JP2003516727A - 塩類土壌中で生長可能なストレス耐性のある特大のトランスジェニック植物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 液胞型ピロホスファターゼのアップレギュレートされた発現を引き起こすポリヌクレオチド配列を含む、塩類を含む培地中において生長可能なストレス耐性の特大のトランスジェニック植物。さらに、かかるポリヌクレオチド配列を含むかかるトランスジェニック植物によって生産された種子、およびかかる種子から生長した子孫植物が開示される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （技術分野） 関連出願 本出願は、Roberto Graxiolaによって１９９９年１１月１０日に出願された米
国仮出願第６０／１６４８０８号、標題「植物におけるプロトン輸送体および使
用（Proton Transporters and Use in Plant）」、Roberto Graxiolaによって２
０００年８月２２日に出願された米国出願第０９／６４４０３９号、標題「植物
におけるプロトン輸送体および使用（Proton Transporters and Use in Plant）
」およびRoberto Graxiolaによって２０００年８月１８日に出願された米国仮出
願第６０／２２６２２３号、標題「耐乾性／耐凍性トランスジェニック植物（Dr
ought/Freeze Resistant Transgenic Plants）」を優先権主張し、その全ての全
教示は出典明示により本明細書の一部とされる。

【０００２】 政府援助 本明細書に記載の発明は、全体または一部において、国立衛生研究所（Nation
al Institutes of Health）の交付番号ＧＭ５２４１４、ＤＫ５４２１４、ＤＫ
４３４９５、ＤＫ５１５０９、ＤＫ３４８５４およびＧＭ３５０１０により、お
よび全国科学基金（National Science Foundation）の交付番号ＭＣＢ９３１７
１７５により援助された。

【０００３】 （背景技術） １．発明の分野 本発明は、干ばつおよび／または凍結のような環境ストレスに関して強く、栄
養／生殖構造に関して（その通常の表現型相対物と比べて）特大であり、高塩分
の培地中で生長可能な遺伝子改変された植物に関する。

【０００４】 ２．関連分野の背景 人類が新しいミレニアムに入るとき、人類に食物を供給する見通しは侮りがた
い。世界人口はことごとく増えているが、作物収量を改善するための農業研究の
主要な目標は取り残されている。また、より丈夫な作物以外の植物、例えば、鑑
賞植物、草、低木、および人に有益であることまたは人を心地よくすることが見
出された他の植物を開発することは、園芸学的研究の主要な目標である。 近年まで、作物および園芸の改善は、望ましい特徴を有する植物の選択的交配
に依存していた。しかしながら、多くの植物はその中に、その親と同一の望まし
い特性を生じない異種遺伝子成分を有するので、かかる選択的交配技術はしばし
ば、好ましいとは言えなかった。

【０００５】 分子生物学における進歩は、人類が動物および植物の生殖質を扱うことを可能
にした。植物の遺伝子操作は、遺伝物質（典型的には、ＤＮＡまたはＲＮＡの形
態）の単離および操作ならびにその後の遺伝物質の植物中への導入を伴う。かか
る技術は、害虫耐性を増大した植物、医薬および他の化学物質を発現可能な植物
、および有益な特性を発現する植物の開発をもたらした。有利なことに、かかる
植物は目的の遺伝子を含有するのみであり、受精能力は残存している。

【０００６】 植物科学における最近の関心のある１の特定の領域は、ストレス耐性を改善し
た植物の開発であった。一般に、植物は、不利な環境条件の間に確実に生き残る
ための適応メカニズムを有し、維持する。植物が一般に遭遇する２つの一般的な
ストレスは、凍結と干ばつであり、そのどちらも細胞脱水に関連している。ある
種の植物は、冷気または長時間の脱水への曝露によって発現される遺伝子を含有
し、その遺伝子は、干ばつおよび／または凍結に対しその相対物の多くより大き
な耐性を提供する直接的または間接的な原因となる生産物をコードする。現在、
熱および水ストレスに応答するいくつかの遺伝子が特徴付けられている（例えば
、米国特許第５８３７５４５号、第５０７１９６２号、第４７０７３５９号を参
照のこと）。これらの遺伝子は、多くによって、植物の生残りを助けると仮定さ
れるある種の蛋白質、例えば、「水ストレス蛋白質」を生産すると考えられる。
例えば、ストレス状態に曝露されたある特定の植物は、アブシジン酸（ＡＢＡ）
と呼ばれる、植物がストローマを閉じるのを助け、それによりストレスの重篤度
を軽減するホルモンを生産する。不運にも、ＡＢＡは新しい葉の形成を阻害し、
花および果実を落とし、収量の減少を引き起こすことが知られている。

【０００７】 大抵の熱帯性植物は、長期間の干ばつおよび／または凍結に耐える能力を進化
させてきたとは考えられない。逆に、多くの温帯性植物はかかる状態に耐える少
なくともいくつかの能力を発達させてきたことが知られている。乾燥状態におけ
る、および凍結後における種々の植物の生産性は劇的に異なる。例えば、タバコ
（Nicotiana種）は、干ばつに非常に敏感な新しい葉を生産し、給水量が限られ
、蒸発量が大きい地域において商業的に生産することができない。水ストレスと
は対照的に、凍結耐性に関係する蛋白質および遺伝子についてはほとんど知られ
ていない。しかしながら、耐凍性の主要要素は脱水に対する耐性を含みうると仮
定されている（例えば、Yelenosky, G.C., Guy, L. (1989) Plant Physiol. 89:
444-451参照）。

【０００８】 最近の関心のある別の特定領域は、塩類土壌において生長できる改善された能
力を有する植物の開発である。土壌の塩類集積作用は、供給される水が溶存塩を
含有する場合に起こる。かかる供給から水が蒸発すると、塩類が徐々に土壌に蓄
積する。潅漑した土地の塩類集積作用の進行は、我々の惑星の最も生産的な地域
の多くにおいて農業の未来を危険にさらしている（Serrano, R.ら, Crit. Rev.
Plant Sci., 13:121-138 (1994)）。例えば、乾燥地域は、大抵の作物の生長に
最適な光周期および温度条件を提供するが、降水量は最適状態に及ばない。かか
る環境において土壌は頻繁かつ迅速に塩類集積されることがわかったので、人工
的な潅漑は、短期間においてのみ該問題を解決したにすぎなかった。塩類集積土
壌環境において生長するために、植物は、土壌中に存在するよりも非常に低比率
のＮａ^＋／Ｋ^＋を細胞質において維持しなければならず、それにより、食物作物
を包含するいくつかの植物の生長を保護する。

【０００９】 生理学的研究は、根における塩の排除および／または葉細胞液胞における塩の
封鎖が耐塩性の重大な決定子であることを示唆する（Kirsch, M.ら, Plant Mol.
Biol., 32:543-547 (1996)）。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）の毒性濃度は、最
初に、ＮａＣｌが液胞中に区分されている完全に膨張した葉において増加する。
それらの負荷容量の限界を超えた後にだけ、サイトゾルおよびアポプラズムの濃
度が毒性レベルに達し、最後に膨圧の喪失を導き、それゆえ、植物の死をもたら
す。Ｖ−ＡＴＰアーゼを介する液胞内腔の過酸性化が、サイトゾルの解毒をもた
らすＮａ^＋／Ｈ^＋交換活性に必要な余剰プロトンを提供することが示唆された（
Tsiantis, M.S.ら, Plant J., 9:729-736 (1996)）。塩ストレスは、例えば、ヒ
マワリ幼植物根の液胞膜小胞におけるＡＴＰ−およびピロホスフェート（ＰＰｉ
）−依存性Ｈ^＋輸送の両方を増大することが知られている。塩処理はまた、アミ
ロライド感受性Ｎａ^＋／Ｈ^＋交換活性を誘導する（Ballesteros, E.ら, Physiol
ogia Plantarum, 99:328-334 (1997)）。塩生植物メセンブリアンテマ・クリス
タリナム（Mesembryanthemum crystallinum）において、高ＮａＣｌは、葉細胞
において液胞型Ｈ^＋−ＡＴＰアーゼ（Ｖ−ＡＴＰアーゼ）および液胞型Ｎａ^＋／
Ｈ^＋対向輸送体の両方の活性を刺激する。

【００１０】 農業目的のさらに別の領域は、作物植物の収量を改善すること、およびある種
の鑑賞植物の美的な質を改善することである。植物作物の収量およびある種の鑑
賞植物の美的価値観は、栄養および／または生殖構造が野生型植物よりも大きい
植物を生長させることによって改善されうる。ある種の生長因子が植物および／
または植物花の大きさを増すために使用されうることが知られている。不運にも
、かかる生長因子の適用は、高価であり、時間がかかる。 したがって、干ばつおよび／または凍結に対する改善されたストレス耐性を有
し、種々の野生型相対物よりも大きな大きさの特性を有し、かつ、それらが生長
する土壌中の塩に対する増大した耐性を有する植物に対する要望が存在する。

【００１１】 （発明の開示） 発明の概要 本発明は、液胞型ピロホスファターゼのアップレギュレートされた発現を有す
るトランスジェニック植物を開示する。かかるアップレギュレートされた活性を
示す植物は一般に、野生型相対物よりも大きく、干ばつ／凍結に対する改善され
たストレス耐性を示し、かつ、それらが生長している培地中の塩に対する増大し
た耐性を有することが見出された。

【００１２】 植物中の液胞型ピロホスファターゼの発現を改変するいずれかの適当な外来性
核酸分子を用いて、本発明にしたがってトランスジェニック植物を形質転換する
ことができる。外来性核酸は、液胞型ピロホスファターゼ蛋白質（外来性液胞型
ピロホスファターゼ）、例えばＡＶＰ１、その機能的部分（ペプチド、ポリペプ
チド）、またはその相同物をコードする核酸、および／または外来性核酸が導入
される植物の内在性液胞型ピロホスファターゼの発現を改変する核酸を含むこと
ができる。「外来性核酸」なる語によって、それが導入される植物細胞、または
トランスジェニック部分が生産された植物もしくは植物部分以外の供給源由来の
核酸が意味される。形質転換に使用される外来性核酸はＲＮＡまたはＤＮＡ（例
えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ）であることができる。さらに、外来性核酸は環
状または直線状、二本鎖または一本鎖分子であることができる。一本鎖核酸はセ
ンス鎖またはアンチセンス鎖であることができる。液胞型ピロホスファターゼ蛋
白質をコードする核酸の「機能的部分」なる語によって、液胞型ピロホスファタ
ーゼ蛋白質の機能的特徴を保持する蛋白質またはポリペプチドをコードする核酸
の一部が意味される。特定の具体例において、核酸はＡＶＰ１、その機能的部分
または相同物をコードする。

【００１３】 外来性核酸が導入される植物の内在性液胞型ピロホスファターゼの発現を改変
する核酸は、植物において機能する調節配列（例えば、誘導可能、構造配列）お
よびアンチセンス核酸を包含する。調節配列の例は、液胞型ピロホスファターゼ
のプロモーター、エンハンサーおよび／またはサプレッサーを包含する。核酸は
、また、例えば、ポリアデニル化部位、リポーター遺伝子および／またはイント
ロン配列など、その存在が核酸の機能または発現に必要ではないが、例えば、転
写および／または（例えば、ｍＲＮＡの）安定性に影響を及ぼすことによって核
酸の発現および／または機能を改善することのできる配列を包含することができ
る。かかるエレメントは、核酸の最適な作用を得るために核酸分子中に含まれる
ことができる。

【００１４】 本発明において有用な核酸は、既知の方法を用いて種々の供給源から得ること
ができる。例えば、本発明において有用な液胞型ピロホスファターゼ（例えば、
ＡＶＰ１）をコードしている核酸は、天然供給源、例えば、タバコ、細菌、トマ
トまたはトウモロコシから得ることができる。１の具体例において、該核酸は、
トランスジェニック植物の野生型に対応する液胞型ピロホスファターゼをコード
する。別の具体例において、該核酸は、トランスジェニック植物の野生型に対応
しない液胞型ピロホスファターゼをコードする。外来性核酸が導入される植物の
内在性液胞型ピロホスファターゼの発現を改変する核酸（例えば、調節配列）は
、また、化学的に合成されることができ、組換え技術によって生産されることが
でき、および／または商業的供給源から得ることができる。

【００１５】 本発明の核酸を植物中に導入するための種々の方法は、当業者に知られている
。例えば、アグロバクテリウムによって媒介される植物形質転換、粒子爆撃、微
粒子爆撃（例えば、米国特許第４９４５０５０号；米国特許第５１００７９２号
）、プロトプラスト形質転換、花粉中への遺伝子導入、生殖器官中への注入およ
び未成熟胚中への注入を用いることができる。外来性核酸は、植物の根細胞、茎
細胞および／または葉細胞のような植物のいずれかの適当な細胞中に導入するこ
とができる。 いずれかの適当な植物を、本発明のトランスジェニック植物を生産するために
使用することができる。例えば、トマト、トウモロコシ、タバコ、コメ、モロコ
シ属、キュウリ、レタス、芝生、鑑賞植物（例えば、より大きな花、より大きな
葉）およびマメ科植物を本明細書に記載のように形質転換して、本発明のトラン
スジェニック植物を生産することができる。さらに、本発明のトランスジェニッ
ク植物は、土壌または水（水耕法による）のような植物生長を支持するいずれか
の培地において生長させることができる。

【００１６】 本発明のトランスジェニック植物は、好ましくは、土壌中の高い塩濃度に耐性
がある。「塩」なる語によって、いずれかの塩類、すなわち、酸の水素が金属ま
たはその等価物に置き換わったときに形成される化合物が意味され、限定するも
のではないが、一価および二価の毒性カチオン、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ_２ 、ＭｇＣｌ、ＣｄＣｌ、ＺｎＣｌおよび硫化物塩を含む塩を包含する。

【００１７】 耐塩性は、発現がアップレギュレートされるように植物中の液胞型ピロホスフ
ァターゼの発現を改変する外来性核酸で植物細胞を形質転換することによって、
本発明の植物中に導入されうる。そのいくつかがクローン化されたいずれかの適
当な液胞型ピロホスファターゼを本発明の組成物および方法において用いること
ができる（例えば、Sarasian, Z.ら, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89:1775-1
779 (1992); Jenslerchlら, Molec. Biol., 29: 833-840 (1995); Kim, Y.ら, P
lant Physiol., 106:375-382 (1994)）。特定の具体例において、本発明は、Ａ
ＶＰ１を過剰発現するように設計された外来性核酸構築物を含む、耐塩性のトラ
ンスジェニック植物に関する（Sarasian, Z.ら, Proc. Natl. Acad. Sci., USA,
89:1775-1779 (1992)）。植物細胞の形質転換は、植物全体、種子、葉、根また
はいずれか他の植物部分において行ってもよい。かかるトランスジェニック植物
は、好ましくは、対応する非トランスジェニック植物の生長を阻害する塩濃度中
で生長するように改変される。本発明の目的でもある、トランスジェニック植物
のトランスジェニック子孫、トランスジェニック植物によって生産された種子お
よびトランスジェニック種子から生長した子孫トランスジェニック植物は、有利
なことに、かかる耐塩性特性を有する。植物を形質転換細胞から再生してトラン
スジェニック植物を得てもよく、それをあるレベルの耐塩性についてスクリーン
してもよい。好ましい具体例において、外来性核酸はＡＶＰ１またはその相同物
をコードする。好ましくは、植物中の液胞型ピロホスファターゼの発現は、塩化
ナトリウム（ＮａＣｌ）濃度が約０．２Ｍ〜約０．３Ｍであるときに、トランス
ジェニック植物がＮａＣｌに耐性のある程度まで強化される。また、塩水中で生
長可能なトランスジェニック植物は、１以上の植物細胞中に植物中の液胞型ピロ
ホスファターゼの発現をアップレギュレートする核酸を導入して形質転換細胞を
得ることによって生産されうる。本明細書で使用される場合、「塩水」なる語は
、好ましくは、水中の塩濃度が約０．２Ｍ〜約．０４Ｍである塩の存在を特徴と
する水を包含する。１の具体例において、塩水は海水を示す。

【００１８】 本発明のトランスジェニック植物は、また、塩（約０．２Ｍ〜約０．４Ｍ塩濃
度）に耐性のある二重トランスジェニック植物を生産するために使用することが
できる。１の具体例において、本発明は、植物中の液胞型ピロホスファターゼの
発現およびＮａ^＋／Ｈ^＋対向輸送体を改変する外来性核酸で形質転換された１以
上の植物細胞を含む耐塩性の二重トランスジェニック植物に関する。有益な構築
物中における液胞型ピロホスファターゼはＡＶＰ１、またはその相同物であり、
Ｎａ^＋／Ｈ^＋対向輸送体はＡｔＮＨＸ１またはその相同物である。本発明は、ま
た、二重トランスジェニック植物のトランスジェニック子孫ならびに該トラスジ
ェニック植物によって生産された種子および該種子から生長した子孫トランスジ
ェニック植物を包含する。

