CN1609202A

CN1609202A - 一种快速获得大量转基因植物新品种的分子育种方法

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Publication number: CN1609202A
Application number: CN 200310102540
Authority: CN
Inventors: 王涛; 张万军
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2003-10-22
Filing date: 2003-10-22
Publication date: 2005-04-27
Anticipated expiration: 2023-10-22
Also published as: CN1274816C

Abstract

本发明提供了一种快速获得大量转基因植物新品种的方法，按照本方法，使农杆菌转化后获得的抗性愈伤组织以体细胞胚发生途径分化形成再生苗。从而，大幅度提高了转基因苗的再生效率。通过在体细胞胚萌发和生长过程中添加目标抗性的筛选试剂，进行目标抗性植株的筛选，使目标抗性转基因苗的获得率大幅度提高，并减少了后期检测的工作量。利用该技术12周即可获得大量的目标抗性转基因苜蓿再生苗，满足当代进行大规模的生物学测定和优良株系的筛选的需要，结合田间试验，当代即可获得大量表型好的优良品系。该技术体系在饲草育种中具有显著的经济效益和社会效益。

Description

一种快速获得大量转基因植物新品种的分子育种方法

技术领域

本发明涉及利用农杆菌介导的遗传转化、拟转化植物的高频植株再生体系和再生植株的目标抗性筛选三者相结合培育新品种(系)的方法，属于生物技术领域。

背景技术

植物遗传转化(genetic transformation)是把外源核苷酸片段转入植物组织、细胞使外源DNA能够保留、表达、并能够传递给后代的技术。它是伴随着分子生物学和植物细胞组织培养技术不断发展，在70年代中期才兴起的一门新技术，在近20年来发展十分迅速。自1985年，Adang等人报道了B.t基因成功导入烟草，并且，外源基因在转基因烟草基中表达(Gene，1985，36：289～300.)，现在转基因植物已扩展到经济作物、粮食作物、蔬菜、花卉、药用植物、水果、树木以及牧草等在内的35个属，120多个物种。现在，一些经基因工程改良(或培育)的作物新品种如番茄、油菜、烟草、西葫芦、亚麻、玉米、大豆和棉花都已经实现了商品化，涉及的性状包括品质改良、抗虫、抗除草剂、抗病性的改良等(王国英，1998，科学，50，5：38～40)。但是，在某些物种上生物技术育种却进展缓慢，其主要原因通常是没有建立合适的相关物种的高效遗传转化的技术体系，而该技术体系中高频的植株再生体系是实现遗传改良的关键。

通过基因工程技术对苜蓿进行遗传改良是近年来生物技术在牧草分子育种中的主要应用领域。其主要原因是，苜蓿素有“牧草之王”之称，是世间各国发展畜牧业的首选草种。另外，苜蓿蛋白含量高，是作为植物生物反应器生产疫苗等功能蛋白的优良植物材料。早在1986年，MariaDeak(Plant Cell Reports，5：97～100)就利用农杆菌介导法将NPT-□基因导入苜蓿的幼嫩茎段，并得到转基因植株，实现了对苜蓿的遗传转化。1988年，Mireille等人(Plant Cell Reports，7：512～516)将卡那霉素抗性基因用农杆菌侵染法导入紫花苜蓿叶片受体细胞。之后，借助多种转化方法对苜蓿的遗传转化的研究的报道也较多，也取得了不少成果。Halluin(CropSci，1990，30：866～871)借助农杆菌将抗除草剂基因转化苜蓿获得成功，Hill等人(Bio/Technology，1991，9：373～377)利用农杆菌将Bt毒蛋白基因导苜蓿获得成功。2000年，我国吕德扬(遗传学报，27，4：331～337；中国科学，4，8：342～348)报道了国内首例转基因苜蓿再生的研究，但仅得到11株转基因再生苗。这对苜蓿的高效遗传转化并进行改良是不够的。综观国内外生物技术在苜蓿遗传改良上的应用，转化后再生苗获得效率低是制约其发展的主要问题。抗性愈伤多数在40％之内，而抗性愈伤的分化率也仅为1～5％，这严重影响了苜蓿生物技术育种的发展。因此，建立完备的苜蓿生物技术分子育种体系是必要的。

