KR20120007038A - 식물 ｓｎｆ１-관련 단백질 키나제 유전자 - Google Patents

식물 ｓｎｆ１-관련 단백질 키나제 유전자 Download PDF

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Abstract

본 발명은 식물 Snf1 관련 단백질 키나제 (SnRK) 유전자 및 유전자 생성물의 단리, 정제, 특성화 및 용도에 관한 것이다. 본 발명은 단리되고 정제된 SnRK DNA를 포함하고, 유전자를 사용하여 수분 손실 및 식물 가뭄 내성, 수크로스 함량, 전분 함량, 종자 오일 함량, 지방산 합성, 종자 오일 아실 조성, 종자 크기/중량, 생물학적 스트레스에 대한 저항성/내성, 증가된 뿌리 생물체량, 및/또는 다른 종자 성분, 식물 내로 탄소 흐름 (flux)을 조절하는 방법, 및 유전자로 형질전환된 조직 및 식물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 도입된 DNA 서열을 함유하는 게놈을 갖는 트랜스제닉 식물, 식물 조직 및 식물 종자, 및 그러한 식물 및 식물 종자의 생산 방법에 관한 것이다.

Description

식물 ＳＮＦ１-관련 단백질 키나제 유전자{PLANT SNF1-RELATED PROTEIN KINASE GENE}
우선권
본원은 2009년 4월 10일자로 발명의 명칭 "PLANT SNF1-RELATED PROTEIN KINASE GENE"로 출원된 미국 특허 가출원 61/168,532를 기초로 한 우선권의 이익을 주장한다.
기술분야
본 발명은 일반적으로 식물 특징의 유전자 조작을 위해 유용한 식물 유전자에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 상업 또는 작물 식물에서, 예를 들어 식물 수분 손실 및 식물 가뭄 내성, 수크로스 함량, 전분 함량, 종자 오일 함량, 지방산 합성, 종자 오일 아실 조성, 종자 크기/중량, 생물학적 스트레스에 대한 저항성/내성, 증가된 생물체량 (biomass), 및/또는 다른 종자 성분 내로의 탄소 흐름 (flux)을 변경시키기 위해 유용한 Snf1-관련 단백질 키나제 (SnRK) 유전자의 확인, 단리 및 도입에 관한 것이다.
많은 증거가 Snf1-관련 단백질 키나제가 효모 및 포유동물 세포에서 영양 및 환경 스트레스에 반응하여 기본적인 대사 경로를 조정하는 중요한 조절자로서 역할을 수행함을 입증한다 ([Hardie, 2007]; [Hardie and Carling, 1997]; [Hedbacker and Carlson, 2008]). 효모 사카로마이세스 세레비지아에 (Saccharomyces cerevisiae)에서, 수크로스 비-발효 키나제 Snf1은 글루코스-억제성 유전자의 전사의 탈억제를 위해 요구되는 세린/트레오닌 단백질 키나제이다. 이것은 또한 글루코스 신생합성, 글리코겐 축적, 미토콘드리아 및 퍼옥시좀 (peroxisome) 생물발생, 및 포자형성에 관여한다. 효모 Snf1의 포유동물 오르토로그 (ortholog)는 아데노신 모노포스페이트 (AMP)-활성화된 단백질 키나제 (AMPK)이다.
ATP를 고갈시키는 세포 스트레스 반응 시에, AMPK는 활성화되어 콜레스테롤 및 지방산 생합성에 관여하는 효소를 인산화하고 억제한다. AMPK가 3-히드록시-3-메틸글루타릴-CoA (HMG-CoA) 환원효소 (콜레스테롤 및 다른 이소프레노이드 화합물의 합성에서 핵심 조절 효소), 아세틸 CoA 카르복실라제 (ACC) (말로닐 CoA 합성에서 속도 제한 효소), 및 호르몬-감수성 리파제를 또한 불활성화시킬 수 있음은 잘 입증되어 있다. 동시에, AMPK는 ATP 생산을 촉진하도록 지방산 이화 경로를 촉발한다. 예를 들어, AMPK는 말로닐 CoA 분해에 관여하는 효소인 말로닐-CoA 데카르복실라제 (MCD)를 인산화하고 활성화시킨다. 보다 최근에, 글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제를 불활성화시키는데 있어서 AMPK에 대한 역할이 또한 포유동물 세포에서 제안되었다. 따라서, AMPK는 트리글리세리드 및 콜레스테릴 에스테르의 합성 및 파괴를 조절하는 잠재력을 갖는다.
아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana) 및 쌀 게놈의 완전한 서열의 생물정보학 연구에서, 식물에 효모로부터의 고전적인 Snf1-형 키나제에 관련된 큰 집단의 키나제가 존재함이 밝혀졌다. 아라비돕시스에서, Snf1-관련 키나제 (SnRK)는 5개의 모든 염색체 상에서 발견되고 38개의 구성원으로 이루어진다. 서열 유사성에 따라, 이들 키나제는 다음 3개의 하위군으로 분류될 수 있다: SnRK1 (3개의 구성원), SnRK2 (10개의 구성원) 및 SnRK3 (25개의 구성원) (E.M. Hrabak et al., Plant Physiol. 2003, 132, 666-680). 개별 키나제의 구조는 키나제 도메인 및 조절 도메인으로 구성된다. 이들 키나제는 N-말단의 키나제 촉매 도메인에서 비교적 높은 유사성을 보이지만, C-말단의 그의 조절 도메인은 매우 다르고, 이것은 단백질-단백질 상호작용에서 기능을 하거나 키나제 활성을 조절하는 것으로 생각된다 (E.M. Hrabak et al., Plant Physiol. 2003, 132, 666-680). 이것은 각각의 키나제에 대한 복잡한 기능성을 강조한다.
서열 유사성에 기초하여 SnRK1 키나제는 효모 Snf1 키나제 및 포유동물 AMPK의 최근접 상동체이다. 이들은 호밀, 아라비돕시스, 담배, 보리, 쌀, 사탕무 및 감자를 포함한 다양한 종으로부터 단리되었다. 호밀 및 담배 유전자가 효모에서 Snf1 돌연변이를 보완할 수 있다는 발견은 Snf1에 대한 식물 SnRK1 유전자의 기능적 유사성을 예측한다. 따라서, 당 대사에서 식물 SnRK1에 대한 역할이 제안되었다. 감자에서 SnRK1의 안티센스 발현은 수크로스 합성효소의 당-유도가능 발현의 손실을 일으켰다 (Purcell et al., Plant Journal 1998, 14:195-202). 이들 안티-센스 라인을 사용한 추가의 작업은 전분 생합성에서 핵심 조절 단계인 ADP글루코스 피로포스포릴라제의 번역후 변형의 조정을 통해 탄소 유동에 영향을 미치기 위한 SnRK1 키나제에 대한 잠재적인 역할을 나타낸다 (Tiessen et al., Plant Journal 2003, 35:490-500). 추가로 지지하는 증거는 보리에서 SnRK1의 안티센스 발현이 화분립 내에 전분 축적이 거의 또는 전혀 없도록 하고, 이것은 웅성 불임을 일으킨다는 발견으로부터 기인하였다 (Y. Zheng et al., Plant Journal 2001, 28:431-441).
SnRK1 군과는 달리, SnRK2 및 SnRK3 군의 대표적인 것은 동물 및 진균에서 발견되지 않고, 이것은 식물에서 세포 반응의 독특한 조절을 예측한다. 최근에, SnRK3 키나제 (CIPK (CBL-상호작용 단백질 키나제)로서도 칭함)는 식물 칼슘 센서의 신규한 패밀리 (칼시뉴린 B-유사 단백질 (CBL)로 불림)와 상호작용할 수 있는 것으로 나타났다 ([Kudla et al., 1999]; [Shi et al., 1999]; [Kim et al., 2000]). 아라비돕시스에서, CBL 패밀리 내에 10개의 구성원이 존재하고, 각각은 칼슘에 결합하는 3개의 EF-핸드 (hand)를 함유한다 (Kolukisaoglu et al., 2004). 스트레스 조건 하에, 칼슘 시그너쳐 (signature)는 상이한 CBL 및 SnRK3 (CIPK) 구성원 사이의 특이적 상호작용을 변화 및 해독하여, 하류 유전자의 변경된 발현에 이어 특이적인 생리학적 반응을 일으킨다. 예를 들어, CBL1은 CIPK7 및 CIPK9와 상호작용하여 가뭄 반응을 촉진하는 반면, CBL9는 CIPK3을 활성화시켜 저온 반응을 향상시킨다. CBL-SnRK3 (CIPK) 네트워크는 스트레스 반응에서 그의 중추적인 역할 때문에 스트레스 호르몬으로서 언급되는 식물 호르몬 아브시스산 (ABA)과 대부분 상호작용하는 것이 알려져 있다. 상기 메카니즘을 지지하는 증거는 다음의 것들을 포함한다: (i) 스트레스 조건에서와 같이, ABA는 CBL1 및 CIPK3 유전자의 발현을 유도할 수 있다; (ii) cbl9 및 cipk3 돌연변이체는 ABA에 과민성이다; (iii) 아라비돕시스에서 SnRK3 군의 구성원 (PKS18로 지정됨, 주석이 달린 At5g45820에 대응함)의 과다발현은 종자 발아 동안 ABA에 대한 과민성을 부여한 반면, 유전자의 침묵화는 ABA-불감성을 일으켰다 (D. Gong et al., J. Biol. Chem. 2003, 277:42088-42096).
키나제의 C-말단 도메인에서의 낮은 서열 유사성 때문에, SnRK2 군은 2개의 하위군, 즉 SnRK2a 및 SnRK2b로 추가로 나누어질 수 있다 ([M. Boudsocq et al., J. Biol. Chem. 2004, 279:41758-66]; [T. Umezawa et al., PNAS 2004, 101:17306-17311]). SnRK2a는 SnRK2.2, SnRK2.3, SnRK2.6, SnRK2.7 및 SnRK2.8로 이루어진다. 다른 5개의 구성원, 즉, SnRK2.1, SnRK2.4, SnRK2.5, SnRK2.9 및 SnRK2.10은 SnRK2b 하위군에 속한다 (Umezawa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2004, 101:17306-11]). 몇몇 연구에서는 SnRK2 하위군 내의 개별적인 키나제가 생물학적 과정에서 구분되는 역할을 가질 수 있음을 입증하였다. 예를 들어, SnRK2.2 및 SnRK2.3은 서열 유사성에 기초하여 SnRK2.6에 가장 밀접하게 관련된 2개의 단백질 키나제이지만 (Hrabak et al., 2003), 이들은 SnRK2.6과 매우 다르게 기능한다. SnRK2.2 및 SnRK2.3은 종자 발아 및 묘목 성장 동안 ABA 신호전달을 매개하는 핵심 단백질 키나제인 것으로 나타났다. 그러나, ABA 신호전달의 양성 조절인자로서, SnRK2.6은 기공 개폐 (stomatal aperture)의 ABA-매개된 조절에 관여하는 반면, 종자 휴면 및 발아는 아라비돕시스 SnRK2.6 돌연변이체에서 영향을 받지 않는다 ([Mustilli et al., 2002]; [Yoshida et al., 2006]).
SnRK2 하위군에서 각각의 키나제에 대한 특수 기능성을 강조하는 적어도 3개의 인자가 존재하는 것으로 생각된다. 먼저, 개별 키나제는 상이한 시간 및 공간적 발현을 보일 수 있다. 예를 들어, SnRK2-8은 뿌리에서 풍부하게 발현되고 잎 및 장각과 (silique)에서 약하게 발현되고 (Umezawa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2004, 101:17306-11); SnRK2-6은 아라비돕시스에서 공변 세포 및 맥관 조직에서 주로 발현되고 (Mustilli et al., 2002); SnRK2-2 및 SnRK2-3은 둘 모두 다양한 조직에서 광범위한 발현을 보이지만, SnRK2-3은 근단에서 특히 강한 발현을 보인다 (Fujii et al., Plant Cell, 2007, 19:485-494). 두 번째로, C-말단의 조절 도메인은 상이한 SnRK2 키나제 사이에 매우 다르지만, 키나제 도메인은 상당히 보존된다. 예를 들어, SnRK2-4와 SnRK2-6 키나제 사이의 전체 서열 유사성은 70%인 반면, C-말단 도메인에서는 단지 30% 동일성만 존재한다. 이것은 SNRK2-6 및 다른 신호전달 성분의 상호작용이 SnRK2-4의 상호작용과 다를 수 있고, 그에 의해 이들 2개의 키나제에 의해 부여되는 상이한 기능을 예측할 수 있음을 제안한다. 지지하는 증거는 이들 2개의 키나제가 상이한 환경적인 신호에 반응한다는 발견에서 기인한다 (M. Boudsocq et al., J. Biol. Chem. 2004, 279, 41758-66). 또한, 키나제의 생리학적 기능의 제어에서 C-말단 도메인의 역할은 실험에 의해 확인되었다 ([Belin et al., 2006]; [Yoshida et al., 2006]). 마지막으로, 키나제의 근소한 구조적 차이가 상이한 하위세포 국재화를 일으킬 수 있다. 각각의 키나제가 기능하는 방식을 이해하기 위해, 그가 살아있는 세포 내에 위치하는 곳을 이해할 필요가 있다.
본 발명의 하나의 실시양태는 식물 세포를 Snf1-관련 단백질 키나제 단백질을 코딩하는 핵산 서열로 형질전환시키고; 식물이 종자를 생산할 때까지 식물 세포로부터 식물을 성장시키고; 식물로부터 종자를 수확하는 것을 포함하는, 식물, 식물 종자 또는 그의 자손체를 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 실시양태는 식물의 생산 방법에 의해 생산된 식물로부터 수확한 종자를 포함한다. Snf1-관련 단백질 키나제 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 그의 게놈에 통합된 식물, 식물 종자, 또는 그의 자손체가 또한 포함된다.
본 발명의 또 다른 측면은 센스 또는 안티-센스 핵산 구성체를 식물 형질전환 벡터 내로 도입하여 변형된 식물 형질전환 벡터를 생성하는 것을 포함하는, 식물, 식물 저장 기관 또는 식물 종자의 오일, 당, 또는 전분 함량을 변화시키는 방법을 포함하고, 여기서 상기 센스 또는 안티-센스 핵산 구성체는 아라비돕시스 Snf1-관련 단백질 키나제 (SnRK) 단백질을 코딩하는 단리된, 정제된 또는 재조합 핵산 서열을 포함한다. 식물, 식물 저장 기관 또는 식물 종자의 게놈을 변형된 식물 형질전환 벡터로 형질전환시킨다. 식물, 식물 저장 기관, 또는 식물 종자를 성장시킨 후, 오일 또는 생체중합체를 추출한다. 벡터에 의해 형질전환된 게놈을 갖는 유전적으로 형질전환된 식물 및 식물 종자가 본 발명의 추가의 실시양태로서 또한 포함된다. 그러한 식물 및 식물 종자는 동일한 유전자형의 게놈이 변형되지 않은 식물에 비해 변경된 호흡률, 변경된 종자 오일 함량, 변경된 지방산 조성, 향상된 생물체량, 생체중합체를 축적하는 향상된 능력, 및 증가된 뿌리 성장을 보이는 것을 특징으로 할 수 있다.
특정 실시양태에서, 식물에서 Snf1-관련 단백질 키나제 단백질을 조정하는 방법은 식물 세포를 프로모터에 작동가능하게 연결된 식물 Snf1-관련 단백질 키나제 폴리뉴클레오티드로 안정하게 형질전환시키고 (여기서, 폴리뉴클레오티드는 센스 또는 안티센스 배향으로 존재한다); 식물에서 Snf1-관련 단백질 키나제 단백질을 조정하기 위해 충분한 시간 동안 폴리뉴클레오티드를 발현할 수 있는 재생된 식물을 생산하기 위해 식물 세포를 식물 성장 조건 하에 성장시키는 것을 포함한다.
