CN101412990B - 羊草果聚糖水解酶及其编码基因与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种羊草果聚糖水解酶及其编码基因与应用。该蛋白，一种羊草果聚糖水解酶，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：1)序列表中序列1的氨基酸残基序列；2)将序列表中序列1氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有β-2，1糖苷键水解酶功能的蛋白质。本发明的耐低温蛋白的编码基因可转入植物中提高植物抗逆性。该基因对于植物耐逆分子机制的研究，植物抗逆性品种的选育具有重要的理论及实际意义，并为改良作物的耐逆性提供了一条经济、快速、有效的途径。本发明在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。
Description
技术领域
本发明涉及羊草果聚糖水解酶及其编码基因与应用，特别是涉及羊草果聚糖水解酶及其编码基因在培育抗逆性提高的植物和水解果聚糖β-2，1糖苷键中的应用。
背景技术
果聚糖(fructan)是由果糖组成的线型或/和分支型的多聚体，是约15％的被子植物的重要贮藏碳水化合物。随着果聚糖代谢酶类的发现，果聚糖除了作为植物异养器官根、茎、籽粒和自养器官叶的短期或长期贮藏物外，还具有多种重要生理功能，如调节植物适应低温光合作用、调控植物蔗糖分配以及使植物适应水分亏缺、高浓度CO2、缺氧条件等。此外，果聚糖因高甜度和低热值性而成为重要的保健用品，作为食用甜味剂和低热值性食品原料。一般情况下低DP果聚糖不易被消化，可防止产生龋齿和增胖，并可纠正肠内菌群失调等；高DP果聚糖具优越的物理化学性能，可用作营养食品(代替脂肪)和非食物原料。然而植物中果聚糖的水解酶的活力一直是果聚糖有效降解的瓶颈。
不同生物果聚糖的降解存在两种形式的催化酶类，一类是果聚糖外水解酶(fructanexohydrolase，FEH)，另一类是果聚糖内水解酶(endo-inulinlase)。一般认为高等植物果聚糖的降解由果聚糖外水解酶催化(Nelson and Spollen，1987)，该酶作用是将果聚糖多聚体末端果糖解离下来，释放出自由果糖。目前，仅少数几种植物FEH被克隆，分别是菊苣(C.intybus)1-FEHI(Claessens et al，1990)和1-FEHII(De Roover et al，1999)、菊芋(H.tuberosus)1-FEH(Marx et al，1997a)、黑麦草(Lolium perenne)6-FEH(Marx et al，1997b)、具β(2→6)键特异性的燕麦(Avena sativa)FEH(Henson and Livingstone，1996)、β(2→1)特异性的大麦(H.Vulgare)FEH(Henson and Livingstone，1998)，尽管在黑麦草中得到了FEH，但知之甚少，对羊草中果聚糖代谢，果聚糖外水解酶FEH基因的研究尚属空白。
发明内容
本发明的目的是提供一种羊草果聚糖水解酶及其编码基因与应用。
本发明所提供的羊草果聚糖水解酶，名称为Lc1-FEH，来源于赖草属羊草(Leymuschinensis(Trin.)Tzvel)，是如下(a)或(b)的蛋白质：
(a)由序列表中序列1的氨基酸残基序列组成的蛋白质；
(b)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有羊草果聚糖水解酶功能的由(a)衍生的蛋白质。
其中，序列表中的序列1所示的蛋白序列由600个氨基酸残基组成，自氨基端(N)第72位-第76位氨基酸残基为保守的NDPSG结构域，第196位-第199位为FRDP结构域，第251位-255位为WECPD结构域。自氨基端第1位-第27位为定位信号肽。
为了使(a)中的Lc1-FEH分泌到细胞周质或培养基中或使其功能稳定，可在由序列表中序列1的氨基酸残基序列组成的蛋白质的N端连接上信号肽序列，为了(a)中的Lc1-FEH便于纯化，可在由序列表中序列1的氨基酸残基序列组成的蛋白质的N端或C端连接上如表1所示的标签。
表1.标签的序列
| 标签 | 残基 | 序列 |
| Poly-Arg | 5-6(通常为5个) | RRRRR |
| Poly-His | 2-10(通常为6个) | HHHHHH |
| FLAG | 8 | DYKDDDDK |
| Strep-tag II | 8 | WSHPQFEK |
| c-myc | 11 | EQKLISEEDL |
上述(b)中的Lc1-FEH可人工合成，也可先合成其编码基因，再按照下述方法进行生物表达得到。上述(b)中的Lc1-FEH的编码基因可通过将序列表中序列2的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5＇端连上信号肽的编码序列，和/或在其5＇端和/或3＇端连上表1所示的标签的编码序列得到。
