KR101661706B1 - 미생물로부터 리소포스파티딜에탄올아민 18:1의 생산 방법 - Google Patents

미생물로부터 리소포스파티딜에탄올아민 18:1의 생산 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 미생물로부터 추출된 인지질에 포스포리파아제 A2 (phospholipase A2)를 처리하여 리소포스파티딜에탄올아민 (lysophosphatidylethanolamine) 18:1을 생산하는 방법 및 상기 방법에 의해 생산된 리소포스파티딜에탄올아민 18:1에 관한 것으로, 본 발명의 리소포스파티딜에탄올아민 18:1은 식물체의 생장 저해 부작용 없이 식물체의 면역 반응을 증가시키기 위한 백신 재료 및 과일 저장성 증진용 조성물로 사용될 수 있으며, 더 나아가 식품, 의약품, 화장품 및 농업용으로 사용될 수 있어 관련 산업에 매우 유용하다.

Description

미생물로부터 리소포스파티딜에탄올아민 18:1의 생산 방법{Method for producing lysophosphatidylethanolamine 18:1 from microorganisms}
본 발명은 미생물로부터 리소포스파티딜에탄올아민 18:1 (lysophosphatidylethanolamine 18:1, 이하 LPE18:1)의 생산 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 슈도모나스 시린개 피브이. 토마토 DC3000 (Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000, 이하 Pst)로부터 추출된 인지질에 포스포리파아제 A2 (phospholipase A2, 이하 PLA2)를 처리하여 LPE18:1을 생산하는 방법 및 상기 방법에 의해 생산된 LPE18:1에 관한 것이다.
리소포스파티딜에탄올아민(lysophosphatidylethanolamine)은 세포막 주요 구성성분 인지질(Phospholipids) 중의 하나인 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine)에서 두 번째 아실 체인 (2nd acyl chain)이 PLA2 효소활성에 의하여 떨어져 나가면서 생성되며 생체 내에 소량으로 존재한다. 리소포스파티딜에탄올아민를 처리하였을 때 식물체 노화를 억제하고 과일의 숙성(ripening)을 촉진한다는 것이 밝혀졌다(미국등록특허 제5110341호 및 미국등록특허 제5126155호). 리소포스파티딜에탄올아민은 주로 계란 노른자위나 콩에서 추출한 포스파티딜에탄올아민에 PLA2 효소를 처리하여 생산되며, 조성 성분은 대부분 1st 아실 체인이 16:0 또는 18:0인 LPE16:0과 LPE18:0이다. 리소포스파티딜에탄올아민이 어떠한 생체 기작으로 노화를 억제하는지 연구하는 과정에서 LPE18:1이 LPE16:0 또는 LPE18:0 보다 훨씬 생체 효능이 뛰어난 superior molecule임을 밝혔다 (미국등록특허 제6426105호). 현재까지 리소포스파티딜에탄올아민 제조방법에 대한 기술은 계란 노른자위 또는 콩을 소재로 사용하여 성분이 대부분 LPE16:0과 LPE18:0이고 LPE18:1은 거의 없다(한국등록특허 제0331932호). 이에 LPE18:1를 생성시키는 소재를 찾는 노력이 있었으나 찾지 못하였다.
본 발명은 LPE18:1을 생산할 수 있는 소재가 슈도모나스와 같은 미생물에 있는 것을 밝힌 것으로 상세한 연구방법과 결과를 아래에 기술한다. 병원균이 식물체에 침입을 하면 식물체는 일부의 병원균에 대하여 병 저항성 반응을 일으키는데 그 기작이 아직 잘 밝혀져 있지 않다. 특히 초기 병저항성 유도 신호전달기작에 대한 정보가 많이 있지 않다. 그동안 avrRpm1를 지닌 슈도모나스 시린개 피브이. 토마토 DC3000 (Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000, 이하 Pst - avrRpm1)이 숙주 식물체 애기장대 (Arabidopsis thaliana, Col-0 ecotype)의 세포외 공간에 침투하면, 병원균은 Avr 단백질 (avrRpm1)을 타입 Ⅲ 분비 기작을 통해 숙주의 세포질로 도입시키는데, 만약 숙주 세포가 avrRpm1 단백질을 인식하는 저항 단백질인 RPM1을 가지고 있으면, 상기 단백질간의 상호작용은 살리실산의 증가, NPR1 (NON-EXPRESSER OF PR GENES 1)의 활성화 및 PR (PATHOGENESIS - RELATED) 유전자의 발현 등과 같은 저항 유전자 유도 면역 반응을 이끌어낸다고 알려져 있었다. 그러나, 이러한 gene-for-gene 상호작용을 연결하는 상위 단계의 분자, 유전학 기반 및 식물체의 저항 유전자 유도 숙주 면역 반응은 대부분 밝혀져 있지 않았다.
본 발명자들은 이러한 밝혀져 있지 않은 초기 신호전달 연구에서 LPE18:1이 식물체의 병저항성을 유도하는 신호전달 인자인 것을 밝혔다. 놀랍게도 LPE18:1이 침입하는 병원균 (슈도모나스)에서 주로 생성되어 나오는 것을 밝혔다. 연구결과를 요약하면 비병원성 슈도모나스(Pst-avrRpm1)가 애기장대 식물체에 침입하면 avrRpm1 단백질을 세포내에 주입하는데 이때 식물체가 이 단백질 인자를 gene-for-gene interaction으로 인식하고, 곧 포스포리파아제 A2-alpha (PLA2α) 단백질을 발현시킨다. PLA2α 단백질은 침입한 병원균들이 있는 세포 밖으로 분비되어 나가 병원균의 막에 있는 포스파티딜에탄올아민을 분해하여 LPE18:1을 주요성분으로 생성시킨다. 이 LPE18:1은 신호전달물질 기능을 발휘하여 주위로 퍼져나가 병원균이 침입하지 않은 이웃세포 안으로 들어가 병 저항성을 유도시킨다.
상기한 연구결과에서 보듯이 LPE18:1을 생성시키는 소재가 슈도모나스 등과 같은 미생물에 있음을 알 수 있었다. 이에 본 발명자들은 슈도모나스(Pst)를 대량 배양한 다음 지질을 추출하고 PLA2 효소를 처리하여 LPE18:1이 대량 생성되는 것을 확인하였다. 이러한 자체 제조한 LPE18:1를 식물체에 살포하여 생체효과를 기존의 LPE16:0/LPE18:0 혼합액 그리고 상업적으로 판매되는 높은 순도의 LPE18:1와 비교하였다. 미생물 슈도모나스에서 자체 제조한 LPE는 대부분 LPE18:1과 LPE16:0이었으며 극히 소량의 LPE16:1이 들어 있었다. 자체 제조한 crude LPE18:1은 효과 면에서 LPE16:0/LPE18:0 mixture보다 좋았으며 pure LPE18:1 보다는 낮았다. 또한, LPE18:1를 생성시키는 소재를 슈도모나스 외의 미생물에서도 얻을 수 있는지 조사하였다. 그람 음성 세균인 대장균(E. coli), 그람 양성 세균인 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis), 아쓰로박터 시트레서스(Arthrobacter citresus), 효모인 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 및 조류인 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris)에 대해서 인지질을 분리하여 분석한 결과, 다른 미생물에서는 PLA2를 처리하였을 때 LPE18:1가 거의 생성되지 않았고 오직 슈도모나스에서만 생성되었다.