또 다른 실시양태는 식물 세포를 Snf1-관련 단백질 키나제 단백질을 코딩하는 수단으로 형질전환시키고; 식물이 종자를 생산할 때까지 식물 세포로부터 식물을 성장시키고; 식물로부터 종자를 수확하고; 수확한 종자로부터 오일을 추출하는 것을 포함하는, 트랜스제닉 (transgenic) 종자로부터 오일을 추출하기 위한 방법에 관한 것이다. 상기 방법에 의해 생산된 오일이 또한 포함된다.
또 다른 실시양태는 서열 1 또는 서열 3에 따른 데옥시리보핵산 서열, 또는 서열 1 또는 서열 3의 일부, 또는 서열 1 또는 서열 3에 실질적으로 상동성인 서열을 함유하는 것을 특징으로 하는, 식물 세포의 형질전환을 위한 벡터에 관한 것이다. 서열 1 또는 서열 3의 도입된 뉴클레오티드 서열, 또는 서열 1 또는 서열 3의 일부, 또는 서열 1 또는 서열 3에 실질적으로 상동성인 서열을 함유하는 것을 특징으로 하는 게놈을 갖는 식물 또는 식물 종자가 하나의 실시양태로서 또한 포함된다. 마찬가지로, 특정 실시양태에서 상기 게놈 내로 도입된 상기 뉴클레오티드 서열이 서열 1 또는 서열 3, 또는 서열 1 또는 서열 3의 일부, 또는 서열 1 또는 서열 3이나 서열 1 또는 서열 3의 일부에 실질적으로 상동성인 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 뉴클레오티드 서열을 상기 식물의 게놈 내로 도입함으로써 트랜스제닉 식물을 생산하는 방법이 포함된다.
본 발명의 또 다른 측면은 식물 또는 식물 종자의 게놈을 형질전환시키기 위한 벡터를 사용하여 센스 또는 안티-센스 핵산 구성체를 식물 형질전환 벡터 내로 도입한 후, 식물 또는 식물 종자를 성장시키고 식물 종자로부터 오일을 추출함으로써, 식물의 오일 함량, 지방산 조성, 또는 종자 수율을 변화시키는 방법을 포함하고, 여기서 상기 핵산 서열은 서열 1 또는 서열 3, 또는 서열 1 또는 서열 3의 일부, 또는 서열 1 또는 서열 3에 실질적으로 상동성인 서열인 것을 특징으로 한다. 본 발명의 또 다른 측면은 프로모터와 기능적으로 연관된 식물 물질의 오일 함량을 변경시키기 위한 Snf1-관련 단백질 키나제 수단을 포함하는 벡터에 의해 추가로 형질전환된 식물, 식물 종자 및 식물의 자손체를 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 식물의 가뭄 내성을 변경시키는 방법은 Snf1-관련 단백질 키나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는, 서열 1 및 서열 3으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 핵산 서열을 포함하는 핵산 구성체를 식물 형질전환 벡터 내로 도입하고; 식물 또는 식물 종자의 게놈을 상기 식물 형질전환 벡터로 형질전환시키고; 핵산 서열을 발현시키고; 식물 또는 식물 종자를 성장시키고; 뉴클레오티드 서열이 도입되지 않았지만 동일한 조건에서 성장시킨 식물과 동일한 유전자형의 통계상 유의한 수의 식물의 평균 가뭄 내성에 비해 변경된 가뭄 내성을 갖는 형질전환된 식물을 선택하는 것을 포함한다.
도 1은 340293, 340318, 340367, 340378 및 340397로서 지명된 아라비돕시스 탈리아나의 34일령 야생형 (wt) 및 SnRK2-6 트랜스제닉 식물주에서 줄기에서 곁가지 수의 비교를 보여주는 그래프이다. 오차 막대는 ±SD이다.
도 2는 아라비돕시스 탈리아나의 27일령 야생형 (wt) 및 트랜스제닉 식물주의 탈락된 지상부 (aerial portion)에서 수분 손실을 보여주는 플롯이다. 각각의 데이타 점은 아라비돕시스 탈리아나의 5개의 비의존적인 트랜스제닉 주의 평균을 나타낸다. 수분 손실은 식물로부터 지상부의 탈락 후 0시간 내지 6시간의 초기 생체 중량 (fresh weight)의 퍼센트로서 보고된다. wt와 트랜스제닉 사이의 수분 손실의 유의한 차이는 P (ttest) <0.004에 의해 예시된다.
도 3은 아라비돕시스 탈리아나에서 SALK_008068에서 T-DNA 삽입을 위한 27일령 동형접합 (낙아웃 (knockout)) 및 눌 (null)의 탈락된 지상부에서 수분 손실을 보여주는 플롯이다. 수분 손실은 식물로부터 지상부의 탈락 후 0시간 내지 6시간의 초기 생체 중량의 퍼센트로서 보고된다. wt와 트랜스제닉 사이의 수분 손실의 유의한 차이는 P (ttest) <0.004에 의해 예시된다.
도 4는 아라비돕시스 탈리아나의 30일령 야생형 (wt) 및 T3 SnRK2-6 트랜스제닉 주 (340293, 340318, 340367, 340378 및 340397)로부터의 잎에서 가용성 당 함량 (글루코스, 프럭토스 및 수크로스의 nmol/g)을 보여주는 그래프이다. 각각의 데이타 점은 아라비돕시스 탈리아나의 5개의 비의존적인 SnRK2-6 트랜스제닉 주 (340293, 340318, 340367, 340378 및 340397)의 평균을 나타낸다. 오차 막대는 ±SD이다 (n= 샘플링된 각각의 식물주의 8 또는 10개의 식물).
도 5는 아라비돕시스 탈리아나의 30일령 야생형 (wt) 및 5개의 비의존적인 SnRK2-6 트랜스제닉 주로부터의 잎에서 전분 함량을 보여주는 그래프이다. 각각의 데이타 점은 아라비돕시스 탈리아나의 5개의 비의존적 SnRK2-6 트랜스제닉 주 (340293, 340318, 340367, 340378 및 340397)의 평균을 나타낸다. 전분 함량은 각각의 식물주로부터 잎의 총 전분 함량의 nmol/g으로서 보고된다. 오차 막대는 ±SD이다 (n= 샘플링된 각각의 식물주의 8 또는 10개의 식물).
도 6은 아라비돕시스 탈리아나의 야생형 (wt) 및 SnRK2-6 트랜스제닉 주로부터의 잎의 지방산 조성의 비교를 보여주는 그래프이다. 각각의 데이타 점은 아라비돕시스 탈리아나의 5개의 비의존적인 SnRK2-6 트랜스제닉 주 (340293, 340318, 340367, 340378 및 340397)의 평균을 나타낸다. 지방산의 비율은 각각의 식물주로부터 잎의 전체 조성의 Mol %로서 보고된다. 오차 막대는 ±SD이다 (n= 샘플링된 각각의 식물주의 10개의 식물).
도 7은 아라비돕시스 탈리아나의 야생형 (wt) 및 SnRK2-6 트랜스제닉 주에서 식물당 종자 수율의 비교를 보여주는 그래프이다. 보다 구체적으로, 이것은 보통, 온건한 및 가혹한 성장 조건 하에 종자 수율의 비교이다. "보통" 조건 하에 성장된 식물은 전체 성장 주기 동안 잘 급수되었다. "온건한" 조건 하에 성장시킨 식물에서 개화기 동안 6일 동안 관수 (irrigation)를 중단하였다. "가혹한" 조건 하에 성장된 식물에서 영양생장기 동안 16일 동안 관수를 중단하였다. 오차 막대는 ±SD이다 (n= 샘플링된 각각의 식물주의 30개의 식물). wt 및 트랜스제닉 주 사이의 종자 수율의 유의한 차이는 P (ttest) <0.001에 의해 예시된다.
도 8은 옥수수 식물의 34일령 눌 분리개체 (segregant) (null) 및 SnRK2-6 트랜스제닉 주 (트랜스제닉)의 탈락된 잎 부분에서 수분 손실을 보여주는 플롯이다. 각각의 데이타 점은 옥수수 식물의 8개의 비의존적인 트랜스제닉 주의 평균을 나타낸다. 각각의 비의존적 식물주로부터 5개의 눌 분리개체 및 5개의 키나제-함유 식물 (모두 매우 유사한 크기를 보였다)을 사용하였다. 각각의 식물에 대해, 보이는 엽령 (collar)을 갖는 최상부 잎을 절제하고 분석에 사용하였다. 수분 손실은 식물로부터 지상부의 탈락 후 0분 내지 180분의 초기 생체 중량의 퍼센트로서 보고된다. 눌 및 트랜스제닉 주 사이의 수분 손실의 유의한 차이는 P (ttest) <0.003에 의해 예시된다.
도 9A-9C는 3개의 비의존적 식물주로부터 34일령 눌 분리개체 (null) 및 SnRK2-6-함유 옥수수 식물 (트랜스제닉)의 탈락된 잎에서 수분 손실을 보여주는 플롯이다. 각각의 데이타 점은 동일한 식물주로부터 5개의 비의존적 옥수수 식물의 평균을 나타낸다. 각각의 식물에 대해, 보이는 엽령을 갖는 최상부 잎을 절제하고 분석에 사용하였다. 수분 손실은 식물로부터 지상부의 탈락 후 0분 내지 90분의 초기 생체 중량의 퍼센트로서 보고된다.
도 10은 4가지 비의존적 식물주 (이들은 2280(1)006.006R.011R, 2280(2)015.006R.008R, 2280(2)016.004R.017R 및 2280(3)025.006R.007R로서 지명된다)로부터 눌 분리개체 (null) 및 SnRK2-6-함유 옥수수 식물 (트랜스제닉)에서 뿌리 생물체량의 비교를 보여주는 그래프이다. 지상부를 자르고, 뿌리를 토양을 제거하고 상이한 샘플 사이의 습기 변동을 제거하기 위해 온실에서 7일 동안 건조함으로써 수집하였다.
도 11은 벡터로서 사용할 수 있는 플라스미드 pDAB4504의 지도이다. 벡터는 본 발명에서 식물 형질전환을 위한 다음의 두드러진 특징을 갖는다: CsVMV 프로모터, SnRK2-6 및 AtuORF24 3'-UTR.
도 12는 벡터로서 사용할 수 있는 플라스미드 pDAB7702의 지도이다. 벡터는 본 발명에서 식물 형질전환을 위한 다음의 두드러진 특징을 갖는다: 옥수수 Ubi1 프로모터, SnRK2-6 hv, 및 ZmPer5 3'-UTR.
본 발명의 하나의 실시양태는 상업적 식물 오일의 수율을 증가시키기 위해, 또는 그의 조성을 변형시켜 식물 및 식물 생성물의 구체적인 상업적 개선을 달성하기 위해 식물에서 트리아실글리세롤의 천연 형성을 변형시키기 위해 사용될 수 있는 유전적 요소의 확인, 단리 및 클로닝에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 아라비돕시스 종으로부터 Snf1-관련 단백질 키나제 (SnRK) 유전자 및 cDNA 서열의 단리 및 특성화, 및 식물의 유전자 조작에서 이들 서열의 활용에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 아라비돕시스 종 내로 재도입하기 위한 또는 다른 식물 내로 도입하기 위한, 프로모터 (예를 들어, CsVMV 또는 Ubi1)의 제어 하에, 센스 배향으로 아라비돕시스로부터의 전장 SnRK 코딩 서열 또는 SnRK 서열의 유의한 부분을 함유하는 벡터를 제공하는 것이다. 본 발명의 별도의 실시양태에서, 아라비돕시스 종 내로 재도입하기 위한 또는 다른 식물 내로 도입하기 위한, 그 자신의 5' 상류 조절 서열의 제어 하에, 아라비돕시스로부터의 전장 SnRK 유전자, 또는 SnRK 서열의 유의한 부분으로 이루어지는 아라비돕시스로부터의 게놈 단편을 함유하는 벡터를 제공한다.
아라비돕시스 내로 재도입하기 위한 또는 다른 식물 내로 도입하기 위한, 프로모터의 제어 하에, 안티센스 배향으로 아라비돕시스로부터의 전장 SnRK 서열 또는 SnRK 서열의 유의한 부분을 함유하는 벡터를 제작하는 방법이 또한 포함된다. 또 다른 특정 방법은 그의 종자 오일 함량, 그의 지방산 조성, 그의 평균 종자 중량 또는 크기, 및/또는 그의 수분 손실 및 식물 가뭄 내성을 변화시키기 위해 아라비돕시스 및 다른 식물을 변형시키는 것을 포함한다. 본 발명의 다른 방법은 성장 및 발달을 촉진하기 위해, 예를 들어 뿌리 생물체량을 증가시키기 위해 또는 그의 광합성 활동을 변화시켜 당 및 전분 함량을 증가시키기 위해 아라비돕시스 및 다른 식물을 변형시키는 것을 포함한다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 식물 세포 내로 센스 배향으로 cDNA의 도입을 위한 서열 1 (pSnRKcDNA)의 단리된 및 정제된 데옥시리보핵산 (cDNA)을 함유하는 벡터가 제공된다. 본 발명의 다른 측면으로서, 식물 세포 내로 센스 배향으로 유전자의 도입을 위한 서열 3 (pSnRK2-6 hv5 유전자)의 단리된 및 정제된 식물 최적화된 데옥시리보핵산 (DNA)을 함유하는 벡터를 제공한다. 본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 식물 세포 내로 안티센스 배향으로 유전자 또는 부분 유전자의 도입을 위한 서열 1 또는 그의 일부, 또는 서열 3 또는 그의 일부를 함유하는 벡터의 제조 방법이 제공된다.
또 다른 실시양태는 아라비돕시스 탈리아나의 돌연변이체 종자 주를 제공하는 것을 포함한다. 돌연변이체 종자 주는 SnRK 유전자 내에 삽입 돌연변이를 갖고 (하기 표 1에 제시된 바와 같은), 증가된 SnRK 활성을 보여, 잎 크기 및 곁가지 수의 증가, 감소된 수분 손실, 증가된 당 및 전분 함량, 변경된 종자 지방 아실 조성, 증가된 종자 수율, 및 증가된 뿌리 생물체량을 일으키는 식물을 생산한다. SnRK2-6의 cDNA 서열을 서열 1에 제시하고, 식물-최적화된 DNA 서열을 서열 3에 제시하고, SnRK2-6의 번역된 단백질 서열을 서열 2에 제시한다.
본 발명은 또한 서열 1 또는 서열 3의 도입된 DNA 서열을 함유하는 게놈을 갖는 트랜스제닉 식물 및 식물 종자, 및 그러한 식물 및 식물 종자의 생산 방법에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 당업자가 이해할 바와 같이 서열 1 또는 서열 3의 서열 정보를 사용하여 공지의 방법에 의해 단리된 및/또는 특성 결정된, 25% 또는 그 초과의 동일성 및 50% 또는 그 초과의 유사성의 추정 아미노산 서열을 갖는 식물로부터의 실질적으로 상동성인 DNA 서열, 및 안티-센스 또는 동시-억제 (Jorgensen and Napoli 1994) 용도로 사용함으로써 유전자 발현의 억제제로서 여전히 기능을 할 수 있는 감소된 길이의 부분에 관한 것이다. 당업자는 특이적인 유전자 서열에서 뉴클레오티드의 동일성에서의 작은 변화가 유전자의 유효성을 감소 또는 향상시킬 수 있고, 일부 용도 (예를 들어, 안티-센스 또는 동시-억제)에서 부분 서열은 종종 전장 형태만큼 효과적으로 작용함을 이해할 것이다. 유전자 서열이 변화 또는 단축될 수 있는 방식은 당업자에게 잘 알려져 있고, 변경된 유전자의 유효성을 시험하는 방식도 그러하다. 따라서, 유전자의 그러한 모든 변동은 본 발명의 일부로서 청구된다.