上述羊草果聚糖水解酶的编码基因(Lc1-FEH)也属于本发明的保护范围。
上述羊草果聚糖水解酶的cDNA基因，可具有下述核苷酸序列之一：
1)自序列表中序列2的5＇端第1—1803位核苷酸序列；
2)序列表中序列2的DNA序列；
3)编码序列表中序列1所示蛋白质序列的多核苷酸；
4)在高严谨条件下可与序列表中序列2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
其中，序列表中序列2是由2040个脱氧核苷酸组成，自序列表中序列2的5＇端第1-1803位核苷酸序列为编码序列(ORF)，编码具有序列表中序列1的氨基酸残基序列的蛋白质。
上述高严谨条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。
含有上述羊草果聚糖水解酶的编码基因的表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。
本发明还提供了上述羊草果聚糖水解酶编码基因在提高植物耐逆性中的应用。
本发明羊草果聚糖水解酶基因是能提高植物耐逆性的基因。对羊草幼苗进行干旱、冷、高盐、ABA、SA、碱等诱导，利用定量PCR方法检测胁迫前后Lc1-FEH基因的表达情况。
实验证明，其本发明的羊草果聚糖水解酶蛋白可以水解菊粉、蔗果三糖等含有β2-1糖苷键的果聚糖，受干旱、冷、高盐、ABA、SA、碱等诱导，可以参与羊草对多种逆境胁迫的响应，可能提高植物的抗逆性。Lc1-FEH及其编码基因对于培养优良的牧草品种特别是羊草品种具有重要的理论及实际意义，可应用于农牧业和生态环境治理所需的抗性植物品种的培育与鉴定，具有较高的实际应用价值。本发明在农业、畜牧业领域具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为的羊草幼苗总RNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果。
图2为Lc1-FEH片段琼脂糖凝胶电泳检测结果。
图3为Lc1-FEH3’端产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果。
图4为Lc1-FEH5’端产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果。
图5为PCR扩增的Lc1-FEH全长cDNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果。
图6为Lc1-FEH基因的组织表达结果。
图7为Lc1-FEH基因在不同非生物胁迫因子条件下的表达结果。
图8为纯化酵母表达Lc1-FEH融合蛋白SDS-PAGE电泳检测结果。
图9为酵母表达Lc1-FEH融合蛋白与羊草中果聚糖作用结果。
图10为载体p3301-BI121-Lc1-FEH结构简图。
图11为载体p3301-BI121-Lc1-FEH酶切鉴定结果。
图12为载体p3301-BI121-Lc1-FEH PCR鉴定结果。
图13为转基因水稻PCR鉴定结果。
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物合成及测序工作均由北京奥科生物科技有限责任公司完成。
实施例1、羊草果聚糖外水解酶基因Lc1-FEH cDNA全序列的获得
一、羊草果聚糖外水解酶基因Lc1-FEH全长cDNA序列的获得
1、植物材料总RNA的提取
先以羊草(Leymus chinensis(Trin.)Tzvel(吉生一号，吉林省吉生羊草良种站))幼苗为材料，提取总RNA对其进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图1所示，所提取的RNA有两条明显的电泳条带(泳道1和泳道2)，从上到下分别为28SRNA和18S RNA，表明获得了纯度较高的总RNA。
2、羊草果聚糖外水解酶基因Lc1-FEH序列片段的克隆
根据植物FEH的氨基酸残基序列，寻找保守区域，根据保守区域序列设计引物，引物序列如下：
LC1：CAGAATAACAAGTCCAAATGG；LC2：GCWGCGCTTTTGTACAAGAG。
以步骤1提取的羊草幼苗RNA为模板，用PrimeScriptTM 1st Strand cDNASynthesized Kit试剂盒(Takara公司)并参照试剂盒说明书反转来合成其第一链cDNA，反应体系为：0ligo-dT(10pmol/μl)1μl，Total RNA(≤1μg)2μl，dNTP Mixture(10mmol/l each)1.0μl，5×Buffer 4.0μl，RNase Inhibitor(40U/μl)0.5μl，PrimeScript RTase(200U/μl)0.5μl，RNase-free distilledwater 11μl；反应条件为：65℃ 5min，42℃ 45min，70℃ 15min。将合成的第一链cDNA贮存于-20℃备用。
