CN108728478B

CN108728478B - 利用氢离子焦磷酸化酶提高产量及改良淀粉性质的方法

Info

Publication number: CN108728478B
Application number: CN201710261923.6A
Authority: CN
Inventors: 张鹏; 范维娟; 吴银亮
Original assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Current assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Priority date: 2017-04-20
Filing date: 2017-04-20
Publication date: 2021-08-27
Anticipated expiration: 2037-04-20
Also published as: CN108728478A

Abstract

本发明涉及利用氢离子焦磷酸化酶提高产量及改良淀粉性质的方法。揭示了来自薯类植物的氢离子焦磷酸化酶(AVP1)具有提高薯类植物的产量、改良薯类植物的块根中的淀粉的性质的作用。本发明可应用于薯类植物的品种改良。

Description

利用氢离子焦磷酸化酶提高产量及改良淀粉性质的方法

技术领域

本发明涉及植物生物学领域，更具体地，本发明涉及利用氢离子焦磷酸化酶提高产量及改良淀粉性质的方法。

背景技术

以甘薯为代表的薯类作物，具有超高的光、热、水资源利用效率和单位面积生物量、淀粉含量高、适合种植于干旱瘠薄土地而不与粮食争地等特性，是目前最有开发前景的能源作物。

甘薯属旋花科，甘薯属，甘薯种，为蔓生性草本植物。甘薯植株可分为根、茎、叶、花、果实、种子等部分。甘薯是一种重要的粮食作物，也是食品加工业的重要原料，营养价值丰富。因此，甘薯品种优化以及培植、再生技术的研究具有重要的意义。与甘薯一样具有块根结构的植物还有：马铃薯，木薯等。

中国是世界上甘薯生产面积最大的国家，中国甘薯主要分布在北方、黄淮、长江和南方四大薯区的20多个省份。甘薯是中国重要的粮食、饲料和工业原料，在我国粮食作物中，仅次于水稻、小麦和玉米，居第四位。但不同省区甘薯单产差别很大。造成甘薯单产差距悬殊的原因主要有品种、栽培技术、病虫害、肥力水平、土壤条件、环境条件等。其它薯类植物，如马铃薯、木薯，在中国也有大量种植。

淀粉是由许多葡萄糖分子缩合而成的多糖，有直链和支链两种。直链淀粉由α-1，4糖苷键连接的葡萄糖分子组成，呈线状链；支链淀粉在分支处有α-1，6糖苷键连接，其直链部分也是α-1，4连接。一般的淀粉为直链及支链淀粉的混合物，直链淀粉和支链淀粉在淀粉中所占的比例随植物的种类而异，在多数含有淀粉的植物中，通常含有20～30％直链淀粉、70～80％支链淀粉。在哺乳动物的消化道中，淀粉经淀粉酶、麦芽糖酶等作用，水解为葡萄糖，被吸收利用。粮食作物食用品质的优劣在很大程度上与作物中淀粉的组成，即直链淀粉与支链淀粉的比例有关。目前，以植物块根(如薯类植物块根)为原料的淀粉加工业处于发展阶段，但各种产品的加工对原材料的淀粉品质(如直链淀粉和支链淀粉的含量比例)提出了多样化的需求。依靠传统育种来改变淀粉品质，耗时长，需要大量人力物力，难以满足淀粉加工业的急切需求。

本领域人员已经尝试通过调节淀粉合成的主要基因来调节植物中淀粉的组成和含量，然而与淀粉合成相关的蛋白有许许多多，找到真正有用的基因仍有难度。

为了提高薯类植物的生产产量，提高种植效率，改善种质，本领域有必要从分子生物学水平上研究薯类植物中的优良基因，从而为该类植物的品种改良提供新的途径。

发明内容

本发明的目的在于提供利用氢离子焦磷酸化酶提高产量及改良淀粉性质的方法。

在本发明的第一方面，提供一种氢离子焦磷酸化酶(AVP1)的用途，用于：提高薯类植物的产量；或改良薯类植物的块根中的淀粉的性质。

在一个优选例中，所述的提高薯类植物的产量包括：提高薯类植物块根的重量。

在另一优选例中，所述的改良薯类植物的块根中的淀粉的性质包括：

提高薯类植物的块根中的淀粉含量；

提高薯类植物的块根中的可溶性糖的含量；

提高薯类植物的块根中的直链淀粉含量；

使薯类植物的块根中的淀粉的糊化过程的起始和结束阶段提前；

增大薯类植物的块根中的淀粉粒的粒度。

在另一优选例中，所述的可溶性糖包括：葡萄糖、果糖、蔗糖。

在另一优选例中，所述的氢离子焦磷酸化酶是：

(a)如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的蛋白；或

(b)将SEQ ID NO:2所示氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个；较佳地1-10个；更佳地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有提高薯类植物的产量或改良薯类植物的块根中的淀粉的性质功能的由(a)衍生的蛋白；或

