JP4426348B2 - ホウ素トランスポーター及びその遺伝子 - Google Patents

Description

本発明は、シロイヌナズナにおけるホウ素トランスポーター及びその遺伝子に関する。

ホウ素は高等植物の微量必須元素の一つである（例えば、非特許文献１参照）。ホウ素は毒性も持っており、過剰に摂取すると植物の生育が阻害されたり、動物では急性中毒で死亡したりする。土壌溶液中でホウ素は無電荷の分子状で存在する。そのため比較的容易に溶脱し、農作物において欠乏症が発生しやすい。ホウ素欠乏症による農業上の収量、品質の低下は130品種、日本を含む世界80カ国以上で報告されている（例えば、非特許文献２参照）。また、ホウ素は他の元素と比較して至適濃度範囲が狭いことが知られており、乾燥地での土壌集積や過剰施肥による過剰症の発生も報告されている。

最近になり植物におけるホウ素の役割が明らかにされてきた。ホウ素が細胞壁のペクチン質多糖を架橋することが明らかとなり（例えば、非特許文献３参照）、この架橋が植物の生育に必須であることが示された（例えば、非特許文献４参照）。これが植物におけるホウ素の生理機能に関する最初の分子レベルの知見である。その一方で植物体でのホウ素輸送機構には不明な点が多く残されている。ホウ素は長い間、脂質二重膜の受動拡散によって細胞内に入り、蒸散流によって植物体内を輸送されると考えられていた（例えば、非特許文献５参照）。一方、生育に適したホウ素栄養条件は種間や品種間で大きく異なることが知られていた。吸収や転流、利用効率の違いがその原因の可能性として挙げられていたものの、その要因となる分子は不明であった。近年になりチャネルを介した輸送が提唱された（例えば、非特許文献６参照）が、その根拠はアフリカツメガエルの卵母細胞での発現系や膜小胞を用いたin vitroの実験にすぎず、実際の植物個体でそれらチャネル分子がホウ素輸送に関与するかは示されていなかった。また、ヒマワリの根の吸収実験から輸送体による能動輸送の存在が示唆された（例えば、非特許文献７参照）ものの、それを担う輸送体の同定には至っていなかった。

本発明者らは、生物界で初めて排出型ホウ素トランスポーターＢＯＲ１をモデル植物であるシロイヌナズナより単離した（例えば、特許文献１参照）。ＢＯＲ１は低ホウ素栄養条件下で導管への積極的なホウ素輸送を担うと考えられている（例えば、非特許文献８参照）。また、ホウ素輸送を担うトランスポーターとしてＢＯＲ１以外には、酵母のＹＮＬ２７５ｗが知られている（例えば、非特許文献９参照）。

特開２００２−２６２８７２号公報 Loomis, W.D.; Durst, R. W. (1992) Chemistry and biology of boron. Biofactors 3: 229-239 Shorrocks, V. M. (1997) The occurrence and correction of boron deficiency. Plant and Soil 193: 121-148 Matoh, T.; Ishigaki, K. I.; Ohno, K.; Azuma, J. I. (1993) Isolation and characterization of a boron-polysaccharide complex from radish roots. Plant Cell Physiol. 34: 639-642 O'Neill, M. A.; Eberhard, S.; Albersheim, P.; Darvill, A. G. (2001) Requirement of borate cross-linking of cell wall rhamnogalacturonan II for Arabidopsis growth. Science 294: 846-849 Marschner, H. (1995) Mineral Nutritin of Higher Plants, 2nd ed. Academic Press, San Diego, CA Dordas, C.; Chrispeels, M. J.; Brown, P. H. (2000) Permeability and channel-mediated transport of boric acid across membrane vesicles isolated from Squash roots. Plant Physiol. 124: 1349-1362 Dannel, F.; Heidrun, P; Romheld, V. (2000) Characterization of root boron pools, boron uptake and boron translocation in sunflower using the stable isotope 10B and 11B. Aust. J. Plant Physiol. 156: 756-761 Takano, J.; Noguchi, K.; Yasumori, M.; Kobayashi, M.; Gajdos, Z.; Miwa, K.; Hayashi, H.; Yoneyama, T.; Fujiwara, T. (2002) Arabidopsis boron transporter for xylem loading. Nature 420 (6913): 337-340 Zhao, R. M.; Reithmeier, R. A. F. (2001) Expression and characterization of the anion transporter homologue YNL275w in Saccharomyces cerevisiae. American Journal of Physiology-Cell Physiology 281 (1): C33-C45