한편, 한국공개특허 제2002-0086604호에는 '식물의 건강을 증진시키고, 생물적 및 비생물적 스트레스관련 손상으로부터 식물을 보호하고, 그러한 스트레스의 결과로서 손상된 식물의 회복을 높이는 방법'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제1997-0001484호에는 '병에 대해 식물을 면역시키기 위한 방법 및 조성물'이 개시되어 있으나, 본 발명의 미생물로부터 리소포스파티딜에탄올아민 18:1의 생산 방법에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 포스포리파아제 A2α (PLA2α)에 의해 식물체에 침입한 병원균인 슈도모나스 시린개의 세포막 인지질로부터 식물 면역성을 유도하는 리소포스파티딜에탄올아민 18:1이 생성되는 것을 확인하였고, 이를 토대로 슈도모나스(Pst)를 대량 배양한 다음 지질을 추출하고 PLA2 효소를 처리하여 LPE18:1이 대량 생성되는 것을 확인하였다. 또한, LPE18:1의 소재를 슈도모나스 외의 미생물에서도 얻을 수 있는지 조사하기 위해, 그람 음성 세균인 대장균(E. coli), 그람 양성 세균인 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis), 아쓰로박터 시트레서스(Arthrobacter citresus), 효모인 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 및 조류인 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris)에 대해서 인지질을 추출하여 PLA2를 처리한 결과, 다른 미생물에서는 LPE18:1를 포함한 LPE의 생성이 많지 않았고 오직 슈도모나스에서만 뚜렷이 생성되는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 슈도모나스 미생물을 대량 배양한 후 지질을 추출한 다음 동물에서 구한 PLA2를 처리하여 LPE18:1를 대량생산할 수 있는 점을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 미생물로부터 추출된 인지질에 포스포리파아제 A2 (phospholipase A2)를 처리하여 리소포스파티딜에탄올아민 (lysophosphatidylethanolamine) 18:1을 생산하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 리소포스파티딜에탄올아민 18:1을 제공한다.
본 발명에 따르면, 포스포리파아제 A2α에 의해 식물체에 침입한 병원균의 세포막 인지질로부터 식물 면역성을 유도하는 리소포스파티딜에탄올아민 18:1이 생성되고 식물체의 국소적 면역 반응이 유발되는 것을 확인하였다. 본 발명의 포스포리파아제 A2 처리에 의해 생산된 리소포스파티딜에탄올아민 18:1은 천연 유래의 물질로, 식물체의 생장 저해 부작용 없이 식물체의 면역 반응을 증가시키기 위한 백신 재료 및 과일 저장성 증진용 조성물로 사용될 수 있으며, 더 나아가 식품, 의약품, 화장품 및 농업용으로 사용될 수 있어 관련 산업에 매우 유용하다.
도 1은 pla2 α 변이 식물체에서 국소적인 면역력이 손상된 것을 확인한 결과로, A와 B는 Pst - avrRpm1 인필트레이션 6일 후에 야생형 식물체와는 다르게 pla2 α(녹아웃) 및 pla2 α-Ⅱ(녹다운) 변이 식물체의 전체 식물체(A) 및 잎(B)에서 과민성 반응 지역을 넘어 질병의 증상이 진행되는 것을 관찰한 사진이다. C와 D는 야생형 식물체와 pla2 α 변이 식물체의 잎에서 Pst - avrRpm1(avrRpm1), Pst -avrRpt2(avrRpt2), Pst - avrRps4(avrRps4) 및 독성의 Pst(Pst)를 인필트레이션한 15시간 후의 과민성 반응(C) 및 이온 누출(D)을 확인한 결과이다. NT: 무처리 대조군. E는 Pst - avrRpm1 인필트레이션 후 8시간째에 식물체에서 PR 및 PDF1 .2 유전자의 발현 수준을 확인한 것이다(*P<0.05). F는 야생형 식물체, pla2 α 변이 식물체 및 native-프로모터::PLA2α로 보상된 pla2 α 변이 식물체(PLA2α/pla2 α)에서 감염 세균의 성장을 분석한 결과이다(*P<0.05, **P<0.01).
도 2는 PLA 2 α 아이소폼 발현 및 pla2 α 변이 식물체의 특징을 분석한 결과로, A는 Pst-avrRpm1 접종에 의한 네 종류의 PLA2 아이소폼의 발현 수준을 확인한 결과이고, B는 pla2α 및 pla2α-Ⅱ 변이체의 게노믹 상의 T-DNA 삽입 위치를 나타내는 모식도이며, C는 야생형 및 변이체 식물체에서 PLA 2 α 유전자의 발현 수준을 확인한 결과이고, D는 Pst-avrRpm1 접종 후 야생형과 pla2α 변이 식물체에서 PR1 유전자의 발현 수준을 확인한 결과이며, E는 Pst-avrRpm1 접종 후 야생형과 pla2α 변이 식물체에서 시간 경과에 따른 이온 누출을 확인한 결과이다. F와 G는 각각 Pst-avrRpt2 및 Pst-avrRps4 접종 후 야생형과 pla2α 변이 식물체에서 질병의 증상 관찰 사진과 세균의 증식을 분석한 결과이다.
도 3은 일시적인 PLA2α의 발현이 LPE와 같은 지질 산물의 생성에 미치는 영향을 확인한 결과로, A는 Pst - avrRpm1(avrRpm1)로 접종한 야생형 식물체에서 PLA2α의 발현을 확인한 것이고, B는 Pst - avrRpm1 및 Pst 인필트레이션 1.5시간 뒤 PLA 2 α 프로모터::GUS 형질전환 애기장대 식물체에서 GUS 활성을 분석한 사진이고, C는 야생형 식물체에서 병원균 접종 3시간 후 생성되는 지질 산물을 분석한 결과이고, D는 pla2 α 변이 식물체에서 병원균 접종, 병원균 접종 및 재조합 PLA2α 단백질 처리에 따른 지질 산물을 분석한 결과이고, E는 mock 처리 잎과 Pst - avrRpm1 접종 3시간 후의 야생형 잎에서 LPE 종류들의 각 수준을 분석한 결과이고, F는 살아있는 Pst-avrRpm1, 세균 지질 추출물 및 잎 조직과 PLA2α 단백질을 혼합한 현탁액으로부터 방출되는 LPE 종류들을 분석한 결과이고, G는 재조합 PLA2α 단백질의 항균 능력을 확인한 결과로, M은 mock, P는 PLA2α 단백질, PM은 PLA2α 단백질과 마노알리드의 혼합 그리고 PMM은 PLA2α 단백질과 마노알리드 버퍼(에탄올)의 혼합을 처리한 것을 의미한다(*P<0.05, **P<0.01). H는 방사선 표지한 Pst - avrRpm1를 야생형 식물체의 잎에 접종한 후 3시간 뒤 방사능의 정도를 확인한 결과이다.
도 4는 Pst - avrRpm1로 접종한 식물체의 잎에서 유리지방산(FFA)의 수준을 분석한 결과이다.
도 5는 LPE18:1에 의한 pla2 α 변이 식물체의 국소적인 면역 반응의 회복을 확인한 결과로, A는 Pst - avrRpm1 감염된 pla2 α 변이 식물체에 LPE, LPC 및 LPG를 처리하여 표현형적 결함이 회복되는지를 관찰한 사진이고, B는 Pst - avrRpm1 감염된 pla2α 변이 식물체에 LPE 또는 LPG를 처리하고 감염 세균의 성장을 분석한 결과이며, C는 mock 처리 또는 LPE를 처리한 야생형 잎에서 PR 유전자, 상처 관련 유전자들의 발현 수준을 분석한 결과이고, D는 야생형 식물체와 pla2 α 변이 식물체에서 LPE 처리에 의한 국소적인 면역력의 획득에 관해 확인한 결과이고, E는 LPE에 의한 국소적인 면역력 획득을 설명하는 독성의 Pst에 대한 병 저항성 증가의 모습을 보여주는 사진이며, F는 in vitro상에서 LPE 자체의 Pst에 대한 항균 활성이 있는지 분석한 결과이다(*P<0.05, **P<0.01).
