CN105830763A - 小麦转化中用潮霉素作为筛选剂的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了小麦转化中用潮霉素作为筛选剂的应用，其受体材料为含有潮霉素筛选标记的转基因扬麦14的T3代纯合株系，潮霉素溶液的最适筛选浓度为250mg/L；当潮霉素溶液的筛选剂量为250mg/L时，受体材料的植株存活率为60％，对照材料的植株存活率为20％。本发明将已转化的含有潮霉素筛选标记的转基因T3代纯合株系为材料，配置不同浓度的潮霉素，通过浸种、土培的方法，摸索出潮霉素最适筛选浓度(250mg/L)，提高了小麦遗传转化的工作效率，节约实验成本。

Description

小麦转化中用潮霉素作为筛选剂的应用

技术领域

本发明涉及外源基因转化小麦时潮霉素最适浓度的筛选方法，其具体涉及小麦转化中用潮霉素作为筛选剂的应用，属于转基因小麦遗传育种领域。

背景技术

1、小麦转基因技术的发展

植物转基因技术是将人工分离和修饰过的基因导入到植物体基因组中，由于导入基因的表达，引起植物体的性状的可遗传的修饰，使受体植物产生新性状。20世纪80年代初科学家开始致力于转基因植物的研究：1983年科学家利用农杆菌介导法获得了世界上首例转基因植物烟草(Schell et al,1984)，此后转基因技术就迅速发展开来。至今为止，科学家分离出100多种目的基因，有200多种转基因作物诞生(周岩等，2011)，其中具有代表性的作物有：水稻(Christou et al,1991)、小麦(Vasil et al,1992)、玉米(Klein et al,1989)、大豆(Hinchee et al,1988)和棉花(Umbeck et al,1987)等。在1992年Vasil等利用基因枪法将GUS/Bar基因转入小麦中获得了世界上首例抗除草剂转基因小麦，此后小麦转基因技术不断发展并且建立了许多成熟的转化系统。现阶段小麦转基因方法主要有两大类：1.基因枪法(Vasil et al,1992)、PEG法(Potrykus et al,1985)、电击穿孔法(Halluin et al,1992)和农杆菌介导法(Cheng et al,1997)等基于组织培养技术的转化法；2.显微注射法(Neuhaus et al,1987)、花粉管通道法(曾君祉等,1993)等基于植株本身的转化法。目前小麦转基因的主要方法是基因枪法、农杆菌介导法和花粉管通道法(喻修道等，2010)。

2、农杆菌介导法

农杆菌介导法是一种建立在农杆菌基础上的生物转化系统；农杆菌是一种革兰氏阴性土壤细菌，应用较多的是根癌农杆菌(Agrobateriumtumefaciens)；根癌农杆菌含有Ti质粒，它介导的遗传转化主要是利用Ti质粒上的vir区基因来调控T-DNA的加工和转移，从而使T-DNA将所携带的目的基因转移到细胞核内并整合到植物基因组中。还有一类是发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)，主要是利用Ri质粒的作用诱导被侵染的植物组织产生发状根(刘香利等，2011)，这类农杆菌在植物转基因中运用的较少。

经过多年的研究和发展，农杆菌介导法在双子叶植物上已经得到了充分应用，由于大部分双子叶植物能产生诱导农杆菌转化的信号物质，所以它们是农杆菌的天然寄主。而单子叶植物很少能产生这种信号物质，所以利用农杆菌转化单子叶植物比较困难且研究进度较慢。经过多年的研究，农杆菌转化小麦虽然得到了很大的发展，但在转化过程中受体类型、基因型、预培养时间、菌株种类等因素都会影响农杆菌的转化效率(张福丽等，2011)。

在众多植物遗传转化方法中，农杆菌介导的遗传转化有其独特的价值：一方面它极大地促进人们对植物-微生物相互作用机制的认识；另一方面，由此转移的外源基因多以单拷贝或低拷贝数整合在受体细胞染色体上，有利于其产物的表达和在转基因植株后代中的遗传稳定。

通常情况下，转化的对象是植物的原生质体、细胞和组织，再通过离体培养再生植株的试验程序获得转化体；虽然对某些植物这种转化方式十分有效，但步骤上的繁琐、过分依赖组织培养和植株再生技术，限制了它的应用范围，为此建立一些更方便高效的转化方法十分必要。

3、活体转化法

小麦是重要的粮食作物，但与水稻和玉米相比，小麦的遗传转化工作进展相对缓慢；小麦组织培养和植株再生技术体系尚不完善，植株再生对基因型依赖性很强，目前只有少数几个品种类型有较高的植株再生频率，大多数优良主栽品种植株再生频率极低，甚至完全不能分化再生植株；经继代的小麦愈伤组织，其生长较为缓慢，无论采用何种选择标记基因和筛选剂对小麦愈伤组织进行筛选都较为困难。因此，若能建立起不依赖植株再生技术的转化方法，将会极大地促进小麦遗传转化工作。

