MX2011010638A

MX2011010638A - Gen de cinasa de proteina relacionada con la planta snf1.

Info

Publication number: MX2011010638A
Application number: MX2011010638A
Authority: MX
Inventors: Zhifu Zheng; Thomas Greene
Original assignee: Dow Agrosciences Llc
Priority date: 2009-04-10
Filing date: 2010-04-09
Publication date: 2012-01-19
Also published as: US20110167515A1; NZ595476A; ZA201107135B; US9410160B2; US20100281574A1; EP2416643A2; CL2011002518A1; CA2758195A1; AU2010233155A1; JP2012523237A; CN102458098A; BRPI1014907A2; US8927806B2; WO2010118338A3; KR20120007038A; EP2416643A4; WO2010118338A2; IL215571A0; RU2011145572A; CO6450629A2

Abstract

La presente invención se refiere al aislamiento, purificación, caracterización y uso del gen de cinasa de proteína relacionado con la planta Snf1 (SnRK), y productos genéticos. La presente invención incluye el ADN de SnRK aislado y purificado y se refiere a métodos de regulación de la pérdida de agua y la tolerancia a la sequía de la planta, el contenido de sacarosa, el contenido de almidón, el contenido de aceite de semilla, la síntesis de ácido graso, la composición acilo de aceite de semilla, el tamaño/peso de la semilla, resistencia/tolerancia a esfuerzos bióticos, la biomasa aumentada de la raíz, y/o el flujo de carbono en otros componentes de la semilla, plantas que utilizan el gen, y a tejidos y plantas transformados con el gen. La invención también se refiere a plantas transgénicas tejidos de plantas y semillas de plantas que tienen un genoma que contiene una secuencia de ADN introducida de la invención, y a un método de producción de dichas plantas y semillas de plantas.

Description

GEN DE CINASA DE PROTEÍNA RELACIONADO CON LA PLANTA SNF1 Referencia Cruzada con Solicitudes Relacionadas La presente solicitud reclama el beneficio de la fecha de presentación de la Solicitud de Patente Provisional Norteamericana Serie No. 61/168,532, presentada en Abril 10, 2009, para un "GEN DE CINASA DE PROTEÍNA RELACIONADO CON LA PLANTA SNF1".

Campo de la Invención La presente invención se refiere generalmente a los genes de las plantas útiles para la manipulación genética de las características de la planta. Más específicamente, la presente invención se refiere a la identificación, aislamiento e introducción de los genes de cinasa de proteína relacionados con la planta Snf1 (SnRK) útiles, por ejemplo, para alterar la pérdida de agua en las plantas y la tolerancia a la sequía de las plantas, el contenido de sacarosa, el contenido de almidón, el contenido de aceite de la semilla, la síntesis de ácidos grasos, la composición acilo del aceite de semilla, tamaño/peso de la semilla, resistencia/tolerancia a los esfuerzos bióticos, biomasa aumentada, y/o flujo de carbono dentro de otros componentes de la semilla, en plantas comerciales y de cultivo.

Antecedentes de la Invención Un cuerpo grande de evidencia demuestra que las cinasas de proteína relacionadas con la planta Snf1 sirven como reguladores importantes que modulan las trayectorias metabólicas fundamentales en respuesta a los esfuerzos nutricionales y ambientales en la levadura y las células de mamífero (Hardie, 2007; Hardie y Carling, 1997; Hedbacker y Carlson, 2008). En la levadura de Saccharomyces cerevisiae, la sacarosa que no fermenta la cinasa de la planta Snf1 es una cinasa de proteína de serina/treonina que es requerida para la depresión de la transcripción de los genes de glucosa que se pueden reprimir. También está comprendido en la g luconeogénesis, la acumulación de glicógenos, la biogénesis de mitocondria y peroxisoma, y la esporulación. El ortólogo de mamífero de la levadura Snf1 es la cinasa de proteína (AMPK) activada por monofosfato de adenosina (AMP).

Al momento de las respuestas al estrés celulares que agotan el ATP, la AMPK es activada y de esta manera fosforila e inhibe las enzimas comprendidas en la biosíntesis del colesterol y los ácidos grasos. Está bien documentado que la AMPK puede desactivar la reductasa de 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA (HMG-CoA) (una enzima regulatoria clave en la síntesis del colesterol y otros compuestos de isoprenoide), la carboxilasa de acetil CoA (ACC) (la cantidad que limita la enzima en la síntesis de malonil CoA), y también la lipasa sensible a la hormona. Concurrentemente, la AMPK detona las trayectorias catabólicas de los ácidos grasos para promover la producción de ATP. Por ejemplo, la AMPK fosforila y activa la descarboxilasa de malonil-CoA (MCD), una enzima comprendida en la degradación de malonil CoA. Más recientemente, un rol para la AMPK en la desactivación de las aciltransferasas de glicero 1-3- fosfato también ha sido sugerida en las células de mamíferos. Por lo tanto, la AMPK, tiene el potencial de regular la síntesis y la descomposición de los triglicéridos y ésteres de colesterilo .

El estudio bioinformático de la secuencia completada de Arabidopsis thaliana y el genoma del arroz revelaron que, en las plantas, existen grupos grandes de cinasas relacionados con las cinasas tipo Snf1 clásicas de la levadura. En la Arabidopsis, las cinasas relacionadas con la planta Snf1 (SnRKs) se descubrieron en todos los cinco cromosomas y consiste de 38 miembros. De acuerdo con la similitud de la secuencia, estas cinasas pueden ser clasificadas en tres subgrupos: SnRK1 (tres miembros), SnRK2 (diez miembros) y SnRK3 (25 miembros) (E.M. Hrabak y asociados, Plant Physiol. 2003, 132, páginas 666 a 680). La estructura de la cinasa individual está comprendida de un dominio de cinasa y un dominio regulatorio. Aunque estas cinasas muestran una similitud relativamente alta en el dominio catalítico de la cinasa en la terminal-N, sus dominios regulatorios en la terminal-C son ampliamente divergentes, lo cual se considera que funcionan en las interacciones de proteína a proteína o que regulan la actividad de la cinasa (E.M. Hrabak y asociados, Plant Physiol. 2003, 132, páginas 666 a 680). Esto subraya una funcionalidad complicada para cada cinasa.

Las cinasas SnRK1, basadas en la similitud de la secuencia, son los homólogos más cercanos de la cinasa de levadura Snf1 y la AMPK de mamíferos. Han sido aisladas de una variedad de especies incluyendo, centeno, Arabidopsis, tabaco, cebada, arroz, betabel y papa. Estos descubrimientos de que los genes del centeno y el tabaco pueden complementar la mutación de la planta Snf1 en la levadura pronostican una similitud funcionar de los genes de la planta SnRK1 para la Snf1. Por consiguiente, ha sido sugerido el rol para la planta SnRK1 en el metabolismo del azúcar. La expresión antisentido de un SnRK1 en la papa dio como resultado la pérdida de la expresión que se puede inducir con azúcar de la sintasa de sacarosa (Purcell y asociados, en Plant Journal 1998, 14: páginas 195 a 202). El trabajo adicional con estas líneas antisentido indica un rol potencial para las cinasas SnRK1 para impactar el flujo de carbono a través de la modificación de regulación posterior a la traducción de la ADPglucosa fosforilasa, un paso regulatorio clave en la biosíntesis del almidón (Tiessen y asociados, en Plant Journal 2003, 35: páginas 490 a 500). La evidencia de soporte adicional viene del descubrimiento de que la expresión antisentido de la SnRK1 en el centeno dio como resultado poca o ninguna acumulación de almidón en los granos de polen, ocasionando la esterilidad de los machos (Y. Zheng y asociados, Plant Journal 2001, 28: páginas 431 a 441 ).

A diferencia del grupo SnRK1, no se descubrieron representantes de los grupos SnRK2 y SnRK3 en animales y hongos, pronosticando su regulación única de respuestas celulares en las plantas. Recientemente, se ha mostrado que las cinasas SnRK3, también denominadas CIPKs (cinasas de proteína que interactúan con el CBL), pueden ¡nteractuar con una familia novedosa de sensores de calcio de plantas, denominadas proteínas similares a la calcineurina B (CBLs) (Kudla y asociados, 1999; Shi y asociados, 1999; Kim y asociados, 2000). En la Arabidopsis, existen diez miembros de la familia CBL, conteniendo cada uno tres manos EF que se enlazan al calcio (Kolukisaoglu y asociados, 2004). Bajo condiciones de esfuerzo, las firmas del calcio cambian y descodifican la interacción específica entre los diferentes miembros CBL y SnRK3 (CIPK), conduciendo a la expresión alterada de los genes descendentes seguido por las respuestas fisiológicas específicas. Por ejemplo, el CBL1 interactúa con el CIPK7 y el CIPK9 para promover la respuesta a la sequía, mientras que el CBL9 activa el CIPK3 para mejorar la respuesta al frío. Se ha observado que la red CBL-SnRK3 (CIPK) interactúa en gran parte con el ácido abscísico de la hormona de la planta (ABA), al cual nos referimos como una hormona del esfuerzo debido a sus roles de pivote en las respuestas de esfuerzo. La evidencia que soporta este mecanismo incluye: (i) como en las condiciones de esfuerzo, el ABA puede inducir la expresión de los genes CBL1 y CIPK3; (¡i) los mutantes cbl9 y cipk3 son hipersensibles al ABA; y (iii) la sobre-expresión de un miembro del grupo SnRK3 (designado PKS18, correspondiente al At5g45820 anotado) en la Arabidopsis confirió la hipersensibilidad al ABA durante la germinación de la semilla, mientras que silenciar el gen dio como resultado la insensibilidad del ABA (D. Gong y asociados, J. Biol. Chem. 2003, 277: páginas 42088 a 42096).

Debido a la poca similitud de la secuencia en los dominios de la terminal-C de las cinasas, el grupo SnRK2 puede ser dividido además en dos subgrupos, es decir, SnRK2a y SnRK2b (M. Boudsocq y asociados, J. Biol. Chem. 2004, 279: páginas 41758 a 41766; T. Umezawa y asociados, PNAS 2004, 101: páginas 17306 a 17311). El SnRK2a consiste de SnRK2.2, SnRK2.3, SnRK2.6, SnRK2.7 y SnRK2.8. Los otros cinco miembros, SnRK2.1, SnRK2.4, SnRK2.5, SnRK2.9 y SnRK2.10, pertenecen al subgrupo SnRK2b (Umezawa y asociados, Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 2004, 101: páginas 17306 a 17311). Varios estudios demostraron que las cinasas individuales en el subgrupo SnRK2 pueden tener diferentes roles en los procesos biológicos. Por ejemplo, aunque las cinasas SnRK2.2 y SnRK2.3 son las dos cinasas de proteína más cercanas relacionadas con la similitud de la secuencia basada en la cinasa SnRK2.6 (Hrabak y asociados, 2003), funcionan de una manera muy diferente que la SnRK2.6. Las cinasas SnRK2.2 y SnRK2.3 han mostrado que son cinasas de proteína clave portadoras de la señalización de ABA durante la germinación de la semilla y el crecimiento del semillero. Sin embargo, como un regulador positivo de la señalización de ABA, las cinasas SnRK2.6 están involucradas en la regulación portada por el ABA de la apertura de la estoma, mientras que la inactividad y germinación de la semilla no es afectada en los mutantes SnRK2.6 de Arabidopsis (Mustilli y asociados, 2002; Yoshida y asociados, 2006).

Se considera que existen por lo menos tres factores de subcalificación de funcionalidad especializada para cada cinasa del subgrupo SnRK2. Primero, las cinasas individuales pueden mostrar diferentes expresiones temporales y espaciales. Por ejemplo, la cinasa SnRK2-8 es expresada de manera abundante en las raíces y débilmente en las hojas y silicuas (Umezawa y asociados, Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 2004, 101: páginas 17306 a 17311); la cinasa SnRK2-6 es expresada principalmente en las células protectoras y los tejidos vasculares en la Arabidopsis (Mustilli y asociados, 2002); y aunque las cinasas SnRK2-2 y SnRK2-3 ambas muestran la expresión de difusión en varios tejidos, la cinasa SnRK2-3 muestra una expresión particularmente fuerte en las puntas de las raíces (Fujii y asociados, Plant Cell, 2007, 19: páginas 485 a 494). Segundo, los dominios regulatorios en la terminal-C son altamente divergentes entre las diferentes cinasas SnRK2 aunque los dominios de cinasa son bastante conservados. Por ejemplo, la similitud general de la secuencia entre las cinasas SnRK2-4 y SnRK2-6 es del 70%, mientras que existe una identidad de solamente el 30% en el dominio de la terminal-C. Esto sugiere que la interacción de la cinasa SNRK2-6 con otros componentes de señalización puede ser diferente de la cinasa SnRK2-4, pronosticando de esta manera diferentes funciones conferidas por estas dos cinasas. La evidencia de soporte vino del descubrimiento de que estas dos cinasas responden a diferentes señales ambientales (M. Boudsocq y asociados, J. Biol. Chem. 2004, 279, páginas 41758 a 41766). Además, el rol del dominio de la terminal-C para controlar la función fisiológica de las cinasas fue verificada experimentalmente (Belin y asociados, 2006; Yoshida y asociados, 2006). Finalmente, la diferencia ligera de la estructura de las cinasas puede conducir a diferentes localizaciones subcelulares. Para entender la forma en que funciona cada cinasa, es necesario entender en donde está localizada en una célula viva.

Breve Descripción de la Invención Una modalidad de la presente invención está dirigida a un proceso para producir una planta, semilla de planta o progenie de la misma, comprendiendo el proceso: la transformación de una célula de la planta con una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de cinasa de proteína relacionada con la planta Snf1; cultivar una planta de la célula de planta hasta que la planta produce semillas; y recolectar la semilla de la planta. Otra modalidad de la presente invención incluye una semilla cultivada de la planta producida por el proceso de producción de la planta. También está incluida una planta, semilla de la planta, o progenie de la misma que tiene la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de cinasa de proteína relacionada con la planta Snf1 incorporada en el genoma de la misma.

Otro aspecto de la presente invención incluye un método para cambiar el contenido de aceite, azúcar, o almidón de una planta, el órgano de almacenamiento de la planta o la semilla de la planta, cuyo proceso incluye la introducción de una construcción de ácido nucleico sentido o antisentido dentro de un vector de transformación de la planta para producir un vector de transformación de la planta modificado, en donde dicha construcción de ácido nucleico sentido o antisentido comprende la secuencia de ácido nucleico aislada, purificada o recom binante que codifica una proteína de cinasa de proteína relacionada con la planta Snf1 de Arabidopsis (SnRK). La planta, el órgano de almacenamiento de la planta o el genoma de la semilla de la planta es transformado con el vector modificado de transformación de la planta. La planta, el órgano de almacenamiento de la planta, o la semilla de la planta son cultivadas y entonces se puede extraer el aceite o biopolímero. Las plantas genéticamente transformadas y las semillas de las plantas que tienen un genoma que ha sido transformado por el vector también están incluidas como un aspecto adicional de la invención. Dichas plantas y semillas de las plantas pueden ser caracterizadas como que exhiben una cantidad de respiración alterada, un contenido de aceite de la semilla alterado, una composición de ácido graso alterada, biomasa mejorada, capacidad mejorada para acumular los biopolímeros, y un crecimiento de la raíz aumentado comparado con una planta del mismo genotipo no modificada genómicamente.

En una modalidad particular, un método para regular el nivel de la proteína de cinasa de proteína relacionada con la planta Snf1 en una planta, incluye: la transformación estable de la célula de la planta con un polinucleótido de cinasa de proteína relacionado con la planta Snf1 enlazado de manera operable con un promotor, en donde el polinucleótido es en la orientación sentido o antisentido; y cultivar la célula de la planta bajo las condiciones de crecimiento de la planta para producir una planta regenerada con capacidad para expresar el polinucleótido por un tiempo suficiente para regular la proteína de cinasa de proteína relacionada con la planta Snf1 en la planta .

Otra modalidad se refiere a un proceso para extraer aceite de la semilla transgénica, comprendiendo el proceso: transformar la célula de una planta con medios para codificar una proteína de cinasa de proteína relacionada con la planta Snf1; cultivar una planta de la célula de la planta hasta que la planta produce semillas; recolectar la semilla de la planta; y extraer aceite de la semilla recolectada. También está incluido el aceite producido mediante este proceso.

Todavía otra modalidad está dirigida a un vector para la transformación de las células de la planta, caracterizado porque dicho vector contiene una secuencia de ácido desoxi-ribonucleico de acuerdo con las SEQ ID No:1 o SEQ ID No:3, o una parte de las SEQ ID No:1 o SEQ ID No:3, o una secuencia que es substancialmente homologa a las SEQ ID No:1 o SEQ ID No:3. También está incluida como una modalidad una planta o semilla de la planta que tiene un genoma, caracterizado porque dicho genoma contiene una secuencia de nucleótidos introducida de las SEQ ID No:1 o SEQ ID No:3, o una parte de las SEQ ID No:1 o SEQ ID No: 3, o una secuencia que es substancialmente homologa a las SEQ ID No:1 o SEQ ID No:3. De un modo similar incluido en las modalidades particulares se encuentran los métodos de producción de plantas transgénicas introduciendo una secuencia de nucleótidos dentro de un genoma de dicha planta, caracterizado porque dicha secuencia de nucleótidos introducida dentro de dicho genoma incluye las SEQ ID No:1 o SEQ ID No.3, o una parte de las SEQ ID No:1 o SEQ ID No:3, o una secuencia que es substancialmente homologa a la SEQ ID No:1 , o a la SEQ ID No:3, o una parte de las SEQ ID No:1 o SEQ ID No: 3.