ホウ素の環境中からの取込みは重要な制御段階であるが、ホウ素輸送を担うトランスポーターはシロイヌナズナのＢＯＲ１と酵母のＹＮＬ２７５ｗしか知られていなかった。植物体におけるホウ素輸送機構を分子レベルで解明し、ホウ素輸送における主要な経路や制限要因を明らかにすることは効率的な施肥方法や育種戦略への知見を与えるものであると考えられる。また、植物体でホウ素輸送に関与する遺伝子を同定することはホウ素欠乏・過剰耐性品種の作出に直接つながると考えられる。本発明の課題は、環境中からのホウ素の取込みや生体内でのホウ素の輸送をより効率良く制御することが可能となる、これまでに知られているトランスポーターとは異なる活性を持つホウ素輸送を司る新たな遺伝子を提供することにある。

本発明者らは上記課題を解決するため鋭意研究し、シロイヌナズナゲノムに存在する６つのＢＯＲ１相同遺伝子のうち、シロイヌナズナにおいて発現しているＡｔ３ｇ６２２７０、Ａｔ３ｇ０６４５０、Ａｔ１ｇ１５４６０、Ａｔ１ｇ７４８１０、Ａｔ５ｇ２５４３０の５遺伝子の完全長ｃＤＮＡを取得した。Ａｔ３ｇ６２２７０、Ａｔ３ｇ０６４５０、Ａｔ１ｇ１５４６０について、ＧＡＬ１プロモーター下流に５'と３'側双方の非翻訳領域を含む完全長ｃＤＮＡをつないだコンストラクトを構築し、酵母のＢＯＲ１相同遺伝子であるＹＮＬ２７５ｗの破壊株に導入した。酵母の菌体内水溶性ホウ素濃度を測定したが、ベクターコントロールと遺伝子を導入した酵母において有意な差は見られなかった。また、ホウ酸を含む培地における耐性も見られなかった。そこで、５'と３'側双方の非翻訳領域を除いたＯＲＦ部分のｃＤＮＡをＧＡＬ１プロモーター下流につないだコンストラクトを構築し、酵母に導入した。ホウ素を含む培地で６０分間培養したところ、いずれもベクターコントロールと比較して菌体内水溶性ホウ素濃度の低下が見られた。また、２０〜８０ｍＭのホウ酸を含む固形培地で生育させたところ、Ａｔ３ｇ０６４５０、Ａｔ１ｇ１５４６０を発現させた酵母ではベクターコントロールと比べてホウ酸耐性を示した。Ａｔ１ｇ１５４６０を発現させた酵母ではＢＯＲ１を発現させた酵母よりも強い耐性を示した。本発明は上記知見に基づいて完成するに至ったものである。

すなわち本発明は、（１）（Ａ）配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列、又は（Ｂ）配列番号５に示される塩基配列からなる遺伝子を、高ホウ酸耐性のホウ素トランスポーター遺伝子として使用する方法や、（２）配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質を、高ホウ酸耐性のホウ素トランスポータータンパク質として使用する方法に関する。

従来知られていたトランスポーターよりも強い輸送活性を持つ本発明のトランスポーターや、それをコードするホウ素トランスポーター遺伝を用いると、植物のホウ素吸収を制御して生産性を高めたり、動物細胞に導入して細胞の活性を制御したり、環境中からのホウ素の除去に応用できる可能性がある。

本発明の遺伝子としては、（Ａ）配列番号２，４，６，８又は１０に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列；（Ｂ）配列番号２，４，６，８又は１０に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつホウ素トランスポーター活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；（Ｃ）配列番号１，３，５，７又は９に示される塩基配列；（Ｄ）配列番号１に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつホウ素トランスポーター活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；又は（Ｅ）配列番号１，３，５，７又は９に示される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつホウ素トランスポーター活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；の何れかの塩基配列からなるホウ素トランスポーター遺伝子であれば特に制限されず、また、本発明のホウ素トランスポータータンパク質としては、（Ａ）配列番号２，４，６，８又は１０に示されるアミノ酸配列；又は（Ｂ）配列番号２，４，６，８又は１０に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質がホウ素トランスポーター活性を有するアミノ酸配列；のどちらかのアミノ酸配列からなるホウ素トランスポータータンパク質であれば特に制限されず、ここで、「ホウ素トランスポーター遺伝子」とはホウ素の輸送に関与する遺伝子をいい、「ホウ素トランスポータータンパク質」とはホウ素の輸送に関与するタンパク質をいう。