4、筛选标记的类型

在植物基因工程研究中，快速、有效地从大量转化群体(包括愈伤组织和种子等)筛选到含有外源目的基因的转化体是成功获得转基因植株的关键。目前，转化体的筛选包括利用抗生素筛选、除草剂筛选和B-葡萄糖苷酸酶(GUS)染色反应筛选这三种方法，其中以抗生素筛选应用较多。目前，潮霉素以其选择效率高、副作用小的优势在水稻、玉米等作物的筛选上得到了广泛应用。

近几年，虽已有研究者在小麦转化实践中尝试用潮霉素作为筛选剂，但由于其对筛选的剂量等缺乏系统研究，迄今成功的报道并不多。

发明内容

针对现有技术中存在的缺点与不足，本发明公开了一种小麦转化中用潮霉素作为筛选剂的应用，筛选出潮霉素最适筛选浓度为250mg/L。

本发明还公开了一种小麦转化中潮霉素最适浓度的筛选方法，通过将已获得的含有潮霉素筛选基因的AtNHXI基因转化扬麦14的T3代纯合株系为材料，对其进行不同浓度的胁迫，筛选出潮霉素最适筛选浓度为250mg/L，在此浓度下转基因植株的出苗率且能正常生长的植株达60％，而对照材料仅为20％，这大大提高了获得阳性植株的概率，并减少了实验成本，降低了实验工作量。

本发明经过农杆菌介导法得到含有潮霉素筛选标记的T3代纯合株系，用于潮霉素最适浓度筛选实验的供试材料；

配置不同浓度的潮霉素溶液对转基因材料和对照材料进行萌发实验，统计转基因和对照材料在潮霉素毒害作用下萌发差异；将已萌发的种子种到花盆里，定期浇灌等量的不同浓度的潮霉素进行培养，统计在不同浓度下苗的成活率；最后通过转基因材料和对照材料种子萌发率及苗成活率得出潮霉素最适筛选浓度。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

小麦转化中用潮霉素作为筛选剂的应用，所述潮霉素的最适筛选浓度为250mg/L。

进一步地，所述小麦转化时，受体材料为含有潮霉素筛选标记的转基因扬麦14的T3代纯合株系。

进一步地，所述潮霉素溶液的浓度为250mg/L时，受体材料的植株存活率为60％，对照材料的植株存活率为20％。

小麦转化中潮霉素最适浓度的筛选方法，其受体材料为含有潮霉素筛选标记的转基因扬麦14的T3代纯合株系；所述方法的步骤如下：

(1)配置不同浓度的潮霉素溶液，备用；

(2)取所述受体材料和对照材料扬麦14的种子若干，分别浸泡在上述不同浓度的潮霉素溶液中，观察并记录种子的萌发率；

(3)取步骤(2)中的萌发的种子分别进行土培，并且定期分别浇灌等量的上述不同浓度的潮霉素溶液，观察种子的生长状态并记录植株存活率；

(4)结合上述种子的萌发率以及植株存活率，最终得出所述潮霉素的最适筛选浓度为250mg/L。

进一步地，所述含有潮霉素筛选标记的基因为AtNHXI。

进一步地，所述受体材料是通过农杆菌介导法转化扬麦14的外植体获得的，载体上的筛选标记基因是潮霉素。

进一步地，所述潮霉素溶液的浓度梯度为0、100、150、200、250和300mg/L。

进一步地，所述浸泡的时间为12h。所述浇灌的用量为200ml/次。

进一步地，所述步骤(3)中，在潮霉素溶液的浓度为250mg/L时，受体材料的植株存活率为60％，对照材料的植株存活率为20％。

本发明具有如下的有益效果：

(1)现有小麦遗传转化的载体以潮霉素作为筛选标记，由于愈伤组织本身比较脆弱，对潮霉素敏感性较强，且目前组培中对潮霉素最适筛选浓度把握不准，一旦浓度过高会造成愈伤大幅死亡，浓度过低易造成大量非转化子逃逸，为后期阳性苗的鉴定增加了负担；

本发明对潮霉素不同浓度筛选效果进行了研究，将已转化的含有潮霉素筛选基因的AtNHXI基因转化扬麦14的T3代纯合株系为材料，对其进行不同浓度的胁迫，摸索出潮霉素最适筛选浓度为250mg/L，在此浓度下转基因植株的出苗率且能正常生长的植株达60％，而对照材料仅为20％，这大大提高了我们获得阳性植株的概率，并减少了实验成本，降低了实验工作量。

(2)利用小麦活体转化技术，在小麦萌发长出2cm长左右的芽后，用刀切取一部分麦锥，进而用农杆菌进行侵染，得到T0代转基因苗，这种方法不依赖再生苗，大大减少了实验周期和实验成本，可以获得大批转基因苗；