(c)氨基酸序列与(a)限定的氨基酸序列有90％以上(较佳地95％以上；更佳地98％以上；更佳地99％以上)相同性，且具有提高薯类植物的产量或改良薯类植物的块根中的淀粉的性质功能的由(a)衍生的蛋白；或

(d)具有(a)蛋白功能的SEQ ID NO:2的蛋白片段。

在另一优选例中，所述的薯类植物包括：甘薯，马铃薯，木薯，山药，芋类。

在本发明的另一方面，提供一种提高薯类植物的产量或改良薯类植物的块根中的淀粉的性质的方法，所述方法包括：提高薯类植物中氢离子焦磷酸化酶的表达。

在一个优选例中，所述的方法包括：将编码氢离子焦磷酸化酶的多核苷酸转入薯类植物中。

在另一优选例中，所述的方法包括步骤：

(i)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含编码氢离子焦磷酸化酶的多核苷酸；

(ii)利用农杆菌使所述编码氢离子焦磷酸化酶的多核苷酸转入薯类植物。

在本发明的另一方面，提供一种氢离子焦磷酸化酶或编码其的多核苷酸的用途，用作鉴定薯类植物的产量性状或淀粉性质的分子标记物。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、野生型及IbAVP1转基因甘薯大田中试块根生长表型及产量。

A，野生型及IbAVP1转基因甘薯大田中试块根生长表型；其中IA4、IA7及IA8为若干个转基因株系。

B，块根产量的柱形图。材料为2015年11月收获于上海五厍大田基地，图中数据为十株以上统计数据。

图2、野生型及转基因甘薯块根淀粉含量的测定。甘薯块根材料于2015年11月取自上海五厍大田基地，取相同位置的块根材料测定，图中所示数据为三次重复结果。**代表t-test检验差异极显著(p<0.01)。

图3、野生型及转基因甘薯块根可溶性糖含量的测定。甘薯块根材料于2015年11月取自上海五厍大田基地，图中所示数据为三次重复结果。*代表t-test检验差异显著(p<0.05)，**代表t-test检验差异极显著(p<0.01)。

图4、转基因甘薯中直链淀粉含量。甘薯块根材料于2015年11月取自上海五厍大田基地，图中所示数据为三次重复结果。*代表t-test检验差异显著(p<0.05)，**代表t-test检验差异极显著(p<0.01)。

图5、转基因甘薯淀粉链长分布特征。

A，野生型和转基因甘薯链长分布特征；

B，转基因与野生型链长分布差异。甘薯块根材料于2015年11月取自上海五厍大田基地，图中所示数据为三次重复结果。*代表t-test检验差异显著(p<0.05)，**代表t-test检验差异极显著(p<0.01)。

图6、转基因甘薯淀粉粒热力学性质分析。甘薯块根材料于2015年11月取自上海五厍大田基地。

图7、转基因甘薯淀粉粒表观结构的变化。甘薯块根材料于2015年11月取自上海五厍大田基地。

图8、转基因甘薯淀粉粒度分布特征。甘薯块根材料于2015年11月取自上海五厍大田基地。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，发现来自薯类植物的氢离子焦磷酸化酶(AVP1)具有提高薯类植物的产量、改良薯类植物的块根中的淀粉的性质的作用。本发明可应用于薯类植物的品种改良。

如本文所用，所述的“薯类植物”是指块根类植物或块茎类植物，其具有淀粉合成途径且在其组织或器官中含有淀粉。所述的块根植物例如木薯(Manihot esculenta)、甘薯(Ipomoea batatas)、山药(Dioscorea sp.)；所述的块茎类植物例如马铃薯(Solanumtuberosum)。

本发明还包括氢离子焦磷酸化酶的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的氢离子焦磷酸化酶相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

任何一种氢离子焦磷酸化酶的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，氢离子焦磷酸化酶的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的氢离子焦磷酸化酶的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50％的全长氢离子焦磷酸化酶的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长氢离子焦磷酸化酶的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。