【００１９】 耐乾性および／耐凍性はまた、植物細胞を植物中の液胞型ピロホスファターゼ
の発現をかかる発現がアップレギュレートされるように改変する外来性核酸で形
質転換することによって植物中に導入されうる。好ましい具体例において、１以
上の外来的に導入された液胞型Ｈ^＋輸送性ポンプ遺伝子を有するゲノムを含む、
実質的に耐乾性および／または耐凍性のあるトランスジェニック植物が提供され
る。耐乾性および／または耐凍性ならびに塩類土壌中での生長能を顕在化してい
る特に好ましい受精能力のあるトランスジェニック植物は、好ましくは作動可能
にプロモーター、例えば、３５−Ｓプロモーターまたは限定するものではないが
、組織特異的プロモーターを包含するいずれか他の強力プロモーターに連結され
た液胞型Ｈ^＋−輸送性ポンプをコードしている単離された外来性キメラＤＮＡ構
築物を含む。トランスジェニック植物は、作動可能にプロモーターに連結された
外来性液胞膜ピロホスフェートＨ^＋ポンプ遺伝子を含むポリヌクレオチド配列を
含有しうる。まだ別の特に好ましい塩類土壌中での生長能を有する耐乾性および
／または耐凍性トランスジェニック植物において、ポリヌクレオチド配列は、３
５Ｓプロモーターの二重タンデムエンハンサーに作動可能に連結された外来性液
胞膜ピロホスフェートＨ^＋ポンプ遺伝子を含む。特に好ましい液胞膜ピロホスフ
ェートＨ^＋ポンプ遺伝子は、ＡＶＰ１遺伝子である。

【００２０】 上記の方法による液胞型ピロホスファターゼの発現のアップレギュレーション
は、また、野生型相対植物より大きな栄養および／または生殖器官を有する植物
を提供するために使用されうる。すなわち、本発明は、植物の１以上の細胞中に
植物中の液胞型ピロホスファターゼの発現を改変する核酸を導入して転換細胞を
得、それにより、植物の収量を増加することを特徴とする、植物の収量を増加す
る方法を提供する。該方法はさらに、形質転換細胞から植物を再生してトランス
ジェニック植物を得、その対応する野生型植物より大きいトランスジェニック植
物を選択し、それにより、その対応する野生型植物より大きいトランスジェニッ
ク植物を生産することを特徴とすることができる。また、その対応する野生型植
物と比べて花の大きさが増したトランスジェニック植物（例えば、鑑賞植物）を
作製する方法であって、植物の１以上の細胞中に植物中の液胞型ピロホスファタ
ーゼの発現を改変する核酸を導入して形質転換細胞を得ることを特徴とする方法
も本発明に包含される。

【００２１】 また、キメラプロモーターに作動可能に連結された液胞膜ピロホスフェート駆
動性Ｈ^＋ポンプ遺伝子を含むカセット、プロモーターに作動可能に連結された外
来性液胞膜ピロホスフェート駆動性Ｈ^＋ポンプ遺伝子を含む新規な遺伝子カセッ
ト、ならびに３５Ｓプロモーターの二重タンデムエンハンサーに作動可能に連結
された外来性液胞膜ピロホスフェート駆動性Ｈ^＋ポンプ遺伝子を含む新規なコー
ディング配列を包含する新規な遺伝子カセットも本発明に開示される。好ましく
は、かかるコーディング配列はＡＶＰ１を過剰発現するように設計される。

【００２２】 また、本発明において、３５Ｓプロモーターの二重タンデムエンハンサーに作
動可能に連結され、さらに、マルチプルクローニング部位に作動可能に連結され
た外来性液胞膜ピロホスフェート駆動性Ｈ^＋ポンプ遺伝子を含むポリヌクレオド
配列を含有する発現ベクター、および３５Ｓプロモーターの二重タンデムエンハ
ンサーに作動可能に連結され、さらに異種コーディング配列に作動可能に連結さ
れた外来性液胞膜ピロホスフェート駆動性Ｈ^＋ポンプ遺伝子を含むポリヌクレオ
チド配列を含有する発現ベクターを包含する新規な発現ベクターが開示される。 開示された発明は、限定するものではないが、作物植物、鑑賞植物、草、低木
または人に有益であることまたは人を心地よくすることが見出されているいずれ
か他の植物を包含するいずれかの植物に応用しうることが発明者によって認めら
れる。

【００２３】 上記の記載ならびに本発明のさらなる目的、特徴および有益性は、付随の図面
と共にしたとき、下記の詳細な記載に関してより十分に理解されよう。

【００２４】 発明の詳細な記載 植物液胞は成熟植物細胞の全細胞内容量の４０〜９９％を構成するので、液胞
の大きさの変化は、細胞の大きさにおける顕著な効果を有する（R. G. Zhen, E.
J. Kim, P. A. Rea, in The Plant Vacuole . (Academic Press Limited, 1997
), vol. 25, pp. 298-337）。液胞の容量は、ポンプおよび輸送体によって媒介
されるイオンおよび水の流動によって調節される。植物において、イオン、溶質
および水の膜の向こう側への移動を引き起こす駆動力はプロトン勾配である。液
胞型Ｈ^＋ポンプの活性は、内腔の酸性化および液胞膜を横切るＨ^＋電気化学ポテ
ンシャル勾配の確立をもたらし、それは、無機イオン、糖類および有機酸の二次
的活性輸送体に動力を供給する。これらの輸送体の活性は細胞ｐＨおよびイオン
ホメオスタシスを調節し、液胞膨張を促進する浸透ポテンシャルを生じるのに必
要な溶質の蓄積を導く（H. Sze, X. Li, M. G. Palmgren, The Plant Cell 11,
677-689 (1999)）。

【００２５】 プロトン電気化学勾配を生じる３つの別個のポンプがある。細胞からＨ^＋を押
出す原形質膜に１つ（ＰＭ Ｈ^＋−ＡＴＰアーゼ）およびそれらの内腔を酸性化
する液胞膜または他の内膜コンパートメントに２つある（液胞型Ｈ^＋−ＡＴＰア
ーゼおよびＨ^＋−ＰＰアーゼ）（R. A. Leigh, in The Plant Vacuole L. a. Sa
nders, Ed. (Academic Press, San Diego, California, 1997), vol. 25, pp. 1
71-194）。 以前の研究は、アンチセンス構築物を用いて、ニンジンの液胞型Ｈ^＋−ＡＴＰ
アーゼのＡサブユニットのレベルにおける減少が細胞膨張を減少し、葉の形態を
改変した植物をもたらすことを示した（J. P. Gogartenら, The Plant Cell 4,
851-864 (1992)）。本発明者は、液胞中へのＨ^＋の供給量の増加が細胞膨張を引
き起こすことができると仮定した。近年、イオン蓄積の液胞機能におけるプロト
ンの利用性として該理論に基づいて、同じ発明者によって、液胞における固体の
蓄積が干ばつに対する保護およびより耐凍性のある植物の生産に有用であるかも
しれないと仮定された。

【００２６】 本発明者は、植物がいくつかの液胞型Ｈ^＋−輸送性ポンプを有し、その活性を
アップレギュレートすること、その発現を増加すること、その転写および／また
は翻訳をアップレギュレートすること、またはそのコピー数を増加することによ
って、液胞中のプロトンの利用性の増加のために、液胞中の固体の蓄積を増加す
ることができることを認めた。発明者は、液胞型Ｈ^＋−輸送性ポンプ、無機ピロ
ホスファターゼまたは単一ポリペプチドよりなるＶ−ＰＰアーゼのコピー数を増
加することによって該仮説を試験した（R. G. Zhen, E. J. Kim, P. A. Rea, in
The Plant Vacuole . (Academic Press Limited, 1997), vol. 25, pp. 298-33
7）。アラビドプシスにおいて、ＡＶＰ−１遺伝子によってコードされるＶ−Ｐ
Ｐアーゼは液胞型Ｈ^＋−ＡＴＰアーゼの大きさと同様の液胞膜（トノプラスト）
を横切るＨ^＋勾配を生じることができる（V. Sarafian, Y. Kim, R. J. Poole,
P. A. Rea, Proc. Natl. Acad. Sci. 89, 1775-1779 (1992)）。当業者によって
理解されるように、他の植物における同様の遺伝子は同様に機能するであろう。

【００２７】 １の具体例において、液胞型ピロホスファターゼを過剰発現するように設計さ
れたプロモーターに作動可能に連結された液胞型ピロホスファターゼ遺伝子を含
む構築物（例えば、発現カセット）を用いて本発明のトランスジェニック植物を
生産する。本明細書で使用される場合、「過剰発現」なる語は、構築物の不在下
で起こるよりも大きな発現／活性をいう。特定の具体例において、ＡＶＰ１を過
剰発現するように設計されたキメラプロモーターに作動可能に連結されたＡＶＰ
１遺伝子を含む構築物を用いて本発明のトランスジェニック植物を生産する。よ
り詳細には、本発明は、ＡＶＰ１遺伝子が３５Ｓプロモーターの二重タンデムエ
ンハンサーに作動可能に連結された構築物に関する。

【００２８】 本発明のトランスジェニック植物は、食物的価値または鑑賞的価値と関連した
もの以外の有用性を見出しうる。例えば、本発明のトランスジェニック植物はそ
れらの野生型相対物とは異なるまたはそれ以上のイオンを取り込むことができる
。下記に論じるように、突然変異体酵母系統（ｅｎａＩ）を用いる研究は、液胞
でのＨ^＋−輸送性ポンプが高等植物のカチオン解毒において重要な役割を果たす
ことを示す（細胞内カチオン解毒系に関与する植物成分は、発芽酵母サッカロミ
セス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の塩感受性突然変異体を補足す
ることによって同定されている）。かかる研究による植物中の液胞型ピロホスフ
ァターゼの発現を改変する外来性核酸を含むトランスジェニック植物および／ま
たはその子孫を土壌および生長培地のバイオリメディエーションに使用してもよ
い。かかる植物は、植物生長を維持できる培地（例えば、土壌、水）からカチオ
ン（例えば、一価および／または二価のカチオン）を除去するために使用するこ
とができる。例えば、本発明の形質転換植物を使用してナトリウム（Ｎａ）、鉛
（Ｐｄ）、マンガン（Ｍｎ）および／またはカルシウム（Ｃａ）イオンを植物生
長を維持する培地から除去することができる。

【００２９】 Ｈ^＋の液胞中への供給の増加が耐乾性および／または耐凍性、および耐塩性生
長、ならびに植物の大きさに及ぼす影響を明らかにするために、本発明者は液胞
型プロトンポンプ、ＡＶＰ−１の余剰コピーを含有するトランスジェニック植物
を作成した。 アラビドプシス・タリアナ（Arabidopsis thaliana）植物をＡＶＰ−１遺伝子
を含有する構築物で形質転換した。次いで、該遺伝子の余剰コピーを含有するト
ランスジェニック系統を単離した。ＡＶＰ−１、オープンリーディングフレーム
を修飾したｐＲＴ１０３のＸｍａ１部位中にクローン化した（R. Topfer, V. Ma
tzeit, B. Gronenborn, J. SchellおよびH-H. Steinbiss, Nucleic acid Resear
ch 15, 5890 (1987)）。該ベクターは３５−Ｓプロモーターのタンデム繰り返し
配列を含有する。３５−Ｓタンデムプロモーター、ＡＶＰ−１ ＯＲＦおよびポ
リアデニル化シグナルを含有するＨｉｎｄＩＩＩフラグメントをｐＰＺＰ２１２
ベクターのＨｉｎｄＩＩＩ部位中にサブクローン化した（P. Hajdukiewicz, Z.
SvabおよびP. Maliga, Plant Molecular Biology 25, 989-994 (1994)）。アグ
ロバクテリウムによって媒介される形質転換を開花しているアラビドプシス・タ
リアナ（生態型コロンビア（Columbia））の真空浸透によって行った。トランス
ジェニック植物は、形質転換植物の種子を２５ｍｇ／リットルのカナマイシンを
補足した植物栄養寒天プレート上に播種することによって選択した。次いで、導
入遺伝子のトランスジェニック植物ホモ接合体を同定するために、植物を２世代
において選択した。

【００３０】 図１Ａは、７週間、１０時間明／暗サイクルで水耕栽培した代表的な（各々、
１０個の植物のうち）野生型（ＷＴ）および２つの独立したトランスジェニック
系統（１’および２’）の上から見た図である。図１Ａにおいてわかるように、
ＡＶＰ−１蛋白質を最高レベルで発現するトランスジェニック系統２’、トラン
スジェニック系統１’および野生型（ＷＴ）の視覚的な比較は、ＡＶＰ−１の量
が植物の大きさに相関することを示す。トランスジェニック植物の大きさは、野
生型よりも大きいことがわかった。トランスジェニック系統１’および２’につ
いて、７５℃で２４時間後に測定した（ｎ＝４）トランスジェニック植物全体の
乾燥重量は、野生型（ＷＴ）の乾燥重量よりも１．５および３倍大きいことがわ
かった。

【００３１】 図１Ｂ（１）、１Ｂ（２）および１Ｂ（３）は、垂直植物栄養寒天プレートの
表面に水平に生長した図１Ａの代表的なＷＴ、１’および２’から得られた代表
的な５日齢幼植物の根および根毛の顕微鏡写真である（倍率：４０倍；写真の棒
の長さ＝２ｍｍ）。両トランスジェニック系統１’および２’の幼植物は、平均
の長さが野生型（ＷＴ）根毛より４０および７０％長い根毛を示した（図１Ｂ）
（根全体の根毛の長さは、各セットの幼植物の５つのメンバーから決定された。
１植物あたり８０本の根毛の平均を測定した）。根毛の長さは液胞の大きさと相
関するので、根毛の大きさの増加はおそらく、液胞容量の増加に起因する。これ
を、減少した液胞容量を有し、異常に短い根毛を有する短い植物であることが報
告されているアラビドプシス突然変異体ｒｄｈ３と比較する（M. E. Galway, J.
W. J. Heckman, J. W. Schiefelbein, Planta 201, 209-218 (1997)）。増大し
た根構造が土壌腐食、マメ科植物における窒素固定に対して正の影響を与え、植
物による水の取り込みにおいて助けとなるであろうことが認められる。

【００３２】 図１Ｃは、野生型（ＷＴ）およびＡＶＰ−１を過剰発現している２つの独立し
たトランスジェニック系統（１’および２’）から単離した膜フラクションのイ
ムノブロットである。全膜フラクションを６週間水耕培地中で生長させた８週齢
野生型（ＷＴ）およびＡＶＰ−１トランスジェニック植物（１’および２’）の
シュート（Shoot）から単離した。植物のシュートのホモジェネートを１５およ
び３０分間、各々、８および１００ｋｇにて連続的に遠心分離した。１００ｋｇ
膜ペレットを１０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ、１０％グリセロール中に再懸濁し、１ｍＭ ＰＭＳＦ蛋白質（１０ｍｇ）
を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、エレクトロブロットし、ＡＶＰ−１蛋白
質の推定親水性ループＩＶに相当するＫＬＨ−結合型合成ペプチドに対して生じ
た抗体を用いて免疫染色した（V. Sarafian, Y. Kim, R. J. Poole, P. A. Rea,
Proc. Natl. Acad. Sci. 89, 1775-1779 (1992)）。ＰＰアーゼを化学ルミネセ
ンスによって検出した。図１Ｃは、トランスジェニック系統（１’および２’）
がＡＶＰ−１蛋白質を野生型（ＷＴ）よりも高いレベルで発現することを示す（
すなわち、ＷＴより１’＝１５％および２’＝５０％）。

【００３３】 水分を欠乏した小麦は細胞Ｋ^＋含量の増加（１００ｍＭから３００ｍＭ）によ
ってより耐乾性にされるので（S. Gupta, G. Berkowitz, P. Pier, Plant Physi
ol 89, 1358-1365 (1989)）、ＡＶＰ−１トランスジェニック植物の増大した耐
乾性は、水分保持容量の増加をもたらすカリウムのより高い液胞濃度の結果であ
ると仮定される（しかしながら、本発明はこれにより、かかる理論に限定されな
い）。研究室試験は明らかにこれを確認する。

【００３４】 図２は、水欠損ストレスに７日曝露後の代表的な野生型植物（ＷＴ）対ＡＶＰ
−１を過剰発現している代表的なトランスジェニク植物（１’および２’）の上
から見た図である。野生型およびＡＶＰ−１を過剰発現しているトランスジェニ
ック植物（図３Ａ）を耐乾性（２４℃）について試験した。水欠損ストレスの７
日後、野生型（ＷＴ）植物は枯れたが、両方の３５Ｓ ＡＶＰ−１トランスジェ
ニック系統（１’および２’）由来の植物は膨張し、生存していた。さらに、次
いで、干ばつストレス植物に水をかけた場合、トランスジェニック植物は正常な
生長をたどり、薹立ちし、種子をつけたが、野生型植物は枯れた。野生型および
３５Ｓ ＡＶＰ−１トランスジェニック植物由来の葉の相対的水分含量を水欠損
ストレスに沿って測定し、それは、ＷＴ植物と比べてトランスジェニック系統に
よる水分保持の増加を示した。

【００３５】 付随の図面には図示されていないが、同様の結果がいくつかの植物種について
２４時間以上の凍結攻撃（＜０℃）に関して見ることができる。かかる仮定に限
定されないが、ＡＶＰ−１を過剰発現しているトランスジェニック植物（１’お
よび２’）は、液胞中のカチオン量がより高いために、野生型（ＷＴ）植物と比
べて凍結からの強化された保護を提供すると考えられる。より多量のカチオンは
、より大きい水分保持容量を導くより大きい浸透圧を提供し、それは、植物に低
土壌水分ポテンシャルに耐える能力を与えるだけでなく、植物の有意な乾燥を導
く凍結からのより大きな保護をも提供する。