再以获得的第一链cDNA为模板，LC1，LC2引物配对进行PCR扩增，PCR反应条件为：94℃预变性4min；94℃30s，55℃40s，72℃60s，35个循环；72℃延伸10min。
反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图2所示(泳道M为分子量标准，泳道1为PCR产物)，经PCR扩增获得了长度约750bp的目的片段。回收并纯化产物，连接到PMD-18T(宝生物工程(大连)有限公司)载体上，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，进行菌液PCR鉴定，对其进行测序并对测序结构进行BLAST分析，结果该片段长度为723bp，具有序列表中序列3的DNA序列，与植物中已知的FEH类基因的具有较高的同源性，表明该片段可能为羊草果聚糖外水解酶蛋白基因的部分序列。
3、羊草果聚糖外水解酶基因Lc1-FEH5’端及3’端序列的克隆
1)羊草果聚糖外水解酶基因Lc1-FEH3’端序列的克隆
根据步骤2获得的Lc1-FEH723bp的cDNA序列设计引物：
FEH3B：5’-GATGCCTTTGTGCCAGATAATG-3’。
以步骤2获得的第一链cDNA为模板，引物FEH3B与OligodT primer5’-GGCCACGCGTCGACTAGTACT17(数字下标表示17个T)-3’配对进行PCR扩增，PCR反应条件为：94℃预变性4min；94℃ 30s，52℃ 40s，72℃ 70s，35个循环；72℃延伸10min。
反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图3所示(泳道M为分子量标准，泳道1为3’端产物)，经PCR扩增获得了长度约1300bp的目的片段。回收并纯化3’端产物，连接到PMD-18T载体上，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，进行菌液PCR鉴定，对其进行测序并对测序结构进行BLAST分析，结果该片段长度为1373bp，具有序列表中序列4的DNA序列，与植物中已知的FEH基因的3’端序列具有较高的同源性，表明该片段可能为羊草果聚糖外水解酶蛋白基因的3’端序列。
2)羊草果聚糖外水解酶基因Lc1-FEH5’端序列的克隆
根据步骤2获得的Lc1-FEH cDNA序列设计引物：
FEH5A：5’-ATGGCSCAAGSKTGGSCCTTCBTC-3’；
FEH3A：5’-CAATACCGCAAAGAAATCCG-3’。
以步骤2获得的第一链cDNA为模板，引物FEH5A与FEH3A配对进行PCR扩增，PCR反应条件为：94℃预变性4min；94℃ 30s，54℃ 40s，72℃ 40s，35个循环；72℃延伸10min。
反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图4所示(泳道M为分子量标准，泳道1为5’端产物)，经PCR扩增获得了长度约750bp的目的片段。回收并纯化5’端产物，连接到PMD-18T载体上，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，进行菌液PCR鉴定，对其进行测序并对测序结构进行BLAST分析，结果该片段长度为753bp，具有序列表中序列5的DNA序列，与植物中已知的FEH基因的5’端序列具有较高的同源性，表明该片段可能为羊草果聚糖外水解酶蛋白基因的5’端序列。
4、羊草果聚糖外水解酶蛋白基因全长cDNA序列的获得
利用步骤3获得的长度为750bp的5’端序列和1300bp的3’端序列之间的重叠区，借助Contig软件拼接得到的Lc1-FEH全长cDNA序列，该序列具有序列表中序列2的多核苷酸序列。序列表中的序列2由2040个碱基，自序列表中序列2的5＇端第1-1803位核苷酸序列为编码序列(ORF)，编码具有序列表中序列1的氨基酸残基序列的蛋白质。序列表中的序列1由600个氨基酸残基组成，根据全长cDNA序列的两端序列设计全长引物，引物的序列如下：
引物1：5’-ATGGCSCAAGSKTGGSCCTTCBTC-3’(S，K，B是兼并碱基符号；其中S为G或C；K为G或T；B为G或C或T)；引物2：5’-ATAGAAGTAAAAAGTACACTGACTCT-3’。
