JP2012523237A - 植物snf1関連タンパク質キナーゼ遺伝子 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、「植物SNF1関連タンパク質キナーゼ遺伝子」について、2009年4月10日に出願された、米国特許仮出願第61/168,532号の出願日の利益を主張するものである。
PCRによる、シロイヌナズナ属SnRK遺伝子内へのT−DNA挿入の同定
配列の類似性により、シロイヌナズナ属のSnRKキナーゼを、3つの亜群であるSnRK1、SnRK2、およびSnRK3へと類別することができる。SnRK1亜群は、それぞれ、At3g01090、At3g29160、およびAt5g39440によりコードされる3つのキナーゼを包含する。SnRK2亜群は、それぞれ、遺伝子At4g40010、At2g23030、At1g60940、At1g10940、At5g63650、At5g08590、At1g78290、At3g50500、At5g66880、およびAt4g33950に対応する10のメンバーからなる。SnRK3は、遺伝子、すなわち、At5g57630、At3g17510、At1g48260、At4g24400、At5g35410、At2g26980、At1g30270、At1g01140、At4g14580、At3g23000、At2g38490、At5g01820、At2g30360、At2g34180、At1g29230、At5g45810、At4g18700、At4g30960、At5g45820、At5g58380、At5g07070、At5g01810、At2g25090、At5g25110、およびAt5g10930によりコードされる25のメンバーを伴う最大の亜群である。
[実施例2]
シロイヌナズナ属種子の抽出および誘導
成熟シロイヌナズナ属種子を採取し、種子以外のすべての植物材料を除去した。採取した全種子から、約10mgずつのアリコートを採取し、1ml容量の96ウェルプレートへと分注した。精度が±2μgである分析用秤を用いることにより、正確な重量測定値を得、これらを記録した。使用前に、ウェルプレートをヘキサンですすぎ、直径4mmのステンレス鋼製ホモジナイズ用ビーズ2個を各ウェル内に入れた。試料を分注した後で、75ppmのヘプタデカン酸メチルおよび0.5Mナトリウムメトキシド0.2mlを含有する0.4mlヘキサンを、各ウェルへと分注した。次いで、各ウェルにキャップをはめ、バーティカルシェーカーに入れて1分間当たり500ストロークで2分間にわたり振とうし、次いで、1分間当たり250ストロークで58分間に変更した。次いで、振とうが完了したら、5600rcfで5分間にわたり、ウェルプレートを遠心分離にかけた。遠心分離後、上部のヘキサン抽出物層を採取し、別の96ウェルプレートに入れた。0.4mlヘキサンによりさらに2回にわたり抽出を実施し、後続の各抽出物を、第1の抽出物と混合した。第2および第3の抽出では、垂直振とう条件を、1回の抽出につき、1分間当たり250ストロークで30分間ずつに変更した。混合した1.2mlのヘキサン抽出物を10倍に希釈して、別の96ウェルプレートに入れ、GC−FIDにより解析した。
結果として得られる脂肪酸メチルエステルである、シロイヌナズナ属種子脂質を、1ml/分の水素をキャリアガスとして、3種類の傾きによる温度勾配を用いる(1.34分間にわたり60℃を維持し、41.3℃/分で150℃とし、9.1℃/分で180℃とし、41.3℃/分で220℃として、1.86分間にわたり維持する)SGE製BPX70型キャピラリーカラム(15m、内径0.22、膜厚0.25)において分解した。投入温度は230℃であり、水素炎イオン化検出器の温度は240℃であった。貯留時間によるFAME解析の同定および定量化は、75ppmのヘプタデカン酸メチルを伴うナタネ油基準物質(Matreya製)により達成した。
[実施例3]
シロイヌナズナ属葉脂質の抽出および誘導
凍結させたシロイヌナズナ属葉を、液体窒素下で、乳鉢および乳棒により微粉へとすりつぶした。この粉末から、約50mgずつのアリコートを採取し、1ml容量の96ウェルプレートへと分注した。使用前に、ウェルプレートをヘキサンですすぎ、直径4mmのステンレス鋼製ホモジナイズ用ビーズを各ウェル内に入れた。試料を分注した後で、0.5mlヘキサンおよび0.5Mナトリウムメトキシド0.25mlを、各ウェルへと分注した。次いで、各ウェルにキャップをはめ、バーティカルシェーカーに入れて1分間当たり250ストロークで30分間にわたり振とうした。次いで、5600rcfで5分間にわたり、ウェルプレートを遠心分離にかけた。遠心分離後、上部のヘキサン抽出物層を採取し、別の96ウェルプレートに入れ、ガスクロマトグラフ水素炎イオン化により解析した。
結果として得られる脂肪酸メチルエステルである、シロイヌナズナ属葉脂質を、1ml/分の水素をキャリアガスとして、3種類の傾きによる温度勾配を用いる(1.34分間にわたり60℃を維持し、41.3℃/分で150℃とし、9.1℃/分で180℃とし、41.3℃/分で220℃として、1.86分間にわたり維持する)SGE製BPX70型キャピラリーカラム(15m、内径0.22、膜厚0.25)において分解した。投入温度は230℃であり、水素炎イオン化検出器の温度は240℃であった。FAME解析の、貯留時間によるFAMEの同定は、ナタネ油基準物質(Matreya製)により達成した。
[実施例4]
シロイヌナズナ属種子の酸による消化(タンパク質の加水分解)