【００３６】 図３は、塩類土壌中で生長させた野生型植物（ＷＴ）対ＡＶＰ−１を過剰発現
している代表的なトランスジェニック植物（１’および２’）の透視図である。
５つの野生型植物（ＷＴ）および２つのＡＶＰ−１過剰発現トランスジェニック
系統（１’および２’）を１０時間明/暗サイクルにおいて土壌で生長させた。
植物を６週間、希釈栄養溶液（１／８ＭＳ塩）を用いて給水し、次いで、ＮａＣ
ｌを補足した希釈栄養溶液を用いて給水した。ＮａＣｌの濃度は１００ｎＭで開
始し、４日毎に１００ｍＭ増加させた。図３の写真は、３００ｍＭ ＮａＣｌが
存在する１０日目の植物に相当する。図３は、２つのＡＶＰ−１植物型（１’お
よび２’）が野生型植物と比べて塩類土壌において有意に耐性があったことを示
す。ＡＶＰ１（ピロホスフェートによってエネルギーが与えられる液胞膜プロト
ンプンプ、本研究）またはＡｔＮＨＸ１（Ｎａ^＋／Ｈ^＋対向輸送体、（Apse, M.
,ら, Science, 285:1256-1258 (1999))および本研究）のいずれかを過剰発現す
る遺伝子操作したアラビドプシス・タリアナ植物が高ＮａＣｌ濃度の存在下で生
長可能であるという事実は、本明細書に記載の方法を強く支持する。二重トラン
スジェニック植物は、さらに強化された耐塩性表現型を示すと予測される。これ
らのアラビドプシス・タリアナ輸送体またはそれらの相対物は、重要な農業作物
において同様の機能を示しうる。３５Ｓ ＡＶＰ１アラビドプシストランスジェ
ニック植物の増加した大きさもまた、遺伝子操作した作物における潜在的な収量
増加に寄与する。

【００３７】 植物オルガネラにおけるカチオンホメオスタシスの作用モデル 本発明はいずれかの特定の仮説に限定されることはないが、本発明者らは、本
明細書に開示されるトランスジェニック植物に関して見出された予想外の結果を
説明しうる植物オルガネラにおけるカチオンホメオスタシスの作用モデルを開発
した。

【００３８】 植物において、輸送過程の多くは、プロトンの一次転流によってエネルギーを
供給される。原形質膜および液胞膜に位置するＨ^＋輸送性ポンプは、Ｈ^＋をサイ
トゾルから各々、細胞外および液胞コンパートメントへ転流させた（Rea, P.A.
ら, Tonoplast Adenosine Triphosphate and inorganic Pyrophosphatase. In:
Methods Plant Biochem., pp. 385-405, Academic Press Limited, London (199
0)）。植物液胞膜は、２つのＨ^＋輸送性ポンプ；Ｖ−ＡＴＰアーゼおよび無機ピ
ロホスファターゼまたはＶ−ＰＰアーゼを含有する。それらの作用は、内腔の酸
性化および液胞膜を横切るＨ^＋電気化学ポテンシャル勾配の確立をもたらす（Da
vies, J.M.ら, The Bioenergetics of Vacuolar H+ Pumps. Plant Vacuole, pp.
340-363, Leigh, R.A., Sanders, D. (編), Academic Press, San Diego (1997
)）。液胞膜は、サイトゾルのｐＨ平衡状態、規則的なＣａ^２＋のコンパートメ
ンテーション（compartmentation）、Ｎａ^＋のような毒性イオンの封鎖、膨圧調
節ならびに養分貯蔵および回収を包含する生理学的過程の幅広いスペクトルに関
係する。液胞は成熟植物細胞の全細胞内容量の４０〜９９％を構成する。液胞型
プロトンポンプ輸送ピロホスファターゼは、Ｖ−ＡＴＰアーゼによって生成され
るものと類似またはそれより大きい定常状態のトランス−液胞膜Ｈ^＋電気化学ポ
テンシャルを生じることのできる植物液胞膜の万能かつ豊富な成分である（Rea,
P.A.ら, Tonoplast Adenosine Triphosphate and Inorganic Pyrophosphatase.
Methods Plant Biochem., pp. 385-405, Academic Press Limited, London (19
90)）。ピロホスフェート（ＰＰｉ）は、幅広い範囲の生合成経路の活性化また
は重合化工程における副産物であり、植物において、シュークロースシンテター
ゼによるシュークロース流動化（mobilization）、ＰＰｉ：フルクトース−６−
ホスフェートホスホトランスフェラーゼによる糖分解、および液胞型プロトンポ
ンプ輸送ピロホスファターゼによる液胞膜エネルギー供給のために、ＡＴＰに別
のエネルギードナーとして作用する（Stitt, M., Bot. Acta 111:167-175 (1998
)）。

【００３９】 クラスリンによって被覆された小胞、エンドソーム、ゴルジ膜および液胞を包
含する細胞内オルガネラの多くは、酸性内部を有する（Xie, X. S.ら, J. Biol.
Chem., 264:18870-18873 (1989)）。該酸性化はプロトン輸送性電気発生ＡＴＰ
アーゼによって媒介され、植物液胞において、また、ピロホスフェート駆動性プ
ロトンポンプＶ−ＰＰアーゼを介する（Davies, J.M.ら, The Bioenergetics of
Vacuolar H+ Pumps. Leigh R.A., Sanders, D., (編) The Plant Vacuole, pp
. 340-363, Academic Press, San Diego (1997); Zhen, R.G.ら, "The Molecula
r and Biochemical Basis of Pyrophosphate-Energized Proton Translocation
at the Vacuolar Membrane Academic Press Limited (1997)）。正味の電気的中
性を維持するためにアニオン輸送の必要性がある（al-Awqati, A., Curr. Opin.
Cell. Biol., 7:504-508 (1995)）。

【００４０】 図４Ａは、酵母プレ液胞コンパートメントにてナトリウム封鎖に関与した輸送
体の作用モデルの図示である；Ｎｈｘ１（Ｎａ^＋／Ｈ^＋対向輸送体）、Ｖｍａｌ
（液胞膜Ｈ^＋−ＡＴＰアーゼ）、Ｇｅｆ１（酵母ＣＬＣ塩化物チャンネル）、Ｅ
ｎａ１（原形質膜Ｎａ^＋−ＡＴＰアーゼ）。ＣＬＣ電圧ゲート制御された塩化物
チャンネルスーパーファミリーの酵母メンバー、Ｇｅｆｌは、後期ゴルジ小胞に
おける銅負荷および酵母におけるプレ−液胞コンパートメントにおけるカチオン
封鎖に必要とされる（Gaxiola, R.A.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:4046
-4050 (1998); Gaxiola, R.A.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:1480-1485
(1999); 実施例１）。さらに、ｇｅｆｌ突然変異体の欠点をＣＬＣスーパーファ
ミリーの原型メンバー、トルペド・マルモラタ（Torpedo marmorata）ＣＬＣ−
０の導入によって、またはアラビドブシス・タリアナＣＬＣ−ｃおよびＣＬＣ−
ｄ塩化物チャンネル遺伝子の導入によって抑制することができることが示された
（Hechenberger, M.ら, J. Biol. Chem., 271:33632-33638 (1996); Gaxiola, R
.A.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:4046-4050 (1998)）。図４Ｂは、Ａｖ
ｐ１（エー・タリアナ（A. thaliana）液胞型ピロホスフェートによりエネルギ
ーを与えられるプロトンポンプ）も包含する図４Ａに示される酵母プレ液胞コン
パートメントにてナトリウム封鎖に関与した輸送体の作用モデルの図示である。

【００４１】 理論に拘束されることは望ましくないが、２つの観察が図４Ａおよび図４Ｂに
示される酵母におけるＮａ^＋封鎖のモデルの提案を導いた。第一に、ｇｅｌｆｌ
突然変異体は高ＮａＣｌ濃度に感受性である。第二に、Ｎａ^＋／Ｈ^＋交換体Ｎｈ
ｘｌはプレ−液胞コンパートメントに局在する（Nass, R.ら, J. Biol. Chem.,
273:21054-21060 (1998)）。図４Ａおよび４Ｂに提案されるモデルは、Ｎｈｘｌ
によるＮａ^＋封鎖が液胞型Ｈ^＋−ＡＴＰアーゼおよびＧｅｆｌ、塩化物チャンネ
ルに依存することを提案する。Ｇｅｆｌに媒介されるアニオン流入は、Ｎａ^＋／
Ｈ^＋交換を介してＮａ^＋の上り勾配の蓄積を駆動するのに十分な大きさのプロト
ン勾配の液胞型Ｈ^＋−ＡＴＰアーゼによる確立を可能にする。

【００４２】 かかるモデルに基づいて、仮定のエンドソームコンパートメント中へのプロト
ンの流入を増加させることがＮｈｘｌ交換体を介するＮａ^＋封鎖を改善するであ
ろうことが理論付けられた。Ｈ^＋利用性を増加するために、液胞型ピロホスフェ
ートによってエネルギーが与えられるプロトンポンプをコードするエー・タチア
ナ機能増大（gain-of-function）突然変異遺伝子ＡＶＰ１−Ｄが発現された（図
３Ｂ）（Zhen, R.G.ら、J. Biol. Chem., 272:22340-22348 (1997)）。酵母中で
発現された該植物ポンプは、試験系統が機能的ＮＨＸｌおよびＧＥＦｌ遺伝子を
有した場合にのみ、試験系統のＮａ^＋耐性を回復した。さらに、共通のオルガネ
ラ、プレ−液胞コンパートメント内にＧｅｆｌｐおよびＮｈｘｌが共に局在する
（Gaxiola, R.A.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:1480-1485 (1999)）。こ
れらの結果は、図４Ａおよび４Ｂにおけるモデルを強く支持し、細胞内ナトリウ
ム解毒に関与するわかりにくい植物輸送体を同定するために酵母プレ−液胞コン
パートメントを使用できることを示す。

【００４３】 図４Ａおよび４Ｂに示されるモデルは、高等植物におけるカチオン解毒におけ
る液胞の役割についての生理学的データと完全に一致する。酵母および植物細胞
は、ゴルジ網から液胞への小胞の通行のための経路およびシグナルを共有する（
Neuhaus, J.M.ら, Plant Mol. Biol., 38:127-144 (1998); (Paris, N.ら, Plan
t Physiol., 115:29-39 (1997); Sato, M.H.ら, J. Biol. Chem., 272:24530-24
535 (1997); Vitale, A.V.ら, Trends Plant Sci., 4:148-154 (1999)）。した
がって、高等植物におけるカチオン解毒における液胞の役割を同定するために、
酵母における研究を計画した。

【００４４】 酵母におけるカチオン封鎖メカニズムの研究 実施例１：酵母系統におけるＡｔＮｈｘ１およびＡｖｐ１の機能 図４Ａおよび４Ｂに示される封鎖モデルを研究するために、原形質膜ナトリウ
ム流出ポンプを欠き、したがって、高塩において生長するために内部解毒系に頼
らなければならない突然変異体酵母系統（ｅｎａ１）を構築した。図４Ａおよび
４Ｂの封鎖モデル（Nass, R.およびRao, R., J. Biol. Chem., 273:21054-21060
(1998)および Gaxiola, R.A.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:4046-4050
(1998)）は、仮定のエンドソームコンパートメント中のプロトンの利用性を増大
できる場合にｅｎａ１系統が耐塩性になる、すなわち、プロトンの流入の増加に
より、細胞質Ｎａ^＋がＮｈｘ１交換体によって封鎖されることを予測する。

【００４５】 酵母液胞型ＡＴＰアーゼは、マルチサブユニット蛋白質であり、それゆえ、そ
のサブユニットのいずれか一つを過剰発現することによってその活性を増加する
ことは困難である。そのかわり、酵母中でエー・タリアナＡＶＰ１遺伝子を発現
することにってプロトンの流入を増加することにより、同じ効果が達成された。
該遺伝子は、酵母中で発現される場合、液胞の内腔中にプロトンをポンプ輸送す
ることができる単一ポリペプチドをコードする（Kim, E.J.ら, Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA, 91:6128-6132 (1994)）。該プロトンポンプの最大活性を確実にす
るために、Ｈ^＋ポンプ輸送容量を増大させたＡＶＰ１遺伝子のＥ２２９Ｄ機能増
大突然変異体（ＡＶＰ１−Ｄ）を発現させた（Zhen, R.G.ら, J. Biol. Chem.,
272:22340-22348 (1997)）。高ＮａＣｌ含量のＳＤ−ｕｒａ培地上での培養後に
、細胞内ナトリウムおよびカリウム含量を突然変異体および野生型細胞について
決定した。

【００４６】 材料および方法 酵母系統およびプラスミド Ｗ３０３に対して同遺伝子型の系統（ura3-1 can1-100 leu2-3, 112trp1-1 hi
s3-11, (Gaxiola, R.A.ら, EMBO J., 11:3157-3164 (1992)）を用いた。プラス
ミドｐＲＧ５２（・gef1::HIS3) (Gaxiola, R.A.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA, 95:4046-4050 (1998)）およびｐＲＧ１９７（・nhx1::HIS3）を用いてＧＥ
Ｆ１およびＮＨＸ１遺伝子の欠失を構築し、各々、ＲＧＹ８５およびＲＧＹ２９
６系統を得た。ｅｎａｌ：：ＨＩＳ３突然変異体はＦｉｎｋ Ｌａｂコレクショ
ン（Ｌ５７０９）から得た。

【００４７】 形質転換の方法 酢酸リチウム法を用いることによって、酵母細胞の形質転換を行った（Gietz,
D.ら, Nucleic Acids Res., 20:1425 (1992)）。単一突然変異系統を交雑する
ことによって、二重突然変異体ＲＧＹ３２４（ｇｅｆ１：：ＨＩＳ３ ｅｎａｌ
：：ＨＩＳ３）、ＲＧＹ３２６（ｎｈｘ１：：ＨＩＳ３ ｅｎａｌ：：ＨＩＳ３
）およびＲＧＹ３４３（ｇｅｆ１：：ＨＩＳ３ ｎｈｘ１：：ＨＩＳ３）を得た
。二重突然変異体は、各単一突然変異体に関連する表現型についてスコアをつけ
ることによって減数分裂子孫のなかで同定された。胞子形成、４分子解剖（tetr
ad dissection）および交配型について記載のようにスコアをつけた（Guthrie C
.およびFink, G.R., Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology (Academ
ic, San Diego (1991)）。細胞はＹＰＤ（１％酵母／２％ペプトン／２％デキス
トロース；Difco）、ＹＰＧＡＬ（１％酵母／２％ペプトン・２％ガラクトース
；Difco）、ＳＤ（Difco; ２％デキストロースを含有する合成培地）またはＡＰ
Ｇ（ＡＰＧは、１０ｍＭアルギニン、８ｍＭリン酸、２％グルコース、２ｍＭ
ＭｇＳＯ_４、１ｍＭ ＫＣｌ、０．２ｍＭ ＣａＣｌ_２および微量ミネラルおよび
ビタミンを含有する合成最少培地である）中で培養した（Rodriguez-Navarro, A
. and Ramos, J., J. Bacteriol., 159:940-945 (1984)）。ＭｎＣｌ_２（Sigma
）、塩化テトラメチルアンモニウム（Sigma）、ＮａＣｌ（Sigma）またはハイブ
ロマイシン−Ｂ（Sigma）を示されたとおりに加えた。

【００４８】 野生型、Ｌ５７０９（ｅｎａｌ：：ＨＩＳ３）、ＲＧＹ３２４（ｇｅｆ１：：
ＨＩＳ３ ｅｎａｌ：：ＨＩＳ３）およびＲＧＹ３２６（ｎｈｘ１：：ＨＩＳ３
ｅｎａｌ：：ＨＩＳ３）系統をｐＹＥＳ２ベクター（Invitrogen）およびZhen
, R.G.ら, J. Biol. Chem., 272:22340-22348 (1997)に記載のプラスミドｐＹＥ
Ｓ２−ＡＶＰ１−Ｅ２２９Ｄで形質転換した。組織化学分析に使用される系統Ｒ
ＧＹ３４３（ｇｅｆ１：：ＨＩＳ３ ｎｈｘ１：：ＨＩＳ３）をｐＲＧ１５１（
ＧＥＦ１−ＧＦＰ）（Gaxiola, R.A.ら Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:4046-
4050 (1998)）およびｐＲＩＮ７３［ＮＨＸ１−（ＨＡ）_３］（Nass, R.,および
Rao, R., J. Biol. Chem., 273:21054-21060 (1998)）で形質転換した。

【００４９】 野生型およびＲＧＹ２９６（ｎｈｘ１：：ＨＩＳ３）系統をベクターｐＡＤ４
（Ballester, R.ら, Cell, 59:681-686 (1989)）で形質転換した。ＲＧＹ２９６
（ｎｈｘｌ：：ＨＩＳ３）をｐＲＧ３０８（ＡＤＨ１：：ＡｔＮＨＸ１）で形質
転換した（ＡｔＮＨＸ１のクローニングを参照のこと）。

【００５０】 細胞内ナトリウムおよびカリウム含量の決定 細胞は、ＳＤ−ｕｒａ培地（Difco; ウラシルを不含の２％デキストロースを
含有する合成培地）中で一晩培養した。ＹＰＧＡＬ（１％酵母抽出物／２％ペプ
トン／２％ガラクトース；Difco）培地に一晩のストックを接種し、Ａ_６００が
０．６になるまで培養した。該ＯＤにて、ＮａＣｌを０．７Ｍの最終濃度まで加
えた。細胞を６時間インキュベートし、遠心分離によって収集し、１．１Ｍソル
ビトールおよび２０ｍＭ ＭｇＣｌ_２を用いて二回洗浄し、９５℃で３０分間、
水で抽出した。

