CN112391394A - 一个水稻稻瘟病抗性相关基因OsCYS及其在基因工程中的应用 - Google Patents

一个水稻稻瘟病抗性相关基因OsCYS及其在基因工程中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于基因工程领域，涉及一个水稻稻瘟病抗性相关基因OsCYS及其在基因工程中的应用。水稻基因OsCYS，是水稻miR1439的靶基因，该基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明公开了水稻基因OsCYS，为水稻中首次报道，该基因是根据分析黑壳子粳接种稻瘟病菌前后基因芯片和iTRAQ蛋白组学结果，筛选到的一个明显受稻瘟病病菌诱导且与水稻miR1439相关的水稻基因。mRNA表达分析表明该基因受稻瘟病菌接种诱导，并且转基因水稻植株的苗瘟、穗瘟抗性都表现增强。因此可利用该基因构建CRISPR转基因材料，提高植物抗病性，以进行植物品种改良。

Description

一个水稻稻瘟病抗性相关基因OsCYS及其在基因工程中的 应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，涉及一个水稻microRNA靶向的稻瘟病抗性相关基因OsCYS及其在基因工程中的应用。
背景技术
MicroRNA(miRNA)是在大多数真核生物中引导基因沉默的短调控非编码RNA，它可以通过触发靶基因转录本的序列特异性剪切或翻译抑制来调节基因表达。miRNA在水稻的生长发育、响应非生物胁迫以及抗稻瘟病病菌中都发挥着十分重要的作用
本发明克隆的OsCYS为水稻miR1439的靶基因，水稻基因OsCYS的表达明显受稻瘟病病菌接种诱导，其CRISPR转基因植株的抗稻瘟性明显增强。研究OsCYS的功能并将其在抗病基因工程中加以应用，对提高水稻稻瘟病抗性有着重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于公开水稻基因OsCYS。
本发明的另一目的是提供稻瘟病抗性相关基因OsCYS的基因工程应用。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
水稻miR1439靶基因OsCYS，该基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明所述的水稻基因OsCYS编码的水稻蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
针对本发明所述的水稻基因OsCYS的CRISPR载体。
作为本发明的一种优选，所述的CRISPR载体是将以pCBC-MT1T2为模板,P3、P4、P5、P6为引物，进行四引物PCR扩增获得的扩增片段连接到pHUE411载体BsaI和BsaI之间所得，其中，P3、P4、P5、P6的引物序列分别为：SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ IDNO.8。
本发明所述的水稻基因OsCYS在通过基因工程手段培育稻瘟病抗性品种中的应用。
作为本发明的一种优选，通过基因工程手段抑制、沉默或敲除本发明所述的水稻基因OsCYS的表达，以提高水稻对稻瘟病的抗性。
作为本发明的进一步优选，所述的应用包括如下步骤：
以pCBC-MT1T2为模板，P3、P4、P5、P6为引物进行四引物PCR扩增，扩增产物连接到pHUE411载体上，构建pHUE411-OsCYS载体，测序鉴定确保载体中编码区阅读框架正确；将获得的pHUE411-OsCYS载体转入大肠杆菌筛选，然后通过转入农杆菌最后转入水稻感稻瘟病菌品种“苏御糯”，经验证获得稻瘟病抗性品种；其中，P3、P4、P5、P6的引物序列分别为：SEQID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8。
本发明所述的水稻基因OsCYS的CRISPR载体在通过基因工程手段培育稻瘟病抗性品种中的应用。
有益效果
1、本发明公开了水稻miR1439靶基因OsCYS。水稻基因OsCYS为水稻中首次报道，黑壳子粳接种稻瘟病菌前后基因芯片分析、iTRAQ蛋白组学结果和mRNA表达分析表明该基因的表达受稻瘟病病菌明显诱导。因此可以利用该基因对植物品种进行改良，从而提高植物的抗病性。
2、本发明的OsCYS基因来自水稻，具有适合于水稻等单子叶植物表达的优化密码子，其基因工程受体植物除了双子叶植物，如大豆、棉花、烟草等之外更加适合于水稻、玉米、小麦等单子叶植物。
3、本发明构建CRISPR载体获得转基因植株，获得的转基因植株抗性明显增强，说明该基因与水稻稻瘟病抗性有关，具有基因工程应用价值。
4、本发明的OsCYS基因，可以通过CRISPR技术对该基因进行敲除，获得纯合的转基因材料，在对转基因后代进行Cas9-free的PCR验证以获得的Cas9-free纯合突变体可直接推广运用，大大缩短了抗性品种的培育时间。
具体实施方式
实施例1
1)总RNA的提取选用水稻品种“黑壳子粳”(为太湖流域粳稻地方品种，为抗稻瘟病菌品种)，待水稻幼苗长至3-4叶期后，用稻瘟病菌孢子进行接种处理，分别取处理后0h，4h，8h，12h，24h，48h的叶片，立即用液氮冷冻，保存于-80℃冰箱。分别取部分叶片，用研钵研碎，转移入盛有Trizol裂解液的1.5mL EP管(TRIzol Reagents,购自Invitrogen,USA)，充分振荡后，抽提总RNA，电泳鉴定总RNA质量。
