CN114908105B

CN114908105B - 一个水稻抗稻瘟病相关基因OsPsbR及其基因工程应用

Info

Publication number: CN114908105B
Application number: CN202210621109.1A
Authority: CN
Inventors: 鲍永美; 赵�智; 潘晓倩; 张红生; 黄骥; 王建飞; 余耀; 唐海娟; 董世楠; 张成成
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2022-05-19
Filing date: 2022-06-02
Publication date: 2023-07-14
Anticipated expiration: 2042-06-02
Also published as: CN114908105A

Abstract

本发明属于基因工程领域，涉及一个水稻稻瘟病抗性相关基因OsPsbR及其在基因工程中的应用。水稻基因OsPsbR编码水稻叶绿体光系统Ⅱ亚基蛋白，该基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明公开了水稻基因OsPsbR，为水稻中首次报道，该基因编码蛋白是通过抗稻瘟病相关SNARE囊泡蛋白OsSYP121酵母文库筛选鉴定得到的，与OsSYP121存在互作。qRT‑PCR表达分析表明OsPsbR受稻瘟病菌接种诱导，并且OsPsbR过表达转基因材料水稻植株的苗瘟抗性增强。因此可利用该基因构建过表达转基因材料，提高植物抗病性，以进行植物品种改良。

Description

一个水稻抗稻瘟病相关基因OsPsbR及其基因工程应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一个水稻的稻瘟病抗性相关基因OsPsbR及其在基因工程中的应用。

背景技术

叶绿体是植物光合作用的场所，且与植物免疫反应密切相关，参与合成植物免疫反应的重要信号物质，如激素水杨酸、茉莉酸和脱落酸，以及Ca²⁺和ROS等次生信使。PsbR(photosystem II subunit R)为叶绿体光系统Ⅱ亚基，其作为停泊蛋白，对光系统Ⅱ的正确组装以及光合作用的正常进行具有重要作用。PsbR突变体中光系统Ⅱ的稳定性降低，电子传递速率减慢，非光化学淬灭减少，光合作用受到抑制。但尚未有研究报道PsbR作为抗病相关基因，参与植物的免疫反应。

发明内容

本发明的目的在于公开水稻基因OsPsbR。

本发明的另一目的是提供稻瘟病抗性相关基因OsPsbR的基因工程应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

水稻编码叶绿体蛋白基因OsPsbR，该基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明所述的水稻基因OsPsbR编码的水稻蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明所述的水稻基因OsPsbR的过表达载体。

作为本发明的一种优选，所述的过表达载体是以水稻品种黑壳子粳的cDNA为模板，扩增水稻基因OsPsbR的CDS序列，连接到pCAMBIA1300s载体上，构建得到1300s-OsPsbR载体。

所诉的水稻基因OsPsbR的过表达转基因材料与野生型苏御糯相比，稻瘟病抗性增强。

作为本发明的进一步优选，所述的应用包括如下步骤：

所述的过表达载体是以水稻品种黑壳子粳的cDNA为模板，扩增水稻基因OsPsbR的CDS序列，连接到pCAMBIA1300s载体上，构建1300s-OsPsbR载体，测序鉴定确保载体中序列的正确；将获得的1300s-OsPsbR载体转入大肠杆菌筛选，然后通过转入农杆菌最后转入水稻感稻瘟病菌品种苏御糯；其中，扩增基因cDNA的引物P9、P10的序列分别为SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12。

本发明所述的水稻基因OsPsbR通过基因工程手段培育稻瘟病抗性品种中的应用。

本发明所述的重组表达载体在通过基因工程手段培育稻瘟病抗性品种中的应用。

作为本发明的一种优选，通过基因工程手段，将本发明所述的重组表达载体导入感病的水稻品种中，以提高水稻对稻瘟病的抗性。

有益效果

1、本发明公开了水稻叶绿体蛋白基因OsPsbR。水稻基因OsPsbR为水稻中首次报道，黑壳子粳接种稻瘟病菌前后qRT-PCR表达水平分析表明该基因的表达受稻瘟病病菌明显诱导。因此可以利用该基因对植物品种进行改良，从而提高植物的抗病性。

2、本发明的OsPsbR基因来自水稻，具有适合于水稻等单子叶植物表达的优化密码子，其基因工程受体植物除了双子叶植物，如大豆、棉花、烟草等之外更加适合于水稻、玉米、小麦等单子叶植物。

3.本发明的OsPsbR基因，通过CRISPR/Cas9技术获得敲除表达转基因材料，表型鉴定表明，与野生型相比，转基因材料的稻瘟病抗性降低。说明该基因与水稻稻瘟病抗性有关，具有基因工程应用价值。

