 диегу-апскогей, по ЫепЬкез апб Ыип1 епйз, > 7 = ХМЬ В1аз1 оиГри!, > 8 = 1аЬи1аг, > 9 1аЬи1аг χνϊίΐι соттеШ Ипез [Ькедег] > ЙеГаик = 0 > -о ВЬАЗТ героП ОШрШ РПе [РНе Ои1] ОрИопа1 > ЙеГаик = з1йои1 > -Р РШег циегу зециепсе (ϋυδΤ \νίΠι ЫазШ, 5ЕО \νίΠι оШегз) [ЗЬтд] > ЙеГаик = Т > -О Соз11о ореп а дар (гего туокез ЙеГаик ЬеЬауюг) [1п1едег] > ЙеГаик = 0 > -Е Соз11о ех1епй а дар (гего туокез ЙеГаик ЬеЬауюг) [Ькедег] > йеГаик = 0 > -X X йгороГГ уа1ие Гог даррей аИдптеШ (ϊη Ьх1з) (гего туокез йеГаик > ЬеЬауюг) [Ькедег] > йеГаик = 0 > -I 5Ьо\у ОГз ίη йеГкпез [Т/Р] > йеГаик = Р > -ς Репаку Гог а пискокйе пизтаХсЬ (ЫазШ оп1у) [1п1едег] > йеГаик = -3 > -г Кехуагй Гог а пискокйе таФЬ (ЫазШ оп1у) [Ькедег] > йеГаик = 1 > -ν ИитЬег оГ йа1аЬазе зециепсез 1о зЬо\у опе-кпе Йезспркопз Гог (V) > [Ькедег] > йеГаик = 500 > -Ь ЫитЬег оГ йаШЬазе зсдиепсе 1о з1ю\у акдптеШз Гог (В) [Ькедег] > ЙеГаик = 250 > -Г Ткгезко1й Гог ех1епйтд Ькз, йеГаик ϊΓ гего [Ькедег] > йеГаик = 0 > -д РегГогт даррей аНдптеШ (ηοί ауаПаЫе ν/ПЬ 1Ыаз1х) [Т/Р] > йеГаик = Т > -О </)иегу ОепеПс сойе 1о изе [Ькедег] > ЙеГаик = 1 > -ϋ ϋΒ ОепеПс сойе (Гог 1Ыаз1[пх] оп1у) [Ькедег] > йеГаик = 1 > -а ИитЬег оГ ргосеззогз ίο изе [Ькедег] > ЙеГаик = 1 > -О ЗецАНдп Ые [РПе Ои1] ОрНопа1 > -I Векеуе Ше циегу ЙеГкпе [Т/Р] > йеГаик = Р > -М Ма1пх [ЗЬтд] > ЙеГаик = ВЬО8иМ62 > -\У \Уогй 8ΐζο, йеГаик ΪΓ гего [Ькедег] > ЙеГаик = 0 > -ζ ЕГГескуе 1епдШ оГ Ше йа1аЬазе (изе гего Гог Ше геа1 βίζε) > [ЗЬтд] > ЙеГаик = 0 > -К ЫитЬег оГ Ьез1 Ькз Ггот а гедюп № кеер (оГГЬу ЙеГаик, ΪΓ изей а > уа1ие оГ 10018 гесоттепйей) [Ькедег] > йеГаиЬ = 0 > -Р 0 Гог ти1Нр1е Ькз 1-разз, 1 Гог зтд1е Ьк 1-разз, 2 Гог 2-разз > [Ькедег] > йеГаик = 0 > -Υ ЕГГесйуе 1епдШ оГ Ше зеагсЬ зрасе (изе гего Гог Ше геа! δίζε)

- 104 022979 > [К.еа1] > ЙеГаиИ = 0 > -8 <3иегу зйапйз ίο зеагсЬ а§агпз1 йа1аЬазе (Гог Ыаз1[пх], апй > 1Ыаз1х). 3 ίδ ЬоШ, 1 ίδ ίορ, 2 ίδ ЪоНот [1п1е§ег] > ЙеГаиИ = 3 > -Т Ргойисе НТМЬ ои1ри1 [Т/Р] > йеГаиИ = Р > -1 Кез1пс1 зеагсЬ оГ йа1аЬазе ίο Ηδί оГ ΟΓδ [δίτΐη§] Орйопа1 > -и изе Ιον/ег сазе йИеппд оГРАЗТА зециепсе [Т/Р] Ор1юпа1 > ЙеГаиИ = Р > -у ϋτοροΓΓ (X) Гог Ыаз1 ех1епзюпз ΐη ЪНз (0.0 туокез ЙеГаиИ > ЪеЬауюг) [К.еа1] > йеГаиИ = 0.0 > -Ζ X йгороГГ уа1ие Гог йпа1 §аррей аИдптеШ (ΐη ЪНз) [1п1е§ег] > йеГаиИ = 0 > -К. Ρ8Ι-ΤΒΕΑ8ΤΝ сЬескронй й1е [РПе Ιη] Ор1юпа1 > -п Ме§аВ1аз1 зеагсЬ [Т/Р] > ЙеГаиИ = Р > -Ь ЬосаРоп оп циегу зециепсе [81пп§] Орйопа!

> -А Ми1йр1е ННз ν/ίηάον/ δΐζε (/его Гог зт§1е ЬН а1§огНЬт) [1п1с§ег] > ЙеГаиИ = 40

Пример 2. Модификации фермента РЬС (еРЬС).

В этом примере описаны иллюстративные протоколы для получения ферментов РЬС по изобретению, включая ферменты Р1-РБС по изобретению. В этом примере описаны ферменты, которые можно использовать для осуществления на практике этого изобретения, например использовать в комбинации с ферментами РЬС по изобретению (например, фермент, обладающий последовательностью, как указано в 8НО ΙΌ NΟ: 8 или как описано в табл. 12-15). Ферменты, которые можно использовать для осуществления на практике этого изобретения, например, в комбинациях или смесях, содержащих ферменты РЬС по изобретению, включают любой фермент фосфолипазу, включая фермент, обладающий последовательностью, как указано в табл. 8 или 9 или как описано в ШО 2008/036863. В альтернативных вариантах осуществления ферменты, которые можно использовать для осуществления на практике этого изобретения, включают полипептиды, обладающие последовательностью, как указано в 81/0 ΙΌ NΟ: 2 и/или 81/0 ΙΌ NΟ: 4, и их варианты, как описано в табл. 8 и 9 ниже.

Фермент фосфолипаза С, обладающий последовательностью, как указано в 8НО ΙΌ NΟ: 2 (кодируемой, например, 81/0 ΙΌ NΟ: 1) является ферментативно активной подпоследовательностью более длинной последовательности 81/0 ΙΌ NΟ: 4 (кодируемой, например, 81/0 ΙΌ NΟ: 3). 81/0 ΙΌ NΟ: 4 имеет лидерную последовательность из остатков 1-37 (полужирным шрифтом) 81/0 ΙΌ NΟ: 2. 81/0 ΙΌ NΟ: 4, кодируемый 81/0 ΙΌ NΟ: 3, использовали в качестве матрицы для дальнейшей модификации с использованием технологии О88М.

Положения пронумерованы, начиная с Ν-концевого метионина. Мутации подчеркнуты и выделены полужирным шрифтом (пронумерованы здесь как Ν100Ό, Ν1688 И Ν171Ό).

- 105 022979

МКККУЬАЬАА МУАЬААРУОЗ УУЕАфТШЗЕ ЗРАР1ЫШ5А ΕΏΚΗΝΕ6ΙΝ3 ΗΙΛίίνΝΚΑΙϋ ΙΜ3ΚΝΤΤΐνΝ ΡΝΕΤΑΕΣΝΕΝ ΚΑΟϋΕΝΟΙΥΒ ΑϋΥΕΝΡΥΥϋΙ)

3ΤΥΑ3ΗΕΥϋΡ ϋΤΟΤΤΥΙΡΕΑ ΚΗΑΚΕΤΟΑΚΥ ΕΝΣΑΟΏΑΥΟΝ ΟΟΜΟΟΑΕΕΥΣ СЬЗЬНУЬСОУ ΝΏΡΜΗΑΑ3ΕΤ ОЬЗУРМСЕНЗ ΚΥΕΝΕνϋΤΙΚ ΝΝΥΐν3Ο3ΝΟ ΥΝΝΝΚΟΑΝΡΕ ШлЛЕСААУАА ΚΟΟΥΡΟννΝΌ ТТКОИЕУКАА ν30ΕΥΑϋΚΝΚ АЕУТРУТСКК ЬМЕАфКУТАС ΥΙΗΙΛίΕϋΤΥν ΝΚ (5Ε<2 Ιϋ N0:4)

И5А ΕΌΚΗΝΕ0ΙΝ3

ΗΣΜίνΝΚΑΙϋ ΙΜ3ΚΝΤΤΐνΝ ΡΝΕΤΑΣΣΝΕΝ ΚΑϋΕΕΝ0ΙΥ3 ΑΟΥΕΝΡΥΥϋϋ

3ΤΥΑ3ΗΕΥϋΡ ϋΤΟΤΤΥΙΡΕΑ ΚΗΑΚΕΤΟΑΚΥ ΕΝΣΑΟφΑΥΟΝ ΟΟΜΟΟΑΕΕΥΣ СЬЗЬНУЬСОУ Ν0ΡΜΗΑΑ3ΕΤ ОЪЗУРМСЕНЗ ΚΥΕΝΕνϋΤΙΚ ΝΝΥΐν3ϋ3ΝΟ ΥΝΝΝΚΟΑΝΡΕ ϋΝΙΕΟΑΑνΑΑ ΚΟϋΥΡΟννΝϋ ТТКОМЕУКАА ν50ΕΥΑϋΚΝΚ ΑΕνΤΡνΤΘΚΚ ЬМЕАОКУТАО ΥΙΗΣΝΕΟΤΥν ΝΚ (8Εζ) Ю N0:2)

АТСААААА(ЗААА6ТАТТА6САСТАССА6СТАТ6СТТ6СТТТА6СТ6С6С

САеТТСААА6Т6ТА6ТАТТТ6САСАААСАААТААТА0Т6АААСТССТ6С

АСС6АТТТТААСЗАТССТСАССТСАССАТААССАТААТСАСОССАТТААС

ТСТСАТТТСТССАТТСТАААТССТССААТТСАСАТСАТСТСТССТААТА

СААС0АТТСТ6ААТСССААТСАААСТССАТТАТТАААТСА6ТССССТСС

ТСАТТТАСААААТССТАТТТАТТСТССТСАТТАССАСААТССТТАТТАТ

САТСАТАСТАСАТАТССТТСТСАСТТТТАТСАТССССАТАСТССААСАА

САТАТАТТССТТТТОССАААСАТеСААААСАААСАСССССААААТАТТТ

ТААССТТССТ60ТСААССАТАССААААТСАА6АТАТССАССААССАТТС

ТТСТАСТТАССАТТАТСССТТСАТТАТТТАССАСАТСТСААТСАСССАА

ТОСАТССАССАТСТТТТАСССАТСТТТСТТАТССААТСССТТТССАТТС

ТАААТАССААААТТТТСТТСАТАСААТААААААТААСТАТАТТСТТТСА

САТАССААТССАТАТТССААТТССААА0САССАААСССАСААСАТТ6СА

ТТСААССА6САССССТАССАССТАААСААСАТТАТССТССССТТ0ТСАА

ССАТАСеАСААААСАТТОСТТТСТААААССАССССТАТСТСААСААТАТ

ССАСАТАААТССССТССССААСТААСАССССТСАСАССАААСССТТТАА

ТССААССССАСССССТТАСАССТССТТАТАТТСАТТТОТССТТТСАТАС СТАТСТАААТСССТАА (ЗЕО Ю N0:3)

ТССТСАССТСАССАТААССАТААТСАССССАТТААСТСТСАТТТСТССА

ТТСТАААТССТССААТТСАСАТСАТСТСТССТААТАСААССАТТСТСАА

ТСССААТСАААСТССАТТАТТАААТСАСТССССТССТСАТТТАСААААТ

ССТАТТТАТТСТССТСАТТАССАСААТССТТАТТАТСАТСАТАСТАСАТ

АТССТТСТСАСТТТТАТСАТССССАТАСТССААСААСАТАТАТТССТТТ

ТСССАААСАТССААААСАААСАСССССААААТАТТТТААССТТССТССТ

СААССАТАССААААТСААСАТАТССАССААССАТТСТТСТАСТТАССАТ

ТАТСССТТСАТТАТТТАССАСАТСТСААТСАСССААТССАТССАССАТС

ТТТТАСССАТСТТТСТТАТССААТСССТТТССАТТСТАААТАССААААТ

ТТТСТТСАТАСААТААААААТААСТАТАТТСТТТСАСАТАССААТССАТ

АТТССААТТССАААССАССАААСССАСААСАТТССАТТСААССАССАСС

ССТАССАССТАААСААСАТТАТССТССССТТСТСААССАТАССАСАААА

САТТССТТТСТААААССАССССТАТСТСААСААТАТССАСАТАААТССС

СТССССААСТААСАССССТСАСАССАААСССТТТААТССААССССАССС

С6ТТАСАССТССТТАТАТТСАТТТСТССТТТ6АТАССТАТСТАААТССС ТАА (ЗЕО Ю N0:1)

Мутации единичных остатков проводили с использованием способов мутагенеза с насыщением сайта гена (С88М) и анализировали в отношении активности фосфолипазы. Для целей скрининга экспрессирующий вектор представлял собой рА8К в хозяине Е. соН Тор10. Лучшие результаты С88М отбирали после первичного скрининга, для которого в качестве субстрата использовали РА/РХ, и образцы анализировали с помощью РСМ8. Затем эти первичные лучшие результаты подтверждали на соевом масле и анализировали с помощью ³¹Р-ЯМР и ВЭЖХ.

Анализ с соевым маслом и методика приготовления образцов для анализа способом ЯМР являются следующими.

Детергент ПМК приготавливали растворением 25 г дезоксихолевой кислоты, 5,84 г ЭДТА, 5,45 г

- 106 022979 основания Тпз в 900 мл воды, затем доведением рН до 10,5 с использованием гранул К0Н. Внутренний стандарт ЯМР представлял собой 50 мМ Т1Р и 12,5 мМ ТВР в изопропаноле категории ВЭЖХ. Оксид дейтерия (Ό, 99,9%), низкопарамагнитный, был от СатЪпДдс 1зо1орс ЬаЪога1опсз 1пс. (ΌΕΜ-11-100). Контроль ЯМР представлял собой лецитин Луапй ЬссйЫп (1п1сгпайопа1 ЬссйЫп & РНозрйоНрМз 8ос1с1у т1хсД зоу рНозрйоНрМз гсГсгспсс 81апДагД ой), Ахаий Ро1аг ЫрМз 1пс, # 95309.

Стандарты и образцы приготавливали следующим образом.

Тщательно перемешать партию неочищенного соевого масла.

Распределить 1 мл масла в 2-мл пробирку. Добавить 60 мкл очищенного фермента (для контроля, 18 единиц) или чистого клеточного лизата (для скрининга мутантов); перемешать в течение 15 с. Единицы определяют как гидролиз 1 мкмоль РС в 1 мин при 37°С при рН 7,3.

Инкубировать при 60°С в течение 48 ч в термосмесителе с качанием при 14000 об/мин, периодически встряхивать на устройстве для встряхивания.

После инкубации перемешать образцы тщательно с использованием устройства для встряхивания.

Отвесить 250 мг (±0,2 мг) каждого образца в 2-мл пробирку и отвесить контроль для ЯМР, состоящий из 10 мг (±0,1 мг) Луапй ЬссйЫп.

К каждому образцу добавить 900 мкл детергента для ЯМР, а затем добавить 100 мкл Ό₂Θ.

Перемешать образцы тщательно встряхиванием на устройстве для встряхивания и качанием в термосмесителе ЕррспДогГ Тйсгтот1хсг, при 30-37°С и 14000 об/мин в течение 30 мин.

Центрифугировать при 13000 об/мин в течение 10 мин.

Осторожно удалить верхний маслянистый слой.

К каждому образцу добавить 750 мкл гексана и осторожно встряхнуть на устройстве для встряхивания.

Центрифугировать при 13000 об/мин в течение 10 мин.

Осторожно удалить 600 мкл нижнего водного слоя и перенести в новую пробирку.

Добавить 25 мкл внутреннего стандарта, хорошо перемешать.

Перенести 500 мкл в 5-мм пробирку для ЯМР.

Высвобождение ОАО измеряли с помощью количественной ВЭЖХ согласно следующему протоко^лу.

Раствор образца представлял собой приблизительно 50 мкл образцов масла и 950 мкл смеси гексан/изопропанол (9:1) до 1 мл. Стандартные растворы представляли собой, например, 0,25, 0,5, 1, 2 и 4 мг/мл масле Н\0УА^ш (Као Согрогайоп, Иазса, П.). Масло Еηоνа представляет собой масло с высоким содержанием ЭАО, которое имеет распределение жирных кислот, сходное с обычным растительным маслом (1,3-ОАО и 1,2-ОАО).

Параметры ВЭЖХ:

колонка: Сйготсдазрйсгс™ 8Ι-60, 15 см х 4,6 мм, температура: 40°С, скорость потока: 2 мл/мин, объем инжекции: 20 мкл, подвижная фаза А: гексан, подвижная фаза В: гексан/изопропанол/этилацетат/муравьиная кислота=800:100:100:1.

Г радиентное элюирование

Время (мин) о ₈ 8.5 15 15.1 19 %В_2 35 98 98 2_2

Параметры испарительного детектора рассеяния света (НЕ80).

Иллюстративные параметры представляли собой температуру 40°С, приращение 5 и давление газообразного азота 3,5 бар (350 кПа). Пик ЭАО идентифицировали путем сравнения времени удержания со временем удержания стандарта. Количественное определение было основано на взаимосвязи между ответом детектора (площадь пика) и концентрацией анализируемого образца.

В табл. 8 описаны последовательности, которые можно использовать для осуществления на практике этого изобретения, например, в комбинации с полипептидами по изобретению (см., например, табл. 12-15), например, в качестве смесей или комбинаций ферментов.

На основе данных ЯМР и ВЭЖХ были отобраны мутации, представленные в табл. 8 ниже. В табл. 8 ниже указана исходная аминокислота, номер положения аминокислотного изменения и измененная аминокислота (для 8Е0 ΙΌ N0: 4). В табл. 8 также указан исходный кодон, замещающий кодон и другие кодоны для той же измененной аминокислоты. Например, во второй строке Е41А указывает на то, что аминокислота в положении 41 исходно представляла собой Е (глутаминовую кислоту), но была заменена на А (аланин). Исходный кодон для замены Е41А представлял собой ОАО, но был заменен на ОСА. Однако также можно было использовать кодоны ОСО, ОСС или ОСТ. В табл. 8 указаны варианты кодонов, которые приводили к вариантам (8ЕР ΙΌ N0: 4) с наилучшим варьированием или улучшением относительно дикого типа (8ЕР ΙΌ N0: 4) для гидролиза РА. Изобретение относится к

- 107 022979 нуклеиновым кислотам и полипептидам, которые кодируют их, содержащим один или все из вариантов, или эквиваленты всех вариантов, указаны в табл. 8.

На фиг. 10 массовая доля отдельных видов фосфолипидов (РЕ) приведена относительно общего РЬ, остающегося после реакции, отражая специфичность мутантов в конкретному виду. Здесь, виды представляли собой фосфатидную кислоту (РА), фосфатидилэтаноламин (РЕ), фосфатидилинозитол (Р1), фосфатидилхолин (РС). Т1Р относится к внутреннему стандарту ЯМР. Высвобожденный ЭАО измеряли способом ВЭЖХ, и он отражает относительные величины между образцами и контролями для общих 1,3-ОАО и 1,2-ОАО.

Положительный контроль представлял собой очищенный образец мутанта Е41А, ранее описанного в Тап ек а1., Вюсйет1к1гу, 37:4275-4279 (1998). Результаты указывают на то, что мутанты хорошо высвобождают ЭАО и обладают хорошей активностью в отношении различных видов, включая фосфатидилхолин (РС) и фосфатидилэтаноламин (РЕ), сравнимой или лучшей, чем у матрицы (8ЕР ГО N0: 4). Например, Ό100Ε и Э100М демонстрируют конкретную активность в отношении РА. Р265К демонстрирует конкретную активность в отношении Р1. Эти мутации можно комбинировать для обеспечения ферментов, обладающих желаемой активностью в отношении различных субстратов.

Таблица 8

Лучшие результаты в О88М

В альтернативных вариантах осуществления изобретение относится к комбинациям (смесям) ферментов РЬС или нуклеиновых кислот, которые кодируют их, содержащих последовательность нуклеиновой кислоты 8ЕР ГО N0: 3 (кодирующую полипептид 8ЕР ГО N0: 4); и/или последовательность нуклеиновой кислоты 8ЕР ГО N0: 1 (кодирующую полипептид 8ЕР ГО N0: 2); или комбинациям (смесям) ферментов РЬС, содержащих 8ЕР ГО N0: 2 и/или 8Е() ГО N0: 4.

В альтернативных вариантах осуществления изобретение относится к комбинациям (смесям) ферментов РЬС или нуклеиновым кислотам, которые кодируют их, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты 8ЕР ГО N0: 3 (кодирующую полипептид 8ЕР ГО N0: 4) и/или последовательность нуклеиновой кислоты 8ЕР ГО N0: 1 (кодирующую полипептид 8ЕР ГО N0: 2), имеющим одну, две или более или все из мутаций нуклеиновых кислот, которые кодируют аминокислотные мутации, приведен- 108 022979 ные выше в табл. 8, включая, например, изменения кодонов, описанные в настоящем документе. В альтернативных вариантах осуществления изобретение относится к комбинациям (смесям) ферментов Ρ^, кодируемых этими нуклеиновыми кислотами, например к комбинациям (смесям) ферментов Ρ^, кодируемых одной, несколькими или всеми из вариантов последовательности нуклеиновой кислоты δΕ^ ГО ΝΟ: 3 и/или δΕ^ ГО ΝΟ: 1, как описано в табл. 8.

После скрининга лучших результатов ΟδδΜ и отбора наилучших результатов (см. табл. 8 выше) проводили дальнейшую охарактеризацию на планшетах с яичным желтком для сужения количества мутантов ΟδδΜ, для включения в дальнейшее исследование с использованием технологии повторной сборки гена. В табл. 10 представлены данные анализа с яичным желтком (анализ с яичным желтком описан ниже) вместе с результатами анализа масла и определения термической устойчивости по остаточной активности. На фиг. 11 проиллюстрированы единичные улучшенные мутанты ΟδδΜ, которые были отобраны для включения в процесс повторной сборки гена. Повторную сборку гена проводили, как описано в настоящем документе.

В табл. 9 ниже приведены 288 полипептидных последовательностей, которые можно использовать для применения на практике этого изобретения, например, в комбинации с полипептидами по этому изобретению (см., например, табл. 12-15), например, в качестве смесей или комбинаций ферментов. В табл. 9 представлены последовательности, которые были получены комбинированием путем повторной сборки гена выбранных единичных улучшенных мутантов ΟδδΜ. Все они представляют собой варианты исходной аминокислотной последовательности δΕ^ ГО ΝΟ: 4 (последовательность дикого типа или νΤ).

Для облегчения прочтения табл. 9, например, для фосфолипазы, охарактеризованной как измененная фосфолипаза 1 (вторая строка таблицы):

аминокислотный остаток дикого типа Е или глутаминовая кислота (д1и) в положении остатка 41 (δΕ^ ГО ΝΟ: 4) модифицирована в остаток Υ или тирозина (!уг); аминокислотый остаток дикого типа Ν или аспарагин (акр) в положении остатка 100 (δΕ^ ГО ΝΟ: 4) модифицирован на остаток М или метионина (те!);

аминокислотный остаток дикого типа Ν или аспарагин (акр) в положении остатка 168 (δΕ^ ГО ΝΟ: 4) модифицирован в остаток δ или серина (кег); аминокислотный остаток дикого типа Ν или аспарагин (акр) в положении остатка 171 (δΕ^ ΙΌ ΝΟ: 4) остается Ν; и аминокислотный остаток дикого типа М или метионин (те!) в положении остатка 176 (δΕ^ ГО ΝΟ: 4) остается Μ.