변경된 잎 크기, 곁가지 수, 수분 손실, 또는 당, 전분 또는 오일 함량 또는 조성을 고려할 때, 본 발명에 따른 식물 또는 종자의 통계상 유의한 수의 평균으로부터의 결과는 동일한 조건 하에 동일한 시간에서 성장시킨 동일한 유전자형의 형질전환되지 않은 (대조군) 식물 또는 종자의 통계상 유의한 수의 평균으로부터의 결과와 가장 잘 비교된다. 이것은 특히 그러한 식물이 상이한 조건 하에 성장될 때 동일한 유전자형의 개별적인 식물의 가변성을 허용한다. 요구되는 평균을 형성하기 위해 사용되는 식물 또는 종자의 실제 수는 변할 수 있지만, 그러한 수가 선택될 때마다 전체적으로 일정한 평균을 제공하기 위해 충분해야 한다. 일반적으로, 숫자는 적어도 10이어야 하고, 보다 바람직하게는 적어도 20, 30, 50 또는 100이다.
본 발명의 SnRK는 식물에서 SnRK 활성, 및 수분 손실, 가뭄 내성, 탄소 동화, 식물 성장 및 발달, 지방산 생체합성 (bioassembly), 및 뿌리 성장을 조작하는데 있어서 유용하다. 예를 들어, 식물을 프로모터 (예를 들어, CsVMV 또는 Ubi1)의 제어 하에 센스 배향으로 SnRK 유전자를 함유하는 구성체로 형질전환시킴으로써, SnRK cDNA의 발현 및 가뭄 내성이 향상될 수 있거나, 식물의 조성이 변경될 수 있다. 이것은 뿌리 작물에서 가뭄 내성 및 전분/오일 비를 변경시키기 위해 특정 잇점을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, SnRk 유전자를 함유하는 구성체로 형질전환된 식물은 또한 이들 식물에서 수분 손실에 대한 저항성, 가뭄 내성, 탄소 동화, 식물 성장 및 발달, 지방산 생체합성, 및 뿌리 성장을 추가로 향상시키는 추가의 이종성 또는 변경된 유전자를 포함할 수 있다.
별법으로, SnRK 발현은 안티-센스 또는 동시-억제 (트랜스위치 (Transwitch)) 현상에 의해 어느 정도 침묵화될 수 있다 ([De Lange et al., 1995]; [Mol et al., 1990]; [Jorgensen and Napoli, 1994]; [Kinney, 1995]; [Vaucheret et al., 1998]; [Taylor, 1998]). 예를 들어, SnRK를 종자-특이적 방식으로 침묵화시키면 SnRK 축적을 감소시킬 수 있다. 이것은 저장 동안 안정성을 향상시키기 위해 종자 뿌리 작물에서 전분, 당 및/또는 오일 함량 또는 비를 감소시키는 용도를 가질 수 있다.
SnRK 유전자 또는 그의 일부를 사용하여 가능한 조작 및 실행가능한 대상의 일부는 다음의 것을 포함하고 이로 제한되지 않는다: 증가된 또는 감소된 오일 함량을 갖는 종자; 증가된 또는 감소된 당 또는 전분 함량을 갖는 잎; 변경된 지방산 조성을 갖는 종자 오일; 감소된 수분 손실을 보이는 식물; 다른 저장 기관 (예를 들어, 덩이줄기, 뿌리 및 잎)에 저장 화합물을 축적하기 위해 향상된 또는 변경된 능력을 보이는 식물; 및 증가된 뿌리 성장 및 생물체량을 갖는 식물.
몇몇 SnRK2 및 SnRK3 키나제는 ABA 신호전달 케스케이드를 통해 비생물학적 스트레스에 반응하여 중요한 역할을 수행하는 것으로 밝혀졌다. 이것은 일부 SnRK 키나제가 상기 대사에서 ABA의 필수적인 역할을 감안할 때 식물 지질 대사의 조절자로서 기능을 할 수 있다는 가능성을 제안한다. 종자 발아 동안, ABA는 저장 지질인 트리아실글리세롤의 수크로스로의 전환을 위한 필수적인 경로인 지방산 베타-산화 및 글리옥실레이트 사이클에 관여되는 유전자의 전사를 감소시킨다 (S.L. Pritchard et al., Plant J. 2002, 31:639-647). 그 반면에, ABA는 배아 (embryo) 발생 동안 트리아실글리세롤 합성을 증가시키고 그의 양성 조절인자로서 거동한다. 종자-특이적 면역조정에 의한 ABA의 감소는 담배 종자유의 생산을 더 적게 하는 것으로 나타났다 (J. Phillips et al., EMBO J. 1997, 16:4489-4496). 반대로, 미성숙 옥수수 배아를 ABA (4 μM)로 처리하면, 지방 아실트랜스퍼라제의 활성이 증가하고, 따라서 오일 수율이 증가하였다 (F. Pacheco-Moises et al., Plant Physiol. 1997, 114:1095-1101). 상기 효과는 아라비돕시스, 브라시카 (Brassica) (나푸스 (napus), 윤케아 (juncea) 및 레이프 (rape)), 땅콩, 당근, 밀, 가문비나무, 아몬드 및 땅콩 (아라키스 히포가에아 (Arachis hypogaea))을 포함한 많은 다른 종에서 관찰되었다. 그럼에도 불구하고, 임의의 SnRK 키나제가 종자 오일 합성의 ABA 조절을 매개하는지는 알려지지 않았다.
종자 오일 생산에 관련된 핵심 키나제를 확인하기 위한 시도에서, 역유전학적 접근법 (reverse genetic approach)을 사용하였다. 이것은 유전자 내로 SALK T-DNA 삽입의 스크리닝에 이어, 종자 오일 함량 및 종자 수율에 대한 유전자 낙아웃의 영향의 결정에 기초한다. 대규모 스크리닝 후에, 종자 오일 생산에서 SnRK2-6 유전자 (At4g33950)의 역할이 밝혀졌다. OST1 (OPEN STOMATA 1)로도 언급되는 상기 유전자는 칼슘-의존성 단백질 세린/트레오닌 키나제 활성을 갖는 단백질을 코딩하고 ABA-매개된 기공 개폐를 조절하는 것으로 이전에 입증되었다 (Mustilli et al., 2002). T-DNA 삽입에 의한 상기 유전자의 불활성화는 탈수 조건 하에 종자 수율을 24% 내지 50% 감소시켰다. 또한, 종자 오일 함량의 7% 내지 25% 감소가 낙아웃 주 SALK_008068에서 검출되었다. 그러나, 단백질 함량은 삽입에 동형접합인 식물 (21.3%) 및 눌 분리개체 (20.9%) 사이에서 단지 적은 변화만을 보였고, 이것은 SnRK2-6 (SnRK2a 하위군의 구성원)이 종자 오일 생산을 위한 양성 조절인자로서 역할을 함을 나타낸다.
SnRK2-6은 ABA-매개된 기공 전도도의 조절자로서 이전에 확인되었고, 이는 아라비돕시스에서 기공 및 맥관 조직에서 우선적으로 발현된다 ([Mustilli et al., 2002]; [Fujii et al., Plant Cell 2007, 19:485-494]). 본 발명에서 역유전학적 연구는 종자 오일 생산에서 그의 역할을 밝혀냈다.
SnRK2-6은 아라비돕시스에서 구성적 프로모터, CsVMV 하에 이소성 (ectopic)으로 발현되었다. CsVMV에 의한 SnRK2-6의 강제된 이소성 발현은 천연 프로모터에 의해 유도된 SnRK2-6 발현의 고도로 공간적으로 위치된 패턴을 파괴할 수 있어서, 정상과 다른 패턴을 생성시킨다. 상기 교란은 식물 성장 및 대사에 영향을 미칠 수 있다.
도 1을 살펴보면, 아라비돕시스에서 SnRK2-6의 과다발현은 잎 성장을 촉진하고, 추가로 곁가지 수를 증가시키는 것으로 입증되었다. 추가로, 야생형 식물에 비해 절제된 트랜스제닉 식물에서 수분 손실은 실질적으로 감소된 것으로 나타났고, 이는 SnRK2-6의 과다발현이 식물의 지상부의 증산 속도를 감소시킬 수 있음을 입증한다. 이와 반대로, 상기 유전자의 낙아웃은 도 3에 도시된 바와 같이 수분 손실을 가속화시켰다.
도 4에 도시된 바와 같이, 트랜스제닉 아라비돕시스 식물에서 증가된 탄소 동화는 SnRK2-6의 과다발현이 식물 성장을 촉진할 수 있음을 입증할 수 있다. 보다 구체적으로, SnRK2-6을 과다발현하는 트랜스제닉 아라비돕시스 식물은 보통 온실 조건 하에 트랜스제닉 잎 내의 프럭토스, 글루코스 및 수크로스 함량의 극적인 증가를 보였다. 트랜스제닉 잎 내의 총 당 함량은 야생형 잎보다 2배 많았다. 트랜스제닉 식물의 전분 함량은 실제로 야생형 수준의 156%이었다. 도 4 및 5를 살펴보면, SnRK2-6의 낙아웃은 가용성 당 또는 전분 함량에 크게 영향을 미치지 않았다. 종합하면, 이들 결과는 SnRK2-6 도입유전자 (transgene)의 구성적 발현이 잎 광합성 활동을 증가시켜 탄소 동화를 증가시킬 수 있음을 나타낸다.
도 6은 트랜스제닉 잎에서 지방산 조성의 극적인 변화를 보여준다. 트랜스제닉 식물의 잎 내의 16:3 및 18:3의 2가지 트리에노익 (trienoic) 지방산은 야생형에 비해 각각 81% 및 26% 증가하였고, 이것은 불포화 과정이 도입유전자에 의해 강화됨을 나타낸다.
잎에서 증가된 광합성 활동과 일치하게, 트랜스제닉 식물에서 종자 수율의 급격한 증가가 검출되었다. 야생형 식물에 비해, 트랜스제닉 식물은 보통 조건, 온건한 가뭄 조건, 및 가혹한 가뭄 조건 하에 각각 종자 수율의 24%, 16% 및 35% 증가를 보였다 (도 7). 이 결과는 도입유전자가 식물 가뭄 내성을 향상시킬 뿐만 아니라 다른 생리학적 과정을 변경하여, 정상 성장 조건 하에 종자 생산을 증가시킴을 시사한다.
종자 오일 분석은 SnRK2-6의 CsVMV-유도 발현이 종자 오일 함량의 유의한 변화를 일으키지 않음을 보여주었다. 그러나, 증가된 종자 수율 때문에 전체 종자 오일 생산은 도입유전자에 의해 증가하였다.
종합하면, SnRK2-6의 구성적 과다발현은 아라비돕시스 잎에서 가용성 당 및 전분의 함량을 대폭 증가시키고 지질 생합성을 변경시켰다. 이것은 또한 정상 및 가뭄 조건 모두에서 종자 수율을 크게 증가시켰다.
도 10에 도시된 바와 같이, 트랜스제닉 옥수수 식물에서 증가된 뿌리 생물체량은 SnRK2-6의 과다발현이 뿌리 성장을 촉진할 수 있음을 입증할 수 있다. SnRK2-6을 과다발현하는 트랜스제닉 옥수수 식물은 눌 식물에 비해 뿌리 생물체량의 극적인 증가 (즉, 11%, 25%, 92%, 및 15%)를 보였다. 이들 결과는 SnRK2-6 키나제가 뿌리 성장을 증가시킬 수 있음을 나타낸다. 그러한 메카니즘은 옥수수 가뭄 내성 증가와 연관될 수 있다.
본 발명에 따른 변형을 위해 특히 바람직한 식물은 아라비돕시스 탈리아나, 서양지치 (borage) (보라고 (Borago) 종), 캐놀라 (Canola), 피마자 (리시누스 코뮤니스 (Ricinus communis)), 코코아 원두 (테오브로마 카카오 (Theobroma cacao)), 옥수수 (제아 메이즈 (Zea mays)), 면 (고시퓸 (Gossypium) 종), 크람베 (Crambe) 종, 쿠페아 (Cuphea) 종, 아마 (리눔 (Linum) 종), 레스퀘렐라 (Lesquerella) 및 림난테스 (Limnanthes) 종, 리놀라 (Linola), 한련 (트로파에올룸 (Tropaeolum) 종), 오에노테라 (Oenothera) 종, 올리브 (올레아 (Olea) 종), 야자 (엘라에이스 (Elaeis) 종), 땅콩 (아라키스 (Arachis) 종), 평지씨, 홍화 (카르타무스 (Carthamus) 종), 대두 (글라이신 (Glycine) 및 소자 (Soja) 종), 해바라기 (헬리안투스 (Helianthus) 종), 담배 (니코티아나 (Nicotiana) 종), 베르노니아 (Vernonia) 종, 밀 (트리티쿰 (Triticum) 종), 보리 (호르데움 (Hordeum) 종), 벼 (오리자 (Oryza) 종), 귀리 (아베나 (Avena) 종), 수수 (소르검 (Sorghum) 종), 호밀 (세칼레 (Secale) 종) 또는 벼과 (Gramineae)의 다른 구성원을 포함한다.
본 발명은 오일종자 작물로부터 생산된 오일종자의 수율 또는 조성을 변경하기 위해 사용될 때 특히 유용하다. 오일종자 작물은 식용 또는 산업상 유용한 오일을 상업상 유의한 수율로 생성할 수 있는 식물 종이고, 상기 나열된 많은 식물 종을 포함한다. 그러한 오일종자 작물은 당업자에게 잘 알려져 있다.
SnRK2-6 유전자는 식물에서 바람직한 형질을 부여하는 하나 이상의 다른 유전자와 함께 도입될 수 있다. 예를 들어, 스트레스 내성 유전자 또는 가뭄 내성 유전자가 임의로 SnRK2-6 유전자와 조합하여 도입될 수 있다.
본 발명은 다음의 예시적인 실시예에 의해 추가로 설명된다.
실시예
실시예 1: PCR에 의한 아라비돕시스 SnRK 유전자 내로의 T-DNA 삽입의 확인
서열 유사성에 따라, 아라비돕시스 SnRK 키나제는 3개의 하위군, 즉 SnRK1, SnRK2 및 SnRK3으로 나눌 수 있다. SnRK1 하위군은 각각 At3g01090, At3g29160 및 At5g39440에 의해 코딩되는 3가지 키나제를 포함한다. SnRK2 하위군은 각각 유전자 At4g40010, At2g23030, At1g60940, At1g10940, At5g63650, At5g08590, At1g78290, At3g50500, At5g66880 및 At4g33950에 상응하는 10개의 구성원으로 이루어진다. SnRK3은 유전자 At5g57630, At3g17510, At1g48260, At4g24400, At5g35410, At2g26980, At1g30270, At1g01140, At4g14580, At3g23000, At2g38490, At5g01820, At2g30360, At2g34180, At1g29230, At5g45810, At4g18700, At4g30960, At5g45820, At5g58380, At5g07070, At5g01810, At2g25090, At5g25110 및 At5g10930에 의해 코딩되는 25개의 구성원이 존재하는 가장 큰 하위군이다.
