JPH08509598A

JPH08509598A - 除草剤抵抗性植物

Info

Publication number: JPH08509598A
Application number: JP6518425A
Authority: JP
Inventors: アール．ウォード，エリック; ヴォルラス，サンドラ; 信一小泉; 幸代多田; 一郎森; 源司岩崎
Original assignee: 日本チバガイギー株式会社
Priority date: 1993-05-13
Filing date: 1994-05-06
Publication date: 1996-10-15
Also published as: AU6544194A; WO1994026909A1; US5541310A; EP0813602A1

Abstract

(57)【要約】成長および発育が、通常植物に対して抑制するレベルにおける、種々のイミダゾールまたはトリアゾール化合物に耐性のあるまたは抵抗性のある、植物、植物組織および植物種子を開示する。上記耐性および抵抗性は改変されたイミダゾールグリセロールホスフェートデヒドラターゼ（ＩＧＰＤ）により与えられる。野性型のおよび改変されたＩＧＰＤをコード化する植物遺伝子、精製植物ＩＧＰＤ、植物からＩＧＰＤの単離法、ならびに精製ＩＧＰＤおよびＩＧＰＤ−コード化遺伝子の両方を使用する方法もまた開示する。

Description

【発明の詳細な説明】除草剤抵抗性植物本発明は広く農業のバイオテクノロジーに関する。さらに特別には、本発明は植物、植物組織および種子の除草剤抵抗性（harbicide resistance）に関する。雑草または作物植物防除するための除草剤の使用は殆ど一般的に行われるようになっている。関連する市場は毎年１０億ドルを超えている。この広範な使用にもかかわらず、雑草防除は農業従事者にとって重大なおよび費用のかかる問題を残している。除草剤の有効な使用は完全な管理を要求する。例えば、時間、施用方法および雑草植物の発育段階は除草剤による良好な雑草防除を得るのに重要である。多様な雑草の種が除草剤に対する抵抗性をもつため、有効な除草剤の製造はますます重要になってきている。残念なことに、より大きい能力、より広い雑草スペクトルおよび土中でのより迅速な分解を示す除草剤はしばしばより大きい作物植物毒性を示す。除草剤に抵抗性（resistant）のあるまたは耐性のある（tolerant）作物雑種または変種は付随する作物に対する損傷の危険のない除草剤の使用を可能にする。アンダーソン（Anderson）らによるＵ．Ｓ．4,761,373では、種々のイミダゾリノンまたはスルホンアミド除草剤に対する植物抵抗性について示す。この抵抗性は、改変された（altered）アセトヒドロキシ酸シンターゼ（AHAS）酵素により与えられる。グッドマン（Goodman）らによるＵ．Ｓ．4,975,374は、グルタミンシンセターゼ（ＧＳ）を阻害することで知られる除草剤、例えばホスフィノスリシンおよびメチオニンスルホキシミンによる阻害に対する抵抗性のある突然変異グルタミンシンセターゼをコード化する遺伝子を含む植物細胞および植物を記載する。ベッドブルック（Bedbrook）らによるＵ．Ｓ．5,013,659はスルホニル尿素除草剤による阻害に抵抗性を与える突然変異アセトラクテートシンターゼを発現する植物を示す。ソマーズ（Some rs）らによるＵ．Ｓ．5,162,602はシクロヘキサジオンおよびアリールオキシフェノキシプロパノン酸除草剤による阻害に対して耐性のある植物を開示する。耐性は改変されたアセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ（ＡＣＣアーゼ）により与えられる。除草剤抵抗性を目的とする遺伝子工学植物に対し、まず除草剤の標的を確認しなければならない。この作業は非常に困難であるといえる。例えば大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉは少なくとも６０個のアミノ酸生合成酵素を発現することができる。植物はずっとより複雑であり、従ってずっとより多くの酵素を含む。可能性のある標的の本当の数はそのため、１つのファクターである。また、植物酵素は精製することが困難であることも分かっており、それはｉｎ−ｖｉｔｒｏにおけるスクリーニングの努力において大規模に阻害される。さらに、特別な植物酵素における除草剤の作用は必ずしも微生物の類似物における除草剤の作用に基づいて予測できない。種々の除草剤例えばアミノトリアゾールは、植物および微生物において異なる生合成経路に影響する。ハミルトンら（Hamilton et al.）, Arch．Biochem．Biophys．112:544-547（1965）；ジェイムおよびラリヌア（Jei ms and Larrinua），Plant Phisiol，91:1226-1231（1989）参照。最後に、植物は迅速な代謝、および乏しい吸収および酵素標的の説明を複雑にする除草剤の転流のような他の抵抗性機構をもつ。本発明の範囲内においてはイミダゾールグリセロールホスフェートデヒドラターゼ（ＩＧＰＤ）が植物から精製され、種々の除草剤に感受性が高いことが見出された。さらに、ＩＧＰＤをコード化する植物由来のｃＤＮＡが単離された。これらの発見に従って、本発明はイミダゾールまたはトリアゾール除草剤およびその混合物による阻害に抵抗性または耐性があり、その抵抗性は元来発現される量におけるＩＧＰＤの活性を通常阻害するレベルにおいて、上記の除草剤による阻害に抵抗性のある又は耐性のある改変された（altered）ＩＧＰＤにより与えられる、植物、植物組織および植物種子を提供する。本発明に含まれる植物は除草剤に対して可能性のある標的たりうべき植物であり、特に、農業的に重要な作物である、例えばトウモロコシおよび小麦、オーツ麦、ライ麦、ソルガム、米、大麦、キビのような他の穀物、芝および牧草（forage grasses）等ならびに綿、サトウキビおよび大豆である。本発明はさらに元来発現された量におけるＩＧＰＤの活性を通常阻害する濃度において、イミダゾールおよびトリアゾール除草剤による阻害に抵抗性または耐性がある植物、植物組織および植物種子の製造方法を示す。本発明の１つの特別な具体例は、野性型ＩＧＰＤをコード化する構造遺伝子と操作可能に連結される植物中で機能する適当なプロモーターを含んでいる組換えＤＮＡ分子により安定に形質転換された、トランスジェニックトウモロコシ植物、トウモロコシ組織またはトウモロコシ種子の製造を示す。これらはトウモロコシ植物の除草剤による酵素の阻害を克服するのに十分な過剰な発現（over-expression）を引き起こす。本発明はまた野性型、改変されてないＩＧＰＤの活性を通常阻害する濃度において、イミダゾールおよびトリアゾール除草剤による阻害に抵抗性または耐性がある改変されたＩＧＰＤ酵素を発現する植物の製造を具体的に示す。この具体例では、植物が耐性ＩＧＰＤをコード化する構造遺伝子を含む組換えＤＮＡ分子によって安定に形質転換されていてよく、または除草剤耐性系から単離され、特徴づけられ、発育されることによる直接選択技術（direct selection techniques）により調整されてもよい。本発明はまたＩＧＰＤを製造しおよび使用するための方法にもまた関する。特に本発明は、ＩＧＰＤの活性に影響を及ぼす新しい除草剤に対するスクリーニングのため、および除草剤−抵抗性ＩＧＰＤ突然変異を確認するため、精製した野性型ＩＧＰＤを使用する方法に関する。改変されたＩＧＰＤをコード化する遺伝子は植物細胞形質転換法において選択可能なマーカーとして使用できる。本発明はイミダゾールおよびトリアゾール除草剤およびその混合物による阻害に抵抗性または耐性があり、その抵抗性または耐性は改変されたＩＧＰＤ酵素により与えられる植物、植物組織および植物種子を示す。ＩＧＰＤ［ＥＣ４．２．１．１９］はイミダゾールグリセロールホスフェート（ＩＧＰ）のイミダゾールアセトールホスフェート（ＩＡＰ）への脱水を触媒する。反応はヒスチジン生合成経路で起こる。代表的な植物は通常意図される目的のためにこれらの除草剤を施用したいかなる植物をも含む。好ましい農業的に有用な作物は、即ち、綿、大豆、ナタネ、トウモロコシ、米、小麦、大麦、オーツ麦、ライ麦、ソルガム、キビ、芝、牧草等として表す種子植物および裸子植物である。用語「イミダゾール除草剤」は以下に示す、式Ｉによりおよび除草剤活性；即ちそれは植物細胞または植物全体の成長、代謝または複製を阻害する；を示す式Ｉの全ての誘導体により示されるイミダゾールを包含する。〔式中、Ｒ’は水素原子もしくはフッ素原子を表すか、または−Ｏ−Ｌ基（基中、Ｌは水素原子、を表す。）を表し、ならびにＲ”は−ＳＣＨ₂ＣＨ₃または−ＳＣＨ₂ＣＨ₂ＯＨ基を表す。〕。用語「トリアゾール除草剤」は以下に示す、式ＩＩによりおよび上記で定義した除草剤活性を示す式ＩＩの誘導体により示される除草性化合物を包含する。〔式中、Ａは式：（式中、Ｒ₁は水素原子、炭素原子数１ないし４のアルキル基または炭素原子数２ないし４のアルケニル基を表す。）で表される置換基を表し；Ｂは水素原子、炭素原子数１ないし４のアルキル基または−ＣＨ₂ＯＨ；ＤおよびＤ’は水素原子またはヒドロキシ基を表し、但しＤおよびＤ’のうちの一つのみがヒドロキシ基を表すことができ；ＦおよびＧは互いに独立して炭素原子数１ないし４のアルキル基を表すか；式中、ＢおよびＧは一緒に−（ＣＨ₃）−を表し；ｎは０または１を表し；およびＫはＰ（Ｏ）（ＯＲ₂）₂ （基中、Ｒ₂は水素原子またはアルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウムもしくは有機アンモニウムカチオンを表す。）を表す。〕ＩＧＰＤの活性に対して通常、阻害的であるイミダゾールおよびトリアゾール除草剤のレベルは技術的によく知られた施用割合を含み、そして、それは環境、時間または施用方法のような外部因子に一部には依存する。例えば、式（ＩＩ）で表されるトリアゾール除草剤の場合、施用割合は０．０００１ないし１０ｋｇ／ｈａ、好ましくは０．００５ないし２ｋｇ／ｈａの範囲である。この施用割合または除草剤の濃度は所望の作用に基づいて変えることもでき、技術的によく知られた方法により決定してもよい。「改変された（altered）ＩＧＰＤ酵素」は野性型、除草剤感受性酵素の増加された発現または突然変異体の、除草剤−耐性ＩＧＰＤの発現を意味する。「増加された発現」は少なくとも除草剤により生じた成長阻害を克服するのに十分な植物細胞中のＩＧＰＤのレベルを生じる。発現されたＩＧＰＤのレベルは通常、元来の発現量の少なくとも２倍、好ましくは５倍、およびより好ましくは１０倍である。従って、増加された発現は野性型ＩＧＰＤ遺伝子の多重複製によるものであってよく；ＩＧＰＤ遺伝子の範囲内のＩＧＰＤコード化配列の多重発生、即ち遺伝子増幅；または植物細胞中の内因性ＩＧＰＤ遺伝子の非コーディング調節配列における突然変異によるものであってもよい。このような改変されたＩＧＰＤ酵素を含む植物は直接選択により得ることができる。