Таблица 9

Библиотека фосфолипаз, полученная комбинированием путем повторной сборки гена единичных улучшенных мутантов ΟδδΜ

Измененая фосфолипаза	Е41	N100	N168	N171	Μ176
1	Υ	Μ	8	Ν	Μ
2	Е	νν	8	Ε	Μ
3	А	Μ	Ν	Ε	νν
4	Υ	Ε	8	Ε	Μ
5	Υ	Υ	3	Ν	Μ
6	К	Ε	Ν	Ε	Μ
7	Е	Υ	Ν	Ε	Μ
8	Е	Ε	Ν	Ν	νν
9	А	νν	3	Ε	Μ
10	Υ	Υ	3	Ν	νν
11	Е	ί	3	Ν	νν
12	А	Ε	Ν	Ν	Μ
13	νν	Μ	Ν	Ν	Μ
14	νν	Υ	3	Ε	Μ
15	К	ί	Ν	Ε	νν
16	νν	νν	3	Ε	νν
17	νν	Ν	3	Ν	Μ
18	νν	ь	Ν	Ε	Μ
19	к	Ν	Ν	Ε	Μ
20	Ε	Ν	Ν	Ν	νν
21	Υ	Ν	3	Ε	Μ
22	К	Ν	3	Ν	νν
23	Ε	Υ	3	Ν	νν
24	Ε	Ь	Ν	Ε	νν
25	Α	Ν	Ν	Ε	Μ
26	Α	νν	Ν	Ν	Μ
27	νν	Μ	Ν	Ε	νν
28	Ε	ί	3	Ε	νν
29	Υ	Ε	3	Ν	Μ
30	Ε	Ε	Ν	Ν	Μ
31	Ε	νν	Ν	Ε	Μ
32	Ε	νν	Ν	Ν	νν
33	Ε	νν	3	Ε	Μ
34	Ε	Υ	3	Ν	Μ
35	Ε	Ν	3	Ν	Μ
36	Ε	Б	Ν	Ε	νν
37	Υ	Μ	Ν	Ε	Μ
38	Ε	Ν	3	Ν	νν

- 109 022979

39	νν	Ν	Ν	Ε	νν
40	Ε	Μ	3	Ν	Μ
41	Υ	Ν	3	Ν	Μ
42	Υ	Υ	Ν	Ε	Μ
43	Υ	Ι	Ν	Ε	Μ
44	Ρ	Μ	Ν	Ν	νν
45	Ε	Ν	3	Ε	Μ
46	Ρ	Μ	3	Ν	νν
47	Ε	Ρ	3	Ν	νν
48	νν	Υ	Ν	Ε	νν
49	Ρ	Ρ	Ν	Ε	Μ
50	к	Μ	3	Ν	νν
51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130	Α К К К Ρ Ε Ε Α Ε νν νν Α Υ Ρ Α Ρ Ε Ε Ε Ε Ρ Ε Υ Υ Α Ε νν Υ Ε νν Ε νν Ε Υ Ε Ρ Ρ νν Ε Ε Υ Υ Α Ε Ε Ρ Ε Ρ νν νν Ε Ρ Α Α Ρ Α Ρ Ρ Υ Ε Ρ Ε Ε Ρ Ρ Υ Ρ νν Α Α Ε Ε νν Ε Ε Υ Α Υ νν Ρ	Ν νν ь νν νν ь ι_ Υ Υ Ν Ν Ρ Μ Ρ Μ Ν Μ Υ Ρ νν νν νν ь Ν Υ Ρ ι Ν Ρ Ν Μ Ν νν Μ Υ Μ ί Ρ ь ь Ρ ί. Ν Ν Μ Ν Μ νν νν Ν Ν νν νν Υ Υ Υ Ν Ρ Ν νν Ν ί Ν νν νν Υ Υ Υ Ν ь Υ Υ Ν Μ Ν νν νν Υ Υ Υ	Ν 3 3 Ν Ν Ν 3 3 3 Ν Ν 3 3 3 Ν Ν Ν 3 3 3 3 Ν Ν 3 3 3 3 Ν Ν 3 3 3 3 Ν Ν Ν 3 3 3 Ν Ν 3 3 Ν 3 Ν Ν 3 Ν Ν 3 3 3 3 3 Ν 3 Ν Ν 3 3 Ν 3 3 Ν Ν Ν 3 3 3 Ν 3 3 Ν Ν Ν Ν 3 Ν Ν	Ε Ν Ν Ε Ν Ν Ε Ν Ν Ε Ν Ν Ε Ν Ν Ε Ε Ε Ε Ν Ν Ε Ν Ν Ε Ν Ν Ε Ε Ε Ε Ν Ν Ε Ν Ε Ε Ν Ν Ε Ν Ε Ν Ν Ν Ε Ε Ε Ν Ν Ε Ε Ε Ε Ε Ν Ν Ν Ε Ε Ε Ν Ν Ν Ε Ε Ν Ν Ν Ν Ε Ε Ε Ν Ε Ε Ν Ε Ν Ε	νν Μ Μ Μ Μ νν Μ νν νν Μ νν Μ νν Μ Μ Μ Μ Μ Μ Μ νν νν νν νν νν Μ Μ Μ Μ Μ Μ νν νν νν νν νν νν Μ Μ Μ νν Μ νν νν νν νν νν νν Μ Μ νν νν νν Μ νν νν Μ νν νν νν Μ Μ νν νν Μ νν νν νν Μ νν νν νν νν Μ Μ νν νν Μ νν Μ
131	Α	Ν	3	Ε	Μ
132	Α	ь	3	Ε	νν
133	Ε	Ρ	Ν	Ε	νν
134	Ρ	Ν	3	Ε	νν
135	Ρ	Ν	3	Ε	νν
136	Ε	νν	Ν	Ν	Μ
137	Ε	Ν	Ν	Ε	νν
138	νν	νν	Ν	Ε	νν
139	Υ	νν	3	Ν	νν
140	νν	Υ	Ν	Ε	Μ
141	Ρ	Υ	3	Ν	νν
142	Ρ	Υ	3	Ν	Μ

110

111

247	А	ь	Ν	Ε	νν
248	Υ	ь	δ	Ν	Μ
249	Р	м	3	Ν	Μ
250	Υ	м	δ	Ε	Μ
251	Р	м	Ν	Ε	Μ
252	Р	νν	Ν	Ε	νν
253	Υ	Б	Ν	Ν	Μ
254	к	νν	Ν	Ν	Μ
255	Υ	N	Ν	Ν	νν
256	в	Р	3	Ν	νν
257	А	Р	δ	Ν	νν
258	А	Р	Ν	Ε	Μ
259	А	ь	Ν	Ν	νν
260	А	ί	Ν	Ε	Μ
261	В	м	3	Ε	νν
262	νν	м	3	Ν	Μ
263	В	м	3	Ν	Μ
264	А	νν	3	Ν	Μ
265	В	м	Ν	Ν	Μ
266	Р	Υ	Ν	Ν	Μ
267	А	м	Ν	Ν	νν
268	Р	Р	3	Ν	Μ
269	Υ	Р	Ν	Ε	νν
270	Р	ί	Ν	Ε	Μ
271	Υ	ь	3	Ε	νν
272	Р	ί I	Ν	Ν	νν
273	Υ	м	3	Ν	νν
274	А	м	Ν	Ε	Μ
275	А	νν	Ν	Ε	νν
276	νν	νν	3	Ν	νν
277	Р	Μ	Ν	Ν	Μ
278	Υ	Υ	Ν	Ν	Μ
279	в	Ν	Ν	Ν	νν
280	Р	Ρ	3	Ν	νν
281	в	Ρ	Ν	Ε	νν
282	А	ί	3	Ν	Μ
283	νν	ί	3	Ε	νν
284	в	ι	3	Ε	Μ
285	νν	Μ	Ν	Ε	Μ
286	А	Μ	3	Ν	νν
287	νν	νν	Ν	Ε	Μ
288	νν	νν	3	Ν	Μ

В табл. 10 обобщенно представлены результаты анализов, анализирующих различную ферментативную активность, и характеристики экспрессирующей системы для иллюстративных ферментов по изобретению (и в случае экспрессирующей системы Р1сЫа Рак1опк - активность экспрессии нуклеиновых кислот, которые кодируют их), все из полипептидов по изобретению представляют собой варианты исходной последовательности фосфолипазы с 8ЕР ΙΌ NО: 4 (кодируемой, например, последовательностью нуклеиновой кислоты 8ЕР ΙΌ NО: 3).

- 112 022979

Таблица 10

Анализ активности и обобщение

			Анализ масла	Экспрессия в Р1сЫа Раз1оп8	Термическая устойчивость по процентной остаточной активности
Улучшен- ные мутанты РЬС О38М	Аминокис- лотный остаток улучшен- ного мутанта ОЗЗМ	ОЗЗМ Атто Αοΐά сЬап§е	% гидролиза РА через 24 ч	Активность на планшетах с яичным желтком	Экспрессируемый Е. соН белок	Экспресси- руемый ΡίΜα РаМогчз белок
Неочищенное масло			0
Е41Е	41	Дикий ТИП	20	Активный	81%	100%
Е41А	41	А	29	Активный	83%	99%
Ε41ΧΥ	41	Ψ	31	Активный	94%	Ν/Α
Е41Р	41	Р	68	Неактивный	80%	Ν/Α
Ε41Υ	41	Υ	69	Неактивный	89%	Ν/Α
Е41К	41	К	66	Активный	78%	104%
Е94К	94	К.	23	Активный	Ν/Α	Ν/Α
ОЮОЬ	100	ь	45	Активный	Ν/Α	87%
шоом	100	м	48	Активный	Ν/Α	104%
Ш00У	100	Υ	57	Активный	Ν/Α	105%
Ш00Р	100	Р	59	Активный	43%	92%
Ш00АУ	100	\ν	61	Активный	Ν/Α	91%
А104Ь	104	ь	26	Активный	115%	86%
Ш11К	111	к.	27	Активный	Ν/Α	99%
Т112К	112	к	23	Активный	107%	92%
У116\У	116	XV	23	Активный	118%	102%
Ι117ΑΥ	117	XV	15	Активный	109%	102%
Р118УУ	118		17	Активный	Ν/Α	Ν/Α
Е125К	125	к	15	Активный	99%	86%
ϋ17ΐν	171	V	29	Активный	Ν/Α	106%
Ш71Е	171	Е	44	Активный	Ν/Α	110%
Μ176ΥΥ	176	λν	42	Активный	101%	101%
Ώ230Η	230	н	21	Активный	Ν/Α	97%
Э230К	230	к	14	Активный	107%	104%
ϋ234\Υ	234		10	Активный	101%	98%
ϋ234ν	234	V	0	Активный	109%	102%
Ώ234Ο	234	О	3	Активный	109%	114%
ϋ234Κ	234	к	27	Активный	114%	90%
Ο234Κ	234	к	23	Активный	Ν/Α	101%
Ο265Κ	265	к	0	Неактивный	Ν/Α	Ν/Α
Ε41ΑΝΝΝ	41, 100, 168, 171	Α, Ν, Ν, N	72		63%
Ε41ΑΝΚΝ	41, 100, 168, 171	Α, Ν, К, N	75		65%
Ε41ΑΝΚ.Ν	41, 100, 168, 171	Α, Ν, К, N	79		75%
Ε41ΑΝ8Ν	41, 100, 168, 171	Α,Ν, 8,N	72		85%

Анализ с яичным желтком проводят следующим образом.

Планшеты с яичным желтком получают добавлением 0,5 мас.% фосфатидилхолина яичного желтка в среду перед автоклавированием. Планшеты являются более единообразными, если фосфатидилхолин диспергируют смесителем с высоким сдвиговым усилием перед автоклавированием среды.

В лунки наносят агар и в лунки добавляют равные объемы (например, 2 мл) серийных разведений образцов, включая положительный контроль.

Планшеты оставляют на 3-12 ч при 37°С, и в ходе этого времени фермент диффундирует из лунок, гидролизует лецитин яичного желтка и формирует зоны преципитации вследствие образования диацилглицерина.

Площадь в пределах кольца преципитации, измеренную как диаметр кольца или интегрированная величина плотности (ГОУ), наносят на график против стандартной кривой для положительного контроля для определения активности фосфолипазы образца. Весь процесс можно использовать для определения неизвестной активности РЬС в образце. Способ является полуколичественным.

Фосфатидилхолин (РС): от Зщша, каталожный номер № Р 5394.

РС из высушенного яичного желтка, тип Х-Е, приблизительно 60% РС согласно ТЬС.

В альтернативных вариантах осуществления изобретение относится к комбинациям или смесям ферментов по изобретению и ферментов, описанных в примере 2, включая, например, все варианты ферментов, описанные в табл. 8 и 9 и в А0 2008/036863.

Пример 3. Получение иллюстративных ферментов фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С (Р1-РЬС) по изобретению.

В этом примере описаны иллюстративные ферменты фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С (Р1-РЬС) по изобретению, включая полипептид, имеющий последовательность, как указано в ЗЕР ГО N0: 8, полипептиды, имеющие активность Р1-РЬС, как описано в табл. 12-15 и иллюстративные способы их получения и применения и анализы для определения их активности фосфолипазы.

- 113 022979

В альтернативных вариантах осуществления изобретение относится к полипептидам, имеющим активность фермента Р1-РБС. В некоторых вариантах осуществления эти полипептиды конструировали следующими способами.

Для этой серии вариантов осуществления полипептид, имеющий аминокислотную последовательность ЗЕО ГО ЫО: 6 (кодируемую, например, ЗЕО ГО ΝΌ: 5), отбирали в качестве исходной последовательности или последовательности дикого типа для дальнейшей модификации (или эволюции); в частности использовали подчеркнутую (см. ниже) подпоследовательность ЗЕО ГО ЫО: 6 (или ЗЕО ГО ЫО: 5) с добавлением начального метионина (например, МЛЗЗINV...) в качестве исходной или первоначальной последовательности для эволюции или изменения последовательности для получения вариантов ферментов. Следует отметить, что исходная или первоначальная последовательность для эволюции лишена первых 30 аминокислот, которые включают сигнальную последовательность (курсив), или МNЫККРI^К^РIСЗМV^ЗЛРVР, кодируемую, например, посредством

АТСААСААТААСААСТТТАТТТТвААОТТАТТСАТАТСТАОТАТССТАСТТАСССССТ

ТТСТАТТТ

Исходная или первоначальная последовательности для эволюции также лишена предсказанного участка расщепления (полужирный шрифт, курсив) ОСТТТС (нуклеиновая кислота) или АР (аминокислотные остатки).

Эволюцию (изменение последовательности или мутацию) проводили с использованием мутагенеза с насыщением сайта гена (ОЗЗМ) и повторной сборки гена (см. выше для описания ОЗЗМ и повторной сборки гена) на ЗЕР ГО ЫО: 5 с использованием подчеркнутых последовательностей ниже, с добавлением нуклеиновой кислоты, кодирующей исходный М или метионин (например, для кодируемой аминокислотной последовательности, МЛЗЗIЫV...) в качестве исходной или первоначальной последовательности для эволюции

ЗЕО ГО N0:5:

А ТСАА САА ТАА САА СТТТА ТТТТСАА ОТТА ТТСА ТА ТОТА СТА ТОСТА СТТА СССССТТТ

С7Л77ТСС7ТГСААТОАТААОААААССОТТОСАОСТАОСТСТАТТААТОТОСТТОАА

ААТТООТСТАОАТООАТОАААССТАТАААТСАТОАСАТАССОТТАСгСАСОААТТТСА

АТТССАСОААСАСАТОАТАОТООААСОТТСААОТТОСААААТССОАТАААОСААОТ

ОТООООААТОАСОСААСААТАТОАТТТТСОТТАТСАААТОСАТСАТССАССТАОАА

ТТТТТОАТАТААОАОООСОТТТААСАСАТОАТААТАСОАТАОТТСТТСАТСАТОООС

САТТАТАТСТТТАТОТААСАСТОСАСОААТТТАТАААССААОСОАААСААТТТТТАА

ААОАТААТССААОТОАААСОАТТАТТАТОТСТТТАААААААОАОТАТОАООАТАТО

АААООООСООАААОСТСАТТТАОТАОТАСОТТТОАОАААААТТАТТТТСОТОАТССА

АТСТТТТТАААААСАОААОООААТАТАААОСТТОСАОАТОСТСОТСООААААТТСТ

АТТАСТАААААСАТАТАОТОСТАОТААТСААТСТОСООСАТАТААТААТТТСТАТТО

СССАОАСААТОАСАСОТТТАССТСААСТАТАААТСААААТОТАААТОТААСАОТАС

ААОАТАААТАТАААОТОАОТТАТСАТСАОААААТАААСОСТАТТАААОАТАСАТТА

ААТОАААСОАТТААСААТАОТСААОАТСТТААТСАТСТАТАТАТТААТТТТАСААСС

ТТОТСТТСТООТООТАСАОСАТООААТАОТССАТАТТАТТАТССОТССТАСАТАААТС

СТОАААТТОСАААТТАТАТОААОСААААСААТССТАСОАОАСТОООСТООАТААТА

СААОАТТАТАТАААТОАААААТООТСАССАТТАСТТТАТСААОААОТТАТААОАОС

ОААТААОТСАСТТОТААААТАО

5Ер ГО N0:6:

ТНР5ОТРКЬОКР1КОУУСМТОЕУРРК¥ОМРНОАК1РР1КОКЬТРРКТ1УЬННСРЬУЬУ νΤΕΗΕΡΙΝΕΑΚΟΡΕΚΡΝΡ5ΕΤΙΙΜ§ΕΚΚΕΥΕΡΜΚΟΑΕ55Ρ55ΤΡΕΚΝΥΡΚΡΡΙΡΕΚΤΕΟΝΙ

ΚΕ0ΡΑΚ0ΚΐνΕΕΚΚΥ805ΝΕ500ΥΝΝΡΥνΡΡΝΕΤΡΤ5ΤΙΝ0ΝνΝντν0ΡΚΥΚν§ΥΡΕΚ

ΙΝΑΙΚΡΤΕΝΕΤΙΝΝ8ΕΡνΝΗΕΥΙΝΡΤ8Ε88ΟΟΤΑνΝ8ΡΥΥΥΑ8ΥΙΝΡΕΙΑΝΥΜΚΟΚΝΡΤΚ νθνΐΙΟΡΥΙΝΕΚν8ΡΙΧΥΟΕνΐΚΑΝΚ8ΕνΚ

Таким образом, исходная последовательность для ОЗЗМ представляла собой нуклеиновую кислоту, кодирующую

ΜΑ88ΙΝνΕΕΝν3ΚνΜΚΡΙΝΡΡΙΡΕΑΚΙ3ΙΡ0ΊΉΡ80ΤΡΚΙΌΝΡΙΚ0ν\ν0ΜΤ0ΕΥΡΡΚΥ0

ΜΡΗΟΑΚΙΡΡΙΚΟΚΕΤΡΡΝΤΐνΕΗΗΟΡΕΥΕΥνΤΕΗΕΡΙΝΕΑΚΟΡΕΚΡΝΡ8ΕΤΠΜ8ΕΚΚΕΥΕ

ΡΜΚΟΑΕ88Ρ88ΤΡΕΚΝΥΡΚΡΡΙΡΕΚΤΕΟΝΙΚΕΟΡΑΚΟΚΐνΕΕΚΚΥ8Ο5ΝΕ8ΟΟΥΝΝΡΥνΡ

ΡΝΕΤΡΤ8ΤΙΝ0ΝνΝντν0ΡΚΥΚν8ΥΡΕΚΙΝΑΙΚΡΤΕΝΕΤΙΝΝ8ΕΡνΝΗΕΥΙΝΡΤ8Ε8800

ΤΑνΝ8ΡΥΥΥΑ8ΥΙΝΡΕΙΑΝΥΜΚ0ΚΝΡΤΚν0νΐΙ0ΡΥΙΝΕΚν8ΡΕΕΥ0ΕΥΙΚΑΝΚ8ΕνΚ

Измененные варианты нуклеиновой кислоты (новые последовательности нуклеиновой кислоты, полученные проведением ОЗЗМ для ЗЕО ГО ЫО: 5) субклонировали для экспрессии либо в Е. сой (для фазы ОЗЗМ), либо в Р. Йиогс8ссп8 (для фазы повторной сборки генов).

ОЗЗМ проводили, как описано, например, в патентах США № 6171820; 6238884 (также см. объяснение в настоящем документе). Также см. VО 2008/036863.

Полученные новые варианты или измененные последовательности нуклеиновых кислот и полипептидов анализировали с использованием высокопроизводительного анализа следующим образом.

8ОР для высокопроизводительного анализа термической стабильности

В скрининге ОЗЗМ использовали хозяина Е. сой, ХЕ 1 В1ис (З1га1адспс, Зап Бюдо, СА), с вектором рАЗК (1ВА ОтЬН, ОоШпдсп, Германия). В скрининге повторной сборки гена использовали хозяина

- 114 022979

Рзеибошопаз Пиогезсепз (Пом С1оЬа1 ТесНпо1о§1е8 1пс., публикация патентной заявки США № 20050130160, публикация патентной заявки США № 20050186666 и публикация патентной заявки США № 20060110747) с вектором рГ)ОЖ1169 (Эом С1оЬа1 ТесНпо1о§1е8 1пс., публикация патентной заявки США № 20080058262) и проводили отбор по росту в минимальной среде М9 (Эом С1оЬа1 ТесНпо1о§1е8 1пс., публикация патентной заявки США № 20050186666).

Основные планшеты

1. Основные планшеты создавали путем отбора колоний вариантов, полученных С88М или повторной сборкой генов, в 384-луночный планшет, содержавший 50 мкл среды на лунку.

а) Среда, использованная для выращивания вариантов, полученных С88М, представляла собой ЬВ, и для вариантов, полученных повторной сборкой генов, среда представляла собой М9 (-урацил).

2. Основные планшеты выращивали в течение ночи при 30°С в инкубаторе с увлажнением, а затем добавляли 20% глицерин перед хранением планшетов при -80°С.

Планшеты для экспрессии

1. Основные планшеты размораживали при комнатной температуре или 30°С перед дублированием.

2. Основные планшет дублировали с использованием инструмента с иглами для 384-луночных планшетов для инокуляции планшетов для экспрессии, содержавших 60 мкл среды. Для планшетов для экспрессии использовали ту же среду, что и для основных планшетов.

3. Планшеты для экспрессии выращивали в течение ночи (приблизительно 16 ч) при 30°С в инкубаторе с увлажнением.

4. Планшеты для экспрессии, предназначенные для скрининга С88М, индуцировали с помощью 200 нг/мл безводного тетрациклина (АНТ) и планшеты для повторной сборки генов индуцировали 1РТС в конечной концентрация 0,3 мМ.

5. Планшеты для экспрессии инкубировали для выращивания в течение ночи в увлажненном инкубаторе при 30°С.

6. Затем планшеты для экспрессии хранили при -20°С до замораживания, как правило, в течение ночи для лизиса клеток-хозяев.

7. Перед анализом планшетов для экспрессии их размораживали при комнатной температуре или

30°С.

Роботизированный скрининг термической устойчивости

1. Автомат программировали для переноса 10 мкл из планшетов для экспрессии в планшет для анализа при КТ и в планшет для анализа при нагревании.

2. Планшет для анализа при КТ оставляли при комнатной температуре, а планшет для анализа при нагревании инкубировали при повышенной температуре в течение 1 ч. В ходе обработке нагреванием планшеты для анализа при нагревании накрывали крышкой из пенопласта. Температуры для обработки нагреванием приведены в табл. 11 ниже.

Таблица 11

Температуры для первичного и вторичного роботизированных скринингов

Скрининг	Температурная обработка вариантов, полученных О55М	Температурная обработка вариантов, полученных повторной сборкой гена
Первичный	50°С,55°С	65°С
Вторичный	57°С,60°С	70°С

3. После обработки нагреванием добавляли 40 мкл субстрата метилумбеллиферилмиоинозитолфосфата (МИР1) с использованием ШегРек. Субстрат приготавливали в концентрации 3 мМ так, чтобы конечная концентрация в планшетах для анализа составляла 2,5 мМ.

4. Планшеты для анализа инкубировали при комнатной температуре в течение 5 мин. Затем измеряли флуоресценцию в качестве относительных единиц флуоресценции (КРИ) на флуоресцентном устройстве для считывания при длине волны возбуждения 360 нм и длине волны испускания 465 нм.

Вычисление % остаточной активности

1. Каждый планшет для анализа содержал 12 положительных и 12 отрицательных контролей. Положительные контроли содержали фермент дикого типа и отрицательные контроли содержали только вектор в организме-хозяине.

2. Флуоресценцию отрицательных контролей усредняли для каждого 384-луночного планшета и вычитали из флуореценции вариантов, полученных С88М или повторной сборкой гена, для анализа планшетов при КТ и анализа планшетов при нагревании.

3. Затем результат для каждой лунки планшета для анализа при нагревании делили на результат для соответствующей лунки планшета для анализа при КТ, получая процентную остаточную активность (% КА) для каждого варианта.

4. % КА использовали для ранжирования наиболее термоустойчивых вариантов при высокопроизводительном роботизированном скрининге. Эти лучшие варианты подтверждали в дополнительных анализах.

- 115 022979

Вторичный скрининг

1. Улучшенную температурную устойчивость подтверждали с использованием вторичного скрининга отдельных лучших вариантов. Лучшие варианты отбирали из основных планшетов для первичного скрининга в новые основные планшеты и анализировали при повышенных температурах, приведенных в табл. 11. Протокол анализа был таким же, как протокол, подробно описанный выше для первичного скрининга.

Таблица 12

Обобщенно представлены последовательности и процентная (%) остаточная активность лучших термоустойчивых вариантов ΟЗЗΜ, отобранных для конструирования библиотеки для повторной сборки генов

	% остаточная активность
Положение а.к.	Положение а.к.	Новая а.к.	55°С	57°С	60°С
105	ϋ	О	81,0%	58,8%	3,5%
175	N	Р	119,9%	75,7%	2,1%
176	N	Р	136,7%	103,8%	10,1%
176	N	ь	102,2%	97,2%	9,8%
176	N	Ψ	131,9%	61,7%	3,2%
176	N	Υ	180,0%	106,0%	4,1%
191	Ω	О	124,6%	77,6%	2,3%
205	¥	ь	174,3%	114,2%	0,0%
244	N	т	174,6%	95,7%	5,0%
252	Υ	ь	148,4%	62,0%	22,2%
252	Υ	к	149,3%	187,2%	15,4%
276	Υ	Р	161,6%	112,1%	1,1%
282	δ	с	161,6%	116,4%	8,9%
282	δ	н	256,8%	142,0%	0,7%
282	δ	ь	143,6%	97,8%	0,1%
282	δ	Р	147,6%	96,8%	1,0%
282	δ	к	101,6%	72,5%	4,9%
284	ь	Р	85,9%	72%	0%
291	к	N	86,4%	75,5%	5,6%

Мутанты с точковыми мутациями и ассоциированные с ними данные для табл. 12 представлены ниже в табл. 13. Следует отметить, что в табл. 13 нумерация положений аминокислот начинается с добавленного исходного метионина (например, аминокислота М представляет собой положение 1, аминокислота А представляет собой положение 2, аминокислота З представляет собой положение 3, аминокислота З представляет собой положение 4, аминокислота I представляет собой положение 5, аминокислота Ν представляет собой положение 6 и т.д.). Важно пояснить: для вариантов ЗΕ^ ΙΌ NО: 6 нумерация аминокислотных изменений начинается с аминокислоты 31 ЗΕ^ ΙΌ NО: 6, где аминокислота 31 (А) заменена метионином (М).