在本发明中，术语“氢离子焦磷酸化酶”指具有氢离子焦磷酸化酶活性的SEQ IDNO:2序列的多肽。该术语还包括具有与氢离子焦磷酸化酶相同功能的、SEQ ID NO:2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端(特别是N末端)添加或缺失一个或数个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端(特别是N末端)添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括氢离子焦磷酸化酶的活性片段和活性衍生物。

任何与所述的氢离子焦磷酸化酶同源性高(比如与SEQ ID NO:2所示的序列的同源性为50％或更高；优选的，同源性为60％或更高；优选的，同源性为70％或更高；优选的，同源性为80％或更高；更优选的，同源性为90％或更高，如同源性95％，98％或99％)的、且具有氢离子焦磷酸化酶相同功能的蛋白也包括在本发明内。

在本发明中，“氢离子焦磷酸化酶保守性变异多肽”指与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相比，有至多20个，较佳地至多10个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。

应理解，虽然本发明的氢离子焦磷酸化酶优选获自甘薯，但是获自其它薯类植物的与甘薯氢离子焦磷酸化酶高度同源(如具有80％以上，如85％、90％、95％、甚至98％序列相同性)的其它多肽也在本发明考虑的范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如BLAST。

本发明还涉及编码本发明氢离子焦磷酸化酶或其保守性变异多肽的多核苷酸序列。所述的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:2的蛋白质，但与SEQ ID NO:1所示的编码区序列有差别的核酸序列。优选的，选择氢离子焦磷酸化酶基因组序列(SEQ ID NO:1，同时包含外显子和内含子)或该序列的变异体(含简并的变异体)用于提高薯类植物的产量或改良薯类植物的块根中的淀粉的性质。

编码SEQ ID NO:2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码所述多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明也涉及包含所述的多核苷酸的载体，以及用所述的载体或氢离子焦磷酸化酶编码序列经基因工程产生的宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。转化植物可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如喷洒法、叶盘法、水稻幼胚转化法等。

本发明涉及一种改良植物的方法，该方法包括提高所述薯类植物中氢离子焦磷酸化酶的表达。在得知了所述的氢离子焦磷酸化酶的用途后，可以采用本领域人员熟知的多种方法来提高所述的氢离子焦磷酸化酶的表达。比如可通过本领域人员已知的途径将携带氢离子焦磷酸化酶基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，并使之表达活性的氢离子焦磷酸化酶。

优选的，提供了一种制备转基因植物的方法，包括：

(1)将外源的氢离子焦磷酸化酶的编码多核苷酸转入植物组织、器官或组织，获得转化入氢离子焦磷酸化酶的编码多核苷酸的植物组织、器官或种子；和

(2)将步骤(1)获得的转入了外源氢离子焦磷酸化酶的编码多核苷酸的植物组织、器官或种子再生成植物植株。

其它增加氢离子焦磷酸化酶基因或其同源基因表达的方法是本领域周知的。例如，可通过用强启动子驱动从而增强氢离子焦磷酸化酶基因或其同源基因的表达。或者通过增强子(如水稻waxy基因第一内含子、Actin基因第一内含子等)来增强该氢离子焦磷酸化酶基因的表达。适用于本发明方法的强启动子包括但不限于：35s启动子，水稻、玉米的Ubi启动子等。

可采用任何适当的常规手段，包括试剂、温度、压力条件等来实施所述的方法。

此外，本发明还涉及利用氢离子焦磷酸化酶或其编码基因作为一种基因转化植株后代的追踪标记。本发明还涉及利用氢离子焦磷酸化酶或其编码基因作为一种分子标记，通过检测植物中氢离子焦磷酸化酶的表达情况，鉴定植物的产量以及淀粉性质。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

I.材料与方法

1、甘薯(Ipomoea batatas[L.]Lam.)

甘薯品种泰中6号(泰安农科院)。

IbAVP1过表达转基因甘薯株系如下制备：

构建IbAVP1过表达载体：以甘薯cDNA为模板，PCR扩增IbAVP1基因，引物如下：

IbAVP1FP：5’-ATAGGATCCATGGTTGCGGCGACGAT-3’(SEQ ID NO:3)；

IbAVP1RP：5’-CAGCCATGGTCAAAAGATCTTGAAGAG-3’(SEQ ID NO:4)；

PCR产物连接到pMD18-T中，序列经测序验证后，基因经BamHⅠ/PstⅠ酶切位点连接到p1301(pCAMBIA1301)植物载体上的BamHⅠ/PstⅠ位点，形成终表达载体p1301-35S::IbAVP1。