この方法は技術的によく知られている。例えばソマーズ（Somers）らのＵ．Ｓ．5,162,602およびアンダーソン（Anderson）らのＵ．Ｓ．4,761,373およびそれらに引用されている文献参照。これらの植物はまた技術的に周知である遺伝子工学技術により得ることもできる。除草剤−感受性ＩＧＰＤの増加された発現はまた、ＩＧＰＤをコード化する相同のまたは異種の構造遺伝子に操作的に連結された、植物細胞中の関連する構造遺伝子の発現を起こさせうるプロモーターを含む組換えまたはキメラのＤＮＡ分子により安定に形質転換することによって達成できる。「相同の（homologous）」は、ＩＧＰＤ遺伝子は標的の植物細胞について分類上同一の有機体から単離されることを意味する。「異種の（heterogeous）」はＩＧＰＤが標的の植物細胞とは分類学上異なる有機体から得られることを意味する。ＩＧＰＤ遺伝子は植物ｃＤＮＡライブラリーにより、バクテリアのまたは酵母の栄養要求性突然変異体を相補させることによって得ることができる。スナスタッドら（Snustad et al.），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１２０：１１１１−１１１４（１９８８）（トウモロコシグルタミンシンターゼ）；デロウンニーら（Delauney et al），Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２２１：２９９−３０５（１９９０）（大豆、プロリン−５−カルボキシレートレダクターゼ）；フリッシュら（Frisch et al.）,Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２２８：２８７−２９３（１９９１）（トウモロコシジヒドロジピコリネートシンターゼ）；エラーら（Eller et al.），ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８：５５７−５６６（１９９２）（ナタネクロロプラスト３−イソプロピルマレエートデヒドロゲナーゼ）；エレッジら（Elledge et al.），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８，１７３１−１７３５（１９９１）；ミネットら（Minet et al.），ＰｌａｎｔＪ．２：４１７−４２２（１９９２）（ジヒドロオロテートデヒドロゲナーゼ）およびそれらに引用された文献参照。他の公知の方法は例えば特定の核酸プローブとクロスハイブリッド形成する配列に対して、または特定の抗体プローブと交差反応するＩＧＰＤ酵素の製造のための発現ライブラリーをスクリーニングすることにより、高等植物のゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることを含む。好ましい方法はＥ．ｃｏｌｉ、ｈｉｓＢ栄養要求性突然変異体とアラビドプシスタリアナ（Arabidopsis thaliana）ｃＤＮＡライブラリーを相補させること含む。用語「改変されたＩＧＰＤ酵素」の用語はここでは突然変異除草剤−抵抗性または除草剤−耐性ＩＧＰＤを包含する。このような酵素をコード化する遺伝子は技術的に周知な多くの手法により得ることができる。第一の一般的方法は全ての種類の微生物もしくは組織培養、種子または植物における、直接的または間接的突然変異誘発手法を含む。例えば、一般的に操作可能な微生物例えばＥ．ｃｏｌｉまたはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは例えば、紫外線、エチルもしくはメチルメタンスルホネートによりｉｎｖｉｖｏでランダム突然変異にかけることができる。突然変異誘発手順は例えばミラー（Miller），ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ，コールドスプリングハーバーラボラトリ（Cold Spring Harbor Laboratory），コールドスプリングハーバー（Cold Spring Harbor），ＮＹ（１９７２）；デーヴィスら（Davis et a l.），ＡｄｖａｎｃｅｄＢａｃｔｅｒｉａｌＧｅｎｅｔｉｃｓ，コールドスプリングハーバーラボラトリ，コールドスプリングハーバー，ＮＹ（１９８０）およびシャーマンら（Sherman et al.），ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＹｅａｓｔＧｅｎｅｔｉｃｓ，コールドスプリングハーバーラボラトリ，コールドスプリングハーバー，ＮＹ（１９８３）に記載されている。突然変異誘発のために選択される微生物は、ＩＧＰＤ遺伝子を含み、その配列がよく知られている。突然変異誘発された細胞は通常阻害剤の阻害性濃度の存在下で成長できる。ＤＮＡは阻害剤に抵抗性または耐性を示すコロニーから調整され；これらのコロニーから得られたＩＧＰＤはさらに本発明の実例となる。それらはクローンニングまたはポリメラーゼ連鎖反応増幅のいずれかにより単離され、そしてそのそれらの配列は決定される。推測される突然変異ＩＧＰＤ遺伝子は形質転換により野性型細胞に阻害剤抵抗性または耐性を付与するそれらの能力を試験される。ＩＧＰＤの突然変異除草剤−抵抗性または除草剤−耐性対立遺伝子を得る第二の方法は植物から直接的に得る方法に関する。例えば、アラビドプシス（Arabid opsis ）のような植物の成長阻害において上記に記載したようなＩＧＰＤ阻害剤の作用は、阻害剤の増加する濃度を含む単なる最少塩類培地の平板上に技術的に認識される方法で滅菌された種子を平板培養することにより測定できる。このような濃度は１，３，１０，３０，１１０，３３０，１０００および３３００部／百万（ｐｐｍ）の範囲である。著しい成長阻害を再現可能に検出できる最少投与量は以降の実験に対して使用される。エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）で突然変異誘発されたＭ₂種子〔レールシーズ社，アリゾナ州，ツクソン（Lehle Seeds,Tucson,AZ）〕、即ちエチルメチルスルホネートで突然変異誘発された種子から生育された植物の子孫の種子を、抵抗性に対して選択するため阻害剤の適当な濃度を含む最少塩類培地上に１０，０００個までの種子／平板（１０ｃｍ径）の密度で平板培養する。成長を続けおよび緑色に生存する実生は平板培養７−２１日間後に土壌に移植しそして完全に発達して種が結実するまで成長させる。これらの種子の子孫を除草剤に対して抵抗性および耐性について試験する。抵抗性が優性であると仮定すれば、種子を抵抗性：感受性＝３：１に分離した植物はＭ₂世代で抵抗性に対して異形接合したと推定される。全ての抵抗性の種子を生じさせる植物はＭ₂世代で抵抗性に対して同形接合したと推定される。抵抗性または耐性の遺伝的ベースが改変されたＩＧＰＤ遺伝子であることを確認するため２つのアプローチを利用することができる。第一に、以下の表１（配列番号：１）に示されるアラビドプシス（Arabidopsis）ｃＤＮＡの配列で与えられた、推測上阻害剤に対する抵抗性を生ずるＩＧＰＤ遺伝子の新しい対立遺伝子はＰＣＲを使用して単離できる。コーディング配列における突然変異の存在を決定する対立遺伝子を配列決定後、推測上抵抗性を与える対立遺伝子が形質転換されている植物において、上記対立遺伝子を阻害剤に対する抵抗性を与えるそれらの能力に関して試験できる。これらの植物はアラビドプシス植物または成長が阻害剤に敏感な他の植物のいずれかであってよい。第二には、上記ＩＧＰＤ遺伝子は公知の制限断片長多型（ＲＦＬＰｓ）に関してマッピングされ得る。例えばチャングら（Chang et al.）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ，ＵＳＡ８５：６８５６−６８６０（１９８８）；ナムら（Nam et al.），ＰｌａｎｔＣｅｌｌ１：６９９−７０５（１９８９）参照。抵抗性の特徴は同じマーカーを使用して個別にマッピングされる。ＩＧＰＤ遺伝子位置の１つから区別できない位置への上記抵抗性がマッピングされる場合にはそのＩＧＰＤ遺伝子の突然変異の結果らしいとする。ＩＧＰＤの阻害剤−抵抗性または阻害剤−耐性対立遺伝子を得る第三の方法は、植物細胞培養における選択である。問題の植物の活発に成長しているカルスまたは懸濁培養を阻害剤の増加する濃度の存在下で、ヒスチジンを欠く規定の培地で生育される。成長の程度の変化は種々の培養で記録される。ある培養では、阻害剤の通常の阻害濃度の存在下においてさえも成長し続ける早い成長の変種のコロニーが生じる。推測上抵抗性を与えるＩＧＰＤ遺伝子の対立遺伝子が単離され、前述の段落に記載された方法と同様に試験される。第四の方法はヒスチジンを欠くが、阻害剤の阻害濃度を含む培地上の微生物を培養し、次に阻害剤の存在下で成長するそれらのコロニーを選択することによる、細菌または酵母の野性型、除草剤感受性ＩＧＰＤ遺伝子の突然変異誘発に関する。さらに特別には、ＩＧＰＤをコード化するアラビドプシスｃＤＮＡのような植物ｃＤＮＡは他のＩＧＰＤ活性を欠く微生物中でクローニングされる。このような微生物の例は、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＳ．ｃｅｒｖｉｓｉａｅ栄養要求性突然変異体を含む。形質転換された微生物は次にｉｎｖｉｖｏで直接、上記したような突然変異誘発物質に曝すか、あるいは例えばナトリウムビスルフィット〔ショートルら（Shortle et al.），ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．１００，４５７−４６８（１９８３）；メトキシルアミン〔カドナガら（Kadonaga et al. ），ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１３：１７３３−１７４５（１９８５）；オリゴヌクレオチドに関連する飽和突然変異誘発（oligonucleotide-dire cted saturation mutagenesis）〔ハッチンソンら（Hutchinson et al），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８３：７１０−７１４（１９８６）〕；または種々のポリメラーゼ取り違い手法（verious polymerase miscorpor ation strategies）〔例えば、ショートルら（Shorte et al.），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９：１５８８−１５９２（１９８２）；シライシら（Shiraishi et al.），Ｇｅｎｅ６４：３１３−３１９（１９８８）；およびロイングら（Leung et al.），Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ１：１１−１５（１９８９）参照。