도 6은 LPE가 PR 유전자 발현에 미치는 영향을 확인한 결과로, A는 LPE 처리 용량에 따른 PR1 유전자의 발현 수준을 확인한 결과이고, B는 LPE에 의한 PR 유전자들 및 상처 관련 유전자들의 발현 수준을 RT-PCR로 확인한 결과이며, C와 D는 각각 리소인지질 종류 및 유리지방산 종류에 따른 PR1 유전자의 발현 수준을 RT-PCR로 확인한 결과이다.
도 7은 LPE에 의한 ICS1-의존적 살리실산 생합성 및 NPR1 활성화를 확인한 결과로, A와 C는 유전자 발현 수준을 확인한 결과이며, B와 D는 살리실산 수준을 분석한 결과이다. E는 35S::NPR1 - eGFP를 지닌 형질전환 식물체에 mock, LPE 또는 살리실산을 처리하고 NPR1의 세포질에서 핵으로의 위치변화를 확인한 이미지이다.
도 8은 LPE 매개 저항성 반응이 ICS1과 NPR1에 의존적임을 보여주는 결과로, 야생형과 변이체(sid2 및 npr1)에서 Pst - avrRpm1 또는 LPE를 처리하고 PR1 유전자의 발현수준을 RT-PCR로 확인한 결과이다.
도 9는 PLA2α 단백질과 LPE에 의해 매개되는 에틸렌-의존적 PDF1 .2의 발현을 확인한 결과로, A와 D는 유전자 발현 수준의 변화를, B와 E는 에틸렌 합성 수준을 그리고 C와 F는 자스몬산의 합성 수준을 분석한 결과이다(*P<0.05, **P<0.01).
도 10은 ein2 변이 식물체에서 LPE가 PDF1 .2 발현을 유도하지 못한 것을 확인한 결과이다.
도 11은 국소적인 면역 반응에 있어서 PLA2α-유래 지질 시그날링의 관계를 확인한 결과로, A는 pla2 α 변이 식물체에 버퍼, Dsbc 또는 PLA2α 단백질을 인필트레이션한 후 ICS1과 PR1 유전자의 발현 수준을 확인한 것이고, B 및 C는 야생형 및 변이체(eds1 및 pad4)에서 ICS1과 PR1 유전자의 발현 수준을 확인한 결과이다. D는 본 발명의 PLA2α 단백질과 LPE 사이의 상호작용 및 신호체계를 모식화한 그림이다.
도 12는 pla2α 변이 식물체의 결함이 정상보다 덜 성숙한 잎과 단일 생장 식물체 잎에서는 크지 않음을 보여주는 결과로, 국소적인 면역 반응의 유도를 위해 PLA2α의 활성 및 PLA2α의 아포플라스트의 분비가 중요함을 확인한 결과이다. A는 야생형과 pla2α 변이 식물체에 살리실산(SA)를 처리하고, PR1 유전자의 발현 정도를 시간 경과별로 확인한 결과이고, B는 mock 처리, PLA2α 단백질 처리 및 PLA2α 단백질 및 저해제(Mano)를 함께 처리한 군에서 PR1 유전자의 발현을 분석한 결과이고, C는 PLA 2 α의 발현 수준이 과발현 식물체(OE)에서 높게 발현됨을 확인한 결과이고, D는 Pst-avrRpm1 접종 후 pla2α 변이 식물체에서 생장 조건(SD, 9시간 광주기의 단일조건; LD, 16시간 광주기의 장일조건) 및 잎의 성숙도 정도를 구분하여 세균 성장을 확인한 결과이다(*P<0.05, **P<0.01). E는 PLA2α 저해제를 전처리하고 Pst -avrRpm1 접종한 후 야생형과 pla2α 변이 식물체에서 세균 성장을 분석한 결과이고, F는 신호 펩티드가 없어 아포플라스트로 분비하지 못하고 세포질에 머물게 되는 PLA2α 구조의 벡터를 pla2α 변이 식물체에 형질전환(no S.P. PLA2α/pla2α)한 후, Pst-avrRpm1를 접종하여 세균 성장을 분석한 결과이다.
도 13은 포스포리피드(phospholipid, PE)에 포스포리파아제 A2 (phospholipase A2)를 처리한 경우 리소포스파티딜에탄올아민 (lysophosphatidylethanolamine, LPE)이 생성되는 원리를 보여주는 그림이다.
도 14는 슈도모나스의 인지질 추출물에 포스포리파아제 A2를 처리하여 생산된 LPE를 확인한 결과이다. 슈도모나스에서 추출한 인지질에 포스포리파아제 A2 처리하기 전(상)와 후(하)를 HPLC-ELSD 분석법으로 PE의 분해 및 LPE의 생성을 확인할 수 있다.
도 15는 슈도모나스의 인지질 추출물에 포스포리파아제 A2를 처리하여 생산된 LPE가 주로 LPE18:1과 LPE16:0임을 보여 주는 MS/MS 분석 결과이다.
도 16은 LPE18:1의 소재를 슈도모나스 외의 미생물에서도 얻을 수 있는지 조사하기 위해, 그람 양성 세균인 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis), 아쓰로박터 시트레서스(Arthrobacter citresus), 그람 음성 세균인 대장균(E. coli), 효모인 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 및 조류(Algae)인 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris)에 대해서 인지질을 추출하여 PLA2를 처리한 결과, 다른 미생물에서는 LPE18:1를 포함한 LPE의 생성이 많지 않았고 오직 슈도모나스에서만 뚜렷이 생성되는 것을 확인하였다.
도 17은 단감 신선도 유지에 대한 본 발명의 슈도모나스로부터 제조된 LPE 처리 효과를 그래프로 나타낸다. (NT: 무처리, LPE(Doosan): LPE16:0/LPE18:0 혼합물, LPE(Pure Std): 아반티(Avanti, Ltd (USA))로부터 구입한 순수 LPE18:1, LPE(New-Self): 본 발명의 슈도모나스로부터 제조된 LPE18:1, DAT: 처리 후 일수)
도 18은 단감 신선도 유지에 대한 본 발명의 슈도모나스로부터 제조된 LPE 처리 효과를 사진으로 나타낸 결과이다. (NT: 무처리, LPE(Doosan): LPE16:0/LPE18:0 혼합물, LPE(Pure Std): 아반티(Avanti, Ltd (USA))로부터 구입한 순수 LPE18:1, LPE(New-Self): 본 발명의 슈도모나스로부터 제조된 LPE18:1, DAT: 처리 후 일수)
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
(a) 미생물을 대량 배양한 후 수확하여 인지질을 추출하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 추출된 인지질에 포스포리파아제 A2 (phospholipase A2)를 처리하여 리소포스파티딜에탄올아민 (lysophosphatidylethanolamine)을 생성하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계의 생성된 리소포스파티딜에탄올아민을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 리소포스파티딜에탄올아민의 대량 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 리소포스파티딜에탄올아민 (lysophosphatidylethanolamine, 이하 LPE)은 LPE 16:0, LPE 16:1, LPE 18:0, LPE 18:1, LPE 18:2 또는 LPE 18:3 등일 수 있고, 바람직하게는 LPE 16:0, LPE 16:1 또는 LPE 18:1 등일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 LPE 18:1일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 방법에 있어서, 상기 미생물은 그람 음성 세균일 수 있으며, 바람직하게는 슈도모나스 속 (Pseudomonas sp.) 미생물일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 슈도모나스 시린개 (Pseudomonas syringae)일 수 있으며, 더더욱 바람직하게는 슈도모나스 시린개 피브이. 토마토 DC3000 (Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 방법에 있어서, 상기 인지질은 포스파티딜콜린 (phosphatidylcholine), 포스파티딜세린 (phosphatidylserine) 또는 포스파티딜에탄올아민 (phosphatidylethanolamine) 등일 수 있으나, 바람직하게는 포스파티딜에탄올아민일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 포스파티딜에탄올아민의 첫 번째 위치의 아실 체인이 18:1인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 포스포리파아제 A2는 생체막의 주요한 구성성분인 글리세롤 인지질 sn-2위치의 에스테르결합을 가수분해하여 리소인지질과 지방산을 유리하는 효소로, 본 발명의 포스포리파아제 A2는 뱀독, 벌독 또는 돼지 췌장액과 같은 동물 유래, 미생물 유래 또는 식물 유래의 효소일 수 있고 또한 재조합 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 방법에 있어서, 수확한 세균으로부터 인지질을 추출하는 방법 및 리소포스파티딜에탄올아민을 분리 및 정제하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기의 방법에 의해 생산된 리소포스파티딜에탄올아민을 제공한다. 본 발명의 방법에 의해 생산된 리포포스파티딜에탄올아민은 바람직하게는 리소포스파티딜에탄올아민 18:1일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명의 실시예에 대해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
식물 재료 및 시약
애기장대 식물체는 22℃, 상대습도 60%에서, 16시간 광주기 그리고 광자 유속 밀도(photon flux density) 120μmolesm-2s-1의 조건에서 키웠다. 식물체의 방어 반응이 연령 의존적이기 때문에, 4주령 식물체의 완전히 성숙한 잎을 다수의 분석을 위해 사용하였다. pla2α, pla2α-II, sid2, npr1-5, rps2 및 ein2 (각각 Salk_099415, CS857021, Salk_042603, CS3724, Salk_087581, CS3071 및 CS8072)를 포함하는 애기장대 (Arabidopsis thaliana) 변이체는 애기장대 생물 자원 센터 (Arabidopsis Biological Resource Center, 미국)으로부터 구매하였다. 애기장대 변이체 eds1 및 pad4-5는 각각 S.A. Whitham (Iowa State University, 미국)와 J.E. Parker (Max Planck Institute for Plant Breeding Research, 독일)로부터 얻었다. NPR1 - eGFP와 NahG를 발현하는 형질전환 계통은 X.Dong (Duke University, 미국)과 O.M.Park (고려대학교, 한국)으로부터 각각 얻었다.