成熟シロイヌナズナ属種子を採取し、種子以外のすべての植物材料を除去した。採取した全種子から、約20mgずつのアリコートを採取し、ゴム製のO字型環状ネジ式キャップを伴う、オートクレーブ処理可能な2mlの遠心管へと分注した。精度が±2μgである分析用秤を用いることにより、正確な重量測定値を得、これらを記録した。使用前に、酸で洗浄した4mmのガラス製ビーズ10個ずつを、各遠心管へと添加した。試料を分注した後で、遠心管をバーティカルシェーカーに取り付け、1分間当たり500ストロークで5分間にわたり振とうした。次いで、0.1%フェノールおよび1%2−メルカプトエタノールを伴う6Nの塩酸1.4mlを、各試料に添加した。次いで、遠心管を、再度バーティカルシェーカーに取り付け、1分間当たり500ストロークで15分間にわたり垂直振とうした。垂直振とうが完了したら、遠心管を加熱ブロックへと取り付け、100℃で24時間にわたり加熱して消化を完了させた。消化プロセスが終了したら、遠心管を室温まで冷却し、0.4μmのガラス製フィルターにより、消化物を濾過した。濾過された消化物のうちの0.1mlを、0.3mlの2N水酸化ナトリウム、0.6mlの水、および高速液体クロマトグラフィー蛍光検出による解析のための内部基準物質として1000ピコモル/μlのノルバリンを含む0.1mlの水を含む1.5mlのガラス製注入用バイアル内で希釈した。
一級アミノ酸は、o−フタルアルデヒド(OPA)により誘導した。二級アミノ酸は、9−フルオレニルメチルクロロホルメート(FMOC)により誘導した。いずれの誘導反応も、カラム処理前に、HPLC注入用ループを用いて達成した。試料はまず、10.2pHの0.4Nホウ酸緩衝液により緩衝処理し(1μlの試料に対して4μlの緩衝液)、次いで、OPAおよびFMOC(1μlのOPAおよび1μlのFMOCの順序で)と混合した。次いで、試料を注入し、解析した。
誘導したアミノ酸残基は、40℃で2種類の溶出勾配を用いる、150×3.0mmの5μmC18(2)逆相カラム上で分解した。水相(溶出物A)は、7.8pHの40mMリン酸ナトリウム緩衝液からなり、有機相(溶出物B)は、アセトニトリル:メタノール:水(45:45:10のv/v/v)からなった。溶媒の勾配系は、0〜1.9分A/B(%)=100:0;1.9〜18.1分A/B(%)=43:57;18.1〜18.6分A/B(%)=0:100;18.6〜22.3分A/B(%)=0:100;22.3〜23.2分A/B(%)=100:0;23.2〜26A/B(%)=100:0であった。流速は、2ml/分で一定であった。
[実施例5]
新鮮なシロイヌナズナ属葉を、液体窒素下で、乳鉢および乳棒で組織を砕くことにより微粉へとすりつぶした。デンプンについての解析を行う前に、80%エタノールにより、試料を脱糖化した。デンプンの消化は、それぞれ、α−アミラーゼおよびアミログルコシダーゼにより実施した。放出されたグルコースは、グルコースオキシダーゼベースの酵素アッセイおよびペルオキシダーゼベースの酵素アッセイにより検出した。デンプン含量は、遊離グルコースをデンプンへと補正した、放出グルコースに基づいて計算した。
[実施例6]
液体窒素ならびに乳鉢および乳棒を伴う手作業により、シロイヌナズナ属葉組織をすりつぶし、極微粉試料を得た。細かくすりつぶした葉組織約100mgを、80:20のメタノール;0.1N HCl溶液により抽出し、十分に混合し、350mg/mLの抽出物を結果として得た。試料をペレット状の微粒子へと遠心分離し、抽出された代謝物を含有する上清アリコートを除去し、内部基準物質としての、グルコースの安定的同位体を含有する80:20のアセトニトリル:水により1:10に希釈し、タンデム質量分析による検出を伴う液体クロマトグラフィー(LC−MS/MS)により解析した。
Q1:+/−の分子イオンのm/z
DP:最大の分子イオン形成についてのデクラスタリングポテンシャル
Q3:分子イオンから生成される生成物イオンのm/z
CE:最大の生成物イオン形成についての衝突エネルギー
CXP:細胞脱出ポテンシャル
を確定する目的で、個々の二次代謝物の基準物質(約10μg/mL)を、質量分析器中に注入した。
[実施例7]
シロイヌナズナ属SnRK2−6遺伝子を増幅するため、Oligo dT20をプライマー(Invitrogen製SuperScriptIII RTキット)として用いて一本鎖cDNAを合成するのに、シロイヌナズナ属葉から単離した全RNA(900ng)を用いた。それらのいずれもがNco I部位(下線を付した)を包含するプライマー対である5’−TAA TTT CCA TGG ATC GAC CAG CAG TGA GT−3’および5’−TTT TTT CCA TGG ATC ACA TTG CGT ACA CAA TCT CT−3’を用いて、このsscDNAをさらに増幅した。次いで、増幅されたSnRK2−6遺伝子を、NcoIにより消化し、ゲートウェイエントリーベクターであるpDAB3731中に挿入した。挿入の方向は、シーケンシングすることにより決定した。結果として得られる、CsVMV、SnRK2−6、およびAtuORF24 3’−UTRを含む植物転写単位(PTU)を、ゲートウェイLR反応を用いて、バイナリーゲートウェイデスティネーションベクターであるpDAB3725中にクローニングした。結果として得られる、pDAB4504と称するプラスミド(図11)を用いて、アグロバクテリウム属(Agrobacterium)を形質転換した。
[実施例8]
