JP3107820B2 - 低温耐性植物およびその作製法 - Google Patents

低温耐性植物およびその作製法

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の技術分野 本発明は、脂質の脂肪酸の組成が変化した植物、より
詳細には、脂質の脂肪酸の組成が変化したことによって
低温傷害に対する耐性を与えられた植物およびそのよう
な植物の作製法に関する。
発明の背景 低温は種々の高等植物に傷害を与えるが、この傷害は
大きく二つに大別される。ひとつは０℃あるいはそれ以
下の温度で引き起こされる傷害であり、凍結傷害（free
zing injury）と呼ばれる。もう一つは本発明の主題で
あり、低温傷害（chilling injury）と呼ばれ、凍結傷
害とは全く異なる。熱帯・亜熱帯植物の多くは、５〜15
℃の範囲の温度によって、植物体全体および／または一
部の組織が傷害を受け、さまざまな生理的傷害および激
しい場合には最終的に死にまでいたる。
低温傷害を受けやすい植物を「低温感受性」植物と呼
び、これには多くの主要な農作物、たとえばイネ、トウ
モロコシ、ヤマイモ、サツマイモ、キュウリ、ピーマ
ン、ナス、カボチャ、バナナ、メロン、カランコエ、シ
クラメン、ユリ、バラ、ヒマ、ヘチマ、タバコが含まれ
る。これらの植物は５〜15℃、多くは10℃前後の温度
で、発芽や成長の阻害、組織の壊死、さらには植物体全
体の枯死などさまざまな傷害を受けるため、冷害や霜害
にあいやすい。また、低温感受性植物の収穫物である果
実、野菜などは低温保存ができない（バナナを冷蔵庫か
ら取り出すとすぐに黒変することにみられるように）た
め、収穫後の長期保存が難しい。
これに対し、多くの温帯起源の植物は０℃付近の低温
でも傷害を受けない低温耐性植物である。低温耐性の農
作物には、コムギ、オオムギ、ホウレンソウ、レタス、
ダイコン、エンドウ、ネギ、キャベツ、などを挙げるこ
とができる。野生の植物では、タンポポ、シロイヌナズ
ナなども低温耐性である。
低温傷害は、細胞の生体膜を構成する膜脂質の流動性
を関連が深い。生体膜は生細胞の基本構造単位の一つで
ある。それらは細胞膜として細胞の中と外を区切るだけ
でなく、真核細胞においては、さまざまな膜構造体（細
胞内小器官）を形成して、細胞内を種々の機能単位に分
画する。生体膜は種々の高分子物質や荷電低分子物質に
対して単なる物理的なバリアではなく、膜中のタンパク
質の働きにより、特定の物質を選択的に透過させたり、
および／または濃度勾配に逆らって能動輸送したりする
ことができる。このように生体膜は、細胞質や細胞内小
器官内の微環境をそれぞれの目的に応じて好適な状態に
保つ。いくつかの生化学的過程では、たとえば呼吸や光
合成によるエネルギー生成のように、生体膜の中と外の
特定物質の特定の濃度勾配が必要になる。光合成の場合
には、光エネルギーによって葉緑体中のチラコイド膜の
両側に水素イオンの濃度勾配が形成され、この濃度勾配
のエネルギーが、チラコイド膜中のタンパク質によっ
て、生細胞中で利用される高エネルギー物質であるATP
に変換されるのである。従って、もしも生体膜に前記し
たようなバリア能がなければ、細胞中の微環境が損なわ
れるばかりでなく、濃度勾配に基づくこれらの細胞機能
も損なわれ、生細胞に大きな機能障害が生じるであろ
う。
生体膜を構成する膜脂質は主にリン脂質および、葉緑
体においては糖脂質である。リン脂質はグリセロールの
１位と２位に長鎖アルキル基（脂肪酸アシル基）が、３
位にリン酸基を介して極性基が結合した物質である。そ
れらはひとつの分子中に親水性部分（極性基）と疎水性
部分（脂肪酸アシル基）を持つ両性（amphipathic）物
質であり、そのため水中に分散させると、疎水性部分を
内側、親水性部分を表面側にした脂質二分子層を形成す
る。この脂質二分子層は生体膜の基本構造であり、その
内部および／または表面に種々のタンパク質が「埋め込
まれて」いる。脂質二分子層は、生理条件下では二分子
層内部が高い流動性を持っており、タンパク質や脂質分
子の膜中での自由な横方向拡散や回転を可能にしてい
る。このような生体膜の流動性は細胞の機能にとって必
須である（Darnell,J.et al.,“Molecular cell biolog
y",Scientific American Books,1986）。
液晶状態にある脂質二分子層の温度を相転移温度（T
c）と呼ばれる特定の温度まで下げていくと、その二分
子層は膜内部の流動性が低いゲル状態に移行する。生体
膜のように種々の脂質が混在した膜では、ある温度にお
いてTcの高い脂質がゲル化し始めるが、Tcの低い脂質は
まだ液晶状態のままであるので、膜中に液晶相とゲル相
とが混在した状態になる。相分離状態では生体膜は荷電
低分子物質に対するバリア能を失う。
低温傷害と膜脂質の相転移の関係が最初に提唱された
のは1970年代の初頭である（Lyons,J.M.,Ann.Rev.Plant
Physiol.,24:445,1973）。しかしながら、この時点で
はこの関係を裏付ける具体的な知見はなかった。その
後、モデル生物としてシアノバクテリア（藍藻）を用い
て行われた一連の実験では、低温において細胞膜が相分
離状態になり、その結果イオンなどの電解質が非可逆的
に細胞外へ流出することによりシアノバクテリアに低温
傷害が起きることが明らかにされた（Murata,N.and Nis
hida,I,in“The biochemistry of plants vol.9 Lipid
s:Structure and function",p.315,Academic Press,Orl
ando,1987））。
通常脂質は極性基によって分類される（膜脂質の構造
は前記参照）が、これは、カラムや薄層クロマトグラフ
ィなどにおける挙動が、極性基によってほぼ決まるから
である。しかし、極性基が同じであっても、結合してい
るひたつの脂肪酸アシル基の組合せによって多くのさま
ざまな分子が存在する。これらの分子を区別するため
に、「分子種」という言葉が用いられる。各脂質分子種
のTcは脂肪酸アシル基の鎖長や不飽和度（二重結合の
数）、および極性基の種類、さらにある場合には周囲の
塩濃度などに依存する。これらの中でも最も影響の大き
いのは脂肪酸アシル基の不飽和度であり、脂肪酸アシル
基がふたつとも飽和している特定の分子種のTcは室温よ
りも高く、一方の脂肪酸アシル基にひとつ二重結合が入
ると、Tcは０℃前後まで下がる（Santaren,J.F.et al.,
Biochem.Biophys,Acta,687:231,1982）（ただしその二
重結合がトランス型の立体配座をとる場合には、Tcに対
する効果は非常に小さい（Phillips,M.C.et al.,Chem.P
hys.Lipids,8:127,1972。膜脂質のほとんどの二重結合
はシス型立体配座であり、トランス型立体配座は比較的
まれである）。このことは、脂肪酸アシル基中に二重結
合を少なくとも１個持つような脂質分子種（以下「不飽
和分子種」という）は、低温傷害がおきる10℃前後の温
度で相転移を起こさないことを意味する。したがってふ
たつの脂肪酸アシル基がともに飽和している脂質分子種
（以下、「飽和分子種」という）のみが低温傷害の起因
（primary event）と考えられる生体膜の相分離の原因
となりうる。
種々の低温感受性および低温耐性植物の膜脂質を抽出
し、極性基の種類ごとに分離して脂肪酸組成および分子
種組成を調べた。その結果、植物の膜脂質の中で飽和分
子種が明らかに多いのはホスファチジルグリセロール
（PG）のみであること、およびPG中の飽和分子種の割合
が、低温感受性植物では高い（30〜70％）のに対し、低
温耐性植物では低（＜20％）ことが見いだされた（Mura
ta,N.,Plant Cell Physiol.,24:81,1983;Roughan,P.G.,
Plant Physiol.,77:740,1985）。PGはプラスチド（葉緑
体、色素体）の生体膜の主な成分であるから、PG分子種
組成と低温感受性間のこの関係は、高等植物の低温傷害
の主な起因がPGの相転移によって引き起こされるプラス
チド生体膜の相分離であることを強く示唆している（Mu
rata,N.and Nishida,I.,in Chilling injury of hortic
ultural crops,p.181,CRC Press,Boca Raton,1990）。
PGはプラスチドに局在するが、緑葉においてはもっぱ
ら葉緑体で合成される（Sparace,S.A.and Mudd,J.B.Pla
nt Physiol.,70:1260,1982）。その生合成経路は次のよ
うなステップで進む。
1. グリセロール−３−リン酸のsn−１位に脂肪酸アシ
ル基が転移。
2. sn−２位にもうひとつの脂肪酸アシル基が転移。
3. ３−リン酸基にグリセロールがエステル結合。
4. 脂肪酸アシル基の不飽和化。
脂肪酸はもっぱら葉緑体で合成される。合成された脂
肪酸はアシルキャリアタンパク質（ACP）と呼ばれるタ
ンパク質に結合したアシル−ACPとしてPG合成のステッ
プ１、２の反応に供される。葉緑体で合成される脂肪酸
の大部分は、パルミチン酸（飽和Ｃ−16酸、以下16:0と
表記）およびオレイン酸（モノ−不飽和Ｃ−18酸、以下
18:1と表記）である。
前記した概要のステップ１は、Acyl−ACP:glycerol−
３−phospate acyltransferase（EC 2.3.1.15）（以下A
Taseと表記）によって触媒される。この酵素は葉緑体の
ストローマに存在する可溶性酵素である。これはホウレ
ンソウ、エンドウで部分精製され（Bertrams,M.and Hei
nz,E.,Plant Physiol.,68:653,1981）、カボチャでは均
