CN113106118B - 一种利用草甘膦筛选豇豆遗传转化体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用草甘膦筛选豇豆遗传转化体的方法，所述方法为：将抗草甘膦基因通过农杆菌介导侵染豇豆外植体，以草甘膦为筛选剂，筛选阳性转化体。传统以抗生素为筛选剂的豇豆遗传转化，外植体转化率仅4％～5％，转化体阳性率仅50％～60％。本发明创新性地使用了草甘膦作为筛选剂，在显著降低假阳性率的同时，豇豆外植体的转化率可达到8％～10％，转化体阳性率高达99.9％，是一种高效的豇豆外植体转化方法。

Description

一种利用草甘膦筛选豇豆遗传转化体的方法
(一)技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用草甘膦为筛选剂的豇豆遗传转化的方法。
(二)背景技术
豇豆(Vigna unguiculata L.)是世界上主要的粮用及蔬菜作物之一。豇豆富含各种蛋白质、叶酸及锌、镁、铁等矿质元素。由于豇豆是严格的自花授粉作物，柱头和花药被龙骨瓣包围，人工杂交非常容易破坏柱头和花药从而导致母本花蕾脱落，人工杂交困难，因此传统育种存在局限性。转基因技术成为豇豆新品种培育的重要手段。
豇豆目前使用较为广泛的转化体系是利用根癌农杆菌介导的转化体系。其中主要以新霉素、潮霉素、磷霉素、卡那霉素等抗生素做为转化体系的筛选标记，利用此类筛选剂的转化体系转化效率低、假阳性比较高。在遗传转化中，筛选剂的选择不仅直接影响转化效率，而且影响转基因材料的实用性。草甘膦是一种灭生性除草剂，对多种植物具有杀灭的作用。草甘膦作为一种植物遗传转化的筛选剂，已经成功应用于玉米、大豆等植物的遗传转化体系。但是利用草甘膦作为筛选剂的豇豆转化技术仍然缺乏。以草甘膦为筛选剂的豇豆遗传转化方法，其难点在于适用于草甘膦筛选体系的豇豆外植体的选择，以及豇豆耐草甘膦遗传转化筛选体系的建立。至今尚未见有利用草甘膦筛选成功转化豇豆的文献报道。通过大量的筛选试验，本发明创造性地将抗草甘膦基因作为筛选标记，建立了一种基于草甘膦为筛选剂的豇豆高效遗传转化体系，不仅大幅提高了豇豆遗传转化效率，同时将豇豆遗传转化苗的阳性率提升至高达99.9％。本发明披露了一种利用草甘膦作为筛选剂的豇豆高效转化方法。
(三)发明内容
本发明的目的提供一种利用草甘膦筛选豇豆遗传转化体的方法，旨在提高豇豆转化体系的转化率以及阳性率。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种利用草甘膦筛选豇豆遗传转化体的方法，所述方法为：将抗草甘膦基因通过农杆菌介导侵染豇豆外植体，以草甘膦为筛选剂，筛选阳性转化体。所述以草甘膦为筛选剂是指用含抗草甘膦基因的农杆菌菌液侵染豇豆外植体，侵染后的外植体共培养，然后依次用含草甘膦的芽诱导筛选培养基、芽伸长培养基、生根培养基培养，筛选阳性转化体。
所述抗草甘膦基因核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示：
SEQ ID NO:1:
atgctacacggtgcaagcagccggccggcaaccgctcgcaaatcttccggcctttcgggaacggtcaggattccgggcgataagtccatatcccaccggtcgttcatgttcggcggtcttgccagcggtgagacgcgcatcacgggcctgcttgaaggtgaggacgtgatcaataccgggaaggccatgcaggctatgggagcgcgtatccgcaaggaaggtgacacatggatcattgacggcgttgggaatggcggtctgctcgcccctgaggcccctctcgacttcggcaatgcggcgacgggctgcaggctcactatgggactggtcggggtgtacgacttcgatagcacgttcatcggagacgcctcgctcacaaagcgcccaatgggccgcgttctgaacccgttgcgcgagatgggcgtacaggtcaaatccgaggatggtgaccgtttgcccgttacgctgcgcgggccgaagacgcctaccccgattacctaccgcgtgccaatggcatccgcccaggtcaagtcagccgtgctcctcgccggactgaacactccgggcatcaccacggtgatcgagcccatcatgaccagggatcataccgaaaagatgcttcaggggtttggcgccaacctgacggtcgagacggacgctgacggcgtcaggaccatccgccttgagggcaggggtaaactgactggccaagtcatcgatgttccgggagacccgtcgtccacggccttcccgttggttgcggcgctgctcgtgccggggagtgacgtgaccatcctgaacgtcctcatgaacccgaccaggaccggcctgatcctcacgcttcaggagatgggagccgacatcgaggtgatcaacccgcgcctggcaggcggtgaagacgttgcggatctgcgcgtgcgctcctctaccctgaagggcgtgacggtcccggaagatcgcgcgccgtccatgatagacgagtatcctattctggccgtcgccgctgcgttcgccgaaggggccacggtcatgaacggtcttgaggaactccgcgtgaaggaatcggatcgcctgtcggcggtggccaatggcctgaagctcaacggtgttgactgcgacgagggtgagacctcactcgtggtccgtggccggcctgatggcaagggcctcggcaacgccagtggagcggccgtcgccacgcacctcgatcatcgcatcgcgatgtccttcttggtgatgggtctcgtctcagagaacccggtgaccgtcgatgacgccacgatgatagcgacgagcttcccagagttcatggatctgatggcgggcctcggggccaagatcgaactgtctgacacgaaggccgcttga。
本发明所述利用草甘膦筛选豇豆遗传转化体的方法包括如下步骤：
(1)构建含抗草甘膦基因的表达载体，转化农杆菌；
(2)取步骤(1)得到的农杆菌，对豇豆外植体进行侵染；
(3)将步骤(2)侵染后的外植体置于共培养培养基，26～28℃共培养3～5d；
(4)将步骤(3)共培养后外植体转入含草甘膦的芽诱导筛选培养基，26～28℃暗培养15～21天，获得带有新生芽的外植体；
(5)将步骤(4)带有新生芽的外植体转入含草甘膦的芽伸长培养基，26～28℃光暗交替培养15～21天，获得伸长阳性芽；
(6)将步骤(5)伸长阳性芽转入含草甘膦的生根培养基，26～28℃光暗交替培养15～21天，获得转化苗，炼苗后，转移至温室。
进一步，步骤(4)-步骤(6)中草甘膦加入浓度均为0.1～50mg/L，优选10-50mg/L。
步骤(3)共培养培养基为含有0.1～5mg/L 6-苄氨基嘌呤(6-BA)、0.1～4mg/L赤霉素(GA3)和1～10mg/L乙酰丁香酮(AS)的MS固体培养基，其中6-BA的浓度优选0.1～2.5mg/L，更优选2.5～5mg/L，具体可以选择0.1mg/L、2.0mg/L或5mg/L；GA3浓度优选0.1mg/L、1mg/L或4mg/L；AS浓度优选1～5mg/L或5～10mg/L，更优选1mg/L、5mg/L或10mg/L。优选所述共培养培养基组成为含2mg/L 6-BA、1mg/L GA3和5mg/L AS的MS固体培养基。所述共培养的条件为26～28℃(如26～27℃、27～28℃、26℃、27℃或28℃)、暗培养3～5d(如3～4d、4～5d、3d、4d或5d)。
步骤(4)芽诱导筛选培养基为含有0.1～6mg/L 6-BA、100～500mg/L特美汀(Timentin)和40～50mg/L草甘膦的MS固体培养基，其中6-BA浓度选择0.1～1mg/L、1～2mg/L、2～3mg/L、3～4mg/L、4～5mg/L、5～6mg/L，具体选择0.1mg/L、1mg/L、2mg/L、3mg/L、4mg/L、5mg/L或6mg/L；Timentin浓度选择100～300mg/L、300～500mg/L，具体选择100mg/L、300mg/L或500mg/L；草甘膦浓度选择40～45mg/L、45～50mg/L，具体选择40mg/L、45mg/L或50mg/L。优选所述芽诱导筛选培养基组成为含3mg/L 6-BA、300mg/L Timentin和45mg/L草甘膦的MS固体培养基。所述芽诱导筛选培养的条件为26～28℃(如26～27℃、27～28℃、26℃、27℃或28℃)、光暗交替培养28d。