トランスジェニックの双子葉植物および単子葉植物(例えば、トウモロコシ)において、SnRK2−6タンパク質を生成することが可能となるように、シロイヌナズナSnRK2−6遺伝子のコード配列合成形をデザインした。出発塩基配列は、配列番号1に開示されるタンパク質コード領域を含み、配列番号2に開示されるタンパク質配列をコードする、Genbank受託番号At4g33950であった。
C1の加重平均%=1/(%C1+%C2+%C3+その他)×%C1×100
[式中、C1は、問題となるコドンであり、%C2、%C3、その他は、表4Aおよび4BのD欄で示す、残りの同義コドンに対する、%による植物平均を表わす]
を用いて、各コドンの加重平均についての%表示を計算した。
[実施例9]
トウモロコシのSnRK2−6遺伝子を異種発現させるため、そのオープンリーディングフレーム配列を、ヘミコットにおけるコドン使用に従いコドン最適化し、これを、SnRK2−6hvと称した。加えて、「3つのフレーム終止コドン」および「トウモロコシのコンセンサス配列」に対応するヌクレオチド配列を、SnRK2−6hv遺伝子の5’末端に導入し、「6つのフレーム内の終止コドン」を、その3’末端へと導入した。後続のクローニングを容易にするため、2つの制限部位である、BbsIおよびSacIを、該配列の5’端および3’端へと付加した。次いで、全配列を合成したが、これを、以下でさらに詳細に説明する。
[実施例10]
形質転換は、WeigelおよびGlazebrook(2002)により説明されている通りに実施した。
採取した新鮮な種子を、乾燥剤の存在下において、室温で7日間にわたり乾燥させた。種子を、Sigma Chemical Co.(ミズーリ州、セントルイス)から市販されている、0.1%アガロース溶液中に懸濁させた。懸濁させた種子を、4℃で2日間にわたり保管して休眠要件を満たし、種子の同調発芽(層別化)を確保した。
WeigelおよびGlazebrook(2002)によるプロトコールを用いて、エレクトロコンピテントのアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)(Z797S株)細胞を調製した。WeigelおよびGlazebrook(2002)による電気穿孔法の変法を用いて、コンピテントのアグロバクテリウム属細胞を形質転換した。50μlのコンピテントアグロバクテリウム属細胞を氷上で解凍し、約10nm〜約25ngのプラスミドpDAB4504を細胞に添加した。DNAと細胞との混合物を、あらかじめ冷却した2mmの電気穿孔用キュベットに添加した。Eppendorf AG(ドイツ、ハンブルグ)から市販されているEppendorf Electoroporator2510を用いて、以下の条件:電圧:2.4kV、パルス長:5ミリ秒で形質転換した。電気穿孔後、1mLのYEP培養液をキュベットに添加し、細胞−YEP懸濁液を、15mlの培養試験管に移した。一定に振とうしている水浴中28℃で4時間にわたり、細胞をインキュベートした。インキュベーション後、Sigma Chemical Co.(ミズーリ州、セントルイス)から市販されている、スペクチノマイシン(100mg/L)およびストレプトマイシン(250mg/L)を含むYEP+寒天を含むプレートに培養物を播種した。28℃で2〜4日間にわたり、プレートをインキュベートした。スペクチノマイシン(100mg/L)およびストレプトマイシン(250mg/L)を含む新鮮なYEP+寒天プレート上においてコロニーを選択し、画線し、約28℃で1〜3日間にわたりインキュベートした。ベクター特異的な制限消化酵素を用いることにより制限消化解析を行い、遺伝子挿入の存在を検証する目的で、コロニーを選択した。製造元の指示書に従い実施される、Qiagen High Speed Maxi Prepsを用いて、選択されたアグロバクテリウム属コロニーから、プラスミドDNAを精製した。アグロバクテリウム属の形質転換で用いたバイナリーベクターに由来するプラスミドDNAを、対照として組み入れた。0.5〜1μgのDNAを用いて、4つの個別の消化反応を行った。約4時間〜約5時間にわたり反応を進め、0.65%アガロースゲル電気泳動によりこれを解析し、臭化エチジウム染色により可視化した。すべての酵素についてのその消化が、プラスミド対照と同一であるコロニーを選択した。
フローラルディップ法を用いて、シロイヌナズナ属を形質転換した。選択されたコロニーを用いて、スペクチノマイシン(100mg/L)およびストレプトマイシン(250mg/L)を含有するYEP培養液による、15mLずつの1または複数の前培養物に接種した。220rpmで一定に振とうしながら、約28℃で一晩にわたり、培養物(複数可)をインキュベートした。各前培養物を用いて、スペクチノマイシン(100mg/L)およびストレプトマイシン(250mg/L)を含有するYEP培養液による500mlの培養物2つずつに接種し、該培養物を、一定に振とうしながら、約28℃で一晩にわたりインキュベートした。次いで、室温(すなわち、約24℃)、約8700×gで約10分間にわたって、細胞をペレット化させ、結果として得られる上清を廃棄した。この細胞ペレットを、1/2倍濃度のムラシゲおよびスクーグ塩ならびにガムボルグのB5ビタミン、10%(w/v)スクロース、0.044μMベンジルアミノプリン(DMSO中に1mg/mlの原液10μl/リットル)、ならびに、Helena Chemical Company(テネシー州、コリアービル)から市販されているSILWET L−77 300μl/リットルを含有する、500mLの浸潤用培地中に静かに再懸濁させた。約5週齢の植物体を、約15秒間にわたり培地内に浸漬し、最新の花序を浸漬したことを確認する。次いで、植物体を横向きに寝かせ、約24時間にわたり覆い(透明または不透明の覆いで)、次いで、水で洗浄し、直立させる。約22℃で16時間の明期/8時間の暗期により、植物体を生育させた。浸漬の約4週間後、種子を採取した。