本发明就是针对背景技术的不足和缺陷，解决了苜蓿再生难的问题，完善了苜蓿的再生体系和遗传转化体系，大幅度提高了苜蓿的转基因再生植株的获得率，为苜蓿的分子育种奠定了坚实的基础。另外，通过特定的实验设计，使苜蓿遗传转化后抗性愈伤的获得率达到50％以上，抗性愈伤的体细胞胚的发生率达到85％以上，抗性再生苗的阳性率达到80％以上，并直接获得具有目标基因抗性的再生苗系。通过在遗传转化过程中进行优良株系的选择，并扩繁，加快了优良转基因新品种的获得。具有一定的社会效益和经济效益，可应用于我国的牧草改良。

本发明的优点：

(1)时间短，操作简单，可以方便地对苜蓿进行遗传改良。

(2)转化效率高，抗性再生苗多，可提供大量的转基因个体供随后选择。

(3)解决了特异性状优良植株的快速繁殖问题，可以快速提供大量的优良性状的株系苗，不必通过传统种植方式获得种子就可以进行优良品种(系)选择，加速了育种进程。

发明内容

本发明的目的在于提供一种通过生物技术措施对苜蓿进行遗传改良的方法，从而实现苜蓿的高效生物技术育种，以便从多方面提高苜蓿的抗性和改善品质，并为利用苜蓿做生物反应器生产疫苗或是其它功能蛋白提供技术支持。主要技术指标是：苜蓿遗传转化后抗性愈伤的获得率为50％以上，筛选后获得的抗性愈伤的分化率为85％以上，再生苗获得时间为10周左右，其中转基因苗获得率为80％以上。其主要内容包括：适宜于苜蓿再生的基本培养基，愈伤组织的诱导及保持培养基的配比，体细胞胚诱导及萌发，农杆菌转化和抗性愈伤组织的获得，抗性愈伤组织体细胞的诱导，抗性体细胞胚的萌发及转基因抗性再生苗的筛选和获得，抗性再生苗的分子检测和扩大繁殖，小区模拟抗性试验等。

在本发明中，术语“目标基因”表示编码特定蛋白，指导植物生物学特性的基因，如植物的抗旱、抗虫、抗涝、花色、高矮等基因。

术语“选择压”表示在获得转基因再生苗的过程中要通过一定浓度筛选药剂的筛选，筛选药剂的浓度就是选择压，药剂的浓度高低反应选择压的高低。

术语“标记基因”表示指在转基因过程中，为获得目标基因标记性状的转基因植物，用来辅助选择的基因称为标记基因。标记基因常为抗性基因，带有标记基因的细胞、组织、器官、植物体对特定药剂抗性强。

术语“抗逆性基因”表示编码特定的在植物体内渗透调节起作用的小分子物质或是编码促使细胞膜稳定物质的基因，其功能是植物对逆境胁迫有较强的耐受性。抗逆性基因包括使植物的抗旱性、抗冻性、抗涝性、抗虫性等提高的基因。如HVA1基因，使植物的抗旱性提高，属于抗旱基因，rstB基因可使植物的耐盐性提高，属抗盐基因。目前发现的其它与植物的抗性相关的基因还有甜菜碱合成酶基因、山梨醇合成酶基因、SOD家族基因、SOS家族基因等。

本发明提出的一种快速获得大量转基因植物新品种的方以紫花苜蓿苜蓿为例说明。快速获得紫花苜蓿大量转基因植物新品种及其高效遗传转化的分子育种方法，包括以下几个步骤：

(1)苜蓿外植体制备：选取具优良生物学性状的紫花苜蓿鲜嫩材料(子叶、下胚轴、叶片、叶柄、根等)为外植体。子叶、下胚轴等外植体可以通过无菌苗来获得。选取优良紫花苜蓿品种的饱满种子在75％的酒精中浸泡2min，然后用0.1％的氯化汞溶液中消毒10min，再用无菌水冲洗3-5次，接种于1/2MS培养基上发芽获得无菌苗。一周后即可取子叶、下胚轴等做外植体。

