CN112048520B - 一种转基因抗虫豇豆的培育方法 - Google Patents

一种转基因抗虫豇豆的培育方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种转基因抗虫豇豆的培育方法，其包括如下步骤：获取豇豆无菌子叶节；构建含pUBI、Cry1C*基因的质粒，其中，所述pUBI的序列如SEQ ID NO:1所示，所述Cry1C*基因的序列如SEQ ID NO:2所示；利用携带含pUBI、Cry1C*基因的质粒的农杆菌浸染豇豆无菌子叶节，诱导形成愈伤组织，分化出不定芽，生根，长成豇豆植株，从中筛选含Cry1C*基因的转基因豇豆植株；采用转基因豇豆植株自交，获得纯合的转基因豇豆品种。该培育方法能够培育出抗螟鳞翅目害虫的转基因抗虫豇豆品种。

Description

一种转基因抗虫豇豆的培育方法
技术领域
本发明涉及植物技术领域，尤其涉及一种转基因抗虫豇豆的培育方法。
背景技术
豇豆(Vigna unguiculata(L.)Walp.)是豆科豇豆属的一年生蔬菜作物，具有极高的营养价值。豇豆荚螟(Maruba testulalis)，为螟鳞翅目害虫，是豇豆生产中的主要害虫之一，主要危害豆荚，严重影响着豇豆的产量和外观等品质。
然而，目前，市场上并没有出现抗豇豆荚螟等害虫的豇豆品种或种质材料。
发明内容
基于此，有必要提供一种转基因抗虫豇豆的培育方法，以获得具有抗螟鳞翅目害虫的转基因豇豆品种。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
一种转基因抗虫豇豆的培育方法，包括如下步骤：
获取豇豆无菌子叶节；
构建含pUBI、Cry1C*基因的质粒，其中，所述pUBI的序列如SEQ ID NO:1所示，所述Cry1C*基因的序列如SEQ ID NO:2所示；
利用携带所述含pUBI、Cry1C*基因的质粒的农杆菌浸染豇豆无菌子叶节，诱导形成愈伤组织，分化出不定芽，诱导生根，长成豇豆植株，从中筛选含Cry1C*基因的转基因豇豆组织、不定芽、根或植株(转基因植株的筛选可以在细胞阶段、愈伤组织阶段、不定芽阶段、生根阶段和植株阶段的任一阶段)；
采用转基因豇豆植株自交，获得纯合的转基因豇豆品种。
在其中一个实施例中，以序列如SEQ ID NO:3所示的pUBI-Fw和序列如SEQ ID NO:4所示的Cry1C*-Rv为引物，利用PCR法筛选。
在其中一个实施例中，所述PCR的反应程序如下：94℃预变性3min，94℃变性15s，56℃退火15s，72℃延伸30s，变性、退火、延伸重复34个循环，最后72℃延伸5min，16℃孵育10min。
在其中一个实施例中，所述的转基因抗虫豇豆的培育方法还包括以序列如SEQ IDNO:5所示的Cry1C*-Q-Fw和序列如SEQ ID NO:6所示的Cry1C*-Q-Rv为引物、采用Q-PCR法鉴定Cry1C*基因在转基因豇豆植株体内表达情况的步骤。
在其中一个实施例中，所述Q-PCR的反应程序如下：首先，50℃预热2min，95℃预变性10min；其次，95℃变性15s,58℃退火20s，72℃延伸20s，循环40次；最后，融合曲线95℃运行15s，60℃1min，95℃15s。
在其中一个实施例中，所述豇豆为金福临门或武蔬白豇或小仁白子或春宝1号或武蔬4号或武蔬3号。
在其中一个实施例中，所述豇豆为蔬4号、金福临门或武蔬3号。
在其中一个实施例中，诱导形成愈伤组织所采用的培养条件为：采用MS固体培养基，黑暗条件下26±2℃培养，所述MS固体培养基中的有机成分为维生素B5。
在其中一个实施例中，分化出不定芽所采用的培养条件为：采用添加了200mg/mL特美汀的MS固体培养基，26±2℃条件下16小时光照、8小时黑暗条件下依次交替培养，所述MS固体培养基中的有机成分为维生素B5、6-苄氨基嘌呤和激动素。
在其中一个实施例中，所述生根所采用的培养条件为：采用添加了0.5mg/L IBA(异丁醇)和50-100mg/L特美汀的固体MS培养基，26±2℃条件下16小时光照、8小时黑暗条件下依次交替培养。
本发明还提供了利用上述方法培育得到的转基因抗虫豇豆品种。
本发明的有益效果是：
与现有技术相比，本发明利用携带所述含pUBI、Cry1C*基因的质粒的农杆菌浸染豇豆的无菌子叶节，再诱导形成生成豇豆植株，从中筛选含Cry1C*基因的转基因豇豆植株，采用转基因豇豆植株自交，得纯合的转基因豇豆品种。本发明的转基因抗虫豇豆的培育方法能够获得具有抗螟鳞翅目害虫的转基因豇豆品种，具有重要的实践价值。