〕のような技術的に公知の数種類の化学的または酵素学的方法のいずれかによりｉｎｖｉｔｒｏで突然変異誘発物質に曝す。阻害剤の通常の阻害濃度の存在下で成長するコロニーを取り出しそして線状接種を繰り返すことにより純化する。これらのプラスミドを純化しそしてそれらをＩＧＰＤ−欠損微生物中に形質転換させることにより阻害剤への抵抗性または耐性を与える能力を試験する。この試験に合格したプラスミドからのＩＧＰＤｃＤＮＡ挿入断片のＤＮＡ配列が次に決定される。植物または植物細胞において機能できるプロモーター、即ち植物細胞中のＩＧＰＤのような関連した構造遺伝子の発現させることの可能なプロモーターの例は、カリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）１９Ｓまたは３５ＳプロモーターおよびＣａＭＶダブルプロモーター（double promoter）；ノパリンシンターゼプロモーター；病原関連（pathogenesis-related：ＰＲ）タンパク質プロモーター；リブロースビスホスフェートカルボキシラーゼ（ｓｓｕＲＵＢＩＳＣＯ）プロモーター；ユビキノンプロモーター；アクチンプロモーター；ヒストンプロモーター；チューブリンプロモーター等である。好ましいものは参照文献によりここに組み込まれる、カイら（Kay et al.），Ｓｃｉｅｎｃｅ２３６：１２９９ −１３０２（１９８７）に記載されるような３５Ｓプロモーターおよび拡張されたおよび２倍３５Ｓプロモーター、ならびにｐＣＧＮ２１１３内でクローン化されそしてＥＰ−３９２２２５の実施例２３により開示されるＡＴＣＣ４０５８７として寄託された２倍３５Ｓプロモーターである。上記プロモーターは、技術的に認識される手順で、それら自体ＩＧＰＤ発現を増加するためにプロモーター強度を操作するよう修飾（modified）されていてもよい。発現シグナルはまた組織−優先（tissue-preferential）または組織特異的（t issue-specific）プロモーターも含む。用語、組織−優先プロモーターは上記の与えられた発現シグナルが関連する発現可能なＤＮＡの転写の、またはいずれかの慣用のＲＮＡまたはタンパク質検定により示されたようなコード化された生成物の発現のより高いレベルを促進するであろうこと、あるいは与えられたＤＮＡ配列が幾つかの異なる作用を示すであろうこと；即ち関連するＤＮＡ配列の転写または遺伝子産物の発現が植物のある組織において全ての他の組織よりより大きいことを示すため使用される。例えば、組織−優先プロモーターは種子よりも葉、茎、根および／または花粉におけるＩＧＰＤ遺伝子産物のより高い発現を示すことができる。本発明の範囲内で適当に使用することのできる、組織−優先プロモーターの一つの例はトウモロコシＴｒｐＡ遺伝子から単離された髄−優先（pi th-preferred）プローモーターである。用語、組織特異的プロモーターは、植物の他の全ての組織または組織の種類において実質的に関連するコーディングＤＮＡ配列の転写が生じないにもかかわらず、与えられた調節ＤＮＡ配列が植物の１もしくはそれ以上の組織においてまたは組織の１つの種類、例えば緑色組織において関連する発現可能なＤＮＡ配列の転写を完全に促進するであろうことを示すのに使用される。その発現が組織特異的手段において変化することで知られている多くのプロモーターは技術的に周知である。このような例は、緑色組織に特異的である、トウモロコシホスフェノールピルベートカルボキシラーゼ（ＰＥＰＣ）である〔ハドスペスら（Hudspeth e t al.），ＰｌａｎｔＭｏｌＢｉｏｌ１２：５７９−５８９，１９８９〕。他の緑色組織に特異的なプロモーターはクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質プロモーターおよびＲｕｂｉｓＣｏ小ユニットプロモーターを包含する。ここで言及できる他のものは、例えば、植物性カルシウム依存性ホスフェートキナーゼ（ＣＰＤＫ）遺伝子から得られるような花粉−特異的プロモーターである。発育的に調節されたプロモーターもまた使用できる。もちろん、本発明においては、所望の宿主植物で機能するいずれかのプロモーターも、関連するＩＧＰＤ遺伝子の発現を指示するために使用できる。プロモーター配列および隣接するコード化ＤＮＡ配列間のリーダー配列であって、該リーダーの長さが、該プロモーターおよび本発明による該ＤＮＡ配列間の距離が関連する構造遺伝子の発現のための最適な距離になるよう選択されるものを組み込むことはしばしば有利である。キメラ遺伝子の構築のために使用できる、他の調節ＤＮＡ配列は、例えば，誘導または阻害（repression）の意味において植物組織中で関連したＤＮＡ配列の転写を調節できる配列である。例えば、種々の内部因子および外部因子、例えば植物ホルモン、加熱ショック、化学薬品、病原、酸素欠乏、光、ストレス等々により誘導されることの知られたある植物遺伝子がある。植物において誘導可能な遺伝子の他の類は、光調節遺伝子、特にリブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ（ＲＵＢＩＳＣＯ）の小サブユニットの核コード化遺伝子（nuclear coded gene）である。モレリら（Morelli et al.），Ｎａｔｕｒｅ３１５：２００−２０４（１９８５）はエンドウからのＲＵＢＩＳＣＯ遺伝子の５’−フランキング配列がリポーター遺伝子に光誘導性を転移することができ、提供された後者はキメラの形態でその配列に結合することを示す。この観察報告を、他の光誘導性遺伝子、例えばクロロフィル−ａ／ｂ−結合タンパク質に拡張することもまた可能である。調節可能なＤＮＡ配列の他のグループは例えばタバコのＰＲ（pathogenesis-r elated：病原体に関する）タンパク質遺伝子において存在し、そしてＥＰ−Ａ− ３３２，１０４に記載されるような化学的レギュレーターにより誘導可能な、化学的に調節可能な配列である。上記の実施例により言及される調節可能なＤＮＡ配列は天然または合成起源の両方であってよく、またはそれらは天然または合成ＤＮＡ配列の混合物からなるものであってよい。本発明の化学的なＤＮＡ構築物（類）（chemical DNA construct(s)）はプロモーターの多重複製またはＩＧＰＤ構造遺伝子の多重複製を含んでいてよい。加えて、構築物（類）はマーカーに対するコーディング配列およびシグナルもしくは移送（transit）ペプチドのような他のペプチドであって、それぞれＤＮＡ分子の他の機能要素とともに適切なリーディングフレームのもの、に対するコーディング配列を含んでいてよい。このような構築物の製造は当業者の通常のレベルの範囲内にある。有益なマーカーは除草剤、抗生物性または薬剤抵抗性、例えばハイグロマイシン、カナマイシン、Ｇ４１８、ゲンタマイシン、リンコマイシン、メトトレキセート、グリホセート、ホスヒノトリシン等に対する抵抗性を提供するペプチドを含む。これらのマーカーは本発明のキメラＤＮＡ構築物により、形質転換されていない細胞から形質転換された細胞を選択することに使用できる。他の有益なマーカーは可視的反応、例えば発色反応により容易に検出できるペプチド酵素であり、例えばルシフェラーゼ、β−グルクロニダーゼまたはβ−ガラクトシダーゼである。シグナルまたは移送ペプチドは、その作用の所望の部位に輸送する能力により、本発明のキメラＤＮＡ構築物の発現により形成されるＩＧＰＤを提供する。シグナルペプチドの例は植物病原−関連タンパク質、例えばＰＲ−１、ＰＲ−２等に元来連結されたペプチドを含む。ペインら（Payne et al.），ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１：８９−９４（１９８８）参照。移送ペプチドの例はフォンヘインら（Von Heijne et al.），ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．９：１０４−１２６（１９９１）に記載されたような葉緑体移送ペプチド、およびボウントリーら（Bountry et al.），Ｎａｔｕｒｅ３２８：３４０−３４２（１９８７）に記載されたようなミトコンドリアの移送ペプチドを含む。液胞のような種々の細胞性仕切り（Cellular compartment）に対してコード化されたタンパク質の局在（localization）をもたらす配列もまた含まれる。ノイハウスら（Ne uhaus et al.），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：１０３６２−１０３６６（１９９１）、ＥＰ−４６２０６５およびクリスピールズ（Chrispeels），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２：２１−５３（１９９１）参照。これらの出版物の近年の開示はそれらの全ての文献によりここで組み込まれる。組換えＤＮＡ分子は技術的に認識される方法により植物細胞に導入される。当業者は方法の選択が形質転換に対する標的となる植物の種類、例えば単子葉または双子葉植物に依存されることを認識するであろう。植物細胞を形質転換する適当な方法は微量注入法〔クロスウェイら（Crossway et ａl．），ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ４：３２０−３３４（１９８６））、エレクトロポレーション〔リグら（Rigg et al），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃｉＵＳＡ８３：５６０２−５６０６（１９８６），Ａｇｒｏｂａｃｕｔｅｒｉｕｍが介在した形質転換〔ヒンチら（Hinchee et al.），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６：９１５−９２１（１９８８）〕、遺伝子直接導入（パスコウスキら（Pasz kowski et al.），ＥＭＢＯＪ．３：２７１７−２７２２（１９８４））およびアグラセタス社，ウィスコンシン州，マディソン（Agracetus，Inc.，Madison ,Wisconsin）およびデュポン社，デラウェア州，ウィルミントン（Dupont,Inc.W ilmington,Delaware）から市販されている装置を使用する撃ち込み微粒子加速（ ballistic particle accelation）〔例えばサンフォードら（Sanford et al.），ＵＳ特許４，９４５，０５０；およびマクカーベら（Mccabe et al.），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６：９２３−９２６（１９８８）参照〕を含む。