一に精製されている（Nishida,I.et al.,Plant Cell Ph
ysiol.,28:1071,1987）。この酵素は核遺伝子にコード
されており、カボチャ、シロイヌナズナおよび最近エン
ドウからこの遺伝子がクローニングされている（Ishiza
ki,O.et al.,FEBS Lett.,238:424,1988;Nishida,I.et a
l.,in“Plnat lipid biochemistry structure and util
ization",Portland Press,London,1990;Weber,S.et a
l.,Plant Molec.Biol.,17:1067,1991）。種々の取得源
からのATaseは、基質であるアシル−ACPの選択性におい
て異なる。低温耐性であるホウレンソウ、エンドウ、シ
ロイヌナズナ由来のATaseは18:1−ACPに高い選択性を示
すのに対し、低温感受性植物であるカボチャ由来のATas
eは、18:1−ACPと16:0−ACPの両者を同程度に利用する
（Frenzen,M.et al.,Eur.J.Biochem.,129:629,1983;Fre
ntzen,M.et al.,Plant Cell Physiol.,28:1195,198
8）。
前記概要のステップ２を触媒する酵素は葉緑体の包膜
の膜結合酵素であり、16:0−ACPのみを利用する（Frent
zen,M.et al.,Eur.J.Biochem.,129:629,1983）。16:3植
物と呼ばれる多くの植物種において、ステップ１、２の
中間産物であるホスファチジン酸（1,2−diacylglycero
l−３−phosphate）は、葉緑体で合成されるグリセロ脂
質（モノ−およびジガラクトシルジアシルグリセロール
およびスルフォキノボシルジアシルグリセロール）の中
間産物でもある。従って、16:3植物の葉緑体中ではステ
ップ１、２は脂質合成に共通である。
PG生合成のステップ３、４に関与する酵素については
ほとんどわかっていない。しかし、PG中の脂肪酸アシル
基の不飽和化は、平均に起こるのではないことは知られ
ている。sn−１位においては、18:1の多くがさらに不飽
和化されて２ないし３個の二重結合を持つようになるの
に対し、16:0には不飽和化が起こらない。sn−２位にお
いては、結合した16:0のいくらかは、３−trans−ヘキ
サデセン酸（以下16:1tと表記）になるが、シス型の二
重結合は導入されない。トランス型の二重結合は相転移
温度を下げる効果が非常に小さいので、PGの２位におい
て16:0から16:1tへの変換によってTcが10℃程度低くな
るだけで、その結果Tcは低温傷害が起こる温度よりもま
だ高いであろう（Bishop,D.G.and Kenrick,J.R.,Phytoc
hemistry,26:3065,1987）。そこで以下の記述において
は、16:1tを結合したPG分子種を飽和分子種に含めるこ
ととする。シス型の二重結合は２位の脂肪酸アシル基に
は導入されないので、１位の脂肪酸アシル基は飽和分子
種の含量を決定する上で非常に重要である。
低温感受性の農作物には、前記したように、低温耐性
および収穫後の長期保存において大きな問題がある。と
ころが低温感受性農作物には農業生産上非常に重要で欠
かせないものが多く、たとえばイネやトウモロコシは世
界各地の主要穀物である。これら農作物の低温耐性を改
善できれば、低温環境で栽培すること、および／または
収穫物の長期の保存が容易になる。低温感受性であるた
めに温室で栽培されている観賞用花卉や野菜は、低温耐
性の向上によって、温室が不要になったり、あるいは暖
房費用を大幅に節減できることが予想される。さらに、
気温が農作物の栽培限界の主因子になっている場合が多
いことから、低温耐性の向上は作物を栽培する地域を拡
大できると考えられる。
このように、低温耐性植物に対する強い要求があり、
また低温耐性は、作物育種の重要な目標の一つとなって
いる。しかし従来の交雑育種では、交雑は同一種内でし
かできないため、低温耐性育種には遺伝子源に限りがあ
る。高等植物の遺伝子工学における最近の進歩は無限の
遺伝子源の中の遺伝子を、作物に導入することを可能に
した。そこで、遺伝子操作技術によって低温耐性能を与
えることができれば、その効果は計り知れない。
前記したように、高等植物の低温傷害の起因（primar
y event）はプラスチド膜の相分離であり、低温感受性
植物のプラスミド膜にはPGの飽和分子種が多く含まれて
おり、これが相分離を起こす原因と考えられている。し
たがって、低温感受性植物のPGの脂肪酸の組成を変え、
飽和分子種の含量を下げることによって低温感受性植物
の低温耐性を増加させることが可能かもしれない。（Mu
rata,N.,Plant Cell Physiol.24:81,1983）。しかしな
がら、これはあくまで単なる仮説であり、これまでに脂
質の脂肪酸組成を変化させるそのような方法あるいは脂
肪酸組成が変化した植物は全く報告されていない。
発明の概要 本発明は、高等植物において膜脂質、特にホスファチ
ジルグリセロール（PG）の不飽和脂肪酸含量を増加させ
る新規な方法を提供する。要約すれば、これらの方法
は、植物にパルミトイル−アシルキャリアタンパク質
（16:0−ACP）よりもオレオイル−アシルキャリアタン
パク質（18:1−ACP）に対してより高い基質選択性を持
つグリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ
（ATase）活性を有するポリペプチドをコードするDNA配
列を導入して発現させることを特徴とするものである。
本発明はまた、膜脂質の不飽和脂肪酸をある高等植物
種が本来含むより多く含む高等植物を提供する。このよ
うな植物の好ましい態様は、パルミトイル−アシルキャ
リアタンパク質よりもオレオイル−アシルキャリアタン
パク質に対してより高い基質選択性を持つグリセロール
−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ活性を有するポ
リペプチドを発現する形質転換植物である。
ATaseは葉緑体中の脂質生合成の最初のステップを触
媒し、異なる植物種に由来するATaseは、アシル−ACPに
対して異なった基質選択性を示すことは、前記したとこ
ろである。ホウレンソウ、エンドウ、シロイヌナズナの
ような低温耐性植物由来のATaseは18:1−ACPに高い選択
性を示すのに対し、カボチャのような低温感受性植物由
来のATaseは、18:1−ACPと16:0−ACPの両者を同程度に
利用する。
本発明に使用し18:1−ACPに対してより高い基質選択
性を持つATaseをコードするDNA配列は、低温耐性植物の
ATaseをコードするDNA配列および高等植物以外の生物に
由来するATaseをコードするDNA配列の任意のものであり
うる。
好ましくは低温耐性植物のATase、より好ましくはホ
ウレンソウ、エンドウ、シロイヌナズナ、のATaseをコ
ードするDNA配列が用いられる。これらの外来性DNA配列
を発現させてATaseを産生するには、この配列に、発現
調節配列（プロモーター、ターミネーターなど）やタン
パク質を葉緑体へ輸送するのに必要なトランジットペプ
チドをコードする配列を適宜組み合わせたものを用いる
ことにより可能となる。DNA構築物は、当業者に公知で
あって対象とする植物に適切な任意の一般的方法によっ
て植物ゲノムに導入することができる。
本発明によれば、18:1−ACPに対してより高い基質選
択性を持つATaseをコードする外来性DNA配列を植物に導
入して発現させることにより、この植物の膜脂質の不飽
和脂肪酸含量が高まる。本発明の実施において特に重要
な点は、PGの不飽和脂肪酸含量が増加し、その結果PGの
飽和分子種含量が顕著に低下することである。前記した
通り、PGの飽和分子種はプラスチド生体膜の相分離の原
因となり、ある植物の低温傷害に対する耐性能と、PGの
飽和分子種の含量とは負の相関をすることが知られてい
る。
従って、本発明はまた、ホスファチジルグリセロール
の飽和分子種の含量を低下させることにより、０℃より
高い低温で傷害を受ける高等植物（低温感受性植物）
に、本来低温傷害を引起こす温度より低い温度でも障害
をおこさないようにする方法を提供する。
さらに、本発明は、低温傷害に対する耐性が向上した
高等植物を提供する。すなわち、本発明は本来低温傷害
を生ずる温度より低い温度でも障害がおこらない高等植
物種を提供する。この植物の好ましい態様は、パルミト
イル−アシルキャリアタンパク質よりも、オレオイル−
アシルキャリアタンパク質に対して、より高い基質選択
性を持つグリセロール−３−リン酸アシルトランスフェ
ラーゼ活性を有するポリペプチドの発現によって、ホス
ファチジルグリセロールの飽和分子種の含量が本来より
少ない形質転換植物である。
図面の簡単な説明 第１図は、抗シロイヌナズナATase抗体を用いた、シ
ロイヌナズナATase導入形質転換タバコ植物体のウエス
タンブロット分析の結果を示す。レーン１は大腸菌中で
発現されたシロイヌナズナATase調製物50ngを含む。レ
ーン２は非形質転換コントロール植物の全葉緑体タンパ
ク質10μｇを含む。レーン３〜７はそれぞれ形質転換植
物No.1〜５に由来する各全葉緑体タンパク質10μｇを含
む。レーン８は形質転換植物No.1に由来する全葉片タン
パク質10μｇを含む。
第２図は、形質転換タバコ植物体の光合成活性に対す
る低温処理の影響を示す。上部から下部までは、順にベ
クターpBI121、シロイヌナズナATase cDNAおよびカボ
チャATase cDNAで形質転換されたタバコである。
第３図は、植物体レベルでの形質転換タバコ植物体に