步骤(5)芽伸长培养基为含有0.1～4mg/L 6-BA、0.1～5mg/L GA3、100～500mg/LTimentin和25～40mg/L草甘膦的MS固体培养基；其中，6-BA浓度优选0.1～1mg/L、1～2mg/L、2～3mg/L、3～4mg/L，具体优选0.1mg/L、1mg/L、2mg/L、3mg/L或4mg/L；GA3浓度优选0.1～1mg/L、1～2mg/L、2～3mg/L、3～4mg/L、4～5mg/L，具体优选0.1mg/L、1.5mg/L、2mg/L、3mg/L、4mg/L或5mg/L；Timentin浓度优选100～300mg/L、300～500mg/L，具体优选100mg/L、300mg/L或500mg/L；草甘膦浓度选为25～30mg/L、30～35mg/L、35～40mg/L、25～32.5mg/L、32.5～40mg/L；具体选为25mg/L、30mg/L、32.5mg/L、35mg/L或40mg/L。优选所述芽伸长培养基组成为含有2mg/L 6-BA、1.5mg/L GA3、300mg/L Timentin和32.5mg/L草甘膦的MS固体培养基。所述芽伸长培养的条件为26～28℃(如26～27℃、27～28℃、26℃、27℃或28℃)、光暗交替培养28d。
步骤(6)生根培养基为含有0.1～2mg/L吲哚乙酸(IAA)、100～500mg/L Timentin和0.1～25mg/L草甘膦的MS固体培养基；其中IAA浓度选为0.1～1mg/L、1～2mg/L，具体选为0.1mg/L、0.8mg/L或2mg/L；Timentin浓度选为100～300mg/L、300～500mg/L，具体选为100mg/L、300mg/L或500mg/L；草甘膦浓度选为0.1～12.5mg/L、12.5～25mg/L，具体选为1mg/L、12.5mg/L或20mg/L。优选所述生根培养基组成为含有0.8mg/L IAA、300mg/LTimentin和12.5mg/L草甘膦的MS固体培养基。所述生根培养的条件为26～28℃(如26～27℃、27～28℃、26℃、27℃或28℃)、光暗交替培养10d。
步骤(1)含抗草甘膦基因的表达载体构建方法如下：利用XhoI将原始pCambia1300(NCBI序列编号AF234296)载体的hygromycin基因单独切开，替换成SEQ ID NO.1所示抗草甘膦基因。采用电击转化法将含抗草甘膦基因的表达载体导入农杆菌，优选农杆菌AGL1化学感受态细胞。
步骤(2)所述侵染的方法如下：将豇豆外植体置于农杆菌侵染液中，26℃浸染30～45min；所述农杆菌侵染液组成：含有0.1～4mg/L 6-BA、0.1～2mg/L GA3和1～10mg/LAS的农杆菌菌液，所述农杆菌菌液是将含有抗草甘膦基因的农杆菌加入B5液体培养基中至OD600nm值为0.4-0.8制成；其中6-BA浓度选为0.1～1mg/L、1～2mg/L、2～3mg/L、3～4mg/L，具体选为0.1mg/L、1mg/L、2mg/L、3mg/L或4mg/L；GA3浓度选为0.1～1mg/L、1～2mg/L，具体选为0.1mg/L、1mg/L或2mg/L；AS浓度选为1～5mg/L、5～10mg/L，具体选为1mg/L、5mg/L或10mg/L。优选所述农杆菌侵染液组成为：含有2mg/L 6-BA、1mg/L GA3和5mg/L AS的农杆菌菌液。
所述农杆菌菌液的OD600nm值可为0.4～0.8(以B5液体培养基为参照，如0.4～0.6、0.6～0.8、0.4、0.6或0.8)。所述农杆菌侵染液的OD600nm值具体可为0.6(以B5液体培养基为参照)。
所述农杆菌菌液按如下方法制备：将含有抗草甘膦基因的农杆菌涂于含有50mg/L卡那霉素和25mg/L利福平的YEP固体培养基上，28℃暗培36h；刮取农杆菌于B5液体培养基中至OD600nm值为0.4-0.8，获得农杆菌菌液。
所述豇豆的外植体为豇豆的子叶节或胚轴等部分，获得所述豇豆外植体的方法为：将灭菌的豇豆种子置于MS固体培养基，26～28℃(如26～27℃、27～28℃、26℃、27℃或28℃)暗培养2～5d；去壳，取带有胚轴或子叶节的外植体部分。
所述光暗交替培养的周期具体可为16h光照培养/8h黑暗培养，所述光暗交替培养时的光强度可为4000Lx～6000Lx。
所述MS固体培养基(每1升)由如下成分组成：4.43g MS粉末、30g蔗糖和6g植物凝胶，水定容，pH值可为5.6～5.8(如5.6、5.7或5.8)。所述MS粉末可为Phytotech公司的产品(Murashige&Skoog Basal Medium with Vitamins,Product Number:M519,PhytoTechnology 
Figure BDA0003065787860000041