(2)预培养和农杆菌侵染：无菌苗形成后，取子叶横向切成1mm宽的小条，下胚轴切成2-4mm长的小段，接种到改良的SH培养基MSH(以SH(Sckenk & Hilderebrantdt 1972 Can J Bot，50：199-204)大量元素+MS(Murashige & Skoog medium，1962，Physiol.Plant 15：473-497)微量元素及铁盐+水解酪蛋白1～2mg/L+VB₁ 9.9mg/L+VB₆ 9.5mg/L+尼克酸4.5mg/L+琼脂8g/L+30g/L蔗糖为基本成分的培养基，pH 5.8，以下相同)附加2.0mg/L 2，4-D和0.025mg/L激动素(kinetin，KT)预培养1～2天。将带有目标基因的农杆菌菌液(农杆菌菌株为LBA4404，购于鼎国生物公司)，目标基因连在真核表达载体质粒3301(ppt抗性)，质粒1301(潮霉素抗性)和质粒pBI121(卡那霉素抗性)(以上质粒均购于clontech生物公司)上，用MSH附加2.0mg/L 2，4-D和0.025mg/L KT的液体培养基(不加琼脂固化，pH 5.2～6.0)稀释到OD值0.3～0.6后，把经过预培养的苜蓿外植体(子叶、下胚轴等)浸在农杆菌菌液中浸泡5分钟，然后，将材料从菌液中捞出，放在无菌滤纸上吸干，转到愈伤诱导培养基(MSH附加2.0mg/L 2，4-D和0.025mg/L KT的固体培养基，用琼脂8g/L固化)上共培养4～7天到农杆菌斑初现。

(3)苜蓿抗性愈伤组织的筛选和除菌：外植体与农杆菌经过4～7天的共培养后已经开始形成愈伤组织。此时，将所有的外植体和愈伤组织转移到含有筛选药剂的愈伤诱导和保持培养基(MSH附加2.0mg/L2，4-D和0.025mg/L KT的固体培养基，用琼脂8g/L固化)上进行抗性愈伤筛选和除菌(图1)。除菌药剂可用200～400mg/L的羧卞青霉素、或是1500～300mg/L的噻胞霉素或头胞霉素。筛选用药剂(选择压，如：PPT，卡那霉素，潮霉素等)的用量逐渐由低到高，每10～14天更换一次培养基。以潮霉素(hpt)为选择压(对应于1301载体)开始用10mg/L筛选两周，后转到含20mg/L hpt的培养基上筛选2～3次，即完成抗性愈伤筛选过程；以除草剂ppt(phosphinothricin，商品名为Basta，有效成分glufosinate)为选择压(对应于3301载体)时，开始时用5mg/L ppt筛选两周，后转到10mg/L ppt筛选两周，最后，用15mg/L ppt筛选两周即完成抗性愈伤的筛选。用卡那霉素(kam)做选择压(对应于pBI121载体)时，筛选过程是先用50mg/L kam筛选两周，后转移到100mg/L kam的筛选培养基上筛选2～4周，完成抗性愈伤的筛选。当然，根据标记基因的不同，还有其它筛选药剂可供选择(如：四环素，氯霉素、壮观霉素等)，但总的方法是，选择压由低到高。注意每次继代时淘汰褐化和水渍化的愈伤组织。

(4)苜蓿愈伤组织体细胞胚诱导：在苜蓿抗性愈伤组织筛选过程中，部分愈伤组织会逐渐转变为浅黄绿色，即达到体细胞胚发生前的状态(通常称胚性愈伤)，将这种浅黄绿色的愈伤组织转到分化培养基MSH附加0.3～0.6mg/L KT，低浓度抗性愈伤组织筛选药剂和低浓度的除菌抗生素的培养基上进行体细胞胚诱导(图2)。如：若以羧苄青霉素为除菌药剂，此时的添加浓度可以由原来的200～400mg/L降到150mg/L；以PPT为抗性愈伤选择压，此时的选择压浓度可以由高浓度选择压15mg/L降到2～5mg/L左右即可。在体细胞胚诱导培养基上，一般20天左右即可有大量的鱼雷状胚状体形成。

(5)苜蓿体细胞胚的萌发和抗性苗的获得：取在体细胞胚诱导培养基上形成的抗筛选药剂的鱼雷状胚状体，转接到1/2 MS附加抗性愈伤组织筛选药剂(如：PPT 2～5mg/L，卡那霉素25～50mg/L或潮霉素5～10mg/L；筛选药剂的选择因载体而改变)和所转化的目标基因所对应的目标性状(主要为抗盐、抗旱等非生物胁迫性状；本实验所试基因为抗盐基因rstB，故用NaCl为筛选试剂，所选浓度为0.5％；若所试基因为抗旱基因，可用PEG来辅助筛选)的筛选试剂的培养基上使胚状体萌发(图3，4)。注意的是在进行抗性筛选的时候，要确定非转基因苗的对拟筛选的目标性状筛选药剂的初始抗性(确定非转基因苗对筛选标记基因对应试剂和对目标基因对应抗逆性状的抗性)。通常所用的筛选方法为间接筛选，即利用筛选标记基因所对应的性状来筛选，如bar基因(具有除草剂抗性)，Kam^r基因(具有卡那霉素抗性)常用来做标记基因，筛选时只用PPT或卡那霉素来筛选转基因植株。标记基因辅助筛选的方法因为一些不确定的原因使抗性苗的假阳性率较高。本发明提出以筛选标记基因和目标基因结合双重筛选的方法，使目标抗性转基因苗获得率大幅度提高。本实验中用0.5％的NaCL和2mg/L PPT筛选后得到大量的抗性再生苗(图5)，目标抗性(抗盐)转基因再生苗的获得率为80％以上。