Таблица 13

Положение аминокислоты	Исходная аминокислота	Новая аминокислота	50°С	55°С	57°С	60°С	Планшет КТ (данные в относительных единицах флуоресценции, ΡΡΙΙ)
5	I	К	109.5%	-72.4%	-27.7%	-83.3%	119213
10	N	Ρ	142.6%	-97.8%	-167.1%	-149.5%	47737
12	δ	С	98.6%	37.8%	19.6%	-1.6%	3926817
17	Р	к.	105.9%	70.7%	50.6%	0.6%	2834413
20	ϋ	к.	168.8%	56.2%	9.5%	-37.7%	243024
22	I	к.	164.2%	-56.3%	-8.8%	-67.9%	501992
30	Р	<3	69.1%	134.8%	119.4%	56.4%	-98428
31	о	ь	59.7%	321.6%	52.3%	66.5%	-89982
32	т	к.	112.1%	234.3%	158.3%	141.4%	-32840
32	т	Р	-12.9%	-39.0%	5.5%	56.1%	506296
32	т	N	-41.5%	25.5%	-6.8%	15.2%	215696
34	ϋ	О	111.4%	105.7%	112.3%	17.0%	292094
34	ϋ	V	98.0%	-39.1%	19.5%	-8.2%	623943
34	ϋ	δ	108.0%	118.4%	67.9%	-18.3%	400778
48	\ν	с		0.7%	-88%	48%	279831
52	Ω	с	-19.0%	-31.2%	45.1%	-11.0%	440078
52	9	ь	-24.5%	-18.9%	-17.5%	-15.0%	243731
52	Ω	к	-13.8%	-103.8%	-45.8%	-357.5%	64939
56	Ρ	Р	-19.0%	-41.0%	-17.8%	-14.6%	528700
57	к	Р		36.5%	-5%	6%	673072

- 116 022979

57	К.	н	196.2%	54.8%	11.4%	-2.7%	1766819
57	к.	XV		94.5%	32%	-4%	888544
58	Υ	о		87.4%	8%	0%	2203075
59	Ω	Р		125.1%	-1003%	211%	30707
64	А	Р		-17.1%	-38%	21%	298218
67	Р	А		-84.1%	-167%	-46%	132639
68	ϋ	О		859.6%	2454%	113%	-5565
69	I	к	550.5%	219.2%	283.9%	123.1%	-39813
69	I	8		-26.7%	4%	-2%	837975
79	I	К.	111.4%	216.0%	308.4%	539.6%	-47241
79	I	с		-9.4%	18%	-19%	901719
79	I	8		242.7%	-642%	-145%	-33068
103	ь	Е		391.0%	-504%	492%	26863
103	ь	О	312.7%	333.5%	394.9%	317.6%	-14442
103	ь	К		135.6%	279%	238%	-42440
103	ь	А		13.2%	-7%	38%	520801
103	ь	8	105.0%	48.7%	-162.4%	-90.0%	53552
103	ь	N		-331.1%	-381%	-229%	51581
104	к	Р		-1319.4%	1845%	4021%	-7815
105	ϋ	С	106.9%	81.0%	58.8%	3.5%	1739646
107	Р	н		30.7%	7%	-3%	2397754
107	Р	к.		21.4%	4%	-3%	3155286
107	Р	ь	65.8%	55.2%	34.4%	-4.7%	447512
108	8	с	95.5%	65.1%	49.6%	-4.3%	307147

110	Т	Р		-10.5%	-7%	2%	875451
по	т	К	126.1%	52.7%	18.9%	-49.3%	134884
112	I	А		-23.7%	-20%	-4%	453446
112	I	К	55.2%	95.2%	15.4%	-46.1%	59053
115	ь	Е		-102.6%	-89%	103%	48860
115	ь	N		-12.4%	-15%	-10%	1025328
115	ь	8	-5.3%	-8.9%	-10.3%	-10.1%	556124
115	ь	О	-21.1%	-36.4%	-10.3%	-41.2%	644336
115	ь	К		106.0%	-28%	-215%	-55337
116	к	т		18.1%	7%	18%	230855
116	к	V	45.1%	-4.6%	-19.7%	-14.4%	235560
116	к	ь	78.8%	-0.9%	-37.9%	-19.2%	343119
116	к	Р	97.5%	16.1%	-20.9%	-32.3%	182525
116	к	с		-26.1%	-64%	-81%	226865
116	к	Р		-560.3%	-780%	-126%	49518
116	к	Υ		-245.0%	-488%	-141%	39189
117	к	с		10.2%	-26%	-21%	387561
117	к	8		-31.6%	-25%	-23%	548036
118	Е	К		167.4%	409%	163%	-44595
118	Е	Υ		106.8%	-57%	40%	132171
118	Е	с	45.4%	-7.5%	-11.7%	-10.8%	408480
118	Е	Р	100.9%	-77.5%	-82.4%	-11.7%	227778
118	Е	XV		-140.1%	-30%	-49%	115308
118	Е	А		-61.4%	-217%	-58%	106520

117

118	Е	V		-112.9%	57%	-89%	54418
118	Е	δ	-111.6%	-294.0%	-83.6%	-172.0%	84511
118	Е	ь	-615.3%	-772.3%	-540.2%	-764.3%	6410
127	δ	о		167.2%	24%	-2%	2332741
129	Р	δ	-103.1%	-140.8%	-135.6%	-138.6%	38893
129	Р	к		166.2%	46%	-224%	-32568
130	δ	А		209.1%	13%	-3%	2817649
133	Р	δ		-96.6%	245%	124%	68055
134	Е	о		-11.5%	-6%	-6%	1437969
134	Е	Р	-50.2%	-179.6%	-112.4%	-71.5%	107620
136	N	Р		-7.0%	-9%	-7%	967546
139	К.	δ		95.2%	9%	7%	3316801
139	К.	м		65.5%	3%	-2%	3452962
139	К.	Р		176.0%	53%	-3%	2170436
140	ϋ	т		7.5%	-4%	0%	3067537
141	Р	ь		12.2%	-3%	-1%	3026938
142	I	Р	105.3%	42.2%	15.3%	-4.4%	1571795
142	I	к		-9.6%	-5%	-5%	2239061
142	I	о		-2.2%	-7%	-7%	1821775
143	Р	О		84.3%	-10%	14%	547682
143	Р	V	7.9%	-5.3%	-3.4%	-3.4%	2475003
143	Р	δ	27.1%	-10.3%	-12.1%	-11.6%	492372
143	Р	т		7.0%	-22%	-15%	1395343
144	ь	к.		-3.1%	-8%	3%	3104379

144	Ь	Р		7.8%	-2%	0%	1673141
151	К	т		112.2%	6%	0%	3537421
153	О	м		103.8%	1%	-7%	2086156
153	о	V		97.6%	-8%	-13%	1534593
154	ϋ	к.		-4.6%	-3%	-3%	1464648
155	А	к.	101.5%	149.6%	225.5%	159.3%	-37404
155	А	Р		505.6%	86%	111%	-84103
159	I	т	80.3%	9.4%	-3.2%	-4.9%	1414669
160	V	к		-72.5%	-8%	-88%	360024
162	ь	δ	77.9%	-1.3%	-0.7%	9.5%	653562
162	ь	Р		126.7%	11%	5%	2305681
162	ь	О	84.3%	14.3%	-14.4%	-24.4%	822742
162	ь	Е	-8.9%	-25.7%	-27.5%	-99.2%	255160
162	ь	ϋ		-252.6%	-180%	-107%	41739
162	ь	к	8.6%	10.3%	-856.1%	-184.2%	-45546
163	к	Е		-6.9%	-10%	10%	1257238
163	к	XV		-6.8%	-25%	-11%	935455
164	к.	ь		684.4%	2692%	890%	-11232
164	к.	т		-267.9%	-259%	-276%	35611
165	Υ	Е	4.2%	-3.1%	-3.5%	-3.1%	1330418
165	Υ	δ	-0.6%	-4.5%	-5.0%	-4.5%	1204269
165	Υ	ϋ		-9.9%	-26%	-8%	849532
165	Υ	о		-21.0%	-9%	-12%	703657
174	Υ	к.	-27.9%	-10.0%	-12.8%	-11.4%	478910

- 118 022979

175	Ν	Ρ	186.8%	119.9%	75.7%	2.1%	3423684
176	Ν	Ρ	151.7%	136.7%	103.8%	10.1%	3166873
176	Ν	ь	159.0%	102.2%	97.2%	9.8%	1973048
176	Ν	Υ	215.1%	180.0%	106.0%	4.1%	2686812
176	Ν	У	153.3%	131.9%	61.7%	3.2%	3375824
179	У	V		654.7%	-2109%	736%	21624
179	У	ь		211.2%	-87%	-107%	66095
187	8	V		81.7%	20%	9%	3668103
191	<2	° С	141.5%	124.6%	77.6%	2.3%	4030462
193	V	ь	229.3%	177.3%	85.1%	-0.3%	2339956
196	τ	Ρ	253.8%	195.0%	122.7%	363.7%	-81049
197	V	к.	84.1%	159.2%	43.9%	67.0%	-67056
201	Υ	к		97.6%	244%	571%	-94821
201	Υ	А		105.4%	168%	262%	-79800
201	Υ	ь	114.7%	108.5%	94.5%	111.0%	-69345
201	Υ	Р		99.5%	87%	109%	-77061
201	Υ	<2	103.9%	100.2%	114.2%	100.9%	-78259
201	Υ	Е	98.4%	196.7%	94.8%	22.0%	-75564
201	Υ	8	93.7%	276.0%	-294.6%	-67.2%	-89008
201	Υ	н		-469.7%	-450%	-233%	38056
205	Υ	ь	176.2%	174.3%	114.2%	-0.4%	6193145
206	Б	с		68.6%	7%	2%	2578407
208	к	8		-95.6%	-56%	-50%	101991
215	τ	Ь	241.1%	100.4%	42.5%	-2.6%	2276174

216	Ь	А		2.1%	-22%	9%	739181
222	N	Р		-1.8%	-27%	16%	605972
238	8	0	188.7%	120.1%	64.7%	-8.5%	1960910
244	N	Т	147.2%	174.6%	95.7%	5.0%	3312364
244	N	8	144.6%	234.0%	148.4%	1.1%	2624829
252	Υ	Ь	131.0%	148.4%	62.0%	22.2%	6033264
252	Υ	К	220.0%	149.3%	187.2%	15.4%	3753916
252	Υ	1		96.9%	41.4%	3.9%	10341043
261	м	I	129.8%	117.8%	90.7%	-1.0%	3413811
268	к	8		-22.2%	-19%	-23%	353376
268	к	ь		-513.9%	-333%	-149%	49591
272	I	8	163.2%	519.8%	300.9%	1188.1%	-42385
272	I	К.	4.9%	485.2%	277.9%	404.0%	-76173
272	I	О		20.2%	161%	102%	-85289
272	I	Е	199.6%	142.4%	163.1%	97.2%	-65592
272	I	N		-91.2%	-208%	-77%	99735
272	I	Р	92.7%	-130.0%	-142.8%	-113.3%	73365
276	Υ	Р	193.7%	161.6%	112.1%	1.1%	2536481
282	8	с	153.5%	161.6%	116.4%	8.9%	1804086
282	8	к	108.4%	101.6%	72.5%	4.9%	3108844
282	8	Р	158.8%	147.6%	96.8%	1.0%	3082327
282	8	н	193.9%	256.8%	142.0%	0.7%	1966076
282	8	ь	164.4%	143.6%	97.8%	0.1%	2208563
282	8	Е	159.0%	199.7%	77.4%	-1.0%	2499129

119

282	8	V		116.8%	6%	-3%	2625324
282	8	к	180.0%	181.2%	93.1%	-5.0%	1412699
282	8	Р	144.9%	113.1%	28.7%	-5.1%	1668567
284	Ь	Р		85.9%	72%	-1%	3744515
287	<2	ь	106.5%	68.1%	34.0%	-7.2%	2032181
291	к	N	143.8%	86.4%	75.5%	5.6%	3463258
296	ь	Е		-169.4%	20%	31%	188612
О	грицательный кон	ггроль		103.5%	130%	182%	-60543
Отрицательный контроль	161.4%	136.6%	156.0%	157.1%	-47900
Отрицательный контроль		450.3%	69%	156%	-63840
Отрицательный контроль		125.1%	267%	137%	-67530
Отрицательный контроль	483.8%	140.8%	138.9%	135.3%	-33533
Отрицательный контроль	508.5%	123.0%	138.5%	116.6%	-44840
Отрицательный контроль		104.3%	119%	114%	-58308
Отрицательный контроль	150.3%	96.9%	96.4%	89.8%	-57605
Положительный контроль		106.8%	12%	6%	3745053
Положительный контроль		122.1%	3%	6%	2931573
Положительный контроль		106.6%	8%	6%	3418796
Положительный контроль	92.3%	70.7%	55.1%	3.9%	5793014
Положительный контроль		55.1%	7%	2%	3312736
Положительный контроль	153.4%	89.3%	51.6%	1.3%	4765881
Положительный контроль	132.9%	70.0%	34.0%	0.4%	5520616
Положительный контроль	154.3%	80.7%	17.6%	-0.7%	4018936

Повторную сборку гена проводили для нуклеиновых кислот, как описано в настоящем документе, с использованием наилучших термостабильных мутантов из фазы С88М; и условий для вариантов повторной сборки генов, описанных выше в разделе под названием 8ОР для высокопроизводительного анализа термической стабильности, этого примера выше. (Для повторения: нуклеиновые кислоты, кодирующие тридцать одну (31) аминокислоту 8Е^ ГО ЫО: 6 (кодируемой, например, 8Е^ ГО ЫО: 5) удаляли, и нуклеотиды, кодирующие исходный метионин, добавляли с получением нуклеиновой кислоты, которая была изменена в С88М и повторной сборке гена).

Наилучшая комбинация вариантов фермента после повторной сборки гена (для термостабильных мутантов из фазы С88М) указана в табл. 14 ниже. Изобретение относится к ферментам и нуклеиновым кислотам, кодирующим их, содержащим одно, несколько или все из аминокислотных изменений, описанных в табл. 14. Например, из первой строки табл. 14 один иллюстративный фермент по изобретению представляет собой фермент, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в 8Е^ ГО ЫО: 6, но со следующими аминокислотными изменениями: Ν176Ρ, ^191Θ, У205Ь, Ы244Т, Υ252Ρ, Υ276Ρ, 8282Н, Ь284Р и/или Ρ291Ν.

Данные по активности для этих иллюстративных ферментов по изобретению указаны в табл. 15 ниже.

Таблица 14

Наилучшая комбинация вариантов ферментов для повторной сборки генов

Ю

Аминокислотная замена

N175

N176

0191

Υ205

N244

Υ252

Υ276

8282

ί.284

В291

А1

Р

6

т

в

Р

Н

Р

N

В1

Р

Υ

Υ178Η

6

ь

т

к

Р

Н

N

3

Р

Υ

с

1

т

к

Р

н

г

N

4

Р

ь

(3

1

т

к

Р

ь

Р

N

5

Р

с

т

В

Р

н

N

6

Р

Υ

с

ь

В

Μ261Ι

Р

в

N

8

Р

Υ

е

1

т

Р

Р

в

N

В2

Р

Р

с

1

т

1

Р

н

N

11

Р

с

т

Р

Р

к

N

12

Υ

с

ι

т

Р

н

Р

N

14

Р

Р

с

ь

т

Р

Р

ь

Р

N

С2

Р

с

1

т

Р

Μ261Ι

Р

н

N

17

Р

Υ

Θ

ί

т

Р

Р

ί

Р

N

18

Р

с

т

Р

Р

н

Р

20

Р

с

1

т

Р

Р

н

Р

N

21

ί

с

ь

т

Б

Р

н

Р

22

Р

Υ

с

ь

т

Р

н

N

23

Р

с

т

Р

Р

в

Р

24

Р

Υ

с

ί

т

ь

Р

в

Р

А4

Р

с

1

т

1

Р

к

Р

26

Р

с

I.

т

1

Р

в

27

Υ

с

ί.

т

Р

Р

н

Р

N

28

Р

с

1

Р

Р

н

Р

N

29

Р

Р

с

ь

т

I.

Р

н

Р

N

30

Р

ί

т

Р

Р

Р

Р

32

Р

νν

с

1

т

Р

Р

в

Р

33

Р

Υ

ь

т

Р

Р

н

Р

N

34

Р

Υ

с

т

ί

Р

в

Р

N

- 120 022979

Данные для вариантов, полученных повторной сборкой гена, представляют собой

Таблица 15

32

11242

18.88

Р

χν

о

ь

т

к

Р

к.

Р

33

121.27

15.74

Р

Υ

ь

т

к.

Р

н

Р

N

34

88.4

30.67

Р

Υ

о

т

ь

Р

к.

Р

N

35

109.4

58.72

Р

О

ь

т

к

Р

к

Р

N

36

90.24

18.57

Р

XV

О

ь

т

ь

Р

к

N

37

92.94

16

Р

О

ь

т

ь

Р

Р

39

104.51

19.07

Р

О

т

ь

Р

н

Р

N

40

102.54

57.09

Р

Υ

о

т

к.

Р

к.

Р

N

41

94.23

27.83

Р

О

ь

т

Р

к.

Р

N

42

112.91

16.34

Р

Υ

О

т

к

Р

к

Р

N

43

168.76

15.56

Р

Υ

О

ь

ь

н

Р

N

44

254.08

28.87

Р

XV

О

ь

т

к.

Р

к.

Р

45

141.67

15.51

Р

Υ

о

т

к.

Р

N

46

175.31

23.58

Р

XV

О

ь

т

ь

Р

к.

47

172.6

35.64

Р

Υ

О

ь

ь

Р

к.

Р

N

48

109.25

15.12

Р

Υ

О

ь

ь

н

Р

49

95.01

15.33

Р

О

т

к.

Р

н

N

50

81.01

16.01

ь

О

ь

т

ь

Р

н

51

109.05

15.06

Р

Р

о

ь

к

н

Р

N

52

84.83

15.32

Р

Υ

о

т

ь

Р

ь

Р

53

97.17

16.81

Υ

о

ь

к

Р

н

Р

N

Ν210Ν

54

127.34

15.05

Р

О

ь

к

н

N

55

97.32

15.11

Р

XV

О

ь

к

Р

Р

Р

57

149.08

19.49

Р

Υ

О

ь

т

к

к.

Р

58

106.56

17.47

Р

Р

о

ь

т

ь

Р

н

59

89.33

15.06

Р

Р

ь

т

к

Р

н

N

60

89.94

17.85

Р

XV

О

ь

т

ь

Р

к.

Р

61

108.91

17.96

Р

О

ь

т

ь

н

Р

N

Главный лучший вариант, полученный повторной сборкой гена, = О2, или δЕ^ ГО NО: 8, кодируемой ГО N3: 7

121

5Е(} ГО N0:7:

АТООСТАОСТСТАТТААТОТОСТТОААААТТСОТСТАОАТООАТОАААСС

ТАТАААТОАТОАСАТАССОТТАОСАСОААТТТСААТТССАООААСАСАТО

АТАОТООААСОТТСААОТТОСААААТССОАТАААОСААОТОТООООААТО

АСОСААОААТАТОАТТТТСОТТАТСАААТООАТСАТООАОСТАОААТТТТ

ТОАТАТААОАОООСОТТТААСАОАТОАТААТАСОАТАОТТСТТСАТСАТО

ООССАТТАТАТСТТТАТОТААСАСТОСАСОААТТТАТАААСОААОСОААА

СААТТТТТААААОАТААТССААОТОАААСОАТТАТТАТОТСТТТАААААА

АОАОТАТОАООАТАТОАААОСООССОАААССТСАТТТАОТАОТАСОТТТО

АОАААААТТАТТТТСОТОАТССААТСТТТТТАААААСАОААООАААТАТА

ААОСТТООАОАТОСТСОТОООААААТТОТАТТАСТАААААОАТАТАОТОО

ТАОТААТОААТСТОООООАТАТААТТТТТТСТАТТООССАОАСААТОАОА

СОТТТАССТСААСТАТАААТООТААТОТАААТОТААСАОТАСААОАТААА

ТАТАААОТОАОТТТСОАТОАОААААТАААСОСТАТТАААОАТАСАТТААА

ТОАААСОАТТААСААТАОТОААОАТОТТААТСАТСТАТАТАТТААТТТТА

СААОСТТОТСТТСТООТООТАСАОСАТООАСОАОТССАТАТТАТТАТОСО

ТССАООАТАААТССТОАААТТОСАААТТАТАТТААОСААААОААТССТАС

ОАОАОТОООСТООАТААТАСААОАТТТТАТАААТОАААААТООСАТССАТ

ТАСТТТАТСААОААОТТАТАААТОСОААТААОТСАСТТОТААААТОА

ЗЕ(} ГО N0:8:

ΜΑδδΙΝνΕΕΝνδΚνΜΚΡΙΝΟϋΙΡΕΑΚΙδΙΡΟΤΗϋδΟΤΡΚΕρΝΡΙΚρνλνΟΜΤ

ΟΕΥΟΡΚΥΟΜϋΗΟΑΚΙΡϋΙΚΟΚΕΤΟΟΝΤίνΕΗΗΟΡΕΥΕΥνΤΕΗΕΡΙΝΕΑΚΟΡΕΚΟΝ

ΡδΕΤΙΙΜδΕΚΚΕΥΕϋΜΚΟΑΕδδΡδδΤΡΕΚΝΥΡΐωΡΙΡΕΚΤΕΟΝΙΚΕΟΟΑΚ.ΟΚΐνΕΕΚ

ΚΥδΟδΝΕδΟΟΥΝΡΡΥΨΡΟΝΕΤΡΤδΤΙΝΟΝνΝντνΟΟΚΥΚνδΕϋΕΚΙΝΑΙΚΟΤΕΝΕ

ΤΙΝΝδΕΟνΝΗΕΥΙΝΡΤδΕδδΟΟΤΑλνΤδΡΥΥΥΑδΚΙΝΡΕΙΑΝΥΙΚρΚΝΡΤΚνΟλνΠΟΟ

ΡΙΝΕΚνΉΡΙΧΥΟΕνίΝΑΝΚδΕνΚ

Данные скрининга в масле: мелкомасштабный скрининг на содержание фосфолипидов для лучших вариантов, полученных повторной сборкой гена, обобщен в таблице ниже. Масла обрабатывали (или не обрабатывали в случае контроля) ферментом, как описано в протоколе под названием методика мелкомасштабного скрининга масла ниже. Затем образцы анализировали в отношении содержания фосфолипидов с помощью ЯМР с использованием следующего протокола.

Методика мелкомасштабного скрининга в масле.

Задача: исследовать активность сРРС и ΓΙ-РЬС в неочищенном соевом масле в моменты времени в ходе ферментативной реакции.

Масло:

неочищенное соевое масло,

РРА: 0,24%, рН: 6,97,

ЭАО: 0,27% 1,2+0,24% 1,3=0,51% общего ЭАО,

РЬ: 0,21% РА, 0,43% РЕ, 0,25% И, 0,44% РС (1,34% общие РЬ);

без ЬРА, 0,01% ЬРЕ, без ЬР^ 0,02% ЬРС, без 1-ЬРЬ; 0,01% А, без Е, Ι или С; общее содержание фосфора 661 м.д., из которых 628,6 м.д. из РЬ,

СР: 742 м.д. Р, 73,8 м.д. Са, 69,8 м.д. Мд, 0,0 м.д. Рс.

Ферменты:

измененная фосфолипаза 8 (пример 2, табл. 9) - 11,5 единиц/мг, требуется 5,5 единиц х 15 образцов = всего 82,5 единиц/11,5 единиц/мг ~ 7 мг, взвесить 12,1 мг х 11,5 Е/мг = 139,15 единиц, ресуспендированных в 120 мкл 20 мМ Нсрсз рН 7,4, 1 мМ 7п80₄ =1,16 единиц/мкл, требуется 5,5 единиц в 10 мкл,

5,5 единиц/(1,16 единиц/мкл) = 4,7 мкл + 5,3 мкл = 10 мкл, приготовить исходный раствор 94 мкл, 1,16 единиц/мкл и 106 мкл 20 мМ Нсрсз, рН 7,4, 1 мМ 7п80₄. Добавить 10 мкл в реакционную смесь,

8РО ГО N0: 8-4,2 единиц/мг, требуется 0,02 единиц х 15 образцов = всего 0,3 единицы/4,2 единиц/мг ~ 1 мг, взвесить 4,2 мг х 4,2 Е/мг = 17,64 единиц, ресуспендировать в 120 мкл 20 мМ Нсрсз рН 7,4, 1 мМ

7п80₄ = 0,147 единиц/мкл, требуется 0,02 единиц в 10 мкл,

- 122 022979

0,02 единиц/(0,147 единиц/мкл) = 0,14 мкл + 9,86 мкл = 10 мкл, приготовить исходный раствор: 3 мкл, 0,147 единиц/мкл и 197 мкл 20 мМ Нере8 рН 7,4, 1 мМ Ζπ8Ο.·|. Добавить 10 мкл в реакционную смесь.

Условия реакции:

мл масла разделяли на аликвоты в 2-мл пробирки с использованием С1|8оп й181птап.

Масло предварительно нагревали при 60°С, качая при 1400 об/мин в термосмесителе в течение ~30 мин, а затем добавляли фермент.

Образцы удаляли в определенные моменты времени.

Непосредственно после удаления образцов в определенные моменты времени образцы приготавливали для анализа ЯМР. Добавление детергента для ЯМР, рН 10,5 должно было остановить ферментативную реакцию.

Приготовление реагентов, стандартов и образцов определения с помощью ³¹Р-ЯМР фосфолипидов и продуктов.

Использовали два внутренних стандарта ³¹Р либо ТМР (2,2,6,6-тетраметилпиперидин)/трибутилфосфат (ТВР), либо ТМР/триметилпсорален (Т1Р) при рН 10,5. Т1Р является наименее подверженным спектральному перекрыванию, однако он обладает более длительным временем релаксации (2,76 с) по сравнению с 1,02 с для ТВР. ТВР соответствует величинам Т₁ для РС, РЕ и Р1, в то время как Т1Р более соответствует РА. Коэффициенты насыщения вычисляли из данных, полученных с нормальной задержкой цикла повторения, составляющей 1,74 с против цикла повторения 21,6 с, с использованием угла наконечника 58° для оптимального отношения 8/Ν на единицу времени с использованием Т1Р. Это, вероятно, является предпочтительным способом. Хотя ТВР и является более эффективным вследствие короткого Т_ь он имеет промежуточное значение химического сдвига между Р1 и РС и является высокозависимым от температуры и имеет проблему перекрывания.

Это обеспечивает следующие преимущества:

(ί) рН 10,5 точно отделяет ЬР1 от РЕ (они перекрываются при рН 8,6 и 9,5), (ΐΐ) внутренние стандарты ТВР и Т1Р позволяют более быстрые задержки цикла повторения ЯМР с улучшением 8/Ν приблизительно 2,8 в единицу времени, (ΐΐΐ) обеспечивает внутреннюю проверку обоих эталонов как 2 мМ ТВР/Т1Р, так и 2 мМ ТМР, (ΐν) позволяет выбирать различные условия ЯМР, исходя из потребностей (РЬ или продукты, например).

Приготовление реагентов.

1. 5% дезоксихолевая кислота (ЭОС): растворить 5,0 г соли №·ι дезоксихолевой кислоты в 100 мл воды категории ВЭЖХ.

2. 50 мМ ЭДТА/112,5 мМ ТК18: к 100 мл воды категории ВЭЖХ добавить 1,46 г кислоты ЕИТА и 1,3624 г основания ТК18.

3. Детергент 5:4 ИОС/(ЕПТА/ТК18), рН 10,5: смешать 50 мл ЭОС №·ι и 40 мл ЕЭТА/ТК18. Добавлять порционно гранулы КОН до рН 10,5 (несколько гранул). Этот детергент содержит 50 мМ ТК18 для забуферивания рН.

4. В общем, для получения 900 мл детергента: 25 г ЭОС, 5,84 г ЕИТА, 5,45 г основания Тг18, 900 мл Н₂О, довести рН до 10,5 с использованием гранул КОН.

5. Внутренний стандарт 50 мМ ТМР и 50 мМ ТВР в изопропаноле категории ВЭЖХ (1РА): сначала приготовить 100 мМ ТМР (М\У 140,08) и 100 мМ ТВР (М^ 266,32) в 1РА соответственно, а затем перемешать их при соотношении 1:1. Приготавливать свежий исходный раствор каждую неделю анализа и хранить его при 4°С для поддержания стабильности.

Приготовление стандартов и образцов.

6. Калибровочный раствор РЬ: точно отвесить (±0,1 мг) приблизительно 10 мг лецитина АуапИ Ьеа1Ып (РА 5,9%, РЕ 10,4%, Р1 8,3%, РС 14,0%, ЬРС 0,5%) в 2-мл колбу. Добавить 40 мкл внутреннего стандарта 50 мМ ТМР/50 мМ ТВР, 100 мкл И₂О и 860 мкл детергента и тщательно перемешать встряхиванием в течение полуаса и отобрать 500 мкл прозрачного водного раствора в стандартную 5-мм пробирку для ЯМР после центрифугирования в течение некоторого времени*. Концентрации ТМР и ТВР составляют 2000 и 2000 мкМ соответственно; молекулярные массы РА, РЕ, Р1, РС и РЬС составляют приблизительно 697, 716, 857, 758 и 496 соответственно, таким образом, для лецитина АуапИ ЬескЫп концентрация составляет 10,0 мг/мл, для РА она составляет 0,846 мМ, для РЕ она составляет 1,453 мМ, для Р1 она составляет 0,968 мМ, для РС она составляет 1,847 мМ и для ЬРС она составляет 0,101 мМ.