Otro aspecto de la presente invención incluye un método para el cambio del contenido de aceite, la composición de ácido graso, o el rendimiento de la semilla de una planta introduciendo una construcción de ácido nucleico sentido o antisentido dentro de un vector de transformación de la planta, utilizando el vector para transformar el genoma de una planta o la semilla de la planta, y luego cultivando la planta o la semilla de la planta y extrayendo el aceite de la semilla de la planta, caracterizado porque dicha secuencia de ácido nucleico es la SEQ ID No:1 o la SEQ ID No.3, o una parte de las SEQ ID No:1 o SEQ ID No:3, o una secuencia que es substancialmente homologa a las SEQ ID No:1 o SEQ ID No:3. Todavía otro aspecto de la presente invención incluye una planta, una semilla de la planta, y una progenie de una planta que es transformada adicionalmente por un vector que comprende una cinasa de proteína relacionada con la planta Snf1 y medios para alterar el contenido de aceite del material de la planta asociado funcionalmente con un promotor.

Todavía en otra modalidad de la presente invención, un método para alterar la tolerancia a la sequía de una planta, incluyendo dicho método: introducir una construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico, seleccionada del grupo consistente de las SEQ ID No:1 y SEQ ID No:3, que codifican un polipéptido que tiene una actividad de cinasa de proteína relacionada con la planta Snf1 dentro de un vector de transformación de la planta; transformar el genoma de una planta o la semilla de la planta con dicho vector de transformación de la planta; expresar la secuencia de ácido nucleico; cultivar la planta o la semilla de la planta; y seleccionar una planta transformada que tiene la tolerancia a la sequía alterada comparada con una tolerancia a la sequía promedio de un número de plantas estadísticamente importante del mismo genotipo como la planta cultivada en condiciones idénticas, pero sin la secuencia de nucleótidos introducida.

Breve Descripción de los Dibujos La figura 1 es una gráfica que muestra la comparación del número de brotes laterales en los tallos de 34 días de edad (wt) y las líneas transgénicas SnRK2-6 de Arabidopsis thaliana designadas como 340293, 340318, 340367, 340378 y 340397. Las barras de error son ± DE (desviación estándar).

La figura 2 es un trazo que muestra la pérdida de agua en porciones aéreas desprendidas de líneas de Arabidopsis thaliana transgénicas de tipo natural (wt) de 27 días de edad. Cada uno de los puntos de datos representa el promedio de cinco líneas transgénicas de Arabidopsis thaliana independientes. La pérdida de agua es reportada como un porcentaje del peso fresco inicial de las cero horas a las seis horas después del desprendimiento de las porciones aéreas de la planta. La diferencia importante en la pérdida de agua entre la wt y la planta transgénica es ¡lustrada por la P (prueba-t) < 0.004.

La figura 3 es un trazo que muestra la pérdida de agua en las porciones aéreas desprendida de los homozigotes (eliminados) y nulos (nulo) para la inserción del T-ADN en SALK_008068 en la Arabidopsis thaliana de 27 días de edad. La pérdida de agua es reportada como un porcentaje del peso fresco inicial de las cero horas a las seis horas después del desprendimiento de las porciones aéreas de la planta. La diferencia importante en la pérdida de agua entre wt y las plantas transgénicas se ilustra por la P (prueba-t) <0.004.

La figura 4 es una gráfica que muestra el contenido de azúcar soluble (nmol/g de glucosa, fructosa y sacarosa) en las hojas de las líneas transgénicas de 30 días de edad de tipo natural (wt) y T3 SnRK2-6 (340293, 340318, 340367, 3.40378 y 340397) de Arabidopsis thaliana. Cada uno de los puntos de datos representa el promedio de cinco líneas transgénicas SnRK2-6 independientes de Arabidopsis thaliana (340293, 340318, 340367, 340378 y 340397). Las barras de error son ± DE (n = 8 ó 10 plantas de cada línea muestreada).

La figura 5 es una gráfica que muestra el contenido de almidón en las hojas de la cinco líneas transgénicas SnRK2-6 independientes de Arabidopsis thaliana de tipo natural (wt) de 30 días de edad. Cada uno de los puntos de datos representa el promedio de cinco líneas transgénicas SnRK2-6 independientes de Arabidopsis thaliana (340293, 340318, 340367, 340378 y 340397). El contenido de almidón es reportado como nmol/g del contenido total de almidón de las hojas de cada línea. Las barras de error son ± DE (n = 8 ó 10 plantas de cada línea muestreada).

La figura 6 es una gráfica que muestra una comparación de la composición de ácido graso de las hojas de tipo natural (wt) y las líneas transgénicas SnRK2-6 de Arabidopsis thaliana. Cada uno de los puntos de datos representa el promedio de cinco líneas transgénicas SnRK2-6 independientes de Arabidopsis thaliana (340293, 340318, 340367, 340378 y 340397). Las proporciones de ácidos grasos son reportadas como Mol % de la composición total de las hojas de cada línea. Las barras de error son ± DE (n = 10 plantas de cada línea muestreada).

La figura 7 es una gráfica que muestra una comparación del rendimiento de la semilla por planta en las plantas de Arabidopsis thaliana de tipo natural (wt) y las líneas transgénicas SnRK2-6. Más específicamente, es una comparación del rendimiento de la semilla bajo condiciones de cultivo normales, medias y severas. Las plantas cultivadas bajo condiciones "normales" se mojaron bien durante el ciclo completo de cultivo. La irrigación cesó durante seis días durante la etapa de florecimiento en las plantas cultivadas bajo condiciones "medias". La irrigación cesó por 16 días durante la etapa vegetativa en las plantas cultivadas bajo condiciones "severas". Las barras de error son ± DE (n = 30 plantas de cada línea muestreada). La diferencia importante en el rendimiento de la semilla entre las líneas wt y transgénicas se ilustra por la P (prueba-t) <0.001.

La figura 8 es un trazo que muestra la pérdida de agua en las hojas desprendidas de porciones de segregantes (nulos) y líneas transgénicas SnRK2-6 de plantas de maíz (transgénicas) de 34 días de edad. Cada uno de los puntos de datos representa el promedio de ocho líneas transgénicas independientes de plantas de maíz. Se utilizaron cinco segregantes nulos y cinco plantas que contenían cinasa de cada línea independiente, y todas ellas mostraron un tamaño muy similar. Para cada planta, la hoja más alta con un collar visible fue cortada y utilizada en el ensayo. La pérdida de agua es reportada como un porcentaje del peso fresco inicial de cero minutos a 180 minutos después del desprendimiento de las porciones aéreas de la planta. La diferencia importante en la pérdida de agua entre las líneas nula y transgénica se ilustra por la P (prueba-t) <0.003.

Las figuras de la 9A a la 9C son trazos que muestran la pérdida de agua en las hojas desprendidas de las plantas segregantes (nulas) y las plantas de maíz que contienen SnRK2-6 (transgénicas) de tres líneas independientes. Cada uno de los puntos de datos representa el promedio de cinco plantas de maíz independientes de la misma línea. Para cada planta, la hoja más alta con un collar visible fue cortada y utilizada en el ensayo. La pérdida de agua es reportada como un porcentaje del peso fresco inicial de los cero minutos a los 90 minutos después del desprendimiento de las porciones aéreas de la planta.

La figura 10 es una gráfica que muestra una comparación de la biomasa de la raíz en los segregantes nulos (nulo) y las plantas de maíz que contienen SnRK2-6 (transgénicas) de cuatro líneas independientes, las cuales son designadas como 2280(1)006.006R.011R, 2280(2)015.006R.008R, 2280(2)016.004R.017R y 2280 (3)025.006 R .007 R . Las porciones aéreas fueron cortadas y las raíces recolectadas removiendo la tierra y luego secadas en un invernadero durante siete días para eliminar la variación de humedad entre las muestras diferentes.

La figura 11 es un mapa del pDAB4504 plásmido, el cual puede ser utilizado como un vector. El vector contiene las siguientes características salientes para la transformación de la planta en la invención actual: un promotor CsVMV, SnRK2-6 y un AtuORF24 3'-UTR.

La figura 12 es un mapa del pDAB7702 plásmido, el cual puede ser utilizado como un vector. El vector contiene las siguientes características salientes para la transformación de la planta en la invención actual: el promotor U b i 1 de maíz, S n R K2- 6 hv, y ZmPer5 3'UTR.

Descripción Detallada de la Invención Una modalidad de la presente invención está dirigida a la identificación, aislamiento y clonación de un elemento genético que puede ser utilizado para modificar la formación natural de triacilgliceroles en las plantas con el objeto de aumentar la producción de aceites de las plantas comerciales, o para modificar su composición para lograr mejoras comerciales específicas de plantas y productos de las plantas.

Otra modalidad de la presente invención se refiere al aislamiento y caracterización del gen de cinasa de proteína relacionado con la planta Snf1 (SnRK) y la secuencia de cADN de la especie Arabidopsis y a la utilización de estas secuencias en la manipulación genética de las plantas.

Todavía otra modalidad de la presente invención es proporcionar un vector que contiene la secuencia de codificación SnRK de longitud completa o una porción importante de la secuencia SnRK de Arabidopsis en una orientación sentido bajo el control de un promotor (por ejemplo, CsVMV o Ubi1), para volver a introducir en la especie Arabidopsis y para introducir en otras plantas. En una modalidad alternativa de la presente invención, se ha proporcionado un vector que contiene un fragmento genómico de Arabidopsis consistente del gen SnRK de longitud completa, o una porción importante de las secuencias SnRK de las especies Arabidopsis , bajo el control de sus propias secuencias regulatorias superiores 5', para reintroducirla en la especie Arabidopsis y para introducirla en otras plantas.

También está incluido un método para construir un vector que contiene una secuencia SnRK de longitud completa o una porción importante de la secuencia SnRK de Arabidopsis, en una orientación antisentido bajo el control de un promotor, para reintroducirla en la planta de Arabidopsis o para introducirla en otras plantas. Otro método particular incluye la modificación de la planta de Arabidopsis y otras plantas para cambiar su contenido de aceite de las semillas, su composición de ácidos grasos, su peso o tamaño promedio de la semilla, y/o su pérdida de agua y tolerancia a la sequía de la planta. Otros métodos de la presente invención comprenden la modificación de la Arabidopsis y otras plantas para promover el crecimiento y desarrollo, tal como aumentando la biomasa de la raíz, o para cambiar su actividad fotosintética, de esta manera aumentando el contenido de azúcar y almidón.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un vector que contiene el ácido desoxi-ribonucleico aislado y purificado (cADN) de la secuencia SEQ ID No:1 (pSnRKcADN), para la introducción del cADN en la orientación sentido dentro de la célula de la planta. Como otro aspecto de la presente invención, se proporciona un vector que contiene el ácido desoxi-ribon ucleico optimizado aislado y purificado de la planta (ADN) de la SEQ ID No:3 (gen pSnRK2-6 hv5), para la introducción del gen en una orientación sentido dentro de una célula de la planta. De acuerdo todavía con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método para preparar un vector que contiene la SEQ ID No:1 o una parte de la misma, o la SEQ ID No:3, o una parte de la misma, para la introducción del gen o gen parcial en una orientación antisentido, dentro de una célula de la planta.

Otra modalidad incluye proporcionar una línea de semillas mutantes de Arabidopsis thaliana. La línea de semilla mutante tiene una mutación de inserción en un gen SnRK (como se muestra en la Tabla 1 siguiente), y produce plantas que exhiben una actividad aumentada de SnRK, dando como resultado un aumento en el tamaño de la hoja y el número de brotes laterales, una pérdida de agua disminuida, un contenido aumentado de azúcar y almidón, una composición alterada de acilos de ácidos grasos de la semilla, el rendimiento de la semilla aumentada, y la biomasa de la raíz aumentada. La secuencia de cADN de la SnRK2-6 se muestra en la SEQ ID No:1, la secuencia de ADN de planta optimizada se muestra en la SEQ ID No:3 y la secuencia de la proteína traducida de la SnRK2-6 se muestra en la SEQ ID No:2.

La presente invención también se refiere a plantas transgénicas y semillas de las plantas que tienen un genoma que contiene una secuencia de ADN introducida de las SEQ ID No:1 o SEQ ID No:3, y un método de producción de dichas plantas o semillas de las plantas.

La presente invención se relaciona además substancialmente con secuencias de ADN homologas substancialmente de las plantas con secuencias de aminoácidos decididas del 25% o una identidad mayor, y del 50% o una similitud mayor aisladas y/o caracterizadas por métodos conocidos utilizando la información de secuencia de las secuencias SEQ ID No:1, o SEQ ID No:3, como lo podrán apreciar los expertos en la técnica, y a partes de longitud reducida que todavía pueden funcionar como inhibidores de la expresión del gen mediante el uso de una aplicación antisentido o de co-supresión (Jorgensen y Napoli, 1994). Se podrá apreciar por los expertos en la técnica que los cambios pequeños en las identidades de los nucleótidos en una secuencia de gen específica pueden resultar en efectividades reducidas o aumentadas del gen y que, en algunas aplicaciones (por ejemplo, antisentido o co-supresión), las secuencias parciales con frecuencia funcionan tan efectivamente como las versiones de longitud completa. Los medios por los cuales la secuencia de genes puede ser variada o acortada son bien conocidos para los expertos en la técnica, y existen medios de prueba de la efectividad de los genes alterados. Todas dichas variaciones de los genes por lo tanto están reclamadas como parte de la presente invención.

Cuando se consideran, el tamaño de la hoja alterado, el número de brotes laterales, la pérdida de agua, o azúcar, o almidón o el contenido de aceite o composiciones, los resultados de los promedios de los números de plantas o semillas estadísticamente importantes de acuerdo con la presente invención son comparados mejor con los resultados de los promedios de los números estadísticamente importantes de plantas o semillas sin transformar (control) del mismo genotipo cultivado bajo condiciones idénticas al mismo tiempo. Esto permite que la variabilidad de las plantas individuales del mismo genotipo, particularmente cuando dichas plantas son cultivadas bajo diferentes condiciones. El número real de plantas o semillas utilizado para formar el promedio requerido puede variar, pero debe de ser suficiente para proporcionar un promedio generalmente constante siempre que dicho número sea seleccionado. Generalmente, el número deberá ser por lo menos diez, y más preferentemente por lo menos 20, 30, 50 ó 100.

La SnRK de la presente invención es útil para manipular la actividad de SnRK, y la pérdida de agua, la tolerancia a la sequía, la asimilación de carbono, el crecimiento y desarrollo de la planta, el bioensamble de ácidos grasos, y el crecimiento de la raíz en las plantas. Por ejemplo, transformando las plantas con una construcción que contienen el gen SnRK en una orientación sentido, bajo el control de un promotor (por ejemplo, CsVMV o Ubi1), la expresión del cADN del gen SnRK y la tolerancia a la sequía pueden ser mejoradas o la composición de la planta alterada. Esto puede tener ventajas particulares para alterar la tolerancia a la sequía y la proporción de almidón/aceite en las cosechas de la raíz. En algunas modalidades, las plantas transformadas con construcciones que contienen el gen SnRK también pueden incluir heterólogos adicionales o genes alterados que mejoran adicionalmente la resistencia a la pérdida del agua, la tolerancia a la sequía, la asimilación del carbono, el crecimiento y desarrollo de la planta, el bioensamble de ácidos grasos, y el crecimiento de la raíz en estas plantas.

Alternativamente, la expresión del gen SnRK puede ser silenciada hasta cierto grado por el fenómeno antisentido o de co-supresíón (Transcambio) (De Lange y asociados, 1995; Mol y asociados, 1990; Jorgensen y Napoli, 1994; Kinney, 1995; Vaucheret y asociados, 1998; Taylor, 1998). Por ejemplo, silenciar el gen SnRK de una manera específica en la semilla puede dar como resultado la reducción en la acumulación del gen SnRK. Esto podría tener aplicaciones para reducir el contenido o proporción del almidón, azúcar, y/o aceite en las cosechas de la raíz de la semilla para mejorar la estabilidad durante el almacenamiento.

Algunas de las manipulaciones y resultados que son posibles utilizando el gen SnRK o una parte del mismo, incluyen, pero no están limitados a, los siguientes: semillas con contenido de aceite aumentado o disminuido; hojas que contienen contenido de azúcar o almidón aumentado o disminuido; aceites de semilla con una composición alterada de ácidos grasos; plantas que exhiben pérdida de agua disminuida; plantas que exhiben una capacidad mejorada o alterada para cumular los compuestos de almacenamiento en otros órganos de almacenamiento (por ejemplo, tubérculos, raíces, y hojas); y plantas que tienen un crecimiento de la raíz o biomasa aumentados.

Varias de las c i nasas SnRK2 y SnRK3 han mostrado jugar roles críticos en la respuesta a los esfuerzos abióticos a través de la cascada de señalización ABA. Esto sugiere alguna posibilidad de que algunas cinasas SnRK puedan funcionar como un regulador del metabolismo de los lípidos de la planta determinado debido al rol vital del ABA en este metabolismo. Durante la germinación de la semilla, el ABA disminuye la transcripción de los genes comprendidos en la beta-oxidación del ácido graso y el ciclo de glioxilato, los cuales son trayectorias esenciales para la conversión del lípido, triacilglicerol, en la sacarosa durante el almacenamiento (S.L. Pritchard y asociados, Plant J. 2002, 31: páginas 639 a 647). Por otra parte, el ABA aumenta y se comporta como un regulador positivo para la síntesis de triacilglicerol durante el desarrollo del embrión. Se ha mostrado que la reducción de ABA por medio de la inmuno-regulación específica de la semilla da como resultado menor producción de aceite de semilla de tabaco (J. Phillips y asociados, EMBO J. 1997, 16: páginas 4489 a 4496). Por el contrario, el tratamiento de embriones de maíz inmaduros con ABA (4 µ?) elevó las actividades de las aciltransferasas grasas y por lo tanto aumento el rendimiento del aceite (F. Pacheco-Moisés y asociados, Plant Physiol. 1997, 114: páginas 1095 a 1101). Este efecto ha sido observado de muchas otras especies incluyendo Arabidopsis, Brassica (napus, júncea y rape), cacahuate, zanahoria, trigo, brotes, almendras y cacahuate (Arachis hypogaea). No obstante, todavía permanece desconocido si cualquiera de las cinasas SnRK es portadora de la regulación de ABA de la síntesis del aceite de la semilla.