Native-프로모터:: PLA 2 α 를 지닌 pla2α 변이체의 상보성 실험 및 PLA 2 α 과발현 형질전환 계통의 생성
pla2α 변이체 식물체는 BamHI 자리에 native-프로모터 부분(-1175 부터 +922 까지)을 가지고 있는 PLA 2 α 게노믹 DNA를 포함하고 있는 바이너리 식물 형질전환용 벡터인 pCAMBIA1300 클론을 사용하여 꽃대침지법 (floral dip method)으로 형질전환하여 보완하였다. PLA2α의 세포내로의 위치(아포플라스트 (apoplast)로의 분비가 불가한) 인공적인 변형을 위해서, 신호 펩티드가 없는 pPLA2α::PLA 2 α를 지닌 pCAMBIA1300 벡터를 제작하였고, 아그로박테리움을 이용하여 pla2α 식물체로 도입하였다. PLA 2 α-과발현 형질전환 계통의 생성을 위해, p35S::PLA 2 α를 가지고 있는 pBIG 바이너리 벡터를 야생형 식물체로 도입하였다.
식물체의 세균 접종
Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (이하 Pst) 및 이의 독성이 없는 avrRpm1 포함 균주인 Pst-avrRpm1은 Y.J.Kim (고려대학교, 한국)로부터 얻었고, 독성이 없는 avrRpt2 포함 균주인 Pst-avrRpt2는 J.M.Park (KRIBB, 한국)으로부터 얻었다. 독성이 없는 avrRps4 포함 균주인 Pst-avrRps4는 R.Innes (Indiana University, 미국)으로부터 얻었다. 세균 균주는 Katagiri 등 (Arabidopsis Book, 2002, 1:e0039)의 방법에 따라 배양하고 처리하였다.
유전자 발현 분석
총 RNA는 RNA isolator (Gibco, 미국)를 사용하여 액체 질소로 얼려두었던 시료(각 샘플당 6개의 잎)로부터 추출하였다. 역전사 중합효소연쇄반응 (RT-PCR) 및 실시간 정량적 중합효소연쇄반응 (real-time qPCR)은 유전자 특이적 프라이머를 사용하여 수행하였다. 실시간 정량적 중합효소연쇄반응 분석은 Applied Biosystems 7900 Real-Time PCR SystemTM 장비를 사용하였다. 2X SYBR® Green qPCR 마스터 믹스를 PCR 증폭에 사용하였다. 분석값은 우선 ACTIN1 유전자의 양으로 표준화하고, 처리에 따른 유전자 발현의 배(fold) 증가는 mock 또는 무처리 식물체(1.0 배)에 비교하여 결정하였다. 대안적인 참조 유전자 (AT1G13320)는 이전의 연구를 통해서 얻었다 (Hong et al., 2010, Plant Cell Physiol . 51:1694-1706). 본 발명에 사용된 유전자 특이적 프라이머는 하기 표 1 및 표 2와 같다.
RT-PCR용 프라이머
유전자명 정방향(5'→3') (서열번호) 역방향(5'→3') (서열번호)
ACTIN1 GGCGATGAAGCTCAATCCAAACG (1) GGTCACGACCAGCAAGATCAAGAC (2)
ICS1 GGGGATAAGGGGTTCTCACA (3) CTGCCCTAGTTACAACCCGA (4)
JMT GGCCAAAGAGGGTATCATCG (5) GCTCGACCACAGCTCTTATGG (6)
PAL1 AAAGAACATGGTGATCAACGC (7) AGTTGAGATCGCAGCCACTT (8)
PDF1.2 CACCCTTATCTTCGCTGCTC (9) GTTGCATGATCCATGTTTGG (10)
PLA 2 α CTTAACGTCGGTGTTCAGCTC (11) GGGTTTCTTGAGGACTTTGCC (12)
PLA 2 β TCGCACTTCATTGATGCG (13) TCATAGCTCTGTTTTCATATCATTACCT (14)
PLA 2 γ GTCACGTGTTGCTTTCGG (15) AACGTTTGAACTGCTTGTG (16)
PLA 2 δ GCTTTAGGCTTAACCGTCTT (17) AGAAGGAGAAGGGTTCATC (18)
PR1 GTGCTCTTGTTCTTCCCTCG (19) AAGGCCCACCAGAGTGTATG (20)
VSP1 CTCATACTCAAGCCAAACGGATC (21) GCCATGAAGATAGATGCTTAATT (22)
실시간 qRT-PCR용 프라이머
유전자명 정방향(5'→3') (서열번호) 역방향(5'→3') (서열번호)
ACS2 ACCTCTTCTCCGAGCATGAA (23) GCCGTCAAAAACAACCCTAA (24)
ACS6 CCATAAGACGATGGAGACAGC (25) ACCGCCTCGTGTCACTAAAG (26)
ACTIN1 CGTACTACCGGTATTGTGCTCGACT (27) GACAATTTCACGCTCTGCTGTGG (28)
AT1G13320 GCGGTTGTGGAGAACATGATACG (29) GAACCAAACACAATTCGTTGCTG (30)
ICS1 CTAACCAGTCCGAAAGACGACCTC (31) CTTCCTTCGTAAGTCTCCCTGCC (32)
JMT GGCCAAAGAGGGTATCATCGAG (33) CCTCACTGATACTCCCACCTTCC (34)
LOX2 CACCATGGAAATCAACGCTCG (35) CTCAGCCAACCCCCTTTTGATG (36)
PAL1 GAACTTATTAGATTCCTTAACGCCGG (37) GGAAACTGGTAATTGCTTCGAGAATC (38)
PDF1.2 GCTTTCGACGCACCGGC (39) CGTAACAGATACACTTGTGTGCTGGG (40)
PLA 2 α TCCATTTCCTTGACTAAAGAATG (41) AGATAATCATTATTCTTGGATTGG (42)
PR1 CATGTGGGTTAGCGAGAAGGCTA (43) CTCACTTTGGCACATCCGAGTCT (44)
VSP1 CCTCGAATCGAACACCATCT (45) GGCACCGTGTCGAAGTTTAT (46)
GUS 활성의 조직 화학적인 분석 및 PLA 2 α의 아포플라스트로의 이동
조직 화학적인 위치 분석을 위해, PLA 2 α-프로모터::GUS 구조를 가지는 형질전환 애기장대 식물체를 만들었다 (Jung et al., 2012, Front Plant Sci. 3:126). 잎 조직의 감염 자리에 명확한 PLA 2 α 발현을 보여주기 위해서, PLA 2 α-프로모터::GUS 형질전환 애기장대 잎의 배축(abaxial)면으로 병원균을 암조건에서 3시간동안 주사기-인필트레이션한 후, 1.5시간 뒤에 Jefferson (EMBO J. 1987, 6:3901-3907) 등의 방법에 따라 조직 화학적인 GUS 분석을 수행하였다.