7. Раствор образца неочищенного соевого масла: встряхнуть масло и аккуратно отвесить (±0,2 мг) приблизительно 100 мг масла в 2-мл колбу. Добавить 100 мкл И₂О и 900 мкл детергента и тщательно перемешать встряхиванием в течение получаса. После центрифугирования в течение некоторого периода времени отобрать 600 мкл прозрачного водного раствора в колбу* и добавить 24 мкл внутреннего стандарта 50 мМ ТМР/50 мМ ТВР и тщательно перемешать, затем отобрать 500 мкл прозрачного водного раствора в стандартную 5-мм пробирку для ЯМР.

8. Раствор образца рафинированного масла: встряхнуть масло и аккуратно отвесить (±0,2 мг) при- 123 022979 близительно 250 мг масла в 2-мл колбу. Добавить 100 мкл Ό₂Ο и 900 мкл детергента и смесь тщательно перемешать встряхиванием в течение получаса. После центрифугирования в течение некоторого периода времени, отобрать 600 мкл прозрачного водного раствора в колбу* и добавить 24 мкл внутреннего стандарта 50 мМ ТМР/50 мМ ТВР и тщательно перемешать, а затем отобрать 500 мкл прозрачного водного раствора в стандартную 5-мм пробирку для ЯМР.

9. Раствор образца камеди: отвесить приблизительно 10 мг камеди (±0,1 мг) (не более 11 мг) в 2-мл колбу. Добавить 40 мкл внутреннего стандарта 50 мМ ТМР/12,5 мМ ΤΒΡ, 100 мкл Ό₂Ο и 860 мкл детергента и тщательно перемешать встряхиванием в течение получаса, отобрать 500 мкл прозрачного водного раствора в стандартную 5-мм пробирку для ЯМР после центрифугирования в течение некоторого периода времени*.

(*Раствор образца становится двухслойным после центрифугирования. Для переноса нижнего слоя прозначного раствора в пробирку для ЯМР используют шприц с иглой. Использовать осторожно, чтобы не повредить верхний слой).

10. Раствор образца неочищенного масла канолы: встряхнуть масло и аккуратно отвесить (±0,2 мг) приблизительно 250 мг масла в 2-мл колбу. Добавить 100 мкл Ό₂Ο и 900 мкл детергента и тщательно перемешать встряхиванием в течение получаса. После центрифугирования в течение некоторого периода времени отобрать 600 мкл прозрачного водного раствора в флакон* и добавить 24 мкл внутреннего стандарта 50 мМ ТМР/50 мМ ТВР и тщательно перемешать, затем отобрать 500 мкл прозрачного водного раствора в стандартную 5-мм пробирку для ЯМР.

11. Раствор образца отработанной воды: оценить об.% масла в отработанной воде. Встряхнуть отработанную воду и отобрать 0,5 мл в 2-мл колбу и аккуратно ее взвесить (приблизительно 500 мг). Добавить 100 мкл Ό₂Ο и приблизительно 400 мкл детергента для получения 1 мл раствора (исключая масло, удерживаемое отработанной водой) и тщательно перемешать встряхиванием. После центрифугирования в течение некоторого времени отобрать 600 мкл прозрачного водного раствора в колбу* и добавить 24 мкл внутреннего стандарта 50 мМ ТМР/50 мМ ТВР и тщательно перемешать, затем отобрать 500 мкл прозрачного водного раствора в стандартную 5-мм пробирку для ЯМР.

(*Раствор образца становится двухслойным после центрифугирования. Для переноса нижнего слоя прозначного раствора в пробирку для ЯМР используют шприц с иглой. Использовать осторожно, чтобы не повредить верхний слой).

Сбор данных для определения с помощью ³¹Р-ЯМР фосфолипидов и продуктов

Набор параметров для данных установить для автоматизированной работы Κ,ΌΝΝΜΚ™ (Нгикег Βίοδр^η Согрогайоп, Ргетоп!, СА) с углом наконечника 58°, означающим высокую мощность по умолчанию. Поместить образец в пробоотборник с помощью команд е_)/г). Проверить ей!е = 300,0. В Τοрδр^η сначала применить действие граг и считать набор параметров Ρ31-ΤΒΡ-ΤΜΡ-к!й. Перейти в окно получения информации посредством асс|и и настроить пробоотборник ΟΝΡ как для 31Р, так и для 1Н с использованием команды »оЬЬ. Выбрать е_|, а затем продолжать с помощью автоматики IсοηNΜΡ с использованием той же таблицы параметров. При автоматизации образцы выстраиваются в очередь и анализируются по очереди путем предварительного заклинивания. Редактируемыми параметрами являются Νδ и Ό1. Для отведенного времени Νδ=512-2048 обеспечить надлежащее δ/Ν. Коэффициенты масштабирования для учета различного времени релаксации аккумулировались и должны были быть проверены анализом образца лецитина Αν^ίί с любыми образцами.

- 124 022979

Данные скрининга в масле (малый масштаб, содержание фосфолипидов) для лучших вариантов, полученных повторной сборкой генов

Таблица 16

Масло	Обработка ферментом	Масло: Смесь	Масса масла (мг)	РА(%)	РЕ(%)	РИ%)	РС(%)	Общие РЬ (%)	ЬРА(%)
Неочищенное соевое масло	Р1-РЬС А1	200 мг	210.8	0.24	0.42	0.07	0.40	1.13	0.00
Неочищенное соевое масло	ΡΙ-РЬС А1	200 мг	214.7	0.23	0.42	0.06	0.39	1.09	0.00
Неочищенное соевое масло	ΡΙ-РЬС В1	200 мг	211.4	0.24	0.47	0.05	0.44	1.20	0.00
Неочищенное соевое масло	ΡΙ-РЬС В1	200 мг	214.5	0.24	0.44	0.18	0.43	1.28	0.00
Неочищенное соевое масло	Р1-Р1 С В2	200 мг	210.9	0.26	0.48	0.07	0.47	1.28	0.00
Неочищенное соевое масло	Р1-РЬС В2	200 мг	211.4	0.26	0.48	0.06	0.47	1.26	0.00
Неочищенное соевое масло	Р1-РЬС 02	200 мг	211.6	0.25	0.47	0.05	0.45	1.22	0.00
Неочищенное соевое масло	Р1-РЬС 02	200 мг	210	0.24	0.45	0.05	0.43	1.18	0.00
Неочищенное соевое масло	Р1-РЬС А4	200 мг	209.9	0.24	0.43	0.15	0.41	1.23	0.01
Неочищенное соевое масло	Р1-РЬС А4	200 мг	208.5	0.25	0.46	0.10	0.43	1.24	0.00
Неочищенное соевое масло	Р1-РЬС νντ (ЗЕО Ю N0:6)	200 мг	212	0.22	0.41	0.20	0.41	1.24	0.00
Неочищенное соевое масло	Р1-РЬС νντ (ЗЕО Ю N0:6)	200 мг	209.4	0.24	0.46	0.16	0.43	1.29	0.02
Неочищенное соевое масло	Без фермента	200 мг	211.3	0.21	0.39	0.22	0.38	1.20	0.00
Неочищенное соевое масло	Без фермента	200 мг	209.9	0.26	0.44	0.26	0.41	1.37	0.00
Неочищенное масло канолы	Без фермента	200 мг	194.7	0.17	0.13	0.20	0.34	0.85	0.00
Неочищенное масло канолы	Без фермента	200 мг	194.9	0.17	0.14	0.21	0.34	0.85	0.00
Неочищенное масло канолы	Без фермента	200 мг	196.1	0.18	0.14	0.22	0.35	0.89	0.00

Таблица 17

Масло	1 РЕ(%)	ЬРК%)	ЬРС(%)	1- ЬРА(%)	1- ЬРЕ(%)		1- ЬРС(%)	А(%)	Е(%)	!(%}	С(%)	Общий Р (М.Д.)	Общий Р из РЬ (м.д.)
Неочищенное соевое масло	0.01	0.00	0.02	0.00	0.00	0.01	0.00	0.01	0.00	0.02	0.00	644	478
Неочищенное соевое масло	0.01	0.00	0.02	0.00	0.00	0.01	0.00	0.01	0.00	0.02	0.00	646	462
Неочищенное соевое масло	0.01	0.00	0.02	0.00	0.00	0.02	0.00	0.01	0.00	0.02	0.00	725	510
Неочищенное соевое масло	0.01	0.00	0.02	0.00	0.00	0.00	0.00	0.01	0.00	0.00	0.00	640	535
Неочищенное соевое масло	0.01	0.00	0.02	0.00	0.00	0.00	0.00	0.01	0.00	0.03	0.00	729	540
Неочищенное соевое масло	0.01	0.00	0.02	0.00	0.00	0.02	0.00	0.01	0.00	0.03	0.00	755	534
Неочищенное соевое масло	0.02	0.00	0.02	0.00	0.00	0.03	0.00	0.01	0.00	0.03	0,00	729	516
Неочищенное соевое масло	0.01	0.00	0.03	0.00	0.00	0.01	0.00	0.01	0.00	0.03	0.00	733	498
Неочищенное соевое масло	0.02	0.01	0.03	0.00	0.00	0.02	0.00	0.01	0.00	0.02	0.00	701	515
Неочищенное соевое масло	0.01	0.00	0.02	0.00	0.00	0.02	0.00	0.01	0.00	0.03	0.00	700	522
Неочищенное соевое масло	0.01	0.01	0.02	0.00	0.00	0.02	0.00	0.01	0.00	0.00	0.01	657	518
Неочищенное соевое масло	0.01	0.00	0.02	0.00	0.00	0.03	0.00	0.01	0.00	0.00	0.00	737	540
Неочищенное соевое масло	0.01	0.02	0.02	0.00	0.00	0.02	0.00	0.01	0.00	0.00	0.00	608	499
Чеочищенное^оевое	0.01	0.01	0.02	0.00	0.00	0.02	0.00	0.01	0.01	0.00	0.02	759	569
Неочищенное масло канолы	0.02	0.02	0.04	0.00	0.00	0.02	0.00	0.02	0.00	0.00	0.00	480	348
Неочищенное масло канолы	0.01	0.01	0.04	0.00	0.00	0.01	0.00	0.01	0.00	0.00	0.00	474	349
Неочищенное масло канолы	0.01	0.01	0.04	0.00	0.00	0.01	0.00	0.01	0.00	0.00	0.00	484	365

Усредненные данные

Таблица 18

Масло	Обработка ферментом	РА(%)	РЕ(%)	РК%)	РС{%)	Общие РЬ (%)	ЬРА(%)	ЬРЕ(%)	Ι ΡΙί%ϊ	ЬРС(%1
Неочищенное соевое масло	ΡΙ-РЬС А1	0.24	0.42	0.06	0.39	1.11	0.00	0.01	0.00	0.02
Неочищенное соевое масло	ΡΙ-РЬС В1	0.24	0.45	0.12	0.43	1.24	0.00	0.01	0.00	0.02
Неочищенное соевое масло	ΡΙ-РЬС В2	0.26	0.48	0.06	0.47	1.27	0.00	0.01	0.00	0.02
Неочищенное соевое масло	ΡΙ-РЬС Θ2	0.24	0.46	0.05	0.44	1.20	0.00	0.01	0.00	0.03
Неочищенное соевое масло	ΡΙ-РЬС А4	0.24	0.45	0.13	0.42	1.24	0.01	0.01	0.00	0.02
Неочищенное соевое масло	ΡΙ-РЬС νντ (ЗЕО Ю N0:6)	0.23	0.44	0.18	0.42	1.27	0.01	0.01	0.01	0.02
Неочищенное соевое масло	Без фермента	0.23	0.42	0.24	0.40	1.29	0.00	0.01	0.01	0.02
Неочищенное масло канолы	Без фермента	0.17	0.14	0.21	0.34	0.87	0.00	0.01	0.01	0.04

- 125 022979

Таблица 19

Усредненные данные

Масло	11 РА(%)	1- ίΡΕί%)	1- ЬРИ%)	1- ЬРС(%)	Αί%1	Е(%)	1(%)	С(%)	Общий Р (М.Д.)	Общий Р из РЬ (м.д.)
Неочищенное соевое масло	0.00	0.00	0.01	0.00	0.01	0.00	0.02	0.00	645.40	470.17
Неочищенное соевое масло	0.00	0.00	0.01	0.00	0.01	0.00	0.01	0.00	682.44	522.47
Неочищенное соевое масло	0.00	0.00	0.01	0.00	0.01	0.00	0.03	0.00	741.94	536.72
Неочищенное соевое масло	0.00	0.00	0.02	0.00	0.01	0.00	0.03	0.00	730.76	506.92
Неочищенное соевое масло	0.00	0.00	0.02	0.00	0.01	0.00	0.02	0.00	700.48	518.82
Неочищенное соевое масло	0.00	0.00	0.02	0.00	0.01	0.00	0.00	0.00	697.17	528.75
Неочищенное соевое масло	0.00	0.00	0.02	0.00	0.01	0.00	0.00	0.01	683.32	533.87
Неочищенное масло канолы	0.00	0.00	0.01	0.00	0.02	0.00	0.00	0.00	479.51	354.10

Крупномасштабное рафинирование с помощью Р1-РЬС и еРЬС или Р1-РЬС с РЬС (8ЕЦ ΙΌ NО: 2), результаты обобщенно представлены в табл. 20, 21 и 22 ниже. Масла обрабатывали (или не обрабатывали в случае контроля) ферментом с использованием этой методики крупномасштабного скрининга в масле.

Методика крупномасштабного скрининга в масле.

Задача: сравнить активность РЬС, Р1-РЬС, измененных РЬС (или еРЬС) согласно примеру 2 выше, в 2 кг неочищенного соевого масла.

Масло:

неочищенное соевое масло,

РРА: 0,24%, рН: 6,97,

ΌΑΟ: 0,27% 1,2+0,24% 1,3=0,51% общего ΌΑΟ,

РЬ: 0,21% РА, 0,43% РЕ, 0,25% Р1, 0,44% РС (1,34% общие РЬ);

без ЬРА, 0,01% ЬРЕ, без ЬР1, 0,02% ЬРС, без 1-ЬРЬ; 0,01% А, без Е, I или С; общее содержание фосфора 661 м.д., из которых 628,6 м.д. из РЕ,

СР: 742 м.д. Р, 73,8 м.д. Са, 69,8 м.д. Мд, 0,0 м.д. Ре.

Ферменты:

РЕС (8ЕЦ ΙΌ Ν3: 2), требуется 5,5 единиц = 200 м.д.=0,4 г/2000 г масла, предварительно нагреть масло до 60°С при непрерывном перемешивании при 200 об/мин, перенести предварительно нагретое масло в смеситель с высоким сдвиговым усилием, начать перемешивание при низкой скорости, к предварительно нагретому маслу при перемешивании добавить 0,4 г РЕС (8ЕЦ ΙΌ NО: 2)+60 г воды при комнатной температуре, довести смеситель с высоким сдвиговым усилием до уровня 6 (наиболее высокая скорость) на 1 мин, перенести образец обратно в лопастную мешалку и непрерывно перемешивать при 200 об/мин при 60°С в течение 2 ч. Довести температуру до 80°С. Собрать нецентрифугированный образец масла и хранить при КТ для анализа, после достижения температуры масла 80°С центрифугировать с использованием центрифуги Оуго 1е81ег, измененная фосфолипаза 8 (пример 2, табл. 9) - 11,5 Е/мг, требуется 5,5 единиц/г масла, на реакцию 2 кг или 2000 г = всего 11000 единиц, требуется 11000 единиц/11,5 Е/мг = 957 мг.

Неочищенное масло: отвесить 958,6 мг х 11,5 Е/мг = 11024 Единиц. Ресуспендировать образцы в 60 г воды непосредственно перед добавлением к неочищенному маслу.

Измененная фосфолипаза 156 (пример 2, табл. 9)-17,2 Е/мг.

Требуется 5,5 единиц/г масла, на реакцию 2 кг или 2000 г = всего 11000 единиц.

Требуется 11000 единиц/17,2 Е/мг = 640 мг.

Неочищенное масло: отвесить 642,49 мг х 17,2 Е/мг = 11,049 единиц. Ресуспендировать образцы в 60 г воды непосредственно перед добавлением в неочищенное масло.

8ЕЦ ΙΌ Ν3: 8-4,2 Е/мг.

Требуется 0,02 единиц/г масла, на реакцию 2 кг или 2000 г = всего 40 единиц.

Требуется 40 единиц/4,2 Е/мг = 9,5 мг.

Неочищенное масло: отвесить 9,6 мг х 4,2 Е/мг = 40,32 единиц. Ресуспендировать образцы в 60 г воды непосредственно перед добавлением к неочищенному маслу.

Измененная фосфолипаза 8 + 8ЕЦ ΙΌ NО: 8 -2 ч: отвесить 959,2 мг измененной фосфолипазы 8 РН045 х 11,5 Е/мг = 11031 единиц. Отвесить 9,8 мг 8ЕЦ ΙΌ NО: 8 х 4,2 Е/мг= 41,16 единиц.

Измененная фосфолипаза 8 + 8ЕЦ ΙΌ NО: 8 -4 ч: отвесить 959,1 мг измененной фосфолипазы 8 РН045 х 11,5 Е/мг = 11030 единиц. Отвесить 9,8 мг 8ЕЦ ΙΌ NО: 8 х 4,2 Е/мг = 41,16 единиц.

- 126 022979

Ресуспендировать образцы в 60 г воды непосредственно перед добавлением к неочищенному маслу и измененной фосфолипазе 8+8Е^ ГО ЫО: 8 одновременно.

Условия реакции.

2000 г масла отвешивали в 4-л стакан. Масло предварительно нагревали до 60°С на электрической плите с контролем температуры с обратной связью (Вагп§1еаб/ТЬешо1упе ишак).

Перед добавлением фермента масло предварительно нагревали при 60°С при непрерывном перемешивании при ~200 об/мин.

Образцы помещали в высокоскоростной смеситель, к предварительно нагретому маслу добавляли фермент + 60 г воды комнатной температуре при перемешивании на низкой скорости, а затем сразу перемешивали с высоким сдвиговым усилием (максимальная скорость) в течение 1 мин.

Перенести образец обратно в лопастной смеситель и непрерывно перемешивать при 200 об/мин при 60°С в течение 2 ч. Довести температуру до 80°С. Собрать нецентрифугированный образец масла и хранить при -20°С для анализа.

После достижения температуры масла 80°С центрифугировать с использованием высокоскоростной центрифуги.

Таблица 20

Описание анализа масла	Среднее значение %1,2-ЭАС	Среднее значение %1,3-ΌΑΟ	см *—1 ей со ΐ—1 £3] а о	Суммарный, % ОАО	% теоретического максимально получаемого ЭАС	Свободная жирная кислота (титрование)
Неочищенное соевое масло	0,36	0,32	0,68	0,00		0,47
Обработанное ЗЕО Ιϋ ΝΟ: 2 предварительно центрифугированное масло* *	1,11	0,33	1,44	0,76	80	0,47
Обработанное ЗЕф ΙΌ ΝΟ: 2 центрифугированное масло*	0,98	0,33	1,32	0,64	68	0,24
Обработанное измененной фосфолипазой 8 предварительно центрифугированное масло *	1,56	0,33	1,88	1,20	128	0,48
Обработанное измененной фосфолипазой 8 центрифугированное масло*	1,78	0,39	2,16	1,48	158	0,24
Обработанное измененной фосфолипазой 156 предварительно центрифугированное масло *	1,44	0,32	1,76	1,08	114	0,49
Обработанное измененной фосфолипазой 156 центрифугированное масло*	1,48	0,34	1,82	1,14	121	0,25
Обработанное ЗЕф ΙΌ ΝΟ: 8 предварительно центрифугированное масло**	0,66	0,32	0,98	0,30	157	0,48

Обработанное ЗЕО ΙΏ ΝΟ: 8 центрифугированное масло**

0,55

0,34

0,90

0,22

112

0,21

Обработанное измененной фосфолипазой 8 + ЗЕО Ю ΝΟ: 8 в течение 2 ч предварительно центрифугированное масло

Обработанное измененной фосфолипазой 8 + ЗЕО Ю ΝΟ: 8 в течение 2 ч центрифугированное масло***

Обработанное измененной фосфолипазой 8 + ЗЕО Ю МО: 8 в течение 4 у предварительно центрифугированное масло

Обработанное измененной фосфолипазой 8 + ЗЕО ΙΌ МО: 8 в течение 4 ч центрифугированное масло**

1,71

1,87

1,99

1,92

0,33

0,37

0,38

0,38

2,04

2,23

2,37

2,30

1,36

1,55

1,69

1,62

119

136

148

142

0,71

0,24

0,72

0,21

Суммарный БАС = сумма образовавшегося 1,3&1,2 БАС - эндогенный БАС, % теоретического максимально получаемого БАС = (суммарный БАС/теоретический максимальный БАС) х 100, неочищенное соевое масло 06 17 08: РС=0,47, РЕ=0,46, РА=0,22, Р1=0,27.

* Теоретический максимальный БАС из величин для РЬ РС, РЕ и РА в ЯМР=(%РСх0,78) + (%РЕх0,83) + (%РАх0,89) =0,94.

** Теоретический максимальный БАС из величины для РЬ Р1 в ЯМР=(%Р1х0,72) =0,194 *** Теоретический максимальный БАС из величин для Р1. РС, РЕ, РА и Р1 в ЯМР=(%РСх0,78) + (%РЕх0,83) + (%РАх0,89) + (%Р1х0,72)=1,14

- 127 022979

Таблица 21

Таблица 22

Описание анализа масла	РА(%)	Р1 (%)	РЕ(%)	РС (%)	РА(%) 3ϋ	Р1(%) 3Ώ	РЕ (%) 3ϋ	РС(%) 3ϋ	А(%)	К(%)	Е(%)	С(%)
Обработанные 5Е0 Ιϋ N0: 2 камеди	3,60	5,21	5,19	2,96	0,10	0,26	0,28	0,14	0,14	0,00	1,17	2,54
Обработанные измененной фосфолипазой 8 камеди	0,49	6,28	0,04	0,00	0,06	0,40	0,07	0,00	1,22	0,00	3,25	4,41
Обработанные измененной фосфолипазой 156 камеди	1,32	6,67	0,56	0,00	0,06	0,24	0,06	0,00	0,84	0,00	2,85	4,02
Обработанные ЗЕО Ю N0: 8 камеди	2,65	0,63	7,20	7,15	0,10	0,04	0,34	0,24	0,09	0,86	0,03	0,12
Обработанные измененной фосфолипазой 8 + ЗЕО Ιϋ N0: 8 в течение 2 ч камеди	1,35	0,90	0,85	0,28	0,06	0,13	0,05	0,26	1,23	2,98	3,50	4,90
Обработанные измененной фосфолипазой 8 + ЗЕО 10 N0: 8 в течение 4 ч камеди	0,95	0,31	0,39	0,08	0,11	0,06	0,03	0,13	1,34	4,50	3,57	4,83

Таблица 23

Описание	анализе	ι маслаз	ЬРА(%)	ЬРЕ(%)	ЬР1(%)	ЬРС(%)	ΙΕΡΑ (%)	1- ЬРЕ(%)	1- ЬР1(%)	1- ЬРС(%)	Х(иМ) 12,9 м.д.
Неочищенное ι	соевое	масло	0,00	0,01	0,01	0,03	0,00	0,00	0,00	0,00	0
Обработанные камеди	ЗЕО	ΙΏ N0: 2	0,23	0,40	0,58	0,46	0,05	0,00	0,10	0,00	0
Обработанные фосфолипазой	измененной 8 камеди	0,33	0,00	0,29	0,28	0,55	0,00	0,00	0,00	60,9
Обработанные фосфолипазой	измененной 156 камеди	0,00	0,03	0,36	0,55	0,46	0,00	0,00	0,00	0
Обработанные камеди	ЗЕО	Ю N0: 8	0,00	0,28	0,00	0,54	0,00	0,00	0,00	0,00	439,5
Обработанные		измененной
фосфолипазой	8 + ЗЕО	Ю N0: 8 в	0,26	0,20	0,00	0,62	0,60	0,00	0,00	0,00	526,9
течение 2 ч : Обработанные	камеди	измененной
фосфолипазой	8 + ЗЕО	ΙΏ N0: 8 в	0,16	0,07	0,00	0,34	0,63	0,00	0,00	0,00	265,5
течение 4 ч :	камеди

Затем образцы анализировали в отношении содержания фосфолипидов (данные РЬ) с использова- 128 022979 нием ЯМР, как описано выше. Образцы также анализировали в отношении содержания ^ΑΟ (^ΑΟ РРА) с использованием следующих протоколов ВЭЖХ.

Определение диацилглицерина в растительном масле высокоэффективной жидкостной хроматографией с испарительным детектором рассеяния света

Этот способ основан на способе АОСЗ Сй11й-96, как описано для определения моно- и диглицеридов с помощью ВЭЖХ-ЕЬЗЭ (официальный способ АОСЗ Сй11й-96), с некоторыми модификациями. Одним существенным изменением является принятие масла ΕNОУΑ™ в качестве стандарта для целей количественного определения. В способе АОСЗ используется дипальмитин (С16:0) в качестве стандарта. Однако в растительном масле С16:0 составляет только ~10%, в то время как С18:0, С18:1 и С18:2 составляют приблизительно 90%. На хроматограмме ВЭЖХ не только форма пика дипальмитина отличается от формы истинных диацилглицеринов (^ΑΟ) в растительном масле, также отличается ответ детектора на пальмитин относительно С18 ^ΑΟ. Оба фактора влияют на результат количественного определения, поскольку испарительный детектор рассеяния света (ЕЬЗЭ) представляет собой нелинейный детектор. Масло ΕNОУΑ™ представляет собой масло с высоким содержанием ^ΑΟ, изготавливаемое запатентованным способом АОМ с использованием соевого масла и масла канолы в качестве исходных материалов, которые имеют распределение жирных кислот, сходное с обычным растительным маслом и, таким образом, являются лучшим стандартом для количественного определения ^ΑΟ в растительном масле. Количество ^ΑΟ в масле ΕNОУΑ™ можно определять с использованием официального способа АОСЗ Сй11Ь-91 (2) и способа ³¹Р-ЯМР (3, 4).

Приготовление образца и стандартных растворов.

1. Раствор образца: точно взвесить приблизительно 50 мкл образцов масла и добавить 950 мкл смеси гексан/изопропанол = 9:1 с получением 1 мл раствора.