)。
所述B5液体培养基(每1升)由如下成分组成：3.21g B5粉末和10g蔗糖，水定容，pH值可为5.6～5.8(如5.6、5.7或5.8)。所述B5粉末可为Phytotech公司的产品Gamborg B-5Basal Medium,Product Number:G398,PhytoTechnology 
Figure BDA0003065787860000042
)。
所述植物凝胶为sigma公司的产品，产品目录为A7921,CAS号9002-18-0。
本发明采用CP4 EPSPS速测试纸检测豇豆阳性转化体。
与现有方法相比，本发明有益效果主要体现在：
本发明建立以草甘膦为筛选剂筛选豇豆遗传转化体的方法，相比较传统的以新霉素、潮霉素、磷霉素、卡那霉素等抗生素做为转化体系的筛选标记时，转化效率提高至8％～10％，阳性率提高至99.9％。抗草甘膦性状不仅可在遗传转化阶段发挥作用，后续的田间管理可直接用于杂草防治，降低生产过程的成本，减少杂草的营养竞争，提高产量，获得最大经济效益，具有重大应用价值。
(四)附图说明
图1为实施例1转化过程中阳性芽伸长的结果图。
图2为实施例1试纸条结果检测图。
(五)具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但不限定于本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买得到的。
本发明涉及的培养基组成如下：
MS固体培养基：将4.43g MS粉末(购自Phytotech，产品目录为M519)和30g蔗糖溶于1L蒸馏水，调节pH值至5.7，加入6g植物凝胶(购自sigma，产品目录为A7921，CAS号9002-18-0)，121℃高压灭菌20min。
B5液体培养基：将3.21g B5粉末(购自Phytotech，产品目录为G398)和10g蔗糖溶于1L蒸馏水，调节pH值至5.7，121℃高压灭菌20min。
共培养固体培养基：含2mg/L 6-苄氨基嘌呤(6-BA)、1mg/L赤霉素(GA3)和5mg/L乙酰丁香酮(AS)的MS固体培养基。
芽诱导筛选培养基：含3mg/L 6-BA、300mg/L特美汀(Timentin)和45mg/L草甘膦的MS固体培养基。
芽伸长筛选培养基：含有2mg/L 6-BA、1.5mg/L GA3、300mg/L Timentin和32.5mg/L草甘膦的MS固体培养基。
生根培养基：含有0.8mg/L吲哚-3-乙酸(IAA)、300mg/L Timentin和12.5mg/L草甘膦的MS固体培养基。
YEP固体培养基：将5g NaCl、10g胰蛋白胨(Tryptone，购于OXOID，产品目录为LP0042)和10g酵母提取物(Yeast extract，购于OXOID，产品目录为LP0021)溶于1L蒸馏水，加入15g植物凝胶(购自sigma，产品目录为A7921)，pH自然。
实施例1、利用草甘膦高效筛选剂豇豆遗传转化体的方法
1、具体步骤包括：
(1)构建豇豆遗传转化的载体质粒：利用限制性内切酶XhoI消化pCambia1300(NCBI序列编号AF234296)质粒，将原载体上位于两个XhoI位点间的hygromycin基因替换成抗草甘膦筛选标记基因cp4-epsps(UniProt-KB accession NO:Q9R4E4，核苷酸序列为SEQID NO.1所示)，载体的其余部分未做改动；需要指出的是，这里的抗草甘膦筛选标记基因可以是其他具有相似效果的抗草甘膦基因，此处仅以最常用的cp4-epsps基因为例进行说明，替换为其他适用基因时也应视为本发明的内容；
(2)将上述载体质粒利用电击转化法转入农杆菌AGL1化学感受态细胞(基因型为C58 RecA(rif R/carbR)Ti pTiBo542DT-DNA Succinamopine，购自武汉淼灵生物科技有限公司)中，于-80℃保存；
(3)将步骤(2)农杆菌涂于含有25mg/L羧苄青霉素和25mg/L利福平的YEP固体培养基上，28℃暗培36h；
(4)刮取步骤(3)农杆菌至B5液体培养基中，悬浮混匀，以B5液体培养基为blank对照，利用分光光度计(Eppendorf BioPhotometer D30)检测OD600nm，用B5液体培养基调整农杆菌的浓度，若浓度较低则再刮取农杆菌，直至测得的OD600nm值为0.6，随后加入终浓度2mg/L 6-BA、1mg/L GA3和5mg/L AS，得到农杆菌侵染液；