SnRK 유전자 내로 T-DNA를 삽입시킨 SALK 주에서, 삽입에 대한 동형접합, 이형접합 및 눌 식물을 표 1 및 2에 제시된 바와 같이 PCR에 의해 스크리닝하였다. PCR 반응에 사용된 게놈 DNA는 아라비돕시스 잎으로부터 단리하였다. 예로서, SALK_008068에서 SnRK2-6 (At4g33950) 내로 T-DNA가 삽입된 식물에 대해 스크리닝하기 위해 GSP108 및 LBa1 프라이머를 사용하였다. 그 반면에, 유전자의 야생형 카피가 SALK_008068의 분리개체 내에 존재하는지 결정하기 위해 GSP108 및 GSP124 (At4g33950의 2개의 유전자-특이적 프라이머)를 사용하였다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
종자 오일 생산에서 각각의 키나제에 대한 기능을 확립하기 위해, 키나제 유전자 내로 삽입을 갖는 SALK 주의 종자에서 오일 프로필 (profile)을 기체 크로마토그래피에 의해 결정하였다. 키나제 유전자의 파괴에 의해 야기되는 영향을 더 잘 평가하기 위해, 동일한 주로부터의 눌 동기체 (sibling)를 대조군으로서 사용하였다. 이론적으로, 눌 동기체는 야생형에 비해 삽입을 위해 동형접합 및 이형접합성인 다른 분리개체에 대해 유전자 배경에서 더 높은 유사성을 갖는다.
실시예 2: 아라비돕시스 종자 지방산 메틸 에스테르 분석
아라비돕시스 종자의 추출 및 유도체화
성숙 아라비돕시스 종자를 수확하고 모든 비-종자 식물 물질을 제거하였다. 수확한 총 종자로부터, ~10 mg 분취물을 취하고 1 ml 용량 96-웰 플레이트 내로 분배하였다. 정확한 중량 측정치는 +/-2 ㎍의 정확도의 분석 저울을 사용하여 얻고 기록하였다. 웰 플레이트를 사용 전에 헥산으로 세정하고, 2개의 4 mm 직경 스테인레스 스틸 균질화 비드를 각각의 웰에 넣었다. 샘플 분배 후에, 75 ppm 메틸 헵타데카노에이트를 함유하는 0.4 ml 헥산 및 0.2 ml 0.5 M 나트륨 메톡시드을 각각의 웰로 분배하였다. 이어서, 웰 플레이트를 덮고 2분 동안 500 스트로크 (stroke)/분에서 수직 진탕기에 넣은 후, 250 스트로크/분에서 58분으로 변화시켰다. 이어서, 진탕이 완료된 후, 웰 플레이트를 5600 rcf에서 5분 동안 원심분리하였다. 원심분리 후에, 상단 헥산 추출층을 취하고 또 다른 96-웰 플레이트에 넣었다. 상기 추출을 0.4 ml 헥산을 사용하여 2회 더 수행하고, 각각의 후속 추출물을 제1 추출물과 합하였다. 제2 및 제3 추출 수직 진탕 조건은 추출마다 250 스트로크/분에서 30분으로 변화시켰다. 합한 1.2 ml 헥산 추출물을 GC-FID에 의한 분석을 위해 또 다른 96-웰 플레이트 내로 10배 희석하였다.
지방산 메틸 에스테르 ( FAME ) 분석
생성되는 지방산 메틸 에스테르 아라비돕시스 종자 지질을 담체 기체로서 1 ml/분 수소를 사용하여 3개의 경사 (ramp) 온도 구배를 이용하여 SGE BPX70 모세관 컬럼 (15 m, ID 0.22, df 0.25) 상에서 분해시켰다 (60℃에서 1.34분 동안 유지, 41.3℃/분으로 150℃까지, 9.1℃/분으로 180℃까지, 41.3℃/분으로 220℃까지 온도구배후 1.86분 동안 유지함). 도입구 온도는 230℃이고, 불꽃 이온화 검출기 온도는 240℃이었다. 체류 시간에 의한 FAME 분석의 확인 및 정량은 75 ppm 메틸 헵타데카노에이트를 갖는 평지씨 오일 참조 표준물 (마트레야 (Matreya) 제품)을 사용하여 달성하였다.
실시예 3: 아라비돕시스 잎 지방산 메틸 에스테르 분석
아라비돕시스 잎 지질의 추출 및 유도체화
동결된 아라비돕시스 잎을 막자사발과 막자를 사용하여 액체 질소 하에 미분말로 연마하였다. 상기 분말로부터 ~50 mg 분취물을 취하고 1 ml 용량 96-웰 플레이트 내로 분포하였다. 웰 플레이트를 사용 전에 헥산으로 세정하고, 4 mm 직경 스테인레스 스틸 균질화 비드를 각각의 웰에 넣었다. 샘플 분포 후에, 0.5 ml 헥산 및 0.25 ml 0.5 M 나트륨 메톡시드를 각각의 웰로 분배하였다. 이어서, 웰 플레이트를 덮고 30분 동안 250 스트로크/분에서 수직 진탕기 내에 넣었다. 이어서, 웰 플레이트를 5600 rcf에서 5분 동안 원심분리하였다. 원심분리 후에, 상단 헥산 추출층을 취하고 기체 크로마토그래프 불꽃 이온화에 의한 분석을 위해 또 다른 96-웰 플레이트 내에 넣었다.
FAME 분석
생성되는 지방산 메틸 에스테르 아라비돕시스 잎 지질을 담체 기체로서 1 ml/분 수소를 사용하여 3개의 경사 온도 구배를 이용하여 SGE BPX70 모세관 컬럼 (15 m, ID 0.22, df 0.25) 상에서 분해시켰다 (60℃에서 1.34분 동안 유지, 41.3℃/분으로 150℃까지, 9.1℃/분으로 180℃까지, 41.3℃/분으로 220℃까지 온도구배후 1.86분 동안 유지함). 도입구 온도는 230℃이고 불꽃 이온화 검출기 온도는 240℃이었다. 체류 시간에 의한 FAME의 확인은 평지씨 오일 참조 표준물 (마트레야 제품)을 사용하여 달성하였다.
실시예 4: 아라비돕시스 종자 총 단백질 분석
아라비돕시스 종자의 산성 소화 (단백질 가수분해)
성숙 아라비돕시스 종자를 수확하고 모든 비-종자 식물 물질을 제거하였다. 수확한 총 종자로부터 ~20 mg 분취물을 취하고 고무 o-자 고리의 스크류 마개가 있는 2 ml 고압멸균가능한 원심분리관 내에 분배하였다. 정확한 중량 측정치는 +/-2 ㎍의 정확도의 분석 저울을 사용하여 얻고 기록하였다. 10개의 산 세척된 4-mm 유리 비드를 사용 전의 각각의 원심분리관에 첨가하였다. 샘플 분포 후에, 원심분리관을 수직 진탕기 내에 500 스트로크/분에서 5분 동안 넣었다. 이어서, 0.1% 페놀 및 1% 2-머캅토에탄올을 갖는 6 N 염산 1.4 ml을 각각의 샘플에 첨가하였다. 이어서, 원심분리관을 다시 15분 동안 500 스트로크/분에서 수직 진탕기에 넣었다. 수직 진탕이 완료된 후, 원심분리관을 100℃에서 24시간 동안 가열 블록 상에 놓아 소화를 완료시켰다. 일단 소화 과정이 끝난 후에, 원심분리관을 실온으로 냉각시키고, 소화물을 0.4 ㎛ 유리 필터를 통해 여과하였다. 0.1 ml의 여과된 소화물을 1.5 ml 유리 주사 바이알 내에서 0.3 ml 2 N 수산화나트륨, 0.6 ml 물, 및 고성능 액체 크로마토그래피 형광 검출에 의한 분석을 위해 내부 표준물로서 1000 pmol/㎕ 노르발린을 갖는 0.1 ml 물로 희석하였다.
아미노산 잔기의 유도체화
1차 아미노산은 o-프탈알데히드 (OPA)로 유도체화하였다. 2차 아미노산은 9-플루오레닐메틸 클로로포르메이트 (FMOC)로 유도체화하였다. 두 유도체화 반응은 모두 HPLC 주입 루프를 이용하여 전치 컬럼에서 달성하였다. 샘플을 먼저 0.4 N 보레이트 버퍼로 10.2 pH에서 (4 ㎕ 버퍼를 1 ㎕ 샘플에) 완충시킨 후, OPA 및 FMOC (1 ㎕ OPA 및 1 ㎕ FMOC 차례로)와 혼합하였다. 이어서, 분석을 위해 샘플을 주입하였다.
HPLC - FLD 에 의한 아미노산 잔기의 분석
유도체화된 아미노산 잔기를 40℃ 2원 (binary) 용출 구배를 이용하여 150 x 3.0 mm 5 ㎛ C18(2) 역상 컬럼 상에서 분해하였다. 수성상 (용출매 A)은 40 mM 인산나트륨 버퍼 (7.8 pH)로 이루어지고, 유기상 (용출매 B)은 아세토니트릴:메탄올:물 (45:45:10 v/v/v)로 이루어졌다. 용매 구배 시스템은 0-1.9 min A/B (%) 100:0; 1.9-18.1 min A/B (%) 43:57; 18.1-18.6 min A/B (%) 0:100; 18.6-22.3 min A/B (%) 0:100; 22.3-23.2 min A/B (%) 100:0; 23.2-26 A/B (%) 100:0이었다. 유동은 일정한 2 ml/분이었다.
형광 검출기 파라미터는 처음 15분의 분석을 위해 340 nm에서 여기 및 450 nm에서 방출로 설정하였다. 이어서, 검출기를 나머지 분석 시간을 위해 266 nm 여기 및 305 nm 방출로 전환시켰다. 처음 15분의 분석은 OPA 유도체 잔기의 검출을 위해 최적화되고, 나머지 분석은 FMOC 유도체 잔기에 대해 최적화된다.
아미노산 잔기의 확인 및 정량은 90.9 pmol/㎕ 노르발린 내부 표준물을 함유하는 아미노산 표준 혼합물 (애길런트 테크놀로지스 (Agilent Technologies)로부터 구입함)을 사용하여 교정하였다. 정량된 잔기는 아스파르트산, 글루탐산, 세린, 히스티딘, 글라이신, 트레오닌, 아르기닌, 알라닌, 티로신, 발린, 메티오닌, 페닐알라닌, 이소류신, 류신, 라이신 및 프롤린이었다. 각각의 잔기의 회복된 질량을 계산하고, 함께 합하여 총 근사 단백질 질량을 제공한 후, 각각의 아라비돕시스 종자 샘플에 대한 % 단백질로 계산하였다.
실시예 5: 신선한 아라비돕시스에 대한 총 전분 분석
신선한 아라비돕시스 잎을 막자사발과 막자를 사용하여 조직을 연마함으로써 액체 질소 하에 매우 미세한 분말로 연마하였다. 샘플을 전분 분석 전에 80% 에탄올에 의해 탈당시켰다. 전분의 소화는 각각 α-아밀라제 및 아밀로글루코시다제를 사용하여 수행하였다. 방출된 글루코스는 글루코스 옥시다제- 및 퍼옥시다제-기반 효소 분석에 의해 검출하였다. 전분 함량은 유리 글루코스를 전분으로 조정하여 방출된 글루코스에 기초하여 계산하였다.
실시예 6: LC/MSMS 대사체 분석
아라비돕시스 잎 조직을 액체 질소 하에 막자사발과 막자로 손으로 연마하여 매우 미세한 분말 샘플을 얻었다. 약 100 mg의 미세하게 연마된 잎 조직을 80:20의 메탄올:0.1N HCl 용액으로 추출하고 잘 혼합하여 350 mg/mL 추출물을 얻었다. 샘플을 원심분리하여 펠렛 입자를 얻고, 추출된 대사체를 함유하는 상등액의 분취액을 제거하고, 내부 표준물로서 글루코스의 안정한 동위원소를 함유하는 80:20 아세토니트릴:물로 1:10으로 희석하고, 직렬 질량 분광 검출을 갖는 액체 크로마토그래피 (LC-MS/MS)로 분석하였다.
LC-MS/MS는 복잡한 생물학적 매트릭스, 예를 들어 종자 조직 추출물 내의 1차 및 2차 대사체의 정량적 분석에 적합한 선택도 및 감도를 제공한다. 관심 있는 화합물의 이온화/반응을 억제할 수 있는 매트릭스 성분으로부터 관심 있는 화합물을 분리하기 위해, MS/MS 정량 전에 액체 크로마토그래피 분리가 바람직하다. 분석물을 이온화하기 위해 양성 (+) 또는 음성 (-) 전기분무 이온화 (ESI) 및 +/- 대기압 화학 이온화 (APCI)를 비롯한 몇몇 기술이 이용가능하다. 화합물의 MS/MS 분석은 본질적으로 다음과 같은 4-단계 공정이다: 1) 관심 있는 화합물에 특이적인 분자 이온의 형성; 2) 분자 이온의 선택; 3) 화합물 특이적 단편 이온의 형성; 4) 화합물 특이적 단편 이온의 검출. LC 컬럼으로부터의 용출액을 4-단계 공정을 밀리초의 시간틀에서 연속하여 수행하는 MS 내로 도입한다.
본 연구에서 LC-MS/MS 분석은 TurboIon™ Spray 도입구가 장치된 어플라이드 바이오시스템즈 (Applied Biosystems) Sciex™ 3000 삼중 사중극자 (quadrapole) 직렬 질량 분광기에 인터페이싱된 애길런트 1100 액체 크로마토그래프 상에서 수행하였다. 종자 조직 추출물의 LC-MS/MS 분석 전에, 개별적인 2차 대사체의 표준물 (~10 ㎍/mL)을 다음 파라미터를 확립하기 위해 질량 분광기 내로 주입하였다 (10 ㎕/분):
Q1 - +/- 분자 이온의 m/z
DP - 분자 이온의 최대 형성을 위한 탈클러스터링 (declustering) 포텐셜 (potential)
Q3 - 분자 이온으로부터 생성된 생성물 이온의 m/z
CE - 생성물 이온의 최대 형성을 위한 충돌 에너지
CXP - 셀 출구 포텐셜.
본 연구에서 모니터링된 아라비돕시스 대사체는 하기 표 3에 제시된 바와 같이 음성 방식 ESI, Q1을 이용하여 예상된 [M-H]- 분자 이온을 형성하는 것으로 밝혀졌다. 각각의 대사체의 정량을 위해 사용된 단편 이온을 아래 표에 나열한다, Q3. 다음 표는 각각의 대사체를 정량하기 위해 사용된 MSMS 파라미터를 제시한다 (G1P = 글루코스-1-포스페이트, G6P = 글루코스-6-포스페이트, ADP-g = 아데노신 디포스페이트-글루코스, GDP-g = 구아노신 5'-디포스페이트-글루코스, UDP-g = 우리딘 5'-디포스페이트-글루코스).
Figure pct00004
관심 있는 아라비돕시스 대사체의 높은 극성 때문에, HILIC 상 액체 크로마토그래피 컬럼 (TSKgel 아미드 (Amide) 80, 토소 바이오사이언시즈 엘엘씨 (TOSOH Biosciences LLC), 100x2 mm, 5 μM)을 분리를 위해 사용하였다. 0:100의 HPLC 물:아세토니트릴에서 출발하여 100:0의 물:아세토니트릴에 이르는 선형 구배를 500 ㎕/분의 유속으로 4분에 걸쳐 사용하였다. 화합물 이온화를 향상시키기 위해, 물을 10 mM 아세트산암모늄으로 완충시켰다.
정량은 각각의 추출물에 대한 선 회귀 분석을 사용하고 각각의 표적화된 대사체에 대한 교정 곡선을 생성함으로써 달성하였다. 추출물에서 발견된 농도에 희석 배율 (10)을 곱하여 샘플 내의 총 nmol g-1 농도를 얻었다. 제시된 모든 데이타는 6개의 복제물 (3개의 분석 복제물 및 2개의 온실 복제물)의 평균이다.