附图说明
图1为实施例1中豇豆外植体的再生情况统计图；其中，图a为再生一个月后各外植体的照片，图b为不同外植体的再生率统计图；
图2为实施例2中抗生素特美汀浓度对脱菌情况及再生率影响的统计图；其中，图a为抗生素特美汀浓度对脱菌情况及再生率影响的照片(浓度分别为：左上0mg/L，右上100mg/L，左下200mg/L，右下300mg/L)，图b为特美汀浓度对脱菌情况的影响关系图，图c为培养基中特美汀的浓度对再生率的影响关系图；
图3为实施例3中抗生素特美汀浓度对生根的影响的统计图；其中，图a为特美汀浓度对于脱菌的影响关系图；图b为特美汀浓度对于生根率的影响关系图；
图4为实施例4中农杆菌浸染浓度对豇豆子叶节再生率的影响统计图；其中，图a对应武蔬4号，图b对应金福临门，图c对应小仁白子，图d对应武蔬3号，OD600×10-1为纵坐标轴；
图5为实施例5中的Bt质粒pCAMBIA1300(Cry1C*)及酶切图谱；
图6为实施例5中所获得的小白仁子转基因豇豆株系实物照片；
图7为实施例5中所获得的春宝1号的转基因豇豆株系实物株系实物照片；
图8为实施例5中针对豇豆小仁白子转基因植株的电泳条带检测图；其中，泳道a为marker，泳道b为水(阴性对照)，泳道c为农杆菌质粒(阳性对照)，泳道d、e均为未转化小仁白子豇豆植株，泳道f、g分别为小仁白子转基因待检植株1、2号；
图9为实施例5中针对武蔬3号、金福临门转基因植株的电泳条带检测图；其中，泳道a为Marker，泳道b为农杆菌质粒(阳性对照)，泳道c为未转化植株(阴性对照)，泳道d-m为武蔬3号转基因待检植株1-10号，泳道n为金福临门转基因待检植株1号；
图10为实施例5中针对春宝1号、金福临门转基因植株的电泳条带检测图；其中，泳道M为Marker，泳道J2-J16为金福临门转基因系，泳道C1-C4为春宝1号转基因系，泳道H2O为阴性对照泳道；
图11为实施例5中小仁白子1号转基因植株内的Cry1C*基因序列与质粒载体DNA的序列的测序比对图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语均属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。
本发明在筛选基因时，基于Cry1C*基因的抗虫性，通过试验将其导入到豇豆中，意外的发现获得了一定的效果，因此选择了上述基因作为目标基因。经过发明人大量的实验后，发现采用pUBI作为启动子，将Cry1C*基因通过质粒构建，并利用携带含pUBI、Cry1C*基因质粒的农杆菌浸染豇豆无菌子叶节，诱导形成愈伤组织，分化出不定芽，诱导生根，长成豇豆植株，从中筛选含Cry1C*基因的转基因豇豆组织、不定芽、根或植株的方式培育出的豇豆植株品种，能够具有较佳的抗虫性。
发明人在实验过程中，还发现转化成功后的转基因植株在进行种植时，其同样会出现基因丢失现象，且不同的豇豆品种出现该现象的概率也不同，其中转化成功率最高的春宝1号其抗性最佳且出现基因丢失的植株占比最少。
本发明中所用的培养基如下：
LCM农杆菌悬浮液(1000mL)：
取配制好的大量元素(20x)50mL、微量元素(200x)5mL、铁盐(200x)5mL、蔗糖20g、20mg/ml的肌醇5mL、1mg/mL的盐酸硫胺素400μL、调整PH至5.8,定容，灭菌冷却后加入VB51mg、6-BA(6-苄氨基嘌呤)0.2mg/L、ACS(乙酰丁香酮)20mg。
诱导形成愈伤组织所用的培养基(1000mL)：
取配制好的大量元素(20x)50mL、微量元素(200x)5mL、铁盐(200x)5mL、蔗糖30g、琼脂粉7.4g，调整PH 5.8，定容，灭菌冷却后加入VB5 1mg。
分化出不定芽所用的培养基(1000mL)：
取配制好的大量元素(20x)50mL、微量元素(200x)5mL、铁盐(200x)5mL、蔗糖30g、琼脂粉7.4g，调整PH 5.8，定容，灭菌冷却后加入VB5 1mg、6-BA 1mg/L、KT 0.1mg/L、特美汀200mg/L。
生根所用的培养基(1000mL)：
取按照MS培养基配方配制好的大量元素(20x)50mL、微量元素(200x)5mL、铁盐(200x)5mL、有机成分(200x)5mL、蔗糖30g、琼脂粉7.4g，调整PH 5.8，定容，灭菌冷却后加入IBA 0.5mg、特美汀50mg/L。
其中，大量元素、微量元素、铁盐、有机成分按照标准MS培养基的配方配制。
实施例1