En un intento para identificar aquellas cinasas clave comprendidas en la producción de aceite de la semilla, se utilizó un método genético inverso. Este método está basado en la selección de la inserción del T-ADN de SALK en los genes, seguido por la determinación del impacto de la eliminación del gen en el contenido de aceite de la semilla y el rendimiento de la semilla. Después de la selección de gran escala, el rol del gen SnRK2-6 (At4g33950) en la producción del aceite de la semilla no estaba descubierto. Este gen, también llamado OST1 (OPEN STOMATA 1), demostró anteriormente que codifica la proteína que posee la actividad de cinasa de la proteína de serina/treonina dependiente del calcio y regula la apertura de la estoma portada por el ABA (Mustilli y asociados, 2002). La desactivación de este gen mediante la inserción del T-ADN dio como resultado una reducción del 24% al 50% en el rendimiento de la semilla bajo condiciones de deshidratación . Además, una disminución del 7% al 25% del contenido de aceite de la semilla fue detectada en la línea eliminada SALK-008068. Sin embargo, el contenido de proteína solamente mostró un cambio pequeño entre los homozigotes de las plantas para la inserción (21.3%) y segregantes nulos (20.9%), indicando que el gen SnRK2-6, un miembro del subgrupo SnRK2a, actúa como un regulador positivo para la producción de aceite de la semilla.

El gen SnRK2-6 fue identificado anteriormente como un regulador de la conductancia de la estoma portada por ABA, la cual es preferentemente expresada en la estoma y los tejidos vasculares en la Arabidopsis (Mustilli y asociados, 2002; Fujii y asociados, Plant Cell 2007, 19: páginas 485 a 494). Los estudios genéticos inversos en la presente invención descubrieron su rol en la producción de aceite de la semilla.

El gen SnRK2-6 fue expresado ectópicamente bajo un promotor constitutivo, CsVMV, en la Arabidopsis. La expresión ectópica forzada del gen SnRK2-6 por el CsVMV puede interrumpir el patrón altamente localizado espacialmente de expresión del gen SnRK2-6 operado por el promotor natural, originando un patrón diferente al normal. Dicha perturbación puede influir en el crecimiento y metabolismo de las plantas.

Haciendo referencia a la figura 1, la sobre-expresión del gen SnRK2-6 en la Arabidopsis fue demostrada que promueve el crecimiento de la hoja, y además aumenta el número de brotes laterales. Adicionalmente, la pérdida de agua mostró que era substancialmente reducida en las plantas transgénicas extirpadas comparadas con las plantas de tipo natural que demuestran que la sobre-expresión del gen SnRK2-6 puede reducir el índice de transpiración en las partes aéreas de las plantas. En contraste, la eliminación de este gen aceleró la pérdida de agua, como se muestra en la figura 3.

Como se muestra en la figura 4, la asimilación aumentada de carbono en las plantas transgénicas de Arabidopsis puede demostrar que la sobre-expresión del gen SnRK2-6 puede promover el crecimiento de las plantas. Más específicamente, las plantas transgénicas de Arabidopsis que sobre-expresan el gen SnRK2-6 mostraron un aumento dramático del contenido de fructosa, glucosa y sacarosa en las hojas transgénicas bajo condiciones normales de invernadero. El contenido total de azúcar en las hojas transgénicas fue del doble que el de las hojas de tipo natural. El contenido de almidón de las plantas transgénicas fue realmente del 156% del nivel de tipo natural. Haciendo referencia a las figuras 4 y 5, la eliminación del gen SnRK2-6 no afectó grandemente ya sea el contenido de azúcar o almidón soluble. Colectivamente, estos resultados indican que la expresión constitutiva del transgen SnRK2-6 puede aumentar la actividad fotosintética de la hoja conduciendo a una asimilación aumentada del carbono.

La figura 6 muestra un cambio dramático en la composición de ácido graso en las hojas tra nsg én icas . Dos ácidos grasos trienóicos, 16:3 y 18:3, en las hojas de las plantas transgénicas aumentaron en un 81% y 26%, respectivamente, en relación con las plantas de tipo natural, indicando que los procesos de des-saturación son fortalecidos por el transgen.

Consistente con la actividad fotosintética aumentada en las hojas, fue detectado un aumento drástico del rendimiento de la semilla en las plantas transgénicas. Comparado con las plantas de tipo natural, las plantas transgénicas mostraron un aumento del 24%, 16% y 35% en el rendimiento de la semilla, respectivamente, bajo condiciones normales, condiciones medias de sequía, y condiciones de sequía severa (figura 7). Los resultados sugieren que el transgen no solamente mejora la tolerancia a la sequía de las plantas, sino también altera otros procesos fisiológicos, conduciendo a una producción de semilla aumentada bajo condiciones normales de crecimiento.

El análisis del aceite de la semilla mostró que la expresión conducida por el CsVMV del gen SnRK2-6 no dio como resultado un cambio importante en el contenido de aceite de la semilla. Sin embargo, la producción general de aceite de la semilla aumentó por el transgen debido al rendimiento aumentado de la semilla.

Tomados juntos, la sobre-expresión constitutiva del gen SnRK2-6 aumentó drásticamente el contenido de azúcares y almidón solubles y la biosíntesis de lípidos alterada en las hojas de Arabidopsis. Esto resultó adicionalmente en un aumento grande en el rendimiento de la semilla tanto bajo condiciones normales como condiciones de sequía.

Como se muestra en la figura 10, la biomasa de la raíz aumentada en las plantas de maíz transgénicas puede demostrar que la sobre-expresión del gen SnRK2-6 puede promover el crecimiento de la raíz. Las plantas de maíz transgénicas que sobre-expresan el gen SnRK2-6 mostraron un aumento dramático en la biomasa de la raíz (por ejemplo, del 11%, 25%, 92%, y 15%) en comparación con las plantas nulas. Estos resultados indican que la cinasa SnRK2-6 puede aumentar el crecimiento de la raíz. Dicho mecanismo puede estar asociado con el aumento en la tolerancia a la sequía del maíz.

Las plantas particularmente preferidas para la modificación de acuerdo con la presente invención incluyen, Arabidopsis thaliana, borraja (Borago spp.), aceite de Cañóla, ricino (Ricinus communis), grano de cacao {Theobroma cacao), maíz (Zea mays), algodón (Gossypium spp), Crambe spp., Cuphea spp., linaza (Linum spp.), Lesquerella y Limnanthes spp., Linola, nasturtio (Tropaeolum spp.), Oenothera spp., oliva (Olea spp.), palma (Elaeis spp.), cacahuate (Arachis spp.), semilla de colza, azafrán (Carthamus spp.), frijol de soya (Glycine y Soya spp.), girasol (Helianthus spp.), tabaco (Nicotiana spp.), Vernonia spp., trigo (Triticum spp.), cebada (Hordeum spp.), arroz (Oryza spp.), avena (Avena spp.) sorgo (Sorghum spp.), centeno (Sécale spp.) y otros miembros de la familia Cramineae.

La presente invención es particularmente útil cuando es utilizada para modificar el rendimiento o composición de la semilla de aceite producida de los cultivos de semilla de aceite. Las cosechas de semilla de aceite son especies de plantas que tienen la capacidad de generar aceites comestibles útiles industrialmente de rendimientos importantes comercialmente, y que incluye muchas de las especies de plantas de la lista anterior. Dichas cosechas de semilla de aceite son bien conocidas para los expertos en la técnica.

El gen SnRK2-6 puede ser introducido con uno o más de otros genes que confieren características deseables a las plantas. Por ejemplo, el gen de tolerancia al esfuerzo o de tolerancia a la sequía pueden, opcionalmente, ser introducidos en combinación con el gen SnRK2-6.

La presente invención se describió adicionalmente mediante el uso de los siguientes ejemplos ilustrativos.

EJEMPLOS Ejemplo 1: Identificación de la inserción del T-ADN dentro de los genes SnRK de Arabidopsis por PCR De acuerdo con la similitud de secuencia, las cinasas SnRK de Arabidopsis pueden ser divididas en tres subgrupos, SnRK1, SnRK2 y SnRK3. El subgrupo SnRK1 incluye tres cinasas codificadas por At3g01090, At3g29160, y At5g39440, respectivamente. El subgrupo SnRK2 consiste de diez miembros correspondientes a los genes At4g40010, At2g23030, At1g60940, At1g10940, At5g63650, At5g08590, At1g78290, At3g50500, At5g66880, y At4g33950, respectivamente. El subgrupo SnRK3 es el más grande con 25 miembros codificados por los genes: At5g57630, At3g17510, At1g48260, At4g24400, At5g35410, At2g26980, At1g30270, At1g01140, At4g14580, At3g23000, At2g38490, At5g01820, At2g30360, At2g34180, At1g29230, At5g45810, At4g18700, At4g30960, At5g45820, At5g58380, At5g07070, At5g001810, At2g25090, At5g25110, y At5g1093O.

Las líneas con la inserción de T-ADN en los genes SnRKs, las plantas homozigóticas, heterozigóticas y nulas para la inserción fueron seleccionadas por PCR como se muestra en las Tablas 1 y 2. El ADN genómico utilizado en las reacciones PCR fue aislado de las hojas de Arabidopsis. Como ejemplo, los cebadores GSP108 y LBa1 fueron utilizados para seleccionar plantas portadoras de la inserción del T-ADN dentro del SnRK2- 6 (At4g33950) en SALK_008068. Por otra parte, los cebadores GSP108 y GSP124, dos cebadores específicos del gen de At4g33950, fueron utilizados para determinar si una copia de tipo natural del gen está presente en los segregadores de SALK 008068.

Tabla 1: La familia del gen SnRK y las líneas de inserción T-ADN de SALK correspondientes.

Nombre del Gen Lineas SALK Posición de Inserción Específica del gen cebador Grupo SnRKl (3) At3g0109O(Akinl0) At3g29160(Akinll) At5g39440 Grupo SnRK2 (10) At4g40010 (SnRK2-7) SALK 042333 (SI) intrón GSP101 At2g23030 (SnRK2-9) SALK_152137(S25) exdn GSP127. y GSP126* Atlg60940(SnRK2-10) SALK 064987 (S3) 300-UTR3 Atlgl0940 (SnRK2-4) SALK 080588 (S4) exdn GSP103 At5g63650 (SnRK2-5) SALK_075624(S5) exón GSP104 At5g08590 (SnRK2-l) Atlg78290 (SnRK2-8) SALK 031421 (S7) intrón GSP106 SALK_069354 (S8) exón GSP106 At3g50500 (SnRK2-2) At5g66880(SnRK2-3) SALK 096546 (S9) exón GSP107 At4g33950 (SnRK2-6) SALK_O08068(S10) intrón GSP108: y GSP124* Grupo SnRK3 (25) At5g57630(CEPK21) At3gl7510(CIPKl) Atlg48260 (CEPK17) SALK_062790 (S27) exón GSP131 y GSP130* At4g24400 (CIPK8) At5g35410(CIPK24,SOS2) SALK 016683 (Sil) intrón GSP109 At2g26980 (CIPK3) SALK 033968 (SI 2) exón SALK_064491 (S12-1) GSP122, GSP123 y GSP121* Atlg30270 (CTPK23) SALK 032341 (S13) intrón GSP110 AtlgOlWO (CIPK9) SALK 014699 (S 14) intrón GSP111 At4gl4580 (CIPK4) SALK 009893 (S15) exón GSP112 At3g23000(CIPK7) SALK 055008 (S16) exón GSP113 At2g38490 (CEPK22) SALK_135490 (S28) exón GSP133; y GSP132* At5g01820(CEPK14) SALK 009699 (SI 7) exón GSP114 At2g30360 (CIPK11) SALK_055565 (SI 8) exón GSP115 y GSP125* At2g34180 (CEPK13) SALK 124748 (S19) exón GSP116 Atlg29230 (CIPK18) SALK 011025 (S20) 300-UTR5 GSP117 At5g45810(CEPK19) SALK 044735 (S21) exón GSP118 At4gl8700 (CIPK12) SALK_039840 (S22) 1000-P At4g30960 (CEPK6) At5g45820 (CEPK20) SALK_040637 (S23) 1000-P GSP119 At5g58380 (CIPK10) SALK_111320 (S24) exón GSP 120 At5g07070 (CEPK2) At5g01810 (CIPK15) At2g25090 (CIPK16) At5g25110 (CIPK25) SALK_079011 (S29) exón GSP 135 y GSP134* At5gl0930 (ClPK5) SALK_084456 (S26) exón GSP 128 y GSP129* "*" permanece para el GSP (cebador específico del gen) el cual tiene la misma dirección que el LBa1 ; "S#" es el número de muestra interno DAS.

Tabla 2: Las secuencias de nucleótído de los cebadores específicos de gen y LBa1 Nombre del cebador Secuencia de nucleótído LBal 5 -TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG-31 GSP101 5 '-TC IXJGTTCCGGTAACTTTGGA-3 ' GSP 103 5 '-CCAACGACGACTTCTTTCTT-3 * GSP104 5'-TTGGTCAATTGCGTAGATAAAG-3 ' GSP106 5'-GCAAAGCAGCTTCCCAAGAAGA-3' GSP107 5 '-CTCCGCTACTGTCAATGTCGAT-3 * GSP108 5 '-GCAGTGAGTGGTCCAATGGATT-3 ' GSP109 5 '-GCTCAAG AAGC AAATCTTCC AATC-3 ' GSP 110 5 '-TCTCGCTTGCTGTTACTCGCTT-3 ' GSP1 11 5 -CCTTAAAACCAGGCAGGCACTA-3 ' GSP112 5 '-ATCACAGGGACAGTTCTtCTCG-3 ' GSP113 5 '-TCAGGCACCATTTTCTCCTTCC-3 ' GSP114 5 -CCGAATCCTCCCAATTTGTCTG-3 ' GSP115 5 '-AGAAACC AAATCCAACCAACG A-3 ' GSP116 5 '-CCC AACGCCAATACAATTCATG-3 ' GSP117 5 '-TTTCTCCAGCTCTGGTCTGAGTTC-3 ' GSP118 5 '-GAAG AAGCAGGATCAGAGCAATCA-3 ' GSP119 5 -GT GTTTCCTTGCCATTTCCAA-3 ' GSP120 5 -GTAAGCTCATCTTTCTCACCCTGC-3 ' GSP121 5 '-TCGGAGACAGCAAGTGAAACG-3 ' GSP 122 5 -TTTTG AACATCGAAACCGAG A-3 ' GSP123 5 '-GAAG ACTTGGCGCTACTTGGAA-3 ' GSP 124 5 -CCGCTACTGTCGATGTCAAGA-3 ' GSP125 5 '-ATGCCAGAGATCGAGATTGCC-3 ' GSP 126 5 '-TGGTG AAGGATTTAGGATTTGG-3 ' GSP127 5 -TTATCTGATCCAAGCGATTCGA-3 ' GSP129 5 '- ATGGAGGAAGAACGGCGAGTTC-3 ' GSP 130 5 '-GATGATGAGCCCAGCTCATTCA-3 ' GSP131 5 -GGTGATAAAGGG AATGCGTGTT-3 ' GSP 132 5 '-A ACCGGTTGGTTAATCAAACG A-3 ' GSP 133 5 '-TGGCCGAAGACTCTAATTCTTC-3 ' GSP 134 5 '-TATGATTATCACCGTGCCACGA-3 ' En combinación con el LBal (el cebador del límite izquierdo del T-ADN), GSPs fueron utilizados para la selección PCR de las plantas portadoras de la inserción T-ADN dentro de los genes SnRK.

Para establecer la función de cada cinasa en la producción del aceite de la semilla, los perfiles del aceite en las semillas de las líneas SALK portadores de la inserción dentro de los genes de cinasa fueron determinados por cromatografía de gas. Una evaluación mejor del impacto ocasionado por la interrupción de los genes de cinasa, las hermanas nulas de las mismas líneas fueron utilizadas como control. Teóricamente, las hermanas nulas tienen una similitud mayor en el fondo genético a otros segregantes homozigóticos y heterozigóticos para la inserción comparada con los del tipo natural.

Ejemplo 2: Análisis del éster metílico de ácido graso de la semilla de Arabidopsis Extracción y Derivación de Semillas de Arabidopsis Las semillas de Arabidopsis maduras fueron recolectadas y fue removida toda la materia de la planta que no eran las semillas. Del total de semillas recolectadas, se tomaron alícuotas de ~10 mg y fueron distribuidas en una placa de 96 depósitos con capacidad de 1 mi. Las mediciones de peso precisas fueron obtenidas mediante el uso de un balance analítico con una exactitud de +/- 2 g y registradas. La placa del depósito fue enjuagada con hexano antes de utilizarse y dos cuentas de homogeneizadores de acero inoxidable con un diámetro de 4 mm fueron colocadas dentro de cada depósito. Después de la distribución de la muestra, se abastecieron en cada depósito 0.4 mi de hexano con un contenido de 75 ppm de heptadecanoato de metilo y 0.2 mi de metóxido de sodio 0.5 M. La placa del depósito fue entonces tapada y colocada en un agitador vertical durante dos minutos en una cantidad de 500 golpes por minuto y luego cambió a 58 minutos en una cantidad de 250 golpes por minuto. Una vez que estuvo completa la agitación, la placa del depósito fue entonces centrifugada durante cinco minutos en 5600 rcf. Después de la centrifugación, la capa del extracto de hexano superior fue tomada y colocada en otra placa de 96 depósitos. Esta extracción se realizó dos veces más con 0.4 mi de hexano, combinando cada extracto subsecuente con el primero. La segunda y tercera extracciones fueron cambiadas en condiciones de agitación vertical a 30 minutos en 250 golpes por minuto por extracción. Los extractos de 1.2 mi de hexano combinados fueron diluidos 10 veces en otra placa de 96 depósitos para el análisis de GC-FID.