説明される通り、T.O.Plastics Inc.(ミネソタ州、クリアウォーター)から市販されている、10.5インチ×21インチの発芽用トレー上に、T1種子を播種し、概説される条件下でこれを生育させた。播種後5〜6日間にわたり、ドームを取り外した。播種の5日後において、ならびに、播種の10日後に再度、同胞体に、DeVilbiss(イリノイ州、グレンデールハイツ)製圧縮空気散布チップを用いて、トレー1枚当たり約10mlの散布容量(703L/ha)で、Bayer Cropscienceから市販されているグルホシネート除草剤の0.20%溶液(脱イオン化水中20μl/10mL)を散布して、1回の適用当たり280g/haの有効散布率でグルホシネートを送達した。リバティーの調製量は、以下の通りに計算した:(703L/haの散布量=280GPA)。(280gの有効成分/ha)×(1ha/703L)×(1L/グルホシネートの有効成分200g)=0.20%溶液(すなわち、20μl/10ml)。各トレーにつき10mLずつの溶液を、20mLのシンチレーションバイアル内にピペットで注入し、散布した。散布は、水平および垂直の適用パターンを用いて送達した。各散布の後、除草剤名、適用率、および適用日を記した散布ラベルを、各選択トレーに添付した。2回目の散布の4〜7日後に、除草剤抵抗性植物体を同定し、Sunshine mix LP5により調製したポット中に移植した。移植された植物体を、上述の生育条件でConviron内に入れた。
[実施例11]
形質転換用に調製するため、2つの異なる大腸菌(E. coli)株(pSB11前駆体(この場合、pDAB7702またはpDAB3878)およびpRK2013を含有するDH5α)を、37℃で一晩にわたり増殖させた。DH5α菌株は、LB培地(500mlの脱イオン化水中に5gのBactoトリプトン、2.5gのBacto酵母抽出物、5gのNaCl、7.5gの寒天)+スペクチノマイシン(100μg/ml)を含有するペトリプレート上で増殖させ、pRK2013菌株は、LB+カナマイシン(50μg/ml)培地を含有するペトリプレート上で増殖させた。インキュベーション後、プレートを約4℃で静置し、アグロバクテリウム属が適用可能となるまで待機した。
[実施例12]
95%Metro−Mix 360無土壌生育培地(ワシントン州、ベルビュー、Sun Gro Horticulture製)および5%粘土/ローム土壌による混合物を含有する、5ガロン(19リットル)のポット内に、High II F1交配(Armstrongら、1991)による種子を播いた。高圧ハロゲン化ナトリウムランプおよび高圧ハロゲン化金属ランプの組合せを用いて、16時間:8時間の明暗期を伴う温室内において植物体を生育させた。形質転換用の未成熟F2胚を得るため、調節同胞受粉を実施した。受粉の8〜10日後に未成熟胚を単離したが、このとき、胚のサイズは、約1.0〜2.0mmであった。
トウモロコシの穂を、液体石鹸で洗浄し、2分間にわたり70%エタノール中に浸漬し、次いで、30分間にわたり20%の市販漂白剤(0.1%次亜塩素酸ナトリウム)中に浸漬した後、滅菌水ですすぐことにより表面殺菌した。28℃で2〜3日間にわたり、100mg/Lのスペクチノマイシン、10mg/Lのテトラサイクリン、および250mg/Lのストレプトマイシンを含有するYEP培地(40g/Lのペプトン、40g/Lの酵母抽出物、20g/LのNaCl、15g/LのBacto寒天)上で増殖させた1〜2ループの細菌を、100μMのアセトシリンゴンを含有する5mLの液体感染培地(LS塩基性培地(LinsmaierおよびSkoog、1965)、N6ビタミン培地(Chuら、1965)、1.5mg/Lの2,4−D、68.5g/Lのスクロース、36.0g/Lのグルコース、6mMのL−プロリン、pH5.2)中へと移すことにより、アグロバクテリウム属懸濁液を調製した。均一な懸濁が達成されるまで、溶液をボルテックスし、紫色のフィルターを用いるクレット−サマーソンによる比色計を用いて、200クレット単位の最終密度へと濃度を調整した。2mLの感染培地を含有するマイクロ遠心管中に、未成熟胚を直接単離した。3〜5秒間にわたり遠心管をボルテックスにかけ、次いで、液体培地を除去し、新鮮な培地に置き換えて、再度ボルテックスにかけた。培地を三回除去し、密度が200クレット単位のアグロバクテリウム属液1mLで置き換えた。アグロバクテリウム属および胚による溶液を、最高速度で30秒間にわたりボルテックスにかけ、次いで、室温で5分間にわたりインキュベートした後、共培養培地(LS塩基性培地、N6ビタミン培地、1.5mg/Lの2,4−D、30.0g/Lのスクロース、6mMのL−プロリン、0.85mg/LのAgNO3、100μMのアセトシリンゴン、3.0g/Lのゲランガム培地、pH5.8)へと移し、25℃の暗所条件下で5日間にわたり静置した。