(5)准备豇豆外植体：取灭菌的非转基因豇豆(穗丰8号)种子于MS固体培养上，26℃萌发暗培养2d，去外壳，沿着胚轴处一分为二作为两个外植体。将100个外植体浸没在100ml的农杆菌侵染液中，26℃侵染45min；
(6)共培养：将步骤(4)侵染后的外植体置于共培养培养基上，于27℃、5000Lx、16h/8h的光/暗恒温条件下培养4d；
(7)芽诱导：将步骤(6)共培养的外植体转入芽诱导筛选培养基，胚轴端朝下，于27℃、5000Lx、16h/8h的光/暗恒温条件下培养28d，获得带有新生芽的外植体；
(8)芽伸长：将步骤(7)带有新生芽的外植体转入芽伸长筛选培养基，于27℃、5000Lx、16/8h的光/暗恒温条件下培养28d，伸长阳性芽，获得带有阳性芽的外植体；
(9)生根：将步骤(8)带有阳性芽的外植体转入生根培养基，于27℃、5000Lx、16/8h的光/暗恒温条件下培养至有根长出，再培养5d后炼苗，移栽至温室。
2、转化率与阳性率
按照步骤(1)-步骤(9)的方法进行三次实验。每次实验中重复处理300个外植体材料。
统计三次实验的转化率，然后取平均值。转化率＝转化体数/侵染外植体总数*100％。
结果表明，平均转化率为9.8％。
对所有T0代转化体进行单克隆抗体试纸条检测，所用CP4 EPSPS速测试纸为上海佑隆生物科技有限公司的产品，货号：AA0832-LS。取温室萌发的受体材料非转基因豇豆(穗丰8号)叶片组织及所有T0代转化体叶片组织于一次性组织提取管中，用杵旋转碾碎叶片，按压20～30s，加入0.2ml的提取缓冲液，将试纸条插入样品槽中，5～8分钟内读取结果。
结果表明(图2)，非转基因豇豆速测试纸只出现C线，而所有T0代转化体的速测试纸均出现C线与T线，阳性率高达99.9％。
对照例1：
按照上述实施例1方法，将芽诱导培养基、芽伸长培养基和生根培养基中的草甘膦均替换成等量卡那霉素，其他步骤不变。重复三次，每次处理300个外植体材料，实验结果如下：转化率仅4.1％，阳性率也只有40.5％。
对照例2：
按照上述实施例1方法应用于绿豆(Vigna radiata，与豇豆同属于蝶形花科豇豆述)上，无法获得阳性转化体。
上述结果表明，本发明建立的以草甘膦为筛选剂的豇豆遗传转化方法，不仅能有效获得转基因豇豆，而且极大提高了转化效率及阳性率。与传统的新霉素、潮霉素、磷霉素、卡那霉素等抗生素做为筛选剂的豇豆遗传转化方法想比，大大的减少假阳性的比例，阳性率高达99.9％。由此可见，本发明建立的豇豆遗传转化方法是一种高效可行的遗传转化方法，可大大减少转基因鉴定的工作量，具有重大的应用价值。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 一种利用草甘膦筛选豇豆遗传转化体的方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1368
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
atgctacacg gtgcaagcag ccggccggca accgctcgca aatcttccgg cctttcggga 60
acggtcagga ttccgggcga taagtccata tcccaccggt cgttcatgtt cggcggtctt 120
gccagcggtg agacgcgcat cacgggcctg cttgaaggtg aggacgtgat caataccggg 180
aaggccatgc aggctatggg agcgcgtatc cgcaaggaag gtgacacatg gatcattgac 240
ggcgttggga atggcggtct gctcgcccct gaggcccctc tcgacttcgg caatgcggcg 300
acgggctgca ggctcactat gggactggtc ggggtgtacg acttcgatag cacgttcatc 360
ggagacgcct cgctcacaaa gcgcccaatg ggccgcgttc tgaacccgtt gcgcgagatg 420
ggcgtacagg tcaaatccga ggatggtgac cgtttgcccg ttacgctgcg cgggccgaag 480
acgcctaccc cgattaccta ccgcgtgcca atggcatccg cccaggtcaa gtcagccgtg 540
ctcctcgccg gactgaacac tccgggcatc accacggtga tcgagcccat catgaccagg 600