Análisis de Éster Metílico de Ácido Graso (FAME) Los ésteres metílicos de ácido graso resultantes de los lípidos de la semilla de Arabidopsis fueron resueltos en una columna capilar SGE BPX70 (15 m, DI 0.22, df 0.25) utilizando un gradiente de tres rampas de temperatura con 1 ml/minuto de hidrógeno como el gas portador (sostenido a 60°C durante 1.34 minutos, 41.3°C/minuto hasta 150°C, 9.1°C/minuto hasta 180°C, 41.3°C/minuto hasta 220°C sostenido para 1.86 minutos). La temperatura de entrada fue de 230°C y la temperatura de detección de ionización de flama fue de 240°C. La identificación y cuantificación del análisis FAME por el tiempo de retención fue lograda con un estándar de referencia de aceite de semilla de colza (fabricado por Matreya) con 75 ppm de heptadecanoato metílico.

Ejemplo 3: Análisis de éster metílico de ácido graso de la hoja de Arabidopsis Extracción y Derivatización de Lípidos de Hoja de Arabidopsis Las hojas congeladas de Arabidopsis fueron molidas a un polvo fino debajo de nitrógeno líquido utilizando un mortero y maja. De este polvo, se tomaron alícuotas de ~50 mg y se distribuyeron en una placa de 96 depósitos con capacidad de 1 mi. La placa de depósito fue enjuagada con hexano antes de utilizarla y se colocó una cuenta de homogeneización de acero inoxidable con un diámetro de 4 mm dentro de cada depósito. Después de la distribución de la muestra, se abastecieron en cada depósito 0.5 mi de hexano y 0.25 mi de metóxido de sodio 0.5 M. La placa de depósitos entonces fue tapada y colocada en un agitador vertical durante 30 minutos en una cantidad de 250 golpes por minuto. La placa de depósitos entonces fue centrifugada durante cinco minutos en 5600 rcf. Después de la centrifugación, las capas del extracto de hexano superiores fueron tomadas y colocadas en otra placa de 96 depósitos para el análisis por medio de la ionización de flama del cromatógrafo de gas.

Análisis de FAME Los lípidos de la hoja de Arabidopsis de ésteres metílicos de ácido graso resultantes fueron solucionados en una columna capilar SGE BPX70 (15 m, DI 0.22, df 0.25) utilizando un gradiente de temperatura de tres rampas con 1 ml/minuto de hidrógeno como el gas portador (sostenido en 60°C durante 1.34 minutos, 41.3°C/minuto hasta 150°C, 9.1°C/minuto hasta 180°C, 41.3°C/minuto hasta 220°C sostenido por 1.86 minutos). La temperatura de entrada fue de 230°C y la temperatura del detector de ionización de flama fue de 240°C. La identificación del FAME por medio de tiempo de retención fue lograda con un estándar de referencia de aceite de semilla de colza (fabricado por Matreya).

Ejemplo 4: Análisis total de proteína de semilla de Arabidopsis Digestión Acida de Semillas de Arabidopsis (hidrólisis de proteína) Se recolectaron semillas maduras de Arabidopsis y se removió toda la materia de la planta que no eran las semillas. Del total de semillas recolectadas, se tomaron alícuotas de -20 mg y fueron distribuidas en dos tubos de centrífuga de 2 mi que podían someterse al autoclave con tapas de resorte con empaques o de hule. Las mediciones precisas del peso fueron obtenidas mediante el uso de un equilibrio analítico con y una exactitud de +/- 2 pg y registradas. Se agregaron diez cuentas de vidrio de 4 mm lavadas con ácido a cada tubo de centrífuga antes de utilizase. Después de la distribución de la muestra, los tubos de centrífuga fueron colocados en un agitador vertical en 500 golpes por minuto durante cinco minutos. Luego, se les agregaron 1.4 mi de ácido clorhídrico 6 N con fenol al 0.1% y 2-m erca pto eta n o I al 1% a cada muestra. Los tubos de la centrífuga entonces se volvieron a colocar en un agitador vertical durante 15 minutos en 500 golpes por minuto. Después de que se había terminado la agitación vertical, los tubos de la centrífuga fueron colocados en un bloque de calentamiento a una temperatura de 100°C durante 24 horas completando la digestión. Una vez que fue terminado el proceso de digestión, los tubos de centrífuga fueron enfriados a temperatura ambiente y el filtrado digerido a través de un filtro de vidrio de 0.4 pm. Se diluyeron 0.1 mi del digerido filtrado en un frasco de inyección de vidrio de 1.5 mi con 0.3 mi de hidróxido de sodio 2 N, 0.6 mi de agua, y 0.1 mi de agua con 1000 pmol/µ? de norvalina como un estándar interno para el análisis de Detección de Fluorescencia de Cromatografía Líquida de Alto Rendimiento.

Derivatiz ación de los Residuos de Aminoácidos Los aminoácidos primarios fueron derivados con o-ftalaldehído (OPA). Los aminoácidos secundarios fueron derivados con cloroformato de 9-fluorenilmetilo (FMOC). Ambas reacciones de derivatización fueron logradas antes de la columna utilizando el circuito de inyección de HPLC. Las muestras primero fueron reguladas con un regulador de borato 0.4 N en un pH de 10.2 (4 µ? de regulador para una muestra de 1 µ?) y luego mezclados con OPA y FMOC (1 µ? de OPA y 1 µ? de FMOC en ese orden). Entonces las muestras fueron inyectadas para el análisis.

Análisis de Residuos de Aminoácidos por HPLC-FLD Los residuos de aminoácidos derivados fueron resueltos en una columna de fase inversa C18(2) de 150 x 3.0 mm, 5 pm con un gradiente de elución binario de 40°C. La fase acuosa (eluyente A) consistió de 40 mM de regulador de fosfato de sodio en un pH de 7.8 y la fase orgánica (eluyente B) consistió de acetonitrilo:metanol:agua (45:45:10 v/v/v). El sistema de gradiente del solvente fue de 0 a 1.9 min A/B (%) 100:0; de 1.9 a 18.1 min A/B (%) 43:57; de 18.1 a 18.6 min A/B (%) 0:100; de 18.6 a 22.3 min A/B (%) 0:100; de 22.3 a 23.2 min A/B (%) 100:0; de 23.2 a 26 A/B (%) 100:0. El flujo fue una constante de 2 ml/minuto.

Los parámetros del detector fluorescente fueron ajustados para la excitación en 340 nm y la emisión en 450 nm por los primeros 15 minutos del análisis. Entonces el detector cambia a 266 nm de excitación y 305 nm de emisión para el resto del tiempo del análisis. Los primeros 15 minutos del análisis son optimizados para la detección de los residuos derivados de OPA y el resto para los residuos del derivado FMOC.

La identificación y cu antificación de los residuos de aminoácidos fue calibrada con mezclas estándar de aminoácidos (comprados de Agilent Technologies) con un contenido de 90.9 pmol/µ? de estándar interno de norvalina. Los residuos cuantificados fueron de ácido aspártico, ácido glutámico, serina, histidina, glicina, treonina, arginina, alanina, tirosina, valina, metionina, fenilalanina, isoleucina, leucina, lisina, y prolina. La masa recuperada de cada residuo fue calculada, sumada dando una masa de proteína total aproximada, y luego calculada en un porcentaje de proteína para cada muestra de semilla de Arabidopsis.

Ejemplo 5: Análisis total de almidón para la Arabidopsis fresca Las hojas frescas de Arabidopsis fueron molidas a un polvo fino bajo nitrógeno líquido moliendo el tejido en un mortero y maja. A las muestras se les extrajo el azúcar con un 80% de etanol antes del análisis de almidón. La digestión del almidón fue conducida con a-amilasa y amiloglucosidasa, respectivamente. La glucosa liberada fue detectada por el ensayo de enzima basado en peroxidasa y oxidasa de glucosa. El contenido de almidón fue calculado basado en la glucosa liberada con un ajuste de glucosa libre al almidón.

Ejemplo 6: Análisis del metabolito LC/MSMS El tejido de la hoja de Arabidopsis fue molido manualmente con nitrógeno líquido en un mortero y maja para obtener una muestra de polvo muy fino. Aproximadamente 100 mg del tejido de la hoja molido finamente fue extractado con una solución de 80:20 de metanol; HCI 0.1 N y mezclado bien resultando en una extracción de 350 mg/mL. Las muestras fueron centrifugadas para granular los particulados y un alícuota del sobrenadante que contenía los metabolitos extractados fue removido, diluido 1:10 en 80:20 acetonitrilo:agua con un contenido de isótopo estable de glucosa como un estándar interno, y analizado mediante cromatografía líquida con detección espectrométrica de masa de tándem (LC-MS/MS).

El análisis LC-MS/MS proporciona la selectividad y sensibilidad adecuadas para el análisis cuantitativo de los metabolitos primarios y secundarios en las matrices de complejo biológico tales como los extractos de tejido de semillas. Una separación cromatográfica líquida antes de la cuantificación de MS/MS es deseable para separar los compuestos de interés de los componentes de la matriz que pueden suprimir la respuesta/ionización del compuesto de interés. Varias técnicas están disponibles para ionizar los analitos incluyendo la ionización de electro-rocío positiva ( + ) o negativa (-) (ESI) y +/- ionización química atmosférica (APCI). El análisis MS/MS de los compuestos es esencialmente un proceso de cuatro pasos: 1) formación del ión molecular específico para el compuesto de interés; 2) selección de los iones moleculares; 3) formación de los iones del fragmento específico del compuesto; 4) detección de los iones del fragmento específico del compuesto. El eluyente de la columna LC es introducido en el MS, el cual realiza continuamente el proceso de cuatro pasos en un marco de tiempo de milisegundos.

El análisis LC-MSMS en este estudio fue realizado en un cromatógrafo líquido Agilent 1100 que tiene una interfase con un espectrómetro de masa de tándem de triple cuadrupolo 3000 Applied Biosystems Sciex™ equipado con una entrada de Rocío Turbolon™. Antes del análisis LC-MS/MS de los extractos del tejido de la semilla, se infundieron estándares de los metabolitos secundarios individuales (-10 pg/mL) y luego en el espectrómetro de masa (10 pL/minuto) con el objeto de establecer los siguientes parámetros: Q1 - m/z de +/- ión molecular DP - potencial de desintegración de acumulaciones para la formación máxima del ión molecular Q3 - m/z de los iones del producto generados del ión molecular CE - energía de colisión para la formación máxima de iones del producto CXP - salida potencial de células Se encontró que los metabolitos de Arabidopsis monitoreados en este estudio formaban el ión molecular [M-H]" esperado utilizando el ESI, Q1 del modelo negativo como se muestra en la Tabla 3 siguiente, Los iones del fragmento utilizados para la cuantificación de cada uno de los metabolitos se encuentran en la lista de la Tabla siguiente, Q3. La Tabla siguiente es una lista de parámetros de MSMS utilizados para cuantificar cada uno de los metabolitos (G1P = glucosa-1-fosfato, G6P = g I u co s a-6-f o sfato , ADP-g = adenosina difosfato-glucosa, GDP-g = guanosina 5'-difosfato-glucosa, UDP-g = uridina 5'-difosfato-glucosa).

Tabla 3: Iones de Fragmento m/z Analito Qi Q3 DP(V) CE(V) CXP(V) G6P 258.9 139.1 -34 -21 -6 G1P 258.8 240.9 -32 -18 -14 ADP-g 588.1 345.9 -35 -35 -22 GDP-g 604.2 361.8 -33 -36 -22 UDP-g 565.1 322.9 -35 -34 -22 Fructosa 179.0 113.1 -29 -12 -5 Glucosa 179.0 119.1 -30 -10 -5 Sacarosa 341.1 178.9 -56 -20 -10 Debido a la polaridad alta de los metabolitos de Arabidopsis de interés, una columna cromatográfica de fase líquida HILIC (gel TSK Amida 80, TOSOH Biosciences LLC, 100 x 2 mm, 5 µ?) fue utilizada para la separación. Se utilizó un gradiente lineal que comienza con 0:100 de agua:acetonitrilo HPLC que va hasta 100:0 de agua:acetonitrilo durante cuatro minutos en un rango de flujo de 500 L/minuto. Para mejorar la ionización del compuesto, el agua fue regulada con 10 mM de acetato de amonio.

La cuantificación fue lograda creando una gráfica de calibración para cada metabolito objetivo y utilizando el análisis de regresión lineal en cada extracto. La concentración encontrada en el extracto multiplicada por el factor de dilución (10) para obtener una concentración de nmol g"1 en la muestra. Todos los datos presentados son el promedio de seis duplicados, tres duplicados analíticos y dos duplicados de invernadero.

Ejemplo 7: Construcción del vector de expresión SnRK2-6 para la transformación de Arabidopsis Con el objeto de amplificar el gen SnRK2-6 de Arabidopsis, el ARN total (900 ng) aislado de las hojas de Arabidopsis fue utilizado para la síntesis de cADN de un solo hilo utilizando el Oligo dT20 como el cebador (equipo RT de Invitrogen SuperScriptIII). El sscADN fue amplificado adicionalmente utilizando un par de cebadores, 5'-TAA TTT CCA TGG ATC GAC CAG CAG TGA GT-3' y 5'-TTT TTT CCA TGG ATC ACA TTG CGT ACA CAA TCT CT-3', ambos de los cuales incluyen un sitio Neo I (subrayado). El gen SnRK2-6 amplificado fue entonces digerido con Neo I e insertado en el vector pDAB3731 de entrada de la compuerta. La orientación del inserto fue determinada mediante la elaboración de secuencia. La unidad de transcripción de la planta resultante (PTU) que comprende los cebadores CsVMV, SnRK2-6 y AtuORF24 3'-UTR fue clonado en un vector pDAB3725 de destino de compuerta binaria utilizando la reacción LR de la compuerta. El plásmido resultante, designado pDAB4504 (figura 11), fue utilizado para la transformación de la Agrobacterium.

Ejemplo 8: Región de Codificación Optimizada para la Planta SnRK2-6 Sintética La versión sintética de la secuencia de codificación de un gen SnRK2-6 de la Arabidopsis thaliana fue diseñado para hacer posible la producción de la proteína SnRK2-6 en plantas dicotiledóneas y monocotiledóneas transgénicas (por ejemplo, maíz). La secuencia básica de partida fue el Número de Acceso del Genbank At4g33950, que comprende una proteína que codifica la región descrita en la SEQ ID No:1, y que codifica la secuencia de la proteína descrita en la SEQ ID No:2.

Para producir una secuencia de ADN optimizada de la planta que codifica una proteína SnRK2-6, una secuencia de ADN fue diseñada para codificar la secuencia de aminoácidos de la proteína, utilizando un código genético redundante establecido de la tabla de inclinación del codón recopilada de las secuencias de codificación de la proteína de los genes encontrado en las plantas huésped particulares (maíz y dicotiledóneas). Las regiones de codificación de la proteína de los 706 genes del maíz (Zea mays) fueron extractados del Genbank, los cuales están disponibles en el Centro Nacional de Información de Biotecnología, la Biblioteca Nacional de Medicina de los Estados Unidos de América (Bethesda, MD), y la composición del codón fue calculada utilizando la función CodonFrequency del Paquete de Análisis de Secuencia de Wisconsin, que se consigue en Genetics Computer Group, Universidad de Wisconsin (Madison, Wl). Las tablas de uso del codón para el tabaco (codones 423,797 de Nicotiana tabacum) , algodón (codones 62,111 de Gossypium hirsutum; 62,111), frijol de soya (codones 362,096 de Glycine max), y cañóla (codones 195,005 de Brassica napus) están disponibles en el Instituto de Investigación de ADN Kazusa (JAPÓN).

Tabla 4A: Distribuciones del codón en genes del maíz y cuatro especies de dicotiledóneas.