対する低温処理の影響を示す。上図および下図はそれぞ
れコントロールのpBI−121形質転換タバコ植物体および
シロイヌナズナATase cDNA導入形質転換植物体であ
り、低温処理の前（左）および後（右）である。
発明の具体的説明 一般に、あるDNA配列を発現させてそれがコードする
ポリペプチドを産生させるためには、そのポリペプチド
に対応するコーティング配列の他に、発現調節配列が必
須である。特に重要なのは、コーディング配列上流のプ
ロモーター配列および下流のポリアデニル化シグナルで
ある。本発明において、プロモーターおよびポリアデニ
ル化シグナルとしては、植物中で機能することが知られ
ている公知のもの、例えばカリフラワーモザイクウィル
ス35Sプロモーター、ノパリン合成酵素のプロモータ
ー、リブロース二リン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナ
ーゼ小サブユニットのプロモーター、およびノパリン合
成酵素のポリアデニル化シグナル、オクトピン合成酵素
のポリアデニル化シグナル、などを適宜組み合わせて用
いることができる。さらに発現されたポリペプチドを細
胞の特定の場所、たとえば葉緑体に輸送したい場合に
は、ポリペプチドのＮ末端にトランジットまたはリーダ
ーペプチド配列がなければならない。したがって、本発
明で「ATase（あるいはATase活性を有するポリペプチ
ド）をコードするDNA配列」というときは、このコーテ
ィング領域のみを限定して指すのではなく、発現調節配
列および／またはトランジットペプチドをコードする配
列をも包含するものとする。
本発明で用いる16:0−ACPよりも18:1−ACPに対してよ
り高い基質選択性を持つATase活性を有するポリペプチ
ドをコードするDNA配列として好ましいのは、低温耐性
植物、とりわけホウレンソウ、エンドウ、シロイヌナズ
ナ、のATaseをコードするDNA配列である。そのようなDN
A配列は、全部または一部を化学合成することができる
が、より好ましくは低温耐性植物からATaseをコードす
るcDNAまたはゲノムDNAをクローニングして得ることが
できる。以下に示す具体例では、シロイヌナズナ（Arab
idopsis thaliana）のATaseをコードするcDNA（Nishid
a,I.et al.,in“Plant lipid biochemistry,structure
and utilization",Portland Press,London,1990）を用
いた。しかしながら、本発明で使用できるDNA配列は、
上記したようなシロイヌナズナATaseのcDNA配列に限定
されるものではない。
このシロイヌナズナのATaseをコードするcDNAの塩基
配列を配列番号１に示した。このcDNAの取得そのものは
本発明を構成する要素ではないが、参考のために、詳細
な取得方法を後記する参考例１、２に示す。要約すれ
ば、シロイヌナズナATaseをコードするゲノムDNAクロー
ンはカボチャATaseのcDNAフラグメントをプローブとし
て用いシロイヌナズナのゲノムDNAライブラリーから取
得した。このゲノムDNAをプローブとしてシロイヌナズ
ナのcDNAライブラリーをスクリーニングしてcDNAクロー
ンを得た。配列番号１に示したシロイヌナズナのcDNA
は、459アミノ酸から成る分子量50,431のポリペプチド
をコードしている。このポリペプチドのＮ末端から90番
目のアミノ酸までは、葉緑体への輸送に必要なトランジ
ットペプチドであると考えられており、トランジットペ
プチドは輸送に際して切断され、369アミノ酸から成る
成熟酵素となる。このcDNAを大腸菌で発現させて得られ
るATaseは、16:0−ACPよりも18:1−ACPに対してより高
い基質選択性を示す（参考例３）。
得られたDNA配列がcDNAである場合には、このcDNAを
形質転換植物中で発現させるために、cDNA配列の上流お
よび下流に適当な発現調節配列が必要である。取得した
DNA配列がゲノムDNAフラグメントで調節配列が含まれて
いる場合は、そのフラグメントをそのまま用いてもよ
い。さらに、本発明によって発現されるATaseは葉緑体
中での脂質合成に関与するので、形質転換植物中で発現
されたATaseは、細胞質から葉緑体に輸送されることが
必要である。一般に核ゲノムにコードされているタンパ
ク質を葉緑体に輸送するためには、そのＮ末端にトラン
ジットペプチド配列が必要である（Van den Broeck et
al.,Nature,313:358,1985）。高等植物のプラスチドに
存在するATaseは本来細胞質で合成されて葉緑体で機能
するので、後記の具体例で用いるシロイヌナズナATase
のcDNAに見られるように、高等植物ATaseをコードするD
NA配列は、cDNAまたはゲノムDNAフラグメントであって
も、トランジットペプチドとして機能するアミノ酸配列
をコードするDNA配列を含んでいると考えられる。しか
し、必要があれば、リブロース二リン酸カルボキシラー
ゼ／オキシゲナーゼ小サブユニットのトランジットペプ
チドのような、公知のトランジットペプチドをコードす
るDNA配列を利用してもよい。
本発明によれば、16:0−ACPよりも18:1−ACPに対して
より高い基質選択性を持つATaseのポリペプチドをコー
ドするDNA配列は、細菌など高等植物以外の生物由来のA
TaseをコードするDNA配列を用いることもできる。この
ようなDNA配列を用いる時、適当な発現調節配列および
トランジットペプチドをコードする配列を、このDNA配
列の上流および／または下流に適当な配置となるように
つなげることが必要になることがあろう。このような配
置を生成させるための具体的な構成および操作は、Mole
cular Cloning 2nd ed.（Sambrook et al.eds.,Cold Sp
ring Harbar Laboratory Press,New York,1989）のよう
な実験操作法を参照することができ、また当業者にとっ
て容易に理解できるところである。
本発明において使用する、16:0−ACPよりも18:1−ACP
に対してより高い基質選択性を持つATaseのポリペプチ
ドをコードするDNA配列としてはまた、前記したような
各種ATaseの誘導体をコードするものであってもよい。
ここで「誘導体」とは、前記のATaseに対して１または
それより多くのアミノ酸の置換、欠失、挿入または付加
のあるポリペプチドであって、そのアミノ酸配列の変化
が、ATase活性および18:1−ACPに対する基質選択性を低
下させることのないようなものをいう。
本発明を用いて形質転換植物を作製するのに好適な低
温感受性植物としては、イネ、トウモロコシ、ヤマイ
モ、サツマイモ、キュウリ、ピーマン、ナス、カボチ
ャ、バナナ、メロン、シクラメン、ユリ、バラ、ヒマ、
ヘチマ、タバコ、などがあげられるが、これらに限定さ
れるものではない。
高等植物にDNA配列を導入するには、植物の形質転換
のために確立されている任意の方法、たとえばアグロバ
クテリウムのTiプラスミドをベクターとして用いる方法
やプロトプラストにエレクトロポレーションで導入する
方法などを、対象とする植物に応じて適宜用いることが
できる（たとえば“Plant genetic transformation and
gene expression;a laboratory manual",Draper,J.et
al.eds.,Blackwell Scientific Publications,1988参
照）。一般に、双方葉植物の場合には、Tiプラスミドベ
クターを用いるのが好ましく、単子葉植物やアグロバク
テリウムに感染しにくい双子葉植物の場合には、エレク
トロポレーションなどの物理的導入法が好ましい。形質
転換のための植物材料としては、導入法に応じて、葉片
（leaf disk）、茎片（stem disk）、塊茎片（tuber di
sk）、プロトプラスト、カルス、花粉、花粉管などの組
織片を用いることができる。
本発明においては、16:0−ACPよりも18:1−ACPに対し
てより高い基質選択性を持つATaseをコードするDNA配列
を高等植物に組み込んで発現させることにより、特にPG
の不飽和脂肪酸含量が増加し、その結果PG中の飽和分子
種含量が顕著に低下する。
ATaseはPG生合成の最初のステップを触媒するが、同
時に、多くの植物ではこのステップは葉緑体中での他の
脂質の生合成経路に共通しており（発明の背景参照）、
ATaseの反応生成物はPGだけでなく他の種々の脂質に利
用される。また、基質選択性の異なる外来のATaseの形
質転換植物で発現させても、その植物が本来持っている
ATaseが失われるわけではないので、必ずしも外来のATa
seの基質選択性が反映されるとは限らない。したがっ
て、外来のATaseを発現させても、膜脂質の脂肪酸組
成、ましてやPGの分子種組成が変化するかどうか予測す
ることはできなかった。これらの点から、本発明におい
て見られるようなPGの飽和分子種含量の顕著な低下は全
く予期せぬことであった。
本発明によりPCの飽和分子種、すなわち生体膜の相分
離を引き起こし高等植物の低温傷害の原因となる脂質分
子種を大幅に減らすことができる。これは遺伝子操作に
よって植物に低温耐性を賦与した最初の例である。
以下、実験例によって本発明をより具体的に説明す
る。
実験例１ シロイヌナズナATaseのゲノムDNAフラグメン
トの単離 （１）ゲノムDNAライブラリーの作成 約10g（湿重量）のシロイヌナズナ（Arabidopsis th
aliana Heynhold）（Lansberg系統）の葉および茎より
Current Protocols in Molecular Biology,（Ausbel,F.