실시예 7: 아라비돕시스 형질전환을 위한 SnRK2-6 발현 벡터의 제작
아라비돕시스 SnRK2-6 유전자를 증폭시키기 위해, 아라비돕시스 잎으로부터 단리한 총 RNA (900 ng)를, 프라이머 (인비트로겐 (Invitrogen) SuperScriptIII RT 키트)로서 올리고 (Oligo) dT20을 사용하는 단일 가닥 cDNA 합성을 위해 사용하였다. sscDNA를 둘 모두 Nco I 부위 (밑줄침)를 포함하는 다음 프라이머 쌍을 사용하여 추가로 증폭하였다: 5'-TAA TTT CCA TGG ATC GAC CAG CAG TGA GT-3' 및 5'-TTT TTT CCA TGG ATC ACA TTG CGT ACA CAA TCT CT-3'. 이어서, 증폭된 SnRK2-6 유전자를 Nco I로 소화시키고, 게이트웨이 도입 (entry) 벡터 pDAB3731 내로 삽입하였다. 삽입체 배향은 서열결정에 의해 결정하였다. CsVMV, SnRK2-6 및 AtuORF24 3'-UTR을 포함하는 생성되는 식물 전사 단위 (PTU)를 게이트웨이 LR 반응을 이용하여 2원 게이트웨이 목적 (destination) 벡터 pDAB3725 내로 클로닝하였다. 생성되는 플라스미드 (pDAB4504로 지명됨) (도 11)를 아그로박테리움 (Agrobacterium) 형질전환을 위해 사용하였다.
실시예 8: SnRK2-6에 대한 식물-최적화된 합성 코딩 영역
아라비돕시스 탈리아나 SnRK2-6 유전자의 합성 버전의 코딩 서열은 트랜스제닉 쌍자엽 식물 및 단자엽 (예를 들어, 옥수수) 식물에서 SnRK2-6 단백질의 생산이 가능하도록 설계되었다. 출발 염기 서열은 서열 2에 개시된 단백질 서열을 코딩하는, 서열 1에 개시된 단백질 코딩 영역을 포함하는 젠뱅크 (Genbank) 기탁 번호 At4g33950이었다.
SnRK2-6 단백질을 코딩하는 식물-최적화된 DNA 서열을 제공하기 위해, DNA 서열은 특정 숙주 식물 (옥수수 및 쌍자엽 식물)에서 발견되는 유전자의 단백질 코딩 서열로부터 편집된 코돈 편향 (bias) 표로부터 확립된 중복성 유전자 코드를 이용하여, 단백질의 아미노산 서열을 코딩하도록 설계되었다. 706개 옥수수 유전자 (제아 메이즈)의 단백질 코딩 영역은 젠뱅크로부터 추출하였고, 이는 유에스 내셔널 라이브러리 오브 메디신 (U.S. National Library of Medicine)의 내셔날 센터 포 바이오테크놀로지 인포메이션 (National Center for Biotechnology Information) (미국 메릴랜드주 베데스다)로부터 이용가능하고, 코돈 조성은 유니버시티 오브 위스콘신 (University of Wisconsin)의 제네틱스 컴퓨터 그룹 (Genetics Computer Group) (미국 위스콘신주 매디슨)으로부터 이용가능한 위스콘신 서열 분석 패키지 (Wisconsin Sequence Analysis Package)의 코돈빈도 함수 (CodonFrequency function)를 사용하여 계산하였다. 담배 (니코티아나 타바쿰 (Nicotiana tabacum); 453,797 코돈), 면 (고시퓸 히르수툼 (Gossypium hirsutum); 62,111 코돈), 대두 (글라이신 맥스 (Glycine max)); 362,096 코돈), 및 캐놀라 (브라시카 나푸스 (Brassica napus); 195,005 코돈)에 대한 코돈 사용 빈도 표는 카주사 디엔에이 리써치 인스티튜트 (Kazusa DNA Research Institute, 일본)로부터 입수할 수 있다.
[표 4A]
Figure pct00005
[표 4B]
Figure pct00006
옥수수 유전자에 대한 천연 유전자 코돈 사용 빈도를 표 4A 및 4B, 컬럼 E에 제시하고, 쌍자엽 식물 유전자에 대한 빈도를 표 4A 및 4B, 컬럼 G-J에 제시한다. 컬럼 E 및 G-J의 값은 각각의 아미노산에 대한 동의 (synonymous) 코돈의 분포 (그 아미노산에 대한 모든 코돈에 대한 사용 빈도의 %)를 나타낸다. 각각의 식물 종류에 가장 바람직한 코돈은 굵은 폰트로 나타내고, 다수 선택이 존재할 때 제2, 제3 또는 제4 등등의 선택 코돈이 확인될 수 있다. 일부 아미노산에 대한 일부 동의 코돈은 쌍자엽 식물 유전자에서 단지 드물게 발견됨이 분명하다 (예를 들어, CGG 및 TCG). 또한, 일부 쌍자엽 식물은 특정 아미노산에 대한 코돈 선호가 다소 상이하다 (예를 들어, 아스파라긴 및 페닐알라닌 코돈). 또한, 일부 아미노산에 대한 일부 동의 코돈이 식물 단백질 코딩 영역에서 단지 드물게 발견됨이 분명하다 (예를 들어, CGA 및 CTA). 추가로, 옥수수 및 쌍자엽 식물은 코돈 사용 빈도가 상이하다 (예를 들어, 알라닌 코돈 GCC는 쌍자엽 식물 유전자보다 옥수수 유전자에서 더 자주 발생하는 반면에, 알라닌 코돈 GCT는 옥수수 유전자보다 쌍자엽 식물 유전자에서 더 자주 사용된다). 따라서, 하나의 식물군의 유전자의 최적 코돈 조성을 반영하도록 설계된 단백질 코딩 영역은 또 다른 식물군에서 발현을 위한 최적 미만의 코돈 조성을 가질 수 있음이 명백하다. 옥수수 및 쌍자엽 식물에 공통적인 가장 고도로 사용된 코돈을 포함하는 편향 코돈 설정을 유도하기 위해, 각각의 코돈에 대한 평균을 표 4A 및 4B의 컬럼 F에 제시된 쌍자엽 식물 데이타세트에 대해 계산하였다.
옥수수 및 쌍자엽 식물 유전자에서 각각의 코돈에 대한 평균 % 분포 값을 표 4A 및 4B, 컬럼 E 및 F의 데이타로부터 계산하고, 표 4A 및 4B, 컬럼 D에 식물 평균으로서 제시한다. 대체로, 드물게 사용되는 것으로 간주되는 코돈의 % 사용 빈도 값 (즉, 옥수수 또는 쌍자엽 식물의 유전자에서 관련 아미노산을 코딩하기 위해 시간의 약 10% 또는 그 미만으로 나타냄)은 분석에 포함시키지 않았다. 이들 코돈 값은 표 4A 및 4B, 컬럼 D에 DNU (사용하지 않음)로 표시한다. 이 경우에, 개별적인 아미노산에 대한 총 % 코돈 사용 빈도 값은 표 4A 및 4B, 컬럼 D에서 총합이 100%가 아니다.
이들 아미노산에 대한 나머지 코돈 선택의 분포를 균형 잡기 위해, 각각의 코돈에 대한 가중 평균 % 표현을 다음 식을 이용하여 계산하였다:
C1의 가중 평균 % = 1/(%C1 + %C2 + %C3 + 등) x %C1 x 100,
여기서, C1은 해당 코돈이고, %C2, %C3 등은 표 4A 및 4B의 컬럼 D에 제시된 바와 같이 나머지 동의 코돈에 대한 식물 평균 % 값을 나타낸다.
옥수수 및 쌍자엽 식물 유전자에 대해 계산된 코돈의 식물 가중 평균 % 분포를 표 4A 및 4B, 컬럼 C에 제시한다. 따라서, 컬럼 C의 % 분포값과 함께 컬럼 B의 코돈 동일성은 옥수수, 면, 캐놀라, 담배 및 대두의 유전자로부터 계산된 식물-최적화된 코돈 편향 표를 포함한다. 식물-최적화된 유전자는 표 4A 및 4B, 컬럼 C의 코돈 분포에 유사한 전체 코돈 분포를 갖는 것으로 결정될 것이다.
SnRK2-6 단백질을 코딩하는 식물-최적화된 서열을 조작하기 위해, 쌍자엽 식물 및 옥수수의 단백질 코딩 서열로부터 편집된 중복성 식물 최적화된 코돈 편향 표를 이용하여 DNA 서열을 단백질의 아미노산 서열을 코딩하도록 설계하였다. 천연 SnRK2-6 DNA 서열 (서열 1)을 SnRK2-6 단백질의 추정 아미노산 서열 (서열 2)로 번역한 후, 단백질 서열을 오시뭄 바이오솔루션스 (Ocimum Biosolutions, 미국 인디애나주 인디애나폴리스)로부터 상업상 이용가능한 OptGene™ 프로그램을 사용하여 식물-최적화된 DNA 서열로 역-번역하였다. 바람직하지 않은 제한 효소 인식 부위, 잠재적인 식물 인트론 스플라이스 부위, A/T 또는 C/G 잔기의 긴 런 (run), 및 RNA 안정성, 식물 세포 내에서 코딩 영역의 전사 또는 번역을 저해할 수도 있는 다른 모티프를 제거하기 위해 서열의 추가의 개량이 이루어졌다. 목적하는 제한 효소 인식 부위를 도입하기 위해 및 긴 내부 개방 해독 프레임 (+1 이외의 다른 프레임) 및 현저하게 안정한 스템루프 (stemloop) 구조를 제거하기 위해 다른 변화가 이루어졌다. 이들 변화는 모두 상기 설명된 바와 같이 식물-최적화된 편향 코돈 조성을 보유하는 제약 내에서 이루어졌다. SnRK2-6 단백질을 코딩하는 식물-최적화된 서열은 SnRK2-6 hv5로 지명되고, 서열은 서열 2를 코딩하는, 서열 3으로서 개시된다.
표 5는 식물-최적화된 SnRK2-6 hv5 코딩 영역의 코돈 조성을 식물-최적화된 코돈 편향 표와 비교하고, 따라서 최적화 과정의 결과를 보여준다.
Figure pct00007
Figure pct00008
설계를 완료하기 위해, 3개의 모든 상부 가닥 해독 프레임 내에 번역 중지 코돈을 함유하고 Bbs I 제한 효소에 대한 인식 서열로 개시되는 5' 비번역 서열을 SnRK2-6 hv5 서열의 5' 단부에 첨가하였다. 추가로, 6개의 모든 개방 해독 프레임 내에 번역 중지 코돈을 함유하고 Sac I 제한 효소에 대한 인식 서열로 종결되는 3' 비번역 서열을 SnRK2-6 hv5 서열의 3' 단부에 첨가하였다. SnRK2-6 hv6으로 불리는 상기 서열을 서열 4로서 개시한다. SnRK2-6 hv6 설계된 서열의 합성은 피코스크립트 (PicoScript, 텍사스주 휴스턴)에서 계약에 의해 수행되었다.
실시예 9: 옥수수 형질전환을 위한 SnRK2-6 발현 벡터의 제작
옥수수에서 SnRK2-6 유전자를 이종성으로 발현하기 위해, 그의 개방 해독 프레임 서열은 헤미코트 (hemicot) 코돈 사용 빈도에 따라 코돈 최적화되고, 따라서 SnRK2-6 hv로 지명된다. 추가로, "3-프레임 정지" 및 "옥수수 컨센서스"에 대응하는 뉴클레오티드 서열을 SnRK2-6 hv 유전자의 5'-말단에 도입하고, "6-프레임 정지"를 그의 3'-말단에 도입하였다. 후속적인 클로닝을 용이하게 하기 위해, 2개의 제한 부위, 즉 Bbs I 및 Sac I을 서열의 5'- 및 3'-말단에 부가하였다. 이어서, 전체 서열을 아래에 보다 상세하게 설명하는 바와 같이 합성하였다.
Bbs I 및 Sac I로 소화된 상기 합성된 단편을 Acc65 I- 및 Sac I-소화된 pDAB4005 내로 삽입하였다. 이에 의해 옥수수 Ubi1 프로모터, SnRK2-6 hv 및 ZmPer5 3'UTR을 함유하는 식물 전사 단위 (PTU)가 생성되었다. PTU를 Not I을 사용한 소화를 통해 재조합 pDAB4005로부터 절제하고, 목적 벡터 pDAB3878 내로 삽입하였다. 도 12에 제시된 생성되는 플라스미드 (pDAB7702로 지명됨)의 배향 및 통합성은 서열결정에 의해 결정하였다.
실시예 10: 아그로박테리움 및 아라비돕시스 형질전환
형질전환을 문헌 [Weigel and Glazebrook (2002)]에 설명된 바와 같이 수행하였다.
아라비돕시스 탈리아나 성장 조건
새로 수확한 종자를 건조제의 존재 하에 7일 동안 실온에서 건조하였다. 종자를 시그마 케미컬 컴퍼니 (Sigma Chemical Co., 미국 미주리주 세인트루이스)로부터 상업상 이용가능한 0.1% 아가로스 용액 내에 현탁하였다. 현탁된 종자를 휴면 요건을 충족시키고 동시에 일어나는 종자 발아 (층화 (stratification))를 보장하기 위해 4℃에서 2일 동안 저장하였다.
선 그로 호르티컬쳐 인크. (Sun Gro Horticulture Inc., 미국 워싱턴주 벨레뷰)로부터 상업상 이용가능한 선샤인 믹스 (Sunshine Mix) LP5를 미세 질석으로 덮고, 젖을 때까지 호아글란 (Hoaglan) 용액으로 저면-관수하였다. 토양 혼합물을 24시간 동안 배수시켰다. 층화된 종자를 질석 위에 뿌리고, 5 내지 7일 동안 KORD 포르덕츠 (KORD Products, 캐나다 온타리오주 브라말레아)로부터 상업상 이용가능한 것과 같은 습도 유지용 돔 (humidity dome)으로 덮었다.
종자를 발아시키고, 식물을 컨트롤드 인바이런먼츠 리미티드 (Controlled Environments Limited, 캐나다 마니토바주 위니페그)로부터 상업상 이용가능한 콘비론 (Conviron) (모델 CMP4030 및 CMP3244) 내에서 약 22℃의 일정한 온도 및 약 40% 내지 약 50% 범위의 습도 하에 약 120 μmol/m2sec 내지 약 150 μmol/m2sec의 광 강도에서 긴 일광 조건 (16시간 명/8시간 암) 하에 성장시켰다. 식물에 초기에는 호아글란 용액을 급수하고, 후속적으로 토양을 습기가 있지만 젖지 않도록 DI 물을 급수하였다.