【００５１】 細胞中のＮａ^＋およびＫ^＋の量をUniversity of Georgia Chemical Analysis
Laboratoryにおいて、誘導結合プラズマＭＳによって決定した（world wide web
のrserv/uga.edu/rsnew/chemicalanalysis/を参照のこと）。細胞内カチオン濃
度は、１Ｍ ＮａＣｌ中で培養した細胞について算出した細胞内水分値を用いる
ことによって、記載のように評価された（Gaxiola, R.A.ら, EMBO J., 11:3157-
3164 (1992)）。

【００５２】 免疫蛍光 系統ＲＧＹ３４３（ｇｅｆ１：：ＨＩＳ３ ｎｈｘ１：：ＨＩＳ３）をＳＤ−
ｕｒａ、−ｌｅｕ培地（Difco; ウラシルおよびロイシンを含有せずに２％デキ
ストロースを含有する合成培地）中で対数期半ばまで培養し、０．１ｍｇ／ｍｌ
ハイグロマイシンＢを加え、培養物を３０℃で１時間インキュベートした。細胞
を室温で４５分間、攪拌することなく３．７％ホルムアルデヒド（Sigma）で固
定した。スフェロプラスト形成、浸透化、洗浄および抗体インキュベーションを
記載のように行った（Pringle, J.ら, Immunofluorescence Methods for Yeast,
eds. Guthrie, C. And Fink, G.F. (Academic, Sand Diego), Vol. 194 pp.565
-602 (1991)）。一次抗体として使用したＭＡＢ ＨＡ１１はＢａｂｃｏ（Richmo
nd, CA）から得た。Ｃｙ３−結合型ヤギ抗−マウスＩｇＧはＪａｃｋｓｏｎ Ｉ
ｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈから得た。４’，６−ジアミジノ−２−フェニルイ
ンドール（Sigma）をミトコンドリアおよび核ＤＮＡを染色するための封入培地
に加えた。

【００５３】 亜細胞性分画およびウェスタン分析 系統ＲＧＹ３４３（ｇｅｆ１：：ＨＩＳ３ ｎｈｘ１：：ＨＩＳ３）をＡＰＧ
培地（ｐＨ７．０）中で培養し、ライゼートを１０段階シュークロース密度勾配
において記載（Nass, R.およびRao, R., J. Biol. Chem., 273:21054-21060 (19
98)）のように分画した。個々のフラクションのアリコート（１００μｇ）を記
載（Nass, R.および Rao, R., J. Biol. Chem., 273:21054-21060 (1998)）のよ
うに、ＳＤＳ／ＰＡＧＥに付し、ニトロセルロースに転写した。ウェスタンブロ
ットは、モノクローナル抗−ＧＦＰ（緑蛍光蛋白質）抗体（１：１００００希釈
；CLONTECH）、抗−赤血球凝集素抗体（１：１００００希釈；Boehringer Mannh
eim）およびペルオキシダーゼ結合型ヤギ抗−マウス抗体（１：５０００）でプ
ローブし、ＥＣＬ強化化学ルミネセンスシステム（Amersham Pharmacia）を用い
ることによって顕出した。

【００５４】 ＡｔＮＨＸ１のクローニング ＡｔＮＨＸ１をエー・タリアナのファージｃＤＮＡライブラリー（Kieber, J.
J.ら, Cell, 72:427-441 (1993)）（Arabidopsis Biological Resource Center
から得られた）から、部分的クローンを含有する発現配列タグ（Arabidopsis Bi
ological Resources Center, DNA Stock Center）でプローブすることによって
クローン化した。全長クローン（２．１ｋｂ）をベクターｐＳＫ２（Stratagene
）のＮｏｔＩ部位にライゲートし、プラスミドｐＲＧ２９３を作成した。鋳型と
してｐＲＧ２９３およびＧＧＣＣＣＧＧＧＡＴＧＧＡＴＴＣＴＣＴＡＧＴＧＴＣ ＧＡＡＡＣＴＧＣＣＴＴＣＧ （配列番号５）（下線を付した塩基はＯＲＦのヌク
レオチド１−３０に対応する）およびＴ７オリゴヌクレオチドを用いることによ
って、ＡｔＮＨＫ１ ＯＲＦをＰＣＲによって増幅した。次いで、ＰＣＲ産物を
ＸｂａＩおよびＳａｌＩで消化し、ｐＡＤ４ベクター中にライゲートし、プラス
ミドｐＲＧ３０８を作成した。ＡｔＮＨＸ１ ＯＲＦを配列決定してＰＣＲ産物
が正確であることを証明した。全長配列は、アラビドプシス・ゲノム・イニシア
ティブ（The Arabidopsis Genome Initiative） (A TM021B04.4)によって報告さ
れたＯＰＦよりも長く、ＧｅｎＢａｎｋに寄託された（受託番号ＡＦ１０６３２
４）。

【００５５】 ＡＶＰ１−Ｄのクローニング ベクターｐＹＥＳ２（Invitrogen）を野生型、ｅｎａ１、ｅｎａ１ ｎｈｘ１
およびｅｎａ１ ｇｅｆ１突然変異体中に導入した。プラスミドｐＹｅｓ２−Ａ
ＶＰ１−Ｄ（Zhen, R.G.ら, J. Biol. Chem., 272:22340-22348 (1997)）をｅｎ
ａ１、ｅｎａ１ ｎｈｘ１およびｅｎａ１ ｇｅｆ１突然変異体中に導入した。各
系統の５倍連続希釈（１０^５細胞で開始する）を０．５Ｍ ＮａＣｌを含有する
かまたは含有しないＹＰＧＡＬ（１％酵母抽出物／２％ペプトン／２％ガラクト
ース）上に播種し、３０℃で２日間インキュベートした。指数的に増殖している
細胞（ｐＹＥＳ２ベクターで形質転換した野生型およびｅｎａ１ならびにｐＹｅ
ｓ２−ＡＶＰ１−Ｄを有するｅｎａ１、ｅｎａ１ ｎｈｘ１およびｅｎａ１ ｇｅ
ｆ１突然変異体）を０．７Ｍ ＮａＣｌに６時間曝露した。全細胞抽出物を調製
し、Ｎａ^＋およびＫ^＋濃度を決定した。

【００５６】 結果 上記の構築物のｅｎａ１突然変異体は原形質膜ナトリウム流出ポンプを欠き、
したがって、ナトリウム毒性を克服するために内部解毒系に頼らなければならな
い。ｅｎａ１系統の増殖は低濃度のナトリウム（２００ｍＭ）、野生型系統の増
殖を阻害しない濃度に感受性である。ＡＶＰ１−Ｄの過剰発現は塩感受性ｅｎａ
１突然変異体に耐塩性を回復させた。ＡＶＰ１−Ｄによるｅｎａ１系統への耐塩
性の回復は、機能的ＮＨＸ１およびＧＥＦ１遺伝子を必要とし、ｅｎａ１ｎｈｘ
１ＡＶＰ１−Ｄおよびｅｎａ１ ｇｅｆ１ ＡＶＰ１−Ｄ系統は塩感受性である。

【００５７】 図５Ａおよび図５Ｂは、野生型酵母系統およびナトリウム耐性に影響を及ぼす
種々の突然変異を有する酵母系統の細胞内Ｎａ^＋およびＫ^＋含量を示す棒グラフ
であり、値は２つの測定値の平均であり、棒は標準偏差を示す。野生型系統およ
び耐性に影響を及ぼす種々の変異を有する系統の細胞内Ｎａ^＋およびＫ^＋含量は
、０．７Ｍ ＮａＣｌを補足した培地に６時間曝露後に決定された。ｅｎａ１突
然変異体中の細胞内Ｎａ^＋含量は、野生型系統におけるよりも８倍高いことがわ
かった。ｅｎａ１ ＡＶＰ−Ｄ系統において全細胞Ｎａ^＋における一定の減少あ
ることがわかった。該減少の理由は知られていない。ｅｎａ１ ＡＶＰ−Ｄ系統
は、その細胞内Ｎａ^＋含量が野生型よりも４倍高いにもかかわらず、耐塩性であ
ることが見出された。ｇｅｆ１またはｎｈｘ１のいずれかを欠くｅｎａ１ ＡＶ
Ｐ１−Ｄ系統（すなわち、ｅｎａ１ ｇｅｆ１またはｅｎａ１ ｎｈｘ１）におい
て、Ｎａ^＋含量は、ＧＥＦ１ ＮＨＸ１系統における程度まで減少されなかった
。合わせると、遺伝学的および生理学的データはＮｈｘ１、Ｇｅｆ１およびＡｖ
ｐ１が共同でナトリウムを内部に封鎖するモデルと一致する。グラフからわかる
ように、アラビドプシス液胞型Ｈ^＋−ピロホスファターゼ（Ａｖｐ１）は酵母ｅ
ｎａ１突然変異体に耐塩性を与えることが明らかにされた。

【００５８】 細胞内Ｋ^＋含量は、耐塩性と相関することが見出され、該系統のＮａ^＋含量と
逆方向に相関する（図４Ｂ）。野生型Ｋ^＋濃度は１００ｍＭであったが、ｅｎａ
１突然変異体において２０ｍＭに減少した。興味深いことに、ＡＶＰ１−Ｄ遺伝
子を過剰発現するｅｎａ１系統において、Ｋ^＋の細胞内濃度はほとんど野生型レ
ベルまで回復した（図４Ｂ）。しかしながら、ＡＶＰ１−Ｄ過剰発現は、ＮＨｘ
１およびＧＥＦ１の両方が機能的でないかぎり、細胞内カリウムの野生型レベル
を回復することはできなかった（図４Ｂの二重突然変異体ｅｎａ１ ｎｈｘ１ま
たはｅｎａ１ ｇｅｆ１を参照）。

【００５９】 本明細書に示されるように、酵母における細胞内Ｎａ^＋解毒は機能的Ｎａ^＋／
Ｈ^＋交換体（Ｎｈｘ１）および塩化物チャンネル（Ｇｅｆ１）を必要とし、それ
らはプレ−液胞コンパートメントに共に局在する（Gaxiola, R.A.ら, Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA, 96:1480-1485 (1999)）。酵母ＮＨＸ１遺伝子のアラビドプ
シス・タリアナ相同物（ＡｔＮＨＸ１）をクローン化し、ｎｈｘ１酵母突然変異
体中のその機能を試験したとき、ＡｔＮＨＸ１遺伝子はｎｈｘ１突然変異体のカ
チオン感受性表現型を部分的に抑制できることが見出された。図６は、アラビド
プシスＡｔＮＨＸ１（配列番号１）、ヒトＨｓＮＨＥ−６（配列番号２）および
酵母ＳｃＮＨＸ１（配列番号３）由来のＮｈＸ１相同物の推定アミノ酸配列であ
り、一致する残基を黒いボックスで囲み、点線は配列中のギャップを示し、配列
上の＊はヒトＮＨＥ１由来の推定アミロライド結合部位（^１６３ＤＶＦ−ＦＬＦ
ＬＬＰＰＩ^１７３）（配列番号４）を示す。

【００６０】 実施例２：酵母系統におけるＧｅｆ１ｐおよびＮｈｘ１ｐの機能性および共同
局在化 ナトリウム解毒において重要なものとして同定されたＮＨＸ１およびＧＥＦ１
遺伝子はまた、他のカチオンの解毒にも必要とされる。図４Ａおよび図４Ｂにお
いて示されるモデルに照らして、毒性カチオンの存在下、ｇｅｆ１およびｎｈｘ
１に関する酵母系統突然変異体（ｅｎａ１）の生存能力に関する研究がなされた
。

【００６１】 封鎖モデルは、アニオンチャンネルＧｅｆ１とナトリウム交換体Ｎｈｘ１との
間の機能的関連を仮定するだけでなく、これらの２つの蛋白質が共通のコンパー
トメント内に共に局在することも予測する。以前の研究はＮｈｘ１がプレ−液胞
コンパートメントに局在することを示したので（Nass, R.およびRao, R., J. Bi
ol. Chem., 273:21054-21060 (1998)）、Ｇｅｆ１およびＮｈｘ１蛋白質が該コ
ンパートメントに共に局在するか否かを決定するための実験も行った。

【００６２】 材料および方法 系統ＲＧＹ４１９（ｇｅｆ１ ｎｈｘ１）をプラスミドｐＲＧ１５１；ＧＥＦ
１−ＧＦＰおよびｐＲＩＮ７３；ＮＨＸ１−（ＨＡ）_３で形質転換した。形質転
換体をＳＤ（Difco；２％デキストロースを含有する合成培地）中で培養した。
かかる形質転換体の毒性カチオンに対する感受性を決定するために、示された系
統の５倍連続希釈（１０^５細胞で開始する）を３０℃で２日間、示されるように
３ｍＭ ＭｎＣｌ_２、０．４５Ｍテトラメチルアンモニウム（ＴＭＡ）または０
．０５ｍｇ／ｍｌハイグロマイシンＢ（ＨＹＧ）のいずれかを添加したＹＰＤ（
１％酵母抽出物／２％ペプトン／２％デキストロース）上で培養した。

【００６３】 Ｇｅｆ１ｐおよびＮｈｘ１ｐの共同局在化を明らかにするために、２つの研究
が計画された。 ２つの構築物：ＧＥＦ１−ＧＦＰ融合物およびＮＨＸ１−（ＨＡ）_３−タグ付
加した融合物で形質転換されたｇｅｆ１ ｎｈｘ１細胞における亜細胞性フラク
ションの蛍光および免疫検出の分布を決定した。細胞がＯＤ_６００＝０．５に達
したとき、ハイグロマイシンＢ（Sigma）を０．１ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで加
え、細胞を３０℃で４０分間インキュベートした。細胞を固定し、ＨＡエピトー
プおよび４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で染色し
た。細胞を電荷結合素子顕微鏡によって視覚化し、所望により、デコンヴォリュ
ーションアルゴリズム（Scanalytics, Billerica, MA）を用いることによって区
分に分けた（(Kennedy, B.K., et al., Cell, 89:381-391 (1997)); (Bar = １
Φm）。

【００６４】 また、Ｎｈｘ１（ＨＡ）_３およびＧＥＦ１−ＧＦＰの共同局在化の証拠を提供
するために、シュークロース勾配におけるＧｅｆ１ｐおよびＮｈｘ１ｐの移動特
性も決定した。系統ＲＧＹ４１９（ｇｅｆ１ ｎｈｘ１）をプラスミドｐＲＧ１
５１；ＧＥＦ１−ＧＦＰおよびｐＲＩＮ７３；ＮＨＸ１−（ＨＡ）_３で形質転換
し、ＡＰＧ培地中で培養した（Rodriguez-Navarro, A.およびRea, P.A., J. Bio
l. Chem., 159:940-945 (1984)）。これをスフェロプラストに変換し、溶解し、
記載（Sorin, A.ら, J. Biol. Chem., 272:9895-9901 (1997)およびAntebi, A.
およびFink, G.R., Mol. Biol. Cell, 3:633-654 (1992)）のように１０段階シ
ュークロース勾配（１８−５４％）上で分画した。ウェスタンブロットはＧｅｆ
１−ＧＦＰおよびＮｈｘ１−ＨＡの分布を示した。

【００６５】 結果 Ｇｅｆ１突然変異体は、３ｍＭ ＭｎＣｌ_２、０．４５Ｍ塩化テトラメチルア
ンモニウム、および０．０５μｇ／ｍｌハイグロマイシンーＢに対して感受性で
あることが見出された。ｎｈｘ１突然変異体もまた、塩化テトラメチルアンモニ
ウムおよびハイグロマイシンに対して感受性であることが見出された。ハイグロ
マイシンに対するｎｈｘ１突然変異体の極度の感受性は、ｎｈｘ１機能をアッセ
イするための重要な手段を提供しうる。

【００６６】 エピ蛍光デコンヴォリューション顕微鏡によって示されるように、赤血球凝集
素（ＨＡ）−タグ付加したＮｈｘ１およびＧｅｆ１−ＧＦＰ融合蛋白質が共に局
在することが見出された。像の９０°回転におけるシグナル一致の持続は、さら
に、これらの細胞における２つの輸送体蛋白質の共同局在化を支持する。Ｎｈｘ
１（ＨＡ）_３およびＧＥＦ１−ＧＦＰの共同局在化はまた、タグ付加した蛋白質
を発現している細胞から得られた膜調製物のシュークロース密度勾配中における
２つの蛋白質の共同移動によって支持される。両方の蛋白質を含有する膜分画の
沈降作用は、プレ−液胞コンパートメントのそれと一致する（Nass, R.およびRa
o, R., J. Biol. Chem., 273:21054-21060 (1998)）。Ｇｅｆ１−ＧＦＰ（Ｎｈ
ｘ１ではない）もまた、ゴルジ分画中に存在し、以前の研究と一致する（Gaxiol
a, R.A.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:4046-4050 (1998), Schwappach,
B.ら, J. Biol. Chem., 273:15110-15118 (1998)）。