再生のためには、培養物を、「28」誘導培地(MS塩培地およびビタミン培地、30g/Lのスクロース、5mg/Lのベンジルアミノプリン、0.25mg/Lの2,4−D、100nMのR−ハロキシホップ酸、250mg/Lのセフォタキシム、2.5g/Lのゲランガム培地、pH5.7)へと移し、低光度条件(14μEm−2秒−1)下で1週間にわたり静置し、次いで、高光度条件(約89μEm−2秒−1)下で1週間にわたり静置した。その後、組織を、「36」再生培地(植物生育制御物質を欠くことを除き、誘導培地と同じ)へと移した。小植物体を3〜5cmの長さまで生育させたら、これらを、SHGA培地(SchenkおよびHildebrandtの塩およびビタミン(1972))、1.0g/Lのミオイノシトール、10g/Lのスクロース、および2.0g/Lのゲランガム、pH5.8)を含有するガラス製培養試験管へと移し、芽および根をさらに生育および成長させた。植物体を、本明細書の前出で説明した混合物と同じ土壌混合物へと移植し、温室内で開花するまで生育させた。調節受粉を実施して、種子を生成させた。
[実施例13]
SnRK2−6の転写単位を保有するトランスジェニックシロイヌナズナ属植物体をスクリーニングするため、それぞれ、SnRK2−6のT−DNA左側境界近傍の配列、ならびにSnRK2−6の3’端配列によりデザインしたプライマー対である5’−TGA GGT CTA CAG GCC AAA TTC GCT CTT AGC−3’ および5’−ATC ACA TTG CGT ACA CAA TCT CT−3’により、PCRを実施した。T2トランスジェニック植物体の遺伝的分離は、PATインベーダーアッセイおよび除草剤散布を用いて決定した。3:1の分離に適合するトランスジェニック系統は、単一の挿入を保有する可能性が極めて高いので、これらの系統だけを、生化学的研究および生理学的研究のために選択した。
[実施例14]
SnRK2−6hvの転写単位を保有するトランスジェニックトウモロコシ植物体をスクリーニングするため、それぞれ、ZmUbi1プロモーターおよびZmPer5 3’UTRによりデザインしたプライマー対である5’−GTG ACC CGG TCG TGC CCC TCT CTA GA−3’および5’−CCG TGG ATA TAT GCC GTG AAC AAT TG−3’により、PCRを実施した。
[実施例15]
ポリクローナル抗体の調製
2つのポリペプチドである「CHRDLKLENTLLDGSPAPRLKICDFGYSKS」(30アミノ酸)および「MNDNTMTTQFDESDQPGQSIEE」(22アミノ酸)のそれぞれに対して、2つの異なる種類のポリクローナル抗体を調製した。第1のポリペプチドは、SnRK2−6タンパク質のキナーゼドメイン内の137〜166のアミノ酸位置にあり、第2のペプチドは、SnRK2−6タンパク質の制御ドメイン内の286〜307のアミノ酸位置にある。これらの2つのポリペプチドを合成し、キャリアタンパク質としてのスカシガイヘモシアニン(KLH)にコンジュゲートさせた。結果として得られる2つの異なるペプチド−KLHコンジュゲートを用いて、ウサギを免疫化し、2つの異なる種類のポリクローナル抗体を生成させた。これらの抗体を精製するため、ペプチドをウシ血清アルブミン(BSA)にコンジュゲートさせ、これらのコンジュゲートを用いて、アフィニティークロマトグラフィーを行った。
SNF1キナーゼを形質転換した植物体および対照植物体に由来するトウモロコシの葉を、ドライアイスと共に試料採取し、液体窒素と共に、極微粉へとすりつぶした。抽出緩衝液(pH8.0の50mMトリス、50mM NaCl、5mM EDTA、5mM DTT、0.05% Triton X−100)1mL中に約200mgの葉粉末を添加することにより、SNF1キナーゼを含めたタンパク質を抽出した。Bio−Radタンパク質アッセイにより、抽出物のタンパク質濃度を測定したところ、3.2〜3.8mg/mLまで異なっていた。
タンパク質は、MOPSランニングバッファーと共に、Invitrogen、型番NP0301Box(カリフォルニア州、カールスバード)から市販されているNupage 10%ビス−トリスゲルを用いるSDS−PAGEにより分離した。次いで、それらを、トリス/グリシン緩衝液と共に、ニトロセルロース膜上へと移し、100Vで1時間にわたり泳動させた。3%脱脂粉乳を含有するPBST緩衝液中において、室温(RT)で1時間にわたり膜をブロッキングした。ミルク溶液を捨て、ウサギ抗SnRK2−6ポリクローナル抗体を含有する新鮮な緩衝液を添加した。RTで1時間にわたり膜をインキュベートし、次いで、PBSTにより3回にわたり洗浄した。洗浄後、ヤギ抗ウサギIgG−西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートを含有する、新鮮なPBST/ミルク溶液を、膜へと添加した。既に説明した通り、RTで1時間にわたりインキュベートした後に、膜を洗浄した。現像するために、PBST液から膜を取り出し、調製したばかりのECL検出試薬(PIERCE製;検出試薬1:過酸化物溶液;型番1859701、ならびに検出試薬2:ルミノール増強剤溶液;型番1859698)中に浸漬した。化学発光フィルム(CL−Xposureフィルム;PIERCE製、型番31460)を、処理された膜に曝露し、Konica SR−Xフィルム現像剤により現像した。
[実施例16]