ワイシンガーら（Weissinger et al.），ＡｎｎｕａｌＲｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２２：４２１−４７７（１９８８）；サンフォードら（Sanford et al.），ＰａｒｔｉｃｕｌａｔｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ５：２７−３７（１９８７）（タマネギ）；クリストーら（Christou et al.），ＰｌａｎｔＰｈｓｉｏｌ．８７：６７１−６７４（１９８８）（大豆）；マクカーベら（McCabe et al.），Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６：９２３−９２６（１９８８）（大豆）；ダッタら（Datta et al.）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ８：７３６−７４０（１９９０）（米）；クラインら（Kl ein et al.），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：４３０５−４３０９（トウモロコシ）；クラインら（Klein et al.），Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６：５５９−５６３（１９８８）（トウモロコシ）；クラインら（Klein et al.），ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．９１：４４０−４４４（１９８８）（トウモロコシ）；フロムら（Fromm et al.），Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ８：８３３−８３９（１９９０）；およびゴードン−カムら（Gordon -Kamm et al.），ＰｌａｎｔＣｅｌｌ２，６０３−６１８（１９９０）（トウモロコシ）；スヴァブら（Svab et al.），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：８５２６−８５３０（１９９０）（タバコプロトプラスト）も参照。ＩＧＰＤ阻害剤の抵抗性または耐性のある改変されたＩＧＰＤをコード化する遺伝子は、形質転換してない植物から遺伝子は関心ある（of interest）導入遺伝子により形質転換された植物、植物組織または植物細胞を選択する方法において選択可能なマーカーとして使用でき、その段階は（ａ）ＩＧＰＤ阻害剤に抵抗性をもつ改変されたＩＧＰＤをコード化する遺伝子で、植物、植物組織または植物細胞を形質転換すること；（ｂ）このような形質転換された植物または植物細胞をＩＧＰＤ阻害剤を含んでいる培地に移すこと；および（ｃ）培地に生存する植物、植物細胞を選択することからなる。例えば、植物、植物組織または植物細胞は関心ある導入遺伝子と選択性マーカーとしての植物中で発現しうる改変されたＩＧＰＤをコード化する遺伝子との共 −形質転換することができる。このような形質転換された細胞を形質転換された細胞のみが生存できるであろうＩＧＰＤ阻害剤を含む培地に移す。この方法は改変されたＩＧＰＤをコード化する遺伝子で形質転換され得るいかなる植物細胞についても適用でき、いかなる関心ある導入遺伝子と一緒にも使用できる。導入遺伝子およびＩＧＰＤ遺伝子の発現は植物細胞上で機能する同じプロモーターによって、または異なるプロモーターによって行わせることができる。本発明の他の実例は実質的に精製されたＩＧＰＤ、好ましくは植物ＩＧＰＤおよび最も好ましくは小麦ＩＧＰＤを記載するものである。ＩＧＰＤは植物材料から粗ＩＧＰＤを単離し、次にこのように得られた抽出物を精製することにより製造できる。植物材料からの植物酵素の精製は主に植物の酵素の低い量のため非常に困難であった。ＩＧＰＤの場合、従来の研究で使用される標準検定法は信頼できないため、事態を悪くさせている。従って、多くの植物においてＩＧＰＤ活性は検出不可能であった。はっきりいうと、全ての従来報告された研究に使用されたＡｍｅｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２２８：１３１−１４３（１９５７）に記載される、強アルカル中、２８０ｎｍにおけるエノール化ＩＡＰ（イミダゾールアセトールホスフェート）の直接定量は、このような植物調整試料に内在する高いバックグラウンド吸収のために粗植物抽出物および僅かな量の酵素調整試料に適用できない。本発明の内では、ＨＣｌよりもむしろアルカリホスファターゼおよびアルカリの存在下で合成ＩＡＰの酵素的加水分解から生成するイミダゾールアセトール（ＩＡ）の量をアルカリ中、３７０ｎｍにおけるエノール化された形態のそれの吸光度を測定することによって測定する代替の方法が従来は検出不可能な植物中のＩＧＰＤを検出するのを適切にした、より感度の高い方法であることが見出された。出発材料、例えば粗酵素抽出物は公知の技術によって調整できる。同様に粗ＩＧＰＤ抽出物の精製は技術的に認識される手順を適当に組合わせることによって達成できる。スコープス（Scopes），ＰｒｏｔｅｉｎＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅ，第２版，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（ニューヨーク，１９８７）参照。一般に、分画法およびクロマトグラフィのような精製技術の組合せは精製ＩＧＰＤを得るのに好ましい。「精製」は、実質的に均質なＩＧＰＤ調整試料を意味する。好ましい精製スキームは硫酸アンモニウム分画法、疏水クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよびＦＰＬＣクロマトグラフィーのような技術の組合せを含む。特定の精製スキームは求める精製の程度および特に使用する出発材料に主に依存する。特別に好ましい精製技術はアフィニティークロマトグラフィーによるＩＧＰＤに結合できるリガンドを使用することに関する。好ましいリガンドは式（III）に示される。ろ過用ゲルまたはマトリックスのカラムは標準的な技術を使用して調整できる。好ましいカラムはチオプロピルセファロース６Ｂ（thiopropyl Sepharose 6B ）から製造し、そしてそれを緩衝液Ａ（ｐＨ７．４において、２０ｍＭＮａＰＢ／１ｍＭＥＤＴＡ）中の５ｍＭＤＴＴで洗浄する。リガンドはカラムに予め決められた濃度、例えば緩衝液Ａ中に６０μｍｏｌで使用され、溶離液をカラムの最上部から再度注ぎそして再循環を一夜継続する。カラムは次いで１ＭＮａＣｌを含む緩衝液Ａで洗浄できる。ＩＧＰＤを精製するべき試料を予め決められた流速、例えば８ｍｌ／時間でアフィニティーカラムに加え、そして次いで、ＩＧＰＤを脱着させる溶液、例えば１Ｍアミノトリアゾールの添加によるＩＧＰＤの溶離の前に、カラムを緩衝液Ａで洗浄しその後ｐＨ７において１０ｍＭトリス−ＨＣｌで洗浄する。当業者は、特別のパラメーターおよび試薬を適宜に変化できることを認識するはずである。本発明のこの実例は高等植物のいずれかから単離されるＩＧＰＤを包含する。好ましいＩＧＰＤ源は、小麦、トウモロコシ、ライ麦、ソルガム、米、大麦、キビ、芝および牧草、キャベツおよびエンドウを含む。さらに好ましい実例は、ＩＧＰＤが小麦胚芽（wheat germ）から単離されたＩＧＰＤであり、その調整は以下の実施例７に明らかにされている。小麦胚芽ＩＧＰＤは本来約６００，０００Ｄないし約６７０，０００Ｄの分子量をもつ。分子量はスーパーデックスＧ−２００（Superdex G-200）ゲルろ過により測定したものとして約６００，０００Ｄある。６７０，０００の分子量は本来のＰＡＧＥにより測定された。酵素はおのおの２５，５００Ｄの分子量をもつ、少なくとも２４個のサブユニットから構成される。上記サブユニットは非共有結合的に会合している。上記酵素はタンパク質約５．７Ｕ／ｍｇの特異的活性をもつ。等電点は約５．６５である。酵素活性は約３０℃まで安定であるが、６０℃で４０分間のインキュベーションを行った場合約５０％減少する。この酵素は、−８０℃で少なくとも１カ月保存した場合、安定のままであり、即ち実質的に全ての生物活性を保持する。ＩＧＰＤに対する小麦胚芽ＩＧＰＤのＫｍ値は０．４ｍＭとして測定された。最大酵素活性はｐＨ６．６において、１００ｍＭ２−メルカプトエタノールおよび１ｍＭＭｎＣｌ₂を含む５０ｍＭビス−トリス−プロパン−ＨＣｌ緩衝液中で測定されるものである。Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍＩＧＰＤの競合阻害剤として知られるアミノトリアゾールはｐＨ６．６で約４６μＭのＫｉにより競合的にＩＧＰＤを阻害する。マンガンイオンの存在は０．５ｍＭの濃度で酵素の活性を７倍に増強する。Ｍｎ²⁺ に対するＫｍ値は約０．１１である。Ｎ．ｃｒａｓｓａ，Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍおよび酵母のＩＧＰＤと同様に、小麦胚芽酵素は活性に対する還元剤を必要とする。小麦胚芽酵素は以下の表３Ａ（配列番号：９）で明らかにする配列により示されるＤＮＡで宿主細胞を形質転換することにより製造でき、それは本発明の教示するところに一致する。実質的に精製されたＩＧＰＤはまた技術的に周知の遺伝子工学によりここに開示するＩＧＰＤｃＤＮＡを使用して製造できる。この方法によれば、安定にＩＧＰＤ構造遺伝子を含むＤＮＡ分子で形質転換され、その細胞が遺伝子を発現できる組換え宿主細胞は、該宿主細胞が予め決められた量でＩＧＰＤを製造し得るような適当な条件下で培養され、次に製造されたＩＧＰＤを単離する。キメラＤＮＡ分子の構築は技術的に公知である。プロモーター、シグナル配列、５’および３’ 未翻訳配列およびエンハンサーのように特定の調節配列の選択は技術的にルーチン従業者の技術レベルの範囲内にある。適切なリーディングフレームと連結する個別の要素を含む得られた分子は、宿主細胞に形質転換できるベクターへ挿入できる。例としては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ〔ストラータジーン社，カルフォルニア州，ラジョラ（Stratagene,La Jolla,CA）〕，ｐＦＬＡＧ〔インターナショナルバイオテクノロジーズ社，コネチカット州，ニューヘヴン（Internationa l Biotechnologies,Inc.,New Haven,CT）〕，ｐＴｒｃＨｉｓ〔インビトロジェン社，カリフォルニア州，ラジョラ（Invitrogen,La Jolla,CA）〕，のようなプラスミド、およびバキュロウィルス発現ベクター、例えばＡｕｔｏｇｒａｐｈｉｃａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）〔ルックコウおよびサマーズ（Luckow and Summers），Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６：４７−５５（１９８８）〕のゲノムから導きだされたものが含まれる。