上記「ホウ素トランスポーター活性を有するタンパク質」とは、酵母、植物などの生体内でホウ素の輸送に何らかの形で関与するタンパク質を意味し、その具体的な作用機構は特に限定されない。本発明のタンパク質の、具体的な作用機構の一例としては、酵母からホウ酸の排出機構を挙げることができるが、これに限定されるものではない。

配列番号１に示される塩基配列からなるホウ素トランスポーター遺伝子としてはＡｔ３ｇ６２２７０遺伝子を、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるホウ素トランスポータータンパク質としてはＡｔ３ｇ６２２７０を、配列番号３に示される塩基配列からなるホウ素トランスポーター遺伝子としてはＡｔ３ｇ０６４５０遺伝子を、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるホウ素トランスポータータンパク質としてはＡｔ３ｇ０６４５０を、配列番号５に示される塩基配列からなるホウ素トランスポーター遺伝子としてはＡｔ１ｇ１５４６０遺伝子を、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるホウ素トランスポータータンパク質としてはＡｔ１ｇ１５４６０を、配列番号７に示される塩基配列からなるホウ素トランスポーター遺伝子としてはＡｔ５ｇ２５４３０遺伝子を、配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるホウ素トランスポータータンパク質としてはＡｔ５ｇ２５４３０を、配列番号９に示される塩基配列からなるホウ素トランスポーター遺伝子としてはＡｔ１ｇ７４８１０遺伝子を、配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなるホウ素トランスポータータンパク質としてはＡｔ１ｇ７４８１０を、それぞれ挙げることができる。

上記「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を意味する。また、上記「１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を意味する。

例えば、これら１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるＤＮＡ（変異ＤＮＡ）は、化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法により作製することもできる。具体的には、配列番号１，３，５，７又は９に示される塩基配列からなるＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的な手法等を用いて、これらＤＮＡに変異を導入することにより、変異ＤＮＡを取得することができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、モレキュラークローニング第２版、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38,John Wiley & Sons (1987-1997)等に記載の方法に準じて行うことができる。この変異ＤＮＡを適切な発現系を用いて発現させることにより、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質を得ることができる。

上記「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、ＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸をプローブとして使用し、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られる塩基配列を意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡまたは該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍程度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989.以後 "モレキュラークローニング第２版" と略す）等に記載されている方法に準じて行うことができる。

例えば、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げることができ、例えば６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡを好適に例示することができる。

本発明の遺伝子の取得方法や調製方法は特に限定されるものでなく、本明細書中に開示した配列番号１，３，５，７，９に示される塩基配列情報又は配列番号２，４，６，８，１０に示されるアミノ酸配列情報に基づいて適当なブローブやプライマーを調製し、それらを用いて当該遺伝子が存在することが予測されるｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより目的の遺伝子を単離したり、常法に従って化学合成により調製することができる。

具体的には、本発明の遺伝子が単離されたシロイヌナズナより、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製し、次いで、このライブラリーから、本発明の遺伝子に特有の適当なプローブを用いて所望クローンを選抜することにより、本発明の遺伝子を取得することができる。上記ｃＤＮＡの起源としては、上記植物由来の各種の細胞または組織を例示することができ、また、これらの細胞又は組織からの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニングなどはいずれも常法に従って実施することができる。本発明の遺伝子をｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングする方法は、例えば、Molecular Cloning, second edition, Cold Springer HoborLaboratory Press, book 2 ,8.3-8.86,1989に記載の方法等、当業者により常用される方法を挙げることができる。

また、上記（Ｂ）〜（Ｆ）のいずれかに示される塩基配列からなる本発明の変異遺伝子又は相同遺伝子遺伝子としては、配列番号１，３，５，７又は９に示される塩基配列又はその一部を有するＤＮＡ断片を利用し、他の生物体等より、該ＤＮＡのホモログを適当な条件下でスクリーニングすることにより単離することができる。その他、前述の変異ＤＮＡの作製方法により調製することもできる。