本实施例为探究豇豆子叶、子叶节、下胚轴、真叶的再生率试验，包括如下步骤：
以生长4d的豇豆(品种：小仁白子)的子叶、子叶节、下胚轴、真叶为外植体，进行再生苗诱导培养，记录每种外植体的再生率。其中，该再生所采用的培养条件为：采用MS固体培养基，黑暗条件下26±2℃培养，MS固体培养基中的有机成分为维生素B5。
本实施例外植体的再生情况的统计结果见图1，图1-a为再生一个月后各外植体的照片，图1-b为不同外植体的再生率。
由图1-a图可以看出，子叶和下胚轴的愈伤组织上不能分化出不定芽，只有子叶节能够分化出不定芽。
由图1-b图可以看出，四种外植体的再生率差异极显著(p<0.01)，只有子叶节具有较高的再生率。
本实施例的研究表明：豇豆的子叶、子叶节和下胚轴均能够长出愈伤组织，且愈伤组织长势很好，但是子叶和下胚轴的愈伤组织上不能分化成再生苗。
实施例2
本实施例探究抗生素特美汀浓度对于脱菌效果及再生率的影响，以豇豆子叶节为外植体采用与实施例1相同的再生率试验步骤。其中，分化培养基中抗生素特美汀浓度分别为0mg/mL、100mg/mL、200mg/mL、300mg/mL，农杆菌的浸染浓度为3mg/mL。抑(脱)菌效果用未长菌的外植体个数占侵染的外植体总数的百分比来衡量。
研究表明：对于采用未添加特美汀的分化培养基，1周后，长菌情况很严重，培养基状态变绿，平均再生率相比其他处理水平偏低。可见，农杆菌生长会与豇豆子叶节竞争养分，对豇豆不定芽再生的抑制作用很明显。而添加特美汀的分化培养基中农杆菌污染较少，可见添加特美汀对农杆菌起到抑制作用。
在本实施例中，分化培养基中抗生素特美汀浓度对脱菌情况及再生率的影响见图2。
由图2-a和图2-b可以看出，添加200mg/L和300mg/L特美汀的分化培养基与未添加特美汀的对照培养基相比，抑(脱)菌效果均存在极显著差异(p<0.01)。由图2-c可以看出，对于再生情况，200mg/L和300mg/L两个抗生素特美汀浓度之间不存在显著差异。由图2-c可以看出，采用含200mg/mL特美汀的培养基可使子叶节的再生率最高。
实施例3
本实施例探究抗生素特美汀浓度对生根的影响，通过将伸长的不定芽分别转入含特定浓度抗生素特美汀的生根培养基中，培养2周后，记录特美汀抑(脱)菌效果及生根率情况。其中，生根培养基中抗生素特美汀浓度分别为0mg/mL、50mg/mL、100mg/mL。抑菌效果仍用未长菌的外植体个数占侵染的外植体总数的百分比来衡量。
在本实施例中，生根培养基中抗生素特美汀浓度对脱菌情况及再生率的影响见图3。由图3-a可以看出，添加50mg/L和100mg/L特美汀的生根培养基的抑菌效果与不含特美汀的生根培养基相比，抑(脱)菌效果均有极显著差异(p<0.01)。
由图3-b可以看出，采用含50mg/mL和100mg/L特美汀的生根培养基均可以达到较高的再生率。
实施例4
本实施例探究农杆菌浸染浓度对豇豆子叶节再生率的影响。
本实施例使用不同浓度(OD600分别为0.3、0.6、0.9)的农杆菌悬浮液侵染不同基因型受体豇豆材料子叶节外植体，而后采用实施例1的再生培养步骤，1个月后记录不同基因型豇豆材料(小仁白子、武蔬3号、武蔬4号、金福临门、春宝1号)在不同的农杆菌侵染浓度下的再生率。
不同浓度的农杆菌悬浮液对不同基因型豇豆材料的再生率如图4所示，其中图4-a、图4-b、图4-c、图4-d分别对应小仁白子、武蔬3号、武蔬4号、金福临门四个品种。由图4可以看出，农杆菌悬浮液的浸染浓度对同一豇豆品种材料的再生率影响较小，同一品种间再生率没有显著差异。
另外，不同基因型豇豆品种的平均再生率统计结果见下表1：
表1不同基因型豇豆品种的平均再生率统计表
豇豆品种 平均再生率
小仁白子 68％
武蔬3号 94％
武蔬4号 81％
金福临门 28％
春宝1号 ＞94％
由表1可以看出，在不同基因型材料中，武蔬3号、武蔬4号及春宝1号的平均再生率较高，且在实验中发现武蔬3号的一个子叶节位点可以再生出多个不定芽，转化效率相对较高。武蔬3号、武蔬4号及春宝1号在前期发芽实验中发芽率也高于其他品种，可达到90％。因此，认为这三个品种的转化效率较高。
实施例5
本实施例提供一种转基因抗虫豇豆的培育方法，包括如下步骤：
S1，分别获取小白仁子、武蔬3号、金福临门、春宝1号四个品种的豇豆无菌子叶节。
S2，构建含pUBI、Cry1C*基因的质粒，并利用携带所述含pUBI、Cry1C*基因质粒的农杆菌分别浸染步骤S1获得的豇豆无菌子叶节，将浸染后的子叶节在经过LCM农杆菌悬浮液润湿后的培养皿上，26±2℃的黑暗条件下共培养2d。