아그로박테리움 형질전환
전기-반응능 (electro-competent) 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) (균주 Z707S) 세포를 문헌 [Weigel and Glazebrook (2002)]의 프로토콜을 사용하여 제조하였다. 반응능 아그로박테리움 세포를 문헌 [Weigel and Glazebrook (2002)]으로부터 변경된 전기천공 방법을 이용하여 형질전환시켰다. 50 ㎕의 반응능 아그로박테리움 세포를 얼음 상에서 해동시키고, 약 10 ng 내지 약 25 ng의 플라스미드 pDAB4504를 세포에 첨가하였다. DNA 및 세포 혼합물을 예비-냉각 2 mm 전기천공 큐벳에 도입하였다. 에펜도르프 아게 (Eppendorf AG, 독일 함부르크)로부터 상업상 이용가능한 에펜도르프 전기천공기 2510을 다음 설정에서 형질전환을 위해 사용하였다: 전압: 2.4 kV, 펄스 길이: 5 msec. 전기천공 후에, 1 ml의 YEP 브로쓰 (broth)를 큐벳에 첨가하고, 세포-YEP 현탁액을 15 ml 배양 튜브에 옮겼다. 세포를 4시간 동안 일정하게 교반하면서 수조 내에서 28℃에서 인큐베이팅하였다. 인큐베이션 후에, 배양액을 시그마 케미컬 컴퍼니 (미국 미주리주 세인트루이스)로부터 상업상 이용가능한, 스펙티노마이신 (100 mg/L) 및 스트렙토마이신 (250 mg/L)을 함유하는 YEP + 한천 상에 플레이팅하였다. 플레이트를 2-4일 동안 28℃에서 인큐베이팅하였다. 콜로니를 선택하고, 스펙티노마이신 (100 mg/L) 및 스트렙토마이신 (250 mg/L) 함유하는 신선한 YEP + 한천 플레이트 상에 도말하고, 약 28℃에서 1 내지 3일 동안 인큐베이팅하였다. 콜로니를 벡터 특이적 제한 소화 효소를 사용하여 유전자 삽입체의 존재를 확인하는 제한 소화 분석을 위해 선택하였다. 선택된 아그로박테리움 콜로니로부터 플라스미드 DNA를 정제하기 위해 제조자의 지시에 따라 수행된 퀴아젠 (Qiagen) 고속 맥시 프렙스 (High Speed Maxi Preps)를 사용하였다. 아그로박테리움 형질전환에 사용된 이원성 벡터로부터의 플라스미드 DNA가 대조군으로서 포함되었다. 4개의 별개의 소화 반응을 0.5 - 1 ㎍의 DNA를 사용하여 실행하였다. 반응을 약 4시간 내지 약 5시간 동안 실행한 후, 0.65% 아가로스 겔 전기영동에 의해 분석하고, 에티듐 브로마이드 염색에 의해 시각화하였다. 모든 효소에 대한 그의 소화가 플라스미드 대조군과 동일한 콜로니를 선택하였다.
아라비돕시스 형질전환
아라비돕시스는 화아 침지 (floral dip) 방법을 사용하여 형질전환시켰다. 선택된 콜로니를 사용하여 스펙티노마이신 (100 mg/L) 및 스트렙토마이신 (250 mg/L)을 함유하는 YEP 브로쓰의 하나 이상의 15 mL 예비-배양액을 접종하였다. 배양액(들)을 220 rpm에서 일정하게 교반하면서 약 28℃에서 철야 인큐베이팅하였다. 각각의 예비-배양액을 사용하여 스펙티노마이신 (100 mg/L) 및 스트렙토마이신 (250 mg/L)을 함유하는 YEP 브로쓰의 2개의 500 ml 배양액을 접종하고, 배양액을 일정하게 교반하면서 약 28℃에서 철야 인큐베이팅하였다. 이어서, 세포를 실온 (즉, 약 24℃)에서 약 10분 동안 약 8700x g에서 펠렛화하고, 생성되는 상등액을 폐기하였다. 세포 펠렛을 다음 성분을 함유하는 500 mL 침윤 배지 내에 부드럽게 재현탁시켰다: 1/2x 무라시게 (Murashige) 및 스쿡 (Skoog) 염 및 갬보르그 (Gamborg) B5 비타민, 10% (w/v) 수크로스, 0.044 μM 벤질아미노 퓨린 (DMSO 중의 1 mg/ml 원액의 10 ㎕/리터) 및 300 ㎕/리터 SILWET L-77 (헬레나 케미칼 컴퍼니 (Helena Chemical Company, 미국 테네시주 콜리어빌)로부터 상업상 이용가능함). 약 5주령의 식물을 가장 최근에 핀 꽃이 잠기도록 약 15초 동안 배지 내로 침지시켰다. 이어서, 식물을 측면으로 눕히고 약 24시간 동안 덮은 (투명 또는 불투명) 후, 물로 세척하고 직립시켰다. 식물을 16-시간 명/8-시간 암 광주기에서 약 22℃에서 성장시켰다. 침지의 약 4주 후에, 종자를 수확하였다.
형질전환된 식물의 선택
T1 종자를 티.오. 플라스틱스 인크. (T.O. Plastics Inc., 미국 미네소타주 클린워터)로부터 상업상 이용가능한 10.5" x 21" 발아 트레이 (tray) 상에 뿌리고, 개략한 조건 하에 성장시켰다. 파종의 5 내지 6일 후에 돔을 제거하였다. 파종 5일 후에 및 다시 파종 10일 후에, 묘목에 적용 당 280 g/ha 글루포시네이트의 유효 속도를 전달하기 위해 데빌비스 (DeVilbiss) 압축 공기 분무 팁 (tip) (미국 일리노이주 글렌데일 하이츠)을 사용하여 글루포시네이트 제초제 (바이엘 크랍사이언스 (Bayer Cropscience)로부터 상업상 이용가능함)의 0.20% 용액 (20 ㎕/10 mL 탈이온수)을 약 10 ml/트레이 (703 L/ha)의 분무 부피로 분무하였다. 제조하기 위한 리버티 (Liberty)의 양은 다음과 같이 계산하였다: (703 L/ha 분무 부피 = 280 GPA). (280 g ai/ha) x (1 ha/703L) x (1 L/200 g ai 글루포시네이트) = 0.20% 용액 (즉, 20 ㎕/10 ml). 10 mL의 용액을 분무할 각각의 트레이에 대해 20 mL 섬광 바이알 내로 피펫팅하였다. 분무는 수평 및 수직 도포 패턴으로 전달하였다. 각각의 분무 후에, 제초제 명칭, 도포 속도 및 도포 일자를 기록한 분무 표지를 각각의 선택 트레이에 첨가하였다. 제2 분무의 4 내지 7일 후에, 제초제 저항성 식물을 확인하고, 선샤인 믹스 LP5로 준비한 화분 내로 이식하였다. 이식한 식물을 상기 언급된 성장 조건의 콘비론에 넣었다.
실시예 11: 초이원성 (superbinary) 벡터를 위한 아그로박테리움 형질전환
형질전환을 준비하기 위해, 2개의 상이한 이. 콜라이 (E. coli) 균주 (pSB11 전구체 {본 경우에 pDAB7702 또는 pDAB3878} 및 pRK2013을 함유하는 DH5α)를 37℃에서 철야 성장시켰다. DH5α 균주를 LB (500 ml 탈이온수 중의 5 g 박토 (Bacto) 트립톤, 2.5 g 박토 효모 추출물, 5 g NaCl, 7.5 g 한천) + 스펙티노마이신 (100 ㎍/ml)을 담은 페트리 플레이트 상에서 성장시키고, pRK2013 균주를 LB + 카나마이신 (50 ㎍/ml)을 담은 페트리 플레이트 상에서 성장시켰다. 인큐베이션 후에, 아그로박테리움을 이용할 수 있을 때까지 플레이트를 약 4℃에서 유지시켰다.
pSB1을 함유하는 아그로박테리움 균주 LBA4404 (재팬 토바코)를 스트렙토마이신 (250 ㎍/ml) 및 테트라사이클린 (10 ㎍/ml)과 함께 AB 배지 (900 ml 탈이온수 중의 5 g 글루코스, 15 g 한천)를 함유하는 페트리 플레이트 상에서 28℃에서 3일 동안 성장시켰다. 아그로박테리움이 준비된 후에, 항생제가 존재하지 않는 LB 플레이트 상에서 각각의 세균의 하나의 접종 루프 (pDAB7702 또는 pDAB3878, pRK2013, 및 LBA4404+pSB1)를 혼합함으로써 형질전환 플레이트를 준비하였다. 상기 플레이트를 28℃에서 철야 인큐베이팅하였다. 인큐베이션 후에, 1 ml의 0.9% NaCl (500 ml 탈이온수 중의 4.5 g NaCl) 용액을 메이팅 (mating) 플레이트에 첨가하고, 세포를 용액 내로 혼합하였다. 이어서, 혼합물을 표지된 멸균 튜브, 예를 들어 벡톤 디킨슨 앤드 컴퍼니 (Becton Dickinson and Co., 미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스)로부터 상업상 이용가능한 팔콘 (Falcon) 2059으로 옮겼다.
1 ml의 0.9% NaCl을 플레이트에 첨가하고, 나머지 세포를 용액 내로 혼합하였다. 이어서, 상기 혼합물을 상기와 동일한 표지된 튜브로 옮겼다. 100 ㎕의 세균 "원액" 용액을 표지된 팔콘 2059 튜브에 넣은 후, 900 ㎕의 0.9% NaCl을 첨가함으로써 101-104 범위의 세균 세포의 연속 희석액을 만들었다. 이어서, 선택을 보장하기 위해, 100 ㎕의 희석액을 별개의 AB + 스펙티노마이신 (100 ㎍/ml)/스트렙토마이신 (250 ㎍/ml)/테트라사이클린 (10 ㎍/ml) 상에 플레이팅하고 28℃에서 4일 동안 인큐베이팅하였다. 이어서, 콜로니를 AB + Spec/Strep/Tet 플레이트 및 락토스 배지 (500 ml DI H2O 중의 0.5 g 효모 추출물, 5 g D-락토스 일수화물, 7.5 g 한천) 플레이트 상에 "패치 (patch)"한 후 28℃에서 2일 동안 인큐베이터에 두었다. 플레이트를 베네딕트 (Benedict) 용액 (500 ml의 탈이온수 중의 86.5 g 시트르산나트륨 일염기성, 50 g Na2CO3, 9 g CuSO4-5 물)으로 넘치게 하고 아그로박테리움 콜로니가 황색으로 변하도록 함으로써, 락토스 배지 상의 콜로니에 대해 케토-락토스 시험을 수행하였다. 이어서, 황색 (아그로박테리움에 대해 양성)인 임의의 콜로니를 패치 플레이트로부터 집어서 단일 콜로니 단리를 위해 28℃에서 2일 동안 AB + Spec/Strep/Tet 플레이트 상에 도말하였다. 플레이트마다 1개의 콜로니를 AB + Spec/Strep/Tet 배지 상에서 제2 라운드의 단일 콜로니 단리를 위해 집었고, 총 3 라운드의 단일 콜로니 단리를 위해 이를 반복하였다. 단리 후에, 플레이트마다 1개의 콜로니를 집고 이를 사용하여 스펙티노마이신 (100 ㎍/ml), 스트렙토마이신 (250 ㎍/ml) 및 테트라사이클린 (10 ㎍/ml)을 함유하는 별개의 3 ml YEP (500 ml 탈이온수 중의 5 g 효모 추출물, 5 g 펩톤, 2.5 g NaCl) 액체 배양액에 접종하였다. 이어서, 이들 액체 배양액을 200 rpm에서 드럼 (drum) 인큐베이터 내에서 28℃에서 철야 성장시켰다.
이어서, 2 ml의 접종 배양액을 75 ml의 YEP + Spec/Strep/Tet을 담은 250 ml 일회용 플라스크에 옮김으로써 확인 배양을 시작하였다. 이어서, 이들을 200 rpm에서 진탕하면서 28℃에서 철야 성장시켰다. 이어서, 퀴아젠® 프로토콜에 따라, 퀴아젠 (미국 캘리포니아주 발렌시아)로부터 상업상 이용가능한 고속 맥시 프렙스를 세균 배양액에 대해 수행하여 플라스미드 DNA를 생산하였다. 이어서, 500 ㎕의 용출된 DNA를 2개의 깨끗한 표지된 1.5 ml 튜브에 옮기고, 엣지 바이오시스템즈 (Edge BioSystems, 미국 메릴랜드주 게이터스버그)로부터 상업상 이용가능한 Quick-Precip Plus® 프로토콜을 수행하였다. 침전 후에, DNA를 10 mM 트리스 (Tris) HCl (pH 8.0) 및 1 mM 에틸렌 디아민 테트라아세트산 (EDTA)의 혼합물을 포함하는 100 ㎕ TE의 총 부피 내에 재현탁시켰다. 5 ㎕의 플라스미드 DNA를 인비트로겐 (미국 캘리포니아주 칼스바드)으로부터 상업상 이용가능한 50 ㎕의 화학적 반응능 DH5α 이. 콜라이 세포에 첨가하여 부드럽게 혼합하였다.
이어서, 상기 혼합물을 냉각하고 표지한 팔콘 2059 튜브에 옮겼다. 반응물을 얼음 상에서 약 30분 동안 인큐베이팅한 후, 온도를 약 45초 동안 약 42℃로 증가시킴으로써 "열 쇼크 (heat shock)" 처리하였다. 반응물을 약 2분 동안 다시 얼음에 넣은 후, 인비트로겐 (미국 캘리포니아주 칼스바드)으로부터 상업상 이용가능한 450 ㎕의 SOC 배지를 튜브에 첨가하였다. 이어서, 반응물을 200 rpm에서 진탕하면서 37℃에서 1시간 동안 인큐베이팅하였다. 이어서, 세포를 LB + Spec/Strep/Tet (50 ㎕ 및 100 ㎕ 사용) 상으로 플레이팅하고 37℃에서 철야 인큐베이팅하였다. 플레이트마다 3 또는 4개의 콜로니를 집어서 스펙티노마이신 (100 ㎍/ml), 스트렙토마이신 (250 ㎍/ml) 및 테트라사이클린 (10 ㎍/ml)을 함유하는 별개의 3 ml LB (500 ml DI H2O 중의 5 g 박토 트립톤, 2.5 g 박토 효모 추출물, 5 g NaCl) 액체 배양액을 접종하기 위해 사용하였다. 이어서, 이들 액체 배양액을 200 rpm에서 드럼 인큐베이터 내에서 37℃에서 철야 성장시켰다. 이어서, 퀴아젠® 프로토콜에 따라, 미니-프렙스 (mini-preps) (퀴아젠, 미국 캘리포니아주 발렌시아)를 세균 배양액에 대해 수행하여 플라스미드 DNA를 생산하였다. 이어서, 5 ㎕의 플라스미드 DNA를 별개의 반응물에서 HindIII 및 SalI 효소 (뉴 잉글랜드 바이오랩스 (New England Biolabs, 미국 매사추세츠주 베벌리))를 사용하여 37℃에서 1시간 동안 소화시킨 후, 1% 아가로스 (캄브렉스 바이오 사이언스 록랜드, 인크. (Cambrex Bio science Rockland, Inc., 미국 메인주 록랜드)) 겔 상에서 전개시켰다. 이어서, 정확한 밴딩 패턴을 보인 배양액을 사용하여, 500 ㎕의 배양액을 500 ㎕의 멸균 글리세롤 (시그마 케미컬 컴퍼니; 미국 미주리주 세인트루이스)에 첨가하고 및 뒤집어 혼합함으로써 글리세롤 원액을 생성하였다. 이어서, 혼합물을 드라이 아이스 상에서 동결시키고 필요시까지 -80℃에서 보관하였다.
실시예 12: 옥수수의 아그로박테리움-매개된 형질전환
식물 물질
High II F1 교잡종 (Armstrong et al., 1991)으로부터의 종자를 95% Metro-Mix 360 무토양 성장 배지 (선 그로 호르티컬쳐, 미국 워싱턴주 벨레뷰) 및 5% 점토/찰흙 토양의 혼합물이 담긴 5-갤론 (19-리터) 화분에 심었다. 식물을 16:8시간 광주기의 고압 나트륨 및 금속 할라이드 램프의 조합을 이용하여 온실에서 성장시켰다. 형질전환을 위한 미성숙 F2 배아를 얻기 위해, 제어된 형매 (sib)-수분을 수행하였다. 미성숙 배아를 배아의 크기가 약 1.0 내지 2.0 mm일 때 수분의 8 내지 10일 후에 단리하였다.