SnRK2−6キナーゼが、異種染色体バックグラウンドにおける生物学的プロセスに影響を及ぼしうるかどうかを調べるため、本発明者らは、トウモロコシにおいてSnRK2−6遺伝子を発現させた。その機能を確定するため、ヘミコットにおけるコドン使用により、遺伝子配列のコドンを最適化し、次いで、トウモロコシUbi1プロモーターの制御下において、これをHi IIトウモロコシへと導入した。トウモロコシのトランスジェニック系統におけるSnRK2−6の発現は、SnRK2−6ペプチドに対するポリクローナル抗体に基づくウェスタンブロットを用いて決定した。発現したタンパク質は、予測されるサイズ(42kD)を有し、大半の系統において、ウェスタンブロットにより容易に検出可能なレベルを示した。対照としての、非形質転換体であるHi II植物体が、検出可能なレベルのタンパク質を42kDで示すことはなかった(データは示さない)。
[実施例16]
植物体にストレス耐性を付与する1または複数の遺伝子と組み合わせて、SnRK2−6を植物体に導入することができる。適切なストレス耐性遺伝子の例を、表8に示す。
植物体に乾燥耐性を付与する1または複数の遺伝子と組み合わせて、SnRK2−6を植物体に導入することができる。適切な乾燥耐性遺伝子の例を、表9に示す。
Claims (53)
- 植物体、植物種子、またはその後代を作製するプロセスであって、
Snf1関連タンパク質キナーゼタンパク質をコードする核酸配列により、植物細胞を形質転換するステップと、
植物体が種子をつけるまで、前記植物細胞から植物体を生育させるステップと、
前記植物体から種子を採取するステップと
を含むプロセス。 - Snf1関連タンパク質キナーゼタンパク質をコードする核酸配列が前記植物細胞のゲノム中に組み込まれる、請求項1に記載のプロセス。
- 前記植物細胞のゲノム中に組み込まれたSnf1関連タンパク質キナーゼタンパク質をコードする核酸配列を有する種子を選択するステップをさらに含む、請求項1に記載のプロセス。
- Snf1関連タンパク質キナーゼタンパク質をコードする核酸配列が、配列番号1または配列番号3の配列を含む、請求項1に記載のプロセス。
- Snf1関連タンパク質キナーゼタンパク質が、SnRK2−6を含む、請求項1に記載のプロセス。
- Snf1関連タンパク質キナーゼタンパク質をコードする核酸配列が、配列番号2または配列番号4のペプチドをコードする核酸配列を含む、請求項1に記載のプロセス。
- 請求項1に記載のプロセスにより作製される植物体から採取される種子。
- 土壌中に前記種子を植え付けるステップと、
前記種子から第2の植物体を生育させるステップと、
前記第2の植物体から種子を採取するステップと
をさらに含む、請求項1に記載のプロセス。 - Snf1関連タンパク質キナーゼタンパク質をコードする核酸配列により、植物細胞を形質転換するステップが、
Snf1関連タンパク質キナーゼタンパク質をコードする核酸配列により、アグロバクテリウム属(Agrobacterium)細胞を形質転換するステップと、
前記アグロバクテリウム属細胞により、前記植物細胞を形質転換するステップと
を含む、請求項1に記載のプロセス。 - 植物細胞のゲノム中に組み込まれたSnf1関連タンパク質キナーゼタンパク質をコードする核酸配列を有する種子を選択するステップが、
種子からゲノム核酸を単離するステップと、
前記種子から単離されたゲノム核酸から、Snf1関連タンパク質キナーゼタンパク質をコードする核酸配列を増幅するステップと
を含む、請求項3に記載のプロセス。 - 植物体が、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、ルリジサ(Borago)属種、キャノーラ、トウゴマ(Ricinus)属種、カカオ(Theobroma)属種、トウモロコシ(Zea)属種、ワタ(Gossypium)属種、ハマナ(Crambe)属種、タバコソウ(Cuphea)属種、アマ(Linum)属種、レスケレーラ(Lesquerella)属種、リムナンテス(Limnanthes)属種、リノーラ、ノウゼンハレン(Tropaeolum)属種、マツヨイグサ(Oenothera)属種、オリーブ(Olea)属種、アブラヤシ(Elaeis)属種、ラッカセイ(Arachis)属種、ナタネ、ベニバナ(Carthamus)属種、ダイズ(Glycine)属種、ダイズ(Soja)亜属種、ヒマワリ(Helianthus)属種、タバコ(Nicotiana)属種、ショウジョウハグマ(Vernonia)属種、コムギ(Triticum)属種、オオムギ(Hordeum)属種、イネ(Oryza)属種、カラスムギ(Avena)属種、モロコシ(Sorghum)属種、ライムギ(Secale)属種、アブラナ(Brassicaceae)科、およびイネ科(Gramineae)植物の他のメンバーからなる群から選択される、請求項1に記載のプロセス。
- 採取された種子から油を抽出するステップをさらに含む、請求項1に記載のプロセス。
- そのゲノム中に組み込まれたSnf1関連タンパク質キナーゼタンパク質をコードする核酸配列を有する植物体、植物種子、またはその後代。
- 植物体、植物体の貯蔵器官、または植物種子の油含量、糖含量、またはデンプン含量を変化させる方法であって、
センスまたはアンチセンス核酸構築物を植物体形質転換ベクター中に導入して、改変植物体形質転換ベクターを作製するステップであって、前記センスまたはアンチセンス核酸構築物が、シロイヌナズナ属のSnf1関連タンパク質キナーゼ(SnRK)タンパク質をコードする単離核酸配列、精製核酸配列、または組換え核酸配列を含むステップと、
前記改変植物体形質転換ベクターにより、前記植物体、植物体の貯蔵器官、または植物種子のゲノムを形質転換するステップと、
前記植物体、植物体の貯蔵器官、または植物種子を生育させ、前記油または生体高分子を抽出するステップと