好ましいバキュロウイルス／昆虫系はｐｂ１１１１３９２／Ｓｆ２１細胞〔インビトロジェン，カリフォルニア州，ラジョラ（Invitrogen,La Jolla,CA）〕である。他の適当な宿主は微生物、好ましくは細菌および最も好ましくはＥ．ｃｏｌｉおよび酵母である。精製されたＩＧＰＤはＩＧＰＤに阻害作用を有すると予想される化学物質のＩＧＰＤに阻害作用を測定する方法であって下記の段階：（ａ）実質的に精製されたＩＧＰＤを含む反応混合物の予め決められた容量に上記化学物質の予め決められた量を加えること；（ｂ）酵素反応を開始するため、得られた混合物にＩＧＰを加えること；（ｃ）予め決められた時間後反応を終了させること；（ｄ）この混合物にアルカリホスファターゼおよびアルカリを添加すること；および（ｅ）３７０ｎｍ、吸光係数１０，４００における吸光度の差を測定することによる、生成したイミダゾルアセトール（ＩＡ）の量を測定すること；からなる方法に使用できる。精製されたＩＧＰＤは新規な酵素の阻害剤を発見するための検定に使用でき、該阻害剤は商業的に利用可能な除草剤として機能する可能性があるであろう。代表的には化学物質のＩＧＰＤにおける阻害作用は、ＩＧＰからＩＡＰの生成を意味する、３７０ｎｍ、吸光係数１０，４００を使用する吸光度の差を測定することにより、定量する。Ａｍｓら（Ams et al.），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２１２：６８７−６９７（１９５５）参照。種々の濃度の阻害剤溶液、例えば１ｍＭ、１００μＭ、１０μＭおよび１μＭを酵素反応の開始の前に添加する。それぞれの反応混合物は５０ｍＭビス−トリス−プロパン−ＨＣｌ（ｐＨ６．６），１００ｍＭ２−メルカプトエタノール、１ｍＭＭｎＣｌ₂、１ｍＭＩＧＰ、およびＩＧＰＤの２ないし５ｍＵを含む。１度ＩＧＰを添加すると反応は３０℃で進行しおよび反応混合物の１０％までの容量の過塩素酸の添加により停止する。遠心分離後、上澄みを、例えば１Ｍ２−エチルアミノエタノールの添加によりｐＨ１０に調整する。アルカリホスファターゼおよびＭｇＣｌ₂を次に混合物にそれぞれ２５Ｕ／ｍｌおよび２．２ｍＭの最終濃度になるまで添加する。得られた混合物を４５℃で２０分間インキュベーションしその後混合物を、例えば塩−氷中で冷却する。５ＮＮａＯＨの５容量を溶液に加え、２分後、エノール化したＩＡを分光光度計で測定する。酵素活性の１ユニットは検定条件下で１分間当りのＩＡＰ／イミダゾールアセトールの１μｍｏｌの形成を触媒する酵素の量として定義される。ＩＣ₅₀＝１０μＭより大きい阻害剤の測定が予想される場合、検定は阻害剤の一層より低い濃度を使用して繰り返し検定できる。本発明の他の実例は阻害剤−抵抗性または阻害剤−耐性ＩＧＰＤ突然変異体を確認するための検定法にＩＧＰＤを使用することを含む。代表的な検定法は、以下の段階：（ａ）野性型ＩＧＰＤの阻害剤の存在下に、野性型ＩＧＰＤおよびその基質、ＩＧＰをインキュベーションすること；（ｂ）段階（ａ）の野性型ＩＧＰＤ活性を測定すること；（ｃ）野性型ＩＧＰＤの阻害剤の存在下に、突然変異ＩＧＰＤおよびその基質、ＩＧＰをインキュベーションすること；（ｄ）段階（ｃ）の突然変異ＩＧＰＤの活性を測定すること；および（ｅ）段階（ｂ）で測定された野性型ＩＧＰＤの活性を段階（ｄ）で測定された突然変異ＩＧＰＤの活性と比較すること；からなる。以下に示す改良を伴うＩＧＰＤの阻害剤を確認するための検定（阻害剤検定）に対しては反応混合物および反応条件は同様である。第一に、上記に示した方法で得られたＩＧＰＤ突然変異体は反応混合物の一つにおいて阻害剤検定の野性型ＩＧＰＤと置き替えらえる。第二に、野性型ＩＧＰＤの阻害剤は両方の反応混合物に存在する。第三に突然変異活性（阻害剤および突然変異ＩＧＰＤの存在下の酵素活性）および非突然変異活性（阻害剤および野性型ＩＧＰＤの存在下の酵素活性）を比較して、非突然変異活性と比べた場合に突然変異活性に酵素活性の顕著な増加が観察されるかどうか決定する。適当な基質および野性型ＩＧＰＤ酵素の阻害剤の存在する一方で、突然変異活性は突然変異ＩＧＰＤ酵素の酵素活性の何らかの測定がある。適当な基質および野性型ＩＧＰＤ酵素の阻害剤の存在する一方で、非突然変異活性は野性型ＩＧＰＤ酵素の酵素活性の何らかの測定がある。測定技術に伴うある程度の誤差より大きい酵素活性の増加として、好ましくは阻害剤の存在下で野性型酵素の活性の約２倍の増加、より好ましくは約５倍の増加、最も好ましくは約１０倍より大きい増加として著しい増加が明らかになる。本発明を以下の詳細な実施例を参照してさらに記載する。これらの実施例は説明のみを目的として提供され、他に明示しない限り、限定することを意図するものではない。実施例実施例１：Ｅ．ｃｏｌｉｈｉｓＢ突然変異体を相補する植物ｃＤＮＡの単離Ｕｎｉ−ＺＡＰＸＲＧｉｇａｐａｃｋ II Ｇｏｌｄクローニングキット（ストラータジーン社）を使用して、製造業者により記載されたようにして、アラビドプシスタリアナ（Arabidopsis thaliana：イヌカラシ）・エコタイプ・コロンビア（Lehle Seeds Tucson，AZ）からのポリＡ（＋）ＲＮＡのｃＤＮＡライブラリーを、バクテリオファージベクターラムダＺＡＰII〔ストラータジーンクローンニングシステムズ（Stratagene Cloning Systems），カリフォルニア，ラジョラ（La Jol1a,CA）〕内に、構築した。ＤＮＡ挿入断片を含む線状ファージミド（filamentous phageimds）を製造業者の説明に記載されたようにしてヘルパーファージＲ４０８（ストラータジーン社）を使用してライブラリーの増幅された部分から切出した。ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＳＢ３９３０菌株（ＣＧＳＣ♯４９３０）はＥ．ｃｏｌｉＧｅｎｅｔｉｃＳｔｏｃｋＣｅｎｔｅｒ〔コネチカット，ニューヘヴン（New Haven,CT）から入手した。ＳＢ３９３０はＩＧＰＤデヒドロゲナーゼ活性に特定の損傷を含む、ｈｉｓＢ４６３対立遺伝子をもたらす。ＳＢ３９３０はＥ．ｃｏｌｉＫ６０３菌株（ＣＧＳＣ♯６４５１）との交配により雄性にした。Ｋ６０３株はロイシン、スレオニンおよびトリプトフファン栄養要求性株であり、テトラサイクリン抵抗性（ｔｅｔＲ）を与えるＦ１：：Ｔｎ１０を保有する。ｔｅｔＲ、ｌｅｕ＋、ｔｈｒ＋、ｔｒｐ＋トランス接合部（Transcon jugamts）を、選択しおよびヒスチジン栄養要求性に対して試験した。得られた菌株をＳＴ１と名付けた。ｃＤＮＡライブラリーファージミドストックの９０μｌ部分（２．１×１０⁶ 形質導入単位／ｍｌ）をＳＴ１菌株のｍｉｄ−ｌｏｇ期の培養２．２ｍｌに感染させる。混合物を３７℃で１５分間インキュベーションし、次にペレット化し最小量のフォーゲル−ボナーＶＢ培地（Vogel-Bonner VB medium）〔ＶｏｒｇｅｌａｎｄＢｏｎｎｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２１８：９７−１０６，１９５６〕で洗浄する。洗浄した細胞はＶＢ寒天平板（アンピシリンを１００μｇ／ｍｌ［ａｍｐ１００］で含有）および３７℃で２日間インキュベーションを行う。おのおのの平板上には少しのコロニーも観察されない。対照の、栄養に富む培地のａｍｐ１００の平板およびＶＢ＋ヒスチジン平板にはそれぞれ数え切れない数のコロニーを有する（１０，０００より多いコロニー／平板）。ファージミド感染のないＳＴ１のない対照（negative control）は（ＶＢ）ａｍｐ平板上にコロニーは発生しなかった。ファージミド感染由来のコロニーはＶＢａｍｐ１００寒天培地上への線状接種（streaking）を繰り返すことにより純化した。コロニーを液体培養により成長させ、そしてそれらのプラスミドを当業者に公知の方法にて抽出する。ＳＴ１をヒスチジンプロトトロフィに高い頻度で形質転換するそれらの能力に対し純化したプラスミドを試験した。ｈｉｓＢ４６３突然変異体と再現性をもって相補する、ｐＳＴＡ３およびｐＳＴＡ４に示される２つのプラスミドが単離された。ｐＳＴＡ３に含まれるＩＧＰＤをコード化するこのアラビドプシスｃＤＮＡは以下の表１〔配列番号（SEQ ID NO）：１〕に明らかにする。表１に示されたｃＤＮＡ配列はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中にクローニングされ、その結果プラスミドｐＳＴＡ３を生じる。このプラスミドはメリーランド州２０８５２，ロックヴィレ，パークローントライヴ１２３０１（12301 Parkla wn Drive，Rockville,MD 20852）のＡＴＣＣに寄託されている。上記寄託は１９９１年６月５日に、受託番号ＡＴＣＣ７５０１４が与えられている。表１（配列番号：１）に示されたアラビドプシスｃＤＮＡは長さ１１４０ｂｐであり、ヌクレオチド２２においてメチオニンコドンにより開始されている２７１個のアミノ酸の予想されるタンパク質をコード化している。予想されるタンパク質のＮ末端は、他の葉緑体塩基転位ペプチドに類似する特徴をもち、葉緑体に対するヒスチジン生合成経路の明らかな位置に一致する。ナガイら（Nagai et a l.），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８，４１３３（１９９１）。Ｅ．ｃｏｌｉからのｈｉｓＢの配列およびＳ．ｓｅｒｅｖｉｓｉａｅからのＨＩＳ３について予想されるアミノ酸配列の比較は、ｃＤＮＡの予想されるオープンリーディングフレームのコドン７３において開始する高い保存配列の領域を明らかにした。このコドンは、このタンパク質のＮ−末端がエドマン分解に対して遮断される（blocked）ため、実験的に決定されないが、完全なＩＧＰＤのＮ末端と推定される。デヴァラックスら（Deveraux et al.）による、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１２．３８７（１９８４）に記載されたプログラムＧＡＰを使用して決定されたように、推定に基づく完全なアラビドプシスＩＧＰＤタンパク質配列はＥ．ｃｏｌｉからの遺伝子生成物と５２％の同一性および酵母からのＨＩＳ３遺伝子生成物と４５％の同一性を共有する。ＩＧＰＤをコード化する第二のｃＤＮＡは表１として示されたＩＧＰＤｃＤＮＡブローブによりアラビドプシスの葉の組織のｍＲＮＡから作成されたｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングにより単離された。部分的な配列分析は、幾つかのクローンがコーディング領域内で無関係な遺伝子から誘導されたｃＤＮＡに代表されるもとの単離されたＩＧＰＤの配列に対してかなり相同であること（おおよそ７７％）を示した。第二のｃＤＮＡに対する部分的なクローンはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするのに使用され、そしてさらに追加のクローンが単離された。このクローンの部分的な配列は配列番号：１２に示される。