具体地，质粒pCAMBIA1300(Cry1C*)及酶切图谱如图5所示。
其中，驱动Cry1C*基因表达的启动子pUBI序列如SEQ ID NO:1所示。
其中，转基因质粒载体pCAMBIA1300(Cry1C*)基因序列如SEQ ID NO:2所示。
S3，诱导形成愈伤组织：
诱导形成愈伤组织采用的培养条件为：采用MS固体培养基，黑暗条件下26±2℃培养，MS固体培养基中的有机成分为维生素B5。
S4，分化出不定芽：
分化出不定芽所采用的培养条件为:采用添加了200mg/mL特美汀的MS固体培养基，26±2℃条件下16小时光照、8小时黑暗条件下依次交替培养，所述MS固体培养基中的有机成分为维生素B5、6-苄氨基嘌呤和激动素。
S5，生根，长成豇豆植株：
生根所采用的培养条件为:采用添加了0.5mg/L IBA(异丁醇)和50mg/L特美汀的MS培养基，26±2℃条件下16小时光照、8小时黑暗条件下依次交替培养2周。
由分别如图6和7所示的小白仁子转基因豇豆株系实物图照片和春宝1号的转基因豇豆株系实物图—株系1--株系4可以看出，通过该培育方法可以成功获得转基因抗虫豇豆新品种。
S6，采用PCR法筛选含Cry1C*基因的转基因豇豆植株：
利用CTAB法提取转基因待检测豇豆DNA和未转化豇豆DNA，利用Plasmid Mini KitI提取农杆菌中质粒。
以农杆菌质粒为阳性对照，水和未转化的豇豆DNA为阴性对照，用pUBI-Fw(SEQ IDNO:3)和Cry1C*-Rv(SEQ ID NO:4)为引物，Phanta酶(Phanta Super-FidelityDNAPolymerase)50μL体系进行PCR扩增，使用琼脂糖凝胶电泳检测。
其中，pUBI-Fw的引物序列如SEQ ID NO:3所示：5’-cttggatgatggcatatgc-3’。
Cry1C*-Rv的引物序列如SEQ ID NO:4所示：5’-gaggctcctggttagcctct-3’。
具体地，PCR反应程序如下：94℃预变性3min，94℃变性15s，56℃退火15s，72℃延伸30s，变性、退火、延伸重复34个循环，最后72℃延伸5min，16℃孵育10min。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，以DL5000作为DNA Marker。PCR反应体系如下表2所示：
表2 PCR反应体系
试剂种类 用量(μL)
DNA模板 4.0
dNTP 1.0
pUBI-Fw 2.0
Cry1C*-Rv 2.0
Phanta酶 1.0
Buffer 25
ddH2O 15
其中，小仁白子品种的基因型的琼脂糖凝胶电泳检测结果如图8，结果显示：在小仁白子转基因1号转化植株中检测到了与质粒相同的条带存在，而在水、未转化及小仁白子转基因2号植株中不存在这个条带。因此，通过PCR检测，可认为小仁白子转化1号转化植株成功转化了Cry1C*基因。
武蔬3号及金福临门的基因型的琼脂糖凝胶电泳检测结果见图9，结果显示：在武蔬3号基因型转基因的1号、2号、5号、6号、9号、10号转化植株及金福1号转化植株中检测到了与质粒相同的条带存在，而在未转化植株中不存在这个条带。通过PCR初步检测，可推定1号、2号、5号、6号、9号、10号转化植株均为转化苗。
春宝1号、金福临门转基因植株的PCR检测结果如图10所示。由图10可以看出。春宝1号和金福临门转基因系2-16号植株与阴性对照的带型相似，因此可能全为阴性苗，有待进一步确定。春宝1号转基因系1-4号植株与阴性对照的带型不同，春宝1号的2号植株的转基因系稍弱。
S7，将转基因豇豆中的pUBI::Cry1C*进行测序验证：
利用pUBI-Fw+Cry1C*-Rv对小仁白子1号转基因系进行PCR扩增，产物送公司进行一代测序，利用pUBI-Fw测1个正向反应即可，利用Multalin与Cry1C*参考序列(HM107006.1)进行比对，发现基本匹配，表明在转基因豇豆中检测到外源的Cry1C*基因序列。
S8，采用Q-PCR法鉴定转基因豇豆植株Cry1C*基因表达的Bt蛋白：
提取待检测武蔬3号基因型豇豆的总RNA(共16种)，进行反转录得到cDNA。并以16种cDNA为模板，以UBC9为内参基因，UBC9-Q-Fw、UBC9-Q-Rv为内参引物，Cry1C*-Q-Fw、Cry1C*-Q-Rv为基因引物，以
Figure SMS_1
Premix Ex TaqTM(TaKaRa)为荧光染料进行Q-PCR检测。数据采用2－△△Ct方法对进行基因表达相对表达量分析。