本発明のタンパク質の取得・調製方法は特に限定されず、天然由来のタンパク質でも、化学合成したタンパク質でも、遺伝子組換え技術により作製した組み換えタンパク質の何れでもよい。天然由来のタンパク質を取得する場合には、かかるタンパク質を発現している細胞又は組織からタンパク質の単離・精製方法を適宜組み合わせることにより、本発明のタンパク質を取得することができる。化学合成によりタンパク質を調製する場合には、例えば、Fmoc法(フルオレニルメチルオキシカルボニル法)、tBoc法(t−ブチルオキシカルボニル法)等の化学合成法に従って本発明のタンパク質を合成することができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して本発明のタンパク質を合成することもできる。遺伝子組換え技術によりタンパク質を調製する場合には、該タンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡを好適な発現系に導入することにより本発明のタンパク質を調製することができる。これらの中でも、比較的容易な操作でかつ大量に調製することが可能な遺伝子組換え技術による調製が好ましい。

例えば、遺伝子組換え技術によって、本発明のタンパク質を調製する場合、かかるタンパク質を細胞培養物から回収し精製するには、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法、好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが用いられる。特に、アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、本発明のタンパク質に対するモノクローナル抗体等の抗体を結合させたカラムや、上記本発明のタンパク質に通常のペプチドタグを付加した場合は、このペプチドタグに親和性のある物質を結合したカラムを用いることにより、これらのタンパク質の精製物を得ることができる。また、本発明のタンパク質が細胞膜に発現している場合は、細胞膜分解酵素を作用させた後、上記の精製処理を行うことにより精製標品を得ることができる。

さらに、配列番号２，４，６，８若しくは１０に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号２，４，６，８若しくは１０に示されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質は、配列番号２，４，６，８若しくは１０に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の一例をそれぞれ示す配列番号１，３，５，７若しくは９に示される塩基配列の情報に基づいて当業者であれば適宜調製又は取得することができる。例えば、配列番号１，３，５，７若しくは９に示される塩基配列又はその一部を有するＤＮＡをプローブとしてシロイヌナズナ以外の生物より、該ＤＮＡのホモログを適当な条件下でスクリーニングすることにより単離することができる。このホモログＤＮＡの全長ＤＮＡをクローニング後、発現ベクターに組み込み適当な宿主で発現させることにより、該ホモログＤＮＡによりコードされるタンパク質を製造することができる。

本発明の組換えベクターとしては、前記本発明の遺伝子を含み、かつホウ素トランスポーターを発現することができる組換えベクターであれば特に制限されず、本発明の組換えベクターは、本発明の遺伝子を発現ベクターに適切にインテグレイトすることにより構築することができる。例えば、本発明の遺伝子の５'と３'側双方の非翻訳領域を除いたＯＲＦ部分のｃＤＮＡをＧＡＬ１プロモーター下流につないだコンストラクトを好適に例示することができる。発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製可能であるものや、あるいは宿主細胞の染色体中へ組込み可能であるものが好ましく、また、本発明の遺伝子を発現できる位置にプロモーター、エンハンサー、ターミネーター等の制御配列を含有しているものを好適に使用することができる。発現ベクターとしては、酵母用発現ベクター、植物細胞用発現ベクター、細菌用発現ベクター、動物細胞用発現ベクター等を用いることができるが、酵母用発現ベクターや植物細胞用発現ベクターを用いた組換えベクターが好ましい。

酵母用の発現ベクターとして、例えば、ｐＹＥＳ２（Invitrogen）、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、Ｙｃｐ５Ｏ（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等を例示することができる。酵母用のプロモーターとしては、例えば、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ１０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等のプロモーターを具体的に挙げることができる。

植物細胞用の発現ベクターとしては、例えば、Ｔｉプラスミド（Tumor inducing plasmid）、ｐＳＰＯＲＴ１、ｐＴ７Blue-Ｔベクター、ｐＩＧ１２１−Ｈｍ〔Plant Cell Report, 15, 809-814(1995)〕、ｐＢＩ１２１〔EMBO J. 6, 3901-3907(1987)〕などのプラスミド、あるいはタバコモザイクウイルス、カリフラワーモザイクウイルス、ジェミニウイルスなどの植物ウイルスベクター等を例示することができる。植物細胞用のプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター〔Mol.Gen.Genet (1990) 220, 389-392〕、ルブロースビスフォスフェートカルボキシラーゼスモールサブユニットプロモーター等を挙げることができ、ターミネーターとしては、例えばノパリン合成酵素遺伝子のターミネーターを挙げることができる。