2. Стандартные растворы: диапазон 1,2-^ΑΟ и 1.3-^ΑΟ в стандартных растворах должен охватывать истинную концентрацию ^ΑΟ в растворе образца. Одним примером являются 5 растворов масла ΕNОУΑ™ с концентрацией 0,25 мг/мл, 0,5 мг/мл, 1 мг/мл, 2 мг/мл и 4 мг/мл соответственно.

Параметры ВЭЖХ:

колонка: Сйготедазрйеге ЗР60, 15 см х 4,6 мм, температура: 40°С, скорость потока: 2 мл/мин, объем инжекции: 20 мкл, подвижная фаза А: гексан.

подвижная фаза В: гексан/изопропанол/этилацетат/муравьиная кислота = 800:100:100:1 градиентное элюирование:

Время (мин.)	0	8	8.5	15	15.1	19
%В	2	35	98	98	2	2

Параметры ЕЕЗВ.

Параметры Зейех 75 ЕЙЗЭ необходимо оптимизировать для максимизации чувствительности. Они включают температуру, прирост, давление газа в распылителе и положение стеклянной ячейки. Типичным примером является температура 40°С, приращение 5 и давление газообразного азота 3,5 бар (350 кПа).

Идентификация и количественное определение пиков.

Идентификацию пика ^ΑΟ проводят путем сравнения времени удержания со временем стандарта. Количественное определение основано на взаимосвязи между ответом детектора Ι (площадь пика) и концентрацией анализируемого вещества С: ЫКхС'Л здесь К и М представляют собой связанные с экспериментальными условиями константы.

Ссылки.

1. Мопо- апй В1§1усепйек ВеГегттайоп Ьу НРЕС-ЕРЗБ (АОСЗ ОГйс1а1 Ме!йой Сй 11й-96).

2. ВеГегтхпаГхоп оГ Мопо- апй Вщксепйек Ьу СарШагу Οаз Сйгота1о§гарйу (АОСЗ ОГйс1а1 Ме!йой Сй 11Ь-91).

3. Зругок, А.; Бат, Р. Аррйсайоп оГ ³¹Р NΜК ЗресГгоксору ш Роой Апа1ук1к. 1. ОиапПЕПпе ВеГеттайоп оГ 1йе Мопо- апй Вщ1усепйе Сотрокйюп оГ Ойуе Ойк, Р Адйс. Роой Сйет. 2000, 48, 802-805.

4. У1§й, Ο.; РйШррЫк, А.; Зругок, А.; Бат, Р. С1акк1йсайоп оГЕШЫе Ойк Ьу Етр1оут§ ³¹Р апй 'Н NΜК ЗресГгоксору ш СотЬтайоп λνϊΐΐι Ми1йуапа1е ЗГайкГ1са1 Апа1ук1к. А Ргорока1 Гог 1йе БеГесйоп оГ Зеей Ой Айийегайоп т Уйдш Ойуе Ойк, Р Адйс. Роой Сйет. 2003, 51, 5715-5722.

Основной лучший вариант согласно ΟК Ο2 подвергали оптимизации кодонов.

Оптимизацию кодонов проводили двумя различными путями на субклонированной ОКР (Ο2 сойоп ор! νΙ и Ο2 сойоп ор! У2), причем второй способ обеспечил значительно более высокоэкспрессируемый вариант. Для Ο2 сойоп ор! νΙ, исходные кодоны, использование которых в субклонированной ОКР было снижено ниже 15-25%, для Р. Йиогексепк заменяли на кодоны в Р. Йиогексепк с использованием >30%. Кроме того использовали два стоп-кодона ΤΟΑ на 3'-конце ОКР.

- 129 022979 собоп орк VI (5Е<2 ГО N0:9):

АТ66ССА6СА6САТСААС6ТССТС6ААААСТ66ТС6С6СТ66АТ6АА6СС6

АТСААС6АС6АСАТССС6СТ66ССС6САТСА6САТССС666САСССАС6АС

А6С66САССТТСАА6СТ6СА6ААССС6АТСАА6СА66ТСТ6666САТ6АСС

СА66ААТАС6АСТТСС6СТАССА6АТ66АССАС66С6ССС6САТСТТС6АС

АТСС6СС6СССССТ6АСС6АС6АСААСАССАТС6Т6СТ6САССАС66ССС6

СТ6ТАССТ6ТАС6Т6АСССТ6САС6ААТТСАТСААС6АА6ССАА6СА6ТТСС

Т6АА66АСААССС6А6С6АААССАТСАТСАТ6А6ССТ6АА6ААА6ААТАС6

АА6АСАТ6АА666С6СС6ААА6СА6СТТСА6СА6САССТТС6АААА6ААСТ

АСТТСС6С6АССС6АТСТТССТ6АА6АСС6АА66СААСАТСАА6СТ666С6

АС6ССС6С66САА6АТС6ТССТССТ6АА6С6СТАСА6С66СА6СААС6ААА

6С66С66СТАСААСТТСТТСТАСТ66СС66АСААС6АААССТТСАССА6СА

ССАТСААС66СААС6Т6ААС6Т6АСС6Т6СА66АСАА6ТАСАА66Т6А6СС

Т66АС6АААА6АТСААС6ССАТСАА66АСАСССТ6ААС6АААССАТСААСА

АСА6С6АА6АС6Т6ААССАССТ6ТАСАТСААСТТСАССА6ССТ6А6СА6С6

6С66САСС6ССТ66АССА6ССС6ТАСТАСГАС6ССА6СС6САТСААССС66

АААТС6ССААСТАСАТСАА6СА6АА6ААССС6АССС6С6Т666СТ66АТСА

ТССА66АСТТСАТСААС6АААА6Т66САССС6СТ6СТ6ТАССА66АА6Т6А

ТСААС6С6ААСАА6А6ССТ66ТСАА6Т6АТ6А

Для О2 собоп орк У2, кодоны Р. йиогексепк были выбраны так, чтобы их использование (%) наибольшим образом соответствовало использованию (%) каждого кодона в исходной 0КР. Этот способ называют переносом используемых кодонов. Кроме того, предсказанную вторичную структуру мРНК транскрипта минимизировали для предотвращения образования структур стебель-петля и шпилек в области начала трансляции (фрагмент из нуклеотидов в мРНК от -65 до +65, где трансляция начинается в положении +1 с нуклеотида А в АТО, который кодирует первый остаток метионина в белке). В этой минимизации использовали синонимические кодоны со сходным использованием (%) для снижения нежелательных образований пар нуклеотид-нуклеотид. Как и ранее, использовали два стоп-кодона ТОА на 3'конце 0КР.

собоп ορί М2 (5Е0 ГО N0:10):

АТ66С6А6СА6САТСААС6ТСТТ66А6ААСТ66ТССС66Т66АТ6АА6СССАТ

СААС6АС6АТАТСССАСТ66ССС6ТАТСТС6АТССС666САСССАС6АСА6С66САС

СТТТАААСТССА6ААСССААТСАААСА66ТСТ6666САТ6АСССА66А6ТАС6АСТТС

С6СТАССА6АТ66АССАС66С6ССС66АТСТТС6АСАТСС66666С6ССТ6АСС6АС

6АСААСАССАТС6Т6СТ6САССАС666СС6СТ6ТАССТ6ТАССТ6АССТГ6САТ6А6Т

ТСАТСААТ6А66С6АА6СА6ТТССТ6АА66АСААССС6А6С6АААССАТСАТСАТ6ТС

ССТ6АА6ААА6ААТАС6АА6АСАТ6АА66666С66А6А6ТТС6ТТСА6СА6САССТТ

С6АААА6ААСТАСТТСС6С6АССС6АТТТТССТ6АА6АСС6А666СААСАТСАААСТ6

66С6АС6ССС6С66САА6АТС6Т6СТ6ТТ6АА6С66ТАСА6С66СА6СААС6А6ТС

С66666СТАСААСТТСТТТТАСТ66СС66АТААС6АААССТТСАСТТС6АС6АТСААС

66СААС6Т6ААС6Т6АСС6Т6СА66АСАА6ТАСАА66ТСА6ССТС6АС6АААА6АТС

ААТ6ССАТСАА66АСАСССТ6ААС6А6АССАТСААТААСА6С6А66АС6Т6ААССАСТ

Т6ТАСАТСААСТТСАССА6ТСТСТССТСС66С66САСС6ССТ66АССА6ССС6ТАСТА

СТАС6С6А6ТС6ТАТСААСССС6АСАТС6ССААСТАСАТСАААСА6АААААССССАСС

С666ТС66ТТ66АТСАТССА66АСТТСАТСААС6А6АА6Т66САССС6СТ6СТ6ТАС

СА66А66Т6АТСААС6С6ААСАААТС6СТ66Т6АА6Т6АТ6А

Данные, сравнивающие ферментации в объеме 30 л для О2 (8ЕР ΙΌ N0: 8) и его кодоноптимизированных вариантов (8ЕР ΙΌ N0: 9 и 8ЕС) ΙΌ N0: 10), обобщенно представлены в табл. 24. Ферментации проводили в системе Р. йиогексепсе, описанной ранее. Данные, сравнивающие термоустойчивость между кодон-оптимизированной 8ЕР ΙΌ N0: 10 и 8ЕС) ΙΌ N0: 8, обобщенно представлены в табл. 25. Термоустойчивость измеряли, как описано ранее.

- 130 022979

Время	8Е() ГО ΝΟ: 8	8 ЕС) ГО ΝΟ: 9	δΕ()ΙΟΝΟ: 10
24		1.90Е+06
28		3.31Е+06
29	8.98Е+05
32		3.82Е+06
33	1.62Е+06
36		4.94Е+06
37	2.47Е+06
40		4.81Е+06
41	3.82Е+06
44		5.46Е+06
45	5.28Е+06
46			4.38Е+06
48		5.26Е+06
49	6.04Е+06
50			9.02Е+06
52		5.64Е+06
53	5.27Е+06
54			1.14Е+07
56		1.19Е+07
58			2.02Е+07
60		6.22Е+06
62			1.93Е+07
66			1.88Е+07
70			1.53Е+07
75			1.22Е+07

Таблица 24

Таблица 25

Данные, сравнивающие активность О2 (8Ε^ ΙΌ NО: 8) и его кодон-оптимизированного версии (8Ε^ ΙΌ NО: 10), обобщенно представлены в табл. 26. Анализы проводили с использованием методики мелкомасштабного скрининга масла, как описано выше.

Таблица 26

УСРЕДНЕННЫЕ ДАННЫЕ

# образца	Эксперимент	РА(%)	РЕ (%)	ΡΙ (%)	РС(%)	Общие РЬ(%)	ЬРА(%)	ЬРЕ(%)	ЬР1(%)	ЬРС(%)	1- ЬРА(%)
1	ЗЕО Ιϋ ΝΟ: Ιϋ ΝΟ: 80,4 и/д	0,18	0,48	0,02	0,47	1,14	0,00	0,02	0,00	0,03	0,00
2	ЗЕО ΙΌ ΝΟ: Ιϋ N0: 80,2 и/д	0,16	0,43	0,00	0,43	1,01	0,00	0,01	0,00	0,02	0,00
3	ЗЕО ΙΌ N0: Ю N0: 80,1 и/д	0,18	0,46	0,05	0,50	1,19	0,01	0,01	0,00	0,03	0,00
4	ЗЕО Ιϋ N0: 8-0,05 и/д	0,16	0,43	0,05	0,44	1,08	0,01	0,02	0,00	0,03	0,00
5	ЗЕО ΙΌ N0: 10-0,4 и/д	0,19	0,51	0,00	0,53	1,23	0,01	0,02	0,00	0,03	0,00
6	ЗЕО Ю N0: 10-0,2 и/д	0,15	0,41	0,00	0,44	1,00	0,01	0,02	0,00	0,03	0,00
7	ЗЕО Ю N0: 10-0,1 Ы/д	0,15	0,41	0,07	0,41	1,05	0,00	0,02	0,00	0,02	0,00
8	ЗЕО Ιϋ N0: 10-0,05 и/д	0,16	0,45	0,07	0,45	1,13	0,00	0,02	0,00	0,03	0,00
9	Без ферментов (Контроль)	0,17	0,46	0,23	0,47	1,33	0,00	0,02	0,02	0,03	0,00

УСРЕДНЕННЫЕ ДАННЫЕ

# образца	Эксперимент	1-ЬРЕ(%)	1-БР1(%)	1- ЬРС(%)	А(%)	Е(%)	I (%)	С(%)	Общий Р (м.Д.)	Общий Р из РЬ (м.д.)
1	ЗЕф Ю ΝΟ: Ιϋ ΝΟ: 80,4 и/д	0,00	0,00	0,00	0,01	0,00	0,16	0,00	804,49	485,05
2	ЗЕ<2 Ю ΝΟ: Ю ΝΟ: 80,2 и/д	0,00	0,00	0,00	0,01	0,00	0,16	0,00	743,13	429,86
3	ЗЕ<2 ΙΌ ΝΟ: Ιϋ N0: 8ο,ι и/д	0,00	0,00	0,00	0,01	0,00	0,10	0,00	794,03	500,55
4	ЗЕО Ιϋ ΝΟ: 8-0,05 и/д	0,00	0,00	0,00	0,01	0,00	0,08	0,00	710,86	453,40
5	ЗЕО Ιϋ ΝΟ: 10-0,4 и/д	0,00	0,00	0,00	0,01	0,00	0,24	0,00	943,30	523,00
6	ЗЕО ΙΌ ΝΟ: 10-0,2 Ы/д	0,00	0,00	0,00	0,01	0,00	0,16	0,00	731,12	423,97
7	ЗЕО Ю ΝΟ: 10-0,1 Ы/д	0,00	0,00	0,00	0,01	0,00	0,04	0,00	632,84	440,85
8	ЗЕО Ю ΝΟ: 10-0,05 и/д	0,00	0,00	0,00	0,01	0,00	0,05	0,00	681,24	476,04
9	Без ферментов (Контроль)	0,00	0,00	0,00	0,01	0,00	0,00	0,00	711,84	551,23

- 131 022979

Дозировка.

Дозировка фермента может определяться количеством единиц фермента, подлежащего добавлению, на 1 г масла, подлежащего обработке, где одну единицу (Е) определяют как количество фермента, требуемое для высвобождения 1 мкмоль 4-метилумбеллиферона из 4,5 мМ 4-метилумбеллиферилимоинозитол-1-фосфата, соли Ν-метилморфолина в 1 мин при рН 7,5 и 30°С. В одном варианте осуществления дозировка ΡΡί'.' (например, с использованием δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 2) или ρΡΥ'.' находится в диапазоне 1-50 Е/г масла, в то время как ΡΙ ΡΡ-С находится в диапазоне 0,05-20 Е/г масла. В другом варианте осуществления используют дозировки в диапазоне 1-20 Е/г масла для ΡΡ-С или ρΡΥ'.' и 0,05-2 Е/г масла для ΡΙ-ΡΡ-С. В другом варианте осуществления используют дозировки в диапазоне 2-10 Е/г масла для ΡΡ-С или ρΡΥ'.' и 0,1-1 Е/г масла для ΡΙ-ΡΡ-С. В альтернативном варианте осуществления дозировка ΡΡ-С (например, с использованием δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 2) или ρΡΥ'.’ составляет 5,5 Е/г масла и для ΡΙ-ΡΡ-С составляет 0,2 Е/г масла.

Альтернативно дозировка может определяться с использованием удельной активности фермента для конвертирования количества единиц фермента, требуемого на 1 г масла в массу фермента (мкг), требуемого на 1 г масла. В частности, требуемое количество единиц делят на удельную активность (Е/мг) фермента, получая требуемое количество мкг фермента. Например, доза 0,2 Е фермента/г масла, деленная на удельную активность 90,1 Е/мг дает дозу 2,22 мкг фермента/г масла. Таким образом, в одном варианте осуществления доза ΡΙ ΡΡ-С находится в диапазоне 0,55-222 мкг фермента/г масла. В другом варианте осуществления используют дозировки в диапазоне 0,55-22,2 мкг фермент/г масла для ΡΙ-ΡΡ-С. В другом варианте осуществления используют дозировки в диапазоне 1,11-11,1 мкг фермента/г масла для ΡΙ-ΡΕΟ В альтернативном варианте осуществления дозировка ΡΙ-ΡΡ-С составляет 2,22 мкг фермент/г масла.

В альтернативных вариантах осуществления изобретение также относится к комбинациям или смесям ферментов, содержащим ΡΙ-ΡΡί'.' по изобретению и по меньшей мере один другой фермент, например фермент фосфолипазу фермент, например, описанный в табл. 8 или 9, или в νΟ 2008/036863. Например, в альтернативных вариантах осуществления изобретение также относится к комбинациям или смесям ферментов, содержащим ΡΙ-ΡΡί'.' по изобретению и δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 2, не имеющую сигнальную последовательность, кодируемую, например, δΕΟ ГО ΝΟ: 1; или δΕΟ ГО ΝΟ: 4, имеющую сигнальную последовательность (эквивалентна δΕΟ ГО ΝΟ: 2 с сигнальной последовательностью), кодируемую, например, δΕΟ ГО ΝΟ: 3; или включая любые из ферментов ρΡΡί'.', описанных в примере 2 (например, см. табл. 8 и 9), и в νΟ 2008/036863, где описаны варианты δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 4 (кодируемой, например, δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 3). В альтернативных вариантах осуществления изобретение также относится к комбинациям или смесям ферментов, содержащих ΡΙ-ΡΕ' по изобретению, например вариант δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 6 (кодируемый, например, δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 5), как описано в настоящем документе, или варианты δΕΟ ГО ΝΟ: 8 (кодируемые, например, δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 7, и кодон-оптимизированными δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 9 и δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 10).

Примеры 4-9 представляют собой контрольные примеры. В примерах 10-16 описаны иллюстративные способы, предоставленные в настоящем документе.

В каждом из примеров ниже подвесной смеситель представлял собой ЖА.'к Ρν 20 й1дПа1 с плоской лопастью с лезвием; действующий при 200 об/мин для нормального встряхивания и 350 об/мин для интенсивного встряхивания. Центрифуга представляла собой Эе Ра\а1 Оуго - Τρ^ργ, установленную с ΤΗρ Βο»1 υп11 для непрерывного разделения. Ротор центрифуги был закрыт установленными запорными винтами. Смешение с высоким сдвиговым усилием проводили с помощью гомогенизатора КА/к υΠιπΤηγγηχ Τ-50 Ьакю с диспергирующим элементом δ 50 Ν - О 45 О при 10000 об/мин. Фермент ΡΕΑ1 представлял собой Ьесйаке® Ш!га (номер партии ΕΥΝ05015Α, содержащий 11,7 единиц/мг), продаваемый ^го/утек Α/δ, Дания. Фермент ΡΡ-С представлял собой Ρи^^Г^ηе® ΡΡ-С (номер партии 90Βυ006Α1 или 190Όυ001Α1, содержащий 26,0 или 28,6 единиц/мг соответственно) и ΡΙ-ΡΡ-С (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 8), содержащий 4 единиц/мг был предоставлен Уегепшт Согрогайоп, δαιτ 01едо, СаПГогша. Реакцию проводили в стакане объемом 4 л и его накрывали пластиковой оберткой для снижения или устранения какой-либо потери воды. Количество фосфолипидов, остающееся в обработанном масле, измеряли в качестве м.д. Р в соответствии со способом Αιρηο^ Οί1 СЬет1к!к' δοс^еίу ΟίΗ^ί-Η ΜеίЬοй Са 20-99, Αηа1ук^к оГ Ρ^φ^гик ш ΟΪ1 Ьу МисГОе^ Соир1ей ΡΗ^α Οр!^са1 Εт^кк^οη δрес!^οксοру. Свободные жирные кислоты (РР Α) измеряли с использованием ΑπαίαΜ Οί1 СЬет1к!к' δοс^еίу ΟГГ^с^а1 Μе!Ьοй Са 5а-40. Содержание влаги измеряли с использованием Αιρηο^ Οί1 СЬет1к!к' δοс^еίу ΟίΤΐα! Μе!Ьοй Са 2с-25. Содержание нейтрального масла измеряли с использованием способа, указанного в приложении ниже. Не растворимый в ацетоне материал, включавший фосфолипиды, измеряли с использованием ΑιπριΎηι Οί1 СЬет1к!к' δοс^еίу ΟГГ^с^а1 Μе!Ьοй 1а 4-46. Кислотное число измеряли с использованием ΑιπριΎηι Οί1 СЬет1к!к' δοс^еίу ΟίΠша1 Μе!Ьοй 1а 6-55. Способы Р-31 ЯМР и измерения диацилглицерина (^ΑΟ) в высокоэффективной жидкостной хроматографии с испарительным детектором рассеяния света (ВЭЖХ-ΕΕδΌ) проводили способами, описанными Уегепшт Согрогайоп (тогда известной как ОАегка Согрогайоп), 'АпаНа^й Ρ^οГ^1^ηд оГ δта11 δса1е Реасйопк оГ ΡЬοкрЬο1^раке-С тей1а!ей Уеде!аЬ1е Οί1 Оедитттд, а! !Ье ΑιπριΎηι Οί1 Сйет1к!к δοс^еίу 2007 теейпд.

- 132 022979

Пример 4. Контроль - рафинирование гидратацией при нейтральном значении рН.

2001.2 г неочищенного соевого масла, содержавшего 696,3 м.д. фосфора, нагревали до 70-74°С при нормальном встряхивании с использованием подвесного смесителя. Для нагревания масла добавляли 60,0 г деионизированной воды. Смесь масло/вода встряхивали при 450 об/мин в течение 1 мин. Устройство для встряхивания замедляли до 100 об/мин на 30 мин для образования хлопьев и гидратации камедей. Затем обработанное водой масло центрифугировали и разделенные масло и влажные камеди собирали. Остаточный фосфор в рафинированном гидратацией масле составил 80,0 м.д., РРА составили 0,22%, и ЭАС составили 0,34%. Собранные влажные камеди весили 108,5 г.

Пример 5. Контроль - рафинирование РЬС при нейтральном значении рН.

2003.8 г неочищенного соевого масла, содержавшего 696,3 м.д. фосфора, нагревали до 60°С при нормальном встряхивании с использованием подвесного смесителя. При поддержании температуры при 60°С добавляли 0,50 г липазы РЬС Уегепшт РипПпе®® (номер партии 90Ви006А1), а затем 60 г деионизированной воды и всю смесь перемешивали со сдвиговым усилием в течение 60 мин. Масляную смесь встряхивали при нормальной скорости в течение 120 мин при температуре 60°С. Затем обработанное ферментом масло центрифугировали и разделенные масло и влажные камеди собирали. Остаточный фосфор в обработанном РЬС при нейтральном значении рН обеспечивал рафинированное масло с остаточным фосфором 47,0 м.д. Содержание РРА составляло 0,20% и содержание ЭАС составляло 0,61%. Собранные влажные камеди весили 85,5 г.

Пример 6. Контроль - Р1-РЬС (ЗЕЦ ГО N0: 8), рафинирование при нейтральном значении рН.

2001.8 г неочищенного соевого масла, содержавшего 696,3 м.д. фосфора нагревали до 60°С при нормальном встряхивании с использованием подвесного смесителя. При поддержании температуры при 60°С в 10-мл стакан добавляли 0,0110 г Р1-РЬС (ЗЕЦ ГО N0: 8), предоставленной Уегетит, и растворяли в 1 мл деионизированной воды. После растворения белка в воде к маслу добавляли раствор фермента. Стакан промывали три раза приблизительно 1 мл воды для обеспечения того, что добавили весь фермент. Добавляли остальную часть воды, чтобы общее количество добавленной воды составило 60 г. Смесь масла, фермента и воды перемешивали с помощью сдвигового усилия в течение 60 с. Масляную смесь встряхивали при нормальной скорости в течение 120 мин при температуре 60°С. Затем обработанное ферментом масло центрифугировали; и разделенные масло и влажные камеди собирали. Содержание остаточного фосфора в рафинированном масле, полученном в реакции с обработкой Р1-РЬС при нейтральном значении рН, составило 50,3 м.д. Было выявлено, что содержание РРА составляло 0,18% и содержание ЭАС составляло 0,49%. Собранные влажные камеди весили 102,5 г.

Пример 7. Контроль - РЬС вместе с Р1-РБС (ЗЕЦ ГО N0: 8), рафинирование при нейтральном значении рН.

2000.2 г неочищенного соевого масла, содержавшего 696,3 м.д. фосфора, нагревали до 60°С при нормальном встряхивании с использованием подвесного смесителя. При поддержании температуры при 60°С в масло добавляли 0,50 г липазы РЬС Уегепшт Рипйпе® (номер партии 90ВИ006А1), а затем в 10мл стакан добавляли 0,0104 г Р1-РБС (ЗЕЦ ГО N0: 8), предоставленной Уегетит, и растворяли в 1 мл деионизированной воды. После растворения белка в масло добавляли раствор фермента. Стакан промывали три раза приблизительно 1 мл воды для обеспечения добавления в масло всего фермента. Добавляли остальную часть воды, чтобы общий объем воды составил 60 г. Масляную смесь встряхивали при нормальной скорости в течение 120 мин при температуре 45°С. Затем обработанное ферментом масло центрифугировали; и разделенные масло и влажные камеди собирали. Остаточный фосфор в реакции с обработкой РЕА1-Р1-РЕС при нейтральном значении рН обеспечивал в рафинированное масло с остаточным фосфором 50,0 м.д. Содержание РРА составляло 0,24% и содержание ЭАС составляло 0,85%. Собранные влажные камеди весили 84,2 г.

Пример 8. Контроль - РБА1, рафинирование при нейтральном значении рН.

2000,6 г неочищенного соевого масла, содержавшего 694,1 м.д. фосфора, нагревали до 45°С при нормальном встряхивании с использованием подвесного смесителя. При поддержании температуры при 45°С добавляли 0,10 г Nоνоζушек БесЕаке® ИЕга (липаза РЬА1, номер партии ^ΥN05015), а затем 60 г деионизированной воды и всю смесь перемешивали со сдвиговым усилием в течение 60 мин. Смесь масла встряхивали при нормальной скорости в течение 240 мин при температуре 45°С. Затем обработанное ферментом масло центрифугировали и разделенные масло и влажные камеди собирали. Остаточный фосфор реакции с обработкой РЬА1 при нейтральном значении рН обеспечивал в рафинированное масло с остаточным фосфором 27,2 м.д. Содержание РРА составило 0,60% и содержание ЭАС составило 0,33%. Собранные влажные камеди весили 90,0 г.

Пример 9. Контроль - рафинирование с РЬА1 при рН 4,5.

2001.2 г неочищенного соевого масла, содержавшего 641,6 м.д. фосфора, нагревали до 70°С при нормальном встряхивании с использованием подвесного смесителя. Добавляли 2,0 г 50% мас./мас. раствора лимонной кислоты и перемешивали с усилием сдвига в течение 1 мин. Масло подвергали нормальному встряхиванию в течение 1 ч с помощью подвесного смесителя. Маслу позволяли остыть при встряхивании при нормальной скорости до тех пор, пока температура не составила 45°С, затем в масло добав- 133 022979 ляли 1,8 мл 4-молярного раствора гидроксида натрия и перемешивали. Добавляли 0,10 г Nονοζуте8 Ьес1Ьа8е® иНга (липаза РЬА1, номер партии ЬУ05015), а затем всего 60 г деионизированной воды и всю смесь перемешивали со сдвиговым усилием в течение 60 мин. Смесь масла встряхивали при нормальной скорости в течение 240 мин при температуре 45°С. Затем обработанное ферментом масло центрифугировали и разделенные масло и влажные камеди собирали. Остаточный фосфор в масле, обработанном РЬА1 при рН 4,5, обеспечивал рафинированное масло с остаточным фосфором 0,5 м.д. Содержание РРА составляло 0,54% и содержание ОАО составляло 0,33%. Собранные влажные камеди весили 91,4 г.