PCR反应程序如下：首先，50℃预热2min，95℃预变性10min；其次，95℃变性15s,58℃退火20s，72℃延伸20s，循环40次；最后，融合曲线95℃运行15s，60℃1min，95℃15s。
Q-Cry1C*的Q-PCR引物序列如下：
Cry1C*-Q-Fw：5’-caatcagaaccagtgtatcc-3’(SEQ ID NO:5)；
Cry1C*-Q-Rv：5’-agaaggtccaacgattcc-3’(SEQ ID NO:6)。
内参基因采用豇豆UBC9(泛素基因9)
UBC9-Q-Fw：5'-actcactatctccaaggtact-3(SEQ ID NO:7)；
UBC9-Q-Rv：5'-gccagccattcttcaatatac-3'(SEQ ID NO:8)。
Q-PCR反应体系如下表3：
表3 Q-PCR反应体系
试剂种类 用量(μL)
cDNA模板(80-200ng/μL) 4.0
10×Buffer 1.00
10mM dNTPs 0.120
SYBR 0.333
ddH2O 3.45
Easy Taq(5U/μL) 0.100
Cry1C*-Q-Fw(10μM) 0.50
Cry1C*-Q-Rv(10μM) 0.50
由Q-PCR表达量数据见下表4。由表4可以看出，以武蔬3号中一个转基因品系为对照，结果显示，除19号外，其余均达到10倍以上，尤其4号相对表达量达到300倍，6号达到100倍，18号达到200倍，均超量表达。可认为是转化成功的再生苗。
表4 Q-PCR表达量数据
Figure SMS_2
Figure SMS_3
通过普通PCR检测阳性和Q-PCR检测统计阳性豇豆植株，结果见下表5：
表5不同品种的豇豆转基因植株数量统计表
受体材料 再生苗数 普通PCR检测阳性
小仁白子 2 1阳；1阴
武蔬3号 16 6阳，4阴，6未检测
金福临门 16 1阳，15阴
春宝1号 4 3阳；1阴
S9，采用转基因豇豆植株自交，获得纯合的转基因豇豆品种。
S10，分别取小仁白子、武蔬3号、武蔬4号、金福临门、春宝1号的纯合转基因豇豆品种和野生型品种在田间播种，豇豆植株自然感虫，不施用杀虫剂，发现野生型品种叶片和豆荚的受损率均显著大于纯合转基因品种，其中尤以春宝1号最为显著，同时对转基因品种进行测序发现，春宝1号中检测呈阴性的植株(即发生基因丢失的植株)占比最少。
以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 一种转基因抗虫豇豆的培育方法
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1992
<212> DNA
<213> 豇豆(Vigna unguiculata)
<400> 1
ctgcagtgca gcgtgacccg gtcgtgcccc tctctagaga taatgagcat tgcatgtcta 60
agttataaaa aattaccaca tatttttttt gtcacacttg tttgaagtgc agtttatcta 120
tctttataca tatatttaaa ctttactcta cgaataatat aatctatagt actacaataa 180
tatcagtgtt ttagagaatc atataaatga acagttagac atggtctaaa ggacaattga 240
gtattttgac aacaggactc tacagtttta tctttttagt gtgcatgtgt tctccttttt 300
ttttgcaaat agcttcacct atataatact tcatccattt tattagtaca tccatttagg 360
gtttagggtt aatggttttt atagactaat ttttttagta catctatttt attctatttt 420
agcctctaaa ttaagaaaac taaaactcta ttttagtttt tttatttaat aatttagata 480
taaaatagaa taaaataaag tgactaaaaa ttaaacaaat accctttaag aaattaaaaa 540
aactaaggaa acatttttct tgtttcgagt agagaatgcc agcctgttaa acgccgtcga 600
cgagtctaac ggacaccaac cagcgaacca gcagcgtcgc gtcgggccaa gcgaagcaga 660