M.et al.eds.）vol.1,pp.2,3,1−2,3,3（John Wiley an
d Sons,1987）の方法に従ってゲノムDNAを調製した。
ゲノムDNAを制限酵素Sau 3AIで部分分解し、ラムダフ
ァージベクターλDASH（Stratagene）のBamH Iサイトに
挿入し、試験管内パッケージングキット（GIGAPACK GOL
D;Stratagene）を用いてλファージ粒子にパッケージン
グし、ゲノムDNAのλファージライブラリーを得た。
（２）ATaseのゲノムDNAフラグメントの単離 ファージライブラリーを大腸菌P2392株（Stratagen
e）に感染させ、３枚のプレート（10cm×14cm）（各プ
レート当りプラーク６×103〜６×104個）をスクリーニ
ングした。ファージをフィルターに移し、このフィルタ
ーを５×デンハート液（0.1％フィコール、0.1％ポリビ
ニルピロリドン、0.1％牛血清アルブミン）、６×SSC
（90mM NaCl、90mM クエン酸ナトリウム、pH7.4）、10
％硫酸デキストラン、0.1％SDSおよび100μg/mlのサケ
精子DNAを含むハイブリダイゼーション溶液中で68℃に
２時間保持した。
大腸菌AT−03（FERM BP−3094）から単離したカボチ
ャATaseのcDNAを有する組換えプラスミドpAT−03から、
制限酵素EcoR Iで切断することにより、カボチャ（Cucu
rbita moschata Duch）ATaseのcDNAの1.4kbフラグメ
ントを得た。このcDNAフラグメントをニックトランスレ
ーション（ニックトランスレーションキット；宝酒造）
に供し、32P−dATPでラベルして比活性約108dpm/μｇの
プローブを得た。
このプローブをハイブリダイゼーション溶液に加えて
さらに50℃、12時間インキュベーションした。フィルタ
ーを２×SSC、0.1％SDS液中40℃で洗浄した後オートラ
ジオグラフィーを行い、プローブと強くハイブリダイズ
するファージを選抜した。
選択されたファージDNAから制限酵素BamH Iによりシ
ロイヌナズナのゲノムDNAを切り出し、0.8％アガロース
ゲル電気泳動後、2.6kbのDNAフラグメントを回収した。
この断片はプローブに強くハイブリダイズした。これを
プラスミドベクターpBLUESCRIPT（Stratagene）にサブ
クローニングしてプラスミドpBB2.6を得た。
実験例２ シロイヌナズナATaseのcDNAの単離 （１）cDNAライブラリーの作成 約15g（湿重量）のシロイヌナズナ（Arabidopsis th
aliana Heynhold）（Lansberg系統）の葉および茎より
Current Protocols in Molecular Biolory,（Ausbel,F.
M.et al.eds.）vol.1,pp.4,3,1−4,3,4（John Wiley an
d Sons,1987）の方法に従って全RNAを調製した。この全
RNAをもとにWolfらの方法（Nucleic Acids Res.15:291
1,1987）に従ってポリ（Ａ）+RNAを調製した。
上記のポリ（Ａ）+RNAに対して相補的なDNAをファル
マシア社のcDNA合成キット（コードNo.27−9260−01）
を使い、そのマニュアルに従ってオリゴ（dT）ヌクレオ
チドをプライマーとして合成した。このようにして合成
した２本鎖からなるcDNAの各末端には、Not I識別配列
を内部にもつEcoR Iアダプター（Pharmacia）を付け、
これをラムダファージベクターλZAPII（Stratagene）
のEcoR I部位に連結した。このDNAを、試験管内パッケ
ージングキット（GIGAPACK II GOLD;Stratagene）を用
いてλファージ粒子にパッケージングし、cDNAのλZAPI
Iファージライブラリーを得た。
（２）ATase cDNAの単離 上記のようにして得られたλファージライブラリーを
大腸菌XL1−Blue株（Stratagene）に感染させ、１プレ
ート当りプラーク２×104個を含む５枚のプレート（10c
m×14cm）をスクリーニングした。ファージをフィルタ
ーに吸着させ、このフィルターを６×SSC、0.05％スキ
ムミルク、0.02％アジ化ナトリウムを含むハイブリダイ
ゼーション液中で65℃に１時間保持した。シロイヌナズ
ナATaseのゲノムDNAフラグメントを含む組換えプラスミ
ドpBB2.6（参考例１（２））から、制限酵素BamH Iで切
断することによってシロイヌナズナATaseのゲノムDNAフ
ラグメントを得た。このDNAフラグメントをニックトラ
ンスレーション（ニックトランスレーションキット；宝
酒造）に供し、32P−dATPでラベルして比活性約107dpm/
μｇのプローブを得た。このプローブをハイブリダイゼ
ーション溶液に加えてさらに65℃、16時間インキュベー
ションした。フィルターを１×SSC、0.1％SDS液中65℃
で洗浄した後オートラジオグラフィーを行い、プローブ
と強くハイブリダイズするファージを選抜した。
選抜されたファージDNAから制限酵素EcoR Iにより挿
入DNAを切り出し、１％アガロースゲル電気泳動でサイ
ズを測定した。DNAフラグメントの一つは約1.4kbであっ
た。このフラグメントをプラスミドベクターpBLUESCRIP
T（Stratagene）にサブクローニングしてプラスミドpAR
ATを得た。このフラグメントの塩基配列を、ジデオキシ
ターミネーション法（Proc.Natl.Acad,Sci.USA,84:476
7,1987）によって決定した。
挿入DNAの長さは1,445bであり、その中に1,380b（終
止コドンを含む）からなるオープンリーディングフレー
ム（ORF）が見いだされ、この塩基配列を配列番号１に
示す。このオープンリーディングフレームはカボチャAT
aseのcDNAの塩基およびアミノ酸配列と高い相同性があ
ることから、配列番号１の塩基番号16から1,392のDNA配
列は葉緑体へのトランジットペプチドを含む459アミノ
酸，分子量50,431からなるシロイヌナズナATaseの前駆
体をコードしていると推定された。オープンリーディン
グフレームの上流及び下流には、それぞれ15bおよび53b
からなる５′非翻訳領域および３′非翻訳領域が存在し
た。配列番号１に示されているアミノ酸配列−90から−
１はカボチャATaseとの比較から葉緑体へのトランジッ
トペプチドと推測される。
実験例３ シロイヌナズナおよびカボチャ（コントロー
ル）ATaseの大腸菌での発現と基質選択性の比較 （１）大腸菌発現ベクターの構築 参考例２（２）で得られたプラスミドpARATを制限酵
素Hga I（配列番号１の塩基番号285の後を切断する）と
EcoR I（切断部位はcDNAの下流のベクター配列中にあ
る）で切断した。低融点アガロースゲル電気泳動後シロ
イヌナズナATaseのcDNAを含む1.1kbのフラグメントを単
離し、Klenowフラグメントで平滑末端処理した。一方プ
ラスミドpET3c（Novagen）を制限酵素BamH Iで切断し、
Klenowフラグメントで平滑末端処理した後、大腸菌のア
ルカリホスファターゼにより５′末端のリン酸基を除去
した。このようにして得たシロイヌナズナATaseのcDNA
フラグメントとpET3cをT4 DNAライゲースを用いて連結
し、T7プロモーター、T7リーダー配列、シロイヌナズナ
ATaseのcDNAおよびT7ターミネーターを含む発現用ベク
タープラスミドpAR1を得た。
大腸菌AT−03（FERM BP−3094）から調製したカボチ
ャATaseのcDNAを含むプラスミドpAT−03を、制限酵素Ec
oR IとNae Iで切断後、低融点アガロースゲル電気泳動
で1.2kbのカボチャATaseのcDNAを単離した。このフラグ
メントをKlenowフラグメントで平滑末端とし、大腸菌の
アルカリホスファターゼで５′−末端のリン酸基を除去
した。このようにして得たカボチャATaseのcDNAフラグ
メントとpET3cをT4DNAライゲースで連結してT7プロモー
ター、T7リーダー配列、カボチャATaseのcDNAおよびT7
ターミネーターを含む発現用ベクタープラスミドpSQ1を
得た。
大腸菌BL21（DE3）（Novagen）のコンピテントセルを
Molecular Cloning（Maniatis,T,et al.eds.）pp.250−