(6)抗性植株的分子检测：将获得的抗性苗依SDS法分别进行总DNA提取，然后进行目标基因的PCR检测，Southern检测，Northern检测，免疫分析等，分别在不同的水平检测转化的目标基因在苜蓿基因组的整合情况、转录情况和表达水平等。本实验中对抗性再生苗的PCR检测(图7，8)，Southern检测(图9)发现，阳性植株率达80％以上。

(7)抗性转基因再生植株的扩大繁殖：本发明在解决了通常的遗传转化实验中特异抗性苗少而不能在当代进行生物测定、抗性确定等后续实验的矛盾，可以在当代/年获得大量的转基因特异抗性再生苗，可以当代/年进行特异抗性转基因苗的生物学测定，缩短了新品种选择的时间，加快了分子生物育种的步伐。

特异抗性的转基因再生苜蓿的繁殖可以在培养基上采用扦插繁殖，也可以取再生苗的叶片、叶柄等幼嫩材料诱导愈伤组织，在进行体细胞胚诱导和萌发等过程进行扩大繁殖。比较而言，前一种繁殖方式的繁殖系数较低，一株成苗经两个月扦插繁殖两次可以获得6～10棵苗，而后一种方法两个月可获得数百到几千棵苗。前一种方法的操作流程为：将无菌的苜蓿抗性再生苗用剪刀剪成3～4cm的茎段，每段上要求至少带有两个茎节，然后，按其生长极性扦插到1/2MS培养基上，一般20天左右就会有形成新的再生根而成为完整植株。后一种方法的操作流程为：取抗性再生苗的叶片、柄切或茎段做外植体，切成3毫米大小的小段，置于MSH培养基附加2.0mg/L 2，4-D和0.025～0.05mg/L KT的固体培养基上，一般4天后，愈伤组织即可形成，到20天的时候即有大量的体细胞胚发生。此时，将带有体细胞胚的愈伤组织转到分化培养基(MSH培养基附加0.4mg/L KT)上或是1/2MS培养基，30天后体细胞即可以萌发成为完整的再生苗。完成整个再生周期仅须50～60天。

(8)抗性再生植株的移栽和生物学测定：获得的抗性苜蓿再生苗当根达到5cm以上即可以移栽。移栽前先打开培养瓶口锻炼3～5天，在室温下移栽成活率达85％。在湿度为80％，温度白天控制在25℃，晚上控制在20℃，光周期14h光照/10h黑暗的人工气候箱中成活率可以达到95％以上。

经分子检测后获得的具有目标基因整合的苜蓿再生苗经扩大繁殖后进行拟改良目标抗性的小区测试。测试地点选择在可以提供一定胁迫伤害的自然环境或是人工环境下。期间，记录不同株系的生长反映情况，进而确定优良的株系，分离得到具有目标抗性并且长势良好的新品系。

本实验中的所用到的培养基都在灭菌前将pH调到5.8，灭菌条件为121℃下25min。培养室温度为(25±1)℃。光周期为光照14h/黑暗10h。培养物表面的光照强度约为3000lx。

附图说明

图1苜蓿抗性愈伤筛选。

图2苜蓿愈伤组织体细胞胚诱导。

图3苜蓿体细胞胚萌发。

图4抗性转基因苜蓿再生苗。

图5抗0.5％的NaCL和2mg/L PPT的转基因苜蓿植株。

图6转基因苜蓿抗性苗移栽成活。

图7转化后获得的抗性苜蓿苗目标基因(rstB)PCR检测，M为Mark，ck+为目标基因PCR结果，ck-为非转基因植株PCR结果，1，2，5，6，7，9为PCR检测为转基因植株，3，4，8为非转基因植株。