A B C D E F G H I J % % % % Promedio Promedio Promedio Promedio %de %de %de %de Amlno- Codon Ponderado de la del Maíz del DicoAlgodón Cañóla Tabaco Frijol Ácido de la Planta tiledón Planta ALA (A) GCA 27.5 22.9 18 27.8 26.4 23.3 31.0 30.3 GCC 33.0 27.4 34 20.9 22.6 21.2 17.3 22.5 GCG DNU DNU 24 9.8 8.2 14.2 8.1 8.5 GCT 39.5 33 24 41.6 42.8 41.3 43.6 38.7 ARG(R) AGA 29.0 22.9 15 30.7 28.5 31.8 31.7 30.9 AGG 32.5 25.6 26 25.3 26.8 22.1 24.6 27.6 CGA DNU DNU 9 10.6 12.2 9.9 11.9 8.2 CGC 21.3 16.8 24 9.5 8.5 8.9 8.1 12.7 CGG DNU DNU 15 7,7 8.5 8.6 7.7 6.0 CGT 17.2 13.6 11 16.2 15.6 18.6 16.0 14.5 AS fN) AAC 59.5 59.5 68 51.0 51.9 62.6 39.4 50.0 AAT 40.5 40.5 32 49.0 48.1 37.4 60.6 50.0 ASP(D) GAC 49.9 49.9 63 36.7 35.1 42.5 31.1 38.1 GAT 50.1 50.1 37 63.3 64.9 57.5 68.9 61.9 CYS (C) TGC 58.4 58.4 68 48.7 53.1 49.2 42.6 50.0 TGT 41.6 41.6 32 51.3 46.9 50.8 57.4 50;0 END TAA DNU 30.1 20 40.2 39.1 38.5 42.6 40.7 TAG DNU 21.1 21 21.2 20.3 22.1 19.6 22.7 TGA 100.0 48.8 59 38.6 40.6 39.4 37.8 36.6 GLN (Q) CAA 46.7 46.7 38 55.5 57.4 50.0 58.9 55.5 CAG 53.3 53.3 62 44.5 42.6 50.0 41.1 44.5 GLU (E) GAA 39.8 39.8 29 50.5 52.4 43.6 55.7 50.5 GAG 60.2 60.2 71 49.5 47.6 56.4 44.3 49.5 GLY(G) GGA 26.1 26.1 19 33.2 29.9 36.4 34.6 31.9 GGC 29.8 29.8 42 17.5 18.3 16.2 16.2 19.3 GGG 18.0 18.0 19 17.0 19.0 15.2 15.4 18.4 GGT 26.1 26.1 20 32.3 32.7 32.1 33.7 30.4 HIS (H) CAC 52.7 52.7 62 43.4 41.0 49.6 38.3 44.8 CAT 47.3 47.3 38 56.6 59.0 50.4 61.7 55.2 ILE(I) ATA 18.3 18.3 14 22.7 20.4 21.1 25.8 23.4 ATC 45.7 45.7 58 33.3 36.1 42.7 24.6 29.9 ATT 36.0 36.0 28 44.0 43.5 36.2 49.6 46.7 Tabla 4B: Distribuciones del codón en genes del maíz y cuatro especies de dicotiledóneas.

A B C D E F G H I J % % % % Amino- Promedio Promedio Promedio Promedio Codón %de %de %de %de Ácldo Ponderado de la del Maíz del DicoAlgodón Cañóla Tabaco Frijol de la Planta tiledón Planta LEU (L) CTA DNU DNU 8 9.4 7.8 10.1 10.5 9.1 CTC 26.3 21.8 26 17.7 16.7 22.8 13.0 18.1 CTG 24.7 20.5 29 12.0 12.0 11.6 11.2 13.2 CTT 26.0 21.6 17 26.1 27.9 25.2 25.9 25.5 TTA DNU DNU 5 11.4 10.5 10.1 15.3 9.8 TTG 23.1 19.2 15 23.4 25.1 20.2 24.0 24.2 LYS (K) AAA 33.5 33.5 22 45.1 43.1 44.6 50.0 42.5 AAG 66.5 66.5 78 54.9 56.9 55.4 50.0 57.5 METfM) ATG 100.0 100.0 100 100 100.0 100.0 100.0 100.0 PHE(F) TTC 61.0 61.0 71 51.0 54.3 58.6 41.9 49.2 TTT 39.0 39.0 29 49.0 45.7 41.4 58.1 50.8 PRO (P) CCA 30.4 30.4 26 34.8 34.0 29.6 38.9 36.5 CCC 20.0 20.0 24 16.0 16.6 14.6 13.6 19.2 CCG 20.0 20.0 28 12.0 11.1 18.4 10.0 8.3 CCT 29.6 29.6 22 37.3 38.2 37.3 37.5 36.0 SER (S) AGC 24.9 19.0 23 15.0 16.4 16.0 12.5 15.1 AGT DNU DNU 9 15.9 15.2 14.1 17.3 17.1 TCA 23.6 18.0 16 20.1 18.9 18.2 22.6 20.6 TCC 25.8 19.7 23 16.4 17.8 16.7 14.1 16.9 TCG DNU DNU 14 8.4 9.5 10.7 7.2 6.1 TCT 25.7 19.6 15 24.2 22.1 24.3 26.2 24.2 THR(T) ACA 25.2 25.2 21 29.4 28.9 26.3 32.7 29.7 ACC 31.1 31.1 37 25.3 27.6 26.9 19.1 27.7 ACG 16.7 16.7 22 11.3 11.4 16.9 8.8 8.3 ACT 27.0 27.0 20 34.0 32.2 30.0 39.4 34.3 TRP(W) TGG 100.0 100.0 100 100 100.0 100.0 100.0 100.0 TYR(Y) TAC 61.3 61.3 73 49.6 49.4 59.4 41.4 48.2 TAT 38.7 38.7 27 50.4 50.6 40.6 58.6 51.8 VAL(V) GTA DNU DNU 8 13.0 11.5 10.8 18.3 11.5 GTC 28.9 25.9 32 19.8 20.2 24.1 17.0 17.8 GTG 37.3 33.4 39 27.8 26.7 28.3 24.3 32.0 GTT 33.7 30.2 21 39.4 41.5 36.8 40.4 38.7 Los usos del codón del gen natural para los genes del maíz se muestran en las Tablas 4A y 4B, Columnas E, y aquellos para los genes de dicotiledóneas se muestran en las Tablas 4A y 4B, Columnas de la G a la J. Los valores en las Columnas E y de la G a la J presentan las distribuciones (en % de uso para todos los codones de ese aminoácido) de codones sinónimos para cada aminoácido. Los codones más preferidos de cada tipo de planta están indicados con la letra en negrita, y la segunda, tercera, y cuarta, etc., selecciones de codones pueden ser identificadas cuando existen selecciones múltiples. Es evidente que algunos codones sinónimos para algunos aminoácidos se encuentran solamente rara vez en los genes de plantas dicotiledóneas (por ejemplo, CGG y TCG). También, algunas plantas dicotiledóneas difieren algo en la preferencia del codón para aminoácidos particulares (por ejemplo, codones de Asparagina y Fenilalanina). También será evidente que algunos codones sinónimos para algunos aminoácidos se encuentran solamente rara vez en las regiones de codificación de las proteínas de las plantas (por ejemplo, CGA y CTA). Además, las plantas de maíz y de dicotiledóneas difieren en el uso del codón (por ejemplo, el GCC del codón de Alanina ocurre más frecuentemente en los genes de maíz que en los genes de dicotiledóneas, mientras que el codón GCT de Alanina es más frecuentemente utilizado en los genes de dicotiledóneas que en los genes de maíz). Por lo tanto, es obvio que una región de codificación de la proteína diseñada para reflejar la composición óptima de genes del codón de un grupo de plantas puede tener una composición subóptima del codón para la expresión de otro grupo de plantas. Para derivar un conjunto de codones inclinados que comprenden los codones utilizados más ampliamente comunes para el maíz y las dicotiledóneas, se calculó un promedio de cada uno de los codones para los conjuntos de datos de plantas dicotiledóneas mostrados en la Columna F de las Tablas 4A y 4B.

El valor del % promedio de distribución para cada codón en los genes de maíz y dicotiledóneas fue calculado de los datos de las Tablas 4A y 4B, Columnas E y F, y se presenta como el Promedio de Plantas en las Tablas 4A y 4B, Columna D. Generalmente, los valores del % de uso de un codón considerado que se utiliza rara vez (por ejemplo, representado en aproximadamente el 10% o menos de las veces para codificar el aminoácido relevante en los genes de cualquiera de las plantas de maíz o dicotiledóneas) no fueron incluidos en el análisis. Estos valores del codón son indicados por DNU (No Utilizar) en las Tablas 4A y 4B, Columna D. En estos casos, el % total de valores de uso del codón para los aminoácidos individuales no totalizan el 100% en las Tablas 4A y 4B, Columna D.

Para equilibrar la distribución de las selecciones restantes del codón para esos aminoácidos, una representación del % Promedio Ponderado para cada codón fue calculado, utilizando la fórmula: % Promedio Ponderado de C1 = 1 / ( % C 1 + %C2 + %C3 + etc.) x % C1 x 100, en donde C1 es el codón en cuestión y el %C2, %C3, etc., representan los valores del % Promedio de Plantas para los codones sinónimos restantes, como se muestra en la Columna D de las Tablas 4A y 4B.

Las distribuciones de % Promedio Ponderado de las Plantas de los codones calculados para los genes de maíz y dicotiledóneas se presentan en las Tablas 4A y 4B, Columna C. De este modo, las identidades del codón de la Columna B, tomadas junto con los valores del % de distribución en la Columna C, comprenden la Tabla de Inclinación de la Planta Optimizada calculada de los genes de, maíz, algodón, cañóla, tabaco, y frijol de soya. El gen Optimizado de la Planta será determinado que tiene una distribución general del codón similar a la distribución del codón de las Tablas 4A y 4B, Columna C.

Para diseñar una secuencia Optimizada de la Planta que codifica una proteína SnRK2-6, una secuencia de ADN fue diseñada para codificar la secuencia de aminoácidos de la proteína, utilizando una Tabla de Inclinación del Codón Optimizado de la Planta Redundante recopilada de las secuencias de codificación de la proteína de dicotiledóneas y maíz. La secuencia de ADN SnRK2-6 natural (SEQ ID No:1) fue traducida en una secuencia deducida amino de la proteína SnRK2-6 (SEQ ID No:2), entonces la secuencia de la proteína fue traducida inversa en la secuencia de ADN Optimizada de la Planta utilizando el programa OptGene™, el cual se consigue comercialmente en Ocimum Biosolutions (Indianapolis, IN). Los refinamientos adicionales de la secuencia se hicieron para eliminar los sitios de reconocimiento de la enzima de restricción no deseables, los sitios de empalme del intrón de la planta potenciales, las carreras largas de los residuos A/T o C/G, y otros patrones que podrían interferir con la estabilidad del ARN, la transcripción, o traducción de la región de codificación en las células de la planta. Se hicieron otros cambios para introducir los sitios de reconocimiento de la enzima de restricción deseados, y para eliminar los Cuadros de Lectura Abierta internos largos (cuadros diferentes a +1) y generalmente estructuras de lazos de células madre estables. Estos cambios todos se hicieron dentro de las restricciones de retención de la composición del codón inclinado Optimizado de la Planta como se describió anteriormente. La secuencia Optimizada de la Planta que codifica la proteína SnRK2-6 es designada SnRK2-6 hv5, y la secuencia se describe como la SEQ ID No:3, que codifica la SEQ ID No:2.

La Tabla 5 compara las composiciones del codón de las regiones de codificación SnRK2-6 hv5 Optimizadas de la Planta con la Tabla Inclinada del Codón Optimizado de la Planta, demostrando de este modo el resultado del proceso de optimización.

Tabla 5: Comparación de las Composiciones del Codón de Regiones de Codificación SnRK2-6 Naturales, la Versión hv5 Optimizada de la Planta, y la Composición de Inclinación del Codón Optimizado de la Planta %de %de Promedio Aminoácido Codón SnRK2-6 SnR 2-6 Optimizado Natural hv5 optimizado de la Planta ALA (A) GCA 52.4 28.6 27.5 GCC 9.5 33.3 33.0 GCG 9.5 0.0 DNU GCT 28.6 38.1 39.5 ARG(R) AGA 35.0 30.0 29.0 AGG 35.0 30.0 32.5 CGA 15.0 0.0 DNU CGC 10.0 20.0 21.3 CGG 0.0 0.0 DNU CGT 5.0 20.0 17.2 ASN (N) AAC 33.3 60.0 59.5 AAT 66.7 40.0 40.5 ASP (D) GAC 33.3 53.3 49.9 GAT 66.7 46.7 50.1 CYS (C) TGC 16.7 66.7 58.4 TGT 83.3 33.3 41.6 END TAA 0.0 0.0 DNU TAG 0.0 0.0 DNU TGA 100.0 100.0 100.0 %de % de Promedio Aminoácido Codón SnRK2-6 SnRK2-6 Optimizado Natural hv5 optimizado de la Planta GLN (Q) CAA 54.5 45.5 46.7 CAO 45.5 54.5 53.3 GLU (E) GAA 55.2 37.9 39.8 GAG 44.8 62.1 60.2 GLY (G) GGA 52.6 26.3 26.1 GGC 21.1 31.6 29.8 GGG 5.3 15.8 18.0 GGT 21.1 26.3 26.1 fflS(H) CAC 33.3 58.3 52.7 CAT 66.7 41.7 47.3 ILE(I) ATA 37.9 17.2 18.3 ATC 31.0 48.3 45.7 ATT 31.0 34.5 36.0 LEU (L) CTA 16.7 0.0 DNU CTC 13.3 33.3 26.3 CTG 13.3 0.0 24.7 CTT 13.3 33.3 26.0 TTA 30.0 0.0 DNU TTG 13.3 33.3 23.1 LYS (K) AAA 35.3 29.4 33.5 AAG 64.7 70.6 66.5 MET (M) ATG 100 100 100.0 PHE (F) TTC 61.5 61.5 61.0 %de % de Promedio Codón SnRK2-6 SnR 2-6 Optimizado Aminoácido Natural hv5 optimizado de la Planta TTT 38.5 38.5 39.0 PRO (P) CCA 23.8 42.9 30.4 CCC 9.5 23.8 20.0 CCG 23.8 0.0 20.0 CCT 42.9 33.3 29.6 SER(S) AGC 24.0 24.0 24.9 AGT 20.0 0.0 DNU TCA 20.0 16.0 23.6 TCC Í2.0 28.0 25.8 TCG 8.0 0.0 DNU TCT 16.0 32.0 25.7 THR(T) ACA 15.4 30.8 25.2 ACC 15.4 38.5 31.1 ACG 15.4 0.0 16.7 ACT 53.8 30.8 27.0 TRP(W) TGG 100 100 100.0 TYR(Y) TAC 30.8 61.5 61.3 TAT 69.2 38.5 38.7 VAL(V) GTA 8.3 0.0 DNU GTC 8.3 29.2 28.9 GTG 12.5 37.5 37.3 GTT 70.8 33.3 33.7 Para completar el diseño, una Secuencia 5' Sin Traducir que contiene los codones de Detención de traducción de todos los tres cuadros de lectura del hilo superior, e iniciada por una secuencia de reconocimiento para la enzima de restricción Bbs /, fue agregado al extremo 5' de la secuencia SnRK2-6 hv5. Adicionalmente, una Secuencia No Traducida 3' que contiene el codón de Detención de traducción en todos los seis cuadros de lectura abierta, y terminada por la secuencia de reconocimiento para la enzima de restricción Sac /, fue agregado al extremo 3' de la secuencia SnRK2-6 hv5. Esta secuencia, denominada SnRK2-6 hv6, se describe como la SEQ ID No:4. La síntesis de la secuencia designada SnRK2-6 hv6 fue contratada para PicoScript en Houston, Texas.

Ejemplo 9: Construcción del vector de expresión Sn K2-6 para la transformación del maíz El gen SnRK2-6 se expresa de manera heteróloga en el maíz, su secuencia de cuadro de lectura abierta fue el codón optimizado de acuerdo con el uso del codón hemicot, designado de esta manera SnRK2-6 hv. Adicionalmente, la secuencia de nucleótidos correspondiente a las "tres detenciones del cuadro" y "consenso del maíz" fueron introducidos en la terminal-5' del gen SnRK2-6 hv, y "seis detenciones del cuadro" a su terminal-3'. Para facilitar la clonación posterior, se agregaron dos sitios de restricción, Bbs I y Sac I, en el extremo 5'- y 3'- de la secuencia. Entonces, la secuencia completa fue sintetizada, la cual se describe con mayor detalle más adelante.

El fragmento sintetizado anterior digerido con Bbs I y Sac I fue insertado dentro del Acc65 I- y el Sac I- digerido pDAB4005. Esto creo una unidad de transcripción de planta (PTU) que contiene el promotor del maíz Ubi1, SnRK2-6 hv y ZmPer5 3'UTR. El PTU fue cortado del pDAB4005 recombinante a través de la digestión con Not I e insertado dentro del vector de destino pDAB3878. La orientación e integridad del plásmido resultante, designado pDAB7702, el cual se muestra en la figura 12, fue determinada mediante la elaboración de secuencia.

Ejemplo 10: Transformación de Agrobacterium y Arabidopsis La transformación fue realizada como lo describieron Weigel y Glazebrook (2002).

Condiciones de Crecimiento de la Arabidopsis thaliana Se permitió que la semilla recientemente recolectada se secara durante siete días a temperatura ambiente en la presencia de un secante. La semilla fue suspendida en una solución de Agarosa al 0.1%, la cual se consigue comercial mente en Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO.). La semilla suspendida fue almacenada a una temperatura de 4°C durante dos días para completar los requerimientos de inactividad y asegurar la germinación sincrónica de la semilla (estratificación).

La mezcla Sunshine LP5, la cual se consigue comercialmente en Sun Gro Horticulture Inc. (Bellevue, WA) fue cubierta con vermiculita fina y sub-irrigada con una solución de Hoaglan hasta que se mojó. La mezcla de la tierra se permitió que se drenara durante 24 horas. La semilla estratificada fue sembrada en la vermiculita y cubierta con domos de humedad, tales como los que comercialmente se consiguen en KORD Products (Bramalea, Ontario, Canadá) para un período de cinco a siete días.

Las semillas fueron germinadas y las plantas cultivadas en un Conviron (modelos CMP4030 y CMP3244), los cuales se consiguen comercialmente en Controlled Environments Limited (Winnipeg, Manitoba, Canadá) bajo condiciones de días largos (16 horas de luz/8 horas de oscuridad) en una intensidad de la luz en un rango de aproximadamente 120 mol/m2 seg hasta aproximadamente 150 mol/m2 seg bajo temperatura constante de aproximadamente 22°C y una humedad en un rango de aproximadamente el 40% hasta aproximadamente el 50%. Las plantas fueron mojadas inicialmente con solución de Hoaglan y posteriormente con agua desionizada para mantener la humedad de la tierra pero sin mojarla.