を含む方法。 - 前記ゲノムが、請求項14に記載のベクターにより形質転換されていることを特徴とする、遺伝子形質転換植物体。
- 請求項14に記載のベクターにより形質転換されていることを特徴とする、遺伝子形質転換植物種子。
- 同じ遺伝子型の遺伝子改変されていない植物体と比較して、呼吸速度の変化を示すことを特徴とする、請求項15に記載の植物体。
- 同じ遺伝子型の遺伝子改変されていない植物体と比較して、種子油含量の変化を示すことを特徴とする、請求項15に記載の植物体。
- 同じ遺伝子型の遺伝子改変されていない植物体と比較して、脂肪酸組成の変化を示すことを特徴とする、請求項15に記載の植物体。
- 同じ遺伝子型の遺伝子改変されていない植物体と比較して、バイオマスの増大を示すことを特徴とする、請求項15に記載の植物体。
- 同じ遺伝子型の遺伝子改変されていない植物体と比較して、生体高分子を蓄積する能力の増強を示すことを特徴とする、請求項15に記載の植物体。
- 同じ遺伝子型の遺伝子改変されていない植物体と比較して、炭水化物含量の変化を示すことを特徴とする、請求項15に記載の植物体。
- 同じ遺伝子型の遺伝子改変されていない植物体と比較して、スクロース含量およびデンプン含量の変化を示すことを特徴とする、請求項22に記載の植物体。
- 同じ遺伝子型の遺伝子改変されていない植物体と比較して、呼吸速度の変化を示すことを特徴とする、請求項16に記載の植物種子。
- 同じ遺伝子型の遺伝子改変されていない植物体と比較して、種子油含量の変化を示すことを特徴とする、請求項16に記載の植物種子。
- 同じ遺伝子型の遺伝子改変されていない植物体と比較して、脂肪酸組成の変化を示す植物体をもたらすことを特徴とする、請求項16に記載の植物種子。
- 同じ遺伝子型の遺伝子改変されていない植物体と比較して、バイオマスの増大を示す植物体をもたらすことを特徴とする、請求項16に記載の植物種子。
- 同じ遺伝子型の遺伝子改変されていない植物体と比較して、生体高分子を蓄積する能力の増強を示す植物体をもたらすことを特徴とする、請求項16に記載の植物種子。
- 植物体におけるSnf1関連タンパク質キナーゼタンパク質レベルを調節する方法であって、
プロモーターに作動可能に連結された、植物体Snf1関連タンパク質キナーゼポリヌクレオチドにより、植物細胞を安定に形質転換するステップであって、前記ポリヌクレオチドが、センス配向またはアンチセンス配向であるステップと、
前記植物細胞を、植物生育条件下において生育させて、植物体におけるSnf1関連タンパク質キナーゼタンパク質を調節するのに十分な時間にわたり前記ポリヌクレオチドを発現することが可能な再生植物体をもたらすステップと
を含む方法。 - 植物体のSnf1関連タンパク質キナーゼポリヌクレオチドにより、植物細胞を安定に形質転換するステップが、配列番号1および配列番号3からなる群から選択されるポリヌクレオチドにより、植物細胞を安定に形質転換するステップを含む、請求項29に記載の方法。
- トランスジェニック種子から油を抽出するプロセスであって、
Snf1関連タンパク質キナーゼタンパク質をコードする手段により、植物細胞を形質転換するステップと、
植物体が種子をつけるまで、前記植物細胞から植物体を生育させるステップと、
前記植物体から種子を採取するステップと、
採取された種子から油を抽出するステップと
を含むプロセス。 - Snf1関連タンパク質キナーゼタンパク質をコードする手段が、配列番号2および配列番号3をコードする核酸配列からなる群から選択される、請求項31に記載のプロセス。
- 請求項31に記載のプロセスにより生成される油。
- 植物細胞を形質転換するためのベクターであって、配列番号1、もしくは配列番号1の一部、または配列番号1と実質的に相同な配列のデオキシリボ核酸配列を含有することを特徴とするベクター。
- 前記配列が、前記ベクター内にセンス配向で存在する、請求項34に記載のベクター。
- 植物細胞を形質転換するためのベクターであって、配列番号3、もしくは配列番号3の一部、または配列番号3と実質的に相同な配列のデオキシリボ核酸配列を含有することを特徴とするベクター。
- 前記配列が、前記ベクター内にアンチセンス配向で存在する、請求項36に記載のベクター。
- プラスミドpSnRK2−6cDNA。
- プラスミドpSnRK2−6遺伝子。
- 配列番号1もしくは配列番号3、または配列番号1もしくは配列番号3の一部、あるいは配列番号1もしくは配列番号3と実質的に相同な配列の導入ヌクレオチド配列を含有することを特徴とするゲノムを有する植物体。
- 配列番号1もしくは配列番号3、または配列番号1もしくは配列番号3の一部、あるいは配列番号1もしくは配列番号3と実質的に相同な配列の導入ヌクレオチド配列を含有することを特徴とするゲノムを有する植物種子。
- トランスジェニック植物体のゲノム中にヌクレオチド配列を導入することにより前記植物体を作製する方法であって、前記ゲノム中に導入される前記ヌクレオチド配列が、配列番号1もしくは配列番号3、または配列番号1もしくは配列番号3の一部、あるいは配列番号1もしくは配列番号3、または配列番号1もしくは配列番号3の一部と実質的に相同な配列を包含することを特徴とする方法。