잎으로부터 지질 추출 및 ESI-MS/MS 분석
총 지질은 이전에 기술된 방법 (Ruy et al., 1996, Biochem Biophys Acta. 1303:243-250)을 통해서 mock 또는 Pst-avrRpm1 세균 현탁액 (1 x 108 CFU ml-1 in 0.018% Silwet L-77)을 분사한 잎 시료(각 샘플당 3개의 식물체로부터 6개의 잎)로부터 추출하였다. 각각의 인지질 (phospholipid) 및 유리지방산 (FFA)은 Kansas Lipidomics Research center에서 ESI-MS/MS 분석을 통해 정량화하였다.
지질, 살리실산 및 재조합 PLA 2 α 단백질의 처리
모든 인지질은 Avanti Polar Lipids Inc.(미국)으로부터 구매하였고, 유리지방산(16:0, 18:0 및 18:1)은 Sigma Co.(미국)으로부터 구매하였다. 용매를 질소 가스 줄기 (stream) 하에서 건조시킨 후, 지질을 100 nmol ml-1 in 0.018% silwet L-77 (또는 200 nmol ml-1 in H2O)의 최종 농도가 되도록 초음파 분해를 통해 현탁하였다. LPE (lysophosphatidylethanolamine) 종류 중에서 LPE 18:1은 Pst -avrRpm1 접종에서 가장 크게 증가하였기 때문에, 본 발명에서 사용되었다.
재조합 PLA2α 단백질의 성숙한 형태는 Dsbc 단백질과 융합된 대장균에서 생산되었고, 이전에 기술된 방법 (Ryu et al., 2005, Biochem Biophys Acta . 1736:144-151)에 따라 친화크로마토그래피 (affinity chromatography)를 통해 정제하였다. PLA2α와 Dsbc가 분리된 단백질 혼합물 또는 Dsbc:PLA2α 융합 단백질(10㎍ml-1)은 주사기 인필트레인션을 통해 pla2α 변이체의 잎에 0.5㎍ 씩 처리하였다. PLA2α의 효소 활성은 50mM Tris·HCl(pH 8.5)에 10mM Ca2+, 0.05% Triton X-100을 포함하고 있는 반응 혼합물에 기질 PE를 사용하여 in vitro 분석을 통해 확인하였다. Mock 처리 식물체는 버퍼 (50mM Tris·HCl, pH 8.0) 또는 Dsbc 단백질으로 인필트레이션하였다. PLA2α 활성의 불활성화를 위해서, 재조합 PLA2α를 2μM의 비가역적 억제제인 마노알리드 (manoalide)로 30℃에서 30분 동안 전처리하였다. 마노알리드에 의한 PLA2α 활성의 불활성화는 in vitro 분석으로 확인하였다.
PLA 2 α의 항균 활성 및 세균으로부터 지질 산물의 방출
PLA2α의 항균 활성을 측정하기 위해, 류 (Biochem Biophys Acta . 2005, 1736:144-151) 등의 방법에 따라 생산한 3㎍의 유리 성숙 형태의 재조합 PLA2α를 독성의 Pst(5 x 105 CFU ml-1)가 현탁되어 있는 100㎕의 용액-Tris·HCl(50mM, pH 8.0), 10mM 염화칼슘(CaCl2)-에 첨가한다. 세균 샘플은 6시간 동안 28℃에서 약한 교반 상태로 배양한 후, 살아있는 세균만 적정하였다. Mock 대조군은 PLA2α가 없는 용액에 세균이 현탁된 것으로 사용하였다.
살리실산, 에틸렌 및 자스몬산의 정량화 및 NPR1 의 전이
살리실산, 자스몬산 및 에틸렌은 이전에 기술된 방법 (Bowling et al., 1994, Plant Cell 6:1845-1857; Heck et al., 2003, Plant J. 36:342-352)에 따라 Pst-avrRpm1 현탁액 (1 x 108 CFU ml-1 in 0.018% Silwet L-77) 또는 LPE (100 nmol ml-1 in 0.018% Silwet L-77 또는 200 nmol ml-1 in H2O)를 살포한 애기장대 잎 시료의 0.5g으로부터 정량화하였다.
NPR1의 전이는 35S::NPR1-eGFP를 지닌 형질전환 식물체에 LPE(100 nmol ml-1 in 0.018% Silwet L-77), 살리실산(0.3 mM in 0.018% Silwet L-77) 또는 mock 용액(0.018% Silwet L-77)을 살포시키고, 6시간 후에 식물체의 잎을 레이저 주사 공초점 현미경 (laser scanning confocal microscope, Zeiss, 독일)으로 관찰하였다.
이온 누출 분석
잎 조직(샘플당 4개의 잎)을 수확하고, 멸균수로 5분 동안 진공 인필트레이션한 후, 상온에서 2시간 동안 교반하며 배양하였다. 샘플에서의 전해질 (electrolyte) 누출의 정도는 도전율계 (conductivity meter, Mettler Toledo, 스위스)를 사용하여 측정하였다. 총 전해질 누출의 퍼센트로 보여지는 데이터는 동결 후에 6시간 동안 교반하며 상온에서 융해함으로써 얻었다.
통계
Student's t-test는 그룹간에 통계학적인 의의를 결정하기 위해 사용하였다. 세균 성장 분석 및 이온 누출 분석의 데이터는 평균±표준편차로 나타내었으며, 유의값은 *P<0.05; **P<0.01이다. 그 외 다른 모든 데이터들은 평균±표준오차로 표시하였으며, *P<0.05; **P<0.01이다.
슈도모나스 지질 추출액으로부터 LPE18 :1의 제조
슈도모나스 세포 배양물 2 mg을 동결건조 후 물에 녹여 5초간 초음파분해(sonication) 하여 슈도모나스 기질을 얻었다. 이후 시판용 포스포리파아제 A2 (분말 형태)를 물에 녹여 20 ㎕를 취하였다. 상기 슈도모나스 기질 20㎕, 포스포리파아제 A2 효소 20㎕ 및 반응버퍼 (50 mM Tris-HCl, 10 mM CaCl2, 0.05% Triton X-100) 160㎕의 혼합물을 30℃에서 30분간 반응시켰다. 이후 750㎕의 Chl:MeOH(1:2)를 첨가하여 반응을 멈추고, 200㎕ 클로로포름 및 200㎕의 KCl(2M)을 첨가하여 원심분리 후, 상층액을 제거하여 LPE 18:1을 획득하였다.