251（1982）の方法に従って調製した。得られたプラス
ミドpAR1とpSQ1をそれぞれコンピテントセルに導入し、
アンピシリンによる選別によりそれぞれの形質転換体BL
AR1およびBLSQ1を得た。
形質転換体BLAR1およびBLSQ1を500mlのLB培地（200μ
g/mlのアンピシリンを含む）にそれぞれ接種し、37℃で
培養した。培養液の濁度が、波長600nmで0.5になるまで
培養を続けた。その後イソプロピルチオガラクトシドを
最終濃度0.4mMになるように加え、さらに３時間培養を
続けてATaseタンパク質の発現を誘導した。14,000×ｇ
で10分遠心分離して大腸菌を集めた。ペレットを50mM T
ris−HCl（pH7.4）で洗った後、HM緩衝液（45mM Tris−
HCl（pH7.4）、2mM DTT、10％グリセロール、10mMアス
コルビン酸ナトリウム、1mM Benzamidine−HCl、10μg/
ml leupeptin、5mM 6−aminohexanoic acid）に再び懸
濁した。この大腸菌懸濁液を10,000psiでの圧力下フレ
ンチプレスセルに通して細胞を破砕した。破砕液を16,0
00×ｇで10分、さらに100,000×ｇで60分遠心して、上
清を粗酵素画分として回収した。この粗酵素画分を10％
ポリアクリルアミドゲルSDS電気泳動で分離しクマシー
ブリリアントブルーで染色したところ、シロイヌナズナ
またはカボチャのATaseが、相対分子量約40,000のタン
パク質として検出された。
（２）ATase活性の確認 16:0−CoAとＬ−［Ｕ−14C］ グリセロール−３−リ
ン酸を基質として用い西田らの方法（Plant Cell Physi
ol.28:1071,1987）により、粗酵素画分のATase活性を測
定した。大腸菌形質転換体BLAR1およびBLSQ1の粗酵素画
分はいずれもATase活性（グリセロール−３−リン酸へ
の16:0の転移）を示した。それらの画分の比活性はそれ
ぞれ2,000および530nmol/min・mg proteinであった。
得られたATaseの基質選択性をFrentzenらの方法（Pla
nt Cell Physiol.28:1195,1987）により解析した。反応
混合液は、30mMのグリセロール−３−リン酸、それぞれ
1.5μＭの［１−14C］16:0−ACPと［１−14C］18:1−AC
P、および約180pmol/min酵素活性相当の発現ATaseの粗
酵素画分を含む。この測定はpH7.4および8.2で行なっ
た。その結果を表１に示す。シロイヌナズナATaseは、
カボチャATaseと異なり、18:1−ACPに対して高い基質選
択性を示した。
例１ シロイヌナズナATaseのcDNAのタバコ植物体中で
の発現 タバコは低温感受性植物であるが、低温感受性植物の
中では比較的低温に強いと考えられている。シロイヌナ
ズナATaseのcDNAを以下のようにしてタバコに導入して
発現させた。
（１）植物発現用ベクターの構築 植物発現型バイナリープラミドpBI121（Clontech）を
制限酵素Sac IとBamH Iで切断し、Klenowフラグメント
で切断単を平滑末端とした後、T4 DNAライゲースを用い
て両末端を連結した。こうして得たプラスミドpBI121
（−GUS）はβ−Glucuronidase（GUS）遺伝子を含まな
い。このプラスミドはカリフラワーモザイクウイルスの
35Sプロモーター（以後、35Sプロモーターと呼ぶ）とノ
パリン合成酵素（NOS）のターミネーターの間に制限酵
素Xba IとBamH Iのサイトをユニークサイトとして有す
る。
実験例２で得たプラスミドpARATをEcoR Iで切断し、
低融点アガロースゲル電気泳動によりシロイヌナズナAT
aseのcDNAの1.4kbフラグメントとベクターDNAを分離し
た。cDNAフラグメントをゲルから切り出して精製し、Kl
enowフラグメントで切断端を平滑末端とした。一方上記
で得たプラスミドpBI121（−GUS）を制限酵素Xba Iで切
断後、両末端を平滑末端とし,cDNAフラグメントを、こ
の平滑末端部位にクローニングし、35Sプロモーター，
シロイヌナズナATaseのcDNAおよびNOSターミネーターを
含む発現用プラスミドpBI121−35SARTを得た。
（２）pBI121−35SARTのアグロバクテリウムへの導入 Agrobacterium tumefaciens LBA4404（Clontech）
を、50mlのYEB培地（ビーフエキス5g/l、酵母エキス1g/
l、ペプトン1g/l、ショ糖5g/l、2mM MgSO4、pH7.4）に
接種し、28℃で24時間培養後、培養液を3,000rpm、４
℃、20分の遠心で集菌した。菌体を10mlの1mM HEPES（p
H7.4）で３回洗った後、3mlの10％グリセロールで１回
洗い、3mlの10％グリセロールに懸濁してプラスミド導
入用菌液とした。
アグロバクテリウム菌液50μｌおよびpBI121−35SART
1μｇをキュベットに入れ、エレクトロポレーション装
置（Gene Pulser;Bio−Rad）を用いて25μＦ、2,500V、
200Ωの条件で電気パルスをかけ、プラスミドDNAをアグ
ロバクテリウムに導入した。このエレクトロポレーショ
ン処理した菌液をエッペンドルフチューブに移し、800
μｌのSOC培地（トリプトン20g/l、酵母エキス5g/l、Na
Cl 0.5g/l、2.5mM KCl、pH7.0）を加え、28℃で1.5時間
静置培養した。この菌液50μｌを、100ppmのカナマイシ
ンを含むYEB寒天培地（寒天1.2％）上にまき、28℃で２
日間培養した。
得られたコロニー群からシングルコロニーを選んだ。
このコロニーを培養しアルカリ法でプラスミドDNAを調
製した。このプラスミドDNAを適当な制限酵素で消化後
１％アガロースゲル電気泳動によりDNAフラグメントを
分離し、32PでラベルしたシロイヌナズナATaseのcDNAを
プローブとしたサザン分析により、プラスミドpBI121−
35SARTが含まれていることを確認した。このアグロバク
テリウムをALBSARTと呼ぶ。
（３）タバコの形質転換 ALBSARTを、50ppmのカナマイシンを含むLB液体培地で
28℃、12時間培養した。培養液1.5mlを10,000rpm、３分
間遠心して集菌後、カナマイシンを除くために1mlのLB
培地で洗浄後集菌し、1.5mlのLB培地に再懸濁して感染
用菌液とした。
若いタバコ葉を0.5％次亜塩素酸ナトリウム水溶液に1
0分間浸せき後、滅菌水で３回洗い、滅菌済みの濾紙上
で余分の水を拭った。この葉を１片が1cm2になるように
無菌的に切断し、ALBSART菌液上に葉の裏を上にして置
き、２分間静かに振とうした後、滅菌済み濾紙上に葉を
置いて過剰の菌液を除いた。MS−B5培地（ベンジルアデ
ニン1.0ppm、ナフタレン酢酸0.1ppmおよび寒天0.8％を
含むMS培地）（Murashige,T.and Skoog,F.Plant Physio
l.,15:473,1962）上に、1mlのトマト（品種「くりこ
ま」）の懸濁培養細胞を広げた。ワットマンNo.1濾紙
（φ7.0cm）をトマト細胞懸濁培養液上に置き、この濾
紙に裏を上にして葉を置いた。シャーレをパラフィルム
でシールし、16時間明、８時間暗の周期で25℃、２日間
培養した。［特に記載されない限り、タバコ外植片また
は／および植物体はこの条件で培養した。］ついでクラ
ホラン（ヘキスト）250ppmを含むMS−B5培地上に移し、
さらに10日間培養してアグロバクテリウムを除去した。
次にクラホラン250ppmおよびカナマイシン100ppmを含む
MS−B5培地上に置床して、７日間培養した。この間に葉
片の周囲がカルス化し、シュート原基が生じた。さらに
10日間培養後、伸長したシュートをクラホラン250ppmお
よびカナマイシン100ppmを含むMSホルモンフリー培地に
移して培養を継続した。培養10日以内に発根したシュー
トを、カナマイシン耐性の形質転換体として選抜し、透
明なプラスチック容器内のクラホラン250ppmを含むMSホ
ルモンフリー培地に移植した。
（４）形質転換タバコ植物体のウエスタンブロッテング
分析 乳棒と乳鉢を用いて80mM Tris−HCl（pH6.8）、２％S
DS、５％グリセロール、720mM 2−メルカプトエタノー