また、本発明の形質転換体としては、上記本発明の組換えベクターが導入され、かつホウ素トランスポーターを発現する形質転換体であれば特に制限されず、形質転換酵母、形質転換植物（細胞、組織、個体）、形質転換細菌、形質転換動物（細胞、組織、個体）を挙げることができるが、形質転換酵母や形質転換植物（細胞、組織、個体）が好ましい。

形質転換酵母の作製に用いられる宿主酵母としては、サッカロミセス・セレビシェ(Saccharomyces cerevisae)、シゾサッカロミセス・ボンベ(Schizosaccharomyces pombe)、クリュイベロミセス・ラクチス(Kluyveromyces lactis)、トリコスポロン・プルランス(Trichosporon pu11ulans)、シュワニオミセス・アルビウス(Schwanniomyces a11uvius)等を挙げることができる。酵母宿主への組み換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロブラスト法、酢酸リチウム法等を挙げることができる。

形質転換植物（細胞、組織、個体）の作製に用いられる宿主植物（細胞、組織、個体）としては、その種類は特に限定されず、花卉、果実植物、野菜、根菜、穀類、観葉植物、果樹を含む樹木などの植物、例えばナス科、イネ科、アブラナ科、キク科、ゴマ科、モクセイ科、フトモモ科、バラ科、マメ科、ヤシ科又はアカネ科に属する植物や、それら植物の培養細胞、組織（種子、カルスなど）のうちから適宜選択することができる。この形質転換植物を作製するには、本発明の遺伝子を含有した上記本発明の組換えベクターを用い、この組換えベクターを植物細胞内に導入し、植物細胞内のゲノムＤＮＡ中に本発明の遺伝子ＤＮＡを導入する方法を採用することができる。植物の形質転換は、植物の種類等に応じて、リーフディスク共存培養法、エレクトロポレーション法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法等の公知の方法を適宜用いて行うことができる。その他、物理的または化学的に植物細胞の透過性を高めて本発明の組換えベクターを受容体細胞内に直接取り入れて形質転換植物を作製する方法を採用することもできる。

本発明のホウ素トランスポーター遺伝子のスクリーニング方法としては、各種植物、酵母等の遺伝子ライブラリーを用いて、ＹＮＬ２７５ｗ遺伝子が欠損し、ＹＮＬ２７５ｗを発現しないＹＮＬ２７５ｗ破壊酵母を形質転換し、得られた形質転換ＹＮＬ２７５ｗ破壊酵母をホウ素含有培地で培養し、該形質転換ＹＮＬ２７５ｗ破壊酵母のホウ素トランスポーター活性を測定・評価する方法であれば特に制限されるものではなく、ホウ素トランスポーター活性の測定・評価としては、酵母菌体内の水溶性ホウ素濃度の測定・評価を挙げることができる。また、ＹＮＬ２７５ｗの破壊株としては、Saccharomyces cerevisisiae１１６９株（Winzeler, E. A.; Shoemaker, D. D.; Astromoff, A.; Liang, H.; Anderson, K.; Andre, B.; Bangham, R.; Benito, R.; Boeke, J. D.; Bussey, H.; Chu, A. M.; Connelly, C.; Davis, K.; Dietrich, F.; Dow, S. W.; El Bakkoury, M.; Foury, F.; Friend, S. H.; Gentalen, E.; Giaever, G.; Hegemann, J. H.; Jones, T.; Laub, M.; Liao, H.; Liebundguth, N.; Lockhart, D. J.; Lucau-Danila, A.; Lussier, M.; M'Rabet, N.; Menard, P.; Mittmann, M.; Pai, C.; Rebischung, C.; Revuelta, J. L.; Riles, L.; Roberts, C. J.; Ross-MacDonald, P.; Scherens, B.; Snyder, M.; Sookhai-Mahadeo, S.; Storms, R. K.; Veronneau, S.; Voet, M.; Volckaert, G.; Ward, T. R.; Wysocki, R.; Yen, G. S.; Yu, K. X.; Zimmermann, K.; Philippsen, P.; Johnston, M.; Davis, R. W. (1999) Functional characterization of the Saccharomyces cerevisiae genome by gene deletion and parallel analysis. Science 285: 901-906）を好適に例示することができる。