슈도모나스 지질 추출액으로부터 제조된 LPE18 :1을 단감에 처리
단감(Fuyu)를 수확하여 그늘진 상온에서 3~4일간 예건한 후 비닐로 밀봉하여 30~60일간 공기와 빛이 차단된 상태로 0℃ 저장고에 저장하였다. 무처리구(NT), LPE16:0+LPE18:0 혼합물(Doosan), 98% 순수한 시판용 LPE18:1(Pure std), 그리고 본 발명의 슈도모나스 시린개(Pseudomonas syringae)로부터 자체 생산한 LPE18:1이 다량 함유되어 있는 crude LPE 혼합액(New-self)을 각각 2% 용액으로 만들었다. 처리구당 50개씩(1반복 10개씩 5반복, 저장과정 중 상처 등으로 인한 손상된 감은 선별)을 상온에서 2% 용액에 10분간 침지처리하였다. 처리한 후 처리구별로 공기가 통하여 잘 건조되는 용기에 각각 10개씩 겹치거나 부딪치지 않도록 넉넉한 간격으로 겹쳐져 빛이 가려지지 않도록 배열한 후 빛이 조정되는 항온항습기(20℃)에 저장하였다. 저장 후 1일 또는 2일 간격으로 중량, 경도, 변색 그리고 생리장해과를 숙달된 자가 전수 조사하였다.
실시예 1. pla 2 α 변이체에서 국소적 저항 유전자 유도 면역 반응의 손상
식물 방어 반응에서 분비형 PLA2α 단백질의 세포내 기능을 확인하기 위해, TAIR로부터 pla2 α 변이체인 pla2 α(녹아웃) 및 pla2 α-Ⅱ(녹다운)를 얻었다(도 2B 및 2C). 정상 생장 조건하에서 pla2 α 변이체는 야생형 식물체와 표현형적으로 다르지 않았다. 하지만, pla2 α 변이체에서 Pst - avrRpm1에 대한 국소적 면역 반응이 손상된 것이 확인되었고(도 1A, 1B, 1E 및 1F), 독성의 Pst에 대한 pla2 α 변이체의 기본적인 저항성은 약하게 손상된 것이 관찰되었다(도 1F). 비록 pla2 α 변이체가 독성이 없는 세균에 대해서 정상적인 과민성 반응 (HR, hypersensitive response)을 보였지만(도 1C, 1D 및 2E), 야생형 식물체와 비교해서 적절하게 세균 성장을 제한하는데는 실패하였다(도 1B 및 1F). qRT-PCR 분석 또한 야생형에 비해서 pla2 α 변이 식물체가 훨씬 낮은 수준의 Pst - avrRpm1 유도 방어 유전자 발현 경향을 보여주었다(도 1E). 그러나, pla2 α 변이체가 native-프로모터::pla2 α 구조로 형질전환 방법에 의해 보완되면, Pst - avrRpm1의 성장 제한 능력 및 방어 유전자 발현 능력이 복구되었다(도 1F 및 2D). pla2 α 변이체는 Pst - avrRpm1로 접종하면 국소적인 면역 반응을 시작할 수 없을 뿐만 아니라, Pst-avrRpt2 또는 Pst-avrRps4에 대한 반응도 불가했다(도 2F 및 2G). 이러한 결과들은 PLA2α 단백질이 CC-NB-LRR (coiled-coil nucleotide-binding site-leucine-rich repeat) 및 TIR-NB-LRR (toll-interleukin1 receptor-nucleotide binding-leucine rich repeat) 타입 저항 유전자 모두를 통해서 유도되는 면역 반응에 관여함을 의미했다.
실시예 2. 저항성 반응을 매개하는 유전자 PLA 2 α의 발현과 LPE 수준 증가
야생형 식물체에서, PLA 2 α는 낮은 수준으로 발현된다. PLA 2 α 발현은 Pst -avrRpm1 접종에 따라 신속하고 적정하게 유도되지만, 독성의 Pst 접종에 대한 반응에서는 약하게 유도되어(도 3A), PLA 2 α 발현이 저항성 반응을 매개함을 암시했다. 유사한 결과가 pPLA2α::GUS 분석에서도 관찰되었는데, PLA 2 α 프로모터가 Pst -avrRpm1 접종에 반응하여 활성화되었지만, 독성의 Pst에 의해서는 활성화되지 않았다(도 3B). 예상대로, mock 접종 식물체와 비교해서 Pst-avrRpm1를 접종한 야생형 식물체에서 LPE와 같은 PLA2α의 지질 산물의 상당한 증가가 접종 3시간 후에 확인되었다(도 3C). LPG (lysophosphatidylglycerol)와 LPC (lysophosphatidylcholine)도 약하게 증가되는 것이 확인되었다. 독성의 Pst를 접종하면, LPE의 증가는 확인되지 않고, LPC와 LPG만 약하게 증가되는 것이 확인된다(도 3C). 이러한 결과들은 LPE의 증가된 생산은 독성이 없는 Pst의 접종에 대한 특이한 반응임을 의미한다. 반대로, pla2α 변이체는 Pst-avrRpm1 접종에 대한 반응에서 증가된 LPE 생산을 보여주지 않았다(도 3D). Mock 처리 식물체와 비교하여 Pst-avrRpm1에 감염된 야생형 식물체의 잎에서 증가된 LPE 종류들은 LPE18:1, LPE18:2, LPE18:3 및 LPE16:1이었다(도 3E). LPE18:1 및 LPE16:1은 mock 처리 식물체에서는 거의 확인되지 않았지만, Pst -avrRpm1 처리 잎에서 매우 증가된 것이 관찰되었다(도 2E). LPE18:1 및 LPE16:1은 애기장대 잎 조직에서는 거의 없는 지질 종류임이 보고되었다 (Devaiah et al., 2006, Phytochemistry 67:1907-1924). 그래서 본 발명자들은 이러한 지질 산물들이 침입한 세균의 막으로부터 유래된 것인지를 확인해보았다. 세균 감염은 PLA2α의 세포질 골지체로부터 아포플라스트로의 이동을 자극한다. PLA2α는 침입하는 세균에 대한 항균 활성을 보였다(도 3G). Pst - avrRpm1 현탁액 또는 Pst - avrRpm1의 지질 추출물을 재조합 PLA2α 단백질과 함께 배양하면, LPE18:1, LPE16:0 및 LPE16:1이 실제로 세균 또는 세균 지질 추출물로부터 방출되었다(도 3F). LPE 종류들의 일부가 침입한 병원균으로부터 유래한 것에 대한 보다 직접적인 증거를 얻기 위해, Pst - avrRpm1 세균을 [14C]-에탄올아민으로 방사선 표지하였고, 이를 야생형 식물체의 잎에 접종하였다. 접종 3시간 후에 잎을 수확하고, 감염된 잎의 지질 추출물을 박층크로마토그래피 (TLC)로 분리하였다. 세균 접종 후 바로 수확한 대조군(0시간)에서는 방사능의 대부분이 PE 스팟 구역에서 검출되었고, LPE 스팟 구역(0.6%)에서는 확인되지 않았다. 그러나 총 방사능의 약 9%가 세균 접종 3시간 후에 LPE 스팟 구역에서 검출되었고(도 3H), pla2α 변이 식물체에서는 훨씬 적은 방사성 LPE(~3%)가 발견되었다. 이상의 결과는 일부 LPE가 침입한 병원균의 막으로부터 생성되었음을 의미했다. 또한, 어떤 종류의 LPE가 PLA2α 효소 활성에 의해 숙주 세포로부터 생성되는지를 조사하였다. 재조합 PLA2α 단백질을 야생형 식물체의 잎으로 인필트레이션하면, 처리 3시간 째에 LPE16:0이 대부분이고 소량의 LPE18:1, LPE18:2 및 LPE18:3이 검출되었다(도 3F). 이 결과는 Pst - avrRpm1 감염에 대한 반응에서 증가된 LPE의 주요한 종류인 LPE18:1이 숙주 세포의 막으로부터 소량 방출되나 대부분이 침입하는 병원균에서 유래됨을 제시했다. PLA2α의 또다른 지질 산물인 유리지방산 (FFA)도 Pst - avrRpm1 접종에 반응해서 약하게 증가하였지만, 재조합 PLA2α와 보충하여 처리하면 훨씬 크게 증가되었다(도 4A). 주요 유리지방산 종류는 스테아르산 (stearic acid (18:0))과 팔미트산 (palmitic acid (16:0))으로 확인되었다(도 4B).