【００６７】 実施例３：ＮＨＸ１のエー・タリアナ相同物の突然変異体酵母のハイグロマイ
シン感受性を抑制する能力 本明細書に記載の酵母系統は、他の生物において耐塩性を媒介する遺伝子を同
定するための重要な手段を提供する。該系の利用性を試験するために、エス・セ
レビシエ（S. cerevisiae）ＮＨＸ１ ＯＲＦに対し非常に高いホモロジーを有す
るアラビドプシス由来の配列（材料および方法を参照）を同定し、発現配列タグ
（材料および方法を参照）を用いて該アラビドプシス遺伝子の全長クローンを得
た。アラビドプシス（ＡｔＮｈｘ１）、ヒト（ＨｓＮｈｅ６）および酵母（Ｓｃ
Ｎｈｘ１）由来のＮｈｘ１相同物のアミノ酸配列を並べた配列は、予測された膜
貫通ドメイン内のアミノ酸同一性および類似性の部分を示す（図６Ａ−Ｃ）。し
かしながら、これらの関係にもかかわらず、ＡｔＮｈｘ１およびＳｃＮｈｘ１の
Ｃ末端領域はどちらも高い程度のホモロジーを示さないことに注目することが重
要である（図６Ａ−Ｃ）。

【００６８】 哺乳動物Ｎａ^＋／Ｈ^＋対向輸送体の特徴は、アミロライドによるそれらの阻害
である。推定アミロライド結合部位（^１６３ＤＶＦＦＬＦＬＬＰＰＩ^１７３）（
配列番号４）は、ヒトＮＨＥ１対向輸送体遺伝子における点突然変異体によって
定義された（Counillon, L.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:4508-4512 (1
993)）。ＡｔＮｈｘ１、ＨｓＮｈｅ−６およびＳｃＮｈｘ１はほとんど同一の配
列を有する（図６）。しかしながら、酵母培養体におけるＮｈｘ１またはＡｔＮ
Ｈｘ１の活性をアミロライドで阻害する試みは不成功に終わった。

【００６９】 酵母ｎｈｘ１突然変異体のハイグロマイシンに対する極度の感受性は、クロー
ン化したアラビドプシスＡｔＮＨＸ１ ＯＲＦが酵母においてＮａ^＋／Ｈ^＋交換
機能を提供するかどうかの試験を可能にした。ベクターｐＡＤ４（Ballester, R
.,ら, Cell, 59:681-686 (1989)）を野生型およびｎｈｘ１系統中に導入した。
プラスミドｐＲＧ３０８；ＡＤＨ；ＡｔＮＨＸ１を示されるようにｎｈｘ１突然
変異体中に導入した。示された系統の５倍連続希釈（１０^５細胞で開始する）を
３０℃で２日間、ＹＰＤ（−）または０．０５ｍｇ／ｍｌハイグロマイシンを補
足したＹＰＤ（＋）上で培養した。同じ系統の連続希釈をＡＰＧ培地（材料およ
び方法を参照）（−）または０．４Ｍ ＮａＣｌを補足したＡＰＧ上で培養した
（Rodriguez-Navarro, A.およびRamos, J., J. Bacteriol., 159:940-945 (1984
)）。

【００７０】 ＡｔＮＨＸ１遺伝子は、ｎｈｘ１突然変異体のハイグロマイシン感受性を抑制
することができる。ＡｔＮＨＸ１遺伝子はまた、Ｋ^＋利用性が減少した条件下に
おいてのみ、ｎｈｘ１突然変異体のＮａＣｌ感受性を抑制した。しかしながら、
ＡｔＮＨＸ１は、ＡＶＰ１−Ｄ遺伝子を過剰発現している二重突然変異体ｅｎａ
１ ｎｈｘ１のＮａ^＋感受性増殖表現型を救済することができなかった。

【００７１】 実施例４：機能増大酵母ＡｔＮＨＸ突然変異体の作成 材料および方法 クローン化遺伝子に突然変異を誘発させて突然変異ライブラリー作成すること
によって、耐塩性を強化するＡｔＮＨＸの機能増大突然変異体をｅｎａ１酵母に
おいて作成した。該ライブラリーを用いて、塩感受性突然変異体ｅｎａ１および
強化した耐塩性表現型を有するクローンを形質転換した。

【００７２】 また、アラビドプシス・ゲノム・イニシアティブ（ＡＧＩ）によって報告され
たように、ＡｔＮＨＸ１遺伝子に対して類似性を示す他の遺伝子を突然変異体酵
母において発現させて機能増大突然変異体を形成させた。これらのＡｔＮＨＸ１
相同物のうちいくつかは原形質膜輸送体であると考えられ、それゆえ、酵母にお
けるそれらの機能はしばしばｐＨ依存性であり、成功するためにスクリーニング
に使用される培地の正確な組成およびｐＨを必要とする。原形質膜輸送体の同定
は、減少したナトリウム取り込みのために強化した耐塩性を有する植物を操作す
るのを助ける。さらに、酵母における植物ｃＤＮＡ発現ライブラリーを用いて、
ＮａＣｌ解毒に関与する輸送体の他のファミリーを同定する。

【００７３】 ＡｔＮＨＸの機能増大突然変異体を作成するために、Stratgene（Epicurian C
oli XL1-Red competent Cells Cat#200129）によって開発されたランダム突然変
異を導入する方法を使用した。該方法は、３つの一次ＤＮＡ修復経路において欠
陥のある系統中へのクローン化遺伝子の伝達を含む。該系統におけるランダム突
然変異率は、野生型よりも約５０００倍高い。突然変異したＡｔＮＨＸ遺伝子の
ライブラリーをｅｎａ１酵母突然変異体中に形質転換し、耐塩性についてスクリ
ーンした。酵母形質転換は、Schiestlおよび共同研究者によって記載されたとお
りに行った（Gietz, D.ら, Nucl. Acid Res. 20:1425 (1992), 出典明示によっ
てその全体として本明細書の一部とされる）。ＸＬ１−Ｒｅｄランダム突然変異
誘発法に対する別法は、Finkおよび共同研究者によって記載されたＰＣＲアプロ
ーチである（Madhani, H.D.ら, Cell, 91:673-684 (1997)）。

【００７４】 ＡｔＮＨＸ１相同物を試験するために、ＡｔＮＨＸ１に用いたのと同じ系統お
よび条件（Gaxiola, R.A.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:1480-1485 (199
9)）を最初に用いた。しかしながら、これらのスクリーニング系統および／また
は条件が作用しなかったならば、新しい系統および／または条件を決定する。原
形質膜ＡｔＮＨＸ１相同物を扱う場合、アッセイ培地のｐＨ条件は非常に重要で
あることが見出された。

【００７５】 結果 エー・タリアナ機能増大突然変異遺伝子ＡＶＰ１−Ｄの過剰発現は、酵母にお
ける細胞内解毒能力を増大する（Gaxiola, R.A.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. US
A, 96:1480-1485 (1999)）。後者はＨ^＋の液胞コンパートメント中への流入が増
加し、それゆえ、Ｎｈｘ１交換体を介するＮａ^＋封鎖を改善することに起因する
と仮定される（しかしながら、かかる仮説によって限定されるものではない）。

【００７６】 酵母カチオン封鎖研究の結論 上記の酵母研究は、酵母における細胞内Ｎａ^＋封鎖のためのプレ−液胞ｐＨの
重要性の証拠を提供する。植物Ｈ^＋−ピロホスファターゼ（Ａｖｐ１）の過剰発
現は、機能的な塩化物チャンネル（Ｇｅｆ１）およびＮａ^＋／Ｈ^＋交換体（Ｎｈ
ｘ１）を含有する系統においてのみ、酵母に耐塩性を与える。 これらのデータは、Ｎｈｘ１ Ｎａ^＋／Ｈ^＋交換体が液胞型ＡＴＰアーゼおよ
びＧＥＦ１アニオンチャンネルと協力して作用してプレ−液胞コンパートメント
中でカチオンを封鎖するモデルを支持する。いくつかの研究は、プレ−液胞コン
パートメントが原形質膜および後期ゴルジの両方に由来しうることを示唆する。
これらの小胞はおそらく、液胞の構築または負荷物の該オルガネラへのデリバリ
ーに関与する。これらのプレ−液胞小胞が封鎖によってカチオンを解毒し、それ
により、細胞質および他のオルガネラ中のそれらの濃度を低下させると予想する
ことが妥当である。

【００７７】 本明細書に記載の酵母系は、耐塩性における別種の異種蛋白質：塩化物チャン
ネル、Ｈ^＋ポンプ、およびＮａ^＋／Ｈ^＋交換体および他のカチオン／Ｈ^＋交換体
またはカチオン／ビカルボネート共輸送体の機能的評価を可能にする。該系は丈
夫で柔軟である。アラビドプシス塩化物チャンネルの機能（Gaxiola, R.A.ら, P
roc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:4046-4050 (1998), Hechenberger, M.ら, J. B
iol. Chem., 271:33632-33638 (1996)）、Ｈ^＋ポンプ、およびＮａ^＋／Ｈ^＋交換
体は対応する酵母突然変異体においてアッセイすることができる。ＡｔＮＨＸ１
が酵母ｎｈｘ１突然変異体の全ての表現型を抑制することができないにもかかわ
らず、それがＡｔＮＨＸ１と酵母ＮＨＸ１との間のＤＮＡホモロジーと関係した
いくつかの表現型を抑制するという事実は、植物遺伝子が酵母相同物と同様の機
能を実行することを示す。ＡｔＮＨＸ１遺伝子がハイグロマイシンに対するｎｈ
ｘ１突然変異体の感受性を抑制するが、弱いＮａ^＋解毒表現型を提供するだけで
あるという観察は、２つの生物における輸送体の特異な調節または別個のカチオ
ン輸送選択性のいずれかの結果であった。

【００７８】 塩によるＡｔＮＨＸ１の調節および植物遺伝子の酵母ｎｈｘ１突然変異体抑制
能は、カチオンが酵母および植物において解毒されるメカニズムが類似しうるこ
とを示唆する。実際、以前の研究は、耐塩性植物における液胞のナトリウム蓄積
が、液胞型Ｈ^＋−ＡＴＰアーゼ（Ｖ−ＡＴＰアーゼ）および／またはＨ^＋−輸送
性ピロホスファターゼによって生じたプロトン駆動力を利用する液胞膜Ｎａ^＋／
Ｈ^＋対向輸送体によって媒介されうることを示唆した（V-Ppase; refs. Barkla,
B.J.ら, Symp. Soc. Exp. Biol., 48:141-153 (1994), Zhen, R.G.ら, The Mol
ecular and Biochemical Basis of Pyrophosphate-Energized Proton Transloca
tion at the Vacuolar Membrane (Academic, San Diego), Kirsh, Mら, Plant M
ol. Biol., 32:543-547 (1996)）。

【００７９】 ｇｅｆ１およびｎｈｘ１突然変異体の両方がハイグロマイシンに対して高感受
性であるという本明細書に記載の知見は、ハイグロマイシンに対する耐性のレベ
ルが液胞およびプレ−液胞オルガネラの機能に依存することを示す。Ｋ^＋取り込
みに欠損のある酵母突然変異体（ｔｒｋ１）はハイグロマイシンに対して高感受
性であり（Madrid, R.ら, J. Biol. Chem., 273:14838-14844 (1998)）、減少し
たＫ^＋取り込みは、原形質膜ポテンシャルを過分極化し、ハイグロマイシンのよ
うなアルカリカチオンの取り込みを駆動する。原形質膜Ｈ^＋−ＡＴＰアーゼのＨ ^＋ ポンプ輸送活性を減少する突然変異、Ｐｍａｌは、原形質膜ポテンシャルを脱
分極し、ハイグロマイシンに対する耐性を与える（McCusker, J.H.ら, Mol. Cel
l. Biol., 7:4082-4088 (1987)）。したがって、液胞およびプレ−液胞コンパー
トメントのｐＨまたは膜ポテンシャルに影響を及ぼすｇｅｆ１またはｎｈｘ１の
ような突然変異は、ハイグロマイシンのコンパートメンテーションに影響を及ぼ
すことが予想されうる。

【００８０】 アップレギュレートされた液胞Ｈ^＋−輸送性ポンプ活性を有するトランスジェ
ニック植物 塩ホメオスタシスにおけるアラビドプシスＡｔＮＨＸ１遺伝子の役割に関する
さらなる支持は、その発現が塩ストレス植物において誘導されるという観察によ
って提供される（Gaxiola, R.A.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:1480-148
5 (1999)）。特に、アラビドプシス・タリアナは、これらの遺伝子の過剰発現が
植物において耐塩性をもたらすということを明らかとするために宿主モデル植物
として使用されてきた。近年の報告は、トランスジェニックアラビドプシス・タ
リアナにおけるＡｔＮＨＸ１遺伝子の過剰発現が短日サイクル条件下、２００ｍ
Ｍ ＮａＣｌおよび１／８Ｍ．Ｓ．塩で給水された土壌中において維持された生
長を促進することを示す（Apse, M.ら, Science, 285:1256-1258 (1999)）。１
／８Ｍ．Ｓ．塩のあらゆる添加がＮａＣｌストレスの厳しさを軽減する２．５ｍ
Ｍカリウムを提供すること、短日サイクルが酸化的ストレスを軽減することに注
目する価値がある。

【００８１】 実施例５：塩ストレス植物におけるＡｔＮＨＸ１遺伝子の強化された発現 材料および方法 エー・タリアナ植物（生態型コロンビア）をシュークロース不含の非補足植物
栄養寒天（Haughn, G.W.およびSomerville, C., Mol. Gen. Genet., 204:430-43
4 (1986)）上、１９℃で１５日間、連続的照明下で無菌培養した。ＮａＣｌまた
はＫＣｌを２５０ｍＭの最終濃度まで加え、植物を６時間インキュベートした。
塩処理および非処理植物の組織由来の全ＲＮＡを単離し（Niyogi, K.K.およびFi
nk, G.R., Plant Cell, 4:721-733 (1992)）、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ（Amersham）膜
をプラスミドｐＲＧ３０８由来の^３２Ｐ−標識化ＤＮＡプローブでハイブリダイ
ズした。ハイブリダイゼーションは６５℃で一晩行った。０．２％標準セーライ
ンクエン酸塩（ＳＳＣ）／０．１％ＳＤＳを用いて６５℃で洗浄を行った（Ause
bel, F.ら, Curr. Protocols in Mol. Biol. (Wiley, NY) (1988)）。１８Ｓプ
ローブをローディング対照として用いた（Unfried, I.ら, Nucleic Acids Res.,
17:7513 (1989)）。ＭＡＣＢＡＳ２．４プログラムを用いてＲＮＡの相対量を
定量した。

【００８２】 結果 ＮａＣｌストレスはＡｔＮＨＸ１ ｍＲＮＡレベルを４．２倍増加したが、Ｋ
Ｃｌはたった２．８倍の増加を促進した。ナトリウムによって生じたｍＲＮＡレ
ベルにおけるこの増加は、酵母ＮＨＸ１遺伝子についての記載（Nass, R.および
Rao, R., J. Biol. Chem., 273:21054-21060 (1998)）と似ている。ＲＮＡ組織
ブロットはＡｔＮＨＸ１とハイブリダイズした。２５０ｍＭ ＮａＣｌまたはＫ
Ｃｌに６時間曝露した１５日齢植物および塩の不在下で培養した対照由来の全Ｒ
ＮＡの１０μｇを変性ホルムアルデヒドゲル上の電気泳動に付した。ブロットを
ＡｔＮＨＸ１ ＯＲＦの内部のプローブとハイブリダイズした。１８Ｓリボソー
ムプローブをローディング対照として用いた。

【００８３】 実施例６：ＡｔＮＨＸ１を過剰発現しているトランスジェニック植物の耐塩性 材料および方法 アグロバクテリウムに媒介される植物形質転換を用いて、ＡｔＮＨＸ１を過剰
発現するトランスジェニック植物を作成した。トランスジェニックＡｔＮＨＸ１
は、ＣａＭＶの３５Ｓプロモーターの二重タンデムエンハンサーを用いて発現し
た（Topfer, Rら、Nucl. Acid. Res., 15:5890 (1987)）。

【００８４】 １５個の野生型植物および１５個の３５ＳＡｔＮＨＸ１トランスジェニックを
１２時間−日光サイクルで２０日間培養した。該期間の間、希釈栄養溶液（１／
８Ｍ．Ｓ．塩）を用いて５日毎に植物に給水した。２１日目に２００ｍＭ Ｎａ
Ｃｌを撒水溶液に加え、３３日目に３００ｍＭ ＮａＣｌを含有する栄養溶液を
用いて植物に給水した。最後のＮａＣｌ処理後１０日目に植物を写真撮影した。 結果 トランスジェニック植物は、３００ｍＭ ＮａＣｌで給水したとき、野生型対
照よりもそれほど有意に影響されないことが見出された。

【００８５】 実施例７：３５ＳＡＶＰ１を過剰発現しているトランスジェニック植物の耐塩
性 材料および方法 ３５Ｓプロモーターの二重タンデムエンハンサーを用いてＡＶＰ１野生型遺伝
子を過剰発現するように、トランスジェニックアラビドプシス・タリアナ植物を
操作した（Topfer, R.ら, Nucl. Acid Res., 15:5890 (1987)）。ＡＶＰ１は、
アラビドプシス由来のピロホスフェートによってエネルギーを与えられる液胞膜
プロトンポンプをコードする（Zhen, R.G.ら, J. Biol. Chem., 272:22340-2234
8 (1997)）。以前の研究は、ＡＶＰ１遺伝子がアラビドプシスのゲノム中の単一
コピーに存在することを示すが（Kim, Y.ら, Plant Physiol., 106:375-382 (19
94)）、染色体１上のＡＶＰ１に同一ではないが相同の配列は、アラビドプシス
・ゲノム・イニシアティブ（ＡＧＩ）によって仮にＢＡＣ Ｆ９Ｋ２０上のＯＲ
Ｆ Ｆ９Ｋ２０．２と呼ばれていた。