图8抗性苜蓿再生苗筛选标记基因(bar基因)PCR检测，，M为Mark，ck+为目标基因PCR结果，ck-为非转基因植株PCR结果，1，2，5，6，7，9为PCR检测到目标基因(rstB)的转基因植株也检测到标记(Bar)基因。

图9转基因苜蓿再生苗目标基因(耐盐相关基因rstB)Southern杂交检测，M为Mark，ck+为目标基因PCR产物杂交结果，ck-为非转基因植株杂交结果，1-7为转基因植株杂交结果，8为未转化成功的植株。

具体实施方式

实施试剂

本实验中用到的无机盐均为北京刘李店化工厂产品，2，4-D，KT及水解酪蛋白为SIGMA公司产品，维生素为北京芳草医药化工研制公司产品，蔗糖为北京北化精细化学品有限责任公司产品。以上试剂购自中国农业大学物质供应科(市场其它试剂公司亦有售)。

下述实施例是为了更详细地解释本发明，但不应理解为本发明局限于此。

实施例1

供试品种为秘鲁苜蓿，购于农科院畜牧所。取秘鲁苜蓿种子消毒后接种于1/2MS培养基上，一周后取子叶和下胚轴置于愈伤组织诱导和保持培养基(成分为MSH附加2.0mg/L 2，4-D和0.025mg/L KT的固体培养基)上预培养24小时。随后在MSH培养基附加2.0mg/L 2，4-D和0.025mg/L KT的液体培养基稀释5～10倍带有抗盐基因(rstB)的农杆菌(LBA4404)菌液(摇菌浓度为OD值0.8～1.0)中浸泡5分钟，在无菌滤纸上吸干菌液后置于MSH培养基附加2.0mg/L 2，4-D和0.025mg/L KT的固体培养基(愈伤诱导和保持培养基)上共培养5天。然后，转到含有5mg/L ppt和250mg/L羧卞青霉素的愈伤诱导和保持培养基上筛选两周。之后，再将筛选获得的抗性愈伤组织转到含10mg/L ppt的愈伤诱导和保持培养基上筛选两周，最后用15mg/L ppt筛选一次，结束抗性愈伤的筛选。把筛选获得的抗性愈伤转到附加3mg/L ppt，150mg/L羧卞青霉素的分化培养基(MSH分别附加0.3，0.4，0.5，0.6mg/L KT，蔗糖浓度为15g/L，20g/L，共计8个组合)上均可诱导体细胞胚形成，20天后把诱导形成的体细胞胚转到1/2MS附加2mg/L PPT和0.5％ NaCL的无激素培养基1/2 MS上使其萌发并筛选抗盐植株。本实验得到600余株抗性再生苗。将筛选获得的抗性苗经PCR检测和Southern杂交检测发现82％的抗性苗都带有目标基因。选择生长状态较好的株优良单株进行扩大繁殖，当年获得了近100个目标抗性较好的优良株系(每一株系至少500棵苗)。用该方法比传统的方法大大提高了阳性苗的获得率，并且，当年就可以获得优良株系。

实施例2：

供试品种为保定苜蓿，购于农科院畜牧所。其它步骤和基本培养基同实施例1，所用筛选药剂为卡那霉素(购于欣经科生物公司)，初始选择压为50mg/L，筛选时间为两周，后经100mg/L卡那霉素筛选3周，将获得的抗性愈伤组织转到含有25mg/L卡那霉素，150mg/L羧卞青霉素的分化培养基(MSH附加0.4，0.5mg/L激动素，蔗糖浓度为20g/L，两个组合)上诱导体细胞胚分化。后在含25mg/L卡那霉素，NaCl3g/L的1/2MS培养基上筛选抗盐植株，本实验获得321棵抗性再生苗，经PCR检测和Southern杂交检测，发现85％的抗性苗都带有目标基因。对其中生长状态较好的优株进行组织培养扩大繁殖，当年获得近100个优良株系(每一株系至少500棵苗)，并且近90％的都已开花结实。该方法比常规方法大大提高了优株的获得率和优良株系的繁育效率。