ルを含む抽出バッファー中で湿重量0.5gのタバコ葉をす
りつぶした。つぶした葉をバッファーごとエッペンドル
フチューブに入れ、100℃で３分間熱処理した後、15,00
0rpm、20℃、10分間の遠心で上清を回収し全タンパク質
粗抽出液を得た。この粗抽出液中のタンパク質濃度をタ
ンパク質アッセイキット（Bio−Rad）を用いて定量し、
１μg/μｌの濃度に調製した。
全タンパク質粗抽出液10μｌをサンプルローディング
用バッファーと混合し、Laemmli（Nature,227:680,197
0）の系に従いSDS−PAGEゲル（第一化学）を用いて電気
泳動を行い、タンパク質を分離した。
分離したタンパク質を電気ブロッティング装置（アト
ー）を用いて0.025M Tris、0.192Mグリシン、20％エタ
ノール、0.01％SDSを含むブロッティングバッファー中,
100Vで１時間,PVDFメンブレンフィルター（ミリポア）
にブロッティングした。
このメンブレンを、ミルク液（５％ スキムミルク
（Difco）、10mM Tris−HCl、150mM NaCl、0.05％ Twee
n−20、0.05％ NaN3、pH7.2）に浸し、室温で10分間の
振とうを３回くり返して洗った。さらにミルク液中で室
温、３時間インキュベーションし、抗体の非特異的吸着
を防ぐためのブロッキングを行った。その後TBS−Ｔバ
ッファー（10mM Tris−HCl、150mM NaCl、0.05％ Tween
−20、0.05％ NaN3、pH7.2）で３分間の振とうを２回く
り返してメンブレンを洗った。このメンブレンを、TBS
−Ｔバッファーで500倍に希釈した抗シロイヌナズナATa
seマウス抗血清中で室温、２時間インキュベーション
し、続いて、ミルク液中で室温、10分間の洗じょうを３
回、さらにTBS−Ｔバッファー中で室温、３分間の洗じ
ょうを２回行った。
抗体と反応するタンパク質はVectastain ABCキット
（Vector Laboratories）を用いて、ペルオキシダーゼ
の反応により発色させて確認した。
形質転換タバコより抽出した全タンパク質中には、シ
ロイヌナズナATaseに対する抗体と反応するタンパク質
が検出され、その発現量はタバコ葉全タンパク質の約0.
5％であった。
例２ 形質転換タバコ葉のホスファチジルグリセロール
の脂肪酸組成 タバコ形質転換体および、対照の非形質転換タバコ植
物体の葉からホスファチジルグリセロール（PG）を抽出
し、その脂肪酸組成を分析した。
（１）全脂質の抽出 全脂質の抽出はBligh−Dyer法（Can.J.Biochem.Physi
ol.,37:911,1959）で行った。0.1％のブチルヒドロキシ
トルエンを含むイソプロパノール5mlを80℃に温めて置
き、そこに湿重量2gの葉をメスで細断して素早く入れ、
80℃で５分間処理後、室温に冷やした。これに20mlのク
ロロホルム：メタノール（1:2、体積比）を加え、ホモ
ジナイザーで葉を破砕後、15分間静置した。これにクロ
ロホルム12mlおよび蒸留水12mlを加え激しく混合した
後、3,000rpm、４℃、30分間の遠心で水層と有機層に分
けた。有機層（下層）を回収し、これに適当量のエタノ
ールを加えた後、ロータリーエバポレーターを用い、30
℃減圧下で乾燥させた。これを2mlのクロロホルム：メ
タノール（1:4、体積比）に溶かし、全脂質抽出物とし
た。
（２）脂質の分画 DEAE−Toyopearl 650C（東ソー）の懸濁液25mlを1M酢
酸ナトリウム溶液（pH7.0）25mlと混ぜ活性化した。こ
れを蒸留水、メタノールで洗浄し、最後にメタノールに
懸濁し、内径2cmのカラムに高さ1.5cmまで詰めた。さら
にカラムを50mlのクロロホルム：メタノール（1:4、体
積比）で洗浄した。
全脂質抽出物をカラムにのせ、まず50mlのクロロホル
ム：メタノール（1:4、体積比）でモノガラクトシルジ
アシルグリセロールおよびジガラクトシルジアシルグリ
セロール、ホスファチジルエタノールアミンおよびホス
ファチジルコリンを溶出して除いた。次に5mlの酢酸で
ホスファチジルセリンを溶出して除き、最後に50mlのク
ロロホルム：メタノール:10M酢酸アンモニウム水溶液
（20:80:0.2、体積比）でPG、スルフォキノボシルジア
シルグリセロール、ホスファチジルイノシトールを含む
画分を得た。この画分に15mlのエタノールを加え、減圧
下で溶媒を除去した後、1mlのクロロホルム：メタノー
ル（2:1、体積比）に溶かした。
この画分をシリカゲル−TLCプレート（＃5721（Merc
k））を用い、クロロホルム：アセトン：メタノール：
酢酸：水（50:20:10:15:5、体積比）を展開溶媒として
分離しPGを分画した。TLCで分離後、プリムリンを噴霧
して蛍光発色させ、標準となるPGと移動度を比較するこ
とによりPGを同定した。
（３）脂肪酸分析 PGの画分をシリカゲルごとTLCプレートからかきと
り、スクリューキャップ付試験管に入れた。これに2.5m
lのメタノール性５％塩酸を加え、完全密閉下85℃で２
時間半反応させ脂肪酸をメチル化した。生じた脂肪酸メ
チルエステルを5mlのヘキサンで４回抽出し、抽出物を
減圧下で濃縮し、ガスクロマトグラフィーで分析した。
脂肪酸の同定は標準脂肪酸メチルエステルの保持時間と
の比較をして行い、定量にはクロマトパックＣ−R2AX
（島津製作所）を用いた。結果を表２に示す。
PGの飽和脂肪酸（16:0＋16:1t＋ステアリン酸（18:
0））含量は、対照の非形質転換タバコでは68±１％で
あるのに対し、シロイヌナズナATaseを発現している形
質転換タバコでは63±１％と低くなっていた。PGのsn−
２位には16:0と16:1tのみが結合していることを考える
と、PG中の飽和分子種含量は、非形質転換タバコで36±
１％、形質転換タバコで26±１％と計算される（表
２）。
例３ 形質転換タバコ中のシロイヌナズナATaseの葉緑
体への輸送 例１で得たタバコ形質転換体および、対照の非形質転
換タバコ植物体から、無傷葉緑体を調製し、そのタンパ
ク質を分析した。
（１）無傷葉緑体の調製 あらかじめ30mlのホモジナイズバッファー（50mM ピ
ロリン酸ナトリウム、1mM MgCl2、1mM EDTA・2Na、2mM
イソアスコルビン酸ナトリウム、0.1％ ウシ血清アル
ブミン、330mMソルビトール、pH7.8）を氷中に冷やして
おき、そこに湿重量10gの葉をはさみで細断して素早く
入れ、ポリトロン（Kinematica）で粗く葉を破砕後、ミ
ラクロス４層で濾過した。濾液を2,000×ｇ、４℃、２
分の遠心後、沈澱を回収し、3mlの懸濁用バッファー（5
0mM Hepes−NaOH、330mM ソルビトール、pH7.6）を加
え、筆で完全に懸濁した。100×ｇ、４℃、２分の遠心
で破砕物を除いた後、上清を2,000×ｇ、４℃、２分で
遠心し葉緑体画分を沈殿として回収した。この沈殿に1m
lの懸濁用バッファーを加え、筆で完全に再懸濁した。
パーコール（Pharmacia）の濃度勾配（下から、80％
2.6ml、40％ 12ml、15％ 5.4ml）を４℃で調製ししばら
く放置した。上記葉緑体懸濁液をパーコールに載せ、7,
000×ｇ、４℃、15分遠心した。無傷葉緑体を80％と40
％のパーコールの境界に緑色バンドとして分離し、これ
に５倍量の懸濁用バッファーを加えて洗い、2,000×
ｇ、４℃、５分の遠心によって沈殿として回収した。
（２）葉緑体全タンパク質の分析 無傷葉緑体を、400μｌの抽出バッファーに懸濁し、
葉緑体全タンパク質を例１（４）と同様にして調製し
た。葉緑体全タンパク質10μｇを、例１（４）と同様の
方法で、ウエスタンブロッティング分析した。その結果
を第１図に示す。
形質転換タバコの葉緑体全タンパク質中に、シロイヌ
ナズナATaseに対する抗体と反応するタンパク質が検出
された。これは、タバコに導入し発現させたシロイヌナ
ズナATaseが、タバコ葉緑体に移行していることを示し
ている。
さらに、形質転換タバコの無傷葉緑体から可溶性タン
パク質を調製し、ウェスタンブロッティング分析をし
た。その結果可溶性タンパク質中に、シロイヌナズナAT
aseに対する抗体と反応する、タンパク質が検出された
（表示せず）。これは、葉緑体に輸送されたシロイヌナ
ズナATaseが、葉緑体中のストロマに存在していること