감염 및 동시배양
옥수수 알맹이 (ear)를 액체 비누로 문지르고, 2분 동안 70% 에탄올에 담근 다음, 30분 동안 20% 시판 표백제 (0.1% 차아염소산나트륨)에 담근 후 멸균수로 세정함으로써 표면 멸균하였다. 아그로박테리움 현탁액은 100 mg/L 스펙티노마이신, 10 mg/L 테트라사이클린 및 250 mg/L 스트렙토마이신을 함유하는 YEP 배지 (40 g/L 펩톤, 40 g/L 효모 추출물, 20 g/L NaCl, 15 g/L 박토 한천) 상에서 28℃에서 2 내지 3일 동안 성장시킨 세균의 1 내지 2개의 루프를 100 μM 아세토시링곤을 함유하는 5 mL의 액체 감염 배지 (LS 기초 배지 (Linsmaier and Skoog, 1965), N6 비타민 (Chu et al., 1965), 1.5 mg/L 2,4-D, 68.5 g/L 수크로스, 36.0 g/L 글루코스, 6 mM L-프롤린, pH 5.2)에 옮김으로써 제조하였다. 균일한 현탁액이 얻어질 때까지 용액을 볼텍싱하고, 농도를 자줏빛 필터가 구비된 클렛-서머슨 (Klett-Summerson) 비색계를 사용하여 200 클렛 (Klett) 단위의 최종 밀도로 조정하였다. 미성숙 배아는 2 ml의 감염 배지가 담긴 미세 원심분리관 내로 직접 단리하였다. 튜브를 3 내지 5초 동안 볼텍싱한 후, 액체 배지를 제거하고 신선한 배지로 교체하고 다시 볼텍싱하였다. 배지를 세 번째에 제거하고, 200 클렛 단위의 밀도의 1 ml의 아그로박테리움 용액으로 교체하였다. 아그로박테리움 및 배아 용액을 30초 동안 최대 속도로 볼텍싱한 다음 5분 동안 실온에서 인큐베이팅한 후, 암 조건 하에 25℃에서 5일 동안 동시-배양 배지 (LS 기초 배지, N6 비타민, 1.5 mg/L 2,4-D, 30.0 g/L 수크로스, 6 mM L-프롤린, 0.85 mg/L AgNO3 1, 100 μM 아세토시링곤, 3.0 g/L 겔란 (Gellan) 검, pH 5.8)로 옮겼다.
동시-배양 후에, 배아를 2-단계 선택 계획을 통해 이동시킨 후, 형질전환된 단리물을 약 8주 과정에 걸쳐 얻었다. 선택을 위해, LS 기반 배지 (LS 기초 배지, N6 비타민, 1.5 mg/L 2,4-D, 0.5 g/L MES, 30.0 g/L 수크로스, 6 mM L-프롤린, 1.0 mg/L AgNO3, 250 mg/L 세포탁심, 2.5 g/L 겔란 검, pH 5.7)를 다중 선택 수준의 R-할록시포프산과 함께 사용하였다. 배아를 100 nM R-할록시포프를 함유하는 선택 배지로 14일 동안 옮긴 후, 배발생 단리물이 얻어질 때까지 격주 간격으로 약 3회 더 500 nM R-할록시포프로 옮겼다. 임의의 회복된 단리물은 재생 및 추가의 분석을 위해 2주 간격으로 신선한 선택 배지로 옮김으로써 부피를 늘렸다.
재생 및 종자 생산
재생을 위해, 배양액을 낮은 명 조건 (14 μEm-2s-1) 하에 1주 동안, 이어서 높은 명 조건 (약 89 μEm-2s-1) 하에 1주 동안 "28" 유도 배지 (MS 염 및 비타민, 30 g/L 수크로스, 5 mg/L 벤질아미노퓨린, 0.25 mg/L 2,4-D, 100 nM R-할록시포프산, 250 mg/L 세포탁심, 2.5 g/L 겔란 검, pH 5.7)로 옮겼다. 조직을 후속적으로 "36" 재생 배지 (식물 성장 조절자가 결여된 것을 제외하고는 유도 배지와 동일함)로 옮겼다. 묘목이 길이 3-5 cm로 성장했을 때 SHGA 배지 (쉥크 (Schenk) 및 힐데브란트 (Hildebrandt) 염 및 비타민 (1972)), 1.0 g/L myo-이노시톨, 10 g/L 수크로스 및 2.0 g/L 겔란 검, pH 5.8)가 담긴 유리 배양 튜브로 옮겨, 싹 및 뿌리의 추가의 성장 및 발달을 허용하였다. 식물을 본원에서 앞서 설명된 것과 동일한 토양 혼합물에 이식하고, 온실에서 개화까지 성장시켰다. 종자 생산을 위한 제어 수분을 수행하였다.
실시예 13: SnRK2-6 트랜스제닉 아라비돕시스의 분자 특성화
SnRK2-6의 전사 단위를 보유하는 트랜스제닉 아라비돕시스 식물을 스크리닝하기 위해, 각각 SnRK2-6의 T-DNA 좌측 경계 및 3-말단 서열에 가까운 서열에 따라 설계된 다음 프라이머의 쌍을 사용하여 PCR을 수행하였다: 5'-TGA GGT CTA CAG GCC AAA TTC GCT CTT AGC-3' 및 5'-ATC ACA TTG CGT ACA CAA TCT CT-3'. T2 트랜스제닉 식물의 유전적 분리는 PAT 인베이더 (invader) 분석 및 제초제 분무를 이용하여 결정하였다. 단일 삽입을 보유하는 것과 아주 비슷하기 때문에 3:1 분리에 일치하는 트랜스제닉 주만을 생화학적 및 생리학적 연구를 위해 선택하였다.
실시예 14: SnRK2-6 hv 트랜스제닉 옥수수의 분자 특성화
SnRK2-6 hv의 전사 단위를 보유하는 트랜스제닉 옥수수 식물을 스크리닝하기 위해, 각각 ZmUbi1 프로모터 및 ZmPer5 3'UTR에 따라 설계된 다음 프라이머의 쌍을 사용하여 PCR을 수행하였다: 5'-GTG ACC CGG TCG TGC CCC TCT CTA GA-3' 및 5'-CCG TGG ATA TAT GCC GTG AAC AAT TG-3'.
실시예 15: 웨스턴 블롯 (Western blot) 분석
폴리클로날 항체의 제조
2개의 상이한 종류의 폴리클로날 항체를 각각 다음 2개의 폴리펩티드에 대해 제조하였다: "CHRDLKLENTLLDGSPAPRLKICDFGYSKS" (30개의 아미노산) 및 "MNDNTMTTQFDESDQPGQSIEE" (22개의 아미노산). 제1 폴리펩티드는 SnRK2-6 단백질의 키나제 도메인 내의 아미노산 위치 137 내지 166에 위치하고, 제2 펩티드는 SnRK2-6 단백질의 조절 도메인 내의 아미노산 위치 286 내지 307에 위치한다. 이들 2가지 폴리펩티드를 합성하고 담체 단백질로서 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH)에 접합시켰다. 생성되는 2가지 상이한 펩티드-KLH 접합체를 토끼 면역화를 위해 사용하여, 2가지 상이한 종류의 폴리클로날 항체를 생성하였다. 항체를 정제하기 위해, 펩티드를 소 혈청 알부민 (BSA)에 접합시키고, 접합체를 친화도 크로마토그래피에 사용하였다.
샘플 제조
SNF1 키나제 형질전환된 식물 및 대조군으로부터의 옥수수 잎을 드라이 아이스를 사용하여 샘플링하고, 액체 질소를 사용하여 매우 미세한 분말로 연마하였다. SNF1 키나제를 포함하는 단백질은 ~200 mg의 잎 분말을 1 ml의 추출물 버퍼 (50 mM 트리스, pH 8.0, 50 mM NaCl, 5 mM EDTA, 5 mM DTT, 0.05% Triton X-100)에 첨가함으로써 추출하였다. 추출물의 단백질 농도는 바이오-라드 (Bio-Rad) 단백질 분석에 의해 측정하였고, 이들은 3.2 - 3.8 mg/mL로 달랐다.
웨스턴 블롯
단백질을 MOPS 이동 버퍼와 함께 Nupage 10% 비스-트리스 겔 (인비트로겐으로부터 상업상 이용가능함, cat# NP0301Box (미국 캘리포니아주 칼스바드))를 사용하여 SDS-PAGE에 의해 분리하였다. 이어서, 이들을 100 V에서 1시간 동안 트리스/글라이신 버퍼를 사용하여 니트로셀룰로스 막으로 옮겼다. 막을 1시간 동안 실온 (RT)에서 3% 무지방유를 함유하는 PBST 버퍼 내에서 차단하였다. 우유 용액을 부어 내고, 토끼 항-SnRK2-6 폴리클로날 항체를 함유하는 신선한 버퍼를 첨가하였다. 막을 1시간 동안 RT에서 인큐베이팅한 후 PBST로 3회 세척하였다. 세척 후에, 염소 항-토끼 IgG-호스래디시 퍼옥시다제 접합체를 함유하는 신선한 PBST/우유 용액을 막에 첨가하였다. 1시간 동안 RT에서 인큐베이팅한 후, 막을 앞서 설명된 바와 같이 세척하였다. 현상을 위해, 막을 PBST 용액으로부터 제거하고 새로 제조한 ECL 검출 시약 (피어스 (PIERCE), 검출 시약 1 - 퍼옥시드 용액, Cal #1859701, 및 검출 시약 2 - 루미놀 인핸서 용액, Cal #1859698)에 담갔다. 화학발광 필름 (CL-Xposure 필름 (피어스), cal #31460)을 처리된 막에 노출시키고, 코니카 (Konica) SR-X 필름 현상기로 현상하였다.
실시예 16: SnRK2-6의 이종성 발현은 옥수수 가뭄 내성을 증가시킨다.
SnRK2-6 키나제가 이종성 염색체 배경에서 생물학적 과정에 대해 효과를 발휘할 수 있는지를 시험하기 위해서, 본 발명자들은 옥수수에서 SnRK2-6 유전자를 발현시켰다. 그의 기능을 확립하기 위해서, 유전자 서열을 헤미코틸레돈 (hemicotyledon) 코돈 사용 빈도에 따라 코돈-최적화한 후, 옥수수 Ubi1 프로모터의 제어 하에 Hi II 옥수수 내로 도입하였다. 옥수수 트랜스제닉 주에서 SnRK2-6의 발현은 SnRK2-6 펩티드에 대한 폴리클로날 항체를 기초로 하여 웨스턴 블롯을 사용하여 결정하였다. 발현된 단백질은 예상된 크기 (42 kD)를 가졌고, 웨스턴 블롯에 의해 대부분의 주에서 쉽게 검출가능한 수준을 보였다. 대조군으로서, 비-형질전환체 Hi II 식물은 42 kD에서 검출가능한 수준의 임의의 단백질을 보이지 않았다 (데이타 미제시).
T0 Hi II 트랜스제닉 옥수수 식물을 순계 (inbred) 주 5XH751과 역교배시켜 T1 종자를 생성하였다. 생성되는 T1 분리 집단을 눌 분리개체 및 도입유전자를 보유하는 식물을 분리하기 위해 PCR에 의해 스크리닝하였다. 가뭄 내성을 시험하기 위해 설계된 실험에서, 눌 분리개체는 그의 게놈 배경이 서로 가장 유사하기 때문에 동일한 집단으로부터 분리된 트랜스제닉 식물에 대한 대조군으로서 기능한다.
게놈 배경 차이로부터 비롯되는 효과를 규명하기 위해서, 8개의 비의존적인 트랜스제닉 주를 사용하여 옥수수의 가뭄 내성에서 도입유전자의 역할을 평가하였다. 증산 속도와 관련하여, 눌 분리개체 및 SnRK2-6 트랜스제닉 식물의 탈락된 잎에서의 수분 손실은 잎 탈락 기간 동안 측정하였다. 도 8 및 9에 도시된 바와 같이, 트랜스제닉 식물은 눌 분리개체에 비해 감소된 수분 손실 속도를 보였다.
트랜스제닉 옥수수 식물은 시각적 관찰에서 가뭄 스트레스에 대한 더 큰 내성을 보였다. 30일령 옥수수 식물에 6일 동안 관수를 중지할 때, 눌 분리개체는 트랜스제닉 식물보다 심하게 시들었다. 또한, 트랜스제닉 식물은 눌 분리개체보다 빠르게 재수화되었다. 이와 일치하게, 트랜스제닉 64일령 옥수수 식물의 윗부분의 생물체량은 표 6에 제시된 바와 같이 식물에 9일 동안 관수를 중지한 후 재수화의 8일 후에 눌 분리개체의 112% 내지 150%이었다. 표 6에서, 트랜스제닉 식물의 생물체량은 100으로 규정한 눌 분리개체에 대한 백분율로서 표현한다.
Figure pct00009
미국 텍사스주 하프웨이에서 수행된 재배지 실험에서, 3개의 비의존적인 트랜스제닉 옥수수 이벤트는 SnRK2-6 도입유전자가 없는 그의 동기체 (눌)에 비해 등숙기 (grain filling stage)의 가뭄 조건 하에 및 잘 급수된 조건 하에 모두 증가된 곡물 생산량을 보였다 (표 7).
Figure pct00010
종합하면, 상기 결과는 SnRK2-6의 구성적 발현이 옥수수 가뭄 내성을 증가시킬 수 있음을 입증한다. 이것은 가뭄에 대하여 옥수수 식물을 크게 보호하여, 가뭄 조건 하에 수율 손실을 감소시킬 수 있다.
실시예 16: 스트레스 내성 유전자
SnRK2-6은 식물에 스트레스 내성을 부여하는 하나 이상의 유전자와 조합하여 식물 내로 도입될 수 있다. 적합한 스트레스 내성 유전자의 예를 표 8에 제시한다.
Figure pct00011
Figure pct00012
실시예 17: 가뭄 내성 유전자
SnRK2-6은 식물에 가뭄 내성을 부여하는 하나 이상의 유전자와 조합하여 식물 내로 도입될 수 있다. 적합한 가뭄 내성 유전자의 예를 표 9에 제시한다.
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
본 발명이 특정 실시양태에서 설명되었지만, 본 발명은 본 개시내용의 취지 및 범위 내에서 추가로 변형될 수 있다. 따라서, 본원은 그의 일반적인 원리를 사용한 본 발명의 임의의 변동, 사용, 또는 변용을 포함하는 것으로 의도된다. 또한, 본원은, 본 발명이 관련되는 기술의 공지된 또는 종래의 관례에 해당하고 첨부된 특허청구범위의 한계 내에 포함되는, 본 개시내용으로부터의 상기 변형을 포함하는 것으로 의도된다.