本发明潮霉素最适筛选浓度(250mg/L)的确定为活体转化实验的后期T1代的检测提供了方便：只需将T0代转基因种子放在250mg/L的潮霉素中浸泡12h，放在培养皿中，定期浇灌潮霉素溶液，将萌发的种子挑出做PCR验证即可；本发明提高了小麦遗传转化的工作效率，节约成本，得到阳性转基因苗更加方便快捷。

附图说明

图1为在不同浓度潮霉素胁迫下对照与含有潮霉素基因的转基因材料种子萌发率统计；

图2为不同潮霉素浓度下两种材料苗成活数折线图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

一、实验材料

含潮霉素筛选标记的T3代转基因纯合株系与扬麦14(Y14)(扬麦14来自江苏里下河地区农科所)种子若干；

实验试剂：潮霉素试剂、蒸馏水；

实验用品：培养皿、镊子、三角瓶、电子天平、花盆、硅藻土、标签纸等。

二、实验步骤

(1)配置不同浓度的潮霉素溶液备用，潮霉素溶液的浓度分别为0、100、150、200、250和300mg/L；

(2)在步骤(1)的每个潮霉素溶液浓度下，分别取转基因材料和对照材料的种子各30粒，备种子萌发使用，并统计其萌发率(如图1所示)；

从图1可以看出：在潮霉素浓度为0-200mg/L时，含有潮霉素筛选标记的T3代材料的萌发率为100％，并没有受到潮霉素的胁迫而萌发受阻；通过萌发，可以确定潮霉素最低筛选浓度为200mg/L；当浓度为250mg/L时，转基因材料的萌发率为98％，对照材料的能发仅为43％，萌发受到很大抑制；

(3)在步骤(1)的每个潮霉素溶液浓度下，分别取转基因材料和对照材料的种子各20粒，经上述潮霉素溶液浸泡若干小时后(浸泡的时间为12h)，种在花盆里，再定期分别浇灌上述不同浓度的潮霉素溶液让其生长(浇灌的用量为200ml/次)，观察其生长状态并记录出苗数；如表1和图2所示，是不同潮霉素浓度下转基因和对照苗成活率统计：当潮霉素溶液的浓度为250mg/L时，再经过土培，对照材料苗的成活率仅为20％，转基因材料为60％；结合上述步骤(2)中萌发率实验结果，可确定潮霉素的浓度为250mg/L可以去除大部分非转化植株。

表1

Claims (10)

1.小麦转化中用潮霉素作为筛选剂的应用，其特征在于，所述潮霉素的最适筛选浓度为250mg/L。

2.如权利要求1所述的小麦转化中用潮霉素作为筛选剂的应用，其特征在于，所述小麦转化时，受体材料为含有潮霉素筛选标记的转基因扬麦14的T3代纯合株系。

3.如权利要求1或2所述的小麦转化中用潮霉素作为筛选剂的应用，其特征在于，所述潮霉素溶液的浓度为250mg/L时，受体材料的植株存活率为60％，对照材料的植株存活率为20％。

4.小麦转化中潮霉素最适浓度的筛选方法，其特征在于，所述方法的受体材料为含有潮霉素筛选标记的转基因扬麦14的T3代纯合株系；所述方法的步骤如下：

(1)配置不同浓度的潮霉素溶液，备用；

(2)取所述受体材料和对照材料扬麦14的种子若干，分别浸泡在上述不同浓度的潮霉素溶液中，观察并记录种子的萌发率；

(3)取步骤(2)中的萌发的种子分别进行土培，并且定期分别浇灌等量的上述不同浓度的潮霉素溶液，观察种子的生长状态并记录植株存活率；

(4)结合上述种子的萌发率以及植株存活率，最终得出所述潮霉素的最适筛选浓度为250mg/L。

5.如权利要求4所述的小麦转化中潮霉素最适浓度的筛选方法，其特征在于，所述含有潮霉素筛选标记的基因为AtNHXI。

6.如权利要求4所述的小麦转化中潮霉素最适浓度的筛选方法，其特征在于，所述受体材料是通过农杆菌介导法转化扬麦14的外植体获得的，载体上的筛选标记基因是潮霉素。

7.如权利要求4、5或6所述的小麦转化中潮霉素最适浓度的筛选方法，其特征在于，所述潮霉素溶液的浓度梯度为0、100、150、200、250和300mg/L。

8.如权利要求4、5或6所述的小麦转化中潮霉素最适浓度的筛选方法，其特征在于，所述浸泡的时间为12h。

9.如权利要求4、5或6所述的小麦转化中潮霉素最适浓度的筛选方法，其特征在于，所述浇灌的用量为200ml/次。

10.如权利要求4所述的小麦转化中潮霉素最适浓度的筛选方法，其特征在于，所述步骤(3)中，在潮霉素溶液的浓度为250mg/L时，受体材料的植株存活率为60％，对照材料的植株存活率为20％。