将表达载体(pCAMBIA1301-35S::IbAVP1)转化甘薯泰中6号(泰安农科院)，获得一系列IbAVP1过表达转基因株系。

2、甘薯田间中试试验

2.1产量测定用种苗

将温室栽培苗或用种薯育苗获得的甘薯蔓剪切为含2-3个侧芽的茎段(长约20cm)用作种苗，同一地块中保持种苗来源一致，质量相当。

2.2产量测定地点

2014-2015年产量测定在上海松江五厍，其中上海五厍种植密度为每亩2700株(株距30cm，行距80cm)。

3、甘薯组织主要单糖测定

将采集的甘薯新鲜块根于80℃完全烘干，用研钵研磨充分，称取30mg样品入2.0mLEP管中，迅速加入700μL 80％乙醇，充分震荡混匀，70℃摇2小时，14000g离心3分钟；上清移入干净离心管中加入700μL纯水，1200rpm离心5分钟；取1ml上清进入新离心管中，加入700μL氯仿，12000rpm，10分钟。重复抽提一次，去掉色素。在HPLC1260-RI系统上，利用Agilenttechnologies HPLC column(ZORBAX Carbohydrate column；4.6×150mm，5μM分离样品，取10μL进样，流动相为75％乙腈，流速为每分钟0.8毫升，分离温度为35℃，检测器为示差折光检测器。空白对照是80％的乙醇。

4、甘薯组织中淀粉含量的测定

根据Total Starch试剂盒(K-TSTA，Megazyme)，将方法3中烘干的植物组织先用50μL的75％的乙醇润湿，震荡混匀使样品重复分散，防止在加热过程中结块，加入1.5mlAlpha-amylase，沸水孵育12min，使植物组织中的淀粉充分糊化，期间各两分钟震荡混用，防止由于酒精蒸发导致样品喷出EP管；将EP管转移到50℃水浴中，加入50μL淀粉葡糖苷转移酶，孵育30min，将EP管中的全部液体转移到15mL试管中，定容到10mL，取约100μL的样品加入3mL GOPOD，50℃孵育20min；空白对照用同样量的水代替样品；葡糖糖对照为100μL葡糖糖标样(1mg/mL)+3mL GOPOD试剂。所有样品在510nm下测定其吸光值。

其中：F＝100(葡萄糖标样重量100μg)/100μg葡萄糖标样的吸光度值

FV：最终体积(10mL)

⊿A：样品的吸光值

W：样品的重量(mg)

5、甘薯薯储藏根中淀粉的分离

将新鲜收获的甘薯储藏根表皮去除，切片后加一定量蒸馏水置于2L Waring商用磨样机(Waring Commercial,New Hartford,CT)。充分磨匀后的浆液以100目滤网过滤，离心5000rpm，5min。淀粉颗粒将沉降，去除上清。反复几次用蒸馏水离心洗涤淀粉粒。最后将沉淀于恒温通风烘箱中40℃烘烤2d。

6、直链淀粉含量测定

甘薯淀粉中直链淀粉含量的测定参考中华人民共和国国家标准GB/T15683-2008/ISO 6647-1：2007。主要步骤为：称取50mg±0.5mg甘薯淀粉、直链淀粉标样(Sigma，St.Louis，MO，USA)和支链淀粉标样(Sigma，St.Louis，MO，USA)于试管中，加入500μL 95％乙醇将粘在试管内壁上的样品冲下，轻轻摇匀并加入4.5mL 1.0M氢氧化钠溶液混匀后沸水浴10min以上直至淀粉样完全分散，冷却至室温后转移到50mL容量瓶中定容；同时按相同步骤制备不加任何淀粉样的空白对照；利用定容的直链淀粉和支链淀粉标样配制直链淀粉含量为0、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％和100％的系列标准含量溶液各1mL备用；8mL 2％碘液稀释后加4mL 1.0M HAC溶液并定容至200mL即为淀粉显色液，现配现用，同一批样品使用相同的显色液；空白对照、甘薯淀粉样、标准含量溶液各取100μL加入1mL淀粉显色液中混匀显色，空白对照取4次，其它样品取3次，显色后在分光光度计LibraS22(Biochrom Ltd.，UK)上进行720nm波长OD值测量；利用标准含量溶液在720nm处的吸光度值进行一元线性回归并求取相关系数，建立直链淀粉含量与吸光度的方程式，将待测甘薯淀粉样吸光度代入方程式求取其直链淀粉含量。