본원에서 인용되고 논의된 간행물, 특허 및 특허 출원을 비롯한 모든 참조문은 단지 본원의 출원일 이전의 이들의 개시내용을 제공하는 것이다. 본원의 어느 것도, 본 발명자들이 선행 발명에 의하여 상기 개시내용을 앞당길 자격이 없음을 인정하는 것으로서 해석되지 않아야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Dow AgroSciences LLC Zheng, Zhifu Greene, Thomas W <120> PLANT SNF1-RELATED PROTEIN KINASE GENE <130> 2971-8914US <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1089 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> CDS <222> (1)..(1089) <400> 1 atg gat cga cca gca gtg agt ggt cca atg gat ttg ccg att atg cac 48 Met Asp Arg Pro Ala Val Ser Gly Pro Met Asp Leu Pro Ile Met His 1 5 10 15 gat agt gat agg tat gaa ctc gtc aag gat att ggc tcc ggt aat ttt 96 Asp Ser Asp Arg Tyr Glu Leu Val Lys Asp Ile Gly Ser Gly Asn Phe 20 25 30 gga gtt gcg aga ttg atg aga gac aag caa agt aat gag ctt gtt gct 144 Gly Val Ala Arg Leu Met Arg Asp Lys Gln Ser Asn Glu Leu Val Ala 35 40 45 gtt aaa tat atc gag aga ggt gag aag ata gat gaa aat gta aaa agg 192 Val Lys Tyr Ile Glu Arg Gly Glu Lys Ile Asp Glu Asn Val Lys Arg 50 55 60 gag ata atc aac cac agg tcc tta aga cat ccc aat atc gtt aga ttc 240 Glu Ile Ile Asn His Arg Ser Leu Arg His Pro Asn Ile Val Arg Phe 65 70 75 80 aaa gag gtt ata tta aca 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1063 Tyr Leu Thr Gly Ser Leu Asp Ile Asp Asp Asp Met Glu Glu Asp Leu 330 335 340 gag agc gac ctt gat gac ctt gac att gac tcc agc ggt gag att gtg 1111 Glu Ser Asp Leu Asp Asp Leu Asp Ile Asp Ser Ser Gly Glu Ile Val 345 350 355 tac gcc atg tgagtagtta gcttaatcac ctagagctcg gtcacca 1157 Tyr Ala Met 360

Claims (53)

  1. 식물 세포를 Snf1-관련 단백질 키나제 단백질을 코딩하는 핵산 서열로 형질전환시키고;
    식물이 종자를 생산할 때까지 식물 세포로부터 식물을 성장시키고;
    식물로부터 종자를 수확하는 것
    을 포함하는, 식물, 식물 종자 또는 그의 자손체를 생산하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, Snf1-관련 단백질 키나제 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 식물 세포의 게놈 내로 통합되는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, Snf1-관련 단백질 키나제 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 식물 세포의 게놈 내로 통합된 종자를 선택하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, Snf1-관련 단백질 키나제 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 서열 1 또는 서열 3에 따른 서열을 포함하는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, Snf1-관련 단백질 키나제 단백질이 SnRK2-6을 포함하는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, Snf1-관련 단백질 키나제 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 서열 2 또는 서열 4에 따른 펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것인 방법.
  7. 제1항에 따른 방법에 의해 생산된 식물로부터 수확한 종자.
  8. 제1항에 있어서, 종자를 토양에 심고; 종자로부터 제2 식물을 성장시키고; 제2 식물로부터 종자를 수확하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 식물 세포를 Snf1-관련 단백질 키나제 단백질을 코딩하는 핵산 서열로 형질전환시키는 단계가 아그로박테리움 (Agrobacterium) 세포를 Snf1-관련 단백질 키나제 단백질을 코딩하는 핵산 서열로 형질전환시키고; 식물 세포를 아그로박테리움 세포로 형질전환시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  10. 제3항에 있어서, Snf1-관련 단백질 키나제 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 식물 세포의 게놈 내로 통합된 종자를 선택하는 단계가, 종자로부터 게놈 핵산을 단리하고; 종자로부터 단리된 게놈 핵산으로부터 Snf1-관련 단백질 키나제 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 증폭시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 식물이 아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana), 보라고 (Borago) 종, 캐놀라 (Canola), 리시누스 (Ricinus) 종, 테오브로마 (Theobroma) 종, 제아 (Zea) 종, 고시퓸 (Gossypium) 종, 크람베 (Crambe) 종, 쿠페아 (Cuphea) 종, 리눔 (Linum) 종, 레스퀘렐라 (Lesquerella) 종, 림난테스 (Limnanthes) 종, 리놀라 (Linola), 트로파에올룸 (Tropaeolum) 종, 오에노테라 (Oenothera) 종, 올레아 (Olea) 종, 엘라에이스 (Elaeis) 종, 아라키스 (Arachis) 종, 평지씨, 카르타무스 (Carthamus) 종, 글라이신 (Glycine) 종, 소자 (Soja) 종, 헬리안투스 (Helianthus) 종, 니코티아나 (Nicotiana) 종, 베르노니아 (Vernonia) 종, 트리티쿰 (Triticum) 종, 호르데움 (Hordeum) 종, 오리자 (Oryza) 종, 아베나 (Avena) 종, 소르검 (Sorghum) 종, 세칼레 (Secale) 종, 십자화과 (Brassicaceae), 및 식물 벼과 (Gramineae)의 다른 구성원으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 수확한 종자로부터 오일을 추출하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  13. Snf1-관련 단백질 키나제 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 그의 게놈에 통합된 식물, 식물 종자, 또는 그의 자손체.
  14. 센스 또는 안티-센스 핵산 구성체를 식물 형질전환 벡터 내로 도입하여 변형된 식물 형질전환 벡터를 생성하고 - 여기서 상기 센스 또는 안티-센스 핵산 구성체는 아라비돕시스 (Arabidopsis) Snf1-관련 단백질 키나제 (SnRK) 단백질을 코딩하는 단리된, 정제된 또는 재조합 핵산 서열을 포함함 - ;
    식물, 식물 저장 기관 또는 식물 종자의 게놈을 상기 변형된 식물 형질전환 벡터로 형질전환시키고;
    상기 식물, 식물 저장 기관, 또는 식물 종자를 성장시키고, 오일 또는 생체중합체를 추출하는 것
    을 포함하는, 식물, 식물 저장 기관 또는 식물 종자의 오일, 당, 또는 전분 함량을 변화시키는 방법.
  15. 게놈이 제14항에 기재된 벡터에 의해 형질전환된 것을 특징으로 하는 유전적으로 형질전환된 식물.
  16. 종자가 제14항에 기재된 벡터에 의해 형질전환된 것을 특징으로 하는 유전적으로 형질전환된 식물 종자.
  17. 제15항에 있어서, 동일한 유전자형의 게놈이 변형되지 않은 식물에 비해 변경된 호흡률을 보이는 것을 특징으로 하는 식물.
  18. 제15항에 있어서, 동일한 유전자형의 게놈이 변형되지 않은 식물에 비해 변경된 종자 오일 함량을 보이는 것을 특징으로 하는 식물.
  19. 제15항에 있어서, 동일한 유전자형의 게놈이 변형되지 않은 식물에 비해 변경된 지방산 조성을 보이는 것을 특징으로 하는 식물.
  20. 제15항에 있어서, 동일한 유전자형의 게놈이 변형되지 않은 식물에 비해 향상된 생물체량을 보이는 것을 특징으로 하는 식물.
  21. 제15항에 있어서, 동일한 유전자형의 게놈이 변형되지 않은 식물에 비해 생체중합체를 축적하는 향상된 능력을 보이는 것을 특징으로 하는 식물.
  22. 제15항에 있어서, 동일한 유전자형의 게놈이 변형되지 않은 식물에 비해 변경된 탄수화물 함량을 보이는 것을 특징으로 하는 식물.
  23. 제22항에 있어서, 동일한 유전자형의 게놈이 변형되지 않은 식물에 비해 변경된 수크로스 및 전분 함량을 보이는 것을 특징으로 하는 식물.
  24. 제16항에 있어서, 동일한 유전자형의 게놈이 변형되지 않은 식물에 비해 변경된 호흡률을 보이는 것을 특징으로 하는 식물 종자.
  25. 제16항에 있어서, 동일한 유전자형의 게놈이 변형되지 않은 식물에 비해 변경된 종자 오일 함량을 보이는 것을 특징으로 하는 식물 종자.
  26. 제16항에 있어서, 동일한 유전자형의 게놈이 변형되지 않은 식물에 비해 변경된 지방산 조성을 보이는 식물을 생산하는 것을 특징으로 하는 식물 종자.
  27. 제16항에 있어서, 동일한 유전자형의 게놈이 변형되지 않은 식물에 비해 향상된 생물체량을 보이는 식물을 생산하는 것을 특징으로 하는 식물 종자.
  28. 제16항에 있어서, 동일한 유전자형의 게놈이 변형되지 않은 식물에 비해 생체중합체를 축적하는 향상된 능력을 보이는 식물을 생산하는 것을 특징으로 하는 식물 종자.
  29. 식물 세포를 프로모터에 작동가능하게 연결된 식물 Snf1-관련 단백질 키나제 폴리뉴클레오티드로 안정하게 형질전환시키고 - 여기서, 폴리뉴클레오티드는 센스 또는 안티센스 배향으로 존재함 - ;
    식물에서 Snf1-관련 단백질 키나제 단백질을 조정하기에 충분한 시간 동안 폴리뉴클레오티드를 발현할 수 있는 재생된 식물을 생산하기 위해 식물 세포를 식물 성장 조건 하에 성장시키는 것
    을 포함하는, 식물에서 Snf1-관련 단백질 키나제 단백질의 수준을 조정하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 식물 세포를 식물 Snf1-관련 단백질 키나제 폴리뉴클레오티드로 안정하게 형질전환시키는 단계가 식물 세포를 서열 1 및 서열 3으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 폴리뉴클레오티드로 안정하게 형질전환시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  31. 식물 세포를 Snf1-관련 단백질 키나제 단백질을 코딩하는 수단으로 형질전환시키고;
    식물이 종자를 생산할 때까지 식물 세포로부터 식물을 성장시키고;
    식물로부터 종자를 수확하고;
    수확한 종자로부터 오일을 추출하는 것
    을 포함하는, 트랜스제닉 종자로부터 오일을 추출하기 위한 방법.
  32. 제31항에 있어서, Snf1-관련 단백질 키나제 단백질을 코딩하는 수단이 서열 2 및 서열 3을 코딩하는 핵산 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  33. 제31항에 따른 방법에 의해 생산된 오일.
  34. 서열 1에 따른 데옥시리보핵산 서열, 또는 서열 1의 일부, 또는 서열 1에 실질적으로 상동성인 서열을 함유하는 것을 특징으로 하는, 식물 세포의 형질전환을 위한 벡터.
  35. 제34항에 있어서, 상기 서열이 상기 벡터 내에 센스 배향으로 존재하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  36. 서열 3에 따른 데옥시리보핵산 서열, 또는 서열 3의 일부, 또는 서열 3에 실질적으로 상동성인 서열을 함유하는 것을 특징으로 하는, 식물 세포의 형질전환을 위한 벡터.
  37. 제36항에 있어서, 상기 서열이 상기 벡터 내에 안티-센스 배향으로 존재하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  38. 플라스미드 pSnRK2-6cDNA.
  39. 플라스미드 pSnRK2-6gene.
  40. 서열 1 또는 서열 3의 도입된 뉴클레오티드 서열, 또는 서열 1 또는 서열 3의 일부, 또는 서열 1 또는 서열 3에 실질적으로 상동성인 서열을 함유하는 것을 특징으로 하는 게놈을 갖는 식물.
  41. 서열 1 또는 서열 3의 도입된 뉴클레오티드 서열, 또는 서열 1 또는 서열 3의 일부, 또는 서열 1 또는 서열 3에 실질적으로 상동성인 서열을 함유하는 것을 특징으로 하는 게놈을 갖는 식물 종자.
  42. 서열 1 또는 서열 3, 또는 서열 1 또는 서열 3의 일부, 또는 서열 1 또는 서열 3이나 서열 1 또는 서열 3의 일부에 실질적으로 상동성인 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 뉴클레오티드 서열을 식물의 게놈 내로 도입함으로써 트랜스제닉 식물을 생산하는 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 식물이 아라비돕시스 탈리아나, 옥수수 (제아 메이즈 (Zea mays)), 서양지치 (borage) (보라고 종), 캐놀라, 피마자 (리시누스 코뮤니스 (Ricinus communis)), 코코아 원두 (테오브로마 카카오 (Theobroma cacao)), 면 (고시퓸 종), 크람베 종, 쿠페아 종, 아마 (리눔 종), 레스퀘렐라 및 림난테스 종, 리놀라, 한련 (트로파에올룸 종), 오에노테라 종, 올리브 (올레아 종), 야자 (엘라에이스 종), 땅콩 (아라키스 종), 평지씨, 홍화 (카르타무스 종), 대두 (글라이신 및 소자 종), 해바라기 (헬리안투스 종), 담배 (니코티아나 종), 베르노니아 종, 밀 (트리티쿰 종), 보리 (호르데움 종), 벼 (오리자 종), 귀리 (아베나 종), 수수 (소르검 종), 호밀 (세칼레 종) 및 벼과 (Gramineae)의 다른 구성원으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 식물 또는 식물 종자의 게놈을 형질전환시키기 위한 벡터를 사용하여 센스 또는 안티-센스 핵산 구성체를 식물 형질전환 벡터 내로 도입하고, 이어서 식물 또는 식물 종자를 성장시키고, 식물 종자로부터 오일을 추출함으로써 식물의 오일 함량, 지방산 조성, 당/전분/탄수화물 수준 또는 종자 수율을 변화시키는 방법으로서, 상기 핵산 서열은 서열 1 또는 서열 3, 또는 서열 1 또는 서열 3의 일부, 또는 서열 1 또는 서열 3에 실질적으로 상동성인 서열인 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 프로모터와 기능적으로 연관된 식물 물질의 오일 함량을 변경시키기 위한 Snf1-관련 단백질 키나제 수단을 포함하는 벡터에 의해 추가로 형질전환된, 식물, 식물 종자 및 식물의 자손체로 이루어지는 군 중에서 선택되는 식물 물질.
  46. 제45항에 있어서, Snf1-관련 단백질 키나제 수단이 핵산 서열인 식물 물질.
  47. 제45항에 있어서, 프로모터가 CsVMV인 식물 물질.
  48. 제45항에 있어서, 프로모터가 천연 프로모터인 식물 물질.
  49. 제45항에 있어서, 프로모터가 Ubi1 프로모터인 식물 물질.
  50. 제45항에 있어서, 식물 물질이 아라비돕시스 탈리아나, 보라고 종, 캐놀라, 리시누스 종, 테오브로마 종, 제아 종, 고시퓸 종, 크람베 종, 쿠페아 종, 리눔 종, 레스퀘렐라 종, 림난테스 종, 리놀라, 트로파에올룸 종, 오에노테라 종, 올레아 종, 엘라에이스 종, 아라키스 종, 평지씨, 카르타무스 종, 글라이신 종, 소자 종, 헬리안투스 종, 니코티아나 종, 베르노니아 종, 트리티쿰 종, 호르데움 종, 오리자 종, 아베나 종, 소르검 종, 세칼레 종, 십자화과, 및 식물 벼과의 다른 구성원으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 식물 물질.
  51. Snf1-관련 단백질 키나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는, 서열 1 및 서열 3으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 핵산 서열을 포함하는 핵산 구성체를 식물 형질전환 벡터 내로 도입하고;
    식물 또는 식물 종자의 게놈을 상기 식물 형질전환 벡터로 형질전환시키고;
    핵산 서열을 발현시키고;
    식물 또는 식물 종자를 성장시키고;
    동일한 조건에서 성장시켰지만 뉴클레오티드 서열이 도입되지 않은 식물과 동일한 유전자형의 통계상 유의한 수의 식물의 평균 가뭄 내성에 비해 변경된 가뭄 내성을 갖는 형질전환된 식물을 선택하는 것
    을 포함하는, 식물의 가뭄 내성을 변경시키는 방법.
  52. Snf1-관련 단백질 키나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는, 서열 1 및 서열 3으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 핵산 서열을 포함하는 핵산 구성체를 식물 형질전환 벡터 내로 도입하고;
    식물 또는 식물 종자의 게놈을 상기 식물 형질전환 벡터로 형질전환시키고;
    핵산 서열을 발현시키고;
    식물 또는 식물 종자를 성장시키고;
    동일한 조건에서 성장시켰지만 뉴클레오티드 서열이 도입되지 않은 식물과 동일한 유전자형의 통계상 유의한 수의 식물의 평균 뿌리 생물체량에 비해 변경된 뿌리 생물체량을 갖는 형질전환된 식물을 선택하는 것
    을 포함하는, 식물의 뿌리 생물체량을 변경시키는 방법.
  53. 제13항에 있어서, 식물, 식물 종자, 또는 자손체에서 향상된 수분 손실에 대한 저항성, 가뭄 내성, 탄소 동화, 식물 성장 및 발달, 지방산 생체합성, 또는 뿌리 성장을 부여하는 하나 이상의 추가의 이종성 또는 변경된 유전자를 포함하는 식물, 식물 종자, 또는 그의 자손체.
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