야생형 잎에 Pst - avrRpm1를 접종하면 LPE 수준이 mock 처리 잎에 존재하는 양에 비해 35% 증가한다(도 3C). pla2 α 변이 식물체의 잎에 세균 접종 2.5시간 후에 재조합 PLA2α로 인필트레이션한 경우에, 잎에서 30분 후에 LPE 수준이 100% 정도 증가되는 것을 관찰할 수 있었다(도 3D).
실시예 3. pla2 α 변이체의 면역 반응 결함과 외인성 LPE18 :1 처리에 의한 면역반응 회복
야생형과 비교한 pla2 α 변이 식물체의 분석을 기반으로, pla2 α 변이 식물체의 면역 반응의 결함이 하위 면역 반응을 매개하는 지질 산물의 생성 실패에 기인한 것으로 가정하였다. 이 가정을 확인하기 위해, Pst-avrRpm1 접종 1.5시간 후에 LPE18:1를 pla2 α 변이체에 처리하여 보충하였다. 실제로, LPE는 pla2 α 변이체의 국소적 면역 반응 유도 및 과민성 반응 지역 너머로 질병 증상의 전파를 제한하는 능력을 복구시켰다(도 5A 및 5B). 매우 중요하게, LPE 자체가 독성이 없는 Pst의 부재에서 국소적 면역력을 증가시켰다(도 5C-5E). LPE는 PR 유전자인 PR1과 PDF1.2의 발현을 유도하였지만, 상처 관련 유전자인 VSP1 및 JMT의 발현은 유도하지 않았다(도 5C 및 6B). 세균의 부재에서 LPE에 의한 국소적 면역력의 획득은 mock 처리군에 비해 야생형 식물체 뿐만 아니라 pla2α 변이 식물체에서 LPE 처리가 독성의 Pst의 세균 성장을 억제하는 결과에 의해 증명되었다(도 5D). 게다가, 질병의 증상이 LPE를 살포한 잎에서 mock 처리군보다 훨씬 완화된 것을 확인할 수 있었다(도 5F). 이러한 결과들은 pla2α 변이체의 결함이 하위 면역 반응을 촉발하는 LPE18:1과 같은 지질 매개제 생산의 실패 때문임을 지지한다.
LPG 또는 LPC를 처리하였을 때는 PR1 유전자 발현을 유도하는 일부 활성작용이 보였지만(도 6C), pla2 α 변이 식물체의 표현형적 결함을 LPE 만큼 효과적으로 보상하지 못했다(도 5A). 이러한 결과들은 국소적인 숙주 면역 반응에서 독특한 기능을 하는 일차적인 시그날링 분자로서의 LPE의 역할을 분명히 보여준다. LPE가 그 헤드기 (head group)를 잃어 리소포스파티드산 (LPA, lysophosphatidic acid)이 되면, PR1 유전자 발현을 유도하는 능력을 상실한다. 유리지방산은 적은 양의 PR1 유전자 발현을 유도하지만, LPE 만큼 현저하지는 않다(도 6D).
실시예 4. PLA 2 α와 LPE 가 매개하는 ICS1 및 NPR1 의존적 살리실산 신호전달 과정
ICS1은 색소체에 위치하며, 숙주의 면역 반응에서 살리실산 생합성의 주요 효소로서 작용한다. ICS1 변이체인 sid2는 Pst - avrRpt2 또는 Pst - avrRpm1 접종에 대한 반응에서 PR1의 발현에 실패하였다(도 8A). pla2α 변이 식물체에 Pst-avrRpm1을 접종했을 때, 야생형 식물체와 비교하여 ICS1의 발현이 감소되었다(도 7A). 대조적으로, PAL1 발현은 감염된 pla2α 변이 식물체에서 오히려 증가하였다(도 7A). 또한, Pst-avrRpm1으로 접종한 pla2α 변이 식물체는 야생형보다 살리실산의 수준이 매우 낮았다(도 7B). 본 발명자들은 LPE를 포함한 지질 산물의 생성이 없는 pla2 α 변이체는 독성이 없는 세균의 도전에 대한 반응에서 ICS1을 발현하지 못하고, 이러한 결함은 살리실산의 수준을 낮추어 PR 유전자 발현에 이르는 하위 시그날 증폭 유도가 실패될 것이라는 가설을 세웠다. 상기 가정을 검정하기 위해, 외인성의 LPE 처리가 ICS1 발현을 유도하는지 확인해보았다. LPE18:1로 처리한 애기장대 잎은 처리 후 6시간째에 ICS1 유전자 발현을 보여주었으나 PAL1 발현을 증가시키지는 못했다(도 7C). ICS1 유전자 발현은 대조구에 비해 살리실산 생성을 2.5배 증가시켰다(도 7D). 이러한 결과들은 LPE가 ICS1-매개 살리실산 생합성 유도를 통해 살리실산 수준을 우선적으로 증가시킴을 의미했다. LPE 시그날링의 ICS1 의존성은 LPE가 sid2 변이체에서 PR1 유전자의 발현 유도를 실패한 결과를 통해 재확인되었다(도 8A 및 8B).
NPR1은 PR1 유전자 발현을 이끄는 살리실산 매개 면역 반응의 중요 조절자이다. NPR1 활성화는 살리실산에 의하여 세포질로부터 핵으로 NPR1이 이동하는 것을 말한다. NPR1 활성화는 살리실산에 의해 매개되기 때문에, LPE 유도에 의한 살리실산의 증가는 NPR1을 활성화 시킬 수 있을 것이다. 35S::NPR1 - eGFP를 지닌 형질전환 식물체에 LPE의 적용은 실제로 살리실산 처리와 같은, 세포질로부터 핵으로의 단백질 이동 유도를 통해 NPR1을 활성화시켰다(도 7E). 이상의 결과들은 LPE가 저항 유전자 유도 살리실산 생합성에 이어, NPR1 활성 및 PR1 유전자 발현을 매개할 것이라는 가설을 증명한다. 상기 가설은 LPE가 npr1 변이 식물체에서 PR1 유전자의 발현을 유도하지 못함을 관찰한 결과에 의해 재확인되었다(도 8C).
실시예 5. PLA 2 α와 LPE 가 매개하는 에틸렌 의존적 방어 신호전달 과정
pla2 α 변이체는 또한 Pst - avrRpm1 접종에 대한 반응에서 자스몬산 및/또는 에틸렌에 의해 매개되는 것으로 알려진 PDF1 .2의 발현에도 결함이 확인되었다(도 1E). pla2 α 변이 식물체는 에틸렌 생합성 유전자인 ACC 신타제 (ACS)의 발현도 손상되었고, Pst - avrRpm1 접종에 대한 반응에서 에틸렌 생산이 감소되었다(도 9A 및 9B). 그에 반해서, 변이 식물체는 야생형과 비교해서 자스몬산의 수준에는 큰 차이 없이 LOX2의 약화되지 않은 발현을 보여주었다(도 9A 및 9C). LPE로 처리한 애기장대 잎은 ACS 유전자 발현을 보여주며 에틸렌 수준의 증가를 보여주었지만, LOX2 유전자 발현 또는 자스몬산 수준에는 큰 증가가 확인되지 않았다(도 9D-9F). 이상의 결과들은 국소적인 면역 반응동안에 에틸렌 의존적인 PDF1 .2의 발현 또한 PLA2α 및 그의 지질 산물들에 의해 매개됨을 의미했다. 이는 에틸렌-시그날링 변이체의 분석에 의해 더욱 지지되었는데, LPE는 에틸렌-불감 ein2-1 변이 식물체에서 PDF1.2의 발현 유도에 실패하였다(도 10). 이러한 결과들과 일치하게, Pst-avrRpm1 접종에 대한 반응에서 PDF1.2의 발현은 에틸렌 의존적으로 확인되었다(도 10). 이상의 결과들은 PLA2α 및 그의 지질 산물들이 Pst-avrRpm1 접종에 대한 반응에서 ICS1/살리실산-의존적 숙주 방어 시그날링 뿐만 아니라, ACS/에틸렌-의존적 방어 시그날링 역시 매개함을 의미했다.