を示している。
例４ カボチャATaseのタバコ植物体中での発現 PGの飽和分子種含量が高等植物の低温感受性に与える
影響をより詳しく調べるために、タバコにカボチャATas
eをコードするcDNAを導入して発現させ、タバコ本来の
組成よりもPGの飽和分子種含量が高くなった形質転換タ
バコを作製した。実験例３の表１に示されているよう
に、カボチャATaseは18:1−ACPに対する基質選択性がな
く、18:1と16:0をほとんど同程度にグリセロール−３−
リン酸のsn−１位に結合させる。
カボチャATaseのcDNAはすでに発明者らによってクロ
ーニングされ、その塩基配列が公知となっている（Ishi
zaki（Nishizawa）,O.et al.,FEBS Lett.,238:424,198
8）。従って、この配列の情報に従い、化学的DNA合成あ
るいはPCR法等遺伝子工学分野で通常用いられている任
意の合目的方法により取得することが出来る。
カボチャATaseを形質転換タバコ植物体中で発現させ
るにあたっては、ATaseは、葉緑体中で機能する酵素な
ので、発現したATaseが葉緑体に輸送されるようにしな
ければならない（本発明の具体的説明を参照）。そこで
この輸送が確実に起きるように、シロイヌナズナATase
のトランジットペプチド部分（配列番号１のアミノ酸−
90から−１）をコードするDNA配列を、カボチャATaseの
成熟タンパク質をコードするDNA配列とリーディングフ
レームが合うように結合させた。
pARAT（実験例２（２））を制限酵素Hga I（配列番号
１の塩基番号285の後を切断する）とXho I（切断部位は
cDNAの上流のベクター配列中にある）とで切断した。シ
ロイヌナズナATaseのトランジットペプチドをコードす
るDNA配列を含む320bのフラグメントを単離し、Klenow
フラグメントで切断末端を平滑化した。
一方、カボチャATaseのcDNAを含むプラスミドpAT−03
（Ishizaki（Nishizawa）,O.et al.,FEBS Lett.238:42
4,1988）を制限酵素EcoR Iで切断し、1.4kbのカボチャA
TaseのcDNA断片を単離し、プラスミドpUC19（宝酒造）
のEcoR Iサイトに挿入し、プラスミドpUC19/AT03を作製
した。このプラスドを制限酵素Nae Iで切断し、Klenow
フラグメントで切断末端を平滑化した。
これら二つのDNAフラグメントをT4DNAライゲースを用
いて結合し、トランジットペプチドをコードするDNAフ
ラグメントが、カボチャATaseのcDNAに対して順方向に
一つ挿入されたプラスミドpSQARを選抜した。pSQARに
は、５′側から順に、カボチャATaseトランジットペプ
チド（のおそらくは一部）と、シロイヌナズナATaseの
トランジットペプチドとカボチャATaseの成熟タンパク
質が融合した融合タンパク質とがコードされており、そ
の間にはpARAT由来のマルチクローニング部位がある。
この融合タンパク質が形質転換植物の細胞内で発現して
葉緑体中に移行した場合に生成されると考えられる成熟
タンパク質のアミノ酸配列は、Ｎ末端から二番目のアミ
ノ酸がプロリンからロイシンに置換されていること以外
は、カボチャATaseの成熟タンパク質本来の配列と同一
であると考えられる。
pSQARから制限酵素EcoR Iで前記融合タンパク質をコ
ードするDNAフラグメントを切り出し、Klenowフラグメ
ントで切断末端を平滑化した後、植物形質転換用ベクタ
ーpBI121（Clontech）のSma Iサイトに挿入し、プラス
ミドpBI121−35SSQARを得た。このベクタープラスミド
は、35Sプロモーター、融合タンパク質をコードするDNA
配列およびNOSターミネーターを含み、さらに融合タン
パク質をコードするDNA配列とNOSターミネーターの間に
β−glucuronidaseの構造遺伝子が挿入されている。
pBI121−35SSQARを用いて、例１の（２）、（３）と
同様にしてタバコを形質転換し、カボチャATaseが発現
している形質転換タバコを作製した。例２と同様にし
て、得られた形質転換タバコの葉からPGを抽出してその
脂肪酸組成を調べたところ、飽和脂肪酸（16:0＋16:1t
＋18:0）含量は72±１％であり、これから計算される飽
和分子種含量は44％であった。これは非形質転換タバコ
の36％（表２参照）よりも高くなっており、得られた形
質転換タバコのPGの脂肪酸組成が低温感受性型に変わっ
ていることを示す。なお、カボチャ葉のPGの飽和分子種
含量は64％である。
例５ 形質転換タバコ葉の光合成活性に対する低温処理
の影響 光合成は高等植物にとって最も主要かつ重要な生物学
的反応の一つであり、その活性低下は、すなわち植物体
全体の生理学的活性の低下につながる。従って、低温に
よる光合成活性の低下は、植物体の低温感受性を評価す
る上で適切な指標である。
従って、例１、４の形質転換タバコおよびその対照と
してベクタープラスミドpBI121で形質転換したタバコの
葉をそれぞれ用い、低温処理前および低温処理後の光合
成による酸素発生活性を測定し比較した。
気相酸素測定用クラーク型酸素電極を用いて葉の酸素
発生活性を測定した。温度可変型チャンバー内のリーフ
ディフク用酸素電極（Hanzatech,LD2）上に湿らせたス
ポンジマットの敷き、その上に健全葉から採取した8.5
〜10cm2の葉片を葉の裏を下にして置いた。100Wタング
ステンランプ（Hanzatech、LS2）の光を熱遮蔽フィルタ
ー（Hoya、HA−50）を通して葉に照射した（1,000μＥ
・m-2・sec-1）。チャンバー内の気相を７分ごとに二酸
化炭素を５％含む空気で置換しながら、27℃で、約90分
間連続的に葉片の酸素発生活性を測定した後、チャンバ
ー内の温度を１℃に下げた。葉片を活性測定時と同じ光
照射下、４時間放置し、その後チャンバー内の温度を27
℃に戻し、低温処理前と同様にして葉片の酸素発生活性
を測定した。例１、４で得た形質転換タバコおよび対照
のベクターpBI121で形質転換したタバコ（すなわち低温
感受性に関しては非形質転換タバコと同じである）につ
いて得られた結果を第２図に示す。
低温処理前、低温処理後とも、時間とともに酸素発生
活性が徐々に上昇し、ある時間後にほぼ定常値に達し
た。この時の活性をそれぞれ低温処理前、低温処理後の
活性とし、それらの比を表３に示すように低温感受性の
指標として求めた。
対照のpBI121形質転換タバコの酸素発生活性は、１
℃、４時間の低温処理で処理前の70−86％に低下したの
に対し、シロイヌナズナATase cDNA形質転換タバコで
は、同じ低温処理で酸素発生が処理前の90−96％にしか
低下しなかった。このことはシロイヌナズナATase cDN
A形質転換タバコの酸素発生活性が、対照よりも低温に
強くなっていることを示している。従ってこれは、シロ
イヌナズナATase cDNA形質転換タバコが対照より低温
に強くなったことを示していると結論できる。
これとは逆に、カボチャATase cDNA形質転換タバコ
では、１℃、４時間の低温処理で酸素発生活性が処理前
の41−53％にまで低下したが、この低下率は、対照より
有意に大きく、カボチャATase cDNA形質転換タバコが
対照に比べて低温に弱くなった事を示している。
例６ 形質転換タバコ植物体に対する低温処理の影響 例１で得た形質転換タバコ、および対照の非形質転換
タバコおよびpBI121形質転換タバコの全植物体に対する
低温処理の影響を調べた。
透明のプラスチック容器内で生育させたタバコ植物体
の上部を切断し、それぞれをプラスチック容器内のクラ
ホラン250ppmを含むMSホルモンフリー培地に移植し、16
時間明,8時間暗の周期で25℃,2週間生育させた。この間
に移植片は発根し、３〜４枚の葉を持った植物体に生育
した。
このように生育したタバコ植物体をプラスチック容器
ごと、庫内１℃のグロースチャンバーKPS−2000（小糸
工業）内におき、100μE/m2/secの蛍光燈照射下,10日間
低温処理した後、低温処理前の生育条件下に２日間お
き、植物体の低温傷害を観察した。第３図は低温処理前
および処理後の、シロイヌナズナATaseを発現している
形質転換タバコ植物体の１クローンおよび対照のpBI121
形質転換タバコを示している。
対照の非形質転換タバコおよびpBI121形質転換タバコ