cggcacggca tctctgtcgc tgcctctgga cccctctcga gagttccgct ccaccgttgg 720
acttgctccg ctgtcggcat ccagaaattg cgtggcggag cggcagacgt gagccggcac 780
ggcaggcggc ctcctcctcc tctcacggca cggcagctac gggggattcc tttcccaccg 840
ctccttcgct ttcccttcct cgcccgccgt aataaataga caccccctcc acaccctctt 900
tccccaacct cgtgttgttc ggagcgcaca cacacacaac cagatctccc ccaaatccac 960
ccgtcggcac ctccgcttca aggtacgccg ctcgtcctcc cccccccccc ctctctacct 1020
tctctagatc ggcgtgccgg tccatggtta gggcccggta gttctacttc tgttcatgtt 1080
tgtgttagat ccgtgtttgt gttagatccg tgctgctagc gttcgtacac ggatgcgacc 1140
tgtacgtcag acacgttctg attgctaact tgccagtgtt tctctttggg gaatcctggg 1200
atggctctag ccgttccgca gacgggatcg atttcatgat tttttttgtt tcgttgcata 1260
gggtttggtt tgcccttttc ctttatttca atatatgccg tgcacttgtt tgtcgggtca 1320
tcttttcatg cttttttttg tcttggttgt gatgatgtgg tctggttggg cggtcgttct 1380
agatcggagt agaattctgt ttcaaactac ctggtggatt tattaatttt ggatctgtat 1440
gtgtgtgcca tacatattca tagttacgaa ttgaagatga tggatggaaa tatcgatcta 1500
ggataggtat acatgttgat gcgggtttta ctgatgcata tacagagatg ctttttgttc 1560
gcttggttgt gatgatgtgg tgtggttggg cggtcgttca ttcgttctag atcggagtag 1620
aatactgttt caaactacct ggtgtattta ttaattttgg aactgtatgt gtgtgtcata 1680
catcttcata gttacgagtt taagatggat ggaaatatcg atctaggata ggtatacatg 1740
ttgatgtggg ttttactgat gcatatacat gatggcatat gcagcatcta ttcatatgct 1800
ctaaccttga gtacctatct attataataa acaagtatgt tttataatta ttttgatctt 1860
gatatacttg gatgatggca tatgcagcag ctatatgtgg atttttttag ccctgccttc 1920
atacgctatt tatttgcttg gtactgtttc ttttgtcgat gctcaccctg ttgtttggtg 1980
ttacttctgc ag 1992
<210> 2
<211> 1893
<212> DNA
<213> 豇豆(Vigna unguiculata)
<400> 2
atggaggaga acaatcagaa ccagtgtatc ccgtacaatt gtctgagcaa tccggaagaa 60
gttctgctgg atggcgaacg catctcaact ggtaactcat caattgacat ctctctctca 120
cttgttcagt tcttggtttc taactttgtg ccaggaggag gattccttgt tggacttatc 180
gacttcgttt ggggaatcgt tggaccttct caatgggatg catttctcgt tcagatcgaa 240