【００８６】 アグロバクテリウムに媒介される植物形質転換を用いて、ＡＶＰ１を過剰発現
するトランスジェニック植物を作成した。トランスジェニックＡＶＰ１は、Ｃａ
ＭＶの３５Ｓプロモーターの二重タンデムエンハンサーを用いて発現した（Topf
er, Rら、Nucl. Acid. Res., 15:5890 (1987)）。１５個の野生型植物および１
５個の３５ＳＡＶＰ１トランスジェニックを２４時間−日光サイクルで１６日間
培養した。該期間の間、希釈栄養溶液（１／８Ｍ．Ｓ．塩）を用いて４日毎に植
物に給水した。１７日目に２００ｍＭ ＮａＣｌを撒水溶液に加え、２７日目に
２５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する栄養溶液を用いて植物に給水した。最後のＮａ
Ｃｌ処理後１０日目に植物を写真撮影した。実施例６に記載と同一条件および処
理を用いた。

【００８７】 結果 ３５ＳＡＶＰ１植物の５つの異なる系統は、Ｔ２段階において野生型植物と比
べて強化した耐塩性を示した。しかしながら、最も著しい表現型はホモ接合体Ｔ
３植物において明白であった。これらのトランスジェニック植物は野生型植物よ
り大きい。さらに、ホモ接合体３５ＳＡＶＰ１植物は、２４時間光計画において
培養されたとき、２５０ｍＭ ＮａＣｌおよび１／８Ｍ．Ｓ．塩の存在下で維持
された生長を示した。３５ＳＡＶＰ１植物を短日サイクル条件下（１２時間日光
サイクル）で培養した場合、３００ｍＭ ＮａＣｌおよび１／８Ｍ．Ｓ．塩の存
在下での維持された生長が観察された。

【００８８】 実施例８：水耕溶液中における野生型植物および３５ＳＡＶＰ１トランスジェ
ニック植物の生長 標準的な農業用の真水の入手の可能性の減少は、別の農業分野の利用を強いる
。耐塩性作物を用いて、海水を用いる水耕栽培の利用が作物生産における新たな
時代を創造すると考えられる。水耕栽培は、植物生長を増進し、ストレスのない
根およびシュート材料を提供すると報告されている（Gibeaut, D.M.ら, Plant P
hysiol., 317-319 (1997)）。水耕栽培の別の重要な利益は、土壌中よりも正確
にイオン組成を改変できることである。これらの利益は、塩ストレスの生理学的
研究に重要であった。 アラビドプシス植物の水耕栽培の条件が確立され、培地中のＮａＣｌ濃度の上
昇におけるそれら反応が試験された。

【００８９】 材料および方法 一の試験において、水耕栽培した野生型および３５ＳＡＶＰ１トランスジェニ
ック植物を作成した。野生型および３５ＳＡＶＰ１トランスジェニック植物を溶
液培養において、１２時間光サイクルで６５日間生長させた。 別の試験において、野生型および３５ＳＡＶＰ１トランスジェニック植物を溶
液培養において、１２時間光サイクルで２０日間生長させた。４日毎に５０ｍＭ
の増加によってＮａＣｌ濃度を段階的に増加させることを２１日目に開始した。
２００ｍＭ ＮａＣｌの存在下で４日後に、植物を写真撮影した。

【００９０】 また別の水耕試験において、トランスジェニック植物を海洋中に存在する完全
なイオン組成を含有する市販の海水処方で攻撃した。３５ＳＡＶＰ１、３５ＳＡ
ｔＮＨＸ１単一および二重トランスジェニックを野生型アラビドプシス・タリア
ナ植物と一緒に水耕条件下で４週間、短日照明サイクル（Gibeaut, D.M.ら, Pla
nt Physiol., 317-319 (1997)）において培養した。次いで、４日毎に、Ｔｒｏ
ｐｉｃ Ｍａｒｉｎ海塩（worldwide webのthatpetplace.com）の５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌの同等量を加えた。該人工海水混合液は、本物の海水中に存在する他の多量
および微量の要素を含有する。生長をモニターし、生理学的パラメーター、例え
ば、ナトリウム含量および分布を決定した。

【００９１】 結果 野生型および３５ＳＡＶＰ１トランスジェニック植物を水耕栽培した場合、野
生型および３５ＳＡＶＰ１トランスジェニック植物の間で根、葉および茎の大き
さの相違が劇的であることが見出され、３５ＳＡＶＰ１トランスジェニック植物
部分が非常に大きかった。 ＮａＣｌ濃度を４日毎に５０ｍＭずつ段階的に増加した場合（Apse, M.ら, Sc
ience, 285:1256-1258 (1999)）、３５ＳＡＶＰ１トランスジェニック植物は２
００ｍＭ ＮａＣｌの存在下で健康であるようであったが、野生型対照は葉およ
び茎において著しい有害な影響を示した。 野生型アラビドプシス・タリアナ植物と一緒に水耕条件下で４週間、短日照明
サイクル（Gibeaut, D.M.ら, Plant Physiol., 317-319 (1997)）において培養
し、次いで４日毎に、Ｔｒｏｐｉｃ Ｍａｒｉｎ海塩の５０ｍＭ ＮａＣｌの同等
量で攻撃された３５ＳＡＶＰ１、３５ＳＡｔＮＨＸ１単一および二重トランスジ
ェニックは、海塩溶液中で生長することが見出された。野生型アラビドプシス・
タリアナ植物は生育しなかった。

【００９２】 実施例９：トマト植物におけるアラビドプシス・タリアナプロトン輸送体の過
剰発現の効果 より農業上重要な植物、トマト植物におけるこれらのアラビドプシス・タリア
ナプロトン輸送体（ＡＶＰ１およびＡｔＮＨＸ１）の過剰発現の効果を調べた。
トマト植物の耐塩性の増加はおそらく重要な経済的な影響を有すると考えられる
。 ＡＶＰ１およびＡｔＮＨＸ１のトマト相同物を単離し、それらを過剰発現させ
るために対応するキメラを構築した（Bidone, S.ら, Eur. J. Biochem., 253: 2
0-26 (1998); Burbidge, A.ら, J. Exper. Botany, 48:2111-2112 (1997)）。カ
ルスのアグロバクテリウムによって媒介される感染によって遺伝子を導入した。
組織培養法を用いて形質転換植物を再生した。植物を耐塩性ならびに生理学的パ
ラメーター、例えば、ナトリウム含量および分布についてアッセイした。

【００９３】 ３５Ｓ ＡＶＰ１および３５Ｓ ＡｔＮＨＸ１構築物でのトマト形質転換は、Mc
Cormickによって記載されたとおりに行った (McCormick, S., Transformation o
f tomato with Agrobacterium tumefaciens. Plant Tissue Culture Manual, pp
. 1-9, Lindsey, K. (編), Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Neth
erlands (1991)）。Ｔ０およびＴ１トランスジェニックをポリメラーゼ連鎖反応
およびＤＮＡゲルブロッティングによって、ＡＶＰ１およびＡｔＮＨＸ１導入遺
伝子の存在およびコピー数について分析した。ヘテロ接合体およびホモ接合体植
物は、Ｔ１種子内で各トランセンド（transcend）の分離分析後に同定された。
ホモ接合体を、耐塩性ならびに生理学的パラメーター、例えば、ナトリウム含量
および分布についてアッセイした。ＡＶＰ１およびＡｔＮＨＸ１相同物に存在す
る保存配列に基づく縮重したオリゴを設計した。これらの縮重プライマーをトマ
ト由来のポリ（Ａ）＋ＲＮＡから作成されたｃＤＮＡを用いるＲＴ−ＰＣＲ反応
に用いた。得られたＰＣＲフラグメントをプローブとして用いて全長ｃＤＮＡク
ローンを市販のライブラリー（すなわち、Stratagene Cat#936004）から単離し
た。同様の策法がCabocheおよび共同研究者によって記載された（Quesada, A.ら
, Plant Mol. Biol., 34:265-274 (1997)）。

【００９４】 結果 陽性試験結果は、本明細書に記載の封鎖モデルが重要作物にも適用可能である
ことを示す。 図７は、塩を含んだ土壌中で生長した野生型植物（ＷＴ）対ＡＶＰ−１を過剰
発現している代表的なトランスジェニック植物（１’および２’）のＮａ^＋およ
びＫ^＋含量のグラフである。５つの野生型植物（ＷＴ）および２つのＡＶＰ−１
過剰発現トランスジェニック系統（１’および２’）を土壌において１０時間明
／暗サイクルで培養した。希釈栄養溶液（１／８ＭＳ塩）を用いて６週間、植物
に給水し、次いで、ＮａＣｌを補足した希釈栄養溶液を用いて給水した。ＮａＣ
ｌの濃度は１００ｎＭで開始し、４日毎に１００ｍＭずつ増加させた。写真は、
３００ｍＭ ＮａＣｌの存在下で１０日目の植物に相当する。２００ｍＭ ＮａＣ
ｌの存在下で２４時間後に植物の地上部を採取し、それらの新鮮重量を測定した
。７５℃で４８時間後、乾燥重量を測定した。Ｎａ^＋およびＫ^＋含量を原子吸光
によって決定した。図４のグラフの値は、平均＋／−ＳＥ（ｎ＝４）である。グ
ラフからわかるように、トランスジェニック系統（１’および２’）におけるＮ
ａ^＋およびＫ^＋含量は野生型相対物よりも有意に高かった。

【００９５】 図８は、図４の２’の３５ＳＡＶＰ−１トランスジェニック液胞膜小胞中への
カルシウムの取り込み（四角）対図４の野生型（ＷＴ）から得られた小胞中への
カルシウム取り込みのグラフである。野生型植物（白抜き丸）および図４の２’
系統由来のトランスジェニック植物を９週間、１０時間光サイクルで水耕栽培し
た。液胞膜小胞を２５０ｍＭソルビトール、２５ｍＭ ＢＴＰ−Ｈｅｐｅｓ ｐＨ
８．０、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｎＭ ＭｇＳＯ_４および１０μＭ Ｃａ^＋＋を
含有するバッファーに加えた。該混合物を２０℃で１０分間インキュベートした
後、２００μＭ ＰＰｉを加えて反応を開始した。Ｃａ^＋＋イオノホアＡ２３１
８７を５μｇ／ｍｌの最終濃度まで加えてＣａ^＋＋勾配を消散させた。アリコー
ト（２００μｌ）を所定の回数ろ過し、記載のように冷バッファーで洗浄した（
11）。グラフによって明らかにされるように、２’系統由来のトランスジェニッ
ク植物は野生型植物よりも大きいカルシウム取り込みを有する。

【００９６】 上記のデータは、ＡＶＰ−１を過剰発現しているトランスジェニック植物が強
化したＨ^＋ポンプ輸送能力をその液胞膜に有し、強化したＨ^＋供給はＨ^＋駆動性
イオン輸送体の作用によって液胞中により多くのイオン蓄積をもたらすという仮
説と一致する。さらに該理論を支持するために、野生型およびトランスジェニッ
ク液胞膜小胞のＣａ^＋＋取り込み量を決定した。 Ｃａ^＋＋がＣａ^＋＋／Ｈ^＋対向輸送体を介して植物液胞に侵入することは、十
分に明らかにされている（K. S. Schumaker, H. Sze, Plant Physiol. 79, 1111
-1117 (1985)）。さらに、アラビドプシス・タリアナＣａ^＋＋／Ｈ^＋対向輸送体
ＣＡＸ１およびＣＡＸ２をコードしている遺伝子が単離および特徴付けられた（
K. D. Hirschi, R.-G. Zhen, K. W. Cunningham, P. A. Rea, G. R. Fink, Proc
. Natl. Acad. Sci. USA 93, 8782-8786 (1996)）。図８は、３５ＳＡＶＰ−１
トランスジェニック液胞膜小胞中のＣａ^＋＋取り込みが野生型から得られる小胞
中よりも３５％高いことを示す。Ｃａ^＋＋イオノホアＡ２３の適用は、４５Ｃａ ^＋＋ 数をバックグラウンドレベルまで低下させ、小胞の狭さを示した（図８）（
K. S. Schumaker, H. Sze, Plant Physiol. 79, 1111-1117 (1985)）。

【００９７】 かかる理論に限定されないが、ＡＶＰ−１遺伝子を過剰発現しているトランス
ジェニック植物の強化した耐乾性および凍結耐性と一致するモデルを図９Ａおよ
び図９Ｂに示す。該モデルは、トランスジェニック植物の液胞におけるＡＶＰ−
１ポンプの数の増加がどのようにより多くのＨ^＋を提供することができ、二次的
輸送体が液胞の内腔中により多くのカチオンを輸送することを可能にするのかを
示す。より多量のカチオンは、低土壌水分ポテンシャルに耐性のある植物を与え
るより大きな水分保持能力をもたらすより大きな浸透圧を提供する。

【００９８】 実施例１０：３５Ｓ ＡＶＰ１および３５Ｓ ＡｔＮＨＸ１での二重トランスジ
ェニック植物 ピロホスフェートによってエネルギーを与えられる液胞膜プロトンポンプＡＶ
Ｐ１の過剰発現は、おそらく液胞の内腔におけるＨ^＋の利用性を増加し、ＡｔＮ
ＨＸ１ Ｎａ^＋／Ｈ^＋対向輸送体がこれらのＨ^＋を使用してＮａ^＋カチオンを液
胞中に封鎖する。したがって、これらの輸送体のより高い発現がおそらく、液胞
の封鎖能を最大にする。

【００９９】 遺伝子ＡＶＰ１およびＡｔＮＨＸ１の両方を過剰発現するトランスジェニック
アラビドプシス植物を作成するために、Ｔ３ ３５Ｓ ＡＶＰ１植物を雌として使
用し、Ｔ３ ３５Ｓ ＡｔＮＨＸ１植物を雄として使用する。雌性植物を除雄し、
ドナー植物の新たに開花した花から葯を採取した。これらの葯を用いて、葯を柱
頭に接触させることによって除雄した植物を受粉する。採取時のいずれかの混同
を回避するために、受粉した花を標識し、同じ雌性植物由来のいずれかの開花し
たまたは開花しないままの花を除去する。５０％次亜塩化ナトリウム溶液を用い
て採取した種子を滅菌し、５分間、勢いよく混合し、水で入念にリンスする。滅
菌した種子を軟らかい寒天中、４℃で一晩保存する。次いで、それらを固形カナ
マイシン−ハイグロマイシン選択培地上にまく。３５Ｓ ＡＶＰ１構築物は、植
物中のカナマイシン耐性を与えるネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ遺
伝子を有し、一方、３５Ｓ ＡｔＮＨＸ１構築物は、植物中のハイグロマイシン
耐性を与える修飾されたハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼを有する
。耐性幼植物を土壌および水耕培地中に移植して、耐塩性表現型について試験す
る。

【０１００】 エー・タリアナ機能増大突然変異遺伝子ＡＶＰ１−Ｄ（Zhenら, J. Biol. Che
m., 272:22340-22348 (1997)）を過剰発現するためのトランスジェニックアラビ
ドプシス・タリアナ植物を、上記の３５Ａプロモーターの同じ二重タンデムエン
ハンサーを用いて操作する（Topfer, R.ら, Nucl. Acid Res., 15:5890 (1997)
）。機能増大突然変異遺伝子を過剰発現している植物は、強化された表現型を示
す。これらの植物は、３５Ｓ ＡＶＰ１、３５Ｓ ＡｔＮＨＸ１単一および二重ト
ランスジェニックと同時に特徴付けられる。エー・タリアナ機能増大突然変異遺
伝子ＡＶＰ１−Ｄを３５ＳプロモーターおよびＣａＭＶのポリアデニル化シグナ
ルを有するプラスミドｐＲＴ１０３中にサブクローン化する（Topfer, R.ら, Nu
cl. Acid Res., 15:5890 (1997)）。キメラ３５Ｓ ＡＶＰ−Ｄ遺伝子を含有する
ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントをｐＢＩＢｈｙｇ中にサブクローン化する（Becker
, D., Nucl. Acid Res., 18:203 (1990)）。得られるＴ−ＤＮＡベクターをアグ
ロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株ＧＶ３１
０１中にエレクトロポレーションによって形質転換し、その後のアラビドプシス
・タリアナ生態型コロンビアの真空浸透に用いる（Bechtold, N.ら, C.R. Jeanc
es Acad. Sci. Ser. III Sci. Vie, 316:1194-1199 (1993)）。組み込みをＴ３
植物のサザンブロットにおいて確認し、陽性Ｔ３植物のノーザンブロットにおい
て発現をモニターする。

【０１０１】 実施例１１：野生型および３５Ｓ ＡＶＰ１トランスジェニック植物の根由来
の液胞を用いる輸送体比較研究 研究は、３５Ｓ ＡＶＰ１トランスジェニック植物の液胞がピロホスフェート
に依存するより高いプロトン輸送活性を示すかどうかを決定するために計画され
た。これらの決定は、別々に水耕栽培された植物由来の根およびシュート組織を
用いて行われた。導入遺伝子は、３５Ｓプロモーターにもかかわらず組織特異的
調節を示す。