は、低温処理によって葉の多くが白色化した。これは低
温により葉緑体が破壊（クロロシス）されたためである
（第３図上部）。これに対し、シロイヌナズナATase c
DNA形質転換タバコは同じ低温処理によってほとんど傷
害を受けず（第３図下部）、対照のタバコより低温に強
いことを示している。
以上の例は、本発明の技術の適用によって低温耐性植
物のATaseを低温感受性植物に導入・発現させ、この植
物のPGの飽和分子種含量を低下させることにより、低温
感受性植物に低温耐性を賦与できることを証明してい
る。またPGの飽和分子種含量をさらに高めるように操作
されたタバコ植物体が低温傷害に対してより感受性にな
ったことは、低温感受性とPGの分子種組成との相関をさ
らに裏付けるものであり、本発明による高等植物への低
温耐性賦与技術が種々の農作物に対して普遍的応用性が
あることを強く示唆している。
本発明により、低温感受性植物に低温耐性を付与する
遺伝子工学技術がはじめて提供された。低温感受性農作
物に低温耐性を付与することの重要さはすでに前記した
通りであり、本発明の農業上への貢献は計り知れない。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献 「Ｐｌａｎｔ Ｌｉｐｉｄ Ｂｉｏｃ ｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ」Ｐ ｏｒｔｌａｎｄ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄ ｏｎ（1990）ｐ．462〜464 山田康之，岡田吉美編集「現代化学増 刊５ 植物バイオテクノロジー」東京化 学同人（1986）ｐ．197−226

Claims (16)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】少なくとも１種の脂質に結合した脂肪酸中
    の不飽和脂肪酸の含量が、本来の組成よりも高くなった
    ことを特徴とする形質転換植物であって、パルミトイル
    −アシルキャリアタンパク質（16:0−ACP）よりも、オ
    レオイル−アシルキャリアタンパク質（18:1−ACP）に
    対して、より高い基質選択性を持つと共にグリセロール
    −３−リン酸のsn−１位に脂肪酸アシル基を転移させる
    グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ活
    性を有するポリペプチドをコードする外来性DNA配列が
    細胞内に発現可能に存在することを特徴とする、低温耐
    性の形質転換植物。
  2. 【請求項２】上記外来性DNAの発現により、少なくとも
    １種の脂質に結合した脂肪酸中の不飽和脂肪酸の含量
    が、本来よりも少なくとも３％増加したことを特徴とす
    る、請求の範囲第１項記載の形質転換植物。
  3. 【請求項３】ポリペプチドが、低温耐性植物由来のグリ
    セロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼまたは
    その誘導体である、請求の範囲第１または２項記載の形
    質転換植物。
  4. 【請求項４】低温耐性植物が、ホウレンソウ、エンド
    ウ、またはシロイヌナズナである、請求の範囲第３項記
    載の形質転換植物。
  5. 【請求項５】パルミトイル−アシルキャリアタンパク質
    （16:0−ACP）よりも、オレオイル−アシルキャリアタ
    ンパク質（18:1−ACP）に対して、より高い基質選択性
    を持つと共にグリセロール−３−リン酸のsn−１位に脂
    肪酸アシル基を転移させるグリセロール−３−リン酸ア
    シルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコ
    ードする外来性DNA配列を高等植物の細胞に導入するこ
    とにより、この植物の脂質に結合した脂肪酸中の不飽和
    脂肪酸の含量を本来の組成よりも高くする方法。
  6. 【請求項６】上記外来性DNAの発現により、少なくとも
    １種の脂質に結合した脂肪酸中の不飽和脂肪酸の含量
    を、本来よりも少なくとも３％増加させることを特徴と
    する、請求の範囲第５項記載の方法。
  7. 【請求項７】ポリペプチドが、低温耐性植物由来のグリ
    セロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼまたは
    その誘導体である、請求の範囲第５または６項記載の方
    法。
  8. 【請求項８】低温耐性植物が、ホウレンソウ、エンド
    ウ、またはシロイヌナズナである、請求の範囲第７項記
    載の方法。
  9. 【請求項９】本来低温傷害を受ける植物であって、この
    植物の細胞の生体膜中に含まれているホスファチジルグ
    リセロールの飽和分子種含量が本来の組成より低下し、
    かつこの植物に本来傷害を引き起こす温度より低い温度
    でも傷害を受けないようになった形質転換植物であっ
    て、パルミトイル−アシルキャリアタンパク質（16:0−
    ACP）よりも、オレオイル−アシルキャリアタンパク質
    （18:1−ACP）に対して、より高い基質選択性を持つと
    共にグリセロール−３−リン酸のsn−１位に脂肪酸アシ
    ル基を転移させるグリセロール−３−リン酸アシルトラ
    ンスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする
    外来性DNA配列が細胞内に発現可能に存在することを特
    徴とする、低温耐性の形質転換植物。
  10. 【請求項１０】上記外来性DNAの発現により、植物細胞
    の生体膜中に含まれるホスファチジルグリセロールの飽
    和分子種含量が、本来の組成よりも少なくとも８％減少
    したことを特徴とする、請求の範囲第９項記載の形質転
    換植物。
  11. 【請求項１１】ポリペプチドが、低温耐性植物由来のグ
    リセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼまた
    はその誘導体である、請求の範囲第９または10項記載の
    形質転換植物。
  12. 【請求項１２】低温耐性植物が、ホウレンソウ、エンド
    ウ、またはシロイヌナズナである、請求の範囲第11項記
    載の形質転換植物。
  13. 【請求項１３】植物細胞の生体膜中に含まれているホス
    ファチジルグリセロールの飽和分子種含量を低下させる
    ことにより、本来低温傷害を受ける植物に、この植物に
    本来傷害を引き起こす温度より低い温度でも傷害を受け
    ない性質を与える方法であって、パルミトイル−アシル
    キャリアタンパク質（16:0−ACP）よりも、オレオイル
    −アシルキャリアタンパク質（18:1−ACP）に対して、
    より高い基質選択性を持つと共にグリセロール−３−リ
    ン酸のsn−１位に脂肪酸アシル基を転移させるグリセロ
    ール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ活性を有す
    るポリペプチドをコードする外来性DNA配列を高等植物
    の細胞に導入することを特徴とする方法。
  14. 【請求項１４】上記外来性DNAの発現により、植物細胞
    の生体膜中に含まれるホスファチジルグリセロールの飽
    和分子種含量を、本来の組成よりも少なくとも８％減少
    させることを特徴とする、請求の範囲第13項記載の方
    法。
  15. 【請求項１５】ポリペプチドが、低温耐性植物由来のグ
    リセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼまた
    はその誘導体である、請求の範囲第13または14項記載の
    方法。
  16. 【請求項１６】低温耐性植物が、ホウレンソウ、エンド
    ウ、またはシロイヌナズナである、請求の範囲第15項記
    載の方法。
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