7、淀粉链长分布

称取已纯化淀粉5mg，先用500μL 95％乙醇重悬，再加4.5mL去离子水，沸水浴60min，间断涡旋混匀，取2.5mL的糊化样品，加入125μL醋酸钠(600mM,pH 4.4)，25μL NaN3(2％,w/v)，3.5μL异淀粉酶(1000U/μL，I5284，Sigma Aldrich Corporation,St.Louis,USA)，38℃反应24h。加入375μL 2％的硼氢化钠，室温放置24h。将样品分装成600μL每管，在室温下真空干燥。每管溶于60μL的去离子水中，静置60min，然后加入540μL蒸馏水稀释。离心12000rpm，10min，取上清过滤合并为一管。将3mL的样品注射入配置有PAD检测器和PA-1色谱柱的ICS5000(Dionex，CA，USA)。

8、差示扫描量热分析(DSC)

使用Q100调制式差示扫描量热仪(TA Instruments，Norwalk，CT，USA)作淀粉样品糊化热力学分析。将样品(10mg淀粉加40μl水，以50μl水作为空白对照)密封在不锈钢坩埚内，以3℃/min的速度，由0℃升温至120℃再降至0℃，扫描热量变化。数据使用UniversalAnalysis软件进行分析。

9、淀粉粒形态观察

将淀粉粒溶液中的淀粉滴至铜台上的双面胶表面，自然风干后喷金，以扫描电子显微镜进行观察(JSM6360lv,JEOL,Tokyo,Japan)。

10、淀粉粒度分析

利用Mastersizer 3000激光粒度分析仪进行淀粉粒度分析。

实施例1、IbAVP1转基因甘薯的块根田间表型及产量

2015年，本发明人把甘薯移植到上海五厍大田环境中，收获后观察转基因植株的块根表型并测定其重量。结果表明，在大田环境下，转基因甘薯的块根大于野生型(图1，A)。

根据统计的块根重量数据显示，相对于野生型，转基因甘薯的块根重量显著上升(图1，B)。

实施例2、甘薯IbAVP1提高块根淀粉含量

本发明人从大田中收获野生型及IbAVP1的转基因甘薯块根，分析其淀粉的含量。

结果显示，转基因株系的淀粉含量显著高于野生型(图2)，增加约20.07～31.91％。

实施例3、甘薯IbAVP1提高块根中可溶性糖含量

本发明人提取并分析野生型及转基因植株块根中可溶性糖的变化。

结果显示，在转基因植株中，葡萄糖、果糖、蔗糖含量相对于野生型含量有明显提高，分别提高了19.03～76.17％，15.17～40.34％，28.15～54.56％(图3)。

实施例4、直链淀粉含量测定

本发明人测定了转基因植物的直链淀粉的含量。直链淀粉含量的测定依据碘-淀粉络合物吸光度比色法进行测定。

结果如图4所示，转基因甘薯中直链淀粉含量显著提高27.89～31.82％。

实施例5、淀粉脱分支后链长分析

淀粉通过异淀粉酶(isoamylase)水解后，利用HPAEC-PAD分析其水解液中的葡聚糖成分。

分析结果显示，甘薯淀粉的链长分布为DP6-68，在DP11-13及DP43处有两个峰，DP18处有一个肩峰(图5，A)，转基因块根淀粉中短链含量增加、中链含量降低(图5，B)，但其变化都不明显，变化范围只有-0.1～0.3％，表明IbAVP1的表达对块根中支链淀粉结构的影响并不显著。

实施例6、甘薯块根中淀粉的差示热值扫描分析

差示热值扫描(Differential Scanning Calorimetry，DSC)是测定在加热过程中淀粉的吸热能力的一种热力学手段，淀粉的吸热能力主要受到淀粉直链淀粉含量、淀粉结晶度、支链淀粉链长分布等方面的影响，通过分析野生型甘薯及转基因木薯淀粉的热力学性质可以判断IbAVP1对淀粉结构的影响，结果如图6。

块根淀粉的热力学参数显示，野生型甘薯块根储存性淀粉在64.77℃开始糊化，82.29℃结束，在72.51℃有吸热峰(表1)；相对于野生型，转基因植株块根淀粉的T_o、T_p、T_c及⊿H略微有所降低，这可能与直链淀粉升高造成淀粉分子的微观排布不均一有关，导致了糊化过程的起始和结束阶段提前。

表1、野生型及IbAVP1转基因甘薯块根淀粉的热力学参数

注：T_o：起始温度(Onset temperature)，T_p：峰值温度(Peak temperature)，T_c：结束温度(Conclusion temperature)，ΔH：糊化热焓(Thermal enthalpy)。