Способ рафинирования, описанный в примерах 4-10, не обеспечил удаление и/или реакцию всех фосфолипидов, присутствовавших в неочищенном масле, о чем свидетельствовал остаточный фосфор, за исключением эксперимента 6. Эксперимент 6 отражает рафинирование в нормальных условиях реакции для фермента Ресйа8е® 1Л!га. В табл. 27 приведены профили фосфолипидов собранных влажных камедей.

Таблица 27

Аналитические результаты контрольных примеров в нейтральных условиях

Прогон	Добавление фермента	рН	Вода (г)	Температура (С)	Время реакции (минуты)	Фосфор (м.д.)	РРА (%)	ΌΑΘ (%)	Влажные камеди (г)
	Исходный материал	Нейтральный				668,0	0,53	0,32
1	Нет	Нейтральный	60	70	30	80,0	0,22	0,34	108,5
2	РЬС	Нейтральный	60	60	120	47,0	0,20	0,61	85,5
3	Р1-РЬС	Нейтральный	60	60	120	50,3	0,18	0,49	102,5
4	РЬС+Р1-РЬС	Нейтральный	60	60	120	50,0	0,24	0,85	84,2
5	РЬА1	Нейтральный	60	45	240	27,2	0,60	0,33	90,0
6	РЬА!	4,5	60	45	240	0,5	0,54	0,33	91,4

Как видно из табл. 29, рафинирование гидратацией демонстрирует способность к эмульгированию гидратируемых фосфолипидов, обеспечивающую удаление всех типов фосфолипидов, даже некоторые из негидратируемых типов. Однако в масле оставалась большая часть ΝΙ1Ρ о чем свидетельствовал остаточный фосфор, кальций, магний и железо в рафинированном масле (см. табл. 29). Рафинирование с использованием фосфолипазы С было способно осуществить реакцию, по существу, всего фосфатидилхолина и существенного количества фосфатидилэтаноламина. Фосфатидилинозитол и фосфатидная кислота не вступили в реакцию. Количество собранных камедей было значимо ниже, чем в примере с рафинированием гидратацией (85,5 г против 108,5 г), однако в масле оставалось большое количество КНР, о чем свидетельствовал остаточный фосфор приблизительно 50 м.д. и оставшиеся в масле Са, Мд и Ре. Как видно из табл. 29, рафинирование специфичной к фосфатидилинозитолу фосфолипазой обеспечивало влажную камедь с наиболее высоким количеством РС и РЕ из всех контрольных примеров. Фосфолипидный состав выделенных влажных камедей согласно примерам 4-10 также представлен на фиг. 13.

Таблица 28

Фосфолипидный состав выделенных камедей

Про- гон	РС (%)	РЕ (%)	ΡΙ (%)	РА (%)	лизо- РС (%)	лизо- РЕ (%)	лизо- ΡΙ (%)	лизо- РА (%)	с (%)	Е(%)	I (%)	А (%)
1	9,62	7,35	4,02	2,04	0,58	0,35	0,33	ь.а.	ь.а.	ь.а.	ь.а.	0,07
2	0,19	2,05	5,29	2,88	0,44	0,09	0,39	0,28	3,92	2,42	ь.а.	0,19
3	11,0	7,78	0,00	2,33	0,59	0,36	ь.а.	ь.а.	0,05	0,02	4,29	0,12
4	2,39	3,09	1,68	2,77	0,44	0,17	ь.а.	0,35	3,25	1,97	1,26	0,18
5	0,24	0,41	0,67	0,26	8,05	7,33	4,32	3,52	ь.а.	ь.а.	ь.а.	0,19
6	0,62	0,74	0,90	0,13	7,98	7,40	4,30	4,28	ь.а.	ь.а.	ь.а.	0,25

Ь.й. = ниже предела детекции

С помощью фосфолипазы С, образующей фосфоинозитол, прореагировал весь Р1. Подобно примерам 4 и 5 большие количества Ν№ оставались в масле, о чем свидетельствует анализ микроэлементов, описанный в табл. 29.

- 134 022979

Таблица 29

Результаты по элементам для контрольных примеров в нейтральных условиях

Прогон	Добавление фермента	рн	Фосфор (м.д.)	Кальций (м.д.)	Магний (м.д.)	Железо (м.д.)
Среднее значение для неочи-щеного масла	Исходный материал	Нейтральный	668,0	61,67	69,92	0,95
1	Нет	Нейтральный	80,0	34,97	18,79	0,44
2	РЬС	Нейтральный	47,0	21,25	10,14	0,19
3	Р1-РЬС	Нейтральный	50,3	25,33	12,33	0,20
4	РЬС+Р1-РЬС	Нейтральный	50,0	22,49	9,62	0,20
5	РЬА1	Нейтральный	27,2	15,14	7,73	0,13
6	РЬА!	4,5	0,5	0,19	0,12	ь.а.

Содержание влаги и нейтрального масла в выделенных камедях, описаны в табл. 29а.

Таблица 29а

Содержание влаги и нейтрального масла в выделенных камедях

Прогон	Влага (%)	Масло как есть (%)	Масло высушенное (%)	Потери масла (г)
1	43,31	20,40	36,05	22,13
2	49,62	17,04	33,82	14,57
3	40,70	23,97	40,42	24,57
4	46,80	20,44	38,42	17,21
5	44,33	11,63	20,89	10,47
6	45,00	14,52	26,40	13,27

В примере 7 рафинирование с помощью как РЬС, так и Р1-РЬС продемонстрировало существенный ферментативный гидролиз РС, РЕ и Р1 (табл. 27 и фиг. 13), но не настолько же хороший, как один фермент, добавляемый отдельно в примере 5 или 6. Кроме того, остаточный фосфор в масле оставался на уровне приблизительно 50 м.д. вследствие неспособности способа гидролизовать соли фосфатидной кислоты и фосфатидилэтаноламина. В примере 8 рафинирование с помощью РЬА1 гидролизовало практически все фосфолипиды, присутствовавшие во влажных камедях, в их лизоформы, как видно на фиг. 13, о чем свидетельствует значительное количество присутствующих лизофосфолипидов (табл. 28). Однако даже через 4 ч. в масле оставались существенные количества РА, поскольку ΝΙ1Р были не доступны для фермента.

В контрольном эксперименте 6 обработанное РЬА1 масло при рН 4,5 демонстрирует способность фосфолипазы А1 реагировать во всеми типами фосфолипидов, с образованием рафинированного масла с менее чем 1 м.д. остаточного фосфора и, по существу, все камеди конвертировались в их растворимые в воде лизосоединения, как очевидно из фиг. 13 и табл. 30 и 31. Катионы кальция, магния и железа более не были связаны с КНР, но находились в водной фазе. Катионы кальция, магния и железа диссоциировали от солей фосфатидной кислоты и фосфатидилэтаноламина. Вследствие этого, двухвалентные элементы могли теперь реагировать с лимонной кислотой, присутствующей в водной фазе, с образованием цитрата кальция, магния или железа, которые не растворимы в водной фазе при рН реакции в водной фазе. Эти нерастворимые соли выпадали из раствора с образованием жесткой воды, покрывая весь трубопровод, теплообменники и даже центрифугу, до тех пор, пока тяжелую фазу, содержащую смесь прореагировавших камедей, воды и солей, не удалили способом центрифугирования. 1)ау1оп е! а1. в и.8. 2007/0134777 описывает усовершенствованный способ ферментативного рафинирования, где рН слабо забуференной ферментативной реакции снижают от 4,5, например, до диапазона 3,5-4,2 после завершения ферментативной реакции, диссоциируя соли цитрата, тем самым, устраняя загрязнение оборудования, в частности теплообменников и разделяющей центрифуги, которое происходило в результате выпадения в осадок солей кальция и магния при оптимальном значении рН, требуемом для активности фермента.

Как продемонстрировано в следующих примерах, способы, представленные в настоящем документе, включают обработку масла кислотой до более низкого значения рН, составляющего менее трех, обеспечивая диссоциацию фосфатидной кислоты и фосфатидилэтаноламина (ННР), затем доведение рН водной фазы обратно до нейтрального значения рН 7, до того, как гидратация фосфолипидов при рафинировании гидратацией или реакция фосфолипидов с фосфолипазой позволяет мигрировать ΝΙ1Р на поверхность контакта масла и воды, обеспечивая лучшую гидратацию и лучшую доступность субстрата (ΝΙ1Р) для фосфолипаз. В табл. 30 ниже обобщенно представлены примеры способов, проводимых, как описано ниже.

- 135 022979

Таблица 30

Аналитические результаты примеров со скорректированным значением рН

Прогон	Добавление фермента	Доведенное значение рН	Вода (г)	Температура (С)	Время реакции (минуты)	Фосфор (м.д.)	2 Ё	ϋΑΟ (%)	Влажные камеди (г)
7	Нет	7,0	60	70	30	26,9	0,24	0,39	112,0
8	РЬС	7,0	60	60	120	14,4	0,21	1,11	80,0

9	Р1-РЬС	7,0	60	60	120	13,5	0,22	0,61	100,8
10	РЬС+Р1- РЬС	7,0	60	60	120	18,7	0,21	1,04	84,4
11	РЬА1	5,5	60	45	240	1,6	0,54	0,33	91,7
12	РЬА1	6,5	60	45	240	3,4	0,51	0,33	88,7
13	РЬА!	7,0	60	45	240	3,4	0,52	0,39	93,1

Пример 10. Рафинирование гидратацией при доведенном значении рН 7,0.

2002,2 г неочищенного соевого масла, содержавшего 640,1 м.д. фосфора, нагревали до 70°С при нормальном встряхивании с использованием подвесного смесителя. Добавляли 2,0 г 50% об./об. раствора лимонной кислоты и перемешивали со сдвигающим усилием в течение 1 мин. Масло подвергали нормальному встряхиванию в течение 1 ч с помощью подвесного смесителя. В масло добавляли 3,65 мл 4молярного раствора гидроксида натрия и перемешивали. Для нагревания масла добавляли 56,0 г деионизированной воды (всего 60 г воды, включая лимонную кислоту и гидроксид натрия). Смесь масло/вода встряхивали при 450 об/мин в течение 1 мин. Устройство для встряхивания замедляли до 100 об/мин на 30 мин для образования хлопьев и гидратации камедей. Затем обработанное водой масло центрифугировали и разделенные масло и влажные камеди собирали. Остаточный фосфор в рафинированном гидратацией масле составил 26,9 м.д., содержание РРА составляло 0,24%, и содержание ЭАС составляло 0,39%. Собранные влажные камеди весили 112,0 г.

Остаточный фосфор в примере 10, где рН доводили до 7 (26,9 м.д. Р) по сравнению с примером с исходным нейтральным значением рН (80,0 м.д. Р) продемонстрировал, что больше фосфолипидов были доступны либо для гидратации, либо для механического улавливания.

Кроме того, концентрации как фосфатидной кислоты, так и фосфатидилэтаноламина (НР) были увеличены в выделенных камедях, как видно из табл. 31.

Таблица 31

Фосфолипидный состав извлеченных камедей примеров 10-16

Про- гон	РС (%)	РЕ (%)	ΡΙ (%)	РА (%)	Лизо-РС (%)	Лизо- РЕ (%)	Лизо- ΡΙ (%)	Лизо- РА (%)	с (%)	Е(%)	1(%)	А(%)
7	7,62	7,78	4,19	2,81	0,59	0,48	0,34	0,26	ь.а.	ь.а.	ь.а.	0,18

8	0,30	0,88	6,15	3,84	0,67	0,22	0,51	0,67	3,91	2,79	0,06	0,31
9	8,29	8,31	ь.а.	3,11	0,71	0,56	ь.а.	0,48	0,42	0,20	4,63	0,23
10	1,12	1,74	0,74	3,34	0,36	0,09	ь.а.	0,59	3,87	2,62	1,85	0,30
11	0,40	0,51	0,42	0,18	7,78	7,06	4,40	3,83	ь.а.	ь.а.	ь.а.	0,24
12	0,30	0,50	0,50	0,09	8,47	7,72	4,66	4,10	ь.а.	ь.а.	ь.а.	0,24
13	0,14	0,43	0,07	ь.а.	7,65	7,31	3,97	3,26	0,06	ь.а.	0,10	0,24

Ь.б. = ниже предела детекции

Содержание влаги и нейтрального масла в выделенных камедях из примеров 10-16, описано в табл.

31а.

- 136 022979

Таблица 31а

Содержание влаги и нейтрального масла в выделенных камедях

Пример 11. Рафинирование с помощью РЬС при скорректированном значении рН 7,0.

2002,0 г неочищенного соевого масла, содержавшего 640,1 м.д. фосфора, нагревали до 70°С при нормальном встряхивании с использованием подвесного смесителя. Добавляли 2,0 г 50% об./об. раствора лимонной кислоты и перемешивали со сдвигающим усилием в течение 1 мин. Масло подвергали нормальному встряхиванию в течение 1 ч с помощью подвесного смесителя. Маслу позволяли остыть до 60°С, после чего в масло добавляли 3,65 мл 4-молярного раствора гидроксида натрия и перемешивали. При поддержании температуры при 60°С добавляли 0,50 г липазы РЬС Уегепшт Рипйпе® (номер партии 190ϋυ001Α1), а затем остальные 60 г деионизированной воды и всю смесь перемешивали со сдвиговым усилием в течение 60 мин. Масляную смесь встряхивали при нормальной скорости в течение 120 мин при температуре 60°С. Затем обработанное ферментом масло центрифугировали; и разделенные масло и влажные камеди собирали. Остаточный фосфор в масле, обработанном РЬС при доведенном кислотой/основании рН до 7,0, обеспечил рафинированное масло с остаточным фосфором 14,4 м.д. Содержание РРА составляло 0,21% и содержание ΏΑΟ составляло 1,11%. Собранные влажные камеди весили 80,0 г.

Результаты этого эксперимента демонстрируют как удаление фосфолипидов из масла, так и способность фосфолипазы конвертировать фосфолипиды в диацилглицерины в масле. Содержание диацилглицеринов возрастала по сравнению с исходным маслом (0,31%) или 0,34% в контрольном эксперименте по рафинированию гидратацией до 1-1,11% в эксперименте по рафинированию ферментом при доведенном значении рН до 7,0. Содержание остаточного фосфора в масле было снижено от 47,0 м.д. в контрольном эксперименте до 14,4 м.д. в эксперименте с доведением рН. Содержание других металлических микроэлементов также было значительно снижено, как продемонстрировано в табл. 32.

Таблица 32

Результаты по элементам для примеров 10-16

Прогон	Добавление фермента	Установленное рН	Фосфор (м.д.)	Кальций (м.д.)	Магний (м.д.)	Железо (м.д.)
7	Нет	7,0	26,9	7,80	2,71	0,35
8	РЬС	7,0	14,4	4,70	0,96	0,34
9	ΡΙ-РЬС	7,0	13,5	5,30	1,99	ь.а.
10	РЬС+Р1-РЬС	7,0	18,7	4,60	2,14	6.4.
11	РЬА1	5,5	1,6	0,82	0,34	0,01
12	РЬА1	6,5	3,4	2,56	0,95	ь.а.
13	ΡΕΑΙ	7,0	3,4	2,75	1,03	ь.а.

Важно признать, что количество собранных камедей было снижено до наиболее низкого уровня из всех экспериментов, представленных в заявке (80,0 г). Фосфолипидный состав демонстрирует, что практически все из РС и РЕ конвертировались в фосфохолин и фосфоэтаноламин (табл. 31) с образованием диацилглицеринов, найденных в выделенном масле. Количество фосфатидной кислоты также было снижено в собранных камедях, далее демонстрируя увеличенную доступность субстрата для гидратации/механического улавливания или доступность для ферментативной реакции.

Пример 12. Рафинирование РЕРЬС при рН, доведенном до 7,0 2000,0 г неочищенного соевого масла, содержавшего 694,1 м.д. фосфора, нагревали до 70°С при нормальном встряхивании с использованием подвесного смесителя. Добавляли 2,0 г 50% мас./мас. раствора лимонной кислоты и перемешивали со сдвигающим усилием в течение 1 мин. Масло подвергали нормальному встряхиванию в течение 1 ч с помощью подвесного смесителя. Маслу позволяли остыть до 60°С, после чего в масло добавляли 3,65 мл 4-молярного раствора гидроксида натрия и перемешивали. При поддержании температуры при 60°С в 10-мл стакан добавляли 0,0108 г РЙРЬС (8ЕЦ ГО NО: 8), предоставленной Уегепшт, и растворяли в 1 мл деионизированной воды. После растворения белка в воде в масло добавляли раствор фермента. Стакан промывали три раза приблизительно 1 мл воды, чтобы обеспечить добавление всего фермента. Добавляли остальную часть воды, чтобы общее количество добавленной воды составило 60 г. Всю смесь перемешивали со сдвиговым усилием в течение 60 мин. Масляную смесь встряхивали при нормальной скорости в течение 120 мин при температуре 60°С. Затем обработанное ферментом масло центрифугировали и

- 137 022979 разделенные масло и влажные камеди собирали. Остаточный фосфор в обработанном ΡΙ-РЬС масле с доведенным кислотой/основанием рН до 7,0 обеспечил рафинированное масло с остаточным фосфором 13,5 м.д. Содержание РРА составило 0,22% и содержание ОАО составило 0,61%. Собранные влажные камеди весили 100,8 г.

Как и в двух предшествующих примерах, количество РА, присутствующего в собранных камедях, было увеличено в экспериментах с доведенным рН относительно контрольных экспериментов. Кроме того, наибольшее количество РС и РЕ присутствовало в собранных камедях, отсюда 100,8 г влажных камедей. Поскольку фосфатидилинозитол-специфическая фосфолипаза преимущественно реагирует только с ΡΙ, увеличение ОАО было меньшим, чем в реакции фосфолипазы в эксперименте 8, и фосфоинозитол был преобладающим фосфосоединением, присутствовавшим в собранных камедях (табл. 31).

Пример 13. РЬС вместе с ΡΙ-РЬС, рафинирование при рН, доведенном до 7,0 2003,8 г неочищенного соевого масла, содержавшего 641,6 м.д. фосфора, нагревали до 70°С при нормальном встряхивании с использованием подвесного смесителя. Добавляли 2,0 г 50% мас./мас. раствора лимонной кислоты и перемешивали со сдвигающим усилием в течение 1 мин. Масло подвергали нормальному встряхиванию в течение 1 ч с помощью подвесного смесителя. Маслу позволяли остыть до 60°С, после чего в масло добавляли 3,65 мл 4-молярного раствора гидроксида натрия и перемешивали. При поддержании температуры при 60°С в масло добавляли 0,50 г липазы РЬС Уегепшт Ршгйпе® (номер партии 190Эи001А1), а затем в 10-мл стакан добавляли 0,0094 г ΡΙ-РЬС (ЗЕф ΙΌ ΝΟ: 8), предоставленной Уегепшт, и растворяли в 1 мл деионизированной воды. После растворения белка раствор фермента добавляли в масло. Стакан промывали три раза приблизительно 1 мл воды, чтобы обеспечить добавление всего фермента. Добавляли остальную часть воды, чтобы общее количество добавленной воды составило 60 г. Всю смесь перемешивали со сдвиговым усилием в течение 1 мин. Масляную смесь встряхивали при нормальной скорости в течение 120 мин при температуре 60°С. Затем обработанное ферментом масло центрифугировали и разделенные масло и влажные камеди собирали. Остаточный фосфор в РЬС-РЬРЬС в обработанном масле при рН, доведенном до 7,0, обеспечивал рафинированное масло с остаточным содержанием фосфора 18,7 м.д. Содержание РРА составляло 0,21% и содержание ОАО составляло 1,04%. Собранные влажные камеди весили 84,4 г.

Ограниченные количества собранных РС, РЕ и ΡΙ в камедях (табл. 31); большое количество фосфохолина, фосфоэтаноламина и фосфоинозитола в камедях (табл. 31); и высокий уровень диацилглицерина, присутствовавшего в выделенном масле, отчетливо демонстрирует ферментативную реакцию как РЬС, так и ΡΙ-РЬС, в неочищенном масле. Содержание извлеченного РА в камедях также было больше, чем в случае контрольной комбинации ферментов согласно примеру 7.

Пример 14. Рафинирование с помощью РЬА1 при рН, доведенном до 5,5 2001,2 г неочищенного соевого масла, содержавшего 641,6 м.д. фосфора, нагревали до 70°С при нормальном встряхивании с использованием подвесного смесителя. Добавляли 2,0 г 50% мас./мас. раствора лимонной кислоты и перемешивали со сдвигающим усилием в течение 1 мин. Масло подвергали нормальному встряхиванию в течение 1 ч с помощью подвесного смесителя. Маслу позволяли остыть при встряхивании при нормальной скорости до тех пор, пока температура не составила 45°С, затем в масло добавляли 2,55 мл 4молярного раствора гидроксида натрия и перемешивали. Добавляли 0,10 г Νογο/утек ЬесЬаке® ИНга (липаза РЬА1, номер партии ЬУ 05015), а затем всего 60 г деионизированной воды и всю смесь перемешивали со сдвиговым усилием в течение 60 мин. Смесь масла встряхивали при нормальной скорости в течение 240 мин при температуре 45°С. Затем обработанное ферментом масло центрифугировали и разделенные масло и влажные камеди собирали. Остаточный фосфор в масле, обработанном РЬА1 при рН

5.5, обеспечивал рафинированное масло с остаточным фосфором 1,6 м.д. Содержание РРА составляло 0,54%, и содержание ОАО составляло 0,33%. Собранные влажные камеди весили 91,7 г.

Пример 15. Рафинирование с помощью РЬА1 при рН, доведенном до 6,5 2001,6 г неочищенного соевого масла, содержавшего 641,6 м.д. фосфора, нагревали до 70°С при нормальном встряхивании с использованием подвесного смесителя. Добавляли 2,0 г 50% мас./мас. раствора лимонной кислоты и перемешивали со сдвигающим усилием в течение 1 мин. Масло подвергали нормальному встряхиванию в течение 1 ч с помощью подвесного смесителя. Маслу позволяли остыть при встряхивании при нормальной скорости до тех пор, пока температура не составила 45°С, а затем в масло добавляли 3,31 мл 4молярного раствора гидроксида натрия и перемешивали. Добавляли 0,10 г Νογο/утек ЬесЬаке® ИНга (липаза РЬА1, номер партии ΕΥΝ05015), а затем всего 60 г деионизированной воды и всю смесь перемешивали со сдвиговым усилием в течение 60 мин. Смесь масла встряхивали при нормальной скорости в течение 240 мин при температуре 45°С. Затем обработанное ферментом масло центрифугировали и разделенные масло и влажные камеди собирали. Остаточный фосфор в масле, обработанном РЬА1 при рН

6.5, обеспечил рафинированное масло с остаточным фосфором 3,4 м.д. Содержание РРА составило 0,51%, и содержание ОАО составило 0,33%. Собранные влажные камеди весили 88,7 г.

Пример 16. Рафинирование с помощью РЬА1 при рН, доведенном до 7,0 2001,6 г неочищенного соевого масла, содержавшего 641,6 м.д. фосфора нагревали до 70°С при нормальном встряхивании с использованием подвесного смесителя. Добавляли 2,0 г 50% мас./мас. раствора лимонной кислоты и пере- 138 022979 мешивали со сдвигающим усилием в течение 1 мин. Масло подвергали нормальному встряхиванию в течение 1 ч с помощью подвесного смесителя. Маслу позволяли остыть при встряхивании при нормальной скорости до тех пор, пока температура не составила 45°С, а затем в масло добавляли 3,31 мл 4молярного раствора гидроксида натрия и перемешивали. Добавляли 0,10 г Шуо/утек Ьесйаке® И1!га (липаза РЬА1, номер партии ΕΥΝ05015), а затем всего 60 г деионизированной воды и всю смесь перемешивали со сдвиговым усилием в течение 60 мин. Смесь масла встряхивали при нормальной скорости в течение 240 мин при температуре 45°С. Затем обработанное ферментом масло центрифугировали и разделенные масло и влажные камеди собирали. Остаточный фосфор в масле, обработанном РЬА1 при рН 7,0, обеспечивал рафинированное масло с остаточным фосфором 3,4 м.д. Содержание РРА составляло 0,52%, и содержание НАС составляло 0,39%. Собранные влажные камеди весили 93,1 г.

В примерах 14, 15, и 16 продемонстрирован эффект увеличения рН от оптимальных условий для фермента, составляющих 4,5, до рН, доведенного до 5,5, 6,5 и 7,0 соответственно, для фермента фосфолипазы А. Способность осуществлять реакцию при нейтральном рН 7,0 вместо 4,5 могла бы увеличить рентабельность промышленного процесса благодаря используемым для конструирования материалам и стоимости снижения рН до 3,5-4,2 для предупреждения загрязнения промышленного оборудования.

В общем, эксперимент 13 отчетливо демонстрирует, что можно получить низкий остаточный фосфор в масле, все еще при наличии способности к реакции всех фосфолипидов, присутствующих камедей, с образованием их лизоформ, таким образом, максимально увеличивая выход масла для этого типа ферментативной реакции.

На фиг. 14 сравниваются фосфолипидные составы контрольных реакционных смесей при нейтральных значениях рН относительно реакционных смесей с доведенным рН при рН 7,0 параллельно. Можно отчетливо видеть, что во всех реакционных смесях, где после обработки кислотой следовала обработка разбавленной щелочью для доведения водной фазы до нейтрального значения рН, возрастает уровень МНР в собранных камедях и/или обеспечивается конвертирование МНР либо в их лизоформы, либо в их фосфоформы, тем самым увеличивая общий выход и минимизируя какие-либо отходы, образующиеся в этом процессе.

На фиг. 15 сравнивается потеря нейтрального масла в фазу камеди в контрольных реакционных смесях при нейтральных рН относительно реакционных смесей с доведенным рН при рН 7,0 параллельно. Можно отчетливо видеть, что во всех реакционных смесях, где после обработки кислоты следовала обработка разбавленной щелочью для доведения водной фазы до нейтрального значения рН, уровень потери нейтрального масла в фазу камеди снизился.

На фиг. 16 сравнивается потеря нейтрального масла в фазу камеди при условиях различных рН, где используют фосфолипазу А1. Во всех реакционных смесях рН доводили за исключением нейтральной реакции. Продемонстрировано, что количество нейтрального масла является наименьшим, когда рН был доведен до 7,0, относительно даже нейтральной реакционной смеси без доведения, без добавления какойлибо кислоты или основания для способствования доступности ПИР процессу рафинирования.