以步骤1提取的羊草幼苗RNA经反转录合成的第一链cDNA为模板，加入引物1和引物2进行PCR扩增，反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图5所示(泳道M为分子量标准，泳道1为PCR产物)，经PCR扩增获得了长度约1800bp的特异片段。回收并纯化产物，连接到PMD-18T载体上，进行菌液鉴定后，对其进行测序，测序结果与上述拼接结果在扩增部分完全相同，全长为1803bp，核苷酸序列为自序列表中序列2的5＇端第1-1803位核苷酸序列，编码氨基酸序列为序列表中序列1的氨基酸残基序列的蛋白质。表明克隆的3’端和5’端片段属于同一基因，将该具有自序列表中序列2的5＇端第1-1803位核苷酸序列的基因命名为Lc1-FFH，将上述含有该Lc1-FEH基因的PMD-18T重组质粒命名为PMD-Lc1-FEH，将Lc1-FEH编码的蛋白命名为Lc1-FEH。
实施例2、Lc1-FEH及其编码蛋白Lc1-FEH的生物信息学分析
一、Lc1-FEH基因及其编码蛋白的生物信息学分析
利用DNAMAN对实施例1获得的Lc1-FEH的全长cDNA进行生物信息学分析，该序列全长1803bp(具有自序列表中序列2的5＇端第1-1803位核苷酸序列)，编码由600个氨基酸残基组成的蛋白质，氨基酸序列为序列表中序列1的氨基酸残基序列，推测其分子量为66.8kDa，等电点pI值5.49。该蛋白含有三个典型的NDPNG，FRDP和[WEC(V/P)D]结构域，自序列表中序列1的氨基端(N)第72位-第76位氨基酸残基为保守的NDPSG结构域，第196位-第199位为FRDP结构域，第251位-255位为WECPD结构域。用Signal3P(http://www.cbs.dtu.dK/services/SignalP)服务器分析Lc1-FEH具有由27个氨基酸残疾组成的信号肽，即序列表中序列1自氨基端(N端)第1位-第27位氨基酸残基，表明它是FEH家族中的一员。
二、Lc1-FEH与植物中其他已克隆的FEH类蛋白编码氨基酸序列的同源性及系统进化树分析
利用DNAMAN软件对Lc1-FEH与植物中其他已克隆的FEH类蛋白的氨基酸序列(GeneBank登陆号分别为AJ508534、AJ509808、DQ073968、AJ508387)进行同源性分析，并用MEGA3.1软件对Lc1-FEH与植物中其他已克隆的FEH类蛋白的氨基酸序列玉米(Zea mays)INV1(GeneBank登陆号：AF050129)、INV3(GeneBank登陆号：AF050631)、；蚕豆(Vicia faba)、INV2(GeneBank登陆号：Z35162)；胡萝卜(Daucus carota)INV1(GeneBank登陆号：M58362)、INV2(GeneBank登陆号：Q39692)、INV3(GeneBank登陆号：Q39693)；番茄(Lycopersicon esculentum)INV5(GeneBank登陆号：AJ27304)；烟草(Nicotiana tabacum)INV(GeneBank登陆号：X81834)；拟南芥(Arabidopsis thaliana)INV1(GeneBank登陆号：X74514)、INV2(GeneBank登陆号：U11033)、INV4(GeneBank登陆号：AB049617)、INV3(GeneBank登陆号：AB029310)、INV6(GeneBank登陆号：AY060553)、甜菜(Beta vulgaris)6-FEH(GeneBank登陆号：AJ277458)、和INV(GeneBank登陆号：AJ278531)；豌豆(Pisum sativum)INV(GeneBank登陆号：AF063246)；东亚市藜(Chenopodiumrubrum)INV(GeneBank登陆号：X81792)；草莓(Fragaria ananassa)INV(AF000521)；菊苣(Cichorium intybus)INV(GeneBank登陆号：Y11124)、1-FEHIIa(GeneBank登陆号：AJ29033)；水稻(Oryza sativa)INV(GeneBank登陆号：AB154521)；小麦(Triticum aestivum)INV(GeneBank登陆号：AF030420)、1-FEH w1(GeneBank登陆号：AJ516025)、1-FEH w2(GeneBank登陆号：AJ508387)、1-FEH w3(GeneBank登陆号：AJ564996)、6&1 FEH(GeneBank登陆号：AB089269)、6-KEH w1(GeneBank登陆号：AB089271)6-KEH w2(GeneBank登陆号：AB089270)；黑麦草(Lolium perenne L.)1-FEH a(GeneBank登陆号：DQ016297))进行系统进化树分析，同源性分析结果表明Lc1-FEH与单子叶植物小麦、大麦和黑麦草细胞壁类酵素酶同源性最高，分别为89％、87％和72％，表明Lc1-FEH与植物的胞壁类酵素酶同源性较高，而与液泡类酵素酶同源性分别为43％、49％，表明与液泡类酵素酶的同源性较低。系统进化树分子结果表明Lc1-FEH蛋白在进化过程中属于IVc类与小麦、水稻和黑麦草的亲缘关系较近。