アラビドプシスからのこの第二のＩＧＰＤｃＤＮＡの部分配列を含むプラスミドｐＩＧＰＤａｔ．２は１９９４年４月２６日に、アメリカ合衆国、イリノイ州６１６０４、ペオリア，ノースユニバーシティストリート１８１５（1815 Nor th University Street，Peoria,Illinois 61604 U.S.A）のアグリカルチュラルリサーチサービス，パテントカルチャーコレクション（Agricultural R esearch Service， Patent Culture Collection），ノーザーンリージョナルリサーチセンター（Northern Regional Research Center）（ＮＲＲＬ）に寄託し、受託番号ＮＲＲＬＢ− が与えられた。実施例２：植物ｃＤＮＡによりコード化された酵素活性の確認Ｅ．ｃｏｌｉＳＴ１（ｐＳＴＡ３）、ＳＴ１、およびＸＬ１−Ｂｌｕｅ（ストラタジーン社）菌株、野性型ｈｉｓ＋対照菌株からのからの可溶性タンパク質の抽出は以下に示すよう調整された。細菌を栄養に富む培地で、またＸＬ１−Ｂｌｕｅ株の場合にはＶＢ培地で一夜生育させ、そして遠心分離により集める。細胞のおおよそ０．５ないし１．０ｇを、１００ｍＭトリエタノールアミン（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ２−メルカプトエタノールおよび１ｍＭＭｎＣｌ₂からなる溶液４ｍｌに再度懸濁させ、そして２−３分間ショートパルスの超音波処理により破壊する。細胞破片を遠心分離により除去し、上澄中のタンパク質を濃度８０％（ｗ／ｖ）の（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄の添加により沈澱させた。タンパク質ペレットを上記の緩衝液中に再度溶解し、セファデックスＧ−２５（Sephadex G-25 ）カラム〔ニュージャージー州．ピスカタウェイファーマシア社（Pharmacia，P scataway，NJ）への通過により脱塩を行った。ＩＧＰはアメス（Ames），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２２８：１３１−１４３（１９５７）に記載されている方法により合成し、以下に示すようにに精製した。第一の精製段階でドウェックス５０（Dowex 50）カラムの酸性溶出液（ｐＨ１．０）に木炭を加えた（アムス，１９５７）。吸着されていないＩＧＰを含む透明な濾液をＮａＯＨで中和し、木炭カラムにかけた。吸着されたＩＧＰを０．１ＮＨＣｌ中の５０％（ｖ／ｖ）メタノールにより溶出し、凍結乾燥しそしてメタノールで溶解した。ＩＧＰを等量の水を含むプロピレンオキシドで中和した。抽出液は次に、以下に示すようにＩＡＰを加水分解することにより得られるイミダゾールアセトール（ＩＡ）を測定することによって、ＩＧＰＤ活性に対して検定された。反応混合物（総容量１２５μｌ）は、５０ｍＭＢｉｓ−Ｔｒｉｓ −プロパン−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６．６）、１００ｍＭ２−メルカプトエタノール、１ｍＭＭｎＣｌ₂、１ｍＭＩＧＰおよび細菌抽出液１００μｌを含む。反応をＩＧＰＤ基質を添加することにより開始し、そして３７℃でインキュベーションしそして６０分後１Ｎ過塩素酸１／１０容量を加えることによって終了させる。遠心分離後、上澄みを１Ｍ２−エチルアミノエタノールでｐＨ１０に調整する。アルカリホスファターゼ〔シグマ社，モンタナ州，セントルイス（Si gma,St.Louis,MO）〕およびＭｇＣｌ₂を混合物にそれぞれ２５Ｕ／ｍｌおよび２．２ｍＭの最終濃度に達成するまで添加する。４５℃で２０分間のインキュベーション後、反応混合物を塩−氷浴中で冷やす。５ＮＮａＯＨの５容量を溶液に加え、そして２分後にエノール化ＩＡの濃度を吸光係数１０，４００を使用して３７０ｎｍにおける吸光度から測定する〔アムスアンドミッチェル（Ams and Mitchell）,J.Biol.Chem．212，687-697(1955)〕。酵素の１ユニットは記載した検定条件下で１分間当りのＩＡＰの１μｌの形成を触媒する量と定義される。当業者はこの検定の反応体および反応パラメーターをアルカリホスファターゼを除いては、感度を犠牲にすることなく変化できることがわかるであろう。表２に得られたデータをまとめる。ＳＴ１は完全にＩＧＰＤ活性を欠くことが見出された。ＸＬ−１Ｂｌｕｅは検出可能なＩＧＰＤ活性を含んでいた。ＳＴ１（ｐＳＴＡ３）はＩＧＰＤ活性の比較可能なレベルを有した。上記に記載したようにＩＧＰを伴うインキュベーションおよび続くＩＡの測定により、抽出物はＩＧＰＤ活性に対して検定される。ＩＧＰなしの（列２）および煮沸された抽出物による（列３）インキュベーションに対して得られた値を列１の生の値から差し引いて、列４の値を得る。ＳＴ１（ｐＳＴＡ３）およびＳＴ１（ｐＳＴＡ４）はＸ１−１Ｂｌｕｅに比較して活性を有したのに対し、ＳＴ１は活性が見られなかった。実施例３：小麦からのＩＧＰＤｃＤＮＡの単離出発材料として小麦の実生（seedling）を使用して実施例１で上記に記載した方法でｃＤＮＡライブラリーを構築した。ファージライブラリーは１０ｃｍペトリ皿上おおよそ１０，０００プラークの密度で平板培養し、そして３７℃で平板を一夜インキュベーションした後プラークのフィルターリフト（filter lifts o f plaque）が作成される。プラークリフトをプライムタイムキット（Prime Time kit）〔インターナショナルバイオテクノロジーズ社，コネチカット州，ニューヘブン（International Biotechnologies Inc.,New Haven,CT）を用いるランダムプライミング法により３２Ｐ−ｄＣＴＰでラベルされたアラビドプシスｃＤＮＡによりプローブする。ハイブリダイゼイション条件は５０℃で、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ），０．５ＭＮａＰＯ₄ｐＨ７．０，１ｍＭＥＤＴＡである。一夜のハイブイダイゼイセション後、フィルターを２ＸＳＳＣ，１％ＳＤＳで洗浄する。明確にハイブリダイズしたプラークをおおよそ１／１０，０００の頻度でオートラジオグラフィーにて検出した。単一のプラークに純化した後、製造業者の説明に従って（ストラータジーン社，カリフォルニア州ラジョラ）、ｃＤＮＡ導入切片をｉｎｖｉｖｏで切り出した。プラスミドＤＮＡはマジックミニプレップカラム（Magic Miniprep columns）〔プロメガバイオテク社，ウインスコシン州，マディソン（Promega Biotech,Madison WI）〕を使用して精製し、そしてそれらの配列を蛍光染料〔アプライドバイオシステムズ社，カリフォルニア州，フォスターシティ（Applied Biosystems，Inc.,Foster City，CA ）〕でラベルしたジデキシターミネーターを使用するチェインターミネーション法により決定する。幾つかのクローンの配列はＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＩＧＰＤｃＤＮＡのＤＮＡ配列と約７０％の同一性を共有することを見出した。ある外見上完全な長さのクローンに対してもともと決定された配列アンチセンスまたは逆相補性（reverse complement）配向（orientation）における以下に示す表３に明らかにする（配列番号：２）。さらなる配列分析後に組み込まれた若干の修正とともにこの配列はセンス配向（sence orientation）で以下に示す表３Ａに明示する（配列番号：９）。表３Ａに示されたｃＤＮＡ配列はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中でクローニングされてプラスミドｐＷＩＧＰＤにを生じる。このプラスミドは１９９４年４月２６日に、アメリカ合衆国，イリノイ州６１６０４，ペオリア，ノースユニバーシティ１８１５のアグリカルチュラルリサーチサービス，パテントカルチャーコレクション（ＮＲＲＬ），ノーザンリージョナルリサーチセンターに寄託されそして受託番号ＮＲＲＬＢ− を受けた。この実施例は当業者がＩＧＰＤｃＤＮＡまたは他の高等植物種からの遺伝子を比較的簡単な手法で得ることのできるような実験的手順からなる。表１に示される配列（ヌクレオチド２４９ないし８３１）および３Ａ（ヌクレオチド４５３−１０３７）によりコード化されたそれぞれの蛋白質の予想されるアミノ酸配列のアラインメントを表４に明らかにする。同一残基を２つの配列の間の縦棒で示す。アラインメントはデヴェラックスら（Deveraux et al.）,Nucleic Acids Res．12：387-395（1984）に記載されるＧＡＰプログラムを使用して行われる。精製された小麦胚芽ＩＧＰＤ（以下の実施例７参照）から決定されたペプチド配列に相当する領域は下線を引いて示す。実施例４：Ｅ．ｃｏｌｉの組換えＩＧＰＤの発現ＰＣＲオーバーラップ拡張技術（overlap extention technique）を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ中の組換え高等植物ＩＧＰＤを製造するため、ｌａｃＺ遺伝子の５’末端に対するアラビドプシスＩＧＰＤｃＤＮＡの翻訳融合（translational fusion）をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ〔ストラタジーン社，ラジョラ（Stratagene，La Jolla）〕中に作成する。合成オリゴヌクレオチドプライマーＳＶ１２４（配列５’−ＴＧＣＡＡＴＣＣＧＣＧＧＧＴＡＧＡＡＴＴＧＧＡＧＡＡＧＴＡＡ−３ ’：配列番号：５）およびＳＶ１２２（配列５’−ＴＧＣＴＣＣＡＣＣＡＡＣＴＧＡＧＴＡＴＣ−３’；配列番号：６）は、長さ約４１８ｂｐのｐＳＴＡ３のＤＮＡフラグメントを増幅するためポリメラーゼ連鎖反応で使用される。ＰＣＲ生成物はその特異なＳａｃIIおよびＸｂａＩ部位にて消化され、結果として長さ約３００ｂｐのフラグメントが得られる。消化生成物をを低ゲル化温度の（low-gelling-temperature）アガロースゲル上で分離し、そして３００ｂｐＳａｃII−ＸｂａＩフラグメントを切り出す。並行して、プラスミドｐＳＴＡ３をＳａｃIIおよびＸｂＩで消化し、生成物をゲル上で分離し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターおよびＩＧＰＤｃＤＮＡの３’部分を含む、消化生成物からの大きいフラグメントをゲルから切り出す。ベクターフラグメントはＰＣＲ生成物を消化した３００ｂｐＳａｃII−ＸｂａＩに連結し、連結反応生成物はＥ．ｃｏｌｉＸＬ１Ｂｌｕｅ能力細胞〔ストラタジーン社，カリフォルニア州，ラジョラ（Stratagene,La Jolla,CA）〕中で形質転換させる。アンプリシン抵抗性コロニーを選択し、培養しそしてそれらのプラスミドＤＮＡを抽出する。