Пример 17. Исследования распределения размера частиц.

В этом примере исследовали среднее распределение размера капель и преобладающий размер капель при обработке со сдвиговым усилием, применяемой в способах, предоставленных в настоящем документе, и способах, доступных в данной области (например, патенты США 4698185 и 6103505).

Размер частиц в этом исследовании анализировали с использованием анализатора размера частиц (капель) Ма1ует Мак1егк1/ег модели 2000, с вычислением распределения частиц и объема с помощью программного обеспечения, дополняющего оборудование.

Пример 17А. 300 г рафинированного соевого масла нагревали до 90°С в 600-мл стакане при нормальном встряхивании с использованием магнитной мешалки. К нему добавляли 1,8 г деионизированной воды, а затем 0,565 г фосфорной кислоты 85%. Затем смесь перемешивали со сдвигающим усилием в течение 30 с с использованием гомогенизатора ийга-Тштах Т-50 Ьакю с диспергирующим элементом З 50 Ν-С 45 С при 10000 (поставщик полагает, что этот гомогенизатор эквивалентен И1!га Тиггах Т-45, использованному в патентах США 4698185).

Затем образец образовавшейся эмульсии анализировали в Ма1ует 2000. Средний размер капель в водной фазе составлял 3,963 мкм и 90% водной фазы оказалась каплями с диаметром менее 6,675 мкм (табл. 33). Распределение капель представлено на фиг. 17.

- 139 022979

Таблица 33

Размер капель (мкм)	Распределение по объему (%)	Совокупное распределение по объему
Пример 17А	(%)
Пример 17А	Пример 17В	Пример 17ϋ	Пример 17С
Пример 17В	Пример 17ϋ	Пример 17С
1,259	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
1,445	0,13	0,00	0,01	0,00	0,13	0,00	0,01	0,00
1,660	2,38	0,91	0,09	0,01	2,51	0,91	0,10	0,01
1,905	5,25	4,62	0,10	0,10	7,76	5,53	0,20	0,11
2,188	7,63	7,51	0,09	0,23	15,39	13,04	0,29	0,34
2,512	9,37	9,76	0,08	0,35	24,76	22,80	0,37	0,69
2,884	10,44	11,18	0,15	0,49	35,20	33,98	0,52	1,18
3,311	10,84	11,71	0,37	0,67	46,04	45,69	0,89	1,85
3,802	10,62	11,45	0,87	0,90	56,66	57,14	1,76	2,75
4,365	9,95	10,60	1,73	1,20	66,61	67,74	3,49	3,95
5,012	8,95	9,35	2,98	1,60	75,56	77,09	6,47	5,55
5,754	7,72	7,89	4,62	2,12	83,28	84,98	11,09	7,67
6,607	6,30	6,27	6,50	2,77	89,58	91,25	17,59	10,44
7,586	4,78	4,58	8,49	3,56	94,36	95,83	26,08	14,00
8,710	3,21	2,92	10,26	4,46	97,57	98,75	36,34	18,46
10,000	1,80	1,23	11,51	5,46	99,37	99,98	47,85	23,92
11,482	0,62	0,00	11,94	6,45	99,99	100,00	59,79	30,37
13,183	0,01	0,00	11,41	7,30	100,00	100,00	71,20	37,67
15,136	0,00	0,00	9,99	7,97	100,00	100,00	81,19	45,64
17,378	0,00	0,00	7,90	8,27	100,00	100,00	89,09	53,91
19,953	0,00	0,00	5,57	8,23	100,00	100,00	94,66	62,14
22,909	0,00	0,00	3,34	7,81	100,00	100,00	98,00	69,95
26,303	0,00	0,00	1,61	7,06	100,00	100,00	99,61	77,01
30,200	0,00	0,00	0,39	6,08	100,00	100,00	100,00	83,09
34,674	0,00	0,00	0,00	4,97	100,00	100,00	100,00	88,06
39,811	0,00	0,00	0,00	3,85	100,00	100,00	100,00	91,91
45,709	0,00	0,00	0,00	2,82	100,00	100,00	100,00	94,73
52,481	0,00	0,00	0,00	1,96	100,00	100,00	100,00	96,69
60,256	0,00	0,00	0,00	1,28	100,00	100,00	100,00	97,97
69,183	0,00	0,00	0,00	0,79	100,00	100,00	100,00	98,76
79,433	0,00	0,00	0,00	0,47	100,00	100,00	100,00	99,23
91,201	0,00	0,00	0,00	0,27	100,00	100,00	100,00	99,50
104,713	0,00	0,00	0,00	0,17	100,00	100,00	100,00	99,67
120,226	0,00	0,00	0,00	0,11	100,00	100,00	100,00	99,78

Пример 17В. 2000 г рафинированного соевого масла нагревали до 90°С в 4000-мл стакане при нормальном перемешивании с использованием магнитной мешалки. К маслу добавляли 12 г деионизированной воды, а затем 3,767 г фосфорной кислоты 85%. Затем смесь перемешивали со сдвиговым усилием в течение 30 с с использованием гомогенизатора иНга-Тиггах Т-50 Ьакю с диспергирующим элементом З 50 Ν - Ο 45 Ο при 10000.

Затем образец образовавшейся эмульсии анализировали в Макегп 2000. Средний размер капель в водной фазе составлял 3,905 мкм, и 90% водной фазы оказалась каплями с диаметром менее 6,405 мкм (табл. 33). Распределение капель представлено на фиг. 18.

Пример 17С. 2000,3 г неочищенного соевого масла нагревали до 60°С в 4000-мл стакане при нормальном перемешивании с использованием магнитной мешалки. Добавляли 2,0 г 50% мас./мас. раствора лимонной кислоты и перемешивали со сдвигающим усилием в течение 1 мин. Добавляли 3,650 мл 4молярного раствора гидроксида натрия и перемешивали. Добавляли 0,50 г фермента Рипйпе РЬС, а затем всего 60 г деионизированной воды и всю смесь перемешивали со сдвигающим усилием в течение 30 с с использованием гомогенизатора ийга-Тиггах Т-50 Ьакю с диспергирующим элементом З 50 Ν-Ο 45 Ο при 10000 об/мин.

- 140 022979

Затем образец образовавшейся эмульсии анализировали в Макет 2000. Средний размер капель в водной фазе составлял 19,957 мкм, и 90% водной фазы оказалась каплями с диаметром менее 36,998 мкм (табл. 33). Распределение капель представлено на фиг. 19.

Пример 17Ό. 0,6 л (приблизительно 560 г) рафинированного соевого масла нагревали до 40°С в 600мл стакане при рециркуляции с помощью смесителя $1кегкоп. Смеситель охлаждали на водяной бане, чтобы избежать увеличения температуры в ходе эксперимента. Добавляли 0,6 г 50% об./об. раствора лимонной кислоты, а затем 1,095 мл 4-молярного раствора гидроксида натрия. Добавляли 0,028 г (50 м.д.) фермента РЬА ЬесРаке иДга, а затем всего 16,8 г деионизированной воды.

Затем через 15 мин для обеспечения уравновешивания системы отбирали образец образовавшейся эмульсии. Затем образец образовавшейся эмульсии анализировали в Макет 2000. Средний размер капель в водной фазе составлял 12,691 мкм, и 90% водной фазы оказалась каплями с диаметром менее 20,333 мкм (табл. 33). Распределение капель представлено на фиг. 20. Являясь встроенным смесителем $1кегкоп продолжал снижать размер капель, в конечном итоге обеспечивая средний размер частиц 9 мкм.

На фиг. 21 представлено наложение размеров капель (частиц) из примеров 17А, 17В, 17С и 17Ό.

Как видно из данных, пример 17С обеспечивал очень отчетливый профиль распределения капель с наиболее высоким средним размером частиц. Было выявлено, что средний размер частиц согласно примеру 17С был приблизительно в 5 раз больше, чем согласно примерам 17А и 17В, и в 1,6 раз больше, чем согласно примеру 17Ό.

Как видно из данных, для примера 17С выявлено, что более 76% водной фазы находится в каплях с диаметром более 10 мкм, в то время как для примера 17А было выявлено, что 52% водной фазы находится в каплях с диаметром более 10 мкм, для примера 17Ό было выявлено, что менее 0,65% водной фазы находится в каплях диаметром более 10 мкм.

Пример 18. Сравнительное исследование камедей, полученных различными способами.

В этом примере предоставлены сравнительные данные для обработки масла способами, описанными в патенте США № 4698185, и способом, описанным в примерах 4-16 выше.

Различные масла (приведенные в табл. 35) обрабатывают согласно следующему протоколу, как описано в патенте США № 4698185:

нагревают масло до более чем 75°С, добавляют воду для увеличения концентрации до 0,6% мас.%, к рафинированному гидратацией маслу добавляют приблизительно 20-60 мас.% фосфорной кислоты, кислоту диспергируют в течение 30 с, перемешивание продолжают в течение 3 мин, добавляют раствор щелочи в количестве приблизительно 2 об.%, смесь центрифугируют в течение 30 мин при 5000 об/мин, масляную фазу отделяют и промывают 2 мас.% деминерализованной воды, промывочную воду удаляют центрифугированием в течение 30 мин при 5000 об/мин, содержание камедей в масле анализируют.

В табл. 35 предоставлены данные для состава камедей, отделенных от обработанных образцов масла.

- 141 022979

Таблица 35

Тип масла	Соевое	Подсолнечное	Из зародышей кукурузы	Рапсовое	Арахи- совое
Фосфолипиды
РА	55	49	37	72	53
ЬРА	6	20	-	6	-
РС	4	8	26	<1	15
ЬРС РЕ	<1 17	9	13	13	7
ЬРЕ	<1	5		2
Кардиолипин Ν-
ацилфосфати-	13	9	19	7	24
дилэтаноламин
ΡΙ	4	-	5	-
Не идентифицирован	-	-		-

В табл. 36 ниже представлены данные для фосфолипидов в образцах масла, обработанных согласно примерам 10, 11, 12, 13 и 16 выше.

Таблица 36

	Пример 10	Пример 11	Пример 12	Пример 13	Пример 16
Фосфолипиды
РА	11,6	18,9	11,6	20,1	0,0
ЬРА	1,1	3,3	1,8	3,6	14,1
	Пример 10	Пример 11	Пример 12	Пример 13	Пример 16
А	0,7	1,5	0,9	1,8	1,0
РС	31,4	1,5	31,0	6,7	0,6
ЬРС	2,4	3,3	2,7	2,2	32,9
С	ь.а.	19,3	1,6	23,3	0,3
РЕ	32,1	4,3	30,4	10,5	1,9
ЬРЕ	2,0	1,1	1,0	0,5	31,5
Е	ь.а.	13,7	11,2	15,8	ь.а.
ΡΙ	17,3	30,3	9,6	4,4	0,3
ЬР1	1,4	2,5	ь.а.	ь.а.	17,1
Г'	ь.а.	0,3	17,3	11,2	0,4

В табл. 37 ниже обобщенно представлены используемые ферменты, рН реакционной смеси и данные для фосфолипидов в образцах масла, обработанных согласно примерам 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11, 12, 13 и 16 выше.

Таблица 37

	РС	РЕ	ΡΙ	РА	ЬРС	ЬРЕ	ЬР1	ЬРА	С	Е	I	А	Фермент	рн
1	39,5	30,2	16,5	8,4	2,4	1,4	1,4	0,0	0,0	0,0	0,0	0,3	Нет	Нейтральный
7	31,4	32,1	17,3	11,6	2,4	2,0	1,4	1,1	0,0	0,0	0,0	0,7	Нет	7,0
2	1,1	11,3	29,1	15,9	2,4	0,5	2,2	1,6	21,6	13,3	0,0	1,1	РЬС	Нейтральный
8	1,5	4,3	30,3	18,9	3,3	1,1	2,5	3,3	19,3	13,7	0,3	1,5	РЬС	7,0
3	41,5	29,3	0,0	8,8	2,2	1,3	0,0	0,0	0,2	0,1	16,2	0,5	Р1-РЬС	Нейтральный
9	31,0	30,4	0,0	11,6	2,7	2,1	0,0	1,8	1,6	0,7	17,3	0,9	Р1-РЬС	7,0
4	13,6	17,6	9,6	15,8	2,5	1,0	0,0	2,0	18,5	11,2	7,2	1,0	РЬС+Р1-РЬС	Нейтральный
10	6,7	10,5	4,4	20,1	2,2	0,5	0,0	3,6	23,3	15,8	11,2	1,8	РЬС+Р1-РЬС	7,0
5	0,9	1,6	2,7	1,1	32,2	29,3	17,3	14,1	0,0	0,0	0,0	0,7	РЬА1	Нейтральный
13	0,6	1,9	0,3	0,0	32,9	31,5	17,1	14,1	0,3	0,0	0,4	1,0	РЬА!	7,0

Как видно из данных, фосфолипиды, полученные способами, описанными в настоящем документе, обладают уникальным составом.

Варианты осуществления заявленного объекта, описанные выше, являются только иллюстративными, и специалистам в данной области будет понятно или они будут способны установить с использованием не более чем обычного экспериментирования многочисленные эквиваленты конкретных соединений, материалов и методик. Все такие эквиваленты считаются находящимися в объеме заявленного объекта и охватываемыми прилагаемой формулой изобретения.

Хотя изобретение подробно описано применительно к его определенным иллюстративным аспектам, будет понятно, что модификации и варианты находятся в пределах сущности и объема, который описан и заявлен.

Claims (19)

1. Выделенная, синтетическая или рекомбинантная нуклеиновая кислота (полинуклеотид), содержащая или состоящая из последовательности нуклеиновой кислоты:

(а) кодирующей полипептид, обладающий активностью фермента фосфатидилинозитолспецифической фосфолипазы С (ΓΙ-РЬС), и (ΐ) имеющей по меньшей мере примерно 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более или 100% идентичность последовательности с 8Ε^ ΙΌ NО: 5 и

- 142 022979 кодирующей полипептид, имеющий по меньшей мере одно или все из аминокислотных изменений (мутаций), состоящих из Ν176Ρ, Ц191С, Υ205Ε Ц244Т, Υ252Ρ, Υ276Ρ, 8282Н, Ь284Р и Ρ291Ν, где нумерация аминокислотных изменений начинается с 31 аминокислоты 8ЕЦ ГО ΝΌ: 6 или эквивалентных аминокислотных замен или мутаций, или любую их комбинацию;

(ίί) кодирующей полипептид, обладающий аминокислотной последовательностью, как указано в 8ЕЦ ГО МО: 6, и имеющий по меньшей мере одно или все из аминокислотных изменений или замен (мутаций), состоящих из Ν176Ρ, Ц191С, Υ205Ε Ц244Т, Υ252Ρ, Υ276Ρ, 8282Н, Ь284Р и Ρ291Ν, где нумерация аминокислотных изменений начинается с 31 аминокислоты 8ЕЦ ГО NО: 6, или эквивалентных аминокислотных изменений или замен (мутаций), или любую их комбинацию; или (ш) нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из последовательности 8ЕЦ ГО NО: 7, 8ЕЦ ГО NО: 9 или 8ЕЦ ГО NО: 10; или (ίν) имеющей по меньшей мере примерно 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более или 100% идентичности последовательности с 8ЕЦ ГО NО: 7, 8ЕЦ ГО NО: 9 или 8ЕЦ ГО NО: 10;

(b) последовательности нуклеиновой кислоты из (а), кодирующей полипептид, обладающий ферментативной активностью Р1-РЬС, но не имеющий нативной сигнальной последовательности или аминокислотной последовательности пробелка;

(c) последовательности нуклеиновой кислоты из (а) или (Ь), кодирующей полипептид, обладающий ферментативной активностью Р1-РЬС, но не имеющий нативной промоторной последовательности;

(б) последовательности нуклеиновой кислоты из (с), дополнительно содержащей гетерологичную промоторную последовательность или другую последовательность регуляции транскрипции;

(е) последовательности нуклеиновой кислоты по любому из (а)-(б), дополнительно содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую гетерологичную аминокислотную последовательность, или дополнительно содержащая гетерологичную нуклеотидную последовательность;

(Г) нуклеиновой кислоты из (е), где нуклеиновая кислота, кодирующая гетерологичную аминокислотную последовательность, содержит или состоит из последовательности, кодирующей гетерологичную (лидерную) сигнальную последовательность, или метку, или эпитоп, или гетерологичной нуклеотидной последовательности, содержащей гетерологичную промоторную последовательность;

(д) последовательности нуклеиновой кислоты, полностью комплементарной нуклеотидной последовательности по любому (а)-(Г).

2. Вектор, кассета экспрессии, вектор экспрессии, плазмида или носитель для клонирования:

(a) содержащий последовательность нуклеиновых кислот по п. 1; или (b) вектор, кассета экспрессии, вектор экспрессии, плазмида или носитель для клонирования по (а), включающий или содержащийся в вирусном векторе, фаге, фагмиде, космиде, фосмиде, бактериофаге, искусственной хромосоме, аденовирусном векторе, ретровирусном векторе или аденоассоциированном вирусном векторе или бактериальной искусственной хромосоме (ВАС); векторе, полученном из бактериофага Р1 (РАС); дрожжевой искусственной хромосоме ^АС) или искусственной хромосоме млекопитающих (МАС).

3. Клетка-хозяин или трансформированная клетка:

(a) содержащая последовательность нуклеиновых кислот по п.1 или вектор, кассету экспрессии, вектор экспрессии, плазмиду или носитель для клонирования по п.2; или (b) клетка-хозяин или трансформированная клетка по (а), в которой клетка является бактериальной клеткой, клеткой млекопитающего, грибковой клеткой, дрожжевой клеткой, клеткой насекомого или растительной клеткой.

4. Выделенный, синтетический или рекомбинантный полипептид, обладающий активностью фермента фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С (Р1-РЬС), и (a) содержащий аминокислотную последовательность (ί) имеющую по меньшей мере примерно 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более или 100% идентичность последовательности с 8ЕЦ ГО NО: 6 и имеющую по меньшей мере одно или все из аминокислотных изменений или замен (мутаций), состоящих из Ν176Ρ, Ц191С, Υ205Ε, Ν244Χ Υ252Ρ, Υ276Ρ, 8282Н, Ε284Ρ и Ρ291Ν, где нумерация аминокислотных изменений начинается с 31 аминокислоты 8ЕЦ ГО НО: 6 или эквивалентных аминокислотных изменений или замен (мутаций), или любую их комбинацию;

(ίί) кодированную нуклеиновой кислотой по п.1;

(ίίί) имеющую по меньшей мере примерно 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более или 100% идентичность последовательности с 8ЕЦ ГО ХО: 8;

(b) полипептид по (а), но не имеющий нативной сигнальной последовательности и/или последовательности пробелка;

(c) полипептид по (а) или (Ь), дополнительно содержащий гетерологичную аминокислотную последовательность или гетерологичную часть;

(б) полипептид по (с), в котором гетерологичная аминокислотная последовательность или гетерологичная часть содержит или состоит из гетерологичной (лидерной) сигнальной последовательности, маркера, выявляемой метки или эпитопа;

- 143 022979 (е) полипептид по любому из (а)-(Л), в котором (ί) полипептид является гликозилированным или полипептид содержит по меньшей мере один участок гликозилирования, (ίί) полипептид из (ί), в котором гликозилирование является Ν-связанным гликозилированием или О-связанным гликозилированием; (ίίί) полипептид по (ί) или (ίί), где полипептид гликозилирован после экспрессии в дрожжевой клетке; или (ίν) полипептид по (ίίί), где дрожжевой клеткой является клетка Р.рак!опк или З.ротЬе;

(ί) полипептид по любому из (а)-(е), дополнительно содержащий или содержащийся в композиции, включающей по меньшей мере один второй фермент или по меньшей мере один второй фермент фосфолипазы; или (д) полипептид по (ί), в котором по меньшей мере один второй фермент фосфолипазы содержит полипептид, имеющий последовательность, указанную в ЗЕЦ ГО ΝΟ: 2 и/или ЗЕЦ ГО ΝΟ: 4, или по меньшей мере один из их вариантных РЬС ферментов, как описано в табл. 8 и 9.

5. Белковый препарат, содержащий полипептид по п.4, где белковый препарат содержит жидкость, твердое вещество или гель.

6. Полипептид по п.4, в котором полипептид иммобилизован на клетке, металле, смоле, полимере, керамике, стекле, микроэлектроде, частице графита, грануле, геле, пластине, чипе или капиллярной трубке.

7. Чип, содержащий иммобилизованный полипептид по п.4 или иммобилизованную нуклеиновую кислоту, указанную в п.1; или их комбинацию.

8. Способ получения рекомбинантного полипептида, включающий:

(a) обеспечение последовательности нуклеиновой кислоты по п.1 и (b) трансформацию клетки-хозяина нуклеиновой кислотой с этапа (а) с последующей экспрессией нуклеиновой кислоты с этапа (а) с получением, таким образом, рекомбинантного полипептида в трансформированной клетке.

9. Способ модификации кодонов в нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид фосфолипазы, где способ включает:

(a) обеспечение нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид с фосфолипазной активностью, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты по п.1; и (b) идентификацию кодона в нуклеиновой кислоте с этапа (а) и замену его на отличающийся кодон, кодирующий ту же самую аминокислоту, что и замещенный кодон, таким образом, модифицируя кодоны в нуклеиновой кислоте, кодирующей фосфолипазу.

10. Детергентная композиция, содержащая полипептид по п.4 или полипептид, кодированный последовательностью нуклеиновой кислоты по п.1.

11. Композиция, содержащая полипептид по п.4 или полипептид, кодированный последовательностью нуклеиновых кислот по п.1.

12. Способ приготовления вариантной последовательности, кодирующей фосфолипазу, обладающей повышенной экспрессией в клетке-хозяине, включающий модификацию последовательности нуклеиновых кислот по п.1, так чтобы один, несколько или все мотивы, кодирующие участки Ν-связанного гликозилирования, были модифицированы в негликозилируемый мотив.

13. Композиция, содержащая смесь ферментов, включающая:

(ί) полипептид по п.4 и (ίί) по меньшей мере один второй фермент.

14. Композиция по п.13, в которой по меньшей мере один второй фермент является ферментом фосфолипазы.

15. Композиция по п.14, в которой по меньшей мере один второй фермент фосфолипазы содержит полипептид, указанный в ЗЕЦ ГО ΝΟ: 2 и/или ЗЕЦ ГО ΝΟ: 4, или по меньшей мере один из вариантных РЬС ферментов, описанных в табл. 8 и 9.

16. Сухой экстракт барды ГООЗ), сухая гранулированная барда (НОС), конденсированный экстракт барды (СОЗ), влажный экстракт барды ГО\7С) или сухая гранулированная барда с растворимыми веществами ГООСЗ), содержащие полипептид по п.4 или композицию по пп.13-15.

17. Биомасса, содержащая полипептид по п.4 или композицию по пп.13-15.

18. Биомасса по п.17, где биомасса является или содержит животную биомассу, биомассу водорослей и/или растительную биомассу, или липидсодержащую биомассу, или лигноцеллюлозную биомассу, или отходный материал.

- 144 022979

Фиг. 1

Фиг. 2

Фиг. 3

- 145 022979

Фиг. 4

Фиг. 5

Фиг. 6

ФЛС биодегумирование

- 146 022979

Фиг. 7

Фиг. 8

Фиг. 9

Мутация

Исход- Мутироный ванный кодон кодон

Е41А ОАО ОСА Е41\Л/ ОАО ТОО Е41Е ОАО ттс Ε41Υ ОАО ТАС Е41Р ОАО СОТ Е94Р ОАО ссс ОЮОЬ САТ ттс ϋ100Μ ОАТ АТО ϋ100Υ ОАТ ТАТ ϋ100Ε ОАТ ТТТ ϋΐοονν ОАТ ТОО А104Ь ОСТ стт Ω111Ρ ОАТ АОС Τ112Ρ АСТ сое Υ116\Λ/ ТАТ ТОО 1117У7 АТТ ТОО Р118\Л/ ССТ ТОО Ε125Κ ОАА ААО Ω17ΐν ОАТ ото Ω171Ε ОАТ ОАО Μ176\Λ/ АТО ТОО ϋ230Η ОАТ САТ ϋ230Ρ ОАТ сот Ω234\Λ/ ОАТ ТОО Ο234ν ОАТ ото □2340 ОАТ оот Ω234Ρ ОАТ соо Ω234Κ ОАТ ААО Ω265Ρ ОАО СОТ

Массовые доли всех фосфолипидов после реакции

РА ΡΙ ΡΙ/ΡΑ (ΤΙΡ/Ρ)/ РА РЕ ΡΙ РС (мкм) (МКМ) (МКМ) (ΡΑ/ΤΙΡ)

Исходный (δΕΩ Ю N0:175) Исходный (δΕΩ Ю N0:175) Положительный контроль (Е41 А)

Отрицательный контроль Отрицательный контроль

0.083 0.000 0.337 0.000 234 0.061 0.000 0.301 0.000 173 0.056 0.000 0.294 0.000 158 0.000 0.000 0.276 0.000 0 0.000 0.000 0.293 0.000 0 0.044 0.000 0.359 0.000 124 0.030 0.000 0.396 0.000 84 0.034 0.000 0.270 0.000 97 0.069 0.000 0.318 0.000 195 0,096 0.000 0.374 0.000 268 0.057 0.000 0.330 0.000 162 0,086 0.000 0.428 0.000 245 0.093 0.000 0.347 0.000 264 0.051 0.000 0.292 0.000 143 0.067 0.000 0.301 0.000 189 0.052 0.000 0.338 0.000 145 0.074 0.000 0.317 0.000 209 0.021 0.000 0.359 0.000 59 0.048 0.000 0.308 0.000 135 0.053 0.000 0.308 0.000 148 0.045 0.000 0.302 0.000 127 0.051 0.000 0.312 0.000 145 0.057 0.000 0.297 0.000 162 0.043 0.000 0.310 0.000 120 0.045 0.000 0.280 0.000 126 0.074 0.000 0.000 0.000 209 0.072 0.000 0.278 0.000 205 0.082 0.000 0.280 0.000 230 0.021 0.000 0.340 0.000 59 0.119 0.450 0.357 0.643 338 0.096 0.346 0.234 0.517 270

Фиг. 10

Высвобождение

ДАГ (гек Ьу НРЬС)

985 4.209 7.445 1.407 878 5.075 10.973 1.339 859 5.437 12.015 1.354 806 #ϋΐν/0! #οιν/οι 1.358 854 #ϋΐν/0! #ϋΐν/0! 1.350 1043 8.411 12.023 1.343 1150 13.690 17.307 1.338 792 8.165 21.728 1.226 926 4.749 9.388 1.273 1087 4.056 5.476 1.304 971 5.994 10.530 1.302 1256 5.127 5.450 1.300 1018 3.856 6.288 1.288 851 5.951 14.102 1.376 875 4.630 9.938 1.352 986 6.800 12.003 1.430 927 4.435 8.391 1.463 1055 17.881 26.363 1.481 893 6.615 13.569 1.366 896 6.054 13.100 1.339 881 6.937 14.552 1.382 915 6.310 13.574 1.349 873 5.389 12.320 1.377 897 7.475 16.582 1.344 809 6.421 15.011 1.336 0 0.000 #Ωΐν/0! 1.441

816 3.980 9.948 1.338 811 3.526 9.186 1.428 985 16.690 28.320 1.470 1049 3.104 4.672 0.466 681 2.522 9.093 0.417

- 147 022979

Мутанты, полученные с помощью сайт-насыщающего мутагенеза генов С85М, выбранные для включения в библиотеку повторной сборки генов.