4、本发明构建过表达载体，转化水稻中，获得转基因植株，培育稻瘟病抗性品种。

附图说明

图1 OsPsbR受稻瘟病菌诱导的表达模式分析

图2 OsPsbR敲除表达转基因株系类型

图3 OsPsbR敲除表达转基因株系接菌鉴定

A.接种Hoku1后，野生型苏御糯(Su)和OsPsbR敲除表达转基因株系的稻瘟病菌抗性表型

B.野生型苏御糯(Su)和OsPsbR敲除表达转基因株系中的稻瘟病菌相对生长量

C.野生型苏御糯(Su)和OsPsbR敲除表达转基因株系中的病斑数目

D.野生型苏御糯(Su)和OsPsbR敲除表达转基因株系中的病斑长度

图4 OsPsbR过表达转基因株系的鉴定

A.通过PCR对OsPsbR过量表达转基因阳性株系进行鉴定

B.通过qRT-PCR对野生型苏御糯(Su)和OsPsbR过量表达阳性转基因株系中OsPsbR的转录水平进行鉴定

图5 OsPsbR过表达转基因株系接菌鉴定

A.接种Hoku1后，野生型苏御糯(Su)和OsPsbR过量表达转基因株系的稻瘟病菌抗性表型

B.野生型苏御糯(Su)和OsPsbR过量表达转基因株系中稻瘟病菌的相对生长量

C.野生型苏御糯(Su)和OsPsbR过量表达转基因株系中的病斑数目

D.野生型苏御糯(Su)和OsPsbR过量表达转基因株系中的病斑长度

具体实施方式

实施例1

1)总RNA的提取选用水稻品种“黑壳子粳”(为太湖流域粳稻地方品种，为抗稻瘟病菌品种)和“苏御糯”(为太湖流域粳稻地方品种，为感稻瘟病菌品种)，待水稻幼苗长至3-4叶期后，用稻瘟病菌孢子进行接种处理，分别取处理后0h，8h，24h，48h，72h的叶片，立即用液氮冷冻，保存于-80℃冰箱。分别取部分叶片，用研钵研碎，转移入盛有Trizol裂解液的1.5mL EP管(TRIzol Reagents,购自Invitrogen,USA)，充分振荡后，抽提总RNA，电泳鉴定总RNA质量。

2)水稻基因OsPsbR的克隆NCBI搜索OsPsbR序列信息，得到1138bp水稻基因OsPsbR的cDNA序列，并设计两端引物P1和P2：

P1:5-ATTAACTGCATATATCAA-3(SEQ ID NO.3)

P2:3-AAAATAAAGTTTTGGTAG-5(SEQ ID NO.4)

以步骤1)获得的总RNA反转录合成的cDNA第一链为模板，以P1和P2为引物，用高保真酶(购自南京诺唯赞公司)进行PCR扩增，PCR程序如下：95℃预变性5min，95℃变性30sec，56℃复性30sec，72℃延伸45sec，35个循环后，72℃延伸5min，最后72℃延伸10min后连接至pEASY-T1 Blunt载体，委托南京思普金公司测序获得水稻基因OsPsbR的cDNA序列SEQ IDNO.1。

分析上述获得的水稻基因OsCYS的cDNA序列SEQ ID NO.1及其编码蛋白SEQ IDNO.2。

实施例2

通过QuantPrime网站(https://quantprime.mpimp-golm.mpg.de/)，设计OsPsbR基因进行qRT-PCR实验的最佳特异性引物P3、P4：

P3:5-TGCTGGAGGAGTGGTGTTCAAG-3(SEQ ID NO.5)

P4:5-ACTGGTAAAGACCCTTTCCCTTGG-3(SEQ ID NO.6)

通过qRT-PCR分析接种处理后水稻3-4叶期地上部幼苗的表达，结果表明，在黑壳子粳中，接种稻瘟病菌0h后的相对表达量为1.0，8h后的相对表达量为8.3，24h后的相对表达量为2.2，48h后的相对表达量为1.1，72h后的相对表达量为2.0；在苏御糯中，接种稻瘟病菌0h后的相对表达量为1.0，8h后的相对表达量为0.1，24h后的相对表达量为0.8，48h后的相对表达量为1.6，72h后的相对表达量为1.2。黑壳子粳中OsPsbR的表达量在接种后8h显著提高，相较于0h约上升了8倍，在随后的24h，48h和72h显著降低并恢复到0h时的表达水平；而在苏御糯中，相较于0h，OsPsbR的表达量在接菌后8h，24h，48h和72h均没有显著变化(图1)。