Transformación del Agrobacterium Las células del Agrobacterium tumefaciens electro-competente (cepa Z707S) fueron preparadas utilizando un protocolo de Weigel y Glazebrook (2002). Las células agro-competentes fueron transformadas utilizando un método de electroporación adaptado del método de Weigel y Glazebrook (2002). Cincuenta (50) µ? de las células agro-competentes fueron descongeladas en hielo y aproximadamente 10 nm hasta aproximadamente 25 ng del pDAB4504 plásmido se agregó a las células. El ADN y la mezcla de células fueron agregadas a cubetas de electroporación previamente enfriadas de 2 mm. El Electroporador Eppendorf 2510, el cual se consigue comercial mente en Eppendorf AG (Hamburgo, Alemania), fue utilizado para la transformación de las siguientes preparaciones: Voltaje: 2.4 kV, Longitud de impulso: 5 mseg. Después de la electroporación, se agregó 1 mL de caldo YEP a la cubeta y la suspensión de células YEP fue transferida a un tubo de cultivo de 15 mi. Las células fueron incubadas a una temperatura de 28°C en un baño de agua con agitación constante durante cuatro horas. Después de la incubación, el cultivo fue colocado en placas de YEP + agar con espectinomicina (100 mg/L) y estreptomicina (250 mg/L), las cuales se consiguen comercialmente en Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Las placas fueron incubadas por un período de dos a cuatro días a una temperatura de 28°C. Las colonias fueron seleccionadas y ralladas sobre placas de YEP + agar fresco con espectinomicina (100 mg/L) y estreptomicina (250 mg/L) e incubadas a una temperatura de aproximadamente 28°C por un período de uno a tres días. Las colonias fueron seleccionadas para el análisis de digestión de restricción para verificar la presencia del inserto del gen utilizando las enzimas de digestión de restricción específicas del vector. Las Preparaciones Qiagen High Speed Maxi, realizadas de acuerdo con las instrucciones del fabricante, fueron utilizadas para purificar el ADN plásmido de las colonias de Agrobacterium seleccionadas. El ADN plásmido del vector binario utilizado en la transformación del Agrobacterium fue incluido como control. Cuatro reacciones de digestión separadas estuvieron operando utilizando de .5 a 1 de ADN. Se permitió que la reacción corriera por aproximadamente cuatro horas hasta aproximadamente cinco horas y fue analizada por una electroforesis de gel de agarosa del 0.65% y visualizada por una tinción de bromuro de etidio. La colonia fue seleccionada cuya digestión para todas las enzimas fue idéntica al control plásmido.

Transformación de la Arabidopsis La Arabidopsis fue transformada utilizando un método de inmersión floral. La colonia seleccionada fue utilizada para inocular uno o más cultivos previos de 15 mL de caldo YEP con un contenido de espectinomicina (100 mg/L) y estreptomicina (250 mg/L). Los cultivos fueron incubados durante la noche a una temperatura de aproximadamente 28°C con una agitación constante en 220 rpm. Cada cultivo previo fue utilizado para inocular dos, cultivos de 500 mi del caldo YEP con un contenido de espectinomicina (100 mg/L) y estreptomicina (250 mg/L) y los cultivos fueron incubados durante la noche a una temperatura de aproximadamente 28°C con agitación constante. Entonces, las células fueron granuladas en aproximadamente 8700 x g por aproximadamente diez minutos a temperatura ambiente (es decir, aproximadamente 24°C), y el sobrenadante resultante fue descartado. El gránulo de células fue suspendido nuevamente de manera suave en 500 mi de medio de infiltración con un contenido: de sales de Murashige y Skoog 1/2x y vitaminas B5 de Gamborg, 10 % (p/v) de sacarosa, 0.044 µ? de purina bencilamino (10 µ?/litro de un material de 1 mg/ml de DMSO) y 300 µ I /I i tro de SILWET L-77, la cual se consigue comercialmente en Helena Chemical Company (Collierville, TN). Las plantas de aproximadamente cinco semanas de edad fueron sumergidas en el medio durante aproximadamente 15 segundos, asegurándose de sumergir la inflorescencia más nueva. Entonces las plantas fueron colocadas a sus lados y cubiertas (transparentes u opacas) por aproximadamente 24 horas, y luego lavadas con agua, y colocadas de manera vertical. Las plantas fueron cultivadas a una temperatura de aproximadamente 22°C, con un fotoperíodo de 16 horas de luz/8 horas de oscuridad. Aproximadamente cuatro semanas después de la inmersión, las semillas fueron recolectadas.

Selección de Plantas Transformadas La semilla T1 fue sembrada en charolas de germinación de 10.5 pulgadas (26.67 cm) x 21 pulgadas (53.34 cm), las cuales se consiguen comercialmente en T.O. Plastics Inc. (Clearwater, MN) como se describieron y fueron cultivadas bajo las condiciones subrayadas. Los domos fueron removidos de cinco a seis días después de la siembra. Cinco días después de la siembra y luego nuevamente diez días después de la siembra de los semilleros fueron rociados con una solución del 0.20% (20 µ?/10 mL de agua desionizada) de herbicida de glufosinato, el cual se consigue comercialmente en Bayer Cropscience, en un volumen de rociado de aproximadamente 10 ml/charola (703 L/hectárea) utilizando una boquilla de rociado de aire comprimido DeVilbiss (Glendale Heights, IL) para administrar una cantidad efectiva de glufosinato de 280 g/hectárea por aplicación. La cantidad de Liberty fue preparada como se calculó de la manera siguiente: (volumen de rociado 703 L/hectárea = 280 GPA). (280 g a/7hectárea) x (1 hectárea/703 L) x (1 L/200 g ai de glufosinato) = solución al 0.20% (es decir, 20 µ?/10 mi). Diez (10) mL de la solución fueron pipeteados en un frasco de centelleo de 20 mL para cada una de las charolas que iba a ser rociada. El rocío fue administrado utilizando un patrón de aplicación horizontal y vertical. Después de cada rociado, la marca del rociado con el nombre del herbicida, la cantidad de aplicación y la fecha de aplicación se agregaron a cada charola de selección. De cuatro a siete días después del segundo rociado de herbicida resistente a las plantas fueron identificadas y transplantadas en macetas preparadas con una mezcla de Sunshine LP5. Las plantas transplantadas fueron colocadas en un conviron con las condiciones de cultivo mencionadas anteriormente.

Ejemplo 11: Transformación del Agrobacterium para vectores súper-binarios Para prepararlas para la transformación, dos cepas diferentes de E. coli (DH5a que contienen un precursor pSB11 {ya sea pDAB7702 o pDAB3878 en este caso} y pRK2013) fueron cultivados durante la noche a una temperatura de 37°C. Esta cepa DH5a fue cultivada en un plato de petri con un contenido LB (5 g de Bacto Triptona, 2.5 g de Extracto de Bacto Levadura, 5 g de NaCI, 7.5 g de Agar, en 500 mi de agua desionizada) + Espectinomicina (100 pg/ml) y la cepa pRK2013 fue cultivada en un plato de petri con un contenido de LB + Canamicina (50 µ g /m I ) . Después de la incubación, los platos fueron colocados a una temperatura de aproximadamente 4°C para esperar la disponibilidad del Agrobacterium .

La cepa LBA4404 de Agrobacterium con un contenido de pSB1 (Tabaco de Japón) fue cultivado en un plato de petri con un contenido de medio AB (5 g de Glucosa, 15 g de Agar, en 900 mi de agua desionizada) con Estreptomicina (250 pg/ml) y Tetraciclina (10 g/ml) a una temperatura de 28°C durante tres días. Después de que estuvo listo el Agrobacterium, las placas de transformación fueron preparadas mezclando un círculo de inoculación de cada bacteria (pDAB7702 o pDAB3878, pRK2013, y LBA4404 + pSB1) en una placa LB sin antibióticos. Esta placa fue incubada durante la noche a una temperatura de 28°C. Después de la incubación, se le agregó 1 mi de solución de NaCI al 0.9% (4.5 g de NaCI en 500 mi de agua desionizada) para el plato de acoplamiento y las células fueron mezcladas en la solución. Entonces la mezcla fue transferida en un tubo estéril etiquetado tal como un Falcon 2059, el cual se consigue comercialmente en Becton Dickinson and Co. (Franklin Lakes, N J ) .

Un (1) mi de NaCI al 0.9% se agregó a la placa y las células restantes fueron mezcladas en la solución. Esta mezcla entonces fue transferida al mismo tubo etiquetado que el anterior. Las diluciones en serie de las células bacteriales se hicieron en un rango de 101 a 104 colocando 100 µ? de la solución de "material" bacterial en los tubos de Falcon 2059 etiquetados y entonces se les agregaron 900 µ? de NaCI al 0.9%. Al asegurar la selección, se colocaron en placas entonces 100 µ? de las diluciones en las placas separadas AB + Espectinom icina (100 g/ml)/Estreptomicina (250 pg/ml)/Tetraciclina (10 g/ml) y se incubaron a una temperatura de 28°C durante cuatro días. Las colonias fueron entonces "parchadas" sobre placas AB + E spec/E strep/Tet así como un medio de lactosa (0.5 g de Extracto de Levadura, 5 g de monohidrato D-lactosa, 7.5 g de Agar, en 500 mi de agua desionizada H20) y colocadas en el incubador a una temperatura de 28°C durante dos días. La prueba de Ceto-lactosa fue realizada en las colonias de los medios de lactosa inundando la placa con una solución de Benedict (86.5 g de Citrato de Sodio Monobásico, 50 g de Na2C03, 9 g de CuS04-5 agua, en 500 mi de agua desionizada) y se permitió que las agro-colonias se volvieran amarillas. Cualquiera colonias que fueran amarillas (positivas para el agro) fueron entonces recolectadas de la placa del parche y ralladas para un solo aislamiento de la colonia en placas AB + Espec/Estrep/Tet a una temperatura de 28°C durante dos días. Se recolectaron una colonia por placa para una segunda ronda de aislamientos de una sola colonia en medios AB + Espec/Estrep/Tet y estos fueron repetidos por un total de tres rondas de aislamientos de una sola colonia. Después de los aislamientos, una colonia por placa fue recolectada y utilizada para inocular 3 mi separados de YEP (5 g de Extracto de Levadura, 5 g de Peptona, 2.5 g de NaCI, en 500 mi de agua desionizada) los cultivos líquidos que contienen Espectinomicina (100 Mg/ml), Estreptomicina (250 g/ml), y Tetraciclina (10 µg/ml). Estos cultivos líquidos entonces fueron cultivados durante la noche a una temperatura de 28°C en un incubador de tambor a una velocidad de 200 rpm.

Los cultivos de validación entonces fueron manifestados transfiriendo 2 mi de los cultivos de inoculación a matraces desechables de 250 mi con un contenido de 75 mi de YEP + Espec/Estrep/Tet. Estos fueron entonces cultivados durante la noche a una temperatura de 28°C mientras se agitaban a una velocidad de 200 rpm. Después del protocolo de Qiagen®, las preparaciones máximas de alta velocidad que se consiguen comercialmente en Qiagen (Valencia, CA), fueron entonces realizadas en los cultivos bacteriales para producir el ADN plásmido. 500 µ? del ADN eluido fueron entonces transferidos a dos tubos limpios, etiquetados de 1.5 mi y fue realizado el protocolo Quick-Precip Plus®, el cual se consigue comercialmente en Edge BioSystems (Gaithersburg , MD). Después de la precipitación, el ADN se volvió a suspender en un volumen total de 100 µ? TE, incluyendo una mezcla de 10 mM de HCI Tris en un pH de 8.0 y 1 mM de ácido etilén diamina tetra-acético (EDTA). Cinco (5) µ? del ADN plásmido fueron agregados y mezclados suavemente con 50 µ? de células de E. coli de DH5a competentes químicamente; que se consiguen comercialmente en Invitrogen (Carlsbad, CA).

Esta mezcla entonces fue transferida a tubos Falcon 2059 enfriados y etiquetados. La reacción fue incubada en hielo por aproximadamente 30 minutos y luego sometida a "Choque de calor" aumentando la temperatura hasta aproximadamente 42°C por alrededor de 45 segundos. La reacción se volvió a colocar en hielo por aproximadamente dos minutos y luego se le agregaron a los tubos 450 µ? de medio SOC, el cual se consigue comercialmente en Invitrogen (Carlsbad, CA). La reacción entonces fue incubada a una temperatura de 37°C durante una hora, agitándola a una velocidad de 200 rpm. Luego, las células fueron colocadas en placas sobre LB + Espec/Estrep/Tet (utilizando 50 µ? y 100 µ?) e incubadas a una temperatura de 37°C durante la noche. Tres o cuatro colonias por placa fueron recolectadas y utilizadas para inocular 3 mi de LB separados (5 g de Bacto Triptona, 2.5 g de Extracto de Bacto Levadura, 5 g de NaCI, en 500 mi de agua desionizada H20), los cultivos líquidos que contenían Espectinomici na (100 µ?/???), Estreptomicina (250 µg/ml), y Tetraciclina (10 µg/ml). Estos cultivos líquidos entonces fueron cultivados durante la noche a una temperatura de 37°C en un incubador de tambor a una velocidad de 200 rpm. Después del protocolo Qiagen®, los mini-preps (Qiagen, Valencia, CA) fueron entonces realizados en los cultivos bacteriales para producir el ADN plásmido. Cinco (5) µ? del ADN plásmido fueron entonces digeridas en reacciones separadas utilizando las enzimas Hindlll y Salí (New England Biolabs Beverly, MA) a una temperatura de 37°C durante una hora antes de ser operados en un gel de agarosa al 1% (Cambrex Bio Science Rockland, Inc. Rockland, ME). El cultivo que mostró el patrón de formación de bandas correcto fue utilizado entonces para crear los materiales de glicerol y agregar 500 µ? de cultivo a 500 µ? de glicerol estéril (Sigma Chemical Co.; St. Louis, MO) e invirtiendo para mezclarlo. La mezcla entonces fue congelada en hielo seco y almacenada a una temperatura de -80°C hasta que se necesitó.

Ejemplo 12: Transformación del maíz portada por Agrobacterium Material de la Planta Las semillas del cruce Fi High II (Armstrong y asociados, 1991) fueron plantados dentro de macetas de cinco galones (19 litros) con un contenido de una mezcla de un medio de cultivo sin tierra Metro-Mix 360 al 95% (Sun Gro Horticulture, Bellevue, WA) y de arcilla/marga al 5%. Las plantas fueron cultivadas en un invernadero utilizando una combinación de lámparas de sodio y haluro de metal de alta presión con un fotoperíodo de 16:8 horas. Para obtener los embriones F2 inmaduros para la transformación, se realizaron polinaciones controladas de hermanos. Los embriones inmaduros fueron aislados en un período de ocho a diez días posteriores a la polinacion cuando los embriones eran de un tamaño de aproximadamente 1.0 mm a 2.0 mm.

Infección y Ce-cultivo Las mazorcas de maíz fueron esterilizadas en la superficie frotándolas con jabón líquido, sumergiéndolas en etanol al 70% durante dos minutos, y luego sumergiéndolas en blanqueador comercial al 20% (hipoclorito de sodio al 0.1%) durante 30 minutos antes de ser enjuagadas con agua estéril. La suspensión de Agrobacterium fue preparada transfiriendo de uno a dos lazos de bacterias cultivadas en el medio YEP (40 g/L de peptona, 40 g/L de extracto de levadura, 20 g/L de NaCI, 15 g/L de Bacto agar) con un contenido de 100 mg/L de espectinomicina, 10 mg/L de tetraciclina, y 250 mg/L de estreptomicina a una temperatura de 28°C durante dos o tres días en 5 mi de medio de infección líquido (Medio Nasal LS (Linsmaier y Skoog, 1965), vitaminas N6 (Chu y asociados, 1965), 1.5 mg/L de 2,4-D, 68.5 g/L de sacarosa, 36.0 g/L de glucosa, 6 mM de L-prolina, pH 5.2) con un contenido de 100 µ? de acetosiringona . La solución fue sometida a agitación hacia un solo lado hasta que se logró una suspensión uniforme, y la concentración fue ajustada a una densidad final de 200 unidades Klett, utilizando un colorímetro Klett-Summerson con un filtro color morado. Los embriones inmaduros fueron aislados directamente dentro de un tubo de microcentrífuga con un contenido de 2 mL de medio de infección. Los tubos se agitaron hacia un solo lado durante un período de tres a cinco segundos, y luego el medio líquido fue removido y reemplazado con un medio fresco y se volvió a agitar hacia un solo lado. El medio fue removido una tercera vez y reemplazado con 1 ml_ de solución de Agrobacterium con una densidad de 200 unidades de Klett. El Agrobacterium y la solución de los embriones fue agitada hacia un solo lado a una velocidad máxima durante 30 segundos, y luego incubado durante cinco minutos a temperatura ambiente, antes de ser transferido a un medio de cocultivo (Medio Basal LS, vitaminas N6, 1.5 mg/L de 2,4-D, 30.0 g/L de sacarosa, 6 mM de L-prolina, 0.85 mg/L de AgN03,1, 100 µ? de acetosiringona, 3.0 g/L de goma de Gellan, pH 5.8) durante cinco días a una temperatura de 25°C bajo condiciones de oscuridad.