【０１０２】 野生型および３５Ｓ ＡＶＰ１トランスジェニック植物のＰＰＩ−依存性Ｈ^＋
転流活性を比較するために、上記の植物の根および葉由来のシールした液胞膜が
豊富な小胞を調製する。ReaおよびTurner (Rea, P.A.ら, Tonoplast Adenosine
Triphosphate and Inorganic Pyrophosphatase. Meth. Plant Biochem., pp. 38
5-405, Academic Press limited, London (1990))によって記載されたホモジェ
ナイゼーションおよび分画遠心分離に付す。Ｈ^＋転流は、Reaおよび共同研究者
によって記載されたように、液胞膜が豊富な小胞を含有するアッセイ培地中にお
いてアクリジンオレンジ（２．５μＭ）を膜貫通型ｐＨ差インジケーターとして
用いて蛍光測定によってアッセイする（Zhen, R.G.ら, J. Biol. Chem., 272:22
340-22348 (1997)）。アッセイ培地は、３００μＭトリス−ＰＰｉ、５０ｍＭ
ＫＣｌ、２．５μＭアクリジンオレンジ、５ｍＭトリス−Ｍｅｓ（ｐＨ８．０）
を含有する。小胞内酸性化は、１．３ｍＭ ＭｇＳＯ_４の添加によって引き起こ
され、２．５μＭのプロトノホア（protonophore）ＦＣＣＰの添加によって停止
する。各々、４９５および５４０ｎＭの励起発光波長を５ｎＭのスリット幅で用
いて蛍光を測定する（Zhen, R.G.ら, J. Biol. Chem., 269:23342-23350 (1994)
）。Ｈ^＋転流がＡＶＰ１駆動性であることを支持するためのさらなる試験は、特
異的阻害剤アミノメチレンジホスホネートの添加である（Zhen, R.G.ら, Plant
Physiol., 104:153-159 (1994)）。

【０１０３】 実施例１２：トランスジェニック植物の葉および茎におけるＮａ^＋／Ｋ^＋比の
決定 ＮａＣｌの毒性濃度はまず、ＮａＣｌが液胞中に区分されている完全に膨張し
た葉において増加した。ＮａＣｌへの曝露は、Ｋ^＋欠乏および生長阻害を導くＫ ^＋ 取り込みを崩壊または減少することができる（Wu, S.J.ら，Plant Cell, 8:61
7-627 (1996)）。減少したＫ^＋含量および高いＮａ^＋のサイトゾルでの結果は、
重要な酵素の阻害である。かかる酵素の例は、Ｋ^＋含量が低い場合、その活性が
Ｎａ^＋により感受性である酵母の３’（２’），５’−ビスホスフェートヌクレ
オチダーゼである（Murguia, J.R.ら、Science, 267:232-234 (1995)）。

【０１０４】 測定は、本明細書に記載のトランスジェニック植物がそれらの葉細胞またはど
こかにおいてＮａ^＋を封鎖できる増大した液胞の能力を有することを明らかにす
るために行ってもよい。葉および茎におけるＮａ^＋／Ｋ^＋比を決定するために、
水耕条件においてＳ野生型および３５Ｓ ＡＶＰ１／３５Ｓ ＡｔＮＨＸ１二重お
よび単一トランスジェニック（Gibeaut, D.M.ら, Plant Physiol., 317-319 (19
97)）を栽培する。ＮａＣｌを５０ｍＭで開始し、２５０ｍＭまでの段階法にお
ける生長培地に加える（Apse, M.ら, Science, 285:1256-1258 (1999)）。ポイ
ント毎に、処理植物のロゼットおよび茎を収集し、それらの重量を測定する。試
料を８０℃のオーブンで乾燥させ、それらの乾燥重量を測定する。乾燥試料を所
定容量の水中で沸騰させ、それらのＮａ^＋およびＫ^＋含量を原子吸光によって決
定する（Apse, M.ら, Science, 285:1256-1258 (1999); Gaxiola, R.ら, Embo J
., 11:3157-2164 (1992)）。

【０１０５】 実施例１３：３５Ｓ ＡＶＰ１トランスジェニック植物の細胞が大きいので、
またはそれらはより多くの細胞を有するので、またはその両方の理由により、３
５Ｓ ＡＶＰ１トランスジェニック植物がより大きいかどうかの決定 シュート分裂組織を標識するインデックスを野生型植物のそれと比較する。葉
、根および茎の細胞を測定およびカウントする生態学的および解剖学的観察を行
う。３５Ｓ ＡＶＰ１トランスジェニック植物はより多くの細胞を有するので、
それらがより大きいかどうかを決定するために、それらのシュート分裂組織を標
識するインデックスを野生型植物のそれと比較する。

【０１０６】 ＤＮＡ合成または細胞増殖を測定するために、チミジンの代わりにＤＮＡ中に
組み込むことのできる５−ブロモ−２’−デオキシ−ウリジン（ＢｒｄＵ）を用
いてもよい。ＢｒｄＵをＤＮＡ中に組み込んだ細胞を、ＢｒｄＵモノクローナル
抗体に対するモノクローナル抗体および二次抗体として抗−マウスＩｇ−アルカ
リホスファターゼを用いて検出する。結合した抗−ＢｒｄＵモノクローナル抗体
を光学顕微鏡によって視覚化し、ＤＡＰＩ染色とＢｒｄＵ陽性間の比率を確立す
る。プロトコールは、Chiatanteおよび共同研究者 (Levi, M.ら, Physiol. Plan
t. 71:68-72 (1987)によって公表されたものを修飾したものであり、ＢｒｄＵ標
識および検出キットＩＩはBoehringer Mannheimから入手する。植物を異なる時
間、ＢｒｄＵ標識培地に曝露し、次いで、固定化、パラフィン包埋およびセクシ
ョン化をにMeyerowitzおよび共同研究者よって記載されたように行う（Drews, G
.ら, Plant Mol. Biol. Rep., 5:242-250 (1988)）。

【０１０７】 葉組織を観察するために、新鮮な組織を５％アガロース中に埋め込み、それら
をマイクロスライサーを用いて薄く切る。主要な根観察のために、幼植物を４時
間、５０％エタノール、５％酢酸および３．７％ホルムアルデヒド中室温で固定
し、勾配を低くしたエタノールシリーズ中でそれらを脱水し、キシレンでそれら
を浸透させ、パラフィンを用いてそれらを浸透させる。８μｍセクションを０．
０５％トルイジンブルーで染色し、顕微鏡下で細胞をカウントする。細胞の大き
さの視覚化および決定のための別法として、Greenbergおよび共同研究者によっ
て記載された方法（Rateら, The Plant Cell, 11:1695-1708 (1999)）を用いる
。

【０１０８】 実施例１４：輸送体における突然変異体の単離 遺伝学的アプローチは、複雑な生物学的特徴の分析において非常に力強い（Se
rrano, R., Crit. Rev. Plant Sci., 13:121-138 (1994)）。逆遺伝学は、植物
生物学者にとって非常に重要な新規な手段である。Sussmanおよび共同研究者（K
rysan, P.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:8145-8150 (1996)）によるタグ
付加されたノックアウトの良好なコレクションの作成は、アラビドプシスにおけ
る遺伝子破壊の分析のための非常に重要な道を開いた。

【０１０９】 ウィスコンシン大学マディソン校のアラビドプシス・ノックアウト・ファシリ
ティー（The Arabidopsis Knock-out Facility）（world wide web at biotech.
wisc.edu/NewServicesAndResearch /Arabidopsis）を用いて、Ｔ−ＤＮＡベクタ
ーｐＤ９９１で形質転換された６０４８０系統のアラビドプシス（生態型ＷＳ）
をＡｔＣＬＣ−ｃ、ＡｔＣＬＣ−ｄ、ＡＶＰ１、ＡｔＮＨＸ１およびそれらの相
同物内のＴ−ＤＮＡインサートの存在について検索する。上記のノックアウトの
表現型は、正常およびストレス条件下でのこれらの輸送体の生理学的役割の理解
の解明に役立つであろう。ノックアウト植物の最初の特徴付けは、それらの耐塩
性およびそれらのＮａ^＋／Ｋ^＋比の試験を包含する。交雑による二重ノックアウ
トの作成は、輸送体間の相互作用ならびに３５Ｓ ＡＶＰ１および３５Ｓ ＡｔＮ
ＨＸ１トランスジェニック植物の交雑の相互作用をさらに理解するのを助ける。

【０１１０】 アラビドプシスノックアウトを検索するために、ＰＣＲプライマーをウィスコ
ンシン大学のウェブサイトに詳述されるガイドラインにしたがって設計する。試
験プライマーをウィスコンシン大学マディソン校に送り、そこで６２ＰＣＲ反応
が行われ、それらがサザンブロット分析のために発明者らに送られる。陽性ＰＣ
Ｒ産物を配列決定する。配列がＴ−ＤＮＡが遺伝子内に挿入されていることを示
す場合、遺伝子特異的プライマーを別のＰＣＲ反応に付して、２２５個のうち９
つの可能なプールがノックアウトを含有することを決定する。目的のプールの同
定後、２５個の試験管の種子をＴ−ＤＮＡノックアウトを有する個々の植物につ
いてスクリーンする。

【０１１１】 実施例１５：植物細胞におけるカチオン解毒 本明細書に記載の研究は他の証拠と共に、酵母および植物がゴルジ網から液胞
への小胞の通行のための経路およびシグナルを共有することを強く示唆する（Ga
xiola, R.,ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:1480-1485 (1999); Marty, F.
, "The Biogenesis of Vacuoles: Insights from Microscopy. The Plant Vacuo
le, 1-42, Leigh, R.A.およびSanders, D., Academic Press, San Diego (1997)
; Bassham, D.C.ら, Plant Physiol, 117:407-415 (1998)）。

【０１１２】 理論に拘束されることは望ましくないが、本発明者によりおそらく、両方の系
において、プレ−液胞コンパートメントが毒性カチオンから細胞質を解毒する動
的存在であり、その負荷物を液胞にデリバリーするかまたは直接細胞外部へデリ
バリーすると考えられる。ｇｅｆｌ塩化物チャンネルおよびＮｈｘ１ Ｎａ^＋／
Ｈ^＋交換体の両方が、酵母プレ−液胞コンパートメントに局在した（Gaxiola, R
.A.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:1480-1485 (1999)）。酵母細胞におけ
るｇｅｆｌ−ＧＦＰキメラのイン・ビボでの作用がモニターされ、その局在性が
環境条件によって変化することが示された。さらに、４つのエー・タリアナＣＬ
Ｃ塩化物チャンネル遺伝子のうち２つ、ＣＬＣ−ｃおよび−ｄがｇｅｆ１突然変
異表現型の抑制能を有し、それは同様の局在性を意味することが示された（Gaxi
ola, R.A.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:4046-4050 (1998)）。

【０１１３】 どのように、どこで、該カチオン解毒が植物細胞中で行われるかを理解するた
めに、ＡＶＰ１、ＡｔＮＨＸ１およびＡｔＣＬＣ−ｃおよび−ｄのＧＦＰキメラ
の細胞内局在性（Hong, B.ら, Plant Physiol., 119:1165-1175 (1999)）をイン
・ビボでモニターする。また、共焦顕微鏡を用いて、異なる輸送体の共同局在性
を位置決定する。該目的のために、輸送体のＨＡ−タグ付加した形態または抗体
が研究下で必要とされる（Guiltinan, M.J.ら, Meth. Cell Biol., 49:143-151
(1995); Jauh, G. -Y.ら, Plant Cell, 11:1867-1882 (1999); Mullen, R.T.,ら
, Plant. J., 12:313-322 (1997)）。

【０１１４】 ＧＦＰ−キメラの構築のために、DavisおよびViestra（Davies, S.J., Viestr
a, R.D., "Soluble derivatives of green fluorescent protein (GFP) for use
in Arabidopsis thaliana, http:/ / brindabella.mrc-lmb.cam.ac.uk/IndexGF
P.html (1998)）によって報告されたエー・タリアナにおける改善された蛍光を
有する可溶性形態のＧＦＰを用いる。２つの型のＧＦＰキメラ、すなわち、天然
プロモーターの調節下のセットおよび３５Ｓプロモーターの調節下の別のセット
を作成する。ＧＦＰキメラを含有する得られたＴ−ＤＮＡベクターをアグロバク
テリウム・ツメファシエンス系統ＧＶ３１０１中にエレクトロポレーションによ
って形質転換し、アラビドプシス・タリアナ生態型コロンビアのその後の真空浸
透に用いる（Bechtold, N.ら, C.R. Jeances Acad. Sci. Ser. III Sci. Vie, 3
16:1194-1199 (1993)）。赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープタグ付加のために、
酵母用に設計されたが、酵母ベクター中に発現される植物遺伝子をタグ付加する
ように修飾されたＰＣＲ法を用いる。Futcherおよび共同研究者は、エピトープ
タグ（ＨＡ）の反復配列に直接隣接するＵＲＡ３酵母遺伝子を含有するベクター
を設計した（Schneider, B.L.ら, Yeast, 11:1265-1274 (1995)）。ＰＣＲによ
って、タグ−ＵＲＡ３−タグカセットを、得られるＰＣＲフラグメントが各末端
にて目的の遺伝子に対するホモロジーを有するように増幅される。次いで、酵母
におけるイン・ビボでの組換えを用いて、目的の植物ＯＲＦを有するプラスミド
へのＰＣＲキメラの組み込みを指示し、ＵＲＡ^＋表現型によって形質転換体を選
択する。５−フルオロ−オロチン酸の存在下で陽性形質転換体を培養するとき、
ＵＲＡ３遺伝子は「急に消える」。

【０１１５】 結論として、経済的に重要な作物における液胞型Ｖ−ＰＰアーゼの操作は、作
物改善のための重要な手段を提供することができた。耐乾性および耐凍性栽培変
種は、干ばつまたは最小限の降水量のために損害を受けた地域において、新規な
農業的アプローチを提供することができ、ならびに、予期しない霜（着氷性の雨
など）からの保護を農家に提供する。かかる作物はまた、幅広い種類の作物にと
って塩分を含みすぎると考えられる土壌においても生長することができる。

【０１１６】 本発明は、好ましい具体例に関して記載されるが、当業者は、付随の特許請求
の範囲に定義されるような本発明の精神または範囲を逸脱することなく種々の変
更および／または修飾が本発明に施されうることを容易に認めるであろう。本明
細書に引用した全ての引用文献は、出典明示により、個々の引用文献が詳細かつ
個別に出典明示により一部とされることを意図された場合と同範囲まで、本明細
書の一部とされる。

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】 図１Ａは、７週間、１０時間明／暗サイクルで水耕栽培した代
表的な（各１０個の植物のうち）野生型（ＷＴ）および２つの独立したトランス
ジェニック系統（１’および２’）の上から見た図である。

【図１Ｂ】 図１Ｂ（１）、１Ｂ（２）および１Ｂ（３）は、垂直植物栄養
寒天プレートの表面に水平に生育した図１Ａの代表的なＷＴ、１’および２’か
ら得られた代表的な５日齢幼植物の根および根毛の顕微鏡写真である。

【図１Ｃ】 図１Ｃは、野生型（ＷＴ）およびＡＶＰ−１を過剰発現してい
る２つの独立したトランスジェニック系統（１’および２’）から単離した膜フ
ラクションのイムノブロットである。

【図２】 図２は、水欠損ストレスに７日曝露後の代表的な野生型植物（Ｗ
Ｔ）対ＡＶＰ−１を過剰発現している代表的なトランスジェニク植物（１’およ
び２’）の上から見た図である。

【図３】 図３は、塩を含む土壌中で生長した野生型植物（ＷＴ）対ＡＶＰ
−１を過剰発現している代表的なトランスジェニック植物（１’および２’）の
透視図である。

【図４Ａ】 図４Ａは、酵母プレ液胞コンパートメントにてナトリウム封鎖
に関与した輸送体の作用モデルの図示である；Ｎｈｘ１（Ｎａ^＋／Ｈ^＋対向輸送
体）、Ｖｍａｌ（液胞膜Ｈ^＋−ＡＴＰアーゼ）、Ｇｅｆ１（酵母ＣＬＣ塩化物チ
ャンネル）、Ｅｎａ１（原形質膜Ｎａ^＋−ＡＴＰアーゼ）。

【図４Ｂ】 図４Ｂは、Ａｖｐ１（エー・タリアナ（A. thaliana）液胞型
ピロホスフェートによりエネルギーを与えられるプロトンポンプ）も包含する図
４Ａに示される酵母プレ液胞コンパートメントにてナトリウム封鎖に関与した輸
送体の作用モデルの図示である。

【図５】 図５Ａおよび図５Ｂは、野生型酵母系統およびナトリウム耐性に
影響を及ぼす種々の突然変異を有する酵母系統の細胞内Ｎａ^＋およびＫ^＋含量を
示す棒グラフであり、値は２つの測定値の平均であり、棒は標準偏差を示す。

【図６】 図６Ａ、６Ｂ、６Ｃは、対合する線Ａ−ＡおよびＢ−Ｂによって
つなげると、アラビドプシス（Arabidopsis）ＡｔＮＨＸ１（配列番号１）、ヒ
トＨｓＮＨＥ−６（配列番号２）および酵母ＳｃＮＨＸ１（配列番号３）由来の
ＮｈＸ１相同物の推定アミノ酸配列を並べた配列であり；一致する残基をブラッ
クボックスでかこみ、点線で配列のギャップを示し、配列上の＊はヒトＮＨＥ１
由来の推定アミロライド結合部位（^１６３ＤＶＦ−ＦＬＦＬＬＰＰＩ^１７３）（
配列番号４）を示す。