2)水稻基因OsCYS的克隆分析黑壳子粳接种稻瘟病前后的蛋白质组学结果发现该基因受到稻瘟病菌接种的明显诱导(未发表的数据)。以日本晴基因OsCYS序列为探针序列，搜索水稻基因组序列和EST序列数据库，拼接得到1453bp水稻基因OsCYS的全长序列，并设计两端引物P1和P2：
P1:5-AAACAGCCTTTGCTTTCC-3(SEQ ID NO.3)，
P2:5-CACTACTCGTTGTAATCTACC-3(SEQ ID NO.4)
以步骤1)获得的总RNA反转录合成的cDNA第一链为模板，以P1和P2为引物，用高保真酶(购自南京诺唯赞公司)进行PCR扩增，PCR程序如下：95℃预变性5min，95℃变性40sec，56℃复性40sec，72℃延伸90sec，30个循环后，72℃延伸5min，最后72℃延伸10min后连接至pEASY-T1 Blunt载体，委托南京思普金公司测序获得水稻基因OsCYS的cDNA序列SEQ IDNO.1。
分析上述获得的水稻基因OsCYS的cDNA序列SEQ ID NO.1及其编码蛋白SEQ IDNO.2。
实施例2
用实施例1中设计的引物P1、P2进行实时定量RT-PCR分析接种处理后水稻3-4叶期地上部幼苗的表达，结果表明，接种稻瘟病菌孢子6小时后OsCYS的表达明显降低，表明OsCYS基因的表达与稻瘟病菌处理有关。
实施例3
按照CRISPR实验设计标准流程分析目标基因序列，登录网站(http://www.genome.arizona.edu/crispr/CRISPRserach.html)筛选靶点，并设计引物P3、P4、P5、P6。
P3:5-AATAATGGTCTCAGGCGCCACCGTGTCCGCCGCCTA-3(SEQ ID NO.3)
P4:5-GCCACCGTGTCCGCCGCCTAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3(SEQ ID NO.4)
P5:5-CGGCGAGGGGTCGGCGAGGCGCTTCTTGGTGCC-3(SEQ ID NO.5)
P6:5-ATTATTGGTCTCTAAACCGGCGAGGGGTCGGCGAGG-3(SEQ ID NO.6)
以pCBC-MT1T2为模板，以P3、P4、P5、P6为引物进行四引物PCR扩增，建立酶切-连接体系，将四引物PCR扩增片段连接到pHUE411载体上，构建pHUE411-OsCYS载体，测序鉴定确保载体中编码区阅读框架正确。
4)转基因植株的获得和抗性鉴定将步骤3)获得的pHUE411-OsCYS载体转入大肠杆菌筛选，进而转入农杆菌，最后转入水稻感稻瘟病品种“苏御糯”，对获得的转基因植株进行real time PCR验证后进行水稻的抗病性评价。将生长至3-4叶期的转基因T1代植株进行稻瘟病菌孢子接种处理，7天后调查植株的平均病级数为3级，发病叶片平均病斑数目为7个及病斑平均长度为2.90mm，而对照植株的平均病级数为4级以及发病叶片平均病斑数目为15个及病斑平均长度为3.60mm，对孕穗期的转基因T1代植株进行稻瘟病菌注射接菌，调查植株的平均抗级数为5级，平均病粒率为24.17％，而对照植株的平均抗级数为7级以及平均病粒率为46.62％，结果表明，转基因植株与对照相比表现出对稻瘟病菌的明显抗性。
综上所述，本发明人提供的OSCYS基因是在水稻中分离的新基因，其功能与水稻抗病性相关，可以利用该基因对植物品种进行改良，从而提高植物的抗病性。通常先利用本发明OsCYS基因作为目的基因构建CRISPR载体，通过菌液PCR及测序鉴定载体构建情况，以农杆菌介导法为主要方法转化至目标植物，通过基因工程手段培育稻瘟病抗性品种。
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 一个水稻稻瘟病抗性相关基因OsCYS 及其在基因工程中的应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1453
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa)
<400> 1
attgaagctg cccttaaaca gcctttgctt tccccctccc taaaaccccc cgcagcggcg 60
cagcgccacc tctcctcctc agccgaagcg tcggggccat ggccatggcg atggcgtcgc 120
cgcccgcttg cccattcctc ctctcgctct cggccggcgc caccgccatt tccaccgtgt 180
ccgccgccta cggttccgtt tccgccccgc gcgcgcctct cttcctcctc gcctccccgc 240
gtcccgtccc gcctcgccga cccctcgccg cgggctcctc atctcccaag gccgcggcac 300
ccgccgccgt cgagatcccc gaggagtacg tggacgatgt tgatgcggtg aacattgcgc 360
aggacgtcac ccagctgatt gggaaaaccc caatggtgta tctgaataat gttgtcgacg 420