Después del cocultivo, los embriones fueron movidos a través de un esquema de selección de dos pasos después de los cuales los aislados transformados fueron obtenidos sobre el curso de aproximadamente ocho semanas. Para la selección, y el medio basado en LS (Medio Basal LS, vitaminas N6, 1.5 mg/L de 2,4-D, 0.5 g/L de MES, 30.0 g/L de sacarosa, 6 mM de L-prolina, 1.0 mg/L de Ag N03, 250 mg/L de cefotaxima, 2.5 g/L de goma de Gellan, pH 5.7) fueron utilizados con niveles múltiples de selección de ácido R-haloxifop. Los embriones fueron transferidos a los medios de selección con un contenido de 100 nM de R-haloxifop durante 14 días, y luego transferidos a 500 nM de R-haloxifop en intervalos de dos semanas aproximadamente tres veces más hasta que fueron obtenidos aislados em briogénicos. Cualesquiera aislados recuperados fueron acumulados transfiriéndolos a un medio de selección fresco en intervalos de dos semanas para la regeneración y el análisis adicional.

Regeneración y Producción de la Semilla Para la regeneración, los cultivos fueron transferidos a un medio de inducción "28" (sales MS y vitaminas, 30 g/L de sacarosa, 5 mg/L de bencilaminopurina, 0.25 mg/L de 2,4-D, 100 nM de ácido R-haloxifop, 250 mg/L de cefotaxima, 2.5 g/L de goma de Gellan, pH 5.7) por una semana bajo condiciones de poca luz (14 pEm"2s"1), luego una semana bajo condiciones de alta luz (aproximadamente 89 pEm"2s'1). Los tejidos fueron transferidos posteriormente al medio de regeneración "36" (el mismo medio de inducción excepto que carece de reguladores de crecimiento de la planta). Cuando crecieron las plantitas de 3 cm a 5 cm de longitud, fueron transferidas a tubos de cultivo de vidrio con un contenido de medio SHGA (sales y vitaminas de Schenk y Hildebrandt (1972)), 1.0 g/L de m/'o-inositol, 10 g/L de sacarosa y 2.0 g/L de goma de Gellan, pH 5.8) para permitir el crecimiento adicional y desarrollo de los brotes y raíces. Las plantas fueron transplantadas a la misma mezcla de tierra descrita anteriormente y cultivadas hasta el florecimiento en el invernadero. Fueron conducidas las polinaciones controladas para la producción de semillas.

Ejemplo 13: Caracterización molecular del gen SnRK2-6 de la Arabidopsis transgénica Para seleccionar las plantas de Arabidopsis transgénicas portadoras de la unidad de transcripción del gen SnRK2-6, se realizó un PCR con un par de cebadores, 5'-TGA GGT CTA CAG GCC AAA TTC GCT CTT AGC-3' y 5'-ATC ACA TTG CGT ACA CAA TCT CT-3', diseñados de acuerdo con la secuencia cercana al límite izquierdo del T-ADN y la secuencia del extremo 3' del gen SnRK2-6, respectivamente. La segregación genética de las plantas T2 transgénicas fue determinada utilizando un ensayo invasor PAT y rociándole herbicida. Únicamente las líneas transgénicas encajaron en la segregación de 3:1 que fueron seleccionadas para los estudios bioquímicos y fisiológicos ya que ellos era muy probable que portaran una sola inserción. Ejemplo 14: Caracterización molecular del maíz transgénico SnRK2-6 hv Para seleccionar las plantas de maíz transgénico portadoras de la unidad de transcripción de SnRK2-6 hv, se realizó un PCR con un par de cebadores, 5'-GTG ACC CGG TCG TGC CCC TCT CTA GA-3' y 5'-CCG TGG ATA TAT GCC GTG AAC AAT TG-3', diseñados de acuerdo con el promotor ZmUbil y el ZmPer5 3'UTR, respectivamente.

Ejemplo 15: Análisis Western blot Preparación de Anticuerpos Policlonales Dos tipos diferentes de anticuerpos policlonales fueron preparados contra dos polipéptidos, "CHRDLKLENTLLDGSPAPRLKICDFGYSKS" (30 aminoácidos) y "MNDNTMTTQFDESDQPGQSIEE" (22 aminoácidos), respectivamente. El primer polipéptido está localizado en las posiciones de aminoácidos de la 137 a la 166 en el dominio de cinasa de la proteína SnRK2-6, y el segundo péptido está localizado en las posiciones de aminoácidos de la 286 a la 307 en el dominio regulatorio de la proteína SnRK2-6. Estos dos polipéptidos fueron sintetizados y conjugados a hormonas de penetración magnética de hemocianina (KLH) como una proteína portadora. Los dos conjugados KLH-péptidos diferentes resultantes fueron utilizados para la inmunización de conejos para generar dos tipos diferentes de anticuerpos policlonales. Para purificar los anticuerpos, los péptidos fueron conjugados a albúmina de suero bovina (BSA), y los conjugados fueron utilizados para la cromatografía de afinidad.

Preparación de la Muestra Las hojas de maíz de las plantas transformadas de cinasa de Snf1 y los controles fueron muestreados con hielo seco y molidos con nitrógeno líquido hasta un polvo muy fino. Las proteínas incluyendo la cinasa Snf1 fueron extractadas agregando ~200 mg del polvo de la hoja en 1 mL de regulador del extracto (50 mM de Tris, pH 8.0, 50 mM de NaCI, 5 mM de EDTA, 5 mM de DTT, Tritón X-100 al 0.05%). Las concentraciones de proteína fueron medidas por el ensayo de proteína Bio-Rad y variaron de 3.2 mg/mL a 3.8 mg/mL.

Western blot Las proteínas fueron separadas mediante SDS-PAGE utilizando un gel Nupage Bis-Tris al 10%, el cual se consigue comercialmente en Invitrogen, catálogo # NP0301 Box (Carlsbad, CA) con un regulador de operación MOPS. Entonces fueron transferidos sobre membrana de nitrocelulosa con un regulador Tris/glicina por una hora en 100 V. La membrana fue bloqueada en un regulador de PBST con un contenido de leche sin grasa al 3% durante una hora a temperatura ambiente (RT). La solución de leche fue vertida y se agregó el regulador fresco que contenía anticuerpos policlonales anti-SnRK2-6 de conejo. La membrana fue incubada una hora a temperatura ambiente, y luego lavada tres veces con PBST. Después del lavado, la solución de PBST/leche fresca que contenía el conjugado de peroxidasa IgG-rábano anti-conejo cabra fue agregado a la membrana. Después de incubación durante una hora a temperatura ambiente, la membrana fue lavada como se describió anteriormente. Para el desarrollo, la membrana fue removida de la solución PBST y sumergida en reactivo de detección ECL preparado recientemente (PIERCE, reactivo de detección 1 - solución de peróxido, Catálogo #1859701, y reactivo de detección 2 - solución aumentadora de luminol, Catálogo #1859698). Película de quimioluminiscencia (Película CL-Xposure, de PIERCE, catálogo #31460) fue expuesta a la membrana tratada y desarrollada con el desarrollador de película Konica SR-X.

Ejemplo 16: La expresión heteróloga del gen SnRK2-6 aumenta la tolerancia a la sequía del maíz Para probar si la cinasa SnRK2-6 puede ejercer el efecto en los procesos biológicos en los fondos de cromosomas heterólogos, expresamos el gen SnRK2-6 en el maíz. Para establecer su función, la secuencia del gen fue optimizada en el codón de acuerdo con el uso del codón de hemicotiledones y luego introducido en el maíz Hi II bajo el control del promotor Ubi1 de maíz. La expresión del gen SnRK2-6 en las líneas transgénicas del maíz fue determinada utilizando el Western blot basado en los anticuerpos policlonales contra los péptidos SnRK2-6. La proteína expresada tuvo el tamaño esperado (42 kD), y mostró el nivel fácilmente detectable en la mayoría de las líneas por medio del Western blot. Como control, las plantas Hi II no transformantes no mostraron un nivel detectable de cualesquiera proteínas de 42 kD (datos no mostrados).

Las plantas de maíz transgénico T0 Hi II fueron cruzadas recíprocamente con la línea 5XH751 cultivada para producir semillas T1. Las poblaciones resultantes de segregación T1 fueron seleccionadas por medio de PCR para separar los segregantes nulos y las plantas portadoras del transgen. En los experimentos diseñados para probar la tolerancia a la sequía, los segregantes nulos sirven como control para esas plantas transgénicas segregadas de la misma población debido a que sus antecedentes genómicos son los más similares entre ellos.

Para erradicar el efecto resultante de la diferencia del antecedente genómico, ocho líneas transgénicas independientes fueron utilizadas para evaluar el rol del transgen en la tolerancia a la sequía del maíz. En una relación de índice de transpiración, la pérdida de agua en las hojas desprendidas de los segregantes nulos y las plantas transgénicas SnRK2-6 fueron medidas durante un período de separación de la hoja. Como se muestra en las figuras 8 y 9, las plantas transgénicas mostraron una cantidad reducida de pérdida de agua comparada con los segregantes nulos.

Las plantas transgénicas de maíz parecían más tolerantes al esfuerzo de la sequía por medio de observación visual. Cuando fueron privadas de irrigación por seis días, las plantas de maíz de 30 días de edad, los segregantes nulos se llegaron a marchitar de una manera más severa que las plantas transgénicas. Además, las plantas transgénicas fueron rehidratadas mucho más rápido que los segregantes nulos. De acuerdo con esto, la biomasa de la parte superior de las plantas de maíz transgénicas de 64 días de edad fue del 112% al 150% de segregantes nulos a los ocho días después de la reh idratación antes de lo cual las plantas fueron privadas de irrigación por nueve días, como se muestra en la Tabla 6. En la Tabla 6, la biomasa de las plantas transgénicas es expresada como un porcentaje de segregantes nulos los cuales son definidos como 100.

Tabla 6: Las plantas de maíz transgénico SnRK2-6 muestran una cantidad de recuperación más alta de la deshidratación que los segregantes nulos. (%) de Biomasa de los de Origen segregantes T1 Línea T1 Transgenes en regantes Hembra Macho Plantas Seg Independiente hembras Transgénicas nulos 1 2221[1]-003.002 AAD1 5XH751 106.3 100 2 2221[2]-005.004 AAD1 5XH751 80.0 100 3 2280[2]-010.005 AAD1 5XH751 100.0 100 4 2280[1]-002.002 AAD + Sn K2-6 5XH751 126.3 100 5 2280[1]-004.008 AAD1 + SnRK2-6 5XH751 127.5 100 6 2280[1]-006.006 AAD1 + SnRK2-6 5XH751 138.5 100 7 2280[1]-008.004 AAD1 + SnRK2-6 5XH751 122.2 100 8 2280[2]-015.006 AAD1 + SnRK2-6 5XH751 152.9 100 9 2280[2]-016.004 AAD1 + SnRK2-6 5XH751 145.7 100 10 2280[3]-023.002 AAD1 + SnRK2-6 5XH751 138.4 100 11 2280[3]-025.006 AAD1 + SnRK2-6 5XH751 112.5 100 12 2280[3]-026.005 AAD1 + SnRK2-6 5XH751 116.7 100 En un experimento de campo realizado en Halfway, Texas, tres eventos independientes de maíz transgénico mostraron un rendimiento del grano aumentado bajo una condición de sequía en la etapa de llenado de grano, así como bajo una condición de bien mojadas comparadas con sus hermanas sin el transgen SnRK2-6 (nulo) (Tabla 7).

Tabla 7: Efecto del transgen SnRK2-6 en el rendimiento del grano de maíz bajo diferentes condiciones de agua en el campo.

Aumento relativo en el peso de grano por 10 plantas (%) Esfuerzos de sequía en Evento Transgen Trazo Ubicación Bien mojada la etapa de relleno del grano 2280[1]-002.R002.024R. SnRK2-6 101 Halfway, TX 16.4 11.8 Nulo 102 Halfway, TX 0.0 0.0 2280[2]-015.R001.025R. SnRK2-6 103 Halfway, TX 29.0 33.5 Nulo 104 Halfway, TX 0.0 0.0 2280[2]-016.R004.025R. SnRK2-6 105 Halfway, TX 14.3 8.3 Nulo 106 Halfway, TX 0.0 0.0 Colectivamente, los resultados anteriores demuestran que la expresión constitutiva del gen SnRK2-6 puede aumentar la tolerancia a la sequía del maíz. Esto puede proteger grandemente las plantas de maíz contra la sequía, reduciendo de este modo la pérdida de rendimiento bajo condiciones de sequía.

Ejemplo 16: Genes de Tolerancia al Esfuerzo El gen SnRK2-6 puede ser introducido en una planta en combinación con uno o más genes que confieren tolerancia al esfuerzo en las plantas. Los ejemplos de los genes de tolerancia al esfuerzo adecuados se muestran en la Tabla 8.

Tabla 8: Genes Comprendidos en las Regulaciones Posteriores a la Traducción que Confieren Tolerancia Aumentada al Esfuerzo Abiótico Nombre del Función del gen Modificación Fenotipo transgénico gen Protefna de enlace de ARN AtSRL1a Activación Tolerancia a la sal de serina-arginina (SR) Proteína de enlace de ARN GRP2" Activación Tolerancia al frío y congelación Rica en Glicina Proteína de enlace de ARN AtRZ-1ac Activación Tolerancia a la congelación Rica en Glicina STRS1, Pérdida de mutante de Tolerancia a la sal, osmótica, y a Helicasa ARN MUERTO STRS2" función los esfuerzos por calor Tolerancia a las condiciones de Sitio de reconocimiento Dismutasa de Superóxido esfuerzo oxidativo (alta luz, CSD2e de la mutagénesis de un Cu/Zn metales pesados, y viologen MiARN metilo) Tolerancia a la sequía por un XERICO1 Ligasa de Ubiquitina E3 Activación nivel aumentado de ABA (activación de AtNCED3 ) Vernalizado constitutivamente Pérdida de mutante de HOS19 Ligasa de Ubiquitina E3 (expresión del gen en respuesta función al frío aumentado) a. J. Forment, M.A. Naranjo, M. Roldan, R. Serrano y O.

Vicente, la expresión de las proteínas de empalme de Arabidopsis similar a SR confieren tolerancia a la sal a la levadura y a las plantas transgénicas, Plant J. 30 (2002), páginas 511 a 519. b. J.Y. Kim, S.J. Park, B . Jang, CH. Jung, S.J. Ahn, CH. Goh, K. Cho, O. Han y H. Kang, Caracterización funcional de una proteína de enlace de ARN-2 rica en glicina en la Arabidopsis thaliana bajo condiciones de esfuerzo abiótico, Plant J. 50 (2007), páginas 439 a 451. c. Y. O. Kim, J. S. Kim y H. Kang, El dedo de zinc-que contiene la proteína de ARN rica en glicina contribuye al aumento de la tolerancia a la congelación en la Arabidopsis thaliana, Plant J. 42 (2005), páginas 890 a 900. d. P. Kant, S. Kant, M. Gordon, R. Shaked y S. Barak, SUPRESOR 1 DE RESPUESTA AL ESFUERZO Y SUPRESOR 2 DE RESPUESTA AL ESFUERZO, dos helicasas de ARN de Caja-MUERTA que atenúan las repuestas de la Arabidopsis a los esfuerzos abióticos múltiples, Plant Physiol. 145 (2007), páginas 814 a 830. e. R. Sunkar, A. Kapoor y J.-K. Zhu, La inducción a la transcripción de dos genes Cu/Zn de dismutasa de super-óxido en las Arabidopsis es portada por la desactivación del miR398 y la tolerancia importante para el esfuerzo oxidativo, Plant Cell 18 (2006), páginas 2051 a 2065. f. J. H. Ko, S.H. Yang y K.H. Han, La activación de un gen de ANILLO-H2 de Arabidopsis, XERICO, confiere tolerancia a la sequía a través de la biosíntesis aumentada de ácido abscísico, Plant J. 47 (2006), páginas 343 a 355. g. CH. Dong, M. Agarwal, Y. Zhang, Q. Xie y J. K. Zhu, The el regulador negativo de respuestas al frío de la planta, HOS1, es una ligasa del ANILLO E3 que es portadora de la ubiquitinación y degradación del ICE1, Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 103 (2006), páginas 8281 a 8286.

Ejemplo 17: Genes de Tolerancia a la Sequía El gen SnRK2-6 puede ser introducido dentro de una planta en combinación con uno o más genes que confieren tolerancia a la sequía en las plantas. Los ejemplos de los genes adecuados de tolerancia a la sequía se muestran en la Tabla 9. Tabla 9: Genes de Tolerancia a la Sequía Genes Función Mecanismo de acción Referencias Expresión mejorada de genes relacionados con el esfuerzo descendente confiere la tolerancia a la Oh y asociados, Factores de transcripción DREBs/CBFs; ABF3 sequía/frío/sal. La (2005), Ito y inducidos por el esfuerzo sobreexpresión asociados (2006) constitutivamente puede conducir a atrofiar el crecimiento.

Expresión de SNAC1 reduce la pérdida de agua Factores de transcripción Hu y asociados SNAC1 aumentando la inducidos por el esfuerzo (2006) sensibilidad del estoma al ABA Cinasa de proteína Expresión mejorada del Saijo y asociados OsCDPK7 dependiente de Ca inducida gen que responde al (2000) por el esfuerzo estrés Genes Función Mecanismo de acción Referencias La desactivación de la farnesiltransferasa mejora Transferasa- Regulador negativo de la la respuesta de la planta Wang y asociados farnesilo (ERA1) sensibilización ABA al ABA y la tolerancia a la (2005) sequía reduciendo la conductancia del estoma.