实施例3、Lc1-FEH基因的组织特异性表达分析
分析Lc1-FEH的组织特异性表达模式，具体实验方法为：分别提取羊草(Leymuschinensis(Trin.)Tzvel(吉生一号，吉林省吉生羊草良种站))幼苗(萌发以后生长8周的苗)的根、根茎、叶鞘、叶片四种组织的总RNA，及成苗(播种大田生长1年后的苗)根、根茎、叶片、花梗、茎第二节、开花期花序、灌浆期花序、乳熟期花絮利用引物3：TGA ATG GCT ACA GTG CTG C和引物4：CCA GTC CAC CGT TAT TGC C进行RT-PCR分析，以Actin基因(扩增引物为：引物5:GCC AAC AGA GAG AAG ATG ACC和引物6：ATA GAG GGA AAG CAC CGC CT)作为内标，对cDNA模板进行定量PCR。反应结束后，检测其表达量，结果如图6所示，图6中的所示相对表达量是Lc1-FEH表达量与Actin基因表达量的比值。结果表明Lc1-FEH基因在幼苗、成苗不同组织中的表达存在差异，以叶中表达量最低，根茎中表达较高。图6中1为幼苗根、2为幼苗根茎、3为幼苗叶片、4为幼苗叶鞘、5为成苗根、6为成苗根茎、7为成苗叶片、8为花梗、9为茎第二节、10为开花期花序、11为灌浆期花序、12为乳熟期花序。
实施例4、Lc1-FEH在不同非生物胁迫因子条件下的表达模式分析
一、Lc1-FEH在不同非生物胁迫因子条件下的表达模式分析
分析Lc1-FEH在转录水平与不同非生物胁迫因子的关系，具体实验方法为：将萌发后正常生长8周的羊草幼苗分别进行低温(4℃)、高盐(300mM NaCl)、干旱(20％PEG)、脱落酸ABA(100μM)及水杨酸SA(10mM)、碱(75mM Na2CO3)胁迫处理，并于处理不同时间0、1、3、7、19、11、13、15天，提取根茎的RNA。其中低温(4℃)处理是将植株置于4℃环境下放置；高盐(处理液为浓度为300mM NaCl水溶液)、干旱(处理液为质量百分浓度为20％PEG的水溶液)、脱落酸ABA(处理液为浓度为100μM脱落酸水溶液)及水杨酸SA(处理液为浓度为10mM的水杨酸水溶液)、碱(处理液为浓度为75mM的Na2CO3水溶液)胁迫处理是各种处理液每天浇一次，每盆植株均匀浇入400ml，连续浇灌15天。
分批取材后，进行定量PCR实验分析Lc1-FEH基因在不同非生物胁迫因子条件下的表达模式，具体步骤如下：分别提取上述不同处理的羊草幼苗的总RNA后按照大连宝生物公司SYBR Prime ScriptTM RT-PCR Kit试剂盒操作说明书，用特异引物Lc1-FEHs(5’-TGAATGGCTACAGTGCTGC-3’)和Lc1-FEHas(5’-CCAGTCCACCGTTATTGCC-3’)扩增FEH基因，同时用引物：(5’-GCCAACAGAGAGAAGATGACC-3’)和actinas(5’-ATAGAGGGAAAGCACCGCCT-3’)扩增actin作为内标基因，定量PCR反应程序：先95℃，10秒，然后95℃5秒；60℃20秒40个循环。图7纵坐标表示的是处理羊草FEH基因表达量与正常条件下羊草FEH基因表达量的比，未处理条件下的比值设定为1。结果如图7所示，结果表明Lc1-FEH在转录水平明显受碱，ABA，SA及低温胁迫诱导，随着胁迫时间延长，表达量迅速增加，到达到最大值，之后表达水平逐渐降低，在盐、干旱的诱导下的表达量迅速降低(图7所示)。
实施例5、Lc1-FEH在pichia pastoris酵母表达及其水解活性分析
分析Lc1-FEH蛋白对不同的底物水解活性，具体实验方法为：
用分别带有EcoR I和Kpn I酶切位点引物P1：
5’-AGGAATTCATGGCSCAAGSKTGGSCCTTCBTC-3’(下划线标注的是EcoR I酶识别位点)和P2：5’-CAGGTACCTCAAATTACTCCTCTTGTTTTG-3’(下划线标注的是Kpn I酶识别位点)，用PCR的方法扩增出得到Lc1-FEH的编码框。将扩增产物进行测序表明，扩增片段具有序列表中序列2的核苷酸序列。
将上述PCR获得的扩增片段用EcoR I和Kpn I进行酶切，插入pPICZ α B载体(购自Invitrogen)的EcoR I和Kpn I酶切位点之间，得到重组载体，经过酶切和测序验证，将经验证表明含有序列表中序列2的核苷酸序列的正确的重组表达载体命名为pPICZ α B-Lc1-FEH。