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。

［ホウ素トランスポーター遺伝子のシロイヌナズナにおける発現］
シロイヌナズナ全ゲノムを対象として、排出型ホウ素トランスポーターＢＯＲ１の相同遺伝子を、ＴＡＩＲ( HYPERLINK http://www.arabidopsis.org/) http://www.arabidopsis.org/)を用いてＢＬＡＳＴサーチし、６つのＢＯＲ１相同遺伝子を見い出した。これらシロイヌナズナゲノムに存在する６つのＢＯＲ１相同遺伝子のうち完全長ｃＤＮＡが単離されていた３遺伝子、すなわちＡｔ３ｇ６２２７０遺伝子（配列番号１）、Ａｔ３ｇ０６４５０遺伝子（配列番号２）、Ａｔ１ｇ１５４６０遺伝子（配列番号３）はＲＩＫＥＮより供与された。これら３遺伝子を対象に根と地上部から抽出したＲＮＡでＲＴ−ＰＣＲを行ったところ、根と地上部の双方で発現を検出した。特に、Ａｔ３ｇ６２２７０とＡｔ１ｇ１５４６０は根において、Ａｔ３ｇ０６４５０は地上部で強く発現していることが分かった。また、Ａｔ５ｇ２５４３０のｃＤＮＡを花序のＲＮＡから、Ａｔ１ｇ７４８１０のｃＤＮＡを根と地上部のＲＮＡからそれぞれＲＴ−ＰＣＲによって単離した。これらのことから６遺伝子のうち少なくとも５遺伝子が発現しており、発現の組織特異性が異なることを確認した。

［細胞内局在］
タンパクの植物細胞内での局在を調べるため、カリフラワーモザイクウィルス３５Ｓ ＲＮＡプロモーター制御下でＡｔ３ｇ６２２７０、Ａｔ３ｇ０６４５０、Ａｔ１ｇ１５４６０各遺伝子とのＧＦＰ（Green Fluorescence Protein）融合タンパクを発現するコンストラクトをタバコ培養細胞にパーティクルボンバードメントにて導入した。いずれの遺伝子を発現した細胞でもＧＦＰの蛍光は細胞膜に強く観察され、細胞膜に局在する膜タンパク質であることが示された。

［ホウ素トランスポーター遺伝子を発現する酵母の作製］
ｐＹＥＳ２ベクタ−を用い、ＧＡＬ１プロモーター下流に５'と３'側双方の非翻訳領域を含むＡｔ３ｇ６２２７０、Ａｔ３ｇ０６４５０、Ａｔ１ｇ１５４６０の各ｃＤＮＡをつないだコンストラクトを構築した（ｐＴＦ４８５；Ａｔ３ｇ６２２７０，ｐＴＦ４８４；Ａｔ３ｇ０６４５０，ｐＴＦ４８３；Ａｔ１ｇ１５４６０）。また、５'と３'側双方の非翻訳領域を除いたＯＲＦ部分のｃＤＮＡをＧＡＬ１プロモーター下流につないだコンストラクトを構築した（ｐＴＦ５２４；Ａｔ３ｇ６２２７０，ｐＴＦ５２２；Ａｔ３ｇ０６４５０，ｐＴＦ５２０；Ａｔ１ｇ１５４６０）。これらのコンストラクトをＹＮＬ２７５ｗの破壊株である１１６９株に導入した。コロニーは２％（ｗ／ｖ）グルコース，２０ｍｇｌ^-1ヒスチジン，３０ｍｇｌ^-1ロイシン，２０ｍｇｌ^-1メチオニンを含む最小培地（ＳＤ）（Sherman, F. (1991) Getting started with yeast. Methods. Enzymol. 194: 3-21）を用いて選択した。