La sobre-expresión mejora la tolerancia al McKersie y Mn-SOD Dismutasa de superóxido-Mn esfuerzo también en asociados (1996) condiciones del campo La sobre-expresión Gaxiola y facilita los flujos de auxina asociados (2001 ); AVP1 H+ -pirofosfatasa vacuolar que conduce a un Park y asociados crecimiento aumentado (2005) de la raíz La sobre-acumulación de Bahieldin y LEA aumenta la Proteínas LEA inducidas por asociados (2005), HVA 1; OsLEA3 tolerancia a la sequía esfuerzo Xiao y asociados también en condiciones (2007) del campo ERECTA actúa como un regulador de la eficiencia La cinasa similar al receptor de de transpiración con repetición rico en leucina efectos en la densidad del asle y asociados ERECTA putativa es un contribuyente estoma, expansión de la (2005) mayor a un lugar para ? un célula de la epidermis, la cromosoma 2 de Arabidopsis proliferación de célula mesofílica y contacto de célula-célula Genes Función Mecanismo de acción Referencias La acumulación de trehalosa aumentada correlaciona con niveles más altos de Genes biosintéticos de Garg y asociados otsA y otsB carbohidratos solubles, y trehalosa de Escheríchia coli (2002) una capacidad fotosintética elevada y tolerancia aumentada al daño foto-oxidativo Acumulación aumentada Kavi Kishor y sintetasa de 5-pirrolina-5- de prolina conduce a una asociados (1995), P5CS carboxilato osmotolerancia Zhu y asociados aumentada (1998) La acumulación de Deshidrogenase de manitol-1- manitol conduce a la Abebe y asociados mtID fosfato osmotolerancia (2003) aumentada Las líneas que sobre- expresan el GF14A tienen un fenotipo de "permanencia verde", Yan y asociados GF14Á proteína 14-3-3 tolerancia al esfuerzo del (2004) agua aumentado e índices fotosintéticos más altos bajo condiciones de falta de agua La sobre-expresión de la conductancia de la Laporte y NADP-Me Enzima málica-NADP estoma disminuida y asociados (2002) mejora el WUE Aunque la presente invención ha sido descrita en ciertas modalidades de ejemplo, la presente invención puede ser modificada adicionalmente dentro del espíritu y alcance de la descripción. Esta solicitud por lo tanto pretende cubrir cualesquiera variaciones, usos, o adaptaciones de la invención utilizando sus principios generales. Además, esta solicitud pretende cubrir dichas salidas de la presente descripción que se encuentran dentro de la práctica conocida o acostumbrada en la técnica a la cual pertenece la invención y la cual se encuentra dentro de los límites de las reivindicaciones adjuntas.

Todas las referencias, incluyendo las publicaciones, patentes, y solicitudes de patente citadas y aquí explicadas se proporcionan únicamente por su descripción anterior a la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada de lo aquí escrito deberá ser interpretado como una admisión de que los inventores no tienen derecho a anteceder dicha descripción en virtud de la invención anterior.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un proceso para producir una planta, semilla de la planta o progenie de la misma, comprendiendo el proceso: transformar una célula de la planta con una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de cinasa de proteína relacionada con la planta Snf1; cultivar la planta de la célula de la planta hasta que la planta produce semillas; y recolectar las semillas de la planta.

2. El proceso tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de cinasa de proteína relacionada con la planta Snf1 es integrada dentro de un genoma de la célula de la planta.

3. El proceso tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además seleccionar la semilla que tiene la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de cinasa de proteína relacionada con la planta Snf1 integrada dentro de un genoma de la célula de la planta.

4. El proceso tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de cinasa de proteína relacionada con la planta Snf1 comprende una secuencia de acuerdo con las SEQ ID No:1 o SEQ ID No:3.

5. El proceso tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque la proteína de cinasa de proteína relacionada con la planta Snf1 comprende un gen SnRK2-6.

6. El proceso tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de cinasa de proteína relacionada con la planta Snf1 comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido de acuerdo con las SEQ ID No:2 o SEQ ID No:4.

7. Una semilla recolectada de la planta producida mediante el proceso tal y como se describe en la reivindicación 1.

8. El proceso tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además: plantar la semilla en la tierra; cultivar una segunda planta de la semilla; y recolectar la semilla de la segunda planta.

9. El proceso tal y como se describe en la reivindicación 1 , caracterizado porque la transformación de la célula de la planta con la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de cinasa de proteína relacionada con la planta Snf1 comprende: transformar una célula de Agrobacterium con la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de cinasa de proteína relacionada con la planta Snf1¡ y transformar la célula de la planta con la célula de Agrobacterium .

10. El proceso tal y como se describe en la reivindicación 3, caracterizado porque la selección de la semilla que tiene la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de cinasa de proteína relacionada con la planta Snf1 integrada dentro del genoma de la célula de la planta comprende: aislar el ácido nucleico genómico de la semilla; y amplificar la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de cinasa de proteína relacionada con la planta Snf1 del ácido nucleico genómico aislado de la semilla.

11. El proceso tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque la planta es seleccionada del grupo consistente de Arabidopsis thaliana, Borago spp., Cañóla, Ricinus spp., Theobroma spp., Zea spp., Gossypium spp, Crambe spp., Cuphea spp., Linum spp., Lesquerella spp., Limnanthes spp., Linola, Tropaeolum spp., Oenothera spp., Olea spp., Elaeis spp., Arachis spp., semilla de colza, Carthamus spp., Glycine spp., Soya spp., Helianthus spp., Nicotiana spp., Vernonia spp., Triticum spp., Hordeum spp., Oryza spp., Avena spp., Sorghum spp., Sécale spp., Brassicaceae , y otros miembros de la familia de plantas G ramineae .

12. El proceso tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque comprende extraer el aceite de la semilla recolectada.

13. Una planta, semilla de la planta, o progenie de la misma que tiene la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de cinasa de proteína relacionada con la planta Snf1 incorporada en un genoma de la misma.

14. Un método para cambiar el contenido de aceite, azúcar, o almidón de una planta, el órgano de almacenamiento de la planta o la semilla de la planta, comprendiendo dicho proceso: introducir una construcción de ácido nucleico sentido o antisentido dentro de un vector de transformación de la planta para producir un vector de transformación de la planta modificada, en donde la construcción de ácido nucleico sentido o antisentido comprende la secuencia de ácido nucleico aislada, purificada o recombinante que codifica una proteína (SnRK) de la cinasa de proteína relacionada con la Arabidopsis Snf1; transformar dicha planta, el órgano de almacenamiento de la planta o el genoma de la semilla de la planta con dicho vector de transformación de la planta modificada; y cultivar la planta, el órgano de almacenamiento de la planta o semilla de la planta y extraer el aceite o el biopol ímero.

15. Una planta transformada genéticamente, caracterizada porque dicho genoma ha sido transformado por un vector tal y como se describe en la reivindicación 14.

16. Una semilla de la planta transformada genéticamente, caracterizada porque dicha semilla ha sido transformada por un vector tal y como se describe en la reivindicación 14.

17. Una planta tal y como se describe en la reivindicación 15, caracterizada porque exhibe un índice de respiración alterado comparado con una planta no modificada genomicamente del mismo genotipo.

18. Una planta tal y como se describe en la reivindicación 15, caracterizada porque exhibe un contenido de aceite de semilla alterado comparado con una planta no modificada genomicamente del mismo genotipo.

19. Una planta tal y como se describe en la reivindicación 15, caracterizada porque exhibe una composición de ácido graso alterada comparada con una planta no modificada genomicamente del mismo genotipo.

20. Una planta tal y como se describe en la reivindicación 15, caracterizada porque exhibe una biomasa aumentada comparada con una planta no modificada genomicamente del mismo genotipo.

21. Una planta tal y como se describe en la reivindicación 15, caracterizada porque exhibe una capacidad mejorada para acumular biopolímeros comparados con una planta no modificada genómicamente del mismo genotipo.

22. Una planta tal y como se describe en la reivindicación 15, caracterizada porque exhibe un contenido alterado de carbohidratos comparado con una planta no modificada genómicamente del mismo genotipo.

23. Una planta tal y como se describe en la reivindicación 22, caracterizada porque exhibe un contenido de sacarosa y almidón alterados comparado con una planta no modificada genómicamente del mismo genotipo

24. Una semilla de planta tal y como se describe en la reivindicación 16, caracterizada porque exhibe un índice de respiración alterado comparado con una planta no modificada genómicamente del mismo genotipo.

25. Una semilla de planta tal y como se. describe en la reivindicación 16, caracterizada porque exhibe un contenido de aceite de semilla alterado comparado con una planta no modificada genómicamente del mismo genotipo.

26. Una semilla de planta tal y como se describe en la reivindicación 16, caracterizada porque dicha semilla produce una planta la cual exhibe una composición de ácido graso alterada comparada con una planta no modificada genómicamente del mismo genotipo.

27. Una semilla de planta tal y como se describe en la reivindicación 16, caracterizada porque la semilla produce una planta la cual exhibe una biomasa aumentada comparada con una planta no modificada genómicamente del mismo genotipo.

28. Una semilla de planta tal y como se describe en la reivindicación 16, caracterizada porque la semilla produce una planta la cual exhibe una capacidad aumentada para acumular biopolímeros comparada con una planta no modificada genómicamente del mismo genotipo.

29. Un método para regular el nivel de la proteína de cinasa de proteína relacionada con la planta Snf1 en una planta, que comprende: transformar de una manera estable una célula de la planta con un polinucleótido de cinasa de proteína relacionado con la planta Snf1 enlazado de manera operable a un promotor, caracterizado porque el polinucleótido se encuentra en una orientación sentido o antisentido; y cultivar la célula de la planta bajo condiciones de cultivo de la planta para producir una planta regenerada con capacidad para expresar el polinucleótido por un tiempo suficiente para regular la proteína de cinasa de proteína relacionada con la planta Snf1 en la misma.

30. El método tal y como se describe en la reivindicación 29, caracterizado porque se transforma de manera estable una célula de la planta con un polinucleótido de cinasa de proteína relacionado con la planta Snf1 que comprende la transformación estable de una célula de la planta con polinucleótido es seleccionado del grupo consistente de las SEQ ID No:1 y SEQ ID ??:3.

31. Un proceso para extraer aceite de una semilla transgénica, comprendiendo el proceso: transformar la célula de la planta con medios para codificar una proteína de cinasa de proteína relacionada con la planta S nf 1 ; cultivar una planta de la célula de la planta hasta que la planta produce una semilla; recolectar las semillas de la planta; y extractar el aceite de las semillas recolectadas.

32. El proceso tal y como se describe en la reivindicación 31, caracterizado porque los medios para la codificación de la proteína de cinasa de proteína relacionada con la planta Snf1 es seleccionada del grupo consistente de una secuencia de ácido nucleico que codifica las SEQ ID No:2, y SEQ ID No:3.

33. El aceite producido de acuerdo con el proceso tal y como se describe en la reivindicación 31.

34. Un vector para la transformación de las células de la planta, caracterizado porque dicho vector contiene una secuencia de ácido desoxi-ribonucleico de acuerdo con la SEQ ID No:1, o una parte de la SEQ ID No:1, o una secuencia que es substancialmente homologa a la SEQ ID No:1.

35. Un vector tal y como se describe en la reivindicación 34, caracterizado porque dicha secuencia está presente en dicho vector en una orientación sentido.

36. Un vector para la transformación de las células de la planta, caracterizado porque dicho vector contiene una secuencia de ácido desoxi-ribonucleico de acuerdo con la SEQ ID No:3, o una parte de la SEQ ID No:3, o una secuencia que es substancialmente homóloga a la SEQ ID No:3.

37. Un vector tal y como se describe en la reivindicación 36, caracterizado porque la secuencia está presente en dicho vector en una orientación antisentido.

38. Un cADN plásmido pSnRK2-6.

39. Un gen plásmido pSnRK2-6.

40. Una planta que tiene un genoma, caracterizada porque el genoma contiene una secuencia de nucleótidos introducida de las SEQ ID No:1 o SEQ ID No:3, o una parte de las SEQ ID No:1 o SEQ ID No:3, o una secuencia que es substancialmente homóloga a las SEQ ID No:1 o SEQ ID No:3.

41. Una semilla de planta que tiene un genoma, caracterizada porque dicho genoma contiene una secuencia de nucleótidos introducida de las SEQ ID No:1 o SEQ ID No:3, o una parte de las SEQ ID No:1 o SEQ ID No:3, o una secuencia que es substancialmente homóloga a las SEQ ID No:1 o SEQ ID No:3.

42. Un método de producción de plantas transgénicas que introduce una secuencia de nucleótidos en un genoma de dicha planta, caracterizado porque dicha secuencia de nucleótidos introducida en dicho genoma incluye las SEQ ID No:1 o SEQ ID No:3, o una parte de las SEQ ID No:1 o SEQ ID No:3, o una secuencia que es substancialmente homologa a la SEQ ID No:1, o a la SEQ ID No:3, o una parte de las SEQ ID No:1 o SEQ ID No:3.

43. Un método tal y como se describe en la reivindicación 42, caracterizado porque dicha planta es seleccionada del grupo consistente de Arabidopsis thaliana, maíz (Zea mays), borraja (Borago spp.), Cañóla, ricino (Ricinus communis), semilla de cocoa (Theobroma cacao), algodón (Gossypium spp), Crambe spp., Cuphea spp., linaza (Linum spp.), Lesquerella y Limnanthes spp., Linola, nasturtio (Tropaeolum spp.), Oenothera spp., oliva (Olea spp.), palma (Elaeis spp.), cacahuate (Arachis spp.), semilla de colza, azafrán (Carthamus spp.), frijol de soya (Glycine y Soja spp.), girasol (Helianthus spp.), tabaco (Nicotiana spp.), Vernonia spp., trigo (Triticum spp.), cebada (Hordeum spp.), arroz (Oryza spp.), avena (Avena spp.), sorgo (Sorghum spp.), centeno (Sécale spp.), y otros miembros de la familia Gramineae.

44. Un método para cambiar el contenido de aceite, la composición de ácido graso, los niveles de azúcar/almidón/carbohidratos o el rendimiento de la semilla de una planta introduciendo una construcción de ácido nucleico sentido o antisentido dentro del vector de transformación de la planta, utilizando el vector para transformar el genoma de una planta o una semilla de la planta, y luego cultivar la planta o la semilla de la planta y extraer el aceite de la semilla de la planta, caracterizado porque dicha secuencia de ácido nucleico son las SEQ ID No:1 o SEQ ID No:3, o una parte de las SEQ ID No:1 o SEQ ID No:3, o una secuencia que es substancialmente homologa a las SEQ ID No:1 o SEQ ID No:3.

45. Un material de planta, siendo seleccionado dicho material de planta del grupo consistente de una planta, una semilla de planta, y una progenie de una planta, caracterizado porque el material de la planta es transformado además por un vector que comprende medios de cinasa de proteína relacionada con la planta Snf1 para alterar el contenido de aceite del material de la planta funcionalmente asociado con un promotor.

46. El material de la planta tal y como se describe en la reivindicación 45, caracterizado porque los medios de cinasa de proteína relacionados con la planta Snf1 son una secuencia de ácido nucleico.

47. El material de la planta tal y como se describe en la reivindicación 45, caracterizado porque el promotor es CsVMV.

48. El material de la planta tal y como se describe en la reivindicación 45, caracterizado porque el promotor es un promotor natural.

49. El material de la planta tal y como se describe en la reivindicación 45, caracterizado porque el promotor es un promotor U i 1.

50. El material de la planta tal y como se describe en la reivindicación 45, caracterizado porque el material de la planta es seleccionado del grupo consistente de Arabidopsis thaliana, Borago spp., Cañóla, Ricinus spp., Theobroma spp., Zea spp., Gossypium spp, Crambe spp., Cuphea spp., Linum spp., Lesq uerelfa spp., Limnanthes spp., Linola, Tropaeolum spp., Oenothera spp., Olea spp., Elaeis spp., Arachís spp., semilla de colza, Carthamus spp., Glycine spp., Soja spp., Helianthus spp., Nicotiana spp., Vernonia spp., Triticum spp., Hordeum spp., Oryza spp., / ena spp., Sorghum spp., Sécale spp., Brassicaceae, y otros miembros de la familia de plantas Gram/neae.

51. Un método para alterar la tolerancia a la sequía de una planta, comprendiendo dicho método: introducir una construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico, seleccionada del grupo consistente de las SEQ ID No:1 y SEQ ID No:3, que codifica un polipéptido que tiene una actividad de cinasa de proteína relacionada con la planta Snf1 dentro de un vector de transformación de la planta; transformar el genoma de una planta o semilla de la planta con dicho vector de transformación de la planta; expresar la secuencia de ácido nucleico; cultivar la planta o semilla de la planta; y seleccionar una planta transformada que tiene una tolerancia a la sequía alterada comparada con una tolerancia a la sequía promedio de un número importante estadísticamente importante de plantas del mismo genotipo conforme la planta es cultivada en condiciones idénticas, pero sin la secuencia de nucleótidos introducida.

52. Un método para alterar la biomasa de la raíz de una planta, comprendiendo dicho método: introducir una construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico, seleccionada del grupo consistente de las SEQ ID No:1 y SEQ ID No:3, que codifican un polipéptido que tiene una actividad de c i nasa de proteína relacionada con la planta Snf1 dentro de un vector de transformación de la planta; transformar el genoma de la planta o la semilla de la planta con dicho vector de transformación de la planta; expresar la secuencia de ácido nucleico; cultivar la planta o semilla de la planta; y seleccionar una planta transformada que tiene la biomasa de la raíz alterada comparada con una biomasa de raíz promedio de un número de plantas estadísticamente importante del mismo genotipo que la planta cultivada en condiciones idénticas, pero sin la secuencia de nucleótidos introducida.

53. La planta, semilla de la planta, o progenie de la misma tal y como se describe en la reivindicación 13, caracterizada porque comprende uno o más genes heterologos o alterados que imparten resistencia mejorada a la pérdida de agua, tolerancia a la sequía, asimilación del carbono, crecimiento y desarrollo de la planta, bioensamble de ácidos grasos, y crecimiento de la raíz en la planta, semilla de la planta, o progenie.