实施例7、转基因甘薯淀粉颗粒表观形态分析

为分析转基因植株中直链淀粉含量的变化是否影响淀粉颗粒的形态、内部结构，野生型及转基因甘薯淀粉粒及储藏根进行了扫描电镜观察。通过扫描电镜观察淀粉粒表观形态发现转基因，并没有改变淀粉粒的形状(图7)，在转基因植株的许多淀粉粒表面出现浅浅的“沟壑”，这种现象在野生型的淀粉粒中没有观察到。

上述结果说明，转基因植株的直链淀粉的升高会影响到淀粉粒的外观形态。

实施例8、转基因甘薯淀粉颗粒粒度分析

为分析转基因植株中淀粉颗粒的粒度是否有变化，本发明人用Mastersizer 3000激光粒度分析仪进行淀粉粒度分析。

结果如图8以及表2所示，转基因块根的淀粉粒粒度与野生型相比变大了。

表2、野生型及IbAVP1转基因甘薯块根淀粉的粒度参数

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院上海生命科学研究院

<120> 利用氢离子焦磷酸化酶提高产量及改良淀粉性质的方法

<130> 172141

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2304

<212> DNA

<213> 甘薯

<400> 1

atggttgcgg cgacgattct gccagatctc ggcacccagg tcctgatccc ggcgtgtgcg 60

attgtcggca tcgctttcgc cctcgtccag tgggtcctcg tctccaaggt caagctctcc 120

cccgagaagt ccggccctgg gcccgccgac ggcaagaacg gcttcgccga gtcgcttatt 180

gaggaggagg aaggcatcaa tgaccacagc gtcgtgcaca agtgcgccga aatccaaaac 240

gccatctccg aaggtgcaac ctcgttcctt ttcactgaat accagtatgt tggtattttt 300

atggttgctt ttgctatttt gatctttgtt ttcctgggct ctgttgaggg tttcagtaca 360

aaggaccagc cttgcaccta tgacagcacc aaaacgtgca agcctgcact tgccactgct 420

gtattcagta ccatatcctt cttgcttggt gctattactt ccgtagtttc tggctttctc 480

ggaatgaaaa tagcaactta tgcaaatgcc aggactacct tggaggctag aaagggtgtt 540

gggaaggctt tcatcactgc atttaggtct ggtgcagtta tgggtttcct tcttgctgct 600

aatggtcttt tggtcttgta cattaccatc aatctgttca agttgtacta tggtgacgac 660

tgggaaggct tgttcgagtc tatcactggt tatgggcttg gtggatcttc tatggccctc 720

tttggtagag tgggtggggg tatatataca aaagctgctg atgttggagc tgatcttgtg 780

ggaaaggttg agagaaacat tccagaggat gatccaagaa acccagcggt tattgctgac 840

aacgttggag ataatgttgg agatattgct ggaatgggat cagacttgtt tggctcatat 900

gcagaatcat cttgtgcagc ccttgttgta gcttcaatat cttcctttgg catcaaccat 960

gagttcacag ctatgttata tcctcttctt gtcagttcca tcggcattct agtttgcttg 1020

ttcaccaccc ttttcgctac tgatttcttt gaagtcaagg ctgtaaagga aattgagcca 1080

gcattgaaga agcaactcat aatctccact gccctgatga cagttggcat tgctattgtt 1140

acctggattg ctcttccatc gtccttcaca attttcaact ttggtactca gaaagtagta 1200

cagagctggc aattgttcat ctgcgttggt gttggcttgt gggctggtct tattattggg 1260

tttgtcacag agtactacac tagcaatgct tacagccccg tacaagatgt tgctgattcc 1320

tgccgcactg gagctgctac caatgttatt tttggccttg ctttgggtta caaatctgtc 1380

atcattccga tttttgctat agcaatcagc atctttgtta gcttcagctt tgcagctatg 1440

tatggtattg cagttgctgc ccttggaatg cttagcacca tcgccactgg tttggctatt 1500

gatgcatatg gtcccatcag tgacaatgct ggaggcattg cagagatggc tggtatgagt 1560

cataggatac gtgaaagaac tgatgccctt gatgctgcag gaaacaccac cgctgctatt 1620

ggaaagggat ttgcaattgg atctgctgct ctcgtgtctc ttgctctgtt tggtgcattt 1680

gtgagccgtg ctgaaatttc aaccgtagat gtcctgacac ccaaagtctt cattggtttg 1740

ctcgtgggtg ctatgcttcc ctattggttc tccgccatga caatgaagag tgtggggaag 1800