gatcataccg aaaagatgct tcaggggttt ggcgccaacc tgacggtcga gacggacgct 660
gacggcgtca ggaccatccg ccttgagggc aggggtaaac tgactggcca agtcatcgat 720
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agtgacgtga ccatcctgaa cgtcctcatg aacccgacca ggaccggcct gatcctcacg 840
cttcaggaga tgggagccga catcgaggtg atcaacccgc gcctggcagg cggtgaagac 900
gttgcggatc tgcgcgtgcg ctcctctacc ctgaagggcg tgacggtccc ggaagatcgc 960
gcgccgtcca tgatagacga gtatcctatt ctggccgtcg ccgctgcgtt cgccgaaggg 1020
gccacggtca tgaacggtct tgaggaactc cgcgtgaagg aatcggatcg cctgtcggcg 1080
gtggccaatg gcctgaagct caacggtgtt gactgcgacg agggtgagac ctcactcgtg 1140
gtccgtggcc ggcctgatgg caagggcctc ggcaacgcca gtggagcggc cgtcgccacg 1200
cacctcgatc atcgcatcgc gatgtccttc ttggtgatgg gtctcgtctc agagaacccg 1260
gtgaccgtcg atgacgccac gatgatagcg acgagcttcc cagagttcat ggatctgatg 1320
gcgggcctcg gggccaagat cgaactgtct gacacgaagg ccgcttga 1368

Claims (1)

1.一种利用草甘膦筛选豇豆遗传转化体的方法，其特征在于所述方法为：将抗草甘膦基因通过农杆菌介导侵染豇豆外植体，以草甘膦为筛选剂，筛选阳性转化体；所述抗草甘膦基因核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示；
所述方法包括如下步骤：
（1）构建含抗草甘膦基因的表达载体，转化农杆菌；
（2）将豇豆外植体置于农杆菌侵染液中，26℃浸染30~45min；所述农杆菌侵染液是指含有0.1~4mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.1~2mg/L赤霉素和1~10mg/L 乙酰丁香酮的农杆菌菌液，所述农杆菌菌液是将含有抗草甘膦基因的农杆菌加入B5液体培养基中至OD600nm值为0.4-0.8；所述豇豆的外植体为豇豆的子叶节或胚轴；
（3）将步骤（2）侵染后的外植体置于共培养培养基，26~28°C共培养3~5d；共培养培养基为含有0.1~5mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.1~4mg/L 赤霉素和1~10mg/L乙酰丁香酮的MS固体培养基；
 （4）将步骤（3）共培养后外植体转入含草甘膦的芽诱导筛选培养基，26~28°C暗培养15~21天，获得带有新生芽的外植体；芽诱导筛选培养基为含有0.1~6mg/L 6-苄氨基嘌呤、100~500mg/L特美汀和40~50mg/L 草甘膦的MS固体培养基；
 （5）将步骤（4）带有新生芽的外植体转入含草甘膦的芽伸长培养基，26~28°C光暗交替培养15~21天，获得伸长阳性芽；芽伸长培养基为含有 0.1~4mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.1~5mg/L 赤霉素、100~500mg/L特美汀和 25~40mg/L 草甘膦的MS固体培养基；
 （6）将步骤（5）伸长阳性芽转入含草甘膦的生根培养基，26~28°C光暗交替培养15~21天，获得转化苗，炼苗后，转移至温室；生根培养基为含有0.1~2mg/L 吲哚乙酸、100~500mg/L特美汀和 0.1~25mg/L 草甘膦的MS固体培养基；
步骤（4）-步骤（6）中草甘膦加入浓度均为0.1~50mg/L。
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