实施例3

3)按照CRISPR实验设计标准流程分析目标基因序列，登录网站(http://www.genome.arizona.edu/crispr/CRISPRserach.html)筛选靶点，并设计引物P5、P6、P7、P8。

P5:5-AATAATGGTCTCAGGCGGCCTCTGTCATGGCTTCTC-3(SEQ ID NO.7)

P6:5-GGCCTCTGTCATGGCTTCTCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3(SEQ ID NO.8)

P7:5-GTGCGCTTCCACGAGCTAGCGCTTCTTGGTGCC-3(SEQ ID NO.9)

P8:5-ATTATTGGTCTCTAAACGTGCGCTTCCACGAGCTAG-3(SEQ ID NO.10)

以pCBC-MT1T2为模板，以P3、P4、P5、P6为引物进行四引物PCR扩增，建立酶切-连接体系，将四引物PCR扩增片段连接到pBUE411载体上，构建pBUE411-OsPsbR载体，测序鉴定确保载体中编码区阅读框架正确(图2)。

4)转基因植株的获得和抗性鉴定将步骤3)获得的pBUE411-OsPsbR载体转入大肠杆菌筛选，进而转入农杆菌，最后转入水稻品种“苏御糯”，对获得的转基因植株进行测序验证后进行水稻的抗病性评价。将生长至3-4叶期的转基因T1代植株进行稻瘟病菌孢子接种处理，7天后调查植株病斑长度，病斑数目和稻瘟病菌相对生长量。

经测序验证，共获得2种不同类型的纯合转基因株系，命名为OsPsbR-KO-1和OsPsbR-KO-2。OsPsbR-KO-1敲除表达转基因株系在靶点处有1个胸腺嘧啶(T)脱氧核糖核苷酸的缺失，导致移码突变，OsPsbR氨基酸序列改变并提前终止翻译(MAASVMALWL*)；OsPsbR-KO-2敲除表达转基因株系在靶点处有17个核苷酸的缺失，导致移码突变，OsPsbR氨基酸序列改变并提前终止翻译(MAASVMTICISITRTFEASRERDNGKAIFDHSGQ-ESKEDSDIPALWACWRSGVQGRC*)。

接菌7d后观察叶片发病情况发现，相较于野生型苏御糯(Su)，OsPsbR敲除表达转基因株系表现为更感病，病斑数量显著增加，病斑面积显著增大。统计结果表明，2个敲除表达转基因株系OsPsbR-KO-1和OsPsbR-KO-2中稻瘟病菌的相对生长量均显著高于野生型苏御糯，OsPsbR-KO-1株系中稻瘟病菌的相对生长量约为苏御糯的4倍，OsPsbR-KO-2株系中稻瘟病菌的相对生长量约为苏御糯的2倍。在病斑数目方面，苏御糯的平均病斑数目为6，OsPsbR-KO-1株系的平均病斑数目为13，OsPsbR-KO-2株系的平均病斑数目为10，OsPsbR-KO-1和OsPsbR-KO-2株系的病斑数目显著大于苏御糯。在病斑长度方面，苏御糯的平均病斑长度为9.6mm，OsPsbR-KO-1株系的平均病斑长度为13.9mm，OsPsbR-KO-1株系的平均病斑长度为15.3mm，OsPsbR-KO-1和OsPsbR-KO-2株系的病斑长度显著大于苏御糯(图3)。

实施例4

5)设计引物P9和P10，以黑壳子粳的cDNA为模板，对OsPsbR的CDS序列连带载体接头进行扩增。

P9:5-GCTTTCGCGAGCTCGGTACCATGGCTGCCTCTGTC-3(SEQ ID NO.11)

P10:5-TTGCATGCCTGCAGGTCGACCTAAGCCAGTGCACT-3(SEQ ID NO.12)

6)通过Takara公司的限制性内切酶KpnΙ和SalΙ，对pCAMBIA1300s载体进行酶切。酶切后的载体通过同源重组分别与对应片段连接，转化大肠杆菌感受态DH5α中，用对应抗性的LB培养基进行筛选。获得的阳性单克隆菌落经测序验证后，进行质粒提取，并转入农杆菌EHA105中。通过农杆菌介导的水稻转基因体系转入感稻瘟病水稻品种苏御糯的愈伤组织中，通过筛选、分化、生根等一系列过程获得过表达材料的植株。

7)提取转基因植株的DNA，设计引物P11和P12，进行PCR扩增(目标条带大小为600bp)，通过琼脂糖凝胶电泳，检测鉴定阳性的转基因株系；通过qRT-PCR，测量阳性转基因株系中OsPsbR基因的表达量。之后对T1代阳性转基因株系进行接菌鉴定。