gctgctctta agatggttga ggaagtccgt agacaattca ataacatccc ggggctcatg 1860

gaaggcactg ccaagcccga ctatgccacc tgtgttaaga tctcaacaga cgcctccatc 1920

aaggagatga ttccacctgg tgcccttgtc atgctcactc cactaattgt tggaatcttc 1980

ttcggtgtgg aaaccttgtc tggtgtcctt gctggagccc tcgtctctgg tgtacagatt 2040

gctatctctg catccaacac cggtggtgcc tgggataacg ccaagaagta tatcgaggcc 2100

ggggcttcag aacatgcgag aactctcggt cccaagggat ccgattgcca caaggcggcc 2160

gttattggtg acactgtcgg ggaccctctc aaggacacat ccggcccgtc gttgaatatc 2220

ctcatcaagc tcatggccgt cgagtctctc gtgttcgcgc ccttcttcgc cacccatggc 2280

ggccttctct tcaagatctt ttga 2304

<210> 2

<211> 767

<212> PRT

<213> 甘薯

<400> 2

Met Val Ala Ala Thr Ile Leu Pro Asp Leu Gly Thr Gln Val Leu Ile

1 5 10 15

Pro Ala Cys Ala Ile Val Gly Ile Ala Phe Ala Leu Val Gln Trp Val

20 25 30

Leu Val Ser Lys Val Lys Leu Ser Pro Glu Lys Ser Gly Pro Gly Pro

35 40 45

Ala Asp Gly Lys Asn Gly Phe Ala Glu Ser Leu Ile Glu Glu Glu Glu

50 55 60

Gly Ile Asn Asp His Ser Val Val His Lys Cys Ala Glu Ile Gln Asn

65 70 75 80

Ala Ile Ser Glu Gly Ala Thr Ser Phe Leu Phe Thr Glu Tyr Gln Tyr

85 90 95

Val Gly Ile Phe Met Val Ala Phe Ala Ile Leu Ile Phe Val Phe Leu

100 105 110

Gly Ser Val Glu Gly Phe Ser Thr Lys Asp Gln Pro Cys Thr Tyr Asp

115 120 125

Ser Thr Lys Thr Cys Lys Pro Ala Leu Ala Thr Ala Val Phe Ser Thr

130 135 140

Ile Ser Phe Leu Leu Gly Ala Ile Thr Ser Val Val Ser Gly Phe Leu

145 150 155 160

Gly Met Lys Ile Ala Thr Tyr Ala Asn Ala Arg Thr Thr Leu Glu Ala

165 170 175

Arg Lys Gly Val Gly Lys Ala Phe Ile Thr Ala Phe Arg Ser Gly Ala

180 185 190

Val Met Gly Phe Leu Leu Ala Ala Asn Gly Leu Leu Val Leu Tyr Ile

195 200 205

Thr Ile Asn Leu Phe Lys Leu Tyr Tyr Gly Asp Asp Trp Glu Gly Leu

210 215 220

Phe Glu Ser Ile Thr Gly Tyr Gly Leu Gly Gly Ser Ser Met Ala Leu

225 230 235 240

Phe Gly Arg Val Gly Gly Gly Ile Tyr Thr Lys Ala Ala Asp Val Gly

245 250 255

Ala Asp Leu Val Gly Lys Val Glu Arg Asn Ile Pro Glu Asp Asp Pro

260 265 270

Arg Asn Pro Ala Val Ile Ala Asp Asn Val Gly Asp Asn Val Gly Asp

275 280 285

Ile Ala Gly Met Gly Ser Asp Leu Phe Gly Ser Tyr Ala Glu Ser Ser

290 295 300

Cys Ala Ala Leu Val Val Ala Ser Ile Ser Ser Phe Gly Ile Asn His

305 310 315 320

Glu Phe Thr Ala Met Leu Tyr Pro Leu Leu Val Ser Ser Ile Gly Ile

325 330 335

Leu Val Cys Leu Phe Thr Thr Leu Phe Ala Thr Asp Phe Phe Glu Val

340 345 350

Lys Ala Val Lys Glu Ile Glu Pro Ala Leu Lys Lys Gln Leu Ile Ile

355 360 365

Ser Thr Ala Leu Met Thr Val Gly Ile Ala Ile Val Thr Trp Ile Ala

370 375 380

Leu Pro Ser Ser Phe Thr Ile Phe Asn Phe Gly Thr Gln Lys Val Val

385 390 395 400

Gln Ser Trp Gln Leu Phe Ile Cys Val Gly Val Gly Leu Trp Ala Gly