cagctcatca acgaaagaat cgctgagttc gctaggaatg ctgctattgc taaccttgaa 300
ggacttggaa acaacttcaa catctacgtg gaggcattca aggaatggga agaagatcct 360
aacaacccag caaccaggac cagagtgatc gataggttcc gtatccttga tggacttctt 420
gaaagggaca ttcctagctt taggatctct ggatttgaag ttccacttct ctctgtttac 480
gctcaagctg ctaatctcca tcttgctatc cttagagatt ctgtgatctt cggagaaaga 540
tggggattga caaccatcaa cgtgaacgag aactacaaca gactcatcag gcacatcgat 600
gagtacgctg atcactgtgc taacacttac aaccgtggac tcaacaacct tcctaagtct 660
acctatcaag attggatcac atacaaccga cttaggagag accttacatt gactgttctt 720
gatatcgctg ctttctttcc aaactatgac aataggagat atccaattca gccagttggt 780
caacttacaa gggaagttta cactgaccca ctcatcaact tcaacccaca gcttcagtct 840
gttgctcagc ttcctacctt caacgttatg gagagcagcg caatcagaaa tcctcacctc 900
ttcgacatct tgaacaacct tacaatcttt accgattggt ttagtgttgg acgtaacttc 960
tactggggag gacatcgact gatctctagc ctcatcggag gtggtaacat cacatctcct 1020
atctacggaa gagaggctaa ccaggagcct ccaagatcat tcactttcaa cggacctgtg 1080
ttcaggactc tttcaaatcc tactcttcga cttcttcagc aaccttggcc agctccacca 1140
ttcaaccttc gtggtgttga aggagttgag ttctctacac ctacaaacag cttcacctat 1200
cgtggaagag gtactgttga ttctcttact gaacttccac ctgaggacaa cagtgtgcca 1260
cctcgtgaag gatacagtca tcgtctttgt catgcaacct tcgttcaaag atctggaaca 1320
cctttcctta caactggtgt tgtgttctct tggactcatc gtagtgcaac tcttaccaac 1380
acaattgatc cagagaggat caaccagatc cctcttgtga aaggattcag agtttgggga 1440
ggaacctctg tgattacagg accaggattc acaggaggtg atatccttcg aagaaacacc 1500
tttggtgact tcgtttctct tcaagtgaac atcaactcac caatcaccca aagataccgt 1560
cttagatttc gttacgcttc tagtagggat gcacgagtta tcgttcttac aggagctgca 1620
tctacaggag tgggaggtca agttagtgtg aacatgcctc ttcagaaaac tatggagatc 1680
ggagagaacc tcacatctag aacattcaga tacaccgact tcagtaatcc tttctcattc 1740
agagctaatc cagacatcat cggtatcagt gaacaacctc tcttcggtgc aggttctatc 1800
agtagcggtg aactttacat cgacaagatc gagatcatcc ttgcagatgc aacatttgaa 1860
gcagaatctg accttgaaag agcacaaaag tag 1893