用电击法将pPICZ α B-Lc1-FEH转入P.pastoris X-33菌株(购自Invitrogen)得到可表达Lc1-FEH的工程菌株，各取转化细胞200μL均匀涂布于含100mg/LZeocin的YPD(含1％(质量百分含量)酵母提取物，2％(质量百分含量)胰蛋白胨，2％(质量百分含量)葡萄糖，每100ml加入2g琼脂粉灭菌后得到的培养基)平板，30℃静置培养，长出的菌落(Mut+(甲醇利用型菌)P.pastoris转化子单菌落)即为转入pPICZ α B-Lc1-FEH的工程菌株，对这些菌落提取质粒并进行PCR和测序检测，将检测表明正确的含有pPICZ α B-Lc1-FEH的工程菌株命名为X-33-pPICZ α B-Lc1-FEH。
将X-33-pPICZ α B-Lc1-FEH接种于25mL BMGY(含1％(质量百分含量)的酵母提取物，2％(质量百分含量)的胰蛋白胨，1％(质量百分含量)的甘油，1.34％(质量百分含量)的YNB((含有硫酸铵、无氨基酸的酵母基础氮源培养基，成分为：3.4g酵母基础氮源培养基(无硫酸铵)(上海麦莎生物科技有限公司)+10g硫酸铵，溶于1000ml水中，过滤除菌)和4×10-5％(质量百分含量)的生物素的培养基)培养基，30℃振荡培养至OD600为2-6，离心收集细胞，重悬于100-200mL BMMY(含有1％(质量百分含量)的酵母提取物，2％(质量百分含量)的胰蛋白胨，0.5％(质量百分含量)的甲醇，1.34％(质量百分含量)的YNB(含有硫酸铵、无氨基酸的酵母基础氮源培养基，成分为：3.4g酵母基础氮源培养基(无硫酸铵)(上海麦莎生物科技有限公司)+10g硫酸铵，溶于1000ml水中，过滤除菌)和4×10-5％(质量百分含量)的生物素的培养基)中，继续培养。每24h补加甲醇1次，至终浓度为1g/L。培养72小时后，进行如下蛋白提取和检测。同时，将P.pastoris X-33菌株(购自Invitrogen)进行相同的培养，并进行如下蛋白提取纯化和检测作为对照。
按照Liesbet Van Riet等(Liesbet Van Riet，Vinay Nagaraj，Wim Van den Ende，Stefan Clerens，Andres Wiemken and Andre＇Van Laerel.2006.Purification，cloning and functional characterization of a fructan 6-exohydrolase fromwheat(Triticum aestivum L.)Journal of Experimental Botany.57，213-223.)的方法纯化蛋白，后进行进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白表达，结果如图8所示，结果表明，X-33-pPICZ α B-Lc1-FEH表达得到66.8kDa大小的Lc1-FEH蛋白(图8中泳道1)，而P.pastoris X-33菌株对照表达蛋白没有该66.8kDa大小的Lc1-FEH蛋白(图8中泳道2)。图8中，泳道M为分子量标准，泳道1为X-33-pPICZ α B-Lc1-FEH表达并纯化得到的蛋白，泳道2为P.pastoris X-33菌株表达并纯化得到的蛋白。
将获得的纯化蛋白用PH5.0醋酸钠稀释1-2倍后，加入不同的底物(蔗果三糖、蔗果四糖、细菌类果聚糖(WAKO)、菊粉、6-蔗果三糖，新蔗果三糖、蔗糖，至底物浓度为5mM，在30℃孵育进行水解反应，调节蛋白的含量及反应时间使其水解反应成线性阶段，后在90℃加热5min终止反应，反应产物分别用高效阴离子交换色谱仪Carbo Pac PA-1柱分析检测产物。色谱仪按照洗脱的峰面积计算出产物果糖的含量，将其最适底物蔗果三糖水解后得到的果糖量定义为100％，其它底物水解后得到的果糖量与其相比值为其相对活性结果表2所示。同时将纯化蛋白稀释与羊草中分离的果聚糖按照Morvand等的方法(Morvand-Betrand A，Boucaud J，Le Saos J，Prud’homme MP.2001.Roles of the fructans from the elongating leaf bases inthe regrowth following defoliation of Lolium perenne L.Planta 213，109-120)制备，反应48小时用高效阴离子交换色谱仪Carbo Pac PA-1柱分析检测产物结果如图9所示。结果表明Lc1-FEH蛋白能水解菊粉、蔗果三糖、蔗果四糖而对细菌类果聚糖、6-蔗果三糖、新蔗果三糖和蔗糖基本无水解作用(表2)；能水解羊草中分离的6，1蔗果三糖，但对6，6蔗果三糖基本无水解作用(图9)。因此表明Lc1-FEH蛋白能够专一水解β-2，1糖苷键，而对β-2，6糖苷键没有水解作用。说明本发明的Lc1-FEH具有羊草果聚糖水解酶活性。
表2.Lc1-FEH融合蛋白与不同底物水解作用结果
| 底物 | 底物糖苷键的类型 | 聚合度 | 相对活性(％) |
| 蔗果三糖 | β-2，1糖苷键 | 3 | 100 |