- 前記植物体が、シロイヌナズナ、トウモロコシ(Zea mays)、ルリジサ(Borago属種)、キャノーラ、トウゴマ(Ricinus communis)、カカオ豆(Theobroma cacao)、ワタ(Gossypium属種)、ハマナ(Crambe)属種、タバコソウ(Cuphea)属種、アマ(Linum属種)、レスケレーラ(Lesquerella)およびリムナンテス(Limnanthes)属種、リノーラ、ノウゼンハレン(Tropaeolum属種)、マツヨイグサ(Oenothera)属種、オリーブ(Olea属種)、アブラヤシ(Elaeis属種)、ラッカセイ(Arachis属種)、ナタネ、ベニバナ(Carthamus属種)、ダイズ(Glycine属種およびSoja亜属種)、ヒマワリ(Helianthus属種)、タバコ(Nicotiana属種)、ショウジョウハグマ(Vernonia)属種、コムギ(Triticum属種)、オオムギ(Hordeum属種)、イネ(Oryza属種)、カラスムギ(Avena属種)、モロコシ(Sorghum属種)、ライムギ(Secale属種)、ならびにイネ(Gramineae)科の他のメンバーからなる群から選択されることを特徴とする、請求項42に記載の方法。
- センスまたはアンチセンス核酸構築物を、植物体形質転換ベクター中に導入し、前記ベクターを用いて植物体または植物種子のゲノムを形質転換し、次いで、前記植物体または植物種子を生育させ、前記植物種子から油を抽出することにより、前記植物体の油含量、脂肪酸組成、糖/デンプン/炭水化物レベル、または種子収量を変化させる方法であって、前記核酸配列が、配列番号1もしくは配列番号3、または配列番号1もしくは配列番号3の一部、あるいは配列番号1もしくは配列番号3と実質的に相同な配列であることを特徴とする方法。
- 植物体、植物種子、または植物体の後代からなる群から選択される植物材料であって、プロモーターと機能的に関連している、植物材料の油含量を改変するためのSnf1関連タンパク質キナーゼ手段を含むベクターによりさらに形質転換されている植物材料。
- Snf1関連タンパク質キナーゼ手段が、核酸配列である、請求項45に記載の植物材料。
- プロモーターが、CsVMVである、請求項45に記載の植物材料。
- 前記プロモーターが、天然プロモーターである、請求項45に記載の植物材料。
- 前記プロモーターが、Ubi1プロモーターである、請求項45に記載の植物材料。
- 前記植物材料が、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、ルリジサ(Borago)属種、キャノーラ、トウゴマ(Ricinus)属種、カカオ(Theobroma)属種、トウモロコシ(Zea)属種、ワタ(Gossypium)属種、ハマナ(Crambe)属種、タバコソウ(Cuphea)属種、アマ(Linum)属種、レスケレーラ(Lesquerella)属種、リムナンテス(Limnanthes)属種、リノーラ、ノウゼンハレン(Tropaeolum)属種、マツヨイグサ(Oenothera)属種、オリーブ(Olea)属種、アブラヤシ(Elaeis)属種、ラッカセイ(Arachis)属種、ナタネ、ベニバナ(Carthamus)属種、ダイズ(Glycine)属種、ダイズ(Soja)亜属種、ヒマワリ(Helianthus)属種、タバコ(Nicotiana)属種、ショウジョウハグマ(Vernonia)属種、コムギ(Triticum)属種、オオムギ(Hordeum)属種、イネ(Oryza)属種、カラスムギ(Avena)属種、モロコシ(Sorghum)属種、ライムギ(Secale)属種、アブラナ(Brassicaceae)科、ならびにイネ科(Gramineae)植物の他のメンバーからなる群から選択される、請求項45に記載の植物材料。
- 植物体の乾燥耐性を改変する方法であって、
Snf1関連タンパク質キナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、配列番号1および配列番号3からなる群から選択される核酸配列を含む核酸構築物を、植物体形質転換ベクター中に導入するステップと、
前記植物体形質転換ベクターにより、植物体または植物種子のゲノムを形質転換するステップと、
前記核酸配列を発現させるステップと、
前記植物体または植物種子を生育させるステップと、
同一の条件下で生育させた植物体と同じ遺伝子型であるが前記導入核酸配列を有さない、統計学的に有意な数の植物体の平均乾燥耐性と比較して、乾燥耐性の変化を有する形質転換植物体を選択するステップと
を含む方法。 - 植物体の根のバイオマスを改変する方法であって、
Snf1関連タンパク質キナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、配列番号1および配列番号3からなる群から選択される核酸配列を含む核酸構築物を、植物体形質転換ベクター中に導入するステップと、
前記植物体形質転換ベクターにより、植物体または植物種子のゲノムを形質転換するステップと、
前記核酸配列を発現させるステップと、
前記植物体または植物種子を生育させるステップと、
同一の条件下で生育させた植物体と同じ遺伝子型であるが導入核酸配列は有さない、統計学的に有意な数の植物体の根の平均バイオマスと比較して、根のバイオマスの変化を有する形質転換植物体を選択するステップと
を含む方法。 - 植物体、植物種子、または後代における水分喪失に対する抵抗性、乾燥耐性、炭素同化量、植物体の生育および成長、脂肪酸バイオアセンブリー、または根の生育を向上させる、1または複数のさらなる異種遺伝子または改変遺伝子を含む、請求項13に記載の植物体、植物種子、またはその後代。
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