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cttggatgat ggcatatgc 19
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gaggctcctg gttagcctct 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
caatcagaac cagtgtatcc 20
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
agaaggtcca acgattcc 18
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
actcactatc tccaaggtac t 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gccagccatt cttcaatata c 21

Claims (8)

1.一种转基因抗虫豇豆的培育方法，其特征在于，包括如下步骤：
获取豇豆无菌子叶节；
构建含pUBI、Cry1C*基因的pCAMBIA1300质粒，其中，所述pUBI的序列如SEQ ID NO:1所示，所述Cry1C*基因的序列如SEQ ID NO:2所示；
利用携带含所述pUBI、Cry1C*基因质粒的农杆菌浸染豇豆无菌子叶节，诱导形成愈伤组织，分化出不定芽，诱导生根，长成豇豆植株，从中筛选含Cry1C*基因的转基因植株，其中诱导形成愈伤组织所用的培养基的配制方法为：取配制好的20x大量元素 50 mL、200x微量元素 5 mL、200x铁盐5 mL、蔗糖30 g、琼脂粉 7.4 g，调整pH 5.8，定容至1000mL，灭菌冷却后加入维生素B5 1mg；
分化出不定芽所用的培养基的配制方法为：取配制好的20x大量元素50 mL、200x微量元素 5 mL、200x铁盐 5 mL、蔗糖30g、琼脂粉7.4 g，调整PH 5.8，定容至1000mL，灭菌冷却后加入维生素B5 1mg、6-苄氨基嘌呤 1 mg、 激动素 0.1 mg、特美汀 200 mg；
生根所用的培养基的配置方法为：取配制好的20x大量元素50 mL、200x微量元素 5mL、200x铁盐5 mL、200x有机成分 5 mL、蔗糖30 g、琼脂粉7.4 g，调整pH 5.8，定容至1000mL，灭菌冷却后加入IBA 0.5 mg、特美汀 50 mg或者100mg;
其中，大量元素、微量元素、铁盐、有机成分按照标准MS培养基的配方配制；
将转基因豇豆植株自交，获得纯合的转基因豇豆品种。
2.根据权利要求1所述的转基因抗虫豇豆的培育方法，其特征在于，以序列如SEQ IDNO:3所示的pUBI-Fw和序列如SEQ ID NO:4所示的Cry1C*-Rv为引物，利用PCR法筛选。
3.根据权利要求2所述的转基因抗虫豇豆的培育方法，其特征在于，所述PCR的反应程序如下：94℃预变性3min，94℃变性15s，56℃退火15s，72℃延伸30s，变性、退火、延伸重复34个循环，最后72℃延伸5min，16℃孵育10min。
4.根据权利要求1所述的转基因抗虫豇豆的培育方法，其特征在于，还包括以序列如SEQ ID NO:5所示的Cry1C*-Q-Fw和序列如SEQ ID NO:6所示的Cry1C*-Q-Rv为引物、采用Q-PCR法鉴定Cry1C*基因在转基因豇豆植株体内表达情况的步骤。
5.根据权利要求4所述的转基因抗虫豇豆的培育方法，其特征在于，所述Q-PCR的反应程序如下：首先，50℃预热2min，95℃预变性10min；其次，95℃变性15s,58℃退火20s，72℃延伸20s，循环40次；最后，融合曲线95℃运行15s，60℃ 1min，95℃ 15s。
6.根据权利要求1所述的转基因抗虫豇豆的培育方法，其特征在于，诱导形成愈伤组织所采用的培养条件为：黑暗条件下26±2℃ 培养。
7.根据权利要求1所述的转基因抗虫豇豆的培育方法，其特征在于，分化出不定芽所采用的培养条件为：26±2℃条件下16小时光照、8小时黑暗条件下依次交替培养。
8.根据权利要求1所述的转基因抗虫豇豆的培育方法，其特征在于，生根所采用的培养条件为：26±2℃条件下16小时光照、8小时黑暗条件下依次交替培养。
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