| 蔗果四糖 | β-2，1糖苷键 | 4 | 87 |
| 菊粉 | β-2，1糖苷键 | >10 | 47 |
| 6-蔗果三糖 | β-2，6糖苷键 | 3 | 6 |
| 新蔗果三糖 | β-2，6糖苷键 | 3 | 3 |
| 果聚糖(细菌) | β-2，6糖苷键 | 72 | <1 |
| 蔗糖 | 既是α-1，2-苷键又是β-2，1-苷键 | 2 | <1 |
实施例6 Lc1-FEH编码蛋白的抗逆功能验证
一、Lc1-FEH植物表达载体的构建
将PMD-Lc1-FEH用XbalI和SacI双酶切，回收切下的约1800bp的含有Lc1-FEH的片段，将植物表达载体p3301-BI121(购自CAMBIA)用XbalI和SacI双酶切，回收11.4kb的片段，约1800bp的含有Lc1-FEH的片段和11.4kb的片段连接，得到含有Lc1-FEH完整读码框的高效植物双元表达重组载体，将其命名为p3301-BI121-Lc1-FEH(结构简图见图10)。
对构建好的植物表达载体p3301-BI121-Lc1-FEH用Xbal I和Sac I进行双酶切鉴定，对酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图11所示，经酶切获得一条1800bp的条带，表明目的片段已正确连接入表达载体中。图11中，泳道M是分子量标准，泳道1为p3301-BI121-Lc1-FEH酶切鉴定电泳图。
同时用Lc1-FEH特异引物(引物1：5’-ATGGCSCAAGSKTGGSCCTTCBTC-3’；引物2：5’-ATAGAAGTAAAAAGTACACTGACTCT-3’)，以植物表达载体p3301-BI121-Lc1-FEH为模板(图12中泳道1)，以连有Lc1-FEH基因的克隆载体pMD18-T质粒(PMD-Lc1-FEH)为对照(图12中泳道2)，进行PCR检测，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图12所示，以植物表达载体p3301-BI121-Lc1-FEH为模板PCR扩增出一条1800bp的条带，进一步证明Lc1-FEH基因片段已正确连接到载体中，获得了插入序列的Lc1-FEH植物表达载体。图12中，泳道M为分子量标准，泳道1为以植物表达载体p3301-BI121-Lc1-FEH为模板的PCR产物，泳道2为以PMD-Lc1-FEH为模板的的PCR产物。
二、Lc1-FEH转基因水稻(转p3301-BI121-Lc1-FEH水稻)的获得
将步骤一构建的植物表达载体p3301-BI121-Lc1-FEH通过冻融法导入农杆菌EHA105(invitrogen公司)中，筛选重组菌株，将该重组菌株提取质粒进行酶切和测序鉴定，将鉴定表明正确的含有p3301-BI121-Lc1-FEH的重组菌株命名为EHA-Lc1-FEH。
水稻品种台北309(Oryza sativa L.ssp.Japonica.cv.Taipei 309，购自中国农科院水稻研究所)种子在N6D培养基(Chu C.C，Wang C.S，Sun C.C，Hsu C，YinK.C，Chu C.Y.1975.Establishment of efficient medium of anther culture of ricethrought comparative experiments on nitrogen sources.Sci.Sinica，18：659-668；中国科学院植物研究所)上黑暗培养2周后，切下愈伤组织，挑选致密的小块，用EHA-Lc1-FEH菌液浸染，然后按照下述步骤进行筛选和驯化培养：
1)将侵染后的愈伤组织接种于N6D培养基上25-28℃下暗培养3天。
2)将步骤1)培养后的愈伤组织转接到含有10mg/L ppt(除草剂)(sigma公司)的分化培养基(Hiei，Y.S.Ohta，T.Komeri and T.Kumashiro.1994.Efficienttransformat ion of rice mediated by Agrobacterium and sequence analysis of thebounderies of T-DNA.Plant J.6：271-282；中国科学院植物研究所)上，26℃进行分化培养，35天后，待小芽长至5cm转入生根培养基(1/2MS)上，26℃生根培养，待小苗长至8-10cm左右进行驯化后移栽到温室即得到转p3301-BI121-Lc1-FEH水稻。