【図７】 図７は、塩を含む土壌中で生長させた野生型植物（ＷＴ）対ＡＶ
Ｐ−１を過剰発現している代表的なトランスジェニック植物（１’および２’）
のＮａ^＋およびＫ^＋含量の棒グラフである。

【図８】 図８は、図３の２’の３５ＳＡＶＰ−１トランスジェニック液胞
膜小胞中へのカルシウムの取り込み（四角）対図３の野生型（ＷＴ）から得られ
た小胞中へのカルシウム取り込みのグラフである。

【図９】 図９Ａおよび図９Ｂは、ＷＴ液胞中への蓄積に対する、プロトン
により駆動される機能を介する液胞中への固体のより高い蓄積の理論上のメカニ
ズムを示す図示である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ０９／６４４，０３９ (32)優先日 平成12年８月22日(2000．8．22) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ロバート・エイ・ガキシオラ アメリカ合衆国06250コネチカット州マン スフィールド・センター、アパートメント ３、マウント・ホープ・ロード264番 Ｆターム(参考） 2B030 AB04 AD04 CA15 CA17 CA19 4B024 AA08 CA03 CA04 DA01 DA12 EA04 GA11 HA20 4B065 AA72X AA88X AA88Y AB01 BA02 CA53

Claims (86)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 キメラプロモーターに作動可能に連結された液胞膜ピロホス
   フェート駆動性Ｈ^＋ポンプ遺伝子を含む遺伝子カセット。
2. 【請求項２】 液胞膜ピロホスフェート駆動性Ｈ^＋ポンプ遺伝子が外来性で
   ある請求項１記載の遺伝子カセット。
3. 【請求項３】 ３５Ｓプロモーターの２重タンデムエンハンサーに作動可能
   に連結された外来性の液胞膜ピロホスフェート駆動性Ｈ^＋ポンプ遺伝子を含むコ
   ーディング配列。
4. 【請求項４】 ３５Ｓプロモーターの２重タンデムエンハンサーに作動可能
   に連結され、さらに、マルチプルクローニング部位に作動可能に連結された外来
   性の液胞膜ピロホスフェート駆動性Ｈ^＋ポンプ遺伝子を含むポリヌクレオチド配
   列を含有する発現ベクター。
5. 【請求項５】 プロモーターに作動可能に連結された外来性の液胞膜ピロホ
   スフェート駆動性Ｈ^＋ポンプ遺伝子を含むポリヌクレオチド配列を含む耐乾性お
   よび耐凍性トランスジェニック植物。
6. 【請求項６】 請求項５記載の耐乾性および耐凍性トランスジェニック植物
   によって生産された種子。
7. 【請求項７】 請求項６記載の種子由来の子孫植物。
8. 【請求項８】 ３５Ｓプロモーターの２重タンデムエンハンサーに作動可能
   に連結された外来性の液胞膜ピロホスフェート駆動性Ｈ^＋ポンプ遺伝子を含むポ
   リヌクレオチド配列を含有する耐乾性および耐凍性トランスジェニック植物。
9. 【請求項９】 複数の３５Ｓプロモーターの２重タンデムエンハンサーに作
   動可能に連結された外来性の液胞膜ピロホスフェート駆動性Ｈ^＋ポンプ遺伝子を
   含むポリヌクレオチド配列であって、ここに、ピロホスフェート駆動性Ｈ^＋ポン
   プ遺伝子の数が、野生型植物と比べて耐乾性および耐凍性を生じるのに十分な数
   のピロホスフェート駆動性Ｈ^＋ポンプを液胞膜上に発現するのに足りるポリヌク
   レオチド配列を含有するトランスジェニック植物。
10. 【請求項１０】 植物中の液胞型ピロホスファターゼの発現を改変する外来
    性核酸で形質転換された１以上の植物細胞を含む、耐塩性のトランスジェニック
    植物。
11. 【請求項１１】 外来性核酸がＡＶＰ１をコードする請求項１０記載のトラ
    ンスジェニック植物。
12. 【請求項１２】 外来性核酸がＡＶＰ１の相同物をコードする請求項１１記
    載のトランスジェニック植物。
13. 【請求項１３】 ＡＶＰ１の相同物がタバコ、細菌、トマトまたはトウモロ
    コシから得られる請求項１２記載のトランスジェニック植物。
14. 【請求項１４】 ＡＶＰ１を過剰発現するように設計されたかまたは内在性
    ピロホスファターゼをダウンレギュレートするように設計された構築物中にＡＶ
    Ｐ１が存在する請求項１２記載のトランスジェニック植物。
15. 【請求項１５】 構築物が３５Ｓプロモーターの２重タンデムエンハンサー
    に作動可能に連結されたＡＶＰ１を含む請求項１４記載のトランスジェニック植
    物。
16. 【請求項１６】 ＡＶＰ１がトランスジェニック植物の野生型に対応する野
    生型植物に由来する請求項１２記載のトランスジェニック植物。
17. 【請求項１７】 ＡＶＰ１がトランスジェニック植物の野生型に対応しない
    野生型植物に由来する請求項１２記載のトランスジェニック植物。
18. 【請求項１８】 対応する非トランスジェニック植物の生長を阻害する塩濃
    度において生長するトランスジェニック植物。
19. 【請求項１９】 塩濃度が約０．２Ｍ〜約０．３Ｍである請求項１８記載の
    トランスジェニック植物。
20. 【請求項２０】 植物が対応する非トランスジェニック植物よりも大きい請
    求項１１記載のトランスジェニック植物。
21. 【請求項２１】 請求項１１記載のトランスジェニック植物のトランスジェ
    ニック子孫。
22. 【請求項２２】 請求項１１記載のトランスジェニック植物によって生産さ
    れた種子。
23. 【請求項２３】 請求項２２記載の種子から生長した子孫トランスジェニッ
    ク植物。
24. 【請求項２４】 ＡＶＰ１を過剰発現するように設計されたかまたは内在性
    ピロホスファターゼをダウンレギュレートするように設計された外来性核酸構築
    物を含む、耐塩性のトランスジェニック植物。
25. 【請求項２５】 請求項２４記載のトランスジェニック植物のトランスジェ
    ニック子孫。
26. 【請求項２６】 請求項２４記載のトランスジェニック植物によって生産さ
    れた種子。
27. 【請求項２７】 請求項２６記載の種子から生長した子孫トランスジェニッ
    ク植物。
28. 【請求項２８】 構築物が３５Ｓプロモーターの２重タンデムエンハンサー
    に作動可能に連結されたＡＶＰ１遺伝子を含む請求項１４記載のトランスジェニ
    ク植物。
29. 【請求項２９】 ＡＶＰ１を過剰発現するように設計されたかまたは内在性
    ピロホスファターゼをダウンレギュレートするように設計されたキメラプロモー
    ターに作動可能に連結されたＡＶＰ１遺伝子を含む構築物。
30. 【請求項３０】 ＡＶＰ１遺伝子が３５Ｓプロモーターの２重タンデムエン
    ハンサーに作動可能に連結されている請求項２９記載の構築物。
31. 【請求項３１】 植物中の液胞型ピロホスファターゼの発現を改変する外来
    性核酸を植物中に導入することによって得られたトランスジェニック植物。
32. 【請求項３２】 植物細胞中の液胞型ピロホスファターゼの発現を改変する
    外来性核酸を含む植物細胞。
33. 【請求項３３】 植物細胞が根細胞または茎細胞である請求項３２記載の植
    物細胞。
34. 【請求項３４】 外来性核酸がＡＶＰ１をコードする請求項３２記載の植物
    細胞。
35. 【請求項３５】 ＡＶＰ１を過剰発現するように設計されたかまたは内在性
    ピロホスファターゼをダウンレギュレートするように設計された構築物中にＡＶ
    Ｐ１が存在する請求項３４記載の植物細胞。
36. 【請求項３６】 構築物がＡＶＰ１を過剰発現するように設計されたキメラ
    プロモーターに作動可能に連結されたＡＶＰ１遺伝子を含む請求項３５記載の植
    物細胞。
37. 【請求項３７】 ＡＶＰ１遺伝子が３５Ｓプロモーターの２重タンデムエン
    ハンサーに作動可能に連結されている請求項３６記載の植物細胞。
38. 【請求項３８】 ＡＶＰ１がトランスジェニック植物の野生型に対応する野
    生型植物に由来する請求項３４記載の植物細胞。
39. 【請求項３９】 ＡＶＰ１がトランスジェニック植物の野生型に対応しない
    野生型植物に由来する請求項３４記載の植物細胞。
40. 【請求項４０】 植物中の液胞型ピロホスファターゼの発現を改変する外来
    性核酸を植物の１以上の細胞中に導入して植物における形質転換細胞を得、それ
    により、耐塩性のトランスジェニック植物を生産することを特徴とする、耐塩性
    のトランスジェニック植物の製造法。
41. 【請求項４１】 形質転換細胞から植物を再生してトランスジェニック植物
    を得、耐塩性のトランスジェニック植物を選択し、それにより、耐塩性のトラン
    スジェニック植物を生産することを特徴とする請求項４０記載の方法。
42. 【請求項４２】 外来性核酸がＡＶＰ１をコードする請求項４０記載の方法
    。
43. 【請求項４３】 ＡＶＰ１を過剰発現するように設計されたかまたは内在性
    ピロホスファターゼをダウンレギュレートするように設計された構築物中にＡＶ
    Ｐ１が存在する請求項４２記載の方法。
44. 【請求項４４】 構築物がＡＶＰ１を過剰発現するように設計されたキメラ
    プロモーターに作動可能に連結されたＡＶＰ１遺伝子を含む請求項４３記載の方
    法。
45. 【請求項４５】 ＡＶＰ１遺伝子が３５Ｓプロモーターの２重タンデムエン
    ハンサーに作動可能に連結されている請求項４４記載の方法。
46. 【請求項４６】 ＡＶＰ１がトランスジェニック植物の野生型に対応する野
    生型植物に由来する請求項４２記載の方法。
47. 【請求項４７】 ＡＶＰ１がトランスジェニック植物の野生型に対応しない
    野生型植物に由来する請求項４２記載の方法。
48. 【請求項４８】 植物が対応する非トランスジェニック植物の生長を阻害す
    る塩濃度に耐性のある請求項４０記載の方法。
49. 【請求項４９】 塩濃度が約０．２Ｍ〜約０．３Ｍである請求項４８記載の
    トランスジェニック植物。
50. 【請求項５０】 請求項４０記載の方法によって生産されたトランスジェニ
    ック植物。
51. 【請求項５１】 ＡＶＰ１を過剰発現するように設計された核酸構築物を植
    物の１以上の細胞中に導入して形質転換細胞を得、それにより、耐塩性のトラン
    スジェニック植物を生産することを特徴とする、耐塩性のトランスジェニック植
    物の製造法。
52. 【請求項５２】 さらに、形質転換細胞から植物を再生してトランスジェニ
    ック植物を得、耐塩性のトランスジェニック植物を選択し、それにより、耐塩性
    のトランスジェニック植物を生産することを特徴とする請求項５１記載の方法。
53. 【請求項５３】 請求項５１記載の方法によって生産されたトランスジェニ
    ック植物。
54. 【請求項５４】 植物中に液胞型ピロホスファターゼの発現を改変する核酸
    を植物の１以上の細胞中に導入して形質転換細胞を得、それにより、その対応す
    る野生型植物よりも大きいトランスジェニック植物を生産することを特徴とする
    、その対応する野生型植物よりも大きいトランスジェニック植物の製造法。
55. 【請求項５５】 さらに、形質転換細胞から植物を再生してトランスジェニ
    ック植物を得、その対応する野生型植物よりも大きいトランスジェニック植物を
    選択し、それにより、その対応する野生型植物よりも大きいトランスジェニック
    植物を生産することを特徴とする請求項５４記載の方法。
56. 【請求項５６】 外来性核酸がＡＶＰ１をコードする請求項５４記載の方法
    。
57. 【請求項５７】 ＡＶＰ１を過剰発現するように設計されたかまたは内在性
    ピロホスファターゼをダウンレギュレートするように設計された構築物中にＡＶ
    Ｐ１が存在する請求項５６記載の方法。
58. 【請求項５８】 構築物がＡＶＰ１を過剰発現するように設計されたキメラ
    プロモーターに作動可能に連結されたＡＶＰ１遺伝子を含む請求項５７記載の方
    法。
59. 【請求項５９】 ＡＶＰ１遺伝子が３５Ｓプロモーターの２重タンデムエン
    ハンサーに作動可能に連結されている請求項４８記載の方法。
60. 【請求項６０】 ＡＶＰ１がトランスジェニック植物の野生型に対応する野
    生型植物に由来する請求項５６記載の方法。
61. 【請求項６１】 ＡＶＰ１がトランスジェニック植物の野生型に対応しない
    野生型植物に由来する請求項５６記載の方法。
62. 【請求項６２】 トランスジェニック植物を土壌中で生長させる請求項５４
    記載の方法。
63. 【請求項６３】 トランスジェニック植物を水耕法で生長させる請求項５４
    記載の方法。
64. 【請求項６４】 請求項５４記載の方法によって生産されたトランスジェニ
    ック植物。
65. 【請求項６５】 １以上のトランスジェニック植物および／またはその子孫
    を土壌中で生長させることを特徴とし、ここに、該トランスジェニック植物およ
    び／またはその子孫が植物中の液胞型ピロホスファターゼの発現を改変する外来
    性核酸を含む、土壌のバイオリメディエーション方法。
66. 【請求項６６】 植物中の液胞型ピロホスファターゼの発現を改変する核酸
    を植物の１以上の細胞中に導入して形質転換細胞を得、それにより、植物の収量
    を増やすことを特徴とする植物の収量を増加する方法。
67. 【請求項６７】 さらに、形質転換細胞から植物を再生してトランスジェニ
    ック植物を得、その対応する野生型植物より大きいトランスジェニック植物を選
    択し、それにより、植物の収量を増やすことを特徴とする請求項６６記載の方法
    。
68. 【請求項６８】 １以上のトランスジェニック植物および／またはその子孫
    を植物生長を維持できる培地中で生長させることを特徴とし、ここに、該トラン
    スジェニック植物および／またはその子孫が植物中の液胞型ピロホスファターゼ
    の発現を改変する外来性核酸を含む、植物生長を維持できる培地からカチオンを
    除去する方法。
69. 【請求項６９】 培地が土壌および水よりなる群から選択される請求項６８
    記載の方法。
70. 【請求項７０】 カチオンがナトリウム、カルシウム、マンガンおよび鉛よ
    りなる群から選択される請求項６８記載の方法。
71. 【請求項７１】 植物中の液胞型ピロホスファターゼの発現を改変する外来
    性核酸を植物の１以上の細胞中に導入して形質転換細胞を得、それにより、塩水
    中で生長できるトランスジェニック植物を生産することを特徴とする、塩水中で
    生長するトランスジェニック植物の製造法。
72. 【請求項７２】 さらに、形質転換細胞から植物を再生してトランスジェニ
    ック植物を得、塩水中で生長するトランスジェニック植物を選択し、それにより
    、塩水中で生長できるトランスジェニック植物を生産することを特徴とする請求
    項７１記載の方法。
73. 【請求項７３】 塩水濃度が約０．２Ｍ〜約０．３Ｍである請求項７１記載
    の方法。
74. 【請求項７４】 塩水が海水である請求項７３記載の方法。
75. 【請求項７５】 植物中の液胞型ピロホスファターゼおよびＮａ^＋／Ｈ^＋対
    向輸送体の発現を改変する外来性核酸で形質転換された１以上の植物細胞を含む
    、塩に耐性のあるトランスジェニック植物。
76. 【請求項７６】 液胞型ピロホスファターゼがＡＶＰ１またはその相同物で
    ある請求項７５記載のトランスジェニック植物。
77. 【請求項７７】 ＡＶＰ１の相同物がタバコ、細菌、トマトまたはトウモロ
    コシに由来する請求項７６記載のトランスジェニック植物。
78. 【請求項７８】 ＡＶＰ１を過剰発現するように設計されたかまたは内在性
    ピロホスファターゼをダウンレギュレートするように設計された構築物中にＡＶ
    Ｐ１が存在する請求項７６記載のトランスジェニック植物。
79. 【請求項７９】 構築物が３５Ｓプロモーターの２重タンデムエンハンサー
    に作動可能に連結されたＡＶＰ１を含む請求項７８記載のトランスジェニック植
    物。
80. 【請求項８０】 Ｎａ^＋／Ｈ^＋対向輸送体がＡｔＮＨＸ１またはその相同物
    である請求項７５記載のトランスジェニック植物。
81. 【請求項８１】 請求項７５記載のトランスジェニック植物のトランスジェ
    ニック子孫。
82. 【請求項８２】 請求項７５記載のトランスジェニック植物によって生産さ
    れた種子。
83. 【請求項８３】 請求項７２記載の種子から生長した子孫トランスジェニッ
    ク植物。
84. 【請求項８４】 植物中の液胞型ピロホスファターゼの発現を改変する核酸
    を植物の１以上の細胞中へ導入して形質転換細胞を得、それにより、その対応す
    る野生型植物と比べて花の大きさが増したトランスジェニック植物を生産するこ
    とを特徴とする、対応する野生型植物と比べて花の大きさが増したトランスジェ
    ニック植物の製造法。
85. 【請求項８５】 外来性核酸がＡＶＰ１をコードする請求項８４記載の方法
    。
86. 【請求項８６】 請求項８４記載の方法によって生産されたトランスジェニ
    ック植物。