プラスミドの構造はジデオキシ鎖停止法（dideoxy chain termin ation method）によって配列することにより確認する。予期された構造をもつ組換えプラスミドはｐｌａｃＩＧＰＤと呼ぶ。得られたこの菌株から製造された融合タンパク質は、予測されるタンパク質コーディング配列のコドン７３において開始する、推測上アラビドプシスＩＧＰＤに対する完全なコーディング配列が続く、ベータガラクトシダーゼのＮ−末端の約２３個のアミノ酸を含む。Ｅ．ｃｏｌｉ中の高等植物の発現のための他のプラスミドはＩＧＰＤの推測上完全なコーディング配列をベクターｐＦＡＬＧ〔インターナショナルバイオテクノロジー社，コネチカット州、ニューヘブン（International Biotechnologies，Inc.，N ew Haven,CT）〕に挿入することにより構築された。実施例５：バキュロウイルス表現系による昆虫細胞中の組換えＩＧＰＤの発現ＩＧＰＤｃＤＮＡをｐＳＴＡ３から切り出し、バキュロウイルス転移ベクターｐＶＬ１３９２〔インビトロジェン社，カリフォルニア州，サンディエゴ（In vitrogen Corp．San Diego，CA）〕内に連結する。得られたプラスミドはポリヘドリンプロモーター（polyhedrin promoter）の下流にアラビドプシスＩＧＰＤコーディング配列を含む。プラスミドを、野性型ＡｃＭＮＰＶＤＮＡでさらにトランスジェクションした、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）培養細胞系Ｓｆ２１〔インビトロジェン社，カリフォルニア州，サンディエゴ〕中に共トランフェクションする。組換えプラークを顕微鏡試験下で屈折力のあるポリヘドリン結晶（refrctile polyhedrin crystal）のないことにより確認する。高い力価のウイルスストックが単一の組換えプラークから調整される。組換えＩＧＰＤを製造するために、Ｓｆ２１細胞（０．８×１０⁶細胞／ｍｌ）を感染多重度（ＭＯＩ）１０でウイルスより感染させる。感染３日後、感染したＳｆ２１細胞からの粗抽出物を上述したと同様にＩＧＰＤ活性に関して検定する。結果を以下の表５にまとめる。感染されたＳｆ２１細胞からの抽出物の特異活性が１．３ユニット／リットルの全活性をもつ、４．７ｍｕ／ｍｇであると測定された。表５におけるＩＧＰＤ発現レベルの比較はＴｎ細胞中で発現されるアラビドプシスＩＧＰＤにより培地中に高いＩＧＰＤ活性が得られることを示す。実施例６：トランスジェニック植物におけるアラビドプシスＩＧＰＤｃＤＮＡの発現トランスジェニック植物中でアラビドプシスタンパク質を発現するため、ｐＳＴＡ３中に含まれる完全な長さのｃＤＮＡを、以下に示すようなｐＣＧＮ１７６１（EP-392225）から誘導された植物発現ベクターｐＣＧＮ１７６１ＥＮＸに挿入する。ｐＣＧＮ１７６１は、その特定のＥｃｏＲＩ部位で消化され、および配列：５’−ＡＡＴＴＡＴＧＡＣＧＴＡＡＣＧＴＡＧＧＡＡＴＴＡＧＣＧＧＣＣＣＧＣＴＣＴＣＧＡＧＴ−３’（配列番号：７）および５’−ＡＡＴＴＡＣＴＣＧＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＡＴＴＣＣＴＡＣＧＴＴＡＣＧＴＣＡＴ−３’（配列番号：８）の２つのオリゴヌクレオチドからなる二本鎖ＤＮＡフラグメントと連結する。得られたプラスミド、ｐＣＧＮ１７６１ＥＮＸは、カリフラワーモザイクウイルスからの重複の３５Ｓプロモーター〔カイら（Kay et al.），Science 236：1299-1302(1987)〕およびアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のｔｍｌ遺伝子の３’−非翻訳の配列（untranslated sequence）との間にある特定のＥｃｏＲＩ，ＮｏｔＩ，ＸｈｏＩ部位を含む。このプラスミドをＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ部位で消化し、ｐＳＴＡ３の部分的な消化にから得られたＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩフラグメントに、完全なＩＧＰＤｃＤＮＡ（内因性ＥｃｏＲＩ部位を含むｃＤＮＡ）をもたらすように連結する。このプラスミドからは、重複の３５Ｓプロモーターとアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のｔｍｌ遺伝子の３’−非翻訳の配列とにフランキングされる（flanked）アラビドプシスＩＧＰＤｃＤＮＡを含むＸｂａＩフラグメントが切り出される。このＸｂａＩフラグメントをＴ−ＤＮＡ末端配列の間にあるその特定のＸｂａＩ部位において、バイナリーベクターｐＣＩＢ２００（ＥＰ−３３２１０４）内に挿入する。ｐＣＩＢ２００ＩＧＰＤと呼ぶ、得られたプラスミドをＡ．ツメファシエンス菌株ＣＩＢ５４２内で形質転換させる。ウクネスら（Uknes et al.），Plant Cell 5：159-169（1993）参照。ニコチアナ・タバカム，キサンチ-hC変種（Nicotiana tabacum cv．Xanthi-nc ）を、ホルッシュら（Horsh et al.），Science 227：1229（1985）に記載された方法で、ｐＣＩＢ２００ＩＧＰＤをもつＡ．ツメファシエンスＣＩＢ５４２で感染させる。１５個の独立の葉ディスク由来のカナマイシン耐性若木を根付け培地（rooting medium）に移し、次に土に移植しそして得られた植物を温室内で成熟するまで成長させる。これらの植物からの種子を集め、カナマイシンを含むＭＳ寒天培地で発芽させる。１０個の個々の初代形質転換体からの個々のカナマイシン耐性苗木を温室で成熟するまで成長させ、そしてそれらの種子を集める。これらの種子をカナマイシンを含むＭＳ寒天培地で発芽させる。もっぱらカナマイシン抵抗性苗木のみを生じる植物系統は挿入された遺伝子に対して同型接合であり、より先の分析にかける。１５個の別々のトランスジェニック系統のおのおのの葉ディスクは紙パンチにより切出し、そして式（IV）、つまりに示される特定のＩＧＰＤ阻害剤の０または３０ｐｐｍを含むＭＳ寒天培地上に置く。３週間後、それぞれの系統の１０個のディスクの２セットを秤量し、結果を記録する。ＩＧＰＤ−Ｃ、ＥおよびＧと命名するトランスジェニック系統は、野性型の形質転換されない植物よりも約３倍多い阻害剤への抵抗性または耐性である。ＲＮＡはこれらの系列のおのおのの葉から抽出される。おのおのの別々の同型接合系統からの、および非−トランスジェニック−対照植物からの全ＲＮＡはホルムアルデヒド存在下の寒天ゲル電気泳動によって分離する〔オースベルら（Au sbel et al.）,Current Protocols in Molecular Biology, Wiley & Sons,New Y ork(1987)〕。ゲルをナイロン膜（上記オースベルら）にブロットし、そして放射線ラベルされたアラビドプシスＩＧＰＤｃＤＮＡでハイブリダイズする。ハイブリダイゼイションおよび洗浄条件はチャーチおよびギルバート（Church and Gilbert），Proc．Natl．Acad．Sci．USA 81：1991−1995（1984）により記載される。フィルターをオートラジオグラフィーにかけ、ＩＧＰＤ導入遺伝子に相当する強いＲＮＡバンドを全ての４つのトランスジェニックで検出した。アラビドプシスＩＧＰＤメッセージの最も高い外見上のレベルを示すＩＧＰＤ −Ｇラインの種子を、式（Ｉ）に示される特定のＩＧＰＤ阻害剤に対する抵抗性または耐性に対して試験する。トランスジェニック系列からの種子および野性型非−形質転換タバコからの種子は１５００ないし３０００ｐｐｍの濃度における阻害剤を含むＭＳ寒天培地上で発芽させる。２週間後、実生の成長を視覚的に得点に数える。結果を以下の表６に示す。表は式（Ｉ）のＩＧＰＤ阻害剤において生育した実生に関する視覚的にまとめる。系統ＩＧＰＤ−Ｇの実生は式（Ｉ）のＩＧＰＤ阻害剤１５００ｐｐｍを含む培地で発芽した場合、阻害されない成長を示す。３０００ｐｐｍでは、成長の僅かな阻害のみある。野性型タバコ植物は式（Ｉ）の阻害剤１５００ないし３０００ｐｐｍを含むＭＳ培地で阻害される。これらの同型接合トランスジェニック植物から葉を集め、液体窒素で凍結し、２００ｍＭトリエタノールアミン−ＨＣｌ，１０％ポリクラー（Polyclar）ＡＴ〔和光純薬（株）大阪，日本〕にホモジナイズする。抽出物をミラクロス（Mira cloth）〔カリバイオケム、カリフォルニア州、サンディエゴ（Calbiochem,San Diego,CA）を通してろ過しそしてＩＧＰＤ活性について実施例７に記載するように検定する。活性は０．６８ｍｕ／ｍｇタンパク質または７．４５ｍｕ／ｇ生鮮重量であるよう測定される。粗抽出物においてもまたは３０−６０％硫酸アンモニウム画分においても、このことはトランスジェニック対照タバコ植物の活性の検出できないレベルと好ましく比較される。他の植物種のＩＧＰＤ活性を表７にまとめる。これらの結果はトランスジェニックタバコ植物の粗抽出物のＩＧＰＤの活性が試験したいずれかの植物からの８０％硫酸アンモニウム画分のＩＧＰＤの活性を超えることを示す。ＩＧＰＤ−過剰発現系ＩＧＰＤ−Ｇの耐性のさらなる評価のため、植物を温室で成長させそして上記式（IV）で示されるＩＧＰＤ阻害剤の種々の濃度ので処理する。処理した植物を写真に撮った後、それらの健康状態を視覚的に得点にする。結果を以下の表８に記録する。実施例７：小麦胚芽からのＩＧＰＤの精製小麦胚芽〔シグマケミカル社，セントルイス（Sigma Chemical Co.，St Louis ）をアセトン粉体（acetone powder）に加工する。以下の段階を４℃で行う。上記アセトン粉体を２００ｍＭトリエタノールアミンＨＣｌ（ＴＥＡ−ＨＣｌ）に懸濁し、不溶の材料を遠心分離によりろ液により除く。上澄みを、１ｍＭＭｇＣｌ₂、１００ｍＭ２−メルカプトエタノールおよび硫酸アンモニウム（２０％飽和溶液）を含む５０ｍＭＴＥＡ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で平衡させたブチルトーヨーパール（butyl-Toyopearl）６５０Ｍカラム（トーソー，東京）に入れる。酵素活性は同じ緩衝液中の硫酸アンモニウムの直線的勾配（２０−０％飽和溶液）により溶出する。タンパク質を硫酸アンモニウム（８０％飽和溶液）により沈降させることにより集め、１ｍＭＭｎＣｌ₂および１００ｍＭ２−メルカプトエタノールを含む２０ｍＭＴＥＡ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）（精製緩衝液）に溶解する。セファデックス（Sephadex）Ｇ−２５により脱塩後、抽出物を精製緩衝液で平衡させたＤＥＡＥ−トーヨーパール（DEAB-Toyopearl）６５０Ｍカラム（トーソー，東京）に入れる。酵素は精製緩衝液中のＮａＣｌ（０−５００ｍＭ）の直線的勾配により抽出する。