将转p3301-BI121-Lc1-FEH水稻植株进行PCR检测，以Lc1-FEH特异引物(引物1：5’-ATGGCSCAAGSKTGGSCCTTCBTC-3’；引物2：5’-ATAGAAGTAAAAAGTACACTGACTCT-3’)为引物，以转p3301-BI121-Lc1-FEH水稻植株基因组DNA为模板，进行PCR扩增，扩增得到约1800bp的含有Lc1-FEH基因的片段，即为检测阳性。以相同PCR引物扩增的野生型台北309水稻和PMD-Lc1-FEH质粒为对照。结果如图13所示，结果共获得阳性转p3301-BI121-Lc1-FEH水稻植株6株。图13中，泳道1为PMD-Lc1-FEH质粒的扩增结果；泳道2为野生型水稻扩增结果，泳道3-8为转p3301-BI121-Lc1-FEH水稻植株的扩增结果。
三、Lc1-FEH转基因水稻的抗逆性实验
将步骤二获得的6株PCR检测阳性的转p3301-BI121-Lc1-FEH水稻植株的种子播种于含10mg/L ppt(除草剂)(sigma公司)的1/4MS固体培养基平板(抗性平板)上，使其萌发，在抗性平板上26℃生长两周后，将幼苗栽入土中，在温室中培养两周后，将水稻幼苗分成2组，一组置6℃，光下低温处理(胁迫组)4d，另一组置25℃光照培养作对照。同时将野生型水稻品种台北309(Oryza sativaL.ssp.Japonica.cv.Taipei 309)，购自中国农科院水稻研究所)播种于1/4MS固体培养基上，使其萌发并于26℃生长两周其余操作与转p3301-BI121-Lc1-FEH水稻植株相同，作为野生型对照。1/4MS培养基含有MS培养基所含组分，其中，所含大量元素浓度为MS培养基的1/4，其余组分的浓度与MS培养基相同。
将上述处理4d后的转p3301-BI121-Lc1-FEH水稻植株或野生型对照植株分别测定各项生理指标(叶绿素含量、根系活力和细胞膜透性)。叶绿素含量测定采用分光光度计比色法，80％丙酮提取色素；根系活力测定采用TTC法测根系脱氢酶活性；细胞膜透性采用DDS-307型电导率仪测定叶片细胞的外渗电导率(郝再彬，苍晶，徐仲主编.植物生理学实验技术〔M〕1哈尔滨：哈尔滨出版社，2002，21)。各项指标所反映的水稻幼苗的相对变化率是以25℃测定值(A)对6℃测定值(B)的表示，即：相对变化率＝|A-B|×100％/A。
结果表明，转p3301-BI121-Lc1-FEH水稻幼苗经6℃处理四天没有发生冻害现象，而野生型水稻对照植株经6℃处理四天出现了黄叶。
6个转p3301-BI121-Lc1-FEH水稻株系(表3中转基因水稻1-转基因水稻6)幼苗的三个生理指标均比野生型对照的相对变化率小，说明在低温处理下转基因植株的耐冷能力优于对照，而对照植株则变化较大，的受冷后叶绿素含量、TTC还原强度均大幅下降同时外渗电导则大幅增加，结果如表3所示。
上述实验说明本发明的Lc1-FEH可以增强植物的耐低温能力，从而可作为植物耐冷基因工程候选基因加以应用，用来改良植物的抗冷性状。
表3.低温胁迫对水稻幼苗3种生理指标的影响及其相对变化率
序列表
<160>5
<210>1
<211>600
<212>PRT
<213>羊草(Leymus chinensis(Trin.)Tzvel)
<400>1
<210>2
<211>2040
<212>DNA
<213>羊草(Leymus chinensis(Trin.)Tzvel)
<400>2
<210>3
<211>723
<212>DNA
<213>羊草(Leymus chinensis(Trin．)Tzvel)
<400>3
<210>4
<211>1373
<212>DNA
<213>羊草(Leymus chinensis(Trin.)Tzvel)
<400>4
<210>5
<211>753
<212>DNA
<213>羊草(Leymus chinensis(Trin.)Tzvel)
<400>5
Claims (11)
1.一种羊草果聚糖水解酶，其氨基酸序列是序列表中序列1。
2.权利要求1所述的羊草果聚糖水解酶的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述羊草果聚糖水解酶的cDNA基因是自序列表中序列2的5′端第1-1803位核苷酸序列。
4.含有权利要求2或3所述的羊草果聚糖水解酶编码基因的重组表达载体。
5.含有权利要求2或3所述的羊草果聚糖水解酶编码基因的转基因细胞系。
6.含有权利要求2或3所述的羊草果聚糖水解酶编码基因的宿主菌。
7.权利要求2或3所述的羊草果聚糖水解酶编码基因在提高植物耐逆性中的应用，所述提高植物耐逆性为提高植物抗冷性。
8.权利要求1所述的羊草果聚糖水解酶在提高植物耐逆性中的应用，所述提高植物耐逆性为提高植物抗冷性。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于：所述植物为农作物。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述植物为水稻。
11.权利要求1所述的羊草果聚糖水解酶及其编码基因在水解具有β-2，1糖苷键的果聚糖中的应用。
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