实施例3：

供试品种为中苜一号，购于农科院畜牧所。其它步骤和基本培养基同实施例1，所用筛选药剂为潮霉素(购于欣经科生物公司)，初始选择压为10mg/L，筛选时间为两周，后经20mg/L潮霉素筛选3周，将获得的抗性愈伤组织转到含有3mg/L潮霉素，150mg/L羧卞青霉素的分化培养基(MSH附加0.3，0.4mg/L激动素，蔗糖浓度为20g/L，两个组合)上诱导体细胞胚分化。然后，在含潮霉素3mg/L和NaCL3g/L的1/2MS培养基上筛选抗盐植株，本实验获得452棵抗盐再生苗，经PCR检测和Southern杂交检测，发现81％的抗性苗都带有目标基因。对生长状态较好的优株进行组织培养扩大繁殖，当年获得近100个优良株系(每一株系至少500棵苗)，90％的苗都已开花结实。该方法比常规育种方法大大提高了优株的获得率和优良株系的繁育效率。

综上，关于快速获得大量转基因植物新品种/系的分子育种方法主要在抗逆性基因对植株遗传转化时选择效果较好。该技术的关键是：(1)建立该种植物的高频再生体系；(2)转目标抗性基因后的再生植株比非转基因植株的抗性有很大提高；(3)标记基因和目标基因双重筛选抗性植株；(4)严格的分子检测确定目标基因转化成功；(5)大量繁殖表现好的优株，在繁殖的株系中进行新品系/种的选育。

Claims

1.一种快速获得大量转基因植物新品种的分子育种方法，包括(1)制备外植体；(2)所述外植体在含2.0mg/L 2，4-D和0.025mg/L激动素的MSH培养基上预培养之后，用含目标基因的农杆菌菌液侵染外植体，其中所述MSH培养基的基本组分包括SH大量元素，MS微量元素及铁盐，1-2mg/L水解酪蛋白，9.9mg/L VB₁，9.5mg/L VB₆，4.5mg/L尼克酸，8g/L琼脂和30g/L蔗糖；(3)在含除菌药剂浓度逐渐升高的选择压的所述培养基上筛选抗性愈伤组织并除去农杆菌；(4)在含0.3-0.6mg/L激动素和低浓度选择压的所述培养基上诱导愈伤组织体细胞胚；(5)体细胞胚萌发，并利用标记基因和目标基因所对应的药剂来筛选抗性转基因再生苗；(6)对转化后获得的抗性苗进行分子检测；(7)扩大繁殖抗性转基因再生苗；(8)对抗性转基因再生苗进行生物学鉴定，获得优良品系。

2.权利要求1的方法，其中所述植物是苜蓿。

3.权利要求1的方法，其中所述目标基因是抗逆性基因。

4.权利要求3的方法，其中所述抗逆性基因是抗旱、耐盐相关的基因。

5.权利要求1的方法，其中所述除菌药剂是抑制农杆菌生长或使其死亡的药剂。

6.权利要求5的方法，其中所述除菌药剂是羧苄青霉素，噻胞霉素或头孢霉。

7.权利要求1的方法，其中所述选择压是所述标记基因所对应抗性的药剂，如潮霉素，卡那霉素，ppt和四环素。

8.权利要求7的方法，其特征在于所述潮霉素在筛选抗性愈伤组织过程中的浓度由低浓度的10mg/L经4～6周过渡到浓度较高的20mg/L，在诱导体细胞胚的过程中浓度为3mg/L。

9.权利要求7的方法，其中所述卡那霉素在筛选抗性愈伤组织过程中的浓度由低浓度的50mg/L经4～6周过渡到浓度较高的100mg/L，在诱导体细胞胚的过程中浓度为25mg/L。

10.权利要求7的方法，其中所述ppt在筛选抗性愈伤组织过程中的浓度由低浓度的5mg/L，经2～4周过渡到浓度中等的10mg/L，再经2～4周过渡到浓度较高的15mg/L，在诱导体细胞胚的过程中浓度为2-5mg/L。

11.权利要求1的方法，其特征在于在诱导愈伤组织分化为体细胞胚的过程中，将所述培养基中的蔗糖浓度降为15-20g/L。

12.权利要求1的方法，其特征在于经抗性筛选获得的抗性愈伤组织的分化经体细胞胚诱导途径，激动素的使用浓度为0.3～0.6mg/L。

13.权利要求1的方法，其特征在于体细胞胚经诱导形成后，在其萌发成为抗性苜蓿转基因苗的过程中利用标记基因和目标基因双重筛选。

14.权利要求1的方法，其特征在于经分子检测获得的抗性转基因再生苗后，将其经愈伤组织的诱导和分化进行扩大繁殖。

15.权利要求1的方法，其特征在于经由扩大繁殖的抗性转基因再生苗，筛选获得优良品系/种。