P11:5-ATCCACGTCTCAAAGCAAGTGGATTGATGT-3(SEQ ID NO.5)

P12:5-CTAAGCCAGTGCACTAGTGTTGTAGACAAG-3(SEQ ID NO.6)

PCR扩增结果表明，本研究共获得4个阳性过量表达转基因株系，分别命名为OsPsbR-OE-1，OsPsbR-OE-2，OsPsbR-OE-3和OsPsbR-OE-4。经qRT-PCR确认，OsPsbR-OE-1过量表达转基因株系中OsPsbR的相对表达水平为29.04，约是野生型苏御糯的18倍，OsPsbR-OE-2过量表达转基因株系中OsPsbR的相对表达水平为39.56，约是野生型苏御糯的24倍，OsPsbR-OE-3过量表达转基因株系中OsPsbR的相对表达水平为26.34，约是野生型苏御糯的16倍，OsPsbR-OE-4过量表达转基因株系中OsPsbR的相对表达水平为1.00，与野生型苏御糯中OsPsbR的相对表达水平相差不大。OsPsbR-OE-1，OsPsbR-OE-2和OsPsbR-OE-3株系中OsPsbR的表达量相较于苏御糯显著提高，而OsPsbR-OE-4中OsPsbR的表达量与苏御糯无显著性差异(图4)，因此后续利用OsPsbR-OE-1，OsPsbR-OE-2和OsPsbR-OE-3过量表达转基因株系进行进一步研究。

在接种稻瘟病菌Hoku1 7d后，对过表达材料病斑长度、病斑数目和稻瘟病菌相对生长量进行统计。观察叶片发病情况发现，相较于野生型苏御糯(Su)，OsPsbR过表达转基因株系中发病情况较轻，病斑数量更少，扩展的面积小。统计结果表明，相较于苏御糯，3个过表达转基因株系OsPsbR-OE-1，OsPsbR-OE-2和OsPsbR-OE-3中稻瘟病菌的相对生长量均显著降低，苏御糯的稻瘟病菌的相对生长量约为OsPsbR-OE-1株系的6倍，约为OsPsbR-OE-2株系中的2倍，约为OsPsbR-OE-3株系中的4倍。在病斑数目方面，苏御糯的平均病斑数目为11.0，OsPsbR-OE-1株系的平均病斑数目为6.7，OsPsbR-OE-2株系的平均病斑数目为5.3，OsPsbR-OE-3株系的平均病斑数目为5.0，OsPsbR-OE-1，OsPsbR-OE-2和OsPsbR-OE-3转基因株系的病斑数目均显著小于苏御糯。在病斑长度方面，苏御糯的平均病斑长度为11.6mm，OsPsbR-OE-1株系的平均病斑长度为4.9mm，OsPsbR-OE-2株系的平均病斑长度为6.6mm，OsPsbR-OE-3株系的平均病斑长度为9.5mm，OsPsbR-OE-1，OsPsbR-OE-2和OsPsbR-OE-3转基因株系的病斑长度均显著小于苏御糯(图5)。

综上所述，本发明人提供的OsPsbR基因是在水稻中分离的新基因，其功能与水稻抗病性相关，可以利用该基因对植物品种进行改良，从而提高植物的抗病性。通常先利用本发明OsPsbR基因作为目的基因构建过表达载体，通过菌液PCR及测序鉴定载体构建情况，以农杆菌介导法为主要方法转化至目标植物，通过基因工程手段培育稻瘟病抗性品种。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一个水稻抗稻瘟病相关基因OsPsbR及其基因工程应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1138

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa L.)