405 410 415

Leu Ile Ile Gly Phe Val Thr Glu Tyr Tyr Thr Ser Asn Ala Tyr Ser

420 425 430

Pro Val Gln Asp Val Ala Asp Ser Cys Arg Thr Gly Ala Ala Thr Asn

435 440 445

Val Ile Phe Gly Leu Ala Leu Gly Tyr Lys Ser Val Ile Ile Pro Ile

450 455 460

Phe Ala Ile Ala Ile Ser Ile Phe Val Ser Phe Ser Phe Ala Ala Met

465 470 475 480

Tyr Gly Ile Ala Val Ala Ala Leu Gly Met Leu Ser Thr Ile Ala Thr

485 490 495

Gly Leu Ala Ile Asp Ala Tyr Gly Pro Ile Ser Asp Asn Ala Gly Gly

500 505 510

Ile Ala Glu Met Ala Gly Met Ser His Arg Ile Arg Glu Arg Thr Asp

515 520 525

Ala Leu Asp Ala Ala Gly Asn Thr Thr Ala Ala Ile Gly Lys Gly Phe

530 535 540

Ala Ile Gly Ser Ala Ala Leu Val Ser Leu Ala Leu Phe Gly Ala Phe

545 550 555 560

Val Ser Arg Ala Glu Ile Ser Thr Val Asp Val Leu Thr Pro Lys Val

565 570 575

Phe Ile Gly Leu Leu Val Gly Ala Met Leu Pro Tyr Trp Phe Ser Ala

580 585 590

Met Thr Met Lys Ser Val Gly Lys Ala Ala Leu Lys Met Val Glu Glu

595 600 605

Val Arg Arg Gln Phe Asn Asn Ile Pro Gly Leu Met Glu Gly Thr Ala

610 615 620

Lys Pro Asp Tyr Ala Thr Cys Val Lys Ile Ser Thr Asp Ala Ser Ile

625 630 635 640

Lys Glu Met Ile Pro Pro Gly Ala Leu Val Met Leu Thr Pro Leu Ile

645 650 655

Val Gly Ile Phe Phe Gly Val Glu Thr Leu Ser Gly Val Leu Ala Gly

660 665 670

Ala Leu Val Ser Gly Val Gln Ile Ala Ile Ser Ala Ser Asn Thr Gly

675 680 685

Gly Ala Trp Asp Asn Ala Lys Lys Tyr Ile Glu Ala Gly Ala Ser Glu

690 695 700

His Ala Arg Thr Leu Gly Pro Lys Gly Ser Asp Cys His Lys Ala Ala

705 710 715 720

Val Ile Gly Asp Thr Val Gly Asp Pro Leu Lys Asp Thr Ser Gly Pro

725 730 735

Ser Leu Asn Ile Leu Ile Lys Leu Met Ala Val Glu Ser Leu Val Phe

740 745 750

Ala Pro Phe Phe Ala Thr His Gly Gly Leu Leu Phe Lys Ile Phe

755 760 765

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 3

ataggatcca tggttgcggc gacgat 26

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 4

cagccatggt caaaagatct tgaagag 27

Claims

1.一种氢离子焦磷酸化酶的用途，其特征在于，用于提高薯类植物的块根中的直链淀粉含量；所述的氢离子焦磷酸化酶来源于薯类植物，所述的薯类植物是甘薯。

2.一种氢离子焦磷酸化酶的用途，其特征在于，用于增大薯类植物的块根中的淀粉粒的粒度；所述的氢离子焦磷酸化酶来源于薯类植物，所述的薯类植物是甘薯。

3.一种氢离子焦磷酸化酶的用途，其特征在于，用于使薯类植物的块根中的淀粉的糊化过程的起始和结束阶段提前；所述的氢离子焦磷酸化酶来源于薯类植物，所述的薯类植物是甘薯。

4.如权利要求1～3任一项所述的用途，其特征在于，所述的氢离子焦磷酸化酶是如SEQID NO: 2所示氨基酸序列的蛋白。

5.一种提高薯类植物块根中的直链淀粉含量的方法，所述方法包括：提高薯类植物中氢离子焦磷酸化酶的表达；所述的氢离子焦磷酸化酶来源于薯类植物，所述的薯类植物是甘薯。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的方法包括：将编码氢离子焦磷酸化酶的多核苷酸转入薯类植物中。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：

(i) 提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含编码氢离子焦磷酸化酶的多核苷酸；

(ii) 利用农杆菌使所述编码氢离子焦磷酸化酶的多核苷酸转入薯类植物。

8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的氢离子焦磷酸化酶是如SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的蛋白。