Фиг. 11

Фиг. 12

Фиг. 13

- 148 022979

Фиг. 14

Фиг. 15

Фосфолипаза А1

Нейтральный Подведен до 7,0

Фиг. 16

149

Фиг. 17

Фиг. 20

- 150 022979

Распределение частиц по размеру

Размер частиц (мкм) (1) Анализ 4, повторный запуск 2, понедельник, 17 августа, 2009, 11:55:14 (2) Анализируемая эмульсия 2, четверг, 13 августа, 2009, 16:26:10 (3) Анализ 5, повторный запуск 2, понедельник, 17 августа, 2009,13:14:14 (4) Поточное смешивание с высоким сдвиговым усилием с фосфолипазой А2, понедельник, 24 августа 2009, 13:37:52

Фиг. 21

Список последовательностей <110> ϋ3Μ ΙΡ АззеЛз Β.ν.

ϋΑΥΤΟΝ, СЬгтзЛорЬег Ь. 6. САЬНАКЬО, Е1ачто Ыа Βίΐνβ ΒΑΚ.ΤΟΝ, Νβΐ3οη

ΗΙΤ0ΗΜΑΝ, ТттоЛЬу ΣΥΟΝ, ДопаЛЬап Ο'ΟΟΝΟΟΗυΕ, ЕПееп ЫАЬЬ, Магк <120> ФОСФОЛИПАЗЫ, КОДИРУЮЩИЕ ИХ НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ, И СПОСОБЫ ИХ ПРОИЗВОДСТВА И ПРИМЕНЕНИЯ <130> 011631-051-228 <140> Еще не присвоен <140> Прилагается совместно <160> 10 <170> ЕазЛЗЕО £ог ЫтпДомз Уегзтоп 4.0 <210> 1 <211> 738 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Полученная синтетически <400> 1

ЛддЛсадсЛд аддаЛаадса ЛааЛдадддд аЛЛаасЛсЛс дсааЛЛдаса ЛсаЛдЛсЛсд ЛааЛасаасд аЛЛдЛдааЛс ааЛдадЛддс дЛдсЛдаЛЛЛ адааааЛддЛ аЛЛЛаЛЛсЛд ЛаЛдаЛдаЛа дЛасаЛаЛдс ЛЛсЛсасЛЛЛ ЛаЛдаЛссдд ссЛЛЛЛдсда аасаЛдсааа адааасаддс дсааааЛаЛЛ ЛассааааЛс аадаЛаЛдса дсаадсаЛЛс ЛЛсЛасЛЛад ддадаЛдЛда аЛсадссааЛ дсаЛдсадса ЛсЛЛЛЛасдд ЛЛссаЛЛсЛа ааЛасдаааа ЛЛЛЛдЛЛдаЛ асааЛааааа адсааЛддаЛ аЛЛддааЛЛд даааддадса аасссадаад дЛадсадсЛа аасаадаЛЛа ЛссЛддсдЛЛ дЛдаасдаЛа ааадсадссд ЛаЛсЛсаада аЛаЛдсадаЛ аааЛддсдЛд ддааадсдЛЛ ЛааЛддаадс дсадсдсдЛЛ асадсЛддЛЛ асдЛаЛдЛаа аЛсдсЛаа <210> 2 <211> 245 <212> БЕЛОК <213> Искусственная <220>

<223> Полученная синтетически <400> 2

Тгр Зег А1а С1и Азр Ьуз Нтз Азп С1и С1у Не 15 10

11е Уа1 Азп Агд А1а 11е Азр 11е МеЛ Зег Агд

20 25 аЛЛЛдЛддаЛ сдааЛдааас сЛдаЛЛасда аЛасЛддаас

ЛЛаассЛЛдс даЛЛаЛсдсЛ аЛсЛЛЛсЛЛа аЛаасЛаЛаЛ аЛЛддаЛЛда сдасаааада сддаадЛаас аЛаЛЛсаЛЛЛ

ЛдЛаааЛсдЛ

ЛдсаЛЛаЛЛа дааЛссЛЛаЛ аасаЛаЛаЛЛ

ЛддЛсаадса

ЛсаЛЛаЛЛЛа

ЛссааЛдддЛ

ЛдЛЛЛсадаЛ аддадсадсд

ЛЛддЛЛЛдЛа ассддЛдаса дЛддЛЛЛдаЛ

Азп Зег Нтз Ьеи Тгр 15

Азп ТЬг ТЬг 11е Уа1 30

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

738

151

Азп Рго Азп Б1и ТЬг А1а Ьеи Ьеи Азп Е1и Тгр Агд А1а Азр Ьеи Б1и 35 40 45

Азп Е1у Не Туг Зег А1а Азр Туг С1и Азп Рго Туг Туг Азр Азр Зег 50 55 60

ТЬг Туг А1а Зег Шз РЬе Туг Азр Рго Азр ТЬг Б1у ТЬг ТЬг Туг 11е

65 70 75 80

Рго РЬе АЬа Ьуз Шз А1а Ьуз Б1и ТЬг Е1у А1а Ьуз Туг РЬе Азп Ьеи

АЬа 61у Б1п А1а Туг Е1п Азп Е1п Азр МеЬ Е1п Б1п А1а РЬе РЬе Туг 100 105 110

Ьеи Б1у Ьеи Зег Ьеи Шз Туг Ьеи С1у Азр Уа1 Азп Б1п Рго МеЬ Шз 115 120 125

А1а А1а Зег РЬе ТЬг Азр Ьеи Зег Туг Рго Меи Е1у РЬе НЬз Зег Ьуз

130 135 140

Туг Е1и Азп РЬе Уа1 Азр ТЬг Т1е Ьуз Азп Азп Туг 11е Уа1 Зег Азр

145 150 155 160

Зег Азп Е1у Туг Тгр Азп Тгр Ьуз Е1у А1а Азп Рго Е1и Азр Тгр 11е

165 170 175

Е1и Е1у АЬа А1а Уа1 А1а А1а Ьуз Е1п Азр Туг Рго Е1у Уа1 Уа1 Азп

180 185 190

Азр ТЬг ТЬг Ьуз Азр Тгр РЬе Уа1 Ьуз А1а А1а Уа1 Зег Е1п Е1и Туг

195 200 205

АЬа Азр Ьуз Тгр Агд А1а Б1и Уа1 ТЬг Рго Уа1 ТЬг Е1у Ьуз Агд Ьеи

210 215 220

МеЬ Е1и А1а Е1п Агд Уа1 ТЬг А1а Е1у Туг 11е Шз Ьеи Тгр РЬе Азр 225 230 235 240

ТЬг Туг Уа1 Азп Агд

245 <210> <211> <212> <213>

ДНК

Искусственная

Полученная синтетически <4 00>

дЬадЬ;

аада аадЬаЬЬадс асЬадсадсЬ аЬддЬЬдсЬЬ ЬадсЬдсдсс адЬЬсааадЬ 60

ЬЬЬд сасааасааа ЬааЬадЬдаа адЬссЬдсас сдаЬЬЬЬаад аЬддЬсадсЬ 120 даддаЬаадс аЬааЬдаддд даЬЬаасЬсЬ саЬЬЬдЬдда ЬЬдЬаааЬсд ЬдсааЬЬдас 180 аЬсаЬдЬсЬс дЬааЬасаас даЬЬдЬдааЬ ссдааЬдааа сЬдсаЬЬаЬЬ аааЬдадЬдд 240 сдЬдсЬдаЬЬ ЬадааааЬдд ЬаЬЬЬаЬЬсЬ дсЬдаЬЬасд адааЬссЬЬа ЬЬаЬдаЬдаЬ 300 адЬасаЬаЬд сЬЬсЬсасЬЬ ЬЬаЬдаЬссд даЬасЬддаа саасаЬаЬаЬ ЬссЬЬЬЬдсд 360 ааасаЬдсаа аадааасадд сдсааааЬаЬ ЬЬЬаассЬЬд сЬддЬсаадс аЬассааааЬ 420 саадаЬаЬдс адсаадсаЬЬ сЬЬсЬасЬЬа ддаЬЬаЬсдс ЬЬсаЬЬаЬЬЬ аддадаЬдЬд 480 ааЬсадссаа ЬдсаЬдсадс аЬсЬЬЬЬасд даЬсЬЬЬсЬЬ аЬссааЬддд ЬЬЬссаЬЬсЬ 540 аааЬасдааа аЬЬЬЬдЬЬда ЬасааЬаааа ааЬаасЬаЬа ЬЬдЬЬЬсада ЬадсааЬдда 600

ЬаЬЬддааЬЬ ддаааддадс ааасссадаа даЬЬддаЬЬд ааддадсадс ддЬадсадсЬ 660 ааасаадаЬЬ аЬссЬддсдЬ ЬдЬдаасдаЬ асдасаааад аЬЬддЬЬЬдЬ аааадсадсс 720 дЬаЬсЬсаад ааЬаЬдсада ЬаааЬддсдЬ дсддаадЬаа сассддЬдас аддааадсдЬ 780

ЬЬааЬддаад сдсадсдсдЬ ЬасадсЬддЬ ЬаЬаЬтсаЬЬ ЬдЬддЬЬЬда ЬасдЬаЬдЬа 840 ааЬсдсЬаа 849 <211> 282 <212> БЕЛОК <213> Искусственная :223>

Полученная синтетически :220>

<221> СИГНАЛ <222> (1) ... (37) <400> 4

МеЬ Ьуз Ьуз Ьуз Уа1 Ьеи А1а Ьеи А1а А1а МеЬ Уа1 А1а Ьеи А1а А1а 1 ‘ 5 10 15

Рго Уа1 Е1п Зег Уа1 Уа1 РЬе А1а Е1п ТЬг Азп Азп Зег Е1и Зег Рго

20 25 30

А1а Рго Не Ьеи Агд Тгр Зег А1а Е1и Азр Ьуз Шз Азп Е1и Е1у Не

35 40 45

Азп Зег Шз Ьеи Тгр Не Уа1 Азп Агд А1а Не Азр Не МеЬ Зег Агд

50 55 60

Азп ТЬг ТЬг Не Уа1 Азп Рго Азп Е1и ТЬг А1а Ьеи Ьеи Азп С1и Тгр

65 70 75 80

Агд А1а Азр Ьеи Е1и Азп Е1у Не Туг Зег А1а Азр Туг Б1и Азп Рго

Туг Туг Азр Азр Зег ТЬг Туг А1а Зег Шз РЬе Туг Азр Рго Азр ТЬг 100 105 110

Е1у ТЬг ТЬг Туг Не Рго РЬе А1а Ьуз Шз А1а Ьуз Е1и ТЬг Е1у А1а 115 120 125

Ьуз Туг РЬе Азп Ьеи А1а Б1у Б1п А1а Туг Б1п Азп Б1п Азр МеЬ Е1п

130 135 140

Б1п А1а РЬе РЬе Туг Ьеи О1у Ьеи Зег Ьеи Шз Туг Ьеи Б1у Азр Уа1

145 150 155 160

Азп Б1п Рго МеЬ Шз АЬа А1а Зег РЬе ТЬг Азр Ьеи Зег Туг Рго МеЬ

165 170 175

С1у РЬе Шз Зег Ьуз Туг Б1и Азп РЬе Уа1 Азр ТЬг 11е Ьуз Азп Азп

180 185 190

Туг Не Уа1 Зег Азр Зег Азп Б1у Туг Тгр Азп Тгр Ьуз Б1у АЬа Азп

195 200 205

Рго С1и Азр Тгр Не Б1и Б1у А1а А1а Уа1 АЬа АЬа Ьуз С1п Азр Туг

210 215 220

Рго С1у Уа1 Уа1 Азп Азр ТЬг ТЬг Ьуз Азр Тгр РЬе Уа1 Ьуз АЬа АЬа

225 230 235 240

Уа1 Зег С1п Б1и Туг АЬа Азр Ьуз Тгр Агд АЬа Б1и Уа1 ТЬг Рго Уа1

245 250 255

ТЬг Е1у Ьуз Агд Ьеи МеЬ О1и АЬа Е1п Агд Уа! ТЬг АЬа Е1у Туг Не

260 265 270

Шз Ьеи Тгр РЬе Азр ТЬг Туг Уа1 Азп Агд

275 280 <210> 5 <211> 987 <212> ДНК <213> Неизвестно <220>

<223> ДНК, полученная ι ι образца из окружающей среды <400> 5 аЬдаасааЬа адаадЬЬЬаЬ ЬЬЬдаадЬоа ЬгсаЬаЬдЬа дЬаЬддЬасЬ ЬадсдссЬЬЬ 60 дЬаЬЬЬдсЬЬ ЬсааЬдаЬаа даааассдЬЬ дсадсоадсь сЬаЬЬааЬдЬ дсЬЬдааааЬ 120 ЬддЬсЬадаЬ ддаЬдааасс ЬаЬаааЬдаЬ дасаЬассдь ьадсасдааЬ ЬЬсааЬЬсса 180 сдаасасаЬд аЬадЬддаас дЬЬсаадЬЬд сааааЬссда ЬааадсаадЬ дЬддддааЬд 240 асдсаадааЬ аЬдаЬЬЬЬсд ььаьсаааьд даЬсаЬддад сЬадааЬЬЬЬ ЬдаЬаЬаада 300 дддсдЬЬЬаа садаЬдаЬаа сасдаЬадЬЬ сЬЬсаЬсаЬд ддссаЬЬаЬа ЬсЬЬЬаЬдЬа 360 асасЬдсасд ааЬЬЬаЬааа сдаадсдааа сааЬЬЬЬЬаа аадаЬааЬсс аадЬдааасд 420 аЬЬаЬЬаЬдЬ сЬЬЬаааааа ададЬаЬдад даЬаЬдааад дддсддааад сЬсаЬЬЬадЬ 480 адЬасдЬЬЬд адаааааЬЬа ЬЬЬЬсдЬдаЬ ссааЬсЬЬЬЬ Ьааааасада адддааЬаЬа 540 аадсЬЬддад аЬдсЬсдЬдд дааааЬЬдЬа ЬЬасЬааааа даЬаЬадЬдд ЬадЬааЬдаа 600 ЬсЬдддсдаЬ аЬааЬааЬЬЬ сЬаЬЬддсса дасааЬдада сдЬЬЬассЬс аасЬаЬаааЬ 660 сааааЬдЬаа аЬдЬаасадЬ асаадаЬааа ЬаЬааадЬда дЬЬаЬдаЬда дааааЬааас 720 дсЬаЬЬааад аЬасаЬЬааа ЬдааасдаЬЬ аасааЬадЬд аадаЬдЬЬаа ЬсаЬсЬаЬаЬ 780 аЬЬааЬЬЬЬа саадсЬЬдЬс ЬЬсЬддЬддЬ асадсаЬдда аЬадЬссаЬа ЬЬаЬЬаЬдсд 840

- 152 022979

РссРасаРаа аРссРдаааР РдсаааРРаР аРдаадсааа адааРссРа РддаРааРас аадаРРаРаР аааРдааааа РддРсассаР РасРРРаРс ададсдааРа адРсасРРдР ааааРад <210> 6 <211> 328 <212> БЕЛОК <213> Неизвестно дададрдддс 900 адаадРРаРа 960

987 <220>

<223> Белок, полученный из образца из окружающей средь:

<220>

<221> СИГНАЛ <222> (1)...(23) <220>

<221> ДОМЕН <222> (56)...(195) <223> Фосфатидилиноэитол-специфическая фосфолипаза С, домен X

Ьеи Зег А1а

Зег Зег 11с 35

Азп Азр Азр 50

Зег С1у ТЬг 65

ТЬг С1п С1и

РЬе Азр II

Ьуз РЬе Не Ьеи Ьуз 5

Уа1 РЬе А1а РЬе Азп 25

Уа1 Ьеи С1и Азп Тгр 40

Рго Ьеи А1а Агд 11е 55

Ьуз Ьеи С1п Азп Рго 70

Азр РЬе Агд Туг С1п 85 ; Агд С1у Агд Ьеи ТЬг Азр 100 105

Низ С1у Рго Ьеи Туг Ьеи Туг Уа1 ТЬг 115 120

А1а Ьуз С1п РЬе Ьеи Ьуз Азр Азп Рго 130 135

Не Суз

Ьуз ТЬг

Тгр Мер 45

Рго С1у 60

С1п Уа1

Нтз С1у

ТЬг Не

Зег Мер Уа1

Уа1 А1а А1а ЗС

Ьуз Рго Не

ТЬг Низ Азр

Тгр С1у Мер 80

А1а Агд Не 95

Уа1 Ьеи Низ НО

СТи РЬе Не Азп С1и 125

ТЬг Не Не Мер Зег 140

Ьеи Ьуз Ьуз С1и Туг С1и Азр Мер Ьуз С1у А1а С1и Зег Зег РЬе Зег 145 150 155 160 Зег ТЬг РЬе СЬи Ьуз Азп Туг РЬе Агд Азр Рго Не РЬе Ьеи Ьуз ТЬг 165 170 175 СТи СТу Азп Не Т.уз Ьеи С1у Азр АТа Агд С1у Ьуз Не Да1 Ьеи Ьеи 180 185 190 Ьуз Агд Туг Зег СТу Зег Азп С1и Зег СТу 61у Туг Азп Азп РЬе Туг

195 200

Тгр Рго Азр Азп СТи ТЬг РЬе ТЬг 3

ТЬг

215

Азр Ьуз Туг Ьуз 7а1 Зег 230

210

Да1 ТЬг Уа1 225 '

А1а Не Ьуз Азр ТЬг Ьеи Азп 61и ТЬ:

245

Азп Низ Ьеи Туг 11е Азп РЬе ТЬг Зе: 260

Тгр Азп Зег 275

Азп Туг Мер 290

Азр Туг Не 305

265

Рго Туг Туг Туг А1а Зег 280

Ьуз С1п Ьуз Азп Рго ТЬг 295

Азп С1и Ьуз Тгр Зег Рго 310

205

Не Азп С1п Азп Уа1 Азп 220

Туг Азр С1и Ьуз Не Азп 235 240

Азп Азп Зег С1и Азр Да1

255

Зег Зег С1у С1у ТЬг А1а 270

Не Азп Рго СТи Не АТа 285

С1у Тгр Не Не С1п 300

Туг СЬп СТи УаТ Не

Уа1 (

Агд АТа Азп Ьуз ί <210>

<211>

<212>

897

ДНК <213> Искусственная <400> 7 аРддсРадсР дасаРассдР саааарссда даРсаРддад сааРРРРРаа даРаРдааад ссааРсРРРР

РРасРааааа дасааРдада

РаРааадРда аасааРасРд асадсаРдда аРРаадсааа

РддсаРссаР

РадсасдааР

РааадсаадР ддссаРРаРа аадаРааРсс дддсддааад

Рааааасада даРарадРдд сдРРиассРс дРРРддаРда аадаРдРРаа сдадРссаРа адааРссРас

РасРРРаРса дсРРдааааР

РРсааРРсса дРддддааРд

РдаРаРаада

РсРРРаРдРа аадрдааасд сРсаРРРадР дааааРааас с

РРаРРаРдсд 1 дададрдддс 1 адаадРРаРа е

РддРсРадаР ддаасасаРд асдсаадааР дддсдРРРаа асасРдсасд аРРаРиаРдР адРасдРРРд аадсррддад

РсРдддддаР ддРааРдРаа зРааРРРРа асаддараа ддаРдааасс арадрддаас оадаРдаРаа оРРРаааааа аРдсРсдРдд аРааРРРРРР аРдРаасадР аРасаРРааа адРсасРРдР

РаРаааРдаР дРРсаадРРд

РРаРсаааРд

РасдаРадРР сдаадсдааа ададрардад

РРРРсдРдаР дааааРРдРа сРаРРддсса

РРсРддРддР

РдсаааРРаГ аааРдааааа

120

180

240

720

780

840 <211> 298 <212> БЕЛОК <213> Искусственная <400> 8

Мер А1а Зег Зег Не Азп Уа1

1 5

Рго Не Азп Азр Азр Не Рго

Низ Азр Зег С1у ТЬг РЬе Ьуз 35

С1у Мер ТЬг 61п С1и Туг Азр 50 55

Агд Не РЬе Азр 11с Агд С1у 65 70

Ьеи Низ Низ СТу Рго Ьеи Туг

Азп СЬи АТа Ьуз СТп РЬе Ьеи 100

Мер Зег Ьеи Ьуз Ьуз С1и Туг С 115 ;

РЬе Зег Зег ТЬг РЬе С1и Ьуз 1 130 135

Ьуз ТЬг СТи С1у Азп Не Ьуз I 145 150

Ьеи Ьеи Ьуз Агд Туг Зег СТу ί ί Тгр , Не

ТЬг 1

Уа1 ^г 90

Азп I

Мер 1

РЬе 1

Азр 1 ί Е1и : 170 ; ТЬг :

Зег Агд Тгр

Зег Не Рго 30 > Не Ьуз СЬп 45 ί Мер Азр Лиз 6 С ) Азр Азп ТЬг : Ьеи Низ С1и ) Зег С1и ТЬг 110 ; С1у А1а СТи 125 ί Азр Рго Не 140 : Агд СТу Ьуз : С1у С1у Туг : ТЬг 11е Азп

МеР Ьуз 15

С1у ТЬг

Уа1 Тгр

С1у А1а

Не \/а1 80

РЬе Не 95

Не Не

Зег Зег

РЬе Ьеи

Не УаЬ 160

Азп РЬе

- 153 022979

Уа1 Азп Уа1 ТЬг \7а1 С1п Азр Ьуз Туг Ьуз Уа1 Зег Ьеи Азр С1и Ьуз 195 200 205

Не Азп А1а 11е Ьуз Азр ТЬг Ьеи Азп С1и ТЬг 11е Азп Азп Зег С1и 210 215 220

Азр Уа1 Азп Низ Ьеи Туг 11е Азп РЬе ТЬг Зег Ьеи Зег Зег С1у С1у

225 230 235 240

ТЬг А1а Тгр ТЬг Зег Рго Туг Туг Туг А1а Зег Агд 11е Азп Рго С1и

245 250 255

11е А1а Азп Туг 11е Ьуз С1п Ьуз Азп Рго ТЬг Агд 7/а1 С1у Тгр 11е

260 265 270

11е С1п Азр РЬе Не Азп 61и Ьуз Тгр НЬз Рго Ьеи Ьеи Туг С1п С1и

275 280 285

Уа1 Не Азп А1а Азп Ьуз Зег Ьеи \Ы Ьуз

290 295 <210> <211> <212> <213>

900

ДНК

Искусственная <220>

<223> Полученная синтетически <400> 9 аЬддссадса дасаЬсссдс садаасссда дассасддсд сЬдсассасд садРЬссЬда дасаОдаадд ссдаЬсНсс сЬссЬдаадс дасаасдааа

ЬасааддЬда аасаасадсд ассдссЬдда аЬсаадсада

Ьддсасссдс дсаЬсаасдЬ

ЬддсссдсаЬ

ЬсаадсаддЬ сссдсаЬсН дсссдсЬдЬа аддасаассс дсдссдааад

Ьдаадассда дсЬасадсдд ссНсассад дссЬддасда аадасдЬдаа ссадсссдЬа адаасссдас

ЬдсЬдЬасса ссЬсдаааас садсаЬсссд сЬддддсаЬд сдасаЬссдс ссЬдЬасдЬд дадсдааасс садсНсадс аддсаасаЬс садсаасдаа сассаЬсаас ааадаЬсаас ссассЬдЬас сЬасЬасдсс ссдсдЬдддс ддаадЬдаЬс

ЬддЬсдсдсЬ ддсасссасд асссаддааЬ ддссдссЬда асссЬдсасд аЬсаЬсаЬда адсассНсд аадсЬдддсд адсддсддсЬ ддсаасдЬда дссаЬсаадд аЬсаасНса адссдсаЬса

ЬддаЬсаЬсс аасдсдааса ддаЬдаадсс асадсддсас асдасНссд ссдасдасаа ааНсаЬсаа дссЬдаадаа аааадаасЬа асдсссдсдд асаасНсН асдЬдассдЬ асасссЬдаа ссадссЬдад асссддаааЬ аддасНсаЬ ададссЬддЬ даЬсаасдас сНсаадсЬд сЬассадаЬд сассаЬсдЬд сдаадссаад адааЬасдаа сНссдсдас саадаЬсдЬс сЬасЬддссд дсаддасаад сдааассаЬс садсддсддс сдссаасЬас саасдаааад саадЬдаЬда

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720 <210>

<211>

<212>

<213>

900

ДНК

Искусственная

Полученная синтетически

4 0 0>

аЬддсдадса даЬаЬсссас садаасссаа дассасддсд сЬдсассасд садЬЬссЬда дасаЬдаадд ссдаННсс сЬдЬЬдаадс даЬаасдааа

ЬасааддЬса ааЬаасадсд ассдссЬдда дсаЬсаасдЬ

ЬддсссдЬаЬ

ЬсааасаддЬ сссддаЬсЬЬ ддссдсЬдЬа аддасаассс дддсддадад

Ьдаадассда ддЬасадсдд ссЬЬсасЬЬс дссЬсдасда аддасдЬдаа ссадсссдЬа сЬЬддадаас сЬсдаЬсссд сЬддддсаЬд сдасаЬссдд ссЬдЬасдЬд дадсдааасс

НсдИсадс дддсаасаЬс садсаасдад дасдаЬсаас ааадаЬсааЬ ссасЬЬдЬас сЬасЬасдсд

ЬддЬсссддЬ ддсасссасд асссаддадр дддсдссЬда ассПдсаЬд аЬсаЬсаЬдЬ адсассНсд ааасЬдддсд

ЬссдддддсЬ ддсаасдЬда дссаЬсаадд аЬсаасНса адЬсдЬаЬса ддаЬдаадсс асадсддсас асдасНссд ссдасдасаа адЬЬсаЬсаа сссЬдаадаа аааадаасЬа асдсссдсдд асаасНсИ асдЬдассдЬ асасссЬдаа ссадЬсЬсЬс ассссдадаЬ саЬсаасдас сЬЬЬааасЬс сЬассадаЬд сассаЬсдЬд

Ьдаддсдаад адааЬасдаа сНссдсдас саадаЬсдЬд

ЬЬасЬддссд дсаддасаад сдадассаЬс сЬссддсддс сдссаасЬас

240

300

360

540

600

660

720

780 аЬсааасада аааассссас ссдддЬсддЬ ЬддаЬсаЬсс аддасЬЬсаЬ саасдадаад Ьддсасссдс ЬдсЬдЬасса ддаддЬдаЬс аасдсдааса ааЬсдсЬддЬ даадЬдаЬда

840

900