<400> 1

attaactgca tatatcaata tactgtttac agacaactcg ctggctctgt tagagataag 60

atccccagac aactcgctat gatcagaatt gacacctgaa atttctcgac caggaaaata 120

gttaagcagg gcaggaaacc ccaggattat ccatcaacca accaactagg tgcttgcttc 180

agattttcat cagtacatca tctctaatca tccaggtaaa agacaagatc ttgtcacgtg 240

atcatggccc catgacacag tattatcata gctactatcc aactgacaat tgactaacaa 300

atcatagtca ctcactgtct gctactgaaa gccttcctgt atttaaagcc atggatatct 360

gatgatgaac tgcataagag atcatttgca ttaatttcag agatagagtg agtgatcagt 420

tgagtgttgt tgcataaaca tggctgcctc tgtcatggct tctctggctc tgaaaccatc 480

tgcatctcca ttactagaac gttcgaagct tcgagggaaa gggacaatgg caaggccatc 540

tttgatcata gtggccaaga aagcaaagaa gattcagaca tcccagccct atgggcctgc 600

tggaggagtg gtgttcaagg aaggtgttga tgcatctgga agggtagcca agggaaaggg 660

tctttaccag ttttccaaca agtatggagc aaatgttgat gggtacagcc caatatatac 720

cccagaagaa tggtcttcaa ctggtgatgt ctatgttgga ggaaaggcag gtttacttct 780

ctgggcaatc actcttgctg gaattctagt tggcggcgct attcttgtct acaacactag 840

tgcactggct tagctaagtg cagcagacca agctgtgcct gcttccatgt atataatctt 900

cactaggaat gtaaccagtt atgtacctgg actggacttg actgccagcg gtggtaatga 960

ataaggccga gtaatgttaa ttctaagtta tgcaacgatg ttttagtgag caacatagtg 1020

ttcttgggct ctagggacaa ataattttga gttcaacaga gttggcacct gttggatcat 1080

aagagttaaa tcagttgaac agcttattct gaaaaattgg aaaataaagt tttggtag 1138

<210> 2

<211> 137

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa L.)

<400> 2

Met Ala Ala Ser Val Met Ala Ser Leu Ala Leu Lys Pro Ser Ala Ser

1 5 10 15

Pro Leu Leu Glu Arg Ser Lys Leu Arg Gly Lys Gly Thr Met Ala Arg

20 25 30

Pro Ser Leu Ile Ile Val Ala Lys Lys Ala Lys Lys Ile Gln Thr Ser

35 40 45

Gln Pro Tyr Gly Pro Ala Gly Gly Val Val Phe Lys Glu Gly Val Asp

50 55 60

Ala Ser Gly Arg Val Ala Lys Gly Lys Gly Leu Tyr Gln Phe Ser Asn

65 70 75 80

Lys Tyr Gly Ala Asn Val Asp Gly Tyr Ser Pro Ile Tyr Thr Pro Glu

85 90 95

Glu Trp Ser Ser Thr Gly Asp Val Tyr Val Gly Gly Lys Ala Gly Leu

100 105 110

Leu Leu Trp Ala Ile Thr Leu Ala Gly Ile Leu Val Gly Gly Ala Ile

115 120 125

Leu Val Tyr Asn Thr Ser Ala Leu Ala

130 135

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

attaactgca tatatcaa 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aaaataaagt tttggtag 18

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tgctggagga gtggtgttca ag 22

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

actggtaaag accctttccc ttgg 24

<210> 7

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aataatggtc tcaggcggcc tctgtcatgg cttctc 36

<210> 8

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggcctctgtc atggcttctc gttttagagc tagaaatagc 40

<210> 9

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gtgcgcttcc acgagctagc gcttcttggt gcc 33

<210> 10

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

attattggtc tctaaacgtg cgcttccacg agctag 36

<210> 11

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gctttcgcga gctcggtacc atggctgcct ctgtc 35

<210> 12

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ttgcatgcct gcaggtcgac ctaagccagt gcact 35

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atccacgtct caaagcaagt ggattgatgt 30

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ctaagccagt gcactagtgt tgtagacaag 30

Claims

1.水稻基因OsPsbR在通过基因工程手段培育稻瘟病抗性品种中的应用，所述的水稻基因OsPsbR，编码叶绿体光系统Ⅱ亚基，且cDNA 序列如SEQ ID NO. 1 所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于通过基因工程手段提高水稻中所述的水稻基因OsPsbR的表达，以提高水稻对稻瘟病的抗性。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于将水稻基因OsPsbR 的过表达载体转入感稻瘟病水稻品种,以提高感稻瘟病水稻品种对稻瘟病的抗性。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于包括如下步骤：

1）设计引物P9和P10，以黑壳子粳的cDNA为模板，对OsPsbR的CDS序列连带载体接头进行扩增，P9、P10的序列分别为SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12；

2）通过Takara公司的限制性内切酶KpnI和SalI，对pCAMBIA1300s载体进行酶切，酶切后的载体通过同源重组分别与对应片段连接，转化大肠杆菌感受态DH5α中，用对应抗性的LB培养基进行筛选，获得的阳性单克隆菌落经测序验证后，进行质粒提取，并转入农杆菌EHA105中,通过农杆菌介导的水稻转基因体系转入感稻瘟病水稻品种苏御糯的愈伤组织中，通过筛选、分化、生根一系列过程获得过表达材料的植株。

5. 水稻基因OsPsbR的过表达载体在通过基因工程手段培育稻瘟病抗性品种中的应用，所述的水稻基因OsPsbR，其cDNA 序列如SEQ ID NO. 1 所示。