gatgtgttgc taatatcgct gcaaaacttg agtacatggg accttgcagg agcgtcaaag 480
acaggattgg attaagcatg attaatgatg ctgaagagaa aggattaatt tttccaaaca 540
agaccatttt ggttgaacca actactggaa atactggtat aggcctagct tctgtggctg 600
ctgctagggg atacaagcta atagcaactg taccttcatc aatagatgtt gagagatgtg 660
ttcttctacg tgcatttgga gctgagattg tgttaactga tcctaacaag ggactaaaag 720
gagctcttga taaagcagag gaaattgttt cgaagacacc aaatgcatac atgtttcagc 780
agtttaacaa ttccgctaat agtgagatcc actttcaaac cacaggccca gaaatatggg 840
aagacacctt gggtactgtt gacatactag ttgcaagcat tggcacaggt ggcaccatta 900
caggcactgg gcgttatctg aaaatgatga acaaagatat taaggttatt ggggtagaac 960
ctgctgaaac tagtgtaatc tctggtgata atgctggtta tattccaagc atattagatg 1020
ttcagctgct tgatgaagtt gtgaaggtta ccaccacaga ggcagtcgat gttgcaaggg 1080
aacttgcact aaaagagggc ctgctggttg gcatttcgtc aggtgctgcc acagttgctg 1140
ctattaacgt cgctaaaaga cctgaaaatg ctggaaaatt gattgcggtt attttcccca 1200
gctttggaga aagatatatc tctagcattt tattccgtcc gatatatgac tcggtccgaa 1260
gaatgaggaa gagataacta acttctgcca ctccaggaag aagaaggttg ccagttctta 1320
aacctaacat acttccacgg cataacagat tttgaagggt gaggttccag gtagattaca 1380
acgagtagtg aagggcagct tggcgtaatc atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg 1440
ttatccgctc aca 1453
<210> 2
<211> 392
<212> PRT
<213> 水稻(Oryza sativa)
<400> 2
Met Ala Met Ala Met Ala Ser Pro Pro Ala Cys Pro Phe Leu Leu Ser
1 5 10 15
Leu Ser Ala Gly Ala Thr Ala Ile Ser Thr Val Ser Ala Ala Tyr Gly
20 25 30
Ser Val Ser Ala Pro Arg Ala Pro Leu Phe Leu Leu Ala Ser Pro Arg
35 40 45
Pro Val Pro Pro Arg Arg Pro Leu Ala Ala Gly Ser Ser Ser Pro Lys
50 55 60
Ala Ala Ala Pro Ala Ala Val Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Val Asp Asp
65 70 75 80
Val Asp Ala Val Asn Ile Ala Gln Asp Val Thr Gln Leu Ile Gly Lys
85 90 95
Thr Pro Met Val Tyr Leu Asn Asn Val Val Asp Gly Cys Val Ala Asn
100 105 110
Ile Ala Ala Lys Leu Glu Tyr Met Gly Pro Cys Arg Ser Val Lys Asp
115 120 125
Arg Ile Gly Leu Ser Met Ile Asn Asp Ala Glu Glu Lys Gly Leu Ile
130 135 140
Phe Pro Asn Lys Thr Ile Leu Val Glu Pro Thr Thr Gly Asn Thr Gly
145 150 155 160
Ile Gly Leu Ala Ser Val Ala Ala Ala Arg Gly Tyr Lys Leu Ile Ala
165 170 175
Thr Val Pro Ser Ser Ile Asp Val Glu Arg Cys Val Leu Leu Arg Ala
180 185 190
Phe Gly Ala Glu Ile Val Leu Thr Asp Pro Asn Lys Gly Leu Lys Gly
195 200 205
Ala Leu Asp Lys Ala Glu Glu Ile Val Ser Lys Thr Pro Asn Ala Tyr