실시예 6. 식물 면역 반응에서 일어나는 PLA 2 α 유래 지질 신호전달 기작
앞서 서술한 결과들은 일관되게 pla2 α 변이 식물체의 국소적인 숙주 면역 반응의 결함은 PLA2α의 저항 유전자 유도 면역 반응을 매개하는 LPE와 같은 지질 산물들의 생산 실패에서 기인된다는 가설을 지지했다. 상기 가설을 지지하여, pla2α 변이체의 잎에 재조합 PLA2α 단백질의 외부적인 처리는 LPE를 포함하는 내인성의 지질 산물을 생산하였고(도 3D), ICS1 및 PR1 유전자의 in situ 발현을 유도하였다(도 11A). 반면에, PLA2 저해제인 마노알리드 (manoalide)로 촉매 반응을 일으켜 비활성화시킨 재조합 PLA2α 단백질의 처리는 PR1 유전자 발현 유도에 실패하였다(도 12B). pla2α 변이 식물체에 살리실산을 처리하면 PR1 유전자 발현이 유도 되었고(도 12A), 이는 PLA2α 매개 지질 시그날링이 ICS1 유전자 발현 및 살리실산 생합성의 상위 단계에 작용하였음을 의미했다. 본 발명자들은 또한 LPE에 의한 ICS1-의존적 살리실산 생산의 유도가 EDS1 및 PAD4와 같은 다른 요소들에 의해 영향을 받는지도 검증하였다. 흥미롭게도, LPE는 eds1 및 pad4 변이체에서 ICS1 및 PR1 유전자의 발현에 실패하였고(도 11B 및 11C), 이는 ICS1 매개 살리실산의 생산의 LPE 활성화는 DES1/PAD4에 의존적임을 의미했다.
상기의 결과들을 토대로, PLA2α 유래 지질-기반 시그날링은 다음과 같이 작동됨을 제안할 수 있다. 독성이 없는 Pst의 접종에 의한 저항 유전자 매개 방법에 있어서 PLA2α는 급격하고 일시적으로 발현되며, 침입한 세균과 숙주 세포의 막으로부터 LPE를 포함하는 지질 산물이 생성되는 장소인 아포플라스트로 방출된다. 그후 LPE는 PR1 유전자 발현을 이끄는 ICS1/NPR1-의존적 살리실산 신호 체계 및 PDF1 .2 유전자 발현을 이끄는 ACS-의존적 에틸렌 신호 체계를 통해서 저항 유전자 유도 하위 면역 반응을 촉진한다(도 11D).
실시예 7. 슈도모나스 지질 추출액으로부터 LPE18 :1의 제조 확인
슈도모나스 시린개(Pseudomonas syringae)를 대량 배양하여 수확한 후 지질을 추출하였다. 이러한 인지질 추출물에 포스포리파아제 A2 (phospholipase A2)를 처리한 후, HPLC-ELSD 분석법을 이용하여 PE(phosphatidylethanolamine)가 분해되고 LPE (lysophosphatidylethanolamine)이 생성되는지 여부를 확인하였다(도 14). PLA2 처리 전에는 9분 retention time의 PE 피크만 보이고 12.5분 retention time LPE 피크는 미미하게 보였지만(도 14의 상단 크로마토그램), PLA2 처리 후에는 9분 retention time의 PE 피크는 사라지고, 12.5분 retention time의 새로운 LPE 피크가 생겨난 것을 붉은색 박스로 표시하였다(도 14의 하단 크로마토그램). 따라서, 슈도모나스 시린개로부터 분리된 인지질에 포스포리파아제 A2 를 처리하면 LPE를 생성함을 알 수 있었다. MS/MS 분석을 통하여 슈도모나스 시린개에 PLA2를 처리한 후 생성된 LPE의 주요 구성원이 LPE18:1과 LPE16:0임을 확인할 수 있었다 (도 15).
또한, 다른 미생물로부터도 LPE18:1을 생산할 수 있는지를 알아보기 위해서, 그람 음성 세균인 대장균(E. coli), 그람 양성 세균인 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis), 아쓰로박터 시트레서스(Arthrobacter citresus) 및 효모인 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 및 조류인 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris)에 대해서 인지질을 분리하여 분석한 결과, 다른 미생물에서는 LPE18:1이 주요 성분으로 생성되지 않았으며 오직 슈도모나스에서만 발견되었다(도 16). 따라서, 슈도모나스를 제외한 다른 미생물에서는 LPE18:1을 생성하는 것이 어렵다는 것을 알 수 있었다.
실시예 8. 슈도모나스 지질 추출액으로부터 LPE18 :1의 효능 확인
슈도모나스 시린개(Pseudomonas syringae)로부터 대량생산한 LPE18:1를 단감에 처리하여 단감 신선도 유지에 대한 효과를 기존에 사용되고 있는 다른 LPE들과 비교 검정하였다(도 17 및 도 18). 본 발명자가 제조한 LPE18:1는 98% 순수한 판매용 LPE18:1(Avanti Ltd)를 처리한 것에 비해서는 효과가 낮았지만, 무처리구(NT) 또는 LPE16:0+LPE18:0 혼합물 (Doosan) 처리구보다는 효과가 좋은 것을 확인하였다. 이로써, LPE18:1의 원소재가 되는 PE 성분이 슈도모나스 시린개에 많이 존재하고 있으며 슈도모나스를 대량 배양하여 지질을 추출한 후, 지질 추출물에 PLA2 효소를 처리함으로서 LPE18:1이 다량 함유되어 있는 crude LPE mixture를 얻을 수 있음을 확인하였다. 또한, 효능 면에서 순수 LPE18:1 보다는 떨어졌으나 LPE16:0/LPE18:0 혼합물보다는 뛰어남을 확인하였다. 따라서, 본 발명은 슈도모나스 시린개를 배양하여 LPE18:1을 대량 생산할 수 있다는 것을 실증하였다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Method for producing lysophosphatidylethanolamine 18:1 from microorganisms <130> PN15161 <160> 46 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 ggcgatgaag ctcaatccaa acg 23 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ggtcacgacc agcaagatca agac 24 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ggggataagg ggttctcaca 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ctgccctagt tacaacccga 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ggccaaagag ggtatcatcg 20 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gctcgaccac agctcttatg g 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 aaagaacatg gtgatcaacg c 21 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 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Claims (10)

  1. (a) 배양기에서 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.) 균주를 대량 배양한 후 수확하여 포스파티딜에탄올아민 (phosphatidylethanolamine)을 추출하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계의 추출된 포스파티딜에탄올아민에 포스포리파아제 A2 (phospholipase A2)를 처리하여 리소포스파티딜에탄올아민 (lysophosphatidylethanolamine)을 생성하는 단계; 및
    (c) 상기 (b) 단계의 생성된 리소포스파티딜에탄올아민을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 리소포스파티딜에탄올아민의 대량 생산 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 리소포스파티딜에탄올아민은 주요성분이 리소포스파티딜에탄올아민 18:1인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 슈도모나스 속은 슈도모나스 시린개(Pseudomonas syringae)인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서, 상기 포스파티딜에탄올아민은 첫 번째 위치의 아실 체인이 18:1인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 포스포리파아제 A2 는 동물, 미생물 또는 식물 유래인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 삭제
  10. 삭제
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