活性画分をセファデックスＧ−２５で脱塩し、そして精製緩衝液を用いてＭｏｎｏＱＦＰＬＣ〔ファーマシア社（Pharmacia-LKB）〕にかける。活性画分をプールし、そして限外ろ過〔アミコン（Amicon）ＹＭ３０〕により濃縮する。この調整物を１５０ｍＭＮａＣｌを含む精製緩衝液を用いたスーパーデックス２００ＦＰＬＣ（ファーマシア社）で２回クロマトグラフにかける。得られた酵素調整物は使用するまで−８０℃で貯蔵する。表９に酵素の１１４，０００倍精製をもたらす、小麦胚芽からのＩＧＰＤ精製を示す。ＩＧＰＤ活性の決定ＩＧＰＤ活性はＩＡＰの加水分解により得られるイミダゾールアセトールを測定することにより決定した。脱水素酵素反応混合物は容量２５ｍｌ中、５０ｍＭビス−トリス−プロパン−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６．６）、１００ｍＭ２−メルカプトエタノール、１ｍＭＭｎＣｌ₂、１ｍＮＩＧＰ、および酵素の２ないし５ｍＵを含む。反応を基質の添加により開始し、３０℃でインキュベーションし、そして４０分後、１Ｎ過塩素酸１０％（ｖ／ｖ）を加えることにより反応を停止する。遠心分離後、上澄みを、１Ｍ２−エチルアミノエタノールの添加によりｐＨ１０に調整する。アルカリホスファターゼおよびＭｇＣｌ₂を混合物に、それぞれ２５Ｕ／ｍｌおよび２．２ｍＭの最終濃度に達するまで添加する。４５℃で２０分間インキュベーション後、反応混合物を、塩−氷中で冷却する。５ＮＮａＯＨの５容量を溶液に加え、２分後、吸光係数１０，４００を使用してエノール化したイミダゾールアセトールの濃度を３７０ｎｍの吸光度から決定する〔アメスおよびミッチェル（Ames and Mitchell）,J.Biol.Chem.212:687-697,1955〕。酵素活性の１ユニットは検定条件下で１分間当りのＩＡＰ／イミダゾールアセトールの１μｍｏｌの形成を触媒する酵素の量として定義される。ヒスチジノールホスフェート活性ヒスチジノールホスフェート活性は、幾らかの改良を伴う前に記載した方法〔アムス（Ames）ら１９５５〕により決定される。検定混合物は最終的容量１８０μｌ中、２００ｍＭＴＥＡ−ＨＣｌ（ｐＨ８．２）、５ｍＭＬ−ヒスチジノールホスフェートおよび酵素を含有する。反応は基質の添加により開始し、３７℃で１８０分間インキュベーションし、および１Ｎ過塩素酸１０％（ｖ／ｖ）て停止する。混合物を１０，０００ｒｐｍで３分間遠心分離にかける。上澄み１８０μｌの部分をアルコルビン酸−モリブレン酸試薬４２０μｌと混合し４５℃で２０分間インキュベーションする。８２０ｎｍにおいて基質または酵素を除いた対照液に対して吸光度を読み取る。酵素活性の１ユニットは検定条件下で１分間当りのホスフェートの１μｍｏｌの形成を触媒する酵素の量として定義される。タンパク質の測定タンパク質濃度は標準として牛血清アルブミンを使用するブラッドフォード（ Bradford）タンパク質検定法（Bradford，Anales of Biochemsitry 72:248-254 ，1976）により測定した。電気泳動法ラエミリ（Laemmli）（Nature 227:680-685，1970）の方法に従って、勾配ゲル〔ファストゲル（Phastgel）８−２５，ファーマシア社（Pharmacia-LKB）〕を使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。本来のＰＡＧＥはデービスの方法（Davi s,Ann．NY Acad．Sci．121:404-427，1964）に従ってスラブ勾配ゲル（slab gradient gel；ＰＡＧプレート４／１５，第一化学（株）（Dai-ich Chemicals），日本）を使用して行った。等電点電気泳動は両性電解質担体としてセルバライト（Selvalyt）ｐＨ３−７を含むポリアクリルアミドゲル（４％）を使用して行った。ｐＩ値は検定キット（calibration kit ）〔ファーマシア社（Pharmacia-LKB）を使用して測定した。このように得られた精製されたＩＧＰＤはリシルエンドペプチダーゼにより消化し、得られた消化物を逆相ＨＰＬＣにより分離する。得られたペプチドをアプライドバイオシステムズ〔Applied Blosystems，カリフォルニア州、フォスターシティ（Foster City,CA）〕４７０Ａタンパク質配列決定装置による自動化エドマン分解にかける。以下に示すペプチド配列が決定される。ペプチド♯１：ＧＩＮＲＦＧＨＦＴＡＰＬＤＥＡ（配列番号：１０）ペプチド♯２：ＧＶＬＳＲＶ（配列番号：１１）ペプチド♯１は小麦ＩＧＰＤｃＤＮＡ（表４，下線部）から決定された予想されたタンパク質配列と正確に合致する。ペプチド♯２は、最終残基においてｃＤＮＡから誘導された予想されたタンパク質配列と異なる。ペプチドのアミノ酸配列と比較した不一致は、ゲノムサザーンブロット分析により決定されたようにアラビドプシス（Arabidopsis）が２つのＩＧＰＤ遺伝子を有する事実で特に示される、小麦ゲノムの異なる遺伝子によりコード化された複数のイソ型（multiple isoforms）の存在によるものらしい。その６倍体ゲノムをもつ、小麦は２つのＩＧＰＤ遺伝子よりもさらに多くをもつであろう。さらにこれらの配列はアラビドプシス（Arabidopsis）ＩＧＰＤｃＤＮＡ（表４）によりコード化された予想されたタンパク質配列の２つのセグメントと殆ど同じであった。この明細書にて言及した全ての出版物および特許出願は本発明に関係する当業者の技術レベルを示すものである。全ての出版物および特許出願は、それぞれの個々の出版物または特許出願が特別におよび個々に参照文献を組み込んでいることを示すと同じ程度で、ここに組み込まれる。ここに記載した本発明の種々の改良は当業者により明らかになるであろう。このような改良は付属の請求の範囲の範囲内に入ると見なされる。寄託プラスミドｐＳＴＡ３：ＡＴＣＣ７５０１４引用された文献

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者多田幸代大阪府堺市槙塚台３―23―３ (72)発明者森一郎兵庫県宝塚市美幸町10―66 (72)発明者岩崎源司兵庫県宝塚市美幸町10―66

Claims

【特許請求の範囲】１．成長および発育が、イミダゾールまたはトリアゾール除草剤またはその混合物による抑制に耐性（tolerant）があり、その耐性は通常イミダゾールグリセロールホスフェートデヒドラターゼ（ＩＧＰＤ）の活性を抑制するレベルにおいて、上記の除草剤による抑制に耐性のあるＩＧＰＤにより与えられる、植物、植物組織および植物種子。２．トウモロコシである請求項１に記載の植物。３．小麦または大豆である請求項１に記載の植物。４．耐性が野性型ＩＧＰＤの過剰発現（over-expression）より与えられる請求項１に記載の植物。５．耐性が突然変異体ＩＧＰＤの発現により与えられる請求項１に記載の植物。６．植物ＩＧＰＤをコード化する精製されたＤＮＡ分子。７．小麦ＩＧＰＤをコード化する請求項６に記載のＤＮＡ分子。８．配列番号（SEQ ID NO）：９に示される配列からなる、請求項７に記載のＤＮＡ分子。９．アラビドプシス（Arabidopsis）ＩＧＰＤをコード化する請求項６に記載のＤＮＡ分子。１０．配列が配列番号：１に示す配列からなる、請求項９に記載のＤＮＡ分子。１１．配列が配列番号：１２に示す配列からなる、請求項９に記載のＤＮＡ分子。１２．請求項６に記載の分子に操作可能に連結された、植物細胞の関連したコーディング配列の発現を起こさせ得るプロモーターを含む組換えＤＮＡ分子。１３．宿主細胞内へ安定に形質転換できる、請求項１２に記載のＤＮＡ分子を含む組換えベクター。１４．ＩＧＰＤを発現できる、請求項１３に記載のベクターにより安定に形質転換された宿主細胞。１５．植物細胞、細菌細胞、酵母細胞または昆虫細胞である、請求項１４に記載の宿主細胞。１６．上記耐性が請求項１２または１３に記載の組換えＤＮＡから与えられる、請求項１に記載の植物。１７．実質的に精製されたＩＧＰＤ。１８．高等植物から単離された請求項１７に記載のＩＧＰＤ。１９．小麦から単離された請求項１８に記載のＩＧＰＤ。２０．配列番号：４に記載されたタンパク質のための配列からなる、請求項１９に記載のＩＧＰＤ。２１．アラビドプシスから単離された請求項１８に記載のＩＧＰＤ。２２．配列番号：３に記載されたタンパク質のための配列からなる、請求項１１に記載のＩＧＰＤ。２３．請求項１４に記載の宿主細胞により製造される実質的に精製されたＩＧＰＤ。２４．ＩＧＰＤに抑制作用を有すると予想される化学物質のＩＧＰＤに抑制作用を測定する方法であって下記の段階：（ａ）実質的に精製されたＩＧＰＤを含む反応混合物の予め決められた容量に上記化学物質の予め決められた量を加えること；（ｂ）酵素反応を開始するため、得られた混合物にイミダゾールグリセロールホスフェート（ＩＧＰ）を加えること；（ｃ）予め決められた時間後反応を終了させること；（ｄ）この混合物にアルカリホスファターゼおよびアルカリを添加すること；および（ｅ）３７０ｎｍ、吸光係数１０，４００における吸光度の差を測定することによる、生成したイミダゾルアセトール（ＩＡ）の量を測定すること；からなる方法。２５．少なくとも１回の繰り返し段階をさらに含み、各繰り返し段階において上記化学物質の異なる量を反応混合物に加える請求項２４に記載の方法。２６．ＩＧＰが合成由来である、請求項２４に記載の方法。２７．ＩＧＰＤ抑制剤に耐性のあるＩＧＰＤ突然変異体を確認するための方法であって、以下の段階：（ａ）野性型ＩＧＰＤの抑制剤の存在下に、野性型ＩＧＰＤおよびその基質、ＩＧＰをインキュベーションすること；（ｂ）段階（ａ）の野性型ＩＧＰＤの活性を測定すること；（ｃ）野性型ＩＧＰＤの抑制剤の存在下に、突然変異ＩＧＰＤおよびその基質、ＩＧＰをインキュベーションすること；（ｄ）段階（ｃ）の突然変異ＩＧＰＤの活性を測定すること；および（ｅ）段階（ｂ）で測定された野性型ＩＧＰＤの活性を段階（ｄ）で測定された突然変異ＩＧＰＤの活性と比較すること；からなる方法。２８．関心ある（of interest）導入遺伝子によって、形質転換されていない植物から形質転換された、植物、植物組織または植物細胞を選択する方法であって、以下の段階：（ａ）植物、植物組織または植物細胞をＩＧＰＤ抑制剤に耐性のある改変されたＩＧＰＤをコード化する遺伝子で形質転換すること；（ｂ）このように形質転換された植物または植物細胞をＩＧＰＤ抑制剤を含む培地に移すこと；および（ｃ）培地中に生存している植物または植物細胞を選択すること；からなる方法。２９．関心ある導入遺伝子によって植物、植物組織または植物細胞を形質転換する別の段階を含む、請求項２８に記載の方法。３０．試料中のＩＧＰＤの測定方法であって、アルカリホスファターゼおよびアルカリの存在下で、ＩＧＰのＩＧＰＤにより触媒される加水分解から生成するエノール化イミダゾールアセトールホスフェート（ＩＡＰ）の量を測定することよりなる段階からなる方法。３１．上記測定が、３７０ｎｍでのエノール化ＩＡＰの吸光度を測定することからなる、請求項３０に記載の方法。