210 215 220
Met Phe Gln Gln Phe Asn Asn Ser Ala Asn Ser Glu Ile His Phe Gln
225 230 235 240
Thr Thr Gly Pro Glu Ile Trp Glu Asp Thr Leu Gly Thr Val Asp Ile
245 250 255
Leu Val Ala Ser Ile Gly Thr Gly Gly Thr Ile Thr Gly Thr Gly Arg
260 265 270
Tyr Leu Lys Met Met Asn Lys Asp Ile Lys Val Ile Gly Val Glu Pro
275 280 285
Ala Glu Thr Ser Val Ile Ser Gly Asp Asn Ala Gly Tyr Ile Pro Ser
290 295 300
Ile Leu Asp Val Gln Leu Leu Asp Glu Val Val Lys Val Thr Thr Thr
305 310 315 320
Glu Ala Val Asp Val Ala Arg Glu Leu Ala Leu Lys Glu Gly Leu Leu
325 330 335
Val Gly Ile Ser Ser Gly Ala Ala Thr Val Ala Ala Ile Asn Val Ala
340 345 350
Lys Arg Pro Glu Asn Ala Gly Lys Leu Ile Ala Val Ile Phe Pro Ser
355 360 365
Phe Gly Glu Arg Tyr Ile Ser Ser Ile Leu Phe Arg Pro Ile Tyr Asp
370 375 380
Ser Val Arg Arg Met Arg Lys Arg
385 390
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aaacagcctt tgctttcc 18
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cactactcgt tgtaatctac c 21
<210> 5
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aataatggtc tcaggcgcca ccgtgtccgc cgccta 36
<210> 6
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gccaccgtgt ccgccgccta gttttagagc tagaaatagc 40
<210> 7
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cggcgagggg tcggcgaggc gcttcttggt gcc 33
<210> 8
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
attattggtc tctaaaccgg cgaggggtcg gcgagg 36

Claims (8)

1.水稻基因OsCYS，其特征在于该基因为水稻miR1439的靶基因，且cDNA序列如SEQ IDNO.1所示。
2.权利要求1所述的水稻基因OsCYS编码的水稻蛋白，其特征在于其氨基酸序列如SEQID NO.2所示。
3.针对权利要求1所述的水稻基因OsCYS的CRISPR载体。
4.根据权利要求3所述的CRISPR载体，其特征在于所述的CRISPR载体是将以pCBC-MT1T2为模板,P3、P4、P5、P6为引物，进行四引物PCR扩增获得的扩增片段连接到pHUE411载体BsaI和BsaI之间所得，其中，P3、P4、P5、P6的引物序列分别为：SEQ ID NO.5、SEQ IDNO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8。
5.权利要求1所述的水稻基因OsCYS在通过基因工程手段培育稻瘟病抗性品种中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于通过基因工程手段抑制、沉默或敲除权利要求1所述的水稻基因OsCYS的表达，以提高水稻对稻瘟病的抗性。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于包括如下步骤：
以pCBC-MT1T2为模板，P3、P4、P5、P6为引物进行四引物PCR扩增，扩增产物连接到pHUE411载体上，构建pHUE411-OsCYS载体，测序鉴定确保载体中编码区阅读框架正确；将获得的pHUE411-OsCYS载体转入大肠杆菌筛选，然后通过转入农杆菌最后转入水稻感稻瘟病菌品种“苏御糯”，经验证获得稻瘟病抗性品种；其中，P3、P4、P5、P6的引物序列分别为：SEQID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8。
8.权利要求3或4所述的水稻基因OsCYS的CRISPR载体在通过基因工程手段培育稻瘟病抗性品种中的应用。
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