［酵母のホウ素濃度の測定］
酵母のホウ素濃度の測定には、ＳＤ培地のグルコースをガラクトースに代えた最小培地（ＳＧ）を用い、培養は３０℃で行った。２日間培養した酵母１１６９株の培養液５ｍｌを２００ｍｌの培地に加え、対数増殖期になるまで１６時間培養した。５０ｍｌの培養培養液を５０ｍｌプラスチックチューブに移して３０００×ｇで５分間遠心した。上清を除いた後、２０ｍｌの０．１、０．５、１、１０ｍＭのホウ酸を含むＳＧ培地（Ｔｒｉｓを用いてｐＨ５．５に調整）を菌体に加えて６０分間培養した。培養した酵母を遠心し、菌体を氷上で冷やした蒸留水で２回洗浄した。菌体を１ｍｌの蒸留水に懸濁し、チューブに移して３０分煮沸した。これを３０００×ｇで２０分間遠心し、上清を水溶性ホウ素画分として集めた。菌体に２５０μｌの蒸留水を加え、上清を水溶性ホウ素画分と合わせた。菌体を８０℃で４８時間乾燥させ、乾燥重量を測定した。水溶性ホウ素画分サンプルは蒸留水で２．７ｇに合わせ、０．３ｍｌの５０ｐｐｂ Ｂｅを含む０．８ＮのＨＮＯ_3.溶液を加えた。サンプルのホウ素濃度はInductively Coupled Plasma - Mass Spectrometery（ＩＣＰ−ＭＳ）（SEIKO, Chiba, Japan）で測定した。実験は３つの独立した形質転換体を用いて行った。

［高濃度のホウ酸に対する酵母の耐性の検定］
２日間培養した酵母Saccharomyces cerevisisiae１１６９株(Research Genetics社から購入)の培養液０．５ｍｌを５ｍｌの培地に加え、ＯＤ₆₀₀が１になるまで培養した。酵母の培養液を０．８％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ溶液を用いて５倍希釈を５段階行った。７μｌの希釈した培養液を０，２０，４０，８０ｍＭを含むＳＧ固形培地にスポットした。３日間培養し、生育を観察した。
［ホウ素トランスポーター遺伝子を発現させた酵母のホウ素濃度］
ＧＡＬ１プロモーター下流に５'と３'側双方の非翻訳領域を含むＡｔ３ｇ６２２７０、Ａｔ３ｇ０６４５０、Ａｔ１ｇ１５４６０のｃＤＮＡをつないだコンストラクト（ｐＴＦ４８５；Ａｔ３ｇ６２２７０，ｐＴＦ４８４；Ａｔ３ｇ０６４５０，ｐＴＦ４８３；Ａｔ１ｇ１５４６０）を導入した酵母１１６９株を０．５ｍＭのホウ酸を含む培地で６０分間培養し、菌体の細胞内ホウ素濃度を測定した。いずれの遺伝子を導入した酵母においてもベクターコントロールと比べてホウ素濃度に有意な差は見られなかった。

次に、５'と３'側双方の非翻訳領域を除いたＯＲＦ部分のｃＤＮＡをＧＡＬ１プロモーター下流につないだコンストラクト（ｐＴＦ５２４；Ａｔ３ｇ６２２７０，ｐＴＦ５２２；Ａｔ３ｇ０６４５０，ｐＴＦ５２０；Ａｔ１ｇ１５４６０）酵母１１６９株に導入した。対数増殖期になるまで培養した酵母を集菌し、０．１、０．５、１、１０ｍＭのホウ酸を含む培地で６０分間培養した。集菌した後２回蒸留水で洗浄後、３０分間煮沸し、上清を水溶性ホウ素画分としＩＣＰ−ＭＳでホウ素濃度を測定したところ、いずれの場合もベクターコントロールに比べてホウ素濃度の低下が見られた。Ａｔ３ｇ６２２７０とＡｔ３ｇ０６４５０を発現させた酵母のホウ素濃度はＢＯＲ１を発現させた酵母の濃度と有意な差は見られなかったが、Ａｔ１ｇ１５４６０を発現させた酵母の濃度はＢＯＲ１を発現させた酵母の濃度よりも有意に低下した（図１、図２）。これらの結果から、Ａｔ３ｇ６２２７０、Ａｔ３ｇ０６４５０及びＡｔ１ｇ１５４６０の各ホウ素トランスポーターがＢＯＲ１と同様に細胞内から細胞外へホウ素を排出する活性をもつことが示された。

［高濃度のホウ酸に対する酵母の生育］
ＧＡＬ１プロモーター下流に５'と３'側双方の非翻訳領域を含むＡｔ３ｇ６２２７０、Ａｔ３ｇ０６４５０、Ａｔ１ｇ１５４６０のｃＤＮＡをつないだコンストラクト（ｐＴＦ４８５；Ａｔ３ｇ６２２７０，ｐＴＦ４８４；Ａｔ３ｇ０６４５０，ｐＴＦ４８３；Ａｔ１ｇ１５４６０）を導入した酵母１１６９株を高濃度のホウ酸を含む培地で生育させたが、耐性は示さなかった。他方、５'と３'側双方の非翻訳領域を除いたＯＲＦ部分のｃＤＮＡをＧＡＬ１プロモーター下流につないだコンストラクト（ｐＴＦ５２４；Ａｔ３ｇ６２２７０，ｐＴＦ５２２；Ａｔ３ｇ０６４５０，ｐＴＦ５２０；Ａｔ１ｇ１５４６０）を酵母１１６９株に導入した。ＯＤ₆₀₀が１になるまで培養し、培養液を０．８％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ溶液を用いて５倍希釈し、これを５段階行った。７μｌの希釈した培養液を０、２０、４０、８０ｍＭのホウ酸を含むＳＧ固形培地にスポットし、３日間培養した（図３）。ベクターコントロールの酵母は２０ｍＭのホウ酸を含む培地において生育抑制が見られた。ＢＯＲ１、Ａｔ３ｇ０６４５０を発現させた酵母では４０ｍＭのホウ酸を含む培地でベクターコントロールの酵母と比べて耐性を示した。また、Ａｔ１ｇ１５４６０を発現させた酵母では８０ｍＭのホウ酸を含む培地で生育させた場合にもホウ酸を添加しない培地と同様の生育を示し、ＢＯＲ１よりも高いホウ酸耐性を示した。

［ホウ素トランスポーター遺伝子破壊株の生育］
植物体における本発明のホウ素トランスポーター遺伝子のホウ素栄養への関与を検討するため、各ホウ素トランスポーター遺伝子内にＴ−ＤＮＡ挿入をホモに持つ遺伝子破壊株を確立し、それらを用いて生理解析を行った。Ａｔ３ｇ６２２７０破壊株を培地ホウ素濃度０．３μＭの低ホウ素栄養条件で成育させたところ、野生型株と比較して根の伸長阻害、地上部新鮮重の低下、地上部ホウ素濃度の低下が観察された。Ａｔ３ｇ６２２７０破壊株の地上部の生育量とホウ素濃度低下はＢＯＲ１破壊株ほど著しくなかったが、ＢＯＲ１とＡｔ３ｇ６２２７０の二重遺伝子破壊株では一重破壊株のいずれよりも根と地上部の双方で深刻な生長抑制が起こった。一方、培地ホウ素濃度３０μＭのホウ素十分条件では、Ａｔ３ｇ６２２７０破壊株の生育に野生型株との違いは見られなかった。これより、ＢＯＲ１に加えてＡｔ３ｇ６２２７０が低ホウ素栄養条件下で機能し、ホウ素輸送の過程でＢＯＲ１とは異なる役割を担っていることが示された。

本発明のホウ素トランスポーター形質転換酵母１１６９株を、０．５ｍＭのホウ酸を含む培地で培養した際の菌体内の水溶性ホウ素濃度の測定結果を示す図である。 本発明のホウ素トランスポーター形質転換酵母１１６９株を、０．１、０．５、１、１０ｍＭのホウ酸を含む培地で培養した際の菌体内の水溶性ホウ素濃度の測定結果を示す図である。 本発明のホウ素トランスポーター形質転換酵母１１６９株を、０、２０、４０、８０ｍＭのホウ酸を含む培地で培養した、高濃度のホウ酸に対する酵母の生育結果を示す図である。

Claims (2)

1. 以下の（Ａ）又は（Ｂ）の塩基配列からなる遺伝子を、高ホウ酸耐性のホウ素トランスポーター遺伝子として使用する方法。
   （Ａ）配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列；
   （Ｂ）配列番号５に示される塩基配列；
2. 配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質を、高ホウ酸耐